PL197872B1 - Roślina buraka cukrowego wyrażająca aktywność enzymu cp4/epsps oraz jej rośliny potomne, transgeniczne nasiona rośliny buraka cukrowego wyrażające aktywność enzymu cp4/epsps oraz sposób wytwarzania transgenicznych roślin - Google Patents
Roślina buraka cukrowego wyrażająca aktywność enzymu cp4/epsps oraz jej rośliny potomne, transgeniczne nasiona rośliny buraka cukrowego wyrażające aktywność enzymu cp4/epsps oraz sposób wytwarzania transgenicznych roślinInfo
- Publication number
- PL197872B1 PL197872B1 PL334135A PL33413598A PL197872B1 PL 197872 B1 PL197872 B1 PL 197872B1 PL 334135 A PL334135 A PL 334135A PL 33413598 A PL33413598 A PL 33413598A PL 197872 B1 PL197872 B1 PL 197872B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- seq
- dna
- fragment
- sequences
- plants
- Prior art date
Links
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 106
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 41
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 claims abstract description 37
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 126
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 65
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 36
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 claims description 28
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 claims description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 26
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 claims description 23
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 20
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 14
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 208000006278 hypochromic anemia Diseases 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 5
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 102000053632 repetitive DNA sequence Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 claims description 3
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 10
- 230000010354 integration Effects 0.000 abstract description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 26
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 24
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 21
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 20
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 13
- 101150094958 gox gene Proteins 0.000 description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 101100437498 Escherichia coli (strain K12) uidA gene Proteins 0.000 description 5
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 101150101900 uidA gene Proteins 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 3
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 239000011253 protective coating Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 239000005579 Metamitron Substances 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 2
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 2
- VHCNQEUWZYOAEV-UHFFFAOYSA-N metamitron Chemical compound O=C1N(N)C(C)=NN=C1C1=CC=CC=C1 VHCNQEUWZYOAEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000005645 nematicide Substances 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000000885 phytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- KUAZQDVKQLNFPE-UHFFFAOYSA-N thiram Chemical compound CN(C)C(=S)SSC(=S)N(C)C KUAZQDVKQLNFPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LDVVMCZRFWMZSG-OLQVQODUSA-N (3ar,7as)-2-(trichloromethylsulfanyl)-3a,4,7,7a-tetrahydroisoindole-1,3-dione Chemical compound C1C=CC[C@H]2C(=O)N(SC(Cl)(Cl)Cl)C(=O)[C@H]21 LDVVMCZRFWMZSG-OLQVQODUSA-N 0.000 description 1
- MGRVRXRGTBOSHW-UHFFFAOYSA-N (aminomethyl)phosphonic acid Chemical compound NCP(O)(O)=O MGRVRXRGTBOSHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRIZYWQGELRKNT-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-trichloro-1,3,5-triazinane-2,4,6-trione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C(=O)N(Cl)C1=O YRIZYWQGELRKNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000932047 Achromobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241000589159 Agrobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 239000005745 Captan Substances 0.000 description 1
- 239000005746 Carboxin Substances 0.000 description 1
- 102100034330 Chromaffin granule amine transporter Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101100169274 Escherichia coli (strain K12) cydC gene Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 101100420606 Geobacillus stearothermophilus sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 101000641221 Homo sapiens Chromaffin granule amine transporter Proteins 0.000 description 1
- FSNCEEGOMTYXKY-JTQLQIEISA-N Lycoperodine 1 Natural products N1C2=CC=CC=C2C2=C1CN[C@H](C(=O)O)C2 FSNCEEGOMTYXKY-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 239000005807 Metalaxyl Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 240000001140 Mimosa pudica Species 0.000 description 1
- 235000016462 Mimosa pudica Nutrition 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000005843 Thiram Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 241001464837 Viridiplantae Species 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003322 aneuploid effect Effects 0.000 description 1
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229940117949 captan Drugs 0.000 description 1
- GYSSRZJIHXQEHQ-UHFFFAOYSA-N carboxin Chemical compound S1CCOC(C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 GYSSRZJIHXQEHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N cresol red Chemical compound C1=C(O)C(C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C=C(C)C(O)=CC=2)=C1 OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- ZQEIXNIJLIKNTD-UHFFFAOYSA-N methyl N-(2,6-dimethylphenyl)-N-(methoxyacetyl)alaninate Chemical compound COCC(=O)N(C(C)C(=O)OC)C1=C(C)C=CC=C1C ZQEIXNIJLIKNTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003750 molluscacide Substances 0.000 description 1
- 230000002013 molluscicidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QHOQHJPRIBSPCY-UHFFFAOYSA-N pirimiphos-methyl Chemical compound CCN(CC)C1=NC(C)=CC(OP(=S)(OC)OC)=N1 QHOQHJPRIBSPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000018655 severe necrosis Diseases 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- QYOJSKGCWNAKGW-HCWXCVPCSA-N shikimate-3-phosphate Chemical compound O[C@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1O QYOJSKGCWNAKGW-HCWXCVPCSA-N 0.000 description 1
- WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M sodium bisulfate Chemical compound [Na+].OS([O-])(=O)=O WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000342 sodium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960002447 thiram Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
- C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
- C12N15/8275—Glyphosate
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
1. Ro slina buraka cukrowego oraz jej ro sliny potomne wyra zaj ace aktywno sc enzymu cp4/epsps, znamienne tym, ze zawieraj a w swoim genomie fragment DNA, który zastosowany jako matryca w reakcji PCR daje z par a oligonukleotydowych primerów charakteryzuj acych si e sekwen- cjami SEQ ID NO:18 i SEQ ID NO:21 amplifikacj e fragmentu 739 bp. PL PL PL PL PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest roślina buraka cukrowego wyrażająca aktywność enzymu cp4/epsps oraz jej rośliny potomne, transgeniczne nasiona rośliny buraka cukrowego wyrażające aktywność enzymu cp4/epsps oraz sposób wytwarzania transgenicznych roślin.
Roślina buraka cukrowego wyrażająca aktywność enzymu cp4/epsps jest zdolna do tolerowania traktowania herbicydami zawierającymi glifosan jako składnik czynny.
Poważnym problemem dla rolnika na polach buraka cukrowego są chwasty. Współzawodniczą z roślinami uprawnymi zmniejszając w ten sposób plony. Obecnie żaden pojedynczy herbicyd nie jest w stanie skutecznie kontrolować wszystkich chwastów bez uszkadzania samych plonów buraka cukrowego (Miller i wsp., J. Sugar Beets Res. 26:3-4, 1989). W praktyce rolnicy stosują mieszaniny herbicydów, co jednak obniża wzrost roślin. W międzyczasie rośnie liczba gatunków chwastów, które rozwinęły oporność na stosowane herbicydy (Schweizer i wsp., J. of Sugar Beet Research 28:1-23, 1991) zwiększając w ten sposób problem kontroli chwastów na polach buraka cukrowego.
Roundup® jest herbicydem o szerokim zakresie działania. Jest to herbicyd chętnie stosowany, hamuje jednak zarówno wzrost gatunków chwastów jak i roślin uprawnych. Jeden litr chwastobójczego roztworu Roundup® zawiera 360 g swego czynnego składnika (a.i.) glifosanu (nazwa zwyczajowa N-fosfonometylo-glicyny), który jest pobierany przez liście. Dotychczas w ciągu ponad 20 lat stosowania nie powstały żadne chwasty oporne na glifosan (Holt i wsp., Annu. Rev. Plant Physiol., 1993); dodatkowo, nie znaleziono naturalnej tolerancji glifosanu u buraka cukrowego. Stosowanie Roundup® przed kiełkowaniem wydaje się być bardziej skuteczne w kontrolowaniu chwastów w polach buraka cukrowego niż kombinacja herbicydów często stosowana w uprawach buraka cukrowego, złożona fenmedipanu, metamitronu i etofumesanu (Madesen i wsp., WeedRes. 35:105-111, 1995).
Glifosan hamuje biosyntezę aminokwasów aromatycznych, przez nieodwracalne wiązanie do syntazy 3-fosforanu 5-enolopirogrony-loshikimianu (epsps). W obrębie chloroplastu ten enzym katalizuje reakcję 3-fosforanu szikimianu i fosfoenolopirogronianu do wytworzenia 3-fosforanu 5-enoilopirogronyloszikimianu i fosforanu. Około jeden tydzień po zastosowaniu herbicydu można zobaczyć jego efekty, w tym więdnięcie, żółknięcie a następnie całkowite brunatnienie, degeneracja tkanki roślinnej i rozkład korzeni.
Aby nadać roślinom uprawnym oporność na glifosan, skupiono się na wprowadzaniu do roślin genów epsps zdolnych do zwiększania tolerancji glifosanu. Oprócz roślin bakterie i grzyby naturalnie wyrażają aktywność enzymatyczną epsps. Stwierdzono, że cp4/epsps z Agrobacterium sp. CP4 nadaje tolerancję glifosanu (Barry i wsp. „Inhibitors of Amino Acid Biosynthesis: Strategies for Imparting Glyphosate Tolerance in Crop Plants w: Biosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acids in Plants, Singh i wsp. (red) American Society of Plant Physiologists, str. 139-145, 1992). Wprowadzenie genu cp4/epsps do soi i rzepaku oleistego dało tolerancję stosowania herbicydu na liście w warunkach polowych (Dellaney i wsp., Crop Sci. 35:1461-1467, 1995; Padgette i wsp., Crop Sci. 35: 1451-1461, 1995).
Oksydaza reduktaza glifosanu (gox) wyizolowana z Achromobacter sp. szczep LBAA (Barry i wsp., p. wyżej) degraduje glifosan do kwasu aminometylofosfonowego, związku, który nie jest toksyczny dla rośliny. Z powodzeniem zastosowano kombinację genów cp4/epsps i oksydazy glifosanu (gox) do uzyskania transgenicznej pszenicy (Zou i wsp., Plant Celi Rep. 15:159-163, 1995) tolerującej glifosan.
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie roślin buraka cukrowego, które tolerują glifosan w dawkach dostatecznie wysokich by uzyskać optymalne działanie chwastobójcze. Takie rośliny mogą być dalej poprawiane przez krzyżowanie wsteczne z liniami „elite” buraka cukrowego aby zoptymalizować agronomiczne właściwości takie jak wydajność, oporność na patogeny itp.
Buraki cukrowe można transformować stosując transformację z udziałem Agrobacterium tumefaciens (Frey i wsp., Third international congress of plant mol. biol., Tucson, Arizona, USA; D'Halluin i wsp., Bio/Technology 10:309-314, 1992; Konwar, J. Plant Biochem, & Biotech. 3:37-41, 1994). Transformacja z udziałem Agrobacterium często daje w efekcie więcej niż jedną kopię T-DNA wintegrowanego do genomu rośliny. Gen, który ma ulec integracji jest wprowadzany do T-DNA korzystnie tak, że jest zlokalizowany w pobliżu prawej granicy T-DNA, która w odróżnieniu od lewej granicy prawie zawsze będzie przeniesiona do rośliny.
Zgodnie z wynalazkiem roślina buraka cukrowego oraz jej rośliny potomne wyrażające aktywność enzymu cp4/epsps, charakteryzują się tym, że zawierają w swoim genomie fragment DNA, który
PL 197 872 B1 zastosowany jako matryca w reakcji PCR daje z parą oligonukleotydowych primerów mających sekwencje SEQ ID NO:18 i SEQ ID NO:21 amplifikację fragmentu 739 bp, przy czym korzystnie część genomu tej rośliny tworzy DNA mający sekwencję nukleotydową SEQ ID NO:27.
Korzystnie amplifikacja PCR z genomowym DNA rośliny według wynalazku, jako matrycą, daje z parą nukleotydowych primerów charakteryzujących się sekwencjami SEQ ID NO:20 i SEQ ID NO:24 amplifikację fragmentu 834 bp, albo amplifikacja PCR z genomowym DNA rośliny według wynalazku, jako matrycą, daje z parą nukleotydowych primerów charakteryzujących się sekwencjami SEQ ID NO:17 i SEQ ID NO:22 amplifikację fragmentu 1057 bp, albo amplifikacja PCR z genomowym DNA rośliny według wynalazku, jako matrycą, daje z parą oligonukleotydowych primerów charakteryzujących się sekwencjami SEQ ID NO:19 i SEQ ID NO:25 amplifikację fragmentu 1224 bp.
Korzystnie część genomu rośliny według wynalazku tworzy DNA charakteryzujący się sekwencją nukleotydową SEQ ID NO:1, przy czym szczególnie korzystnie sekwencja nukleotydową SEQ ID NO:1 zastępuje wysoce repetytywne sekwencje DNA i w takim przypadku część genomu tworzy DNA mający sekwencję nukleotydową SEQ ID NO:4.
Korzystnie też części genomu rośliny według wynalazku bezpośrednio połączone z sekwencją nukleotydową SEQ ID NO:1 mają sekwencje nukleotydowe SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:3.
Zgodnie z wynalazkiem transgeniczne nasiona rośliny buraka cukrowego wyrażające aktywność enzymu cp4/epsps, charakteryzują się tym, że zawierają w swoim genomie fragment DNA, który zastosowany jako matryca w reakcji PCR daje z parą oligonukleotydowych primerów mających sekwencje SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO:21 amplifikację fragmentu 739 bp, przy czym korzystnie część genomu tych nasion tworzy DNA mający sekwencję nukleotydową SEQ ID NO:27.
Korzystnie transgeniczne nasiona według wynalazku zawierają w swoim genomie fragment DNA, który zastosowany jako matryca w reakcji PCR daje z parą oligonukleotydowych primerów charakteryzujących się sekwencjami SEQ ID NO:20 i SEQ ID NO:24 amplifikację fragmentu 834 bp, albo zawierają w swoim genomie fragment DNA, który zastosowany jako matryca w reakcji PCR daje z parą oligonukleotydowych primerów charakteryzujących się sekwencjami SEQ ID NO:17 i SEQ ID NO:22 amplifikację fragmentu 1057 bp, albo też zawierają w swoim genomie fragment DNA, który zastosowany jako matryca w reakcji PCR daje z parą oligonukleotydowych primerów charakteryzujących się sekwencjami SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:25 amplifikację fragmentu 1224 bp.
Korzystnie w transgenicznych nasionach według wynalazku część ich genomu tworzy DNA charakteryzujący się sekwencją nukleotydową SEQ ID NO:1, przy czym szczególnie korzystnie sekwencja nukleotydową SEQ ID NO:1 zastępuje wysoce repetytywne sekwencje DNA i w takim przypadku część genomu tworzy DNA mający sekwencję nukleotydową SEQ ID NO:4.
Korzystnie też części genomu nasion rośliny według wynalazku bezpośrednio połączone z sekwencją nukleotydową SEQ ID NO:1 mają sekwencje nukleotydowe SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:3.
Zgodnie z wynalazkiem sposób wytwarzania transgenicznych roślin buraka cukrowego wyrażających aktywność enzymu cp4/epsps i zawierających w swoim genomie fragment DNA, który zastosowany jako matryca w reakcji PCR daje z parą oligonukleotydowych primerów mających sekwencje SEQ ID NO:18 i SEQ ID NO:21 amplifikację fragmentu 739 bp, charakteryzuje się tym, że:
(a) prowadzi się transformację in vitro liścieni buraka cukrowego Agrobacterium niosącym wektor zawierający fragment DNA kodujący cp4/epsps, (b) regeneruje się transformowane pędy w obecności glifosanu, (c) przenosi się pędy do gleby w szklarni, (d) traktuje się roślinki glifosanem, (e) ocenia się wizualnie bujność transgenicznych roślin i chlorozę liści, (g) wybiera się transgeniczne rośliny z oceną 9, określającą bujność transgenicznych roślin i chlorozę liści oraz (h) namnaża się wybrane rośliny stosując konwencjonalne techniki namnażania.
Korzystnie według wynalazku transformację prowadzi się z użyciem wektora zawierającego fragment DNA mający sekwencję nukleotydową określoną jako SEQ ID NO:5, a zregenerowane pędy analizuje się za pomocą PCR pod kątem obecności DNA kodującego cp4/epsps.
Rośliny według wynalazku tolerują traktowanie przy stosowaniu ponad około 3x6 litrów herbicydu Roundup® na hektar (około 18 litrów na hektar). Całkowita standardowa dawka do uzyskania dobrej kontroli chwastów waha się od 4 do 6 litrów na hektar w zależności od nacisku chwastów. W tych stężeniach działanie herbicydem nie wywiera wykrywalnych efektów na wigor roślin i chlorozę liści. Tolerancja wyrażana przez te rośliny jest nadawana przez transgenicznie wyrażaną aktywność enzy4
PL 197 872 B1 matyczną cp4/epsps. Korzystną postać tej rośliny zdeponowano w National Collections of Industrial and Marinę Bacteria Limited (23 St Machard Drive, Aberdeen AB2 1RY, Szkocja, Zjednoczone Królestwo) 24 października 1997 pod numerem dostępu NCIMB 40905.
Wynalazek dotyczy rośliny buraka cukrowego oraz jej roślin potomnych i nasion wyrażających aktywność enzymu cp4/epsps, w szczególności tolerujących traktowanie około 4 do około 18 litrami Roundup® na hektar.
Rośliny według wynalazku można uzyskać za pomocą transformacji z udziałem Agrobacterium stosując wektor transformacyjny zawierający pomiędzy prawymi i lewymi sekwencjami granicznymi T fragment DNA opisany w SEQ ID NO:5 kodujący m.in. cp4/epsps.
Zadziwiające jest, że zdarzenie transformacyjne (RRMax) pozbawione lewych i prawych sekwencji granicznych T-DNA w obrębie genomu i dające delecję znacznej części DNA wektora transformacyjnego z zachowaniem DNA kodującego cp4/epsps daje znacznie lepszą tolerancję glifosanu. W szczególności kawałek DNA opisany w SEQ ID NO:1 jest wintegrowany do wysoce repetytywnego obszaru genomu równocześnie zastępując część rzeczonej repetytywnej sekwencji genomowej. Genomowy DNA bezpośrednio przylegający do tej części sekwencji transgenu, w której stosowany wektor transformacyjny jest połączony z T-DNA prawej sekwencji granicznej, ma sekwencję podaną w SEQ ID NO:2. Genomowy DNA bezpośrednio przylegający do drugiego końca wintegrowanego transgenicznego DNA ma sekwencję podaną w SEQ ID NO:3. Całkowita sekwencja DNA nowo utworzonego DNA genomowego jest podana w SEQ ID NO:4.
