MXPA01010922A - Plantas resistentes a herbicidas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona, inter alia, un polinucleotido aislado que comprende una region que codifica para un peptido de transicion de cloroplasto y una 5-enolpiruvilshikimato fosfato sintetasa (EPSPS) a 3' del peptido, en donde dicha region esta bajo el control de expresion de un promotor operable de planta, con las condiciones de que dicho promotor no sea heterologo con respecto a la region y que el peptido de transicion de cloroplasto no sea heterologo con respecto a la sintetasa.

Description

I PLANTAS RESISTENTES A HERBICIDAS | 1 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN I j La presente invención se refiere a tecnología de ! ADN recombinante y en particular a la producción de plantas S transgénicas que exhiben una sustancial resistencia o sustancial tolerancia a herbicidas, cuando se comparan con plantas similares no transgénicas. La presente invención también se refiere, inter alia, a las secuencias de nucleótiidos (y productos de expresión de las mismas) que se utilizan en la producción de o que son producidas por dichas plantas, transgénicas. i 1 Las plantas que son sustancialmente "tolerantes" a un herbecida ' cuando son sometidas al mismo, proporcionan una j curva de dosis/respuesta que se desplaza hacia la derecha cuando • se compara con aquella proporcionada por plantas j similares sometidas a condiciones similares y que no son tolerantes. Tales curvas de dosis/respuesta tienen graficada I la " dosJ s" en el eje de las X y el "porcentaje de muerte", i "efecto! herbicida", etcétera, en el eje de las Y. Las 1 plantasj tolerantes tipicamente requerirán cuando menos el doble dé herbicida que las plantas similares no tolerantes, con el1 fin de producir un efecto herbicida dado. Las plantas que son sustancialmente "resistentes" al herbicida, exhiben pocas, si es que alguna, lesiones necróticas, liticas, cloróticas u otras lesiones cuando se someten al herbicida a concentraciones e Índices que se REF: 133227 emplean típicamente en la comunidad agrícola para matar la hierba en el campo en el que un cultivo va a crecer para propósitos comerciales. Es particularmente preferido que las plantas sean sustancialmente resistentes o sustancialmente tolerantes a los herbicidas (de aquí en adelante "glifosato") cuyo sitio de acción es la enzima 5-enolpiruvilshi imato fosfato sintetasa (de aquí en adelante "EPSPS") , de los cuales la N-fosfonometilglicina (y sus diversas sales) es el ejemplo más prominente. El herbicida se puede aplicar ya sea antes o después de la emergencia, de conformidad con las técnicas normales para la aplicación de herbicidas a campos que comprenden cultivos que se han vuelto resistentes al herbicida. La presente invención proporciona, inter alia, secuencias de nucleótidos útiles para la producción de tales plantas tolerantes o resistentes a herbicidas. De conformidad con la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende la secuencia ilustrada en la SEQ ID NO: 41. La presente invención también proporciona un polinucleótido, excluyendo el ADNc que codifica para la EPSPS del arroz y del maíz, que codifica para una EPSPS y el cual es complementario a un polinucleótido que cuando se incuba a una temperatura de entre 65 y 70°C en solución reguladora de citratos de 0.1 de fuerza conteniendo 0.1% de SDS, seguido por un enjuague a la misma temperatura con solución salina reguladora de citratos de 0.1 de fuerza con 0.1% de SDS, todavía se hibridice con la secuencia ilustrada en la SEQ ID NO: 41. Un polinucleótido codificador de EPSPS de conformidad con la presente invención, sin embargo, se podría obtener mediante la selección de bibliotecas de ADN genómico de plantas con un nucleótido que constituye un intrón dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 41 y la presente invención también incluye tal secuencia que se pueda obtener mediante tal selección. La presente invención también incluye un polinucleótido aislado que comprende una región codificadora de un péptido de transición de cloroplasto y una 5-enolpiruvilshikimato fosfato sintetasa (EPSPS) resistente al glifosato, en el lado 3' del péptido, en donde dicha región está bajo el control de expresión de un promotor operable de planta, con las condiciones de que dicho promotor no sea heterólogo con respecto a dicha región y que el péptido de transición de cloroplasto no sea heterólogo con respecto a dicha sintetasa. El término "heterólogo" tal como se utiliza en la presente, significa de una fuente diferente y, de manera correspondiente, el término "no heterólogo" significa derivado de la misma fuente -pero en un gen en vez de un organismo o a nivel tisular. Por ejemplo, el promotor CaMV35S claramente es heterólogo con respecto a la secuencia codificadora de EPSPS de petunia en cuanto a que el promotor se deriva de un virus y la secuencia -la expresión de la cual controla- se deriva de una planta. El término "heterólogo" de conformidad con la presente invención, tiene todavía un significado más estrecho. Por ejemplo, "heterólogo" en cuanto a lo que se refiere a la presente invención, significa que la secuencia codificadora de EPSPS de petunia es "heteróloga" con respecto a, por ejemplo, un promotor también derivado de la petunia -diferente a aquél que controla la expresión del gen EPSPS. En este sentido, el promotor de petunia