Tolerancja herbicydu wprowadzona do transgenicznych nasion i roślin jest przekazywana przez rozmnażanie płciowe lub wzrost wegetatywny i może więc być utrzymana i namnażana u roślin potomnych.
Ogólnie, znane metody utrzymywania i namnażania transgenicznych nasion i roślin są dostosowywane w zależności od specyficznych celów takich jak uprawa, wysiewanie i zbieranie. Ponieważ rosnący plon jest wrażliwy na atak i zniszczenia powodowane przez owady lub infekcje podejmuje się kroki aby kontrolować choroby roślin, owady, nicienie i inne niesprzyjające stany aby poprawić wydajność upraw. Te obejmują takie mechaniczne kroki jak uprawa gleby lub usuwanie zakażonych roślin jak i stosowanie agrochemikaliów takich jak fungicydy, gametocydy, nematocydy, regulatory wzrostu, środki promujące dojrzewanie i Insektycydy.
Tolerancja herbicydów może być także wprowadzana przez hodowanie roślin, które ma na celu opracowanie roślin o polepszonych właściwościach takich jak tolerancja szkodników, herbicydów lub stresu, poprawiona wartość odżywcza, poprawiona wydajność, lub lepsza budowa powodująca mniejsze straty z pokładania lub rozpadania. Różne etapy hodowlane są określane przez dobrze zdefiniowaną interwencję taką jak wybór linii do krzyżowania, sterowanie zapylaniem linii rodzicielskich, lub wybór odpowiednich roślin potomnych. W zależności od pożądanych właściwości stosuje się różne kroki hodowlane. Odpowiednie techniki są dobrze znane w dziedzinie i obejmują, ale nie ograniczają się, do hybrydyzacji, chowu wsobnego, krzyżowania wstecznego, krzyżowania wieloliniowego, mieszania odmian, hybrydyzacji międzygatunkowej, techniki aneuploidów itp. Tak więc transgeniczne nasiona i rośliny według wynalazku mogą być stosowane do wyhodowania ulepszonych linii roślin, które na przykład zwiększają skuteczność konwencjonalnych metod takich jak traktowanie herbicydami lub pestycydami lub pozwalają na nie stosowanie takich metod ze względu na ich zmodyfikowane właściwości genetyczne. Odmiennie można uzyskać nowe rośliny uprawne z polepszoną tolerancją stresu, które, ze względu na swoje zoptymalizowane genetyczne „wyposażenie” dają zebrane produkty o lepszej jakości niż produkty, które nie były zdolne do tolerancji porównywalnych niesprzyjających warunków rozwojowych.
W produkcji nasion niezbędnymi cechami są jakość i jednorodność nasion, podczas gdy jakość i jednorodność nasion zbieranych przez rolnika nie jest aż tak ważna. Jako, że jest trudno utrzymywać roślinę uprawną wolną od innej rośliny uprawnej i chwastów aby kontrolować choroby przenoszone przez nasiona i aby uzyskać nasiona z dobrym kiełkowaniem, producenci nasion opracowali dość rozległe i dobrze opracowane praktyki produkcji nasion, są oni doświadczeni w sztuce hodowania, kondycjonowania i sprzedawania czystych nasion. Tak więc jest powszechną praktyką, że rolnik kupuje nasiona z certyfikatem spełniające specyficzne standardy jakości zamiast stosowania nasion zebranych z własnych plonów. Materiał do namnażania do stosowania jako nasiona jest zwyczajowo traktowany ochronną powłoką zawierającą herbicydy, insektycydy, fungicydy, środki bakteriobójcze, nematocydy, środki mięczakobójcze i ich mieszaniny. Zwyczajowo stosowane powłoki ochronne zawierają takie związki jak kaptan, karboksyna, tiram (TMTD®), metalaksyl (Apron®) i pirimpos-metyl
PL 197 872 B1 (Actellic®). Jeśli jest pożądane te związki są w jednej formule wraz z przyszłymi nośnikami, związkami powierzchniowo czynnymi lub adiuwantami sprzyjającymi nakładaniu zwyczajowo stosowanymi w sztuce formułowania aby dostarczyć ochronę przeciw uszkodzeniom powodowanym przez bakterie, grzyby lub szkodniki zwierzęce. Powłoki ochronne mogą być stosowane przez impregnowanie materiału do namnażania za pomocą płynnej formuły lub przez powleczenie kombinowaną mokrą lub suchą formułą.
Inne metody nakładania są także możliwe takie jak traktowanie skierowane na pąki lub owoce.
Sposób wytwarzania transgenicznych roślin buraka cukrowego wyrażających aktywność enzymu cp4/epsps według wynalazku może być w szczególności prowadzony w sposób następujący:
Pędy roślin są regenerowane w obecności 0,1 do 10 mM, korzystnie około 1 mM glifosanu po
8-12 tygodniach selekcji. Każdy transgeniczny pęd jest dalej namnażany w 10 kopiach, w których dowolnie można badać obecność transgenu cp4/epsps stosując reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) zanim jest ona przeniesiona do szklarni w celu ukorzenienia. Warunki światła w szklarni to 16 godzin światła i 8 godzin ciemności przy temperaturze 22 ± 2 °C. W stadium trzech do czterech liści na roślinki rozpyla się wodny roztwór Roundup® w dawce od 0,1 do 20 litrów, korzystnie 1 litra na hektar. Ocena na oko bujności roślin i chlorozy w oparciu o skalę od 0 (martwa roślina) do 9 (całkowicie niezmieniona roślina) jest przeprowadzana na poszczególnych roślinach 2 tygodnie po zastosowaniu glifosanu. Oceny 0 do 3 są charakterystyczne dla wrażliwych roślin. Oceny od 3 do 7 wskazują poziom tolerancji niski do pośredniego a oceny 8 do 9 wskazują dobre poziomy tolerancji.
Poniżej podano znaczenia przypisywane poszczególnym ocenom:
9.. . niezmieniona rośiina identyczna jaknietraktowana o^sśin^a kontrolna
8.. . tylko bardzo rTaaa nekrozanaczubkach iiści z mniej niż5% powierzchn i iiścia dotkniętej i żółtej
7.. . bardzo maja nekroza na czubkach iiści i ^<ó:)e^r^c^^t^r1£^ąj^ęj skręcać i mniej ηίζ 5%>
powierzchni liści jest dotkniętej i żółtej
6.5.4.. . wzrastająca nekroza i skręcenie liści, liście stają się mniejsze niż zwykle
3.2.. . brak lubbardzoograniczony wzrost Msch Hściesą skręcone i dotknięte nekrozą
1.. . brak wzrostu raśiinyi do 5%> rośiin pozosjaie zietonych
0... martwa rośiina
Aby zebrać dane z prób w polu rośliny z normalną bujnością i na które nie wpłynął glifosan (ocena 9) są one dalej namnażane lub rozmnażane za pomocą technik konwencjonalnych.
Transformacja jest korzystnie przeprowadzana stosując wektor Ti zawierający kawałek DNA z sekwencją podaną w SEQ ID NO:5 zawierającą geny cp4/epsps i gox (o których wiadomo, że nadają tolerancję na glifosan u pewnych gatunków roślin) oraz gen reporterowy uidA kodujący enzym (β-glukuronidazę. Wzmocniony promotor 35S (Odell i wsp. Naturę 313:810-8182, 1985) jest połączony z genem uidA, promotor wirusa mozaiki trędownika (FMV) (Gouwda i wsp., J. Cell. Biochem. Suppl. 13D:301, 1989) do genów cp4/epsps i gox. Powyżej genów cp4/epsps i genów gox wprowadzany jest peptyd tranzytowy (Gasser i wsp., J. Biol. Chem. 262:4280-4269, 1988) aby uzyskać adresowanie obu białek do chloroplastu.
Stwierdzono, co było zadziwiające, że jedno zdarzenie transformacyjne, które było wygenerowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem było niewrażliwe na dawki do około 3x6 litrów (około 18 litrów) herbicydu Roundup® na hektar. Analiza molekularna wykazała, że:
• istnieje pojedyncza kopia transgenicznego DNA wintegrowana do pojedynczego locus;
• wintegrowany DNA koduje cp4/epsps i odpowiada skróconemu DNA wektora;
• wintegrowany DNA zastępuje fragment genomowego DNA i ma sekwencję przedstawioną w SEQ ID NO:1;
• genomowy DNA bezpośrednio przylegający do wintegrowanego DNA charakteryzuje się sekwencjami SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:3 co daje w wyniku nowy układ sekwencji SEQ ID NO:4;
• geny cp4/epsps i uidA są nienaruszone podczas gdy gen gox jest skrócony;
• inne sekwencje wektora nie są obecne w roślinach transgenicznych.
Obecnie, skoro ta informacja jest dostępna, rośliny pochodzące z jednego ze specyficznych zdarzeń transformacji według wynalazku mogą być łatwo rozróżnione od innych roślin buraka cukrowego za pomocą PCR. Odpowiednie kombinacje par primerów pozwalają na specyficzną identyfikację sekwencji genomowych DNA, które są tylko obecne u roślin bezpośrednio lub pośrednio wynikających
PL 197 872 B1 z identycznych zdarzeń transformacyjnych. Takie wypadki nie są w żaden sposób ograniczone do tych, które uzyskano za pomocą transformacji z udziałem Agrobacterium ale mogą także powstać w wyniku doświadczeń z transformacją biolistyczną.
P r z y k ł a d y
Poniżej podane przykłady ujawniają materiały i metody stosowane w trakcie realizacji wynalazku i uzyskane wyniki.
P r z y k ł a d 1. Transformacja buraka cukrowego
Burak cukrowy o genotypie A1012 jest transformowany wektorem zawierającym cp4/epsps i gen gox zdolny do nadawania tolerancji glifosanu, gen nptll, który nadaje oporność na antybiotyk kanamycynę i gen reporterowy uidA kodujący β-glukuronidazę (GUS). Gen nptll i uidA są funkcjonalnie połączone ze wzmocnionym promotorem 35S (Odell i wsp., Nature 313, 810-812, 1985), podczas gdy geny cp4/epsps i gox są pod kontrolą promotora wirusa mozaiki trędownika (FMV) (Gouwda u wsp., J. Celi Biochem., Suppl. 13D, 301 ;1989). Dodatkowo geny cp4/epsps i gox są połączone z peptydem tranzytowym (Gasser i wsp., J. Biol. Chem. 262:4280-4289, 1988) umieszczonym od strony 5' aby zaadresować oba białka do chloroplastu. cp4/epsps i uidA wykorzystują sekwencje terminatorowe E9 3' podczas gdy gox i nptll stosują odpowiednie sekwencje 3' NOS.
Hodowane in vitro buraki cukrowe (Beta vulgaris L.) transformowano stosując Agrobacterium tumefaciens. Rośliny regenerowano jak opisali Fry i wsp. („Genotype independent transformation of sugarbeet using Agrobacterium tumefaciens” Third International congress of plant mol. biol. Tucson, Arizona, USA, 1991) i Konwar (J. Plant Biochem. & Biotech. 3:37-41, 1994) stosując glifosan w stężeniu 1 mM jako czynnik selekcyjny. Aby wyeliminować A. tumefaciens liścienie są inkubowane trzy razy w pożywce MS zawierającej 500 mg/l cefatoksymu (60 min przy 45-50 obr/min). Regenerowane pędy analizuje się po 8-12 tygodniach selekcji na 1 mM glifosanie, 500 mg/l cefatoksymu wraz z przenoszeniem na świeże pożywki co trzy tygodnie. Każdy transgeniczny pęd jest dalej mikropropagowany w dziesięciu kopiach, analizowany pod kątem obecności transgenu i przenoszony do szklarni w celu ukorzenienia.
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest stosowana aby sprawdzić obecność genu cp4/epsps. Dwadzieścia mg materiału roślinnego jest zbierane w probówce eppendorfa z pędów regenerowanych in vitro. Całkowity DNA ekstrahuje się zasadniczo według Tai i wsp., Plant Mol. Biol. Rep. 8:297-303, 1990. Drobne modyfikacje to dodanie 500 ąl 100 mM Tris HCI pH 8,0 zawierającego 50 mM Na-EDTA, 1,25% SDS (waga/obj), 0,38% kwaśny siarczan sodu (waga/obj) i 200 ng/ml proteinazy K i inkubacja w 65°C przez dwie godziny. Nierozpuszczalny materiał liściowy jest usuwany i całkowity DNA strącany i zamrażany przez dwie godziny w -20°C. PCR przeprowadza się zgodnie z instrukcjami załączonymi z zestawem Perkin-Elmer-Gene-Amp-PCR (Perkin Elmer Corp) stosując zmodyfikowany 10x bufor do reakcji złożony z 100 mM Tris-HCI pH 8,3, 500 mM KCI, 30 mM MgCI2, 1,0% Nonidet-P40 (waga/obj), 0,4 ąM czerwień krezolowa w 24% sacharozie (waga/obj) i Tag Start Antibody (Clontech). Do amplifikacji sekwencji cp4/epsps stosowano następujące primery (Shah i wsp., Science 233: 478-481, 1986).
5'-CAC CGG TCT TTT GGA AGG TGA AG-3' (SEQ ID NO:6) oraz
5'-AAC GAG ACC CAT AAC GAG GAA GC-3' (SEQ ID NO:7).
Do amplifikacji wewnętrznej genomowej sekwencji kontrolnej (surA, surB) stosowano następujące primery:
5'-AAA CAG TCC CGT GCA TCC CCA AC-3' (SEQ ID NO:8) oraz
5'-GAC GCT CTC CTT GAT TCT GTC CC-3' (SEQ ID NO:9).
Nie stwierdzono różnic w wydajności transformacji miedzy różnymi plazmidami binarnymi.
Mikropropagowane pędy są przenoszone do gleby w szklarni. Warunki świetlne szklarni to 200 ąmol m2 sek1 (Osram Power Star HOI-Z, 400 W), 16 godzin światła, 8 godzin ciemności, i temperatura 22 ± 2°C. W stadium trzech do czterech liści roślinki pochodzące z 260 niezależnych transformantów poddano działaniu Roundup®. Stosowany jest skalibrowany rozpylacz do podania wodnego roztworu herbicydu w dawce 1 litra na ha (360 g.a.i.f1). Widoczne oceny skali efektów fitotoksycznych opartych na skali od 0 (całkowita nekroza liści) do 9 (brak widocznych efektów) są odczytywane na indywidualnych roślinach 2 tygodnie po zastosowaniu glifosanu. Dla 75 różnych transformantów wykryto efekty fitotyksyczne od oceny 0-6. Pozostałe 185 (71% ) transformantów ma wynik 7 lub więcej, co oznacza, że wykazują one niewielkie lub brak widocznych efektów po działaniu herbicydu. Są one dalej krzyżowane z nietransgenicznymi burakami cukrowymi w celu produkcji potomstwa F1 dla dalszej oceny w badaniach w polu.
PL 197 872 B1
Badania w polu przeprowadzane są w celu oceny różnych zdarzeń transformacyjnych w warunkach polowych. Pola składają się z trzech rzędów, każdy o długości 9 metrów, z odległością między rzędami 0,5 m. Do każdego poletka wprowadza się jednego transformanta. Po wstępnym podaniu Roundup® 1 l na ha (360 g.a.i.l1) w stadium liścieni aby wyeliminować segregujące nietransgeniczne rośliny rzędy przerzedza się ręcznie do ostatecznie jednej rośliny na 20 centymetrów. Każde poletko jest dzielone na trzy części, które są niezależnie traktowane. Jedno poletko jest traktowane konwencjonalnymi herbicydami metamitronem 0,1 kg a.i.ha! fenmedifanem 0,2 kg a.i.ha1 i etofumezanem 0,1 kg a.i.ha1 . Drugie poletko jest traktowane przez 2 razy 2 litry na ha (1400 a.i.ha1) Roundup® a trzecie poletko jest traktowane 2 razy 4 litry (2880 a.i.ha1) Roundup®. Rośliny są traktowane w stadium dwóch liści i w stadium czterech liści. Dwa tygodnie po ostatnim stosowaniu, u roślin ocenia się efekty fitotoksyczne wynikające ze stosowania herbicydu. Stwierdza się objawy od całkowitej wrażliwości do całkowitej tolerancji. Stwierdza się różnice między oceną w szklarni i oceną w polu. Wynika to prawdopodobnie z różnic środowiskowych między szklarnią i próbą polową w tym z braku światła UV pod szkłem. Nie było morfologicznych ani fizjologicznych różnic miedzy roślinami z poletek traktowanych różnymi dawkami Roundup®, w porównaniu z traktowaniem konwencjonalną mieszaniną herbicydów. Dwa transformanty wykazują wysoką tolerancję Roundup® po traktowaniu 2 razy 2 litrami i 2 razy 4 litrami na ha.
Po rozpyleniu Roundup® mierzono tolerancją przez ocenę wigoru roślin pod kątem wigoru roślin (Tr. vig) i chlorozy liści (Tr. cl). Różne oceny maja następujące znaczenie:
9.. . Niezmieniona rośiina identyczna jaknietraktowana ΚοπΤοΟθ
8.. . Tylko bardzo maaa nekroza na czubkach iiściz mniejniż5% powierzchn i iiścia dotkniętej i żółtej
7.. . Bardzomaaa nekroza na czubkach iiści i które zaczynają się skręcać i mniej ηίζ5% powierzchni liści jest dotkniętej i żółtej
6.5.4.. . Wzrastająca nekroza i skręcenie liści, liście stają się mniejsze niż zwykle
3.2.. . Brak lub bardzo ograniczony wzrosi liśti i wszystkie iiście są skręcone i nekrozą
1.. . brakwzrostu rośiiny i do 5%> rośiin pozostaje zietonych
0... martwa rośiina różnych zdarzeń transformacyjnych (rośliny 1-11) i 1 nietransgeniczną roślinę (roślina 23) napylano 1+4 + 4 litrami Roundup®/Ha (łącznie 9 l/Ha). Wyniki oceny naocznej uszkodzenia są podane w poniższej Tabeli
| Roślina | Ocena wigoru | Ocena Chlorozy |
| 1 | 2 | 3 |
| 1 | 9 | 9 |
| 2 | 6 | 7 |
| 3 | 2 | 3 |
| 4 | 5 | 7 |
| 5 | 9 | 8 |
| 6 | 3 | 3 |
| 7 | 7 | 7 |
| 8 | 7 | 8 |
| 9 | 4 | 6 |
| 10 | 5 | 6 |
| 11 | 5 | 5 |
| 12 | 4 | 5 |
| 13 | 9 | 9 |
| 14 | 3 | 5 |
RRMax
PL 197 872 B1 cd. tabeli
| 1 | 2 | 3 |
| 15 | 4 | 4 |
| 16 | 2 | 3 |
| 17 | 1 | 1 |
| 18 | 2 | 2 |
| 19 | 6 | 8 |
| 20 | 7 | 5 |
| 21 | 4 | 5 |
| 22 | 5 | 7 |
| 23 | 0 | 0 |
(kontrola nietransgeniczna)
P r z y k ł a d 2 Liczba kopii wintegrowanego transgenicznego DNA
Liczba kopii transgenicznego DNA wintegrowanego w obrębie genomu transformanta z najwyższą tolerancją glifosanu (RRMax) jest określana przez analizą typu Southerna fragmentów restrykcyjnych sięgających poza prawe i lewe sekwencje graniczne stosowanego wektora transformacyjnego.
Genomowy DNA z RRMax i nietransgenicznej rośliny z tym samym tłem genetycznym izoluje się z 250 mg liofilizowanego materiału z liści buraka cukrowego według Saghai-Maroof i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:8014-8018, 1984. DNA stosowanego wektora transformacyjnego służy jako kontrola pozytywna. 15 pg DNA trawi się 120 jednostkami enzymu restrykcyjnego przez 4 godziny w 37°C w całkowitej objętości 400 pg. Strawiony DNA strąca się i rozpuszcza w całkowitej objętości 50 |il. Strawiony DNA, pozytywna kontrola plazmidowa i standard masy cząsteczkowej (lambda trawiona EcoRI i Hindlll) rozdzielane są w 0,8% żelu agarozowym. DNA wizualizuje się bromkiem etydyny i sporządza się zdjęcie, na którym jest linijka. DNA następnie przenosi się na błonę HybondN+ i hybrydyzuje z sondą jak opisali Ausubel i wsp. (red) w: „Current protocols in molecular biology”, Green Publishing Associates, Inc. i John Wiley & Sons, Inc., New York, 1987.
Sondy komplementarne do par zasad 975-1766 sekwencji genu cp4/epsps (SEQ ID NO: 5) i par zasad 7108-7535 sekwencji genu gox (SEQ ID NO:5) przygotowuje się za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), w której stosowany wektor transformacyjny służy jako matrycowy DNA dla reakcji. Stosowana jest sonda cp4/epsps w celu określenia liczby wstawek flankujących prawy obszar graniczny. Sonda gox jest stosowana do określenia liczby wstawek flankujących lewy obszar graniczny. Produkty PCR oczyszcza się stosując zestaw Geneclean II® BIO 101 (La Jolla, CA.). Oznakowanie sondy 32P uzyskuje się stosując zestaw do znakowania DNA Megaprime™ firmy Amersham International (Little Chalfont, Królestwo Zjednoczone).
Określenie liczby kopii można wykonać przez analizę genomowego DNA flankującego prawy obszar graniczny. Genomowy DNA trawi się enzymem restrykcyjnym Ncol, który tnie pochodzące od plazmidu sekwencje między promotorem 35S i genem uidA i w obrębie genomu buraka cukrowego. Filtr jest badany wewnętrznym fragmentem PCR z genu cp4/epsps. Po trawieniu Ncol i hybrydyzacji z sondą cp4/epsps stwierdza się pojedynczy prążek 4,7 kb w RRMax. Wykazuje to pojedynczą kopię przeniesionego DNA w pojedynczym locus.
Określenie liczby kopii może też być przeprowadzone przez analizę genomowego DNA flankującego lewy obszar graniczny. Genomowy DNA jest trawiony enzymem restrykcyjnym Hindlll, który tnie sekwencje pochodzące od plazmidu między terminatorem E9 3' genu uidA i promotorem FMV genu gox i w obrębie genomu buraka cukrowego. Po trawieniu Hindlll i hybrydyzacji z sondą gox, wykrywa się pojedynczy prążek około 2,0 kb u transformanta RRMax. Ponieważ minimalna oczekiwana wielkość fragmentu wynosi > 4,4 kb, wynik wykazuje obcięcie plazmidowego DNA w czasie transferu do genomowego DNA rośliny. Tym niemniej wynik potwierdza że tylko pojedyncza kopia przeniesionego DNA wintegrowała w pojedynczym locus.
P r z y k ł a d 3. Analiza miejsca integracji RRMax
Genomowy DNA wyizolowany z 250 mg liofilizowanego materiału liści buraka cukrowego według Saghai-Maroof i wsp. p. wyżej. Przyrządza się bibliotekę fagową XFXII z wielkościami wstawek
9-23 kb w miejscu klonowania Xhol (zamówiona u Stratagene) i przeszukuje się sondami cp4/epsps i gox w celu znalezienia ewentualnych klonów obejmujących zdarzenie integracyjne. W sumie wykryto
PL 197 872 B1 fagów, które hybrydyzowały odpowiednio z sondą cp4/epsps i sondą gox. Jeden z nich oczyszcza się (Fritsch i wsp., 1987) i dalej ocenia za pomocą analizy typu Southerna i PCR. Zawiera on wstawkę genomowego DNA o wielkości 15-16 kb, w tym transgeniczny DNA i flankujące sekwencje buraka cukrowego. Rzeczone flankujące sekwencje amplifikuje się PCR stosując primer pasujący do promotora FMV lub sekwencji genu gox w kombinacji z primerem pasującym do sekwencji w kasecie klonującej A,FIXII (szczegółowo sekwencje podano w Tabeli 1 poniżej). Wintegrowane obszary styku wintegrowany DNA/burak cukrowy poddaje się sekwen-cjonowaniu metodą Sangera terminacji łańcucha za pomocą dideoksystosując Applied Biosystems, Model 373A, Version 2.1.1. Primery stosowane do sekwencjonowania podano w Tabeli 2.
T a b e l a 1. Primery stosowane do amplifikacji obszarów granicznych
| Primer | Sekwencja |
| #3 | 5'-CAAGAAGGTTGGTATCGCTG-3' (SEQ ID NO: 10) |
| #7 | 5'-TCTTTTGTGGTCGTCACTGCGTT-3' (SEQ ID NO: 11) |
| #8 | 5'-GCGAGCTCTAATACGACTCACTAT-3' (SEQ ID NO: 12) |
| #9 | 5'-CGCGAGCTCAATTAACCCTCACT-3' (SEQ ID NO: 13) |
T a b e l a 2. Primery do sekwencjonowania
| Primer | Sekwencja | Opis |
| S1 | 5'-TCTGTACCCTGACCTTGTTG-3' (SEQ ID NO: 14) | aby zsekwencjonować prawy obszar graniczny |
| 53 | 5'-CGTGGATACCACATCGTGAT-3' (SEQ ID NO: 15) | aby zsekwencjonować lewy obszar graniczny |
| 54 | 5'-ACCTTGGCTTGAAGTACTC-3' (SEQ ID NO: 16) | aby zsekwencjonować lewy obszar graniczny |
Analiza sekwencji wykazała, że transgeniczny DNA wbudowany do genomu RRMax ma sekwencją nukleotydową podaną w SEQ ID NO:1. Punkt integracji leży między prawą sekwencją graniczną i promotorem FMV i kończy się 897 par zasad poniżej kodonu start gox. Translacyjne kodony stop dla skróconego genu gox można znaleźć 130 i 235 par zasad poniżej miejsca styku. Zidentyfikowano miejsce Hindlll 210 par zasad poniżej kodonu start gox i sygnał terminacji transkrypcji (AATAAA) 650 par zasad poniżej kodonu start gox. SEQ ID NO:2 opisuje sekwencję DNA genomowego DNA bezpośrednio połączonego z prawym obszarem granicznym transgenicznego DNA i SEQ ID NO:3 sekwencje DNA genomowego bezpośrednio połączonego z lewym obszarem granicznym transgenicznego DNA.
P r z y k ł a d 4. Charakterystyka transgenicznego DNA wbudowanego przez RRMax.
Aby dalej scharakteryzować prawy obszar graniczny genomowy DNA RRMax i DNA wektora do transformacji DNA strawiono enzymem restrykcyjnym BamHI, Hindlll, Bell lub EcoRI. W analizie typu Southerna cięty DNA jest badany za pomocą sondy fragmentu PCR cp4/epsps opisanej w Przykładzie 2. Niezależnie od stosowanego enzymu restrykcyjnego, trawienie różnymi enzymami restrykcyjnymi daje pojedynczy fragment w analizie typu Southerna. Wielkości wykrytych fragmentów są wykryte w Tabeli 3. Dane wykazują, że pojedyncza kopia DNA została przeniesiona do rośliny, i że przeniesienie DNA do rośliny buraka cukrowego dawało w efekcie całkowite przeniesienie genu cp4/epsps. Wyniki są zgodne z wynikami określenia liczby kopii w Przykładzie 2 i w analizie sekwencji nukleotydowej z Przykładu 3.
T a b e l a 3: Wielkości fragmentów przy analizie typu Southerna
| Enzym | RRMax | Wektor do transformacji |
| BamHI | >10 kb | 9,7 kb |
| Hindll | 2,4 kb | 2,4 kb |
| Bell | 3,2 kb | 2,9 kb |
| EcoRI | 1,8 kb | 1,8 kb |
PL 197 872 B1
Aby dalej scharakteryzować fragment wintegrowanego DNA strawiono genomowy DNA z RRMax za pomocą enzymu restrykcyjnego Ncol, BamHI, lub Hindlll. Jako kontrolę strawiono DNA wektora do transformacji tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Filtr hybrydyzowano z fragmentem DNA amplifikowanym techniką PCR obejmującym pary zasad 3796-4837 genu uidA w SEQ ID NO:5. Wielkość wykrytych fragmentów jest przedstawiona w Tabeli 4. Niezależnie od stosowanego enzymu restrykcyjnego, trawienie różnymi enzymami restrykcyjnymi daje pojedynczy sygnał na kliszy do autoradiografii wykazując, że wstawka DNA ma takie same cechy jak wewnętrzny DNA wektora zastosowanego do transformacji.
T a b e l a 4. Wielkości fragmentów wykryte metodą Southerna
| Enzym | Wektor do transformacji | RRMax |
| Ncol | 3,4 kb | 3,4 kb |
| BamHI | 3,2 kb | 3,2 kb |
| Hindlll | 3,2 kb | 3,2 kb |
Aby dalej scharakteryzować lewy obszar graniczny, genomowy DNA RRMax i DNA wektora do transformacji strawiono enzymem restrykcyjnym Ncol, BamHI, Hindll lub EcoRI. W analizie typu Southerna strawiony DNA hybrydyzowano z fragmentem PCR gox opisanym w Przykładzie 2. Wielkość fragmentów jest przedstawiona w Tabeli 5. Niezależnie od stosowanego enzymu restrykcyjnego, trawienie różnymi enzymami restrykcyjnymi powoduje powstanie pojedynczego fragmentu na kliszy do autoradiografii. Oczekuje się, że trawienie enzymem restrykcyjnym Ncol, BamHI, EcoRI da wewnętrzny fragment o znanej wielkości. Jednak żaden z tych enzymów restrykcyjnych nie daje takiego fragmentu wewnętrznego o oczekiwanej wielkości. Wskazuje to, że miejsca restrykcyjne dla Ncol, BamHI i EcoRI nie są obecne w transgenicznej roślinie. Wyniki te są zgodne z wynikami uzyskanymi za pomocą sekwencjonowania, gdzie stwierdzono, że gen gox jest tylko częściowo wintegrowany w roślinie. Trawienie enzymem restrykcyjnym Hindlll daje fragment o wielkości około 2 kb dodatkowo potwierdzając dane sekwencyjne, gdzie miejsce Hindlll zlokalizowane jest poniżej genu gox w genomie. Wyniki też pokazują, że pojedyncza kopia transgenicznego DNA została przeniesiona do rośliny. To dobrze koreluje z pierwotnymi wynikami określenia liczby kopii w Przykładzie 2 i analizą sekwencji w Przykładzie 3. Pojedyncza kopia jest wintegrowana do genomu podczas gdy gen gox jest częściowo wydeletowany.
T a b e l a 5: Wielkości fragmentów uzyskane metodą Southerna
| Enzym | Wektor do transformacji | T9100152 |
| Ncol | 2,5 kb | 3,0 kb |
| BamHI | 2,9 kb | >10 kb |
| Hindll | 9,5 kb | 2,0 kb |
| EcoRI | 1,6 kb | 3,6 kb |
P r z y k ł a d 5: Brak innych sekwencji wektorowego DNA
Aby sprawdzić nieobecność sekwencji oriV, ori-322, aad i nptll w zdarzeniu transformacyjnym można wykonać analizą typu Southerna stosując kombinację enzymów restrykcyjnych/sond pokrywających oriV, ori-322 i nptll.
DNA wektora do transformacji trawi się enzymem restrykcyjnym Nspl, który trawi plazmid w 17 miejscach. W celu analizy fragment Nspl pokrywający oriV i fragment pokrywający ori322 oczyszcza się i stosuje do analizy typu Southerna. Zamplifikowany za pomocą PCR fragment z sekwencją nukleotydów podaną w SEQ ID NO:26 jest stosowany do badania obecności sekwencji nptll. Wszystkie fragmenty oczyszcza się za pomocą zestawu Geneclean® BIO 101 (La Jolla, CA). Wyznakowanie za pomocą 32P uzyskuje się stosując zestaw do znakowania Megaprime™ Anersham International (Little Chalfont, USA).
PL 197 872 B1
Genomowy DNA RRMax trawi się enzymem restrykcyjnym BamHI, który przecina DNA wektora do transformacji w trzech miejscach, umieszczonych w parach zasad 2321,5544 i 8413 SEQ ID NO:5. Hybrydyzacja odpowiedniego filtru typu Southerna z sondą pokrywającą oriV nie wykryła sygnału. Należy więc wywnioskować, że oriV nie jest obecny w RRMax.
Hybrydyzacja odpowiedniego filtru typu Southerna z sondą pokrywającą sekwencje ori-322 i aad nie wykryła sygnału. Należy więc, wywnioskować, że sekwencje ori-322 i aad nie są obecne w RRMax.
Hybrydyzacja odpowiedniego filtru typu Southerna z sondą nptll także nie wykryła sygnału, co wykazuje, że gen nptll nie jest obecny w RRMax.
P r z y k ł a d 6. Stabilność linii RRMax
Trawienie genomowego DNA enzymem restrykcyjnym Bcll i wykonano analizę typu Southerna stosując gen cp4/epsps jako sondę tak jak opisano w Przykładzie 2. Do tej analizy stosuje się cztery rośliny z pokoleń 2 i 3 i pięć roślin z pokolenia 4. Dodatkowo, stosowano trzy rośliny nietransgeniczne jako kontrolę negatywną. Analiza pierwotnego zdarzenia transformacyjnego daje pojedynczy fragment 3,2 kb. Analiza typu Southerna pokoleń potomnych także daje pojedynczy fragment 3,2 kb. Jeśli wprowadzony DNA jest stabilnie dziedziczony z pokolenia na pokolenie, oczekuje się tego samego fragmentu 3,2 kb u wszystkich roślin.
Trawienie genomowego DNA Hindlll i analizę typu Southerna stosując wewnętrzny fragment genu gox jako sondę przeprowadza się jak opisano w Przykładzie 2. Analiza pierwotnego zdarzenia transformacyjnego daje pojedynczy fragment 2,0 kb. Analiza typu Southerna pokoleń potomnych także daje pojedynczy fragment 2,0 kb wskazując stabilne dziedziczenie cechy.
P r z y k ł a d 7. Charakterystyka RRMax za pomocą PCR
Genomowy DNA linii RRMax przygotowuje się jak opisano w Przykładzie 2. Około 0,5 ąg DNA stosuje się jako matrycę w reakcji PCR stosując specyficzne kombinacje primerów charakteryzujących się sekwencjami podanymi w Tabeli 6. Rzeczone specyficzne kombinacje i wielkość zamplifikowanego fragmentu podano w Tabeli 7. W zależności od kombinacji par fragmentów stosowana jest temperatura hybrydyzacji między 55°C i 65°C w każdym z 30 do 35 cykli amplifikacji.
T a b e l a 6: Sekwencje primerów
| Primer | Sekwencja | Opis |
| A | 5'-TCAACCTACAGCTGATTTGGACC-3' (SEQ ID NO; 17) | w pobliżu prawego styku |
| B | 5'-GGACCGGAACGACAATCTGATC-3' (SEQ ID NO: 18) | w pobliżu prawego styku |
| C | 5'-CTAGGGAAGTCCAAATCAGCCG-3' (SEQ ID NO: 19) | w pobliżu lewego styku |
| D | 5'-TTTGGACCGGAACTTTCCAGAAG-3' (SEQ ID NO: 20) | w pobliżu lewego styku |
| a | 5'-CTAACTTGCGCCATCGGAGAAAC-3' (SEQ ID NO: 21) | w obrąbie genu cp4/epsps |
| b | 5'-GACTTGTCACCTGGAATACGGAC-3' (SEQ ID NO: 22) | w obrębie genu cp4/epsps |
| c | 5'-ATTCTTGAGCTCATCAAGCAGCC-3' (SEQ ID NO: 23) | w obrąbie genu cp4/epsps |
| e | 5'-AAGGTTGGTATCGCTGGAGCTG-3' (SEO ID NO: 24) | obrębie sekwencji gox |
| f | 5'-TCTCCACAATGGCTTCCTCTATG-3' (SEQ ID NO: 25) | obrębie sekwencji gox |
PL 197 872 B1
T a b e l a 7: Specyficzne kombinacje primerów
| Kombinacja | Wielkość zamplifikowanego fragmentu |
| A + a | 757 bp |
| A + b | 1057 bp |
| A + c | 2352 bp |
| B + a | 739 bp (SEQ ID NO:27) |
| B + b | 1039 bp |
| B + c | 2334 bp |
| C + e | 888 bp |
| C + f | 1224 bp |
| D + e | 834 bp |
| D + f | 1178 bp |
PL 197 872 B1
Wykaz sekwencji (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY:
(A) NAZWA: Novartis AG (b) ULICA: Schwarzwaldallee 215 (C) MIASTO: Bazyleja (e) PAŃSTWO: Szwajcaria (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 4058 (G) TELEFON: +41 61 324 11 11 (H) TELEFAX: +41 61 322 75 32 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Rośliny transgeniczne (iii) LICZBA SEKWENCJI: 27 (iv) SPOSÓB ZAPISU KOMPUTEROWEGO:
(A) ŚRODOWISKO: Dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Vereion #1.25 (EPO) (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 8012 par zasadowych (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 1:
AACGACAATC IGATCCCCAT CAAGCTTGAG CTCAGGATTT AGCAGCATTC CAGATTOGGT 60
TCAATCAACA AGGTACGAGC CATATCACTT TATTCAAATT OGTATCGCCA AAACCAAGAA 120
GGAACTCCCA TCCTCAAAGG TTTGTAAGGA AGAATTCTCA GTCCAAAGCC TCAACAAGGT 180
CAGGGTACAG AGTCTCCAAA CCATTAGCCA AAAGCTACAG GAGATCAATG AAGAATCTTC 240
AATCAAAGTA AACTACTGTT CCAGCACATG CATCATGGTC AGTAAGTTTC AGAAAAAGAC 300
ATCCACCGAA GACTTAAAGT TAGTOGGCAT CTTTGAAAGT AATCTTGTCA ACATCGAGCA 360
PL 197 872 Β1
GCTGGCTTGT GGOGACCAGA CAAAAAAGGA ATGGTGCAGA ATTGTTAGGC GCACCTACCA 420
AAAGCATCTT TGCCTTTATT GCAAAGATAA AGCAGATTCC TCTAGTACAA GT3GGGAACA 480
AAATAACGTG GAAAAGAGCT CZDCCTGACAG CCCACTCACT AATGCGTATG ACGAACGCA3 540
TGAOGACCAC AAAAGAATTC CCTCTATATA AGAAGGCATT CATTCCCATT TGAAGGATCA 600
TCAGATACTG AACCAATCCT TCTAGAAGAT CTAAGCTTAT CGATAAGCTT GATGTAATTG 660
GAGGAAGATC AAAATTTTCA ATOCCCATTC TTCGATTGCT TCAATTGAAG TTICTCCGAT 720
GGCGCAAGTT AGCAGAATCT GCAATGGTGT GCAGAAOCCA TCTCTTATCT CCAATCTCTC 780
GAAATCCACT CAACGCAAAT CTCCCTTATC GGTITCTCTG AAGACGCAGC AGCATCCACG 840
AGCITATCCG ATITCGTCCT CGTGGGGATT GAAGAAGACT GGGATGACGT TAATTGGCTC 900
TGAGCTTCGT CCTCTTAAGG TCATGTCTTC TGTTTCCACG GCGTGCATGC TICACGCTGC 960
AAGCAGCCCT CCAGCAACTG CTCCTAACTC CTCT3GTCTT TCT3GAACGG TCOGTATTCC 1020
AGGTGACAAG TCTATCTCCC ACAGGTCCTT CATCTTTGGA GGTCTCGCTA GCGGTGAAAC 1080
TCGTATCACC GGTCTITTGG AAGGTGAAGA TCTTATCAAC ACTGGTAAGG CTATGCAAGC 1140
TATGGGTGCC AGAATCCGTA AGGAAGGTGA TACTIGGATC ATTGATGGTG TTGGTAACGG 1200
TGGACTCCTT GCTCCTGAGG CTCCTCTCGA TITCGCTAAC GCTGCAACTG GTTGCOGTTT 1260
GACTATGGGT CTTGTTGGTG TTTACGATTT CGATAGCACT TTCATTGGTG ACGCTTCTCT 1320
CACTAAGCCT CCAATCGGTC GTGTGTTGAA CCCACTTCGC GAAA1GGGTG TGCAGCTGAA 1380
GTCTGAAGAC GGTGATCGTC TTCCACTTAC CTTGCGTGGA CCAAAGACTC CAACGCCAAT 1440
CACCTACAGG CTACCTATGG CTTCCGCTCA AGTGAAGTCC GCTGITCTGC TTGCTGGTCT 1500
CAACACCCCA GCTATCACCA CTGTTATCGA GCCAATCATG ACTCGTGACC ACAOTGAAAA 1560
GATGCTTCAA GCTTTTGCTG CTAACCTTAC OGTIGAGACT GATGCTGACG GTCTGCCTAC 1620
CATCCGTCTT GAAGGTCGTG GTAAGCTCAC CGGTCAACTG ATTGATGTTC CAGGTCATCC 1680
ATCCTCTACT GCTTTCCCAT TGGTTGCTGC CTTGCTTGTr CCAGGTTCCG ACGTCACCAT 1740
CCTTAACGTT TTGATGAACC CAACCCGTAC TGGTCTCATC TTGACTCTGC AGGAAATGGG 1800
TCCOGACATC GAAGTGATCA ACCCACGTCT TGCTGGTGGA GAAGACGTGG CTGACTTGCG 1860
TCTTCGTTCT TCTACTTTGA AGGGTGTTAC TGTTCCAGAA GACCGTGCTC CTTCTATGAT 1920
CGACGACTAT CCAATTCTCG CTCTTGCAGC TGCATTCGCT GAAGGTGCTA CCGTTATGAA 1980
CGGTTTGGAA GAACTCCGTG TTAAGGAAAG CGACCGTCTT TCTGCTGTCG CAAACGGTCT 2040
PL 197 872 Β1
CAAGCTCAAC GGTCTTGATT GCGATCAAGG TCAGACITCT CTOGTCGTGC CTGGTCGTCC 2100
TGACGGTAAG GGTCTCGCTA ACGCTTCTGG AGCAGCTCTC GCTACCCACC TCGATCACCG 2160
TATCGCTATG AGCTTCCTCG TTATGGGTCT CGTTTCTCAA AACCCTCTTA CTCTTGATCA 2220
TGCTACTATG ATCGCTACTA GCTTCCCAGA GTTCATGGAT TTGATGGCTG GTCTTOGAGC 2280
TAAGATCGAA CTCTCOGACA CTAAGGCTGC TTGATGAGCT CAAGAATTCG AGCTCGGTAC 2340
CGGATCCTCT AGCTAGAGCT TTCCTTCGTA TCATCGCTTT CGACAACGTT CGTCAAGTTC 2400
AATGCATCAG TTTCATTGCG CACACACCAG AATCCTACTG ACTTCGAGTA TTATCGCATT 2460
GGGAAAACTG TTTTTCTTGT ACCATTTCTT CTGCTTCTAA TTTACTCTCT 1TITTATTCG 2520
GTTTTCGCTA TCGAACTCTC AAATGGAAAT GGATOGAGAA GAGTTAATGA ATGATATGCT 2580
CCTTTTGTTC ATTCTCAAAT TAATATTATT TCTTTITPCT CTTATTTGTT GTGTOTTGAA 2640
TTTCAAATTA TAAGAGATAT GCAAACATTT TCTTT1GAGT AAAAATGTGT CAAATCGTGG 2700
CCTCTAATGA CCGAAGTTAA TATGAGGACT AAAACACITG TACTTCTACC ATTATGCTTA 2760
TTCACTAGGC AACAAATATA TTTTCAGACC TAGAAAAGCT GCAAATGTTA CTGAATACAA 2820
GTATGTCCTC TICTGTTTTA GACATTTATG AACTTTCCTT TATGTAATTT TCCAGAATCC 2880
TTGTCAGATT CTAATCATTO CTTTATAATT ATAGTTATAC TCATGGATTT CTAGTTOAGT 2940
ATGAAAATAT TTTTTAATCC ATTTTATGAC TTGCCAATTG ATTGACAACA TGCATCAATC 3000
GACCTGCAGC CACTCGAAGC GGCCGCGTTC AAGCTTCTGC AGCTOCGATG TGAGACTTTT 3060
CAACAAAGGG TAATATCCGG AAACCTCCTC QGA.TTCCA.TT GCCCAGCTAT CTCTCACTTT 3120
ATTOTGAAGA TAGTGGAAAA GGAAGGTCGC TCCTACAAAT GCCATCATTG CGATAAAGGA 3180
AAGGCCATCG TTGAAGATGC CTCTGCCGAC AGTGGTCCCA AAGATGGACC CCCACCCACG 3240
AGGAGCATCG TGGAAAAAGA AGACCTTCCA ACCACGTCTT CAAAGCAACT GGATTGATGT 3300
GATGGTCCGA TCTCAGACTT TTCAACAAAG GGTAATATCC GGAAACCTCC TCGGATTCCA 3360
TTGCCCAGCT ATCTGTCACT TTATTCTGAA GATAGTOGAA AAGGAAGGTG GCTCCTACAA 3420
ATGCCATCAT TGOGATAAAG GAAAGGCCAT CGTTGAAGAT GCCTCTGCCG ACACTGGTCC 3480
CAAAGATGGA CCCCCACCCA CGAGGAGCAT CGTGGAAAAA GAAGACGTTC CAACCACGTC 3540
TTCAAAGCAA GTGGATTGAT GTGATATCTC CACTGACGTA AGGGATGACG CACAATCCCA 3600
CTATCCTTCG CAAGACCCTT CCTCTATATA AGGAAGTTCA TITCATTTGG AGAGGACACG 3660
PL 197 872 B1
CTGACAAGCT GACTCTAGCA GATCTCCATG GTOOGTCCTG TAGAAACCCC AACCCGTGAA 3720
ATCAAAAAAC TCGACGGCCT CTGGGCATTC AGTCTGGATC GCGAAAACTG TGGAATIGAT 3780
CAGCGTTGGT GGGAAAGCGC GTTACAAGAA AGCCGGGCAA . TTGCTGTGCC AGGCAGTTTT 3840
AACGATCAGT TOGOCGATGC AGATATTCGT AATTATGCGG GCAAOGTCTG GTATCAGCGC 3900
GAAGTCTITA TACCGAAAGG TTGGGCAGGC CAGCGTATCG TGCTGCGHT CGATGCGGTC 3960
ACTCATTACG GCAAAGTGTG GGTCAATAAT CAGGAAGTGA TGGAGCATCA GGGCGGCTAT 4020
ACGCCATITG AAGCCGATGT CACGCCGTAT GTTATTOCCG GGAAAAGTGT ACGTATCACC 4080
GTTTGTGTGA ACAACGAACT GAACTGGCAG ACTATCCCGC CGGGAATGCT GATTACCGAC 4140
GAAAACGGCA AGAAAAAGCA GTCTTACTTC CATGATTTCT TTAACTATGC CGGAATCCAT 4200
CGCAGCGTAA TGCTCTACAC CACGCCGAAC ACCTTGCTGG ACGATATCAC CGTGGTGACG 4260
CATGTCGCGC AAGACTGTAA CCACGCGTCT GTTGACTGGC AGGTGGTGGC CAATGGTGAT 4320
GTCAGCGTTG AACTGCGTGA TGCGGATCAA CAGGTGGTTG CAACTGGACA AGGCACTAGC 4380
GGGACTTTGC AAGTGGTGAA TCCGCACCTC TGGCAACCGG GTGAAGGTTA TCTCTATCAA 4440
CTGTGCGTCA CAGCCAAAAG CCAGACAGAG TGTGATATCT ACCCGCTTCG CGTCGGCATC 4500
CGGTCAGTGG CAGTGAAGGG CGAACAGTTC CTGATTAACC ACAAACCGTT CTACTTTACT 4560
GGCTTTGGTC GTCATGAAGA TGCGGACTTA CGTGGCAAAG GATTCGATAA CGTGCTGATG 4620
GTGCACGACC ACGCATTAAT GGACTGGATT GGGGCCAACT CCTACCGTAC CTCGCATTAC 4680
CCTTACGCTG AAGAGATGCT CGACTGGGCA GATGAACATG GCATCGTGGT GATTGATGAA 4740
ACTGCTGCTG TCGGCTTTAA CCTCTCTTTA GGCATTGGTT TCGAAGCGGG CAACAAGCCG 4800
AAAGAACTGT ACAGCGAAGA GGCAGTCAAC GGGGAAACTC AGCAAGCGCA CTTACAGGCG 4860
ATTAAAGAGC TGATAGCGOG TGACAAAAAC CACCCAAGCG TGGTGATGTG GAGTATTGCC 4920
AACGAACCGG ATACCCGTCC TGCACGGGAA TATTTCGGCA ITTCGCCACT GGCGGAAGCA 4980
ACGCGTAAAC TCGACCCGAC GCGTCCGATC ACCTGCGTCA ATGTAATGTT CTGCGACGCT 5040
CACACCGATA CCATCAGCGA TCTCTTTGAT GTGCTGTGCC TGAACCGTTA TTACGGATGG 5100
TATGTCCAAA GCGGCGATTT GGAAACGGCA GAGAAGGTAC TGGAAAAAGA ACTTCTGGCC 5160
TGGCAGGAGA AACTGCATCA GCCGATTATC ATCACCGAAT ACGGCGTGGA TACGTTAGCC 5220
GGGCTGCACT CAATGTACAC CGACATGTOG AGTGAAGAGT ATCAGTGTGC ATGGCTGGAT 5280
ATGTATCACC GCGTCTTTGA TCGCGTCAGC GCCGTCGTCG GTGAACAGGT ATGGAATTTC 5340
PL 197 872 B1
GCCGATTTTG CGACCTCGCA AGGCATATTG CGCGTTGGCG GfKTAACAAGA AAKKGATCTT^ 5400
ACTCGCGACC GCAAACCGAA GTCOGCGGCT TTTCTGCTGC AWAAAACGC5 GGCCTGGCTT 5460
AACTTCGCTG TTTTTCCGCT GCTGGGTGGC TTTCTTTGTT TOCTTCTTCT TCCCOGCGCA 5520
CCTTCGTCGG CTTCftGCCTC CGTCGGCAAT 703^3010^ ΊCTTTGTTGC 5580
CCTΓΓFCCΓTC CTATCTTCCC TTTCCACAAC TnTCKTGT TCTGrTTTATT 5640
CTCCACATTT TACAATCCTA CTCACTTCCA GTTTTATGCC AΈCT3GCTAT CTC33CTTTCT' 5700
TCCTTCATCT CTTGTCCTTC TAAΊTTACTC Τ0ΓΤΤΤΤΑΤ TaCGGITTTTS CTATCTCTCT 5760
GTCAAATCCT AATGCATGCT CTACATTTAA CCAATCA!CAT G¢CCCTCTCC^ GTCATTCTCA 5820
ΑΑΤΤΑΑΤΑΤΤ ACTTCCTTTC TTTTTCATTC CTCCCGTTTC GAATΓΠTCA ΊC,ATAAGGTC 5880
TA,ΓCTATATA TTTTGTTTTG ATTAAAAATC TCITATTTTC TGG3CTCCTTT ΊC3ATTCAACΓ 5940
TAATATGACG TCTAAAATAT TCCTATCTCT ACTATI:ACCC TTKrT:TCl!A CCCTATCATAΓ 6000
ATATTΓTCAC ATTCTCAATA CTICTATATC TCACTGAATA C,fTAACCKCIG: TCCTCCTCCC[' 6060
CTTCATTTTC ATGAATTTTT CTTCATGTAA CTTΓTTACAA ΊΌCTCCCCCT3 AΊCTTTATCT 6120
CTGTTΓrΓATA ATCATAGTTA TATΓTATQCT TTΓGTAGCTC AGTATGAWT ΤΑΤΤΤΓΤΤΤΑ 6180
CCTATCTCAT CATTTCCCTA CTCA,TΓCATA TTA,ΓQTTTTA AT<TTCTTTC3 CTCTTCATGT 6240
CCACCCTAGC ATCTACTACC ATΊTTACATT GCCΓTCAATT A^ATTATCCT: C3CTTT:T!IC 6300
ATCTTATCTT AA,TCCCCA'ΓT GTTAATAOTA ACTACCAATT COCATaCICTC JA«GGCTCCCT 6360
ACCAACAATT TCTACCTTAA AGTTTTATCA TCGTTACCCC ACATACTCT[T TTAAACTΊTA 6420
CTCATATCTC ATACGACATT ATTTAACAAT CTTTAATTAA AσΓCCTTTTT: TCCTTCTA^ 6480
TAIICTATCAT CCCTATTATG TTCCACAAAA AGATATTCAT CXTGTTGTTA AΛCGT’TTCCT3 6540
CTA,ΓTΊTCCT AACTTATCTT CTCAATACTC AGTACTTCGT ΊΌΓΟΙ^ TT£»CTTAAA 6600
TGCAACIGCCC TACTA,TCCΓT ACGTCTATTC ATCAATACTA TCTTT!TCTTI? TAΊ’:CCTTTA 6660
ATAAACTTCT TCCCTTTATT TTTACCCGCG AATAATATAA C<TCCTGTTT 3TCTCCCTCC3 6720
TTTGTCTATT TACTAACGCC TA,ΓCATCAAT CCACΓCATGA CCACAATGA AΊTTTTTCCΓT 6780
TATTACAACC TACTTATCTT TATCTTAACC ATCATTACAT ACTGA^TTTCT ^TTTTTTTGC 6840
TGTTCCTTAC AATCGTI,CTT TTTACGTCCT CC,ΓTTCTCAT ΤΑΦη’ΠΓΧ TTCCTTGCTCT 6900
TCGTTATCAT CGTCGTCTTT TTTTATGCTT TCAACTTTCT OCCCTCCTTrc <TCAGTCTCCT 6960
PL 197 872 Β1
GCAAGGCTAA CAACGACATT ACTTCCATCA CAAGCAACGG CGGAAGAGTT AACTGCATGC
AGGTGTOGCC TCCGATTGGA AAGAAGAAGT TTGAGACTCT CTCTTACCTT CCTGACCTTA
CCGATTCCGG TGGTCGCGTC AACTGCATGC AGGOCATOGC TGAGAACCAC AAGAAGGTTO
GTATCGCTGG AGCTOGAATC GTTGGTCTIT GCACTGCTTT GATGCTTCAA CGTCGTGGAT
TCAAGGITAC CTIGATIGAT CCAAACCCAC CAGGTGAAGG T3CTTCTTTC GGTAACGCTG
GTTOCTTCAA CGGTTCCTCC GTIGTTCCAA TGTCCATGCC AGGAAACTTC ACTAGCGTTC
CAAAGTOGCT TCTTGACCCA ATOGGTCCAT TCTCCATCCG TTIGAGCTAC TTTCCAACCA
TCATGCCTTG GTIGATTCGT TTCTTGCTIG CTGGAAGACC AAACAAGGTO AAGGAGCAAG
CTAAGGCACT CCGTAACCTC ATCAAGTCCA CTGTGCCTTT GATCAAGTCC TIGGCTGAGG
AGGCTGATGC TAGCCACCTT ATCCCTCACG AAGGTCACCT TACCGTGTAC CGTGGAGAAG
CAGACTTCGC CAAGGACCGT GGAGGTTGGG AACTTCGTCG TCTCAACGGT GTTOGTACTC
AAATCCTCAG CGCTGATGCA TTCCGTGATT TCGATCCTAA CTTGTCTCAC GCCTTTACCA
AGGGAATCCT TATCGAAGAG AACGGTCACA CCATCAACCC ACAAGGTCTC GTGACTCTCT
TCTTTCGTCG TTTCATCGCT AACGGTGGAG AGTTCGTGTC TGCTCGTGTT ATCGGATTCG
AGACTGAAGG TCGTGCTCTC AAGOGTATCA CCACCACCAA CGGTGTTCTT GCTOTTGATG
CAGCTGTTGT TCCAGCTCGT GCACACTCCA AGTCTCTTOC TAACTCCCTT GGTGATGACA
TCCCATTGGA TACCGAACGT GGATACCACA TCGTGATCGC CAACCCAGAA GCTGCTCCAC
GTATTCCAAC TACCGATGCT TCTOGAAAGT TC (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 89 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 2:
GGATTGTGTT TGGGTTTTGT CTCTCTCTTT AATGTGTTTA AGGGATGAAT TAGAATGCTC
7020
7080
7140
7200
7260
7320
7380
7440
7500
7560
7620
7680
7740
7800
7860
7920
7980
8012
TTAATCAACC TACAGCTGAT TTGGACCGG
PL 197 872 Β1 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 697 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 3:
CGGTCCAAAT TTG1TTACAT TGTGTCCAAA TTTCGGCTGA TTTGGACITC CCTAGCTATG 60
CCAACTAAGC TAATAAAAAA CATGAAACAA CAATTACAAA CTGTCGAGCZA CACCTTCTAC 120
AAACTAGCTT AGATTTCTAT TOGAAGITAC AAAACAGTAA AACTACCAAT AGGATACTAA 180
ATTAAACATA TTAAACTATT ACTCCTCAAA AGCTTGTACA ATTTGCAGAA GAAATGATGG 240
TTGCCCAAAA GCTTCAAAGG GAACCTGCTG GGAAGCCT3C TCGGAOGCTC GGGATGCTGG 300
CAGCAGCATA CCTTGGCTTG AAGTACTCTT CTCTCATTGG TITTGCTTCC CTTGCCCATG 360
TGGTTTTCAT ATGGCCTCAT TACTTCCCAA GGGCTTCAAA TCAGTAGGTG GTGGCAACCA 420
AAAGCATCAA AAACATCTCC TAAAACTAGC 1TATACAACC GGATTACATG AGCTTATACT 480
AGCTTAACTC TTAAAGCATG ATTAACATAA TGATGTTTAA OGTGTCATTA A3TA1TACTA 540
ATCTTGCTTA AGTAGAGATT AACATAGGAT TAGCCTAATC AAGTTGCTTA ACTAAOGTTT 600
TAGAATAAAC CGAGCTACTT AGGCTTAAGT AGAGATTAAC ATAGGA.TTAG CCTAATCAAG 660
1TGCTTAAGT AAGGTTITAG AATAAACCGA GCTAGTT 697 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 8798 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE
PL 197 872 Β1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 4:
GGATTSTCTT TGGGTTTTGT CTCTGTGTTT AATGTGTTTA AGGGATGAAT TAGAATGCTC 60
TTAATCAACC TACAGCTGAT TTGGACCGGA ACGACAATCT GATCCCCATC AAGCTTGAGC 120
TCAGGATTTA GCAGCATTCC AGATTGGGTT CAATCAACAA GGTACGAGCC ATATCACTTT 180
AITCAAATTG GTATCGCCAA AACCAAGAAG GAACTCCCAT CCTCAAAGGT TTGTAAGGAA 240
GAATTCTCAG TCCAAAGCCT CAACAAGGTC AGGGTACAGA GTCTCCAAAC CATTAGCCAA 300
AAGCTACAGG AGATCAATGA AGAATCTTCA ATCAAAGTAA ACTACTGITC CAGCACATGC 360
ATCATGGTCA GTAAGTTTCA GAAAAAGACA TCCACCGAAG ACTTAAAGTT AGTGGGCATC 420
TTTGAAAGTA ATCTTGTCAA CATCGAGCAG CTGGCTTGTG GGGACCAGAC AAAAAAGGAA 480
TGGTGCAGAA TTGTTAGGCG CACCTACCAA AAGCATCTTT GCCTTTATIG CAAAGATAAA 540
GCAGATTCCT CTAGTACAAG TGGGGAACAA AATAACGTGG AAAAGAGCTC TCCTGACAGC 600
CCACTCACTA ATGCGTATGA CGAAOGCAGT GACGACCACA AAAGAATTCC CTCTATATAA 660
GAAGGCA.TTC ATTCCCATTT GAAGGATCAT CAGATACTGA ACCAATCCTT CTAGAAGATC 720
TAAGCTTATC GATAAGCTTG ATGTAATTGG AGGAAGATCA AAATITTCAA TCCCCATTCT 780
TCGATTGCTT CAATTGAAGT TTCTCCGATG GCGCAAGTTA GCAGAATCTG CAATGGTGTG 840
CAGAACCCAT CTCTTATCTC CAATCTCTCG AAATCCAGTC AACGCAAATC TCCCTTATCG 900
GTTTCTCTGA AGACGCAGCA GCATCCACGA GCTTATCCGA TTTCGTCGTC GTGGGGATTG 960
AAGAAGAGTC GGATGACGIT AATTGGCTCT GAGCTTCGTC CTCTTAAGGT CATGTCTTCT 1020
GTITCCACGG CGTGCATGCT TCACGGTGCA AGCAGCCGTC CAGCAACTGC TCGTAAGTCC 1080
TCTGGTCTIT CTGGAACCGT CCGTAITCCA GGTGACAAGT CTATCTCCCA CAGGTCCTTC 1140
ATGTITGGAG GTCTCGCTAG CGGTGAAACT CGTATCACCG GTCTTTTGGA AGGTGAAGAT 1200
GTTATCAACA CTGGTAAGGC TATGCAAGCT ATGGGTGCCA GAATCCGTAA GGAAGGTCAT 1260
ACTTCGATCA TT3ATGGT3T TGGTAACGGT GGACTCCTTC CTCCTGAGGC TCCTCTCGAT 1320
TTCGGTAACG CTGCAACTGG TTGCCGTTTG ACTATGGGTC TTGTTGGTGT TTACGATTTC 1380
GATAGCACTT TCATTGGTGA CGCTTCTCTC ACTAAGCGTC CAATGGGTCG TGTGTTGAAC 1440
PL 197 872 B1
CCACTTCGCG AAATGGCTGT GCAGGTCAAG TCTGAAGACG GTGATCGTCT TCCAGTTACC 1500
TTGCGTGGAC CAAAGACTCC AACGCCAATC ACCTACAGGG TACCTATGGC TTCCGCTCAA 1560
GTGAAGTCCG CTCTTCTCCT TCCTCGTCTC AACACCCCAG GTATCACCAC TGTTATCGAG 1620
CCAATCATGA CTCGTCACCA CACTGAAAAG ATGCTTCAAG GTTTTGGTGC TAACCTTACC 1680
GTTGAGACTG ATGCTGACGG TCTGCCTACC ATCCGTCTTG AAGGTCGTCG TAAGCTCACC 1740
GGTCAAGTGA TTCATCTTCC AGGTGA.TCCA TCCTCTACTG CTTTCCCATT GCTTGCTGCC 1800
TTGCTTGTTC CAGGTTCCGA CGTCACCATC CTTAACCTTT TGATGAACCC AACCCCTACT 1860
GGTCTCATCT TCACTCTCCA GGAAATGGGT GCCGACATCG AAGTGATCAA CCCAOGTCTT 1920
GCTGGTGGAG AAGACGTGGC TCACTTGCCT CTTCCTTCTT CTACTTTCAA GGGTGTTACT 1980
GTTCCAGAAG ACCGTGCTCC TTCTATGATC GACGAGTATC CAATTCTCGC TGTTGCAGCT 2040
GCATTCGCTG AAGGTGCTAC CGTTATGAAC GGTTTGGAAG AACTCCGTGT TAAGGAAAGC 2100
GACCGTCTTT CTGCTGTCGC AAACGGTCTC AAGCTCAACG CTCTTGATTG CGATCAAGGT 2160
GAGACTTCTC TCGTCGTGCG TGCTCCTCCT GACCGTAAGG GTCTCG3TAA CGCTTCTGGA 2220
GCAGCTGTCG CTACCCACCT CGATCACCGT ATCGCTATGA GCTTCCTCGT TATGGGTCTC 2280
GTTTCTGAAA ACCCTGTTAC TGTTGATGAT GCTACTATGA TCGCTACTAG CTTCCCAGAG 2340
TTCATGGATT TGATGGCTCG TCTTGGAGCT AAGATCGAAC TCTCCGACAC TAAGGCTGCT 2400
TCATGAGCTC AAGAATTCGA GCTCGGTACC GGATCCTCTA GCTAGAGCTT TCGTTCCTAT 2460
CATCGGTTTC GACAACGTTC GTCAAGTTCA ATGCATCAGT TTCATTGCGC ACACACCAGA 2520
ATCCTACTGA GTTCGAGTAT TATGGCATTG GGAAAACTGT TTTTCTTGTA CCATTTCTTC 2580
TGCTTGTAAT TTACTGTCTT TTTTATTCGG TTTTCGCTAT CGAACTGTGA AATGGAAATG 2640
GATGGAGAAG AGTTAATGAA TCATATCGTC CTITIGTTCA TTCTCAAATT ΑΑΤΑΤΤΑΤΓΤ 2700
GTTTTTTCTC TCATTTGTTG TGTGTTGAAT TTGAAATTAT AAGAGATATG CAAACATTTT 2760
GTTTTGACTA AAAATGTGTC AAATCGTGGC CTCrAATCAC CGAAGTTAAT ATGAGGAGTA 2820
AAACACTTGT AGTTGTACCA TTATGCTTAT TCACTAGGCA ACAAATATAT TTTCAGACCT 2880
AGAAAAGCTG CAAATGTTAC TGAATACAAG TATGTCCTCT TCTCTTTTAG ACATTTATGA 2940
ACTTTCCTTT ATGTAATTTT CTAGAA.TCCT TGTCAGATTC TAATCATTGC ΊΊΤΑΤΑΑΤΤΑ 3000
TAGTTATACT CATTGATTTT TAGTTGAGTA TGAAAATATT TTTTAATCCA TTTTATGACT 3060
PL 197 872 Β1
TGCCAATTGA TTGACAACAT GCATCAATCG AOCTGCAOOC ACTCGAAGCG GCCGCGTTCA 3120
AGCTTCTGCA GGTTCCGATCT GAGACTTTTC AACAAAGGGT AATATCCGGA AftCCTCCTCG 3180
GAITCCATTG CCCAGCTATC TGTCACTTTA TTGTGAftGAT AGTGGAAAAG GAAGGTGGCT 3240
CCTACAAATG CCATCATTGC GATAAAGGAA AGGCCATCGT TGAAGATGCC TCTGCCGACA 3300
GTCGTCCCAA AGATGGACCC CCACCCACGA GGAGCATCGT GGAAAAAGAA GACGTTCCAA 3360
CCACGTCTTC AAAGCAAGTG GATTGATGTG ATGGTCCGAT GTGAGACTTT TCAACAAAGG 3420
GTAATATCCG GAAACCTCCT CGGATTCCAT TGCCCAGCTA TCTGTCACTT TATTGTGAAG 3480
ATAGTGGAAA AGGAAGGTGG CTCCTACAAA TCCCATCATT GCGATAAAGG AAAGGCCATC 3540
GTTGAAGATG CCTCTGCCGA CAGTGGTCCC AAAGATGGAC CCCCNZCCAC GAGGAGCATC 3600
GTGGAAAAAG AAGACGTTCC AACCACGTCT TCAAAGCAAG TGGATTGATG TGATATCTCC 3660
ACTGACGTAA GGGATGACGC ACAATCOCAC TATCCTTCGC AAGACCCTTC CTCTATATAA 3720
GGAAGTTCAT TTCATITGGA GAGGACACGC TGACAAGCTG ACTCTAGCAG ATCTCCATGG 3780
TCCGTCCTGT AGAAACCCCA ACCCGTGAAA TCAAAAAACT CGACGGCCTG TGGGCATTCA 3840
GTCIGGATCG CGAAAACTGT GGAATTGATC AGCGTIGGTG GGAAAGCGCG TTACAAGAAA 3900
GCCGGGCAAT TGCTGTGCCA GGCAGTTTTA ACGATCAGTT CGCCGATGCA GATATTCGTA 3960
ATTATGCGGG CAACGTCTCG TATCAGCGCG AAGTCTTTAT ACCGAAAGCT TGGGCAGGCC 4020
AGCGTATCGT GCTGCGTTTC GATGCGGTCA CTCATTACGG CAAAGTGTGG GTCAATAATC 4080
AGGAAGTGAT GGAGCATCAG GGCGGCTATA CGCCATTTGA AGCOGATGTC ACGCCGTATG 4140
TTATTGCCGG GAAAAGTGTA CGTATCACCG TTTGTGTGAA CAACGAACTG AACTGGCAGA 4200
CTATCCCGCC GGGAATGGTG ATTACCGACG AAAACGGCAA GAAAAAGCAG TCTTACTTCC 4260
ATGATTTCTT TAACTATGCC GGAATCCATC GCAGCCTAAT GCTCTACACC ACGCCGAACA 4320
CCTGGGTGGA CGATATCACC GTGCTGACGC ATGTCGCGCA AGACTGTAAC CACGCGTCTG 4380
TTGACTGGCA GGTOGTGGCC AATGCTGATG TCAGOGTTGA ACTOCGTGAT GCGGATCAAC 4440
AGGTGGTTGC AACTGGACAA GGCACTAGCG GGACTITGCA ACTGGTGAAT CCGCACCTCT 4500
GGCAACCGGG TGAAGCTTAT CTCTATGAAC TGTGCGTCAC AGCCAAAAGC CAGACAGAGT 4560
GTGATATCTA CCOGCTTCGC GTCGGCATCC GGTCACTGGC ACTGAAGGGC GAA.CACTTCC 4620
TGATTAACCA GAAACCCTTC TACTITACTG GCTTTGGTCG TCATGAAGAT GCGGACTTAC 4680
CTGGCAAAGG ATTCGATAAC CTGCTGATGG TGCACGACCA CGCATTAATG GACTGGATTG 4740
PL 197 872 B1
GGGCCAACTC CTACCGTCCT TCTCGTCATTA CCTTACCTTA CAGAGATGTrc CGATTGGTA 4800
ATGAACATGG CATCGTGGTG ATADGATATTAA CTTGTTGTTG CCGGCTTTAC CCTCTCTTTG 4860
GCATTGGTTT CGCCGCGCGC A/AATAAGCC. ACAGAACTCTT CCAGCGAAGA (GAGCCAT 4920
GGGAAACTCC GCAAGCGCAC TTTACAGGOG ATTACAłGACT CGATAGm' OACCAAACC 4980
ACTCCAGCGT GGTGATGTCG ACATiTATTTCC AACGACTGGA TΊrCC:T2Ί:TT (GTATXGGAA 5040
ATTTCGGCAT TTCGCTACTS GOGGAACCGT CTCCTTCCCT CCCGAZTCCGCCS CCGTrTAATA 5100
CCTGCGTCAC TTTCATGTTC TOZGCGAATTC CATACTGATA (TAATTA^TG^A' CTTCTTCAT 5160
TGTTGTGTTT GAACCGTTAT TAATGGATCT AATCTCCCCAr CiGGGAITTC CGAAACGSCCA^ 5220
AGAAGGTACT GGCAAAAGAC CTKTCTCGCC OGCAGGAGA CACTTATTA CCCAATAATA 5280
TTACCGAATA TGGCGTGGAT ACATCTTAGCC CGGCrGCATC CCAdTACAT OACAAOKKGr 5340
GTGAAGAGTA TCAGTCTCCC TGGCTTTGTA ATGTATCCACT (TJTCrTKGA CTGTGTTAGCG 5400
CCGTCGTTGG TGAAGAGCTA TOGAATO3 CCTGlATGTGC CGACTTCGCAr CGGCCAATGC 5460
GCGTTGGCGG TAACAAGAAA GOGGATCTTC CTTTGTGACCT CCAAACTGAAS CCTX3::T3CGTTC 5520
TTCTGCTGCC CAAACGCTGG ACTGGATCA AAnC-nTC CAAAACTGTA OAGGAKGA 5580
CACAATCAAT CAATAACTTT CCCTGGCGCA CATCTCTCGG TCACA:GTC[ΊG( CTCCGGCATT 5640
TGCGCTTGCT GGGGGCTCCT CTCTAGTTAGA CTTGTCTTITT3 TCATTAKTSGC TKTGATAAT 5700
TTCGTCAAGT TCAATGCATT ACAGTKGCICG CCGTATATAT TA3ArAΊCTΊA CTTAGTTCGA^ 5760
TATTATGGCC TTGGGAAAAC TOTTTTCTT CTTACTArTTT C’TGTGCm' CAATTTACTCI1 5820
GTTTTGTATT CGGTTTTCGT TATCTCGAAC GTGACATTGAA CATSGATTGAr· CAAGAGTITCAr 5880
GACTGCTATG GTCCTTTTGT TCATTCTOCA ΑΤΙ5ΑΤΑΊΤΑ ΤΙΊΟΙΊΊΤΓΓ CCTCCT^JkATTTi 5940
TTTTGTTTTG AATTGGAAAT TATATAAGAT AATGTACAAC CTTTGTTTTTGr C3TAACACT3C 6000
GTTAACTCGT GGCCTTTAAT GAACTGAAT TAnTATGAGA C?:TAAAACAT CTCTAGTTCA 6060
CTCTTCTGTT TATTCATTAG GCACATATA TAATTTCAAA CCTAGAAAA CCKTTCAAITC 6120
TATTGCCTAT CAGTATGTGC TCTTTCTIGT TTAGACAITTA CTGAATTTTT TTT^^/AAT 6180
TTTTCCGACT CTTTGTCAgC TTCTAATCT.CΊXCIΊTAAΊAr CTATAGITTT CCCTTA^KG^A' 6240
TTGTAGTTGA GTATGAAAAT ATTTTTTAAT GCAATITAAT CACTTGCCCACT TGATTCCCAA 6300
CATGTCTCCC TCGACCTGTC GCOCCCAGCT GZAGTTCAGA TTTAGCAKCA TTTTAGATTS 6360
PL 197 872 B1
| GGTTCAATCA | ACAAGGTACG | AGCCATATCA CTTTATTCAA ATTGGTATCG | CCAAAACCAA | 6420 |
| GAAGGAACTC | CCATCCTCAA | AGGTTTGTAA GGAAGAATTC TCA3TCCAAA | GCCTCAACAA | 6480 |
| GGTCAGGGTA | CAGAGTCTCC | AAACCATTAG CCAAAAGCTA CAGGAGATCA | atgaagaatc | 6540 |
| TTCAATCAAA | GTAAACTACT | GTTCCAGCAC ATGCATCATG GTCAGTAAGT | TTCAGAAAAA | 6600 |
| GACATCCACC | GAAGACTTAA | AGTTAGTGGG CATCTTTGAA A3TAATCTTC | TCAACATCA | 6660 |
| GCAGCTGGCT | TGTGGGGACC | AGACAAAAAA GGAATGGTGC AGAATIGTTA | GGCGCACCTA | 6720 |
| CCAAAAGCAT | CTTTGCCTTT | ATTGCAAAGA TAAAGCAGAT TCCTCTAGTA | CAAGTGGGGA | 6780 |
| ACAAAATAAC | GTGGAAAAGA | GCTCTCCTGA CAGCCCACTC ACTAAIGCGT | ATGACGAACG | 6840 |
| CAGTGACGAC | CACAAAAGAA | TTCCCTCTAT ATAAGAAGGC ATTCATTCCC | ATTTGAAGGA | 6900 |
| TCATCAGATA | CTGAACCAAT | CCTTCTAGAA GATCTCCACA ATGGCTTCCT | CTATGCTCTC | 6960 |
| TTCCGCTACT ATGGTTGCCT | CTCCGGCTCA GGCCACTATG GTCGCTCCTT | TCAACGGACT | 7020 | |
| TAAGTCCTCC | GCTGCCTTCC | CAGCCACCCG CAAGGCTAAC AACGACATTA | CTTCCATCAC | 7080 |
| AAGCAACGGC | GGAAGAGTTA | ACTGCATGCA GGTGTGGCCT CCGATTGGAA | AGAAGAAGTT | 7140 |
| TGAGACTCTC | TCTTACCTTC | CTGACCTTAC CGATTCCGGT GGTCGCGTCA | ACTGCATGCA | 7200 |
| GOCCATGGCT | GAGAACCACA | AGAAGGTTGG TATCGCTGGA GCTGGAATCG | 7260 | |
| CACTGCTTTG | ATGCTTCAAC | GTOGTGGATT CAAGGTTACC TTGATTGATC | CAAACCCACC | 7320 |
| AGGTCAAGGT | GCTTCTTTCG | GTAACGCTGG TTGCTTCAAC GGTTCCTCCG | TTGTTCCAAT | 7380 |
| GTCCATGCCA | GGAAACTTGA | CTAGCGTTCC AAAGTCGCTT CTTGACCCAA | TGGGTCCATT | 7440 |
| GTCCATCCGT | TTCAGCTACT | TTCCAACCAT CATGCCTTGG TTGATTCGTT | TCTTGCTTGC | 7500 |
| TGGAAGACCA AACAAGGTGA | AGGAGCAAGC TAAGGCACTC CGTAACCTCA | TCAAGTCCAC | 7560 | |
| TGTGCCTTTG | ATCAAGTCCT | TGGCTGAGGA GGCTGATGCT AGCCACCTTA | TCCGTCACGA | 7620 |
| AGGTCACCTT | ACCGTGTACC | GTGGAGAAGC AGACTTCGCC AAGGACCGTG | GAGGTTGGGA | 7680 |
| ACTTCGTCGT | CTCAACGGTG | TTCGTACTCA AATCCTCAGC GCTGATGCAT | TGCGTGATTT | 7740 |
| CGATCCTAAC | ΤΤ.ν/Κ.’11,Αυυ | CCTTTACCAA. GGGAATCCTT ATCGAAGAGA | ACGGTCACAC | 7800 |
| CATCAACCCA | CAAGGTCTCG | TGACTCTCTT GTTTCGTCGT TTCATCGCTA | ACGGTGGAGA | 7860 |
| GTTCGTGTCT | GCTCGTGTTA | TCGGATTCGA GACTGAAGGT CGTGCTCTCA | AGGGTATCAC | 7920 |
| CACCACCAAC | UiWiHmU | CTGTTGATGC AGCTGTTGTT GCAGCTGGTG | CACACTCCAA | 7980 |
| GTCTCTTGCT | AACTCCCTTG | GTGATGACAT CCCATTGGAT ACCGAACGTG | GATACCACAT | 8040 |
PL 197 872 Β1
CGTGATOGCC AACCCAGAAG CTGCTCCACG TATTCCAACT ACCGATGCTT CTGGAAAGTT
CCGGTCCAAA TTTGTTTACA TTGTGTCCAA ATTTCGGCTG ATTTGGACTT CCCTAGCTAT
GCCAACTAAG CTAATAAAAA ACATGAAACA ACAATTACAA ACTGTOGAGC ACACCTTCTA
CAAACTAGCT TAGATTTCTA TTGGAAGTTA CAAAACACTA AAACTACCAA TAGGATACTA
AATTAAACAT ATTAAACTAT TACTCCTCAA AAGCTTGTAC AATTTGCAGA AGAAATGATG
GTT3CCCAAA AGCTTCAAAG GGAACCTGCT GGGAAGCCTG CTGGGACGCT GGGGATGCTG
GCAGCAGCAT ACCTTGGCTT GAAOTACTCT TCTCTCATTG GTTTTGCITC CCTTGCCCAT
GTGGTCTTCA TATGGCCTCA TTACTTCCCA AGOGCTTCAA ATCAGTAGGT GGTGGCAACC
AAAAGCATCA AAAACATCTC CTAAAACTAG CTTATACAAC CGGATTACAT GAGCTTATAC
TAGCTTAACT CTTAAAGCAT GATTAACATA ATGATGTTTA AGGTGTCATT AAGTATTACT
AATCTTGCTT AAGTAGAGAT TAACATAGGA TTAGCCTAA.T CAAGTTGCTT AACTAAGGTT
TTAGAATAAA CCGAGCTAGT TAGGCTTAAG TAGAGATTAA CATAGGATTA GCCTAATCAA
GTTGCTTAAG TAAGGmTA GAATAAACCG AGCTAGTT (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 8418 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 5:
AAGCTTGAGC TCAGGATTTA GCAGCATTCC AGATTOGGTT CAATCAACAA GGTACGAGCC
ATATCACTTT ATTCAAAITG GTATCGCCAA AACCAAGAAG GAACTCCCAT CCTCAAAGCT
TTGTAAGGAA GAATTCTCAG TCCAAAOCCT* CAACAAGGTC AGGGTACAGA GTCTCCAAAC
CATTAGCCAA AAGCTACAGG AGATCAATGA AGAATCTTCA ATCAAAGTAA ACTACTGTTC
CAGCACATGC ATCATGCTCA GTAAGTTTCA GAAAAAGACA TCCACCGAAG ACTTAAAGTT
8100
8160
8220
8280
8340
8400
8460
8520
8580
8640
8700
8760
8798
120
180
240
300
PL 197 872 B1
AGTGGGCATC TTTGAAAGTA ATCTTGTCAA CATCGAGCAG CTGGCTTGTG GGGACCAGAC 360
AAAAAAGGAA TGGTGCAGAA TTCTTAGGCG CACCTACCAA AAGCATCTTT GCCTTTATTG 420
CAAAGATAAA GCAGATTCCT CTAGTACAAG TCGGGAACAA AATAACGTGG AAAAGAGCTG 480
TCCTGACAGC CCACTCACTA ATGCGTATGA CGAAOGCAGT GACGACCACA AAAGAATTCC 540
CTCTATATAA GAAGGCATTC ATTCCCATTT GAAGGATCAT CAGATACTGA ACCAATCCTT 600
CTAGAAGATC TAAGCTEATC GATAAGCTTG ATCTAATTCG AGGAAGATCA AAATTTTCAA 660
TCCCCATTCT TCGATTGCTT CAMTGAAGT TTCTCCGATG GOGCAńGTTA GCAGAATCTG 720
CAATGGTGTG CAGAACCCAT CTCTTATCTC CAATCTCTCG AAATCCAGTC AACGCAAATC 780
TCCCTTATCG GTTTCTCTGA AGACGCAGCA GCATCCAOGA GCTTATCCGA TTTCGTCGTC 840
GT3GGGATTG AAGAAGAGTG GGATGACGTT AATTGGCTCT GAGCTTCGTC CTCTTAAGGT 900
CATGTCTTCT GTTTCCACGG CGTGCATGCT TCACGGTGCA AGCAGCOGTC CAGCAACTGC 960
TCGTAAGTCC TCTGGTCTTT CTCGAACCCT CCGTATTCCA GGTGACAAGT CTATCTCCCA 1020
CAGGTCCTTC ATGTTTGGAG GTCTCGCTAG CGGTGAAACT CGTATCACCG GTCTTTTCGA 1080
AGGTGAAGAT GTTATCAACA CTGGTAAGGC TATGGAAGCT ATGGGT3CCA GAATCCGTAA 1140
GGAAGGTGAT ACTTGGATCA TTGATCGTCT TGGTAACGGT GGACTCCTT3 CTCCTGAGGC 1200
TCCTCTCGAT TTCGGTAACG CTGCAACTCG TTGCCGTTTG ACTATCGGTC TTGTTGCTCT 1260
TTACGA.TITC GATAGCACTT TCATTGCTCA CGCTTCTCTC ACTAAGCGTC CAATGGGTCG 1320
TGTGTTGAAC CGAGT,TCGCG AAATGGGTGT GGAAATGAAA TCTGAAGACG ATAATGGΓGT 1380
TCCAGTTACC TTGCGTGGAG CAAAAAGTGG AACGCCAATC ACCTACAGOG TACCTATGGC 1440
TTCGAGTCAA GTGAAGTCCG CTGTTCTGGT TGCTGGTCTC AACACCCCAG ATATCAGGAG 1500
TCTTATCGAG CCIAATCATGA CTCCrGACCA CACTGAAAAG ATGCTTCAAG GTTTTCCTGC 1560
TAACGTTAGG GTTGAGACTG ATGGTGAGGA TGTGGGTAGG ATCCGTGTTG AAGGTCGTGG 1620
IftAGCTCACC GGTCAAGTGA TIGATGTTCC AGGTGATCCA TCCΓCTAGTG GTΊTCCGATT 1680
AATTGCTGGG T,TGCTTATΓG CAGOTrCCGA CGICACCATC CTTAAGGTTT TAATAAAGGC 1740
AACCCGrACT OGTCTCATCT TGACTCrGCA GGAAATCGGT GCCGACATCG AAGTGATGAA 1800
GGGACATGΓT GCTGGTGGAG AAGACGTGGC TGACTTGCST ATTGGTTGTT CTACrTTGAA 1860
ΟΟΟΊΟΓΓΑΙΙΤ ATTGCAGAAA AGCATGGTCG TTCTATGATC GAlCGACTATC CAATTCTCGC 1920
TGTTAGAGCT AGATTCGCTG AAGATGGTAG CCTTATGAAC GATTTGAAAG AAC^C^GI^ 1980
PL 197 872 Β1
TAAGGAAAGC GACWTCTTT CTGCTOICGC AAACGGTCTC AAGCTCAAOG GTGTTGATTG 2040
CGATGAAGGT GAGACTICTC TCGTCGTGCG TGGTOGTCCT GAOGGTAAGG GTCTCGGTAA 2100
CGCTTCTGGA GCAGCTGTCG CTACCCACCT CGATCACOOT ATCGCTATGA GCTTCCTCGT 2160
TATGGGTCTC GTITCTGAAA ACCCTGTTAC TGTTGATGAT GCTACTATGA TCGCTACTAG 2220
CTTOCCAGAG TTCATGGATT TGATGGCIGG TCTTGGAGCT AAGATCGAAC TCTCCGACAC 2280
TAAGGCTGCT TGATGAGCTC AAGAATTCGA GCTCGCTACC GGATCCTCTA GCTAGAGCTT 2340
TCGTTCGTAT CATCGGtTTTC GACAACGTTC GTCAACTTCA ATGCATCAGT TTCATTGCGC 2400
ACACACCAGA ATCCTACTGA GTTCGAGEAT TATGGCATTG GGAAAACTCT TTTTCTTGTA 2460
CCATTTGTTG TGCTTGTAAT TCACTGTGTT TTTTATTCGG TTTTCGCTAT CGAACTGTGA 2520
AATGGAAATC GATGGAGAAG AGTTAATGAA TCATATGGTC CTTTTGTTCA TTCTCAAATT 2580
AATATTATTT GTTTTTTCTC TTATTTGTTG TCTGTTGAAT TTGAAATTAT AAGAGATATC 2640
CAAACATTTT GT1T1GAGTA AAAATGTGTC AAATOGTGGC CTCTAATGAC CGAAGTTAAT 2700
ATGAGGAGTA AAACACTTGT AGTTCTACCA TTATGCTTAT TCACTAGGCA ACAAATATAT 2760
TTTCAGACCT AGAAAAGCTC CAAATCTTAC TGAATACAAG TATGTCCTCT TCTCTTTTAG 2820
ACATITATGA ACTITCCTIT ATGTAATTTT CCAGAATCCT TCTCAGATTC TAATCATTGC 2880
ΊΤΓΑΤΑΆΤΤΑ TAGTTATACT CATCGATTTC TAGTTGAGTA TGAAAATATT TTTTAATGCA 2940
TTTTATGACT TGCCAATTGA TTGACAACAT GCATCAATCG ACCTGCAGCC ACTCGAAGCG 3000
GCCGOGTTCA AGCTTCTGCA GGTCCGATGT GAGACTTTTC AACAAAGGGT AATATCCGGA 3060
AACCTCCTCG GATTCCATTG CCCAGCTATC TCTCACTTTA TTGTGAAGAT AGTGGAAAAG 3120
GAAGGTGGCT CCTACAAATG CCATCATTGC GATAAAGGAA AGGCCATCGT TGAAGATGCC 3180
TCTGCCGACA GTGGTCCCAA AGATGGACCC CCACCCACGA GGAGCATCGT GGAAAAAGAA 3240
GACGTTCCAA CCACGTCTTC AAAGCAAGTC GATTGATGTG ATGGTCCGAT GTGAGACTTT 3300
TCAACAAAGG GTAATATCCG GAAACCTCCT CGGATTCCAT TGCCCAGCTA TCTCTCACTT 3360
TATTCTGAAG ATAGTGGAAA AGGAAGGTGG CTCCTACAAA TGCCATCATT GCGATAAAGG 3420
AAAGGCCATC GTTCAAGATC CCTCTGCCGA CAGTCGTCCC AAAGATGGAC OCCCACCCAC 3480
GAGGAGCATC CTGGAAAAAG AAGACGTTCC AACCACGTCT TCAAAGCAAG TGGATIGATG 3540
TGATATCTCC ACTGACGTAA GGGATCACGC ACAATCCCAC TATCCTTCGC AAGACCCTTC 3600
PL 197 872 Β1
CTCTATATAA GGAAGTTCAT TTCATTTGGA GAGGACACGC TGACAAGCTG ACTCTAGCAG 3660
ATCTCCATGG TCCGTOCTGT AGAAACCCCA ACCCGTGAAA TCAAAAAACT CGAOG3CCTG 3720
TGGGCATTCA CTCTGGATCG CGAAAACTGT GGAATTGATC AGCCTTGCTG GGAAAGCGCG 3780
TTACAAGAAA GCCGGGCAAT TGCTGTGCCA GGCAGTITTA ACGATCAGTT CGCCGATGCA 3840
GATATTCGTA ATTATGCGGG CAACGTCTGG TATCAGOGCG AAGTCTTTAT ACCGAAAGGT 3900
TGGGCAGGCC AGCGTATCGT GCTGCGTTTC GATGCGCTCA CTCATTACGG CAAAGTCTGG 3960
GTCAATAATC AGGAAGTGAT GGAGCATCAG GGOGGCTATA CGCCATTTGA AGCCGATGTC 4020
ACGCCGTATG TTATTGCCGG GAAAAGfICTA CCTATCACCG TTTGTGTGAA CAACGAACTG 4080
AACTGGCAGA CTATCCOGCC GGGAATGGTG ATTACCGAOG AAAAOGGCAA GAAAAAGCAG 4140
TCTTACTTCC ATCATTICTT TAACTATGCC GGAATCCATC GCAGCCTAAT GCTCTACACC 4200
ACGCCGAACA CCTGGGTGGA OGATATCACC GTGGTGAOGC ATGTCGCGCA AGACTGTAAC 4260
CACGOGTCTG TTGACTGGCA GGTGGTGGCC AATGGTGATG TCAGCGTTGA ACT3CGTGAT 4320
GCGGATCAAC AOGTGGTTGC AACTGGACAA GGCACTAGCG GGACTITGCA AGTOGTGAAT 4380
CCGCACCTCT GGCAACOGGG TGAAGGTTAT CTCTATGAAC TCTGCCTCAC AGCCAAAAGC 4440
CAGACAGAGT GTGATATCTA (CTOGCTTCGC GTCGGCATCC GGTCAGTGGC ACTGAAGGGC 4500
GAACAGTTCC TGATTAACCA CAAACCGTTC TACTITACT3 GCTTTGGTCG TCATGAAGAT 4560
GCGGACTTAC CTGGCAAAGG ATTOGATAAC GTGCTGATGG TGCACGACCA CGCATTAATG 4620
GACTGGATTG GGGCCAACTC CTACCGTACC TCGCATTACC CTTACGCTGA AGAGATGCTC 4680
GACTGGGCAG ATGAACATGG CAICGTGGTG ATIGATGAAA CTGCTGCTGT CGGCTTTAAC 4740
CTCTCTITAG GCATTGCTTT CGAAGCGGGC AACAAGCCGA AAGAACTGTA CAGCGAAGAG 4800
GCAGTCAACG GGGAAACTCA GCAAGCGCAC TTACAGGCGA TTAAAGAGCT GATAGCGCGT 4860
GACAAAAACC ACCCAAGCCT GGTGATCTGG ACTATTGCCA ACGAACCGGA TACCCGTCCT 4920
GCACGGGAAT ATTTCGGCAT TTCGCCACTG GCGGAAGCAA CGCOTAAACT CGACCCGACG 4980
CGTCCGATCA CCTGCGTCAA TGTAATGTTC TGCGACGCTC ACACCGATAC CATCAGOGAT 5040
CTCTTTGATG TGCTGTGCCT GAACCGTTAT TACGGATGGT ATGTCCAAAG CGGCGATTTG 5100
GAAACGGCAG AGAAGGTACT GGAAAAAGAA CTTCTGGCCT GGCAGGAGAA ACTGCATCAG 5160
CCGATTATCA TCACCGAATA CGGOGTGGAT ACGTTAGCCG GGCTGCACTC AATGTACACC 5220
GACATGT3GA GTGAAGACTA TGACTCTGCA TGGCTGGATA TGTATCACCG CGTCTTTGAT 5280
PL 197 872 B1
CGCGTCAGCG CCGTCGTCGG TGAACAGGTA TGGAATTTCG CCCCIATTGC GACCTCGCAA 5340
GGCATATTGC GCGTTGGCGG CAATAACAAA GGGACCTTCA CITTCCCCAT GCAAACCCAA 5400
TCGGCGGCTT TTCTCCCCCA AAAATCTTGG 700^^^ AAkAACCCGCA 5450
TAGGGAGCTA AATAATCAAC TAACAATTTC TTCGGCCTAT CATCCTC'TTC TCATGCTTCC 5520
CTGGGGAATT TGAGTTTGTT TCGGGACTCC TΓAGCCAGAG C^TCTTTGΌT CAACC.TCTGG 5580
TTTCATAACC TTTCCTAAGT TTAACGTATC AGCTTCA!ΓTG CCTCTATATC TCCATTCTCC 5640
CGACΓTTGAC CATCACTCCA 'ITGGCAAAAC CCTCTTCTΓT OTCTACTATT} ΊTTCCGTCCG 5700
AACTCACΓCC TGGCTTTTCT TATTCAACCG TtCGAAATCC^ AACTCTTGGG 5760
AACACΓTAAT CAATGACACG CCTCTΓTTCT TTA,TCTTCAA ΑΤΚΓΙΓΑΊΤΑ TCC'TΊTCTTT? 5820
TΓT'ΓTATTΓC TT7?ΓTCTCTG AA,TΓTCAAAC CACAAGACAC A,ATCCAA3TI, CTTTCCTTTG 5880
CCAAAAACTC CΓTAAACTGT CGCTCTCAAC CATCGAAGTC AATATCTGAGG GCCAAACTCT 5940
TTCACTTTTA TTATTATCCC TATTCATCAC GTAACAAACA TAΆTTCCTAC CCTCGCAAAA 6000
CTTTAAACGT CATTCAATAC AAGCATGTTT CTΓTGTTCCC T,CGAT[ΊT,A ATGACCTT'TC 6060
TTCATCCAAT TCTCTAGAAC CTΓTGTTACA TCCΓAACTAC ΊKTTTTTCΓAA ΊTAACGCCAT 6120
ATTTATGGAC TTCCACCTCA CTACGAAAAT ATTTCCCAAC GCCTACTCTR3 CCCCCCTTAT 6180
TCATTCATAA TA,CCTACCAA TCGACTCCCA CCTCAAGC,CT G/GACTCCACC ATTCGGTG3T 6240
TTTTACATTC CGTTCAA'ΓTA ATAAGGCATC AGTTACATTA CT:CTCACCT\ ATTCCCATTC 6300
TTAAAATCAA CAAGCAATC,C TTATTCCTAA ACCTTTGCAA «GGAAGATC CCCAGCCAAA 6360
CCCC,TAATAA CGCTAGGGCA TACAGΓT,ΓTT AAACTATCAC C<CTAAAAGA CTGCCAGTTA 6420
ACGAACAATC TTTAA,CTAAA CCAAATCACC CTTTCAGTAT AT(CCTATTA3 CCTTACCAAC 6480
TTTAGAAAAA CATATCTATT CAACATCITAA ACCTAGCTCG CAΆTTCTTCA AACTAACTCT 6540
TTAACACTCA QTACTTCGTC lΓCΓGCGGATT AGACAAAAAA GCGCAKTGGCC JAGA^TTTG:TA 6600
CGTCTATCCA CCAAAAGCAT TCCTCTCCTC ACTCTAAAiCA T^UWAACTACΓ. ^CTTCTCGGA 6660
TAAGCCGGGA ACAAAACAAT GCCGAAAACA CCCGTTCCGA 0^X50: TACCAACCTTC 6720
ATCATGAACC TAGTCACGAC CACAAAACaAA TTTCTTTCAC ATAuAACAAGC AΊCCTTCTTT 6780
ATTTCAAGGA TTATTACACA CTCAATTAAT TTCTTCACAA GATCTCCACA AΊCGGTΓC:CT[' 6840
CTAΊCT'ΓTΓT TTTTCTCACC ACGCTCGTCΓ TCTCGGTCCA GίGGCTATTA3 TCTC:CCICTTT1? 6900
PL 197 872 Β1
TCAACGGACT TAAGTCCTCC GCTGCCTTCC CAGCCACCCG CAAGGCTAAC AACGACATTA 6960
CITCCATCAC AAGCAACGGC GGAAGAGTTA ACTGCATGCA GGTGTGGCCT CCGATTGGAA 7020
AGAAGAAGTT TGAGACTCTC TCTTACCTTC CTGACCTTAC CGATTCCGGT GGTCGCGTCA 7080
ACTGCATGCA GGCCATGGCT GAGAACCACA AGAAGGTTCG TATCGCT3GA GCTOGAATCG 7140
TTGGTGTITG CACTGCTTIG ATGCTTCAAC GTCGTGGATT CAAGGTTACC TTGATTGATC 7200
CAAACCCACC AGCTGAAGGT GCTTCTTTCG GTAACGCTGG TTGCTTCAAC GGTTCCTCCG 7260
TTGTTCCAAT GTCCATGCCA OGAAACTTGA CTAGCGTTCC AAAGTGGCTT CTIGACCCAA 7320
TGGGTCCATT GTCCATCCGT TTCAGCTACT ITCCAAOCAT CATGCCTTGG TTGATTCGIT 7380
TCITGCTTGC TGGAAGACCA AACAAGGTGA AGGAGCAAGC TAAGGCACTC CGTAACCTCA 7440
TCAAGTCCAC TGTGCCTTTG ATCAAGTOCT TGGCTGAGGA GGCTGATGCT AGCCACCTTA 7500
TCCGTCACGA AGGTCACCIT ACCGTGTACC GTGGAGAAGC AGACTTCGCC AAGGACCGTG 7560
GAGGTTGGGA ACTTCGTCGT CTCAACGGTG TTCGTACTCA AATCCTCAGC GCTGATGCAT 7620
TGCGTGATTT CGATCCTAAC TTGTCTCACG CCTTTACCAA GGGAATCCTT ATCGAAGAGA 7680
ACGGTCACAC CATCAACCCA CAAGGTCTOG TGACTCTCTT GTTTCGTCGT TTCATCGCTA 7740
ACGGTGGAGA GTTCGTGTCT GCTCGTGTTA TCGGATTOGA GACTGAAGGT CGTGCTCTCA 7800
AGGGTATCAC CACCACCAAC GGTGTTCTTG CTGTTGATGC AGCTGTT3IT GCAGCTGGTG 7860
CACACTCCAA GTCTCTTGCT AACTCCCTTG GTGATGACAT CCCATTGGAT ACCGAACGTG 7920
GATACCACAT CGTGATOGCC AACCCAGAAG CTGCTCCACG TAITCCAACT ACCGATGCTT 7980
CTGGAAAGTT CATCGCTACT CCTATGGAGA TGGGTCTTCG TGTTGCTGGA ACCGTTGAGT 8040
TCGCTGGTCT CACTGCTGCT CCTAACTGGA AGCGTGCTCA CGTTCTCTAC ACTCACGCTC 8100
GTAAGTTGCT TCCAGCTCTC GCTCCTGCCA GTTCTGAAGA ACGTTACTCC AAGTGGATGG 8160
GTTTCCGTCC AAGCATCCCA GATTCCCITC CAGTGAITGG TCGTGCTACC CGTACTCCAG 8220
ACGTTATCTA CGCTTTCGGT CACGGTCACC TOGGTATGAC TCGTCCTCCA ATGACCGCAA 8280
CCCTCGTTTC TGAGCTCCTC GCAGGTGAGA AGACCTCTAT OGACATCTCT CCATTCGCAC 8340
CAAACCGTTT CGGTATTGGT AAGTCCAAGC AAACTGGTCC TCCATCCTAA GTGGGAATTC 8400
GAGCTCGGTA CCGGATCC 8418
PL 197 872 B1 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasadowych (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 6: CACCGCTCTT TTGGAAGGTG AAG (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasadowych (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) SPLOT: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 7: aacgagaccc ATAACGAGGA AGC (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE
PL 197 872 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 8:
aaacagtccc GTGCATOCCC AAC (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 9: gaogctctcc ttgattctgt ccc (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 10:
CAAGAAGGTT GGTATCGCTG 20 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedyńczy (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) ' RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE
PL 197 872 B1 (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 11:
TCTTTTGTGG TCGTCACTGC GIT (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedyńczy (d) TOPOLOGIA: liniowa ' (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 12: GCGAGCTCTA ATACGACTCA CTAT (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 13:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) SPLOT: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 13: CGCGAGCTCA ATTAACCCTC ACT (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 14:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasadowych (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) SPLOT: pojedyńczy (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa)
PL 197 872 Β1 (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 14:
TCTGTACCCT GACCTTGITG 20 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ED NR: 15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 15:
CGTGGATACC ACATCGTGAT 20 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 16:
ACCTTOGCTT GAAGTACTC 19 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 17:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: liniowa
PL 197 872 B1 (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 17:
TCAACCTACA GCTGATTTGG ACC 23 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 18:
GGACCGGAAC GACAATCTTGA TC 22 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 19:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 19:
CTAGGGAAGT CCAAATCAGC CG 22 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 20:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasadowych (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedyńczy
PL 197 872 B1 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 20;
TTTGGACCGG AACTTTCCAG AAG 23 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 21:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE <ci) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 21:
CTAACTTGCG CCATCGGAGA AAC 23 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 22:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 22:
GACTTGTCAC CTGGAATACG GAC 23
PL 197 872 Β1 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 23:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 23:
ATTCTTGAGC TCATCAAGCA GCC 23 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 24:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 24:
AAG3TTGGTA TCGCTGGAGC TG 22 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 25:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE
PL 197 872 Β1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 25:
TCTCCACAAT GGCTTCCTCT ATG 23 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 26:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 671 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) , (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 26:
CAAGATGGAT TGCAOGCAGG TTCTCCGGCC GCTTGGGTGG AGAGGCTATT OGGCTATGAC 60
TGGGCACAAC AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCOGTGT TCCGGCTGTC AGCGCAGGGG 120
CGCCCGGTTC TTTTTGTCAA GACCGACCTG TCCOGTGCOC TGAATGAACT GCAGGAOGAG 180
GCAGCGCGGC TATCGTGGCT GGCCACGAOG GGCGTTCCTT GCGCAGCTGT GCTCGACGTT 240
GTCACTGAAG CGGGAAGGGA CTGGCTGCTA TTGGGCGAAG TGCCGGGGCA GGATCTCCTG 300
TCATCTCACC TTGCTCCTGC CGAGAAAGTA TCCATCATGG CTGATGCAAT GCGGCGGCTG 360
CATACGCTTG ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCAOCAAG CGAAACATCG CATCGAGCGA 420
GCACGTACTC GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG ATCTGGACGA AGAGCATCAG 480
GGGCTCGCGC CAGCCGAACT GTTCGCCAGG CTCAAGGCGC GCATGCCCGA CGGCGAGGAT 540
CTCGTCGTGA CCCATGGOGA TGCCTGCTTG CCGAATATCA TGGTGGAAAA TGGCCGCTIT 600
TCTGGATTCA TCGACTGTGG CCGGCTGGGT CTGGCGGACC GCTATCAGGA CATAGCGTTG 660
GCTACCCGTG A 671 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 27:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 739 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa)
PL 197 872 B1 (iii) . HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 27:
GGACCGGAAC GACAATCTGA TCCCCATCAA GCTTGAGCTC ACGSflTTAGe AGCTTCXCA3 60
ATTGGGTTCA ATCAACAAGG TACGAGCCAT ATCACTTTAT ΊCAAAACCee ATICGCCAAAA 120
CCAAGAAGGA ACTCCCATCC TCAAAGGTTT GTAAGeAAGA AATCTCAAGC ACAAAGCCKCA 180
ACAAeGTCAe GGCACAeAeC CCAAAAACAA CTAGCAAAAA GGACAA£GGA 240
AACATCAAAC CAAAeTAAAA CAATGTTCAA GCACATGCAT CAACeeCAAG AAAeCCTAAGA 300
AAAAeACACA CAAAGAAeAA TTAAAGCCAe CeeGAATACT ΊCeAAGGCAA' AΓTTeCAAAAA 360
CAeAGAAGAC GeCCCeCGGG GAAAAeAAAA AAAAGGAATe ¢eceCAeAAC' ATCAGeAeA 420
CCTACCAAAA GCACACTTeA CTCCATTeAA AAeATAAAGA AGGACTAAC^ AAGCAAAAeT3 480
GGGAACAAAA TAACGTGGAA AAeAeCCeCA CCeAAAGACA ACCCAAACAA’ AeAeCACeAA 540
AAAeCAGCeA CeACAAAAAA AGAACTACCC CCACACAAeA JAeeAACCAA ACACAACTCG 600
AGGACAATAA GATACCeAAA CAACACCTAC AeAAeACACA 7AGA’CCATGe ACAAeACCGAΓ 660
GCAACCGGAe GAAGACAAAA ACC'CCAAACA CCAATTATTA GeΊCCeCCCA A,:CTeAAGTT’ 720
CCACeACGeA GAAAGCTAG 739
Claims (20)
- Zastrzeżenia patentowe1. Roślina buraka cukrowego oraz jej rośliny potomne wyrażające aktywność enzymu cp4/epsps, znamienne tym, że zawierają w swoim genomie fragment DNA, który zastosowany jako matryca w reakcji PCR daje z parą oiigonukieotydowych primerów charakteryzujących się sekwencjami SEQ ID NO:18 i SEQ ID NO:21 ampiifikację fragmentu 739 bp.
- 2. Roślinaweełuuzzstrz. 1 ,zznmieenntym, ż ż cczęćjej g geomu tworzzDDA echraktee/yzjący się sekwencją nukieotydową SEQ ID NO:27
- 3. Roślinaweełuuzzsrrz. 1 , zznm^^ennaymi, ż ż amuli1ϊkaajaPPR z jej ggeamuo/em DNN jato matrycą daje z parą nukieotydowych primerów charakteryzujących się sekwencjami SEQ ID n0:20 i SeQ ID nO:24 ampiifikację fragmentu 834 bp.
- 4. Roślinaweełuuzzsrrz.1 zznmieenntym, żż amuli1ϊkasjaPPR z z ee ggeamuo/em ODN A ato matrycą daje z parą nukieotydowych primerów charakteryzujących się sekwencjami SEQ ID NO: 17 i SeQ ID nO:22 ampiifikację fragmentu 1057 bp.
- 5. Roślinaweełuuzzsrrz. 1 1 zznm^^ennaymi, ż ż amuli1ϊkaajaPPR z z ej ggeamuo/em DDN Aato matrycą daje z parą oiigonukieotydowych primerów charakteryzujących się sekwencjami SEQ ID NO:19 i SeQ ID NO:25 ampiifikację fragmentu 1224 bp.
- 6. Roślinaweeług zzatrZz 1 .zznmieenntym, ż ż cczśćjej jgeno^m twerzzDNA charaktee/zzjący się sekwencją nukieotydową SEQ ID NO:1.
- 7. Roślinaweeługzzsrrz. 6,zzna^^^ennayyi, żż s eeweeajannUleetydoo/eSEQ ID NN:1 zza^ puje wysoce repetytywne sekwencje DNA.
- 8. Roślinaweeługzasrrz.6, zznmieenntym, żż ccęęći ggeno^m bbezośreeniopołąccośaz s ee kwencją nukieotydową SEQ ID NO:1 mają sekwencje nukieotydowe SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:3.
- 9. Roślinaweeługzęstrz. 7 ,zznai^^ennaymi, żżcczęijej j geamutwerzęDNA mmjącys eeweecję nukieotydową SEQ ID NO:4.PL 197 872 B1
- 10. Transgeniczne nasiona rośliny buraka cukrowego wyrażające aktywność enzymu cp4/epsps, znamienne tym, że zawierają w swoim genomie fragment DNA, który zastosowany jako matryca w reakcji PCR daje z parą oligonukleotydowych primerów charakteryzujących się sekwencjami SEQ ID NO:18 i SEQ ID NO:21 amplifikację fragmentu 739 bp.
- 11. Transggniccne nasiona weełuu zzstrz. 10, zznmieenn tym, żż cczść i ch ggnomu tworzz DNA mający się sekwencję nukleotydową SEQ ID NO:27.
- 12. Trasaggniccnanasiona weeług zzstrz. W, zznmieenntym, żż zzwierająw sweirτl ggnamie fragment DNA, który zastosowany jako matryca w reakcji PCR daje z parą oligonukleotydowych primerów charakteryzujących się sekwencjami SEQ ID NO:20 i SEQ ID NO:24 amplifikację fragmentu 834 bp.
- 13. Trasaggniccnanasiona weeług zzstrz. W, zznaiieenneym. żż zawierająw sweirτl ggnamie fragment DNA, który zastosowany jako matryca w reakcji PCR daje z parą oligonukleotydowych primerów charakteryzujących się sekwencjami SEQ ID NO:17 i SEQ ID NO:22 amplifikację fragmentu 1057 bp.
- 14. Trzsaggniccnanasiona weeług zza^ W, zznaiieenneym. żż zawierająw sweirτl ggnamie fragment DNA, który zastosowany jako matryca w reakcji PCR daje z parą oligonukleotydowych primerów charakteryzujących się sekwencjami SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:25 amplifikację fragmentu 1224 bp.
- 15. Trzsaggniccna nasiona weeług zzsSz. W, zznmieenn tym, żż cczśś i cłi gg^m^ 1werzz DNA charakteryzujący się sekwencją nukleotydową SEQ ID NO:1.
- 16. Tranageniczne nasiona według zastrz. 15, znamienne tym, że sekwencją nukleotydowa SEQ ID NO:1 zastępuje wysoce repetytywne sekwencje DNA.
- 17. Trzsaggniccna nasiona weeługzzstrtr. 11, z znmieenntym. żż cczęśi ggnanίlu bbezpóreenio połączone z sekwencją nukleotydowa SEQ ID NO:1 mają sekwencje nukleotydowe SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:3.
- 18. Trzsaggniccna nasiona weeług zzwsz. 11, zznmieenn tym, żż cczśś i cti ggnamu 1werzz DNA mający sekwencję nukleotydowa SEQ ID NO:4.
- 19. Sposób wytwarzania transgenicznych roślin jak zdefiniowano w zastrz. 1, znaiienny tyi, że (a) prowadzi się transformację in vitro liścieni buraka cukrowego Agrobacterium niosącym wektor zawierający fragment DNA kodujący cp4/epsps, (b) regeneruje się transformowane pędy w obecności glifosanu, (c) przenosi się pędy do gleby w szklarni, (d) traktuje się roślinki glifosanem, (e) ocenia się wizualnie bujność transgenicznych roślin i chlorozę liści, (g) wybiera się transgeniczne rośliny z oceną 9, określającą bujność transgenicznych roślin i chlorozę liści oraz (h) namnaża się wybrane rośliny stosując konwencjonalne techniki namnażania.2,. Sppngóweeługznstrz. 11,zznmieenytym, żż t rzsatormuają crowead.sięz użżyiem wentora zawierającego fragment DNA mający sekwencję nukleotydową określoną jako SEQ ID NO:5,
- 21. Sppogó weełuż zzsSz. 11, cznmieeny tym, żż cnzegnarzwesa ppś- asalizują cię za ppmocą PCR pod kątem obecności DNA kodującego cp4/epsps.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11200397P | 1997-10-31 | 1997-10-31 | |
| PCT/EP1998/006859 WO1999023232A1 (en) | 1997-10-31 | 1998-10-29 | Glyphosate resistant transgenic plants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL334135A1 PL334135A1 (en) | 2000-02-14 |
| PL197872B1 true PL197872B1 (pl) | 2008-05-30 |
Family
ID=22341613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL334135A PL197872B1 (pl) | 1997-10-31 | 1998-10-29 | Roślina buraka cukrowego wyrażająca aktywność enzymu cp4/epsps oraz jej rośliny potomne, transgeniczne nasiona rośliny buraka cukrowego wyrażające aktywność enzymu cp4/epsps oraz sposób wytwarzania transgenicznych roślin |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6204436B1 (pl) |
| EP (1) | EP0950109A1 (pl) |
| JP (1) | JP2001503280A (pl) |
| CN (1) | CN1148453C (pl) |
| AU (1) | AU1558099A (pl) |
| CA (1) | CA2279258A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ300208B6 (pl) |
| DE (1) | DE19881833B4 (pl) |
| DK (1) | DK199900916A (pl) |
| FI (1) | FI991221A0 (pl) |
| GB (1) | GB2337263A (pl) |
| HK (1) | HK1025360A1 (pl) |
| HU (1) | HUP0001729A3 (pl) |
| PL (1) | PL197872B1 (pl) |
| RU (1) | RU2224024C2 (pl) |
| SE (1) | SE520353C2 (pl) |
| SK (1) | SK88599A3 (pl) |
| TR (1) | TR199901515T1 (pl) |
| UA (1) | UA85364C2 (pl) |
| WO (1) | WO1999023232A1 (pl) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5633435A (en) | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| US6204436B1 (en) * | 1997-10-31 | 2001-03-20 | Novartis Ag | Transgenic plants |
| US6489542B1 (en) | 1998-11-04 | 2002-12-03 | Monsanto Technology Llc | Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids |
| PE20010635A1 (es) | 1999-10-08 | 2001-08-15 | Smithkline Beecham Corp | Inhibidores de fab i utiles para el tratamiento de infecciones bacterianas |
| DK1235921T3 (da) * | 1999-12-07 | 2007-04-23 | Monsanto Technology Llc | Regenerering og transformering af sukkerroer |
| JP5111706B2 (ja) | 1999-12-16 | 2013-01-09 | モンサント テクノロジー エルエルシー | 植物における異種ポリペプチドの発現のためのｄｎａ構築物 |
| US7105718B2 (en) | 2000-03-31 | 2006-09-12 | The Regents Of The University Of Colorado | Compositions and methods for regulating metabolism in plants |
| AU1536302A (en) | 2000-10-25 | 2002-05-06 | Monsanto Technology Llc | Cotton event pv-ghgt07(1445) and compositions and methods for detection thereof |
| EP1417318B1 (en) | 2000-10-30 | 2011-05-11 | Monsanto Technology LLC | Canola event pv-bngt04(rt73) and compositions and methods for detection thereof |
| AU2002218413A1 (en) | 2000-11-30 | 2002-06-11 | Ses Europe N.V. | Glyphosate resistant transgenic sugar beet characterised by a specific transgene insertion (t227-1), methods and primers for the detection of said insertion |
| CA2442250A1 (en) * | 2001-03-27 | 2002-10-03 | Syngenta Seeds, Inc. | Uses of white corn hybrids |
| ES2320984T3 (es) * | 2001-04-06 | 2009-06-01 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Inhibidores de fab i. |
| EG26529A (en) * | 2001-06-11 | 2014-01-27 | مونسانتو تكنولوجى ل ل سى | Prefixes for detection of DNA molecule in cotton plant MON15985 which gives resistance to damage caused by insect of squamous lepidoptera |
| US7615678B2 (en) * | 2002-07-18 | 2009-11-10 | Monsanto Technology Llc | Methods for using artificial polynucleotides and compositions thereof to reduce transgene silencing |
| ES2518316T3 (es) | 2002-12-06 | 2014-11-05 | Debiopharm International Sa | Compuestos heterocíclicos, métodos de fabricación de los mismos y su uso en terapia |
| DK2267136T3 (da) | 2003-01-31 | 2013-11-04 | Monsanto Technology Llc | Glyphosattolerante lucerne-begivenheder og fremgangsmåder til detektering deraf |
| ATE553203T1 (de) | 2003-02-12 | 2012-04-15 | Monsanto Technology Llc | Baumwolle ereignis mon 88913 und verbindungen und methoden zur detektion davon |
| EP1597373B1 (de) * | 2003-02-20 | 2012-07-18 | KWS Saat AG | Glyphosat-tolerante Zuckerrübe |
| US7335816B2 (en) * | 2003-02-28 | 2008-02-26 | Kws Saat Ag | Glyphosate tolerant sugar beet |
| CA2519429C (en) * | 2003-03-17 | 2013-08-06 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Pharmaceutical compositions comprising inhibitors of fab i and further antibiotics |
| WO2005059103A2 (en) | 2003-12-15 | 2005-06-30 | Monsanto Technology Llc | Corn plant mon88017 and compositions and methods for detection thereof |
| ES2515101T3 (es) | 2004-06-04 | 2014-10-29 | Debiopharm International Sa | Derivados de acrilamida como agentes antibióticos |
| US20090209427A1 (en) * | 2004-06-24 | 2009-08-20 | Alibhai Murtaza F | Microbial glyphosate resistant epsps |
| DE102004057291C5 (de) * | 2004-11-26 | 2010-08-26 | Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt | Lagerungsinduzierte Promotoren |
| AP2693A (en) | 2005-05-27 | 2013-07-16 | Monsanto Technology Llc | Soybean event MON89788 and methods for detection thereof |
| KR20080075027A (ko) * | 2005-12-05 | 2008-08-13 | 아피늄 파마슈티컬스, 인크. | Ｆａｂｉ 억제제 및 항박테리아제로서의헤테로시클릴아크릴아미드 화합물 |
| EP1984390A2 (en) * | 2006-01-23 | 2008-10-29 | Board of Trustees of Michigan State University | Methods for breeding glyphosate resistant plants and compositions thereof |
| CA2647270A1 (en) * | 2006-03-27 | 2007-10-04 | Monsanto Technology Llc | Methods of producing and using cold temperature tolerant plants, seeds, and crops |
| EA022829B1 (ru) | 2006-05-26 | 2016-03-31 | Монсанто Текнолоджи, Ллс | Трансгенное растение или его часть, обладающие устойчивостью к насекомым отряда lepidoptera |
| EP2054422B1 (en) | 2006-07-20 | 2017-06-14 | Debiopharm International SA | Acrylamide derivatives as fab i inhibitors |
| US8263613B2 (en) * | 2007-02-16 | 2012-09-11 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Salts, prodrugs and polymorphs of fab I inhibitors |
| US10555527B2 (en) | 2009-05-18 | 2020-02-11 | Monsanto Technology Llc | Use of glyphosate for disease suppression and yield enhancement in soybean |
| NZ702695A (en) | 2012-06-19 | 2015-10-30 | Debiopharm Int Sa | Prodrug derivatives of (e)-n-methyl-n-((3-methylbenzofuran-2-yl)methyl)-3-(7-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin-3-yl)acrylamide |
| CN103695446B (zh) * | 2013-01-31 | 2016-08-03 | 北京未名凯拓作物设计中心有限公司 | 一种来源于恶臭假单胞菌的epsp合酶基因及其应用 |
| US10751351B2 (en) | 2016-02-26 | 2020-08-25 | Debiopharm International S.A. | Medicament for treatment of diabetic foot infections |
| DE102016106656A1 (de) | 2016-04-12 | 2017-10-12 | Kws Saat Se | Kernkodierte männliche Sterilität durch Mutation in Cytochrom P450 Oxidase |
| DE102016015741A1 (de) | 2016-04-12 | 2017-11-30 | Kws Saat Se | Kernkodierte männliche Sterilität durch Mutation in Cytochrom P450 Oxidase |
| CN107164514A (zh) * | 2017-06-22 | 2017-09-15 | 中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局 | 转基因甜菜gtsb77品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒 |
| EP3628738A1 (en) * | 2018-09-25 | 2020-04-01 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Method for controlling weed beets and other weeds |
| EP3628160A1 (en) | 2018-09-25 | 2020-04-01 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Use of glyphosate herbicide for controlling unwanted vegetation in beta vulgaris growing areas |
| CN111118055A (zh) * | 2020-01-03 | 2020-05-08 | 鲁东大学 | 高糖品种甜菜转基因体系的建立方法 |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4535060A (en) | 1983-01-05 | 1985-08-13 | Calgene, Inc. | Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use |
| US5094945A (en) | 1983-01-05 | 1992-03-10 | Calgene, Inc. | Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use |
| EP0218571B1 (en) * | 1985-08-07 | 1993-02-03 | Monsanto Company | Glyphosate-resistant plants |
| US4940835A (en) | 1985-10-29 | 1990-07-10 | Monsanto Company | Glyphosate-resistant plants |
| US5145783A (en) | 1987-05-26 | 1992-09-08 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-endolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase |
| US4971908A (en) | 1987-05-26 | 1990-11-20 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase |
| US5312910A (en) | 1987-05-26 | 1994-05-17 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase |
| US5550318A (en) | 1990-04-17 | 1996-08-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US7705215B1 (en) | 1990-04-17 | 2010-04-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| WO1991010725A1 (en) | 1990-01-22 | 1991-07-25 | Dekalb Plant Genetics | Fertile transgenic corn plants |
| US5484956A (en) | 1990-01-22 | 1996-01-16 | Dekalb Genetics Corporation | Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin |
| EP0536330B1 (en) | 1990-06-25 | 2002-02-27 | Monsanto Technology LLC | Glyphosate tolerant plants |
| US5633435A (en) | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| FR2673643B1 (fr) | 1991-03-05 | 1993-05-21 | Rhone Poulenc Agrochimie | Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide. |
| US5631152A (en) | 1994-10-26 | 1997-05-20 | Monsanto Company | Rapid and efficient regeneration of transgenic plants |
| CA2249332C (en) * | 1996-03-29 | 2006-10-10 | Monsanto Europe S.A. | New use of n-(phosphonomethyl)glycine and derivatives thereof |
| US5859348A (en) | 1996-07-17 | 1999-01-12 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Imidazolinone and sulfonyl urea herbicide resistant sugar beet plants |
| US6376754B1 (en) | 1997-03-07 | 2002-04-23 | Asgrow Seed Company | Plants having resistance to multiple herbicides and its use |
| CA2888685C (en) | 1997-04-03 | 2017-05-09 | T. Michael Spencer | Glyphosate resistant maize lines |
| US6204436B1 (en) * | 1997-10-31 | 2001-03-20 | Novartis Ag | Transgenic plants |
-
1998
- 1998-10-29 US US09/182,117 patent/US6204436B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-29 JP JP52534299A patent/JP2001503280A/ja active Pending
- 1998-10-29 DE DE19881833T patent/DE19881833B4/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-29 EP EP98959811A patent/EP0950109A1/en not_active Withdrawn
- 1998-10-29 GB GB9915068A patent/GB2337263A/en not_active Withdrawn
- 1998-10-29 PL PL334135A patent/PL197872B1/pl unknown
- 1998-10-29 CN CNB988016362A patent/CN1148453C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-29 TR TR1999/01515T patent/TR199901515T1/xx unknown
- 1998-10-29 CA CA002279258A patent/CA2279258A1/en not_active Abandoned
- 1998-10-29 WO PCT/EP1998/006859 patent/WO1999023232A1/en not_active Application Discontinuation
- 1998-10-29 UA UA99063655A patent/UA85364C2/uk unknown
- 1998-10-29 RU RU99116249/13A patent/RU2224024C2/ru active
- 1998-10-29 HU HU0001729A patent/HUP0001729A3/hu unknown
- 1998-10-29 SK SK885-99A patent/SK88599A3/sk unknown
- 1998-10-29 CZ CZ0235199A patent/CZ300208B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-10-29 AU AU15580/99A patent/AU1558099A/en not_active Abandoned
-
1999
- 1999-05-28 FI FI991221A patent/FI991221A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1999-06-10 SE SE9902189A patent/SE520353C2/sv not_active IP Right Cessation
- 1999-06-28 DK DK199900916A patent/DK199900916A/da not_active Application Discontinuation
- 1999-11-04 US US09/434,039 patent/US6531649B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-07-26 HK HK00104622A patent/HK1025360A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE9902189D0 (sv) | 1999-06-10 |
| HUP0001729A2 (hu) | 2000-09-28 |
| CA2279258A1 (en) | 1999-05-14 |
| WO1999023232B1 (en) | 1999-07-15 |
| CZ300208B6 (cs) | 2009-03-18 |
| TR199901515T1 (xx) | 2000-11-21 |
| US6531649B1 (en) | 2003-03-11 |
| GB2337263A (en) | 1999-11-17 |
| DE19881833B4 (de) | 2007-05-10 |
| SE520353C2 (sv) | 2003-07-01 |
| HK1025360A1 (en) | 2000-11-10 |
| AU1558099A (en) | 1999-05-24 |
| JP2001503280A (ja) | 2001-03-13 |
| HUP0001729A3 (en) | 2002-04-29 |
| FI991221A (fi) | 1999-05-28 |
| CN1242803A (zh) | 2000-01-26 |
| CN1148453C (zh) | 2004-05-05 |
| FI991221A0 (fi) | 1999-05-28 |
| GB9915068D0 (en) | 1999-08-25 |
| US6204436B1 (en) | 2001-03-20 |
| EP0950109A1 (en) | 1999-10-20 |
| SK88599A3 (en) | 2000-03-13 |
| UA85364C2 (uk) | 2009-01-26 |
| WO1999023232A1 (en) | 1999-05-14 |
| DE19881833T1 (de) | 2000-02-10 |
| DK199900916A (da) | 1999-06-28 |
| CZ235199A3 (cs) | 1999-09-15 |
| GB2337263A8 (en) | 2000-02-24 |
| SE9902189L (sv) | 1999-08-19 |
| RU2224024C2 (ru) | 2004-02-20 |
| PL334135A1 (en) | 2000-02-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL197872B1 (pl) | Roślina buraka cukrowego wyrażająca aktywność enzymu cp4/epsps oraz jej rośliny potomne, transgeniczne nasiona rośliny buraka cukrowego wyrażające aktywność enzymu cp4/epsps oraz sposób wytwarzania transgenicznych roślin | |
| Haughn et al. | Transformation with a mutant Arabidopsis acetolactate synthase gene renders tobacco resistant to sulfonylurea herbicides | |
| US5177010A (en) | Process for transforming corn and the products thereof | |
| US6020539A (en) | Process for transforming Gramineae and the products thereof | |
| EP0731632B1 (en) | Agrobacterium tumefaciens transformation of musa species | |
| EP1173582B1 (en) | Herbicide resistant plants | |
| Russell et al. | Directed excision of a transgene from the plant genome | |
| US8158850B2 (en) | Method to enhance yield and purity of hybrid crops | |
| Lyon et al. | Cotton plants transformed with a bacterial degradation gene are protected from accidental spray drift damage by the herbicide 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid | |
| US6268549B1 (en) | DNA sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides | |
| US20120005769A1 (en) | Chimeric gene with several herbicide tolerance genes, plant cell and plant resistant to several herbicides | |
| MXPA01010922A (es) | Plantas resistentes a herbicidas. | |
| JP2003528571A6 (ja) | 除草剤抵抗性植物 | |
| HUT60766A (en) | Process for producing glyphosate-tolerant 5-enol-pyruvyl-3-phosphoshikimate synthase enzymes, plant genes encoding them and transformed plants comprising same | |
| WO2000066746A1 (en) | Herbicide resistant plants | |
| US6750378B2 (en) | Maize H3C4 promoter combined with the first intron of rice actin, chimeric gene comprising it and transformed plant | |
| Deng et al. | Optimization of Epsps gene and development of double herbicide tolerant transgenic PGMS rice | |
| US7235711B2 (en) | Plant cell plastid transformation method using dual selection and producing transplastomic plants without antibiotic resistance genes | |
| Konagaya et al. | Application of the acetolactate synthase gene as a cisgenic selectable marker for Agrobacterium-mediated transformation in Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis) | |
| US10655141B2 (en) | Plant EPSP synthases and methods of use | |
| CA1341455C (en) | Process for transforming gramineae and the products thereof | |
| AU760662B2 (en) | DNA sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides | |
| Evans | The use of microorganisms in plant breeding | |
| DE60028751T2 (de) | Herbizidresistente pflanzen | |
| US20020002711A1 (en) | Process for transforming germineae and the products thereof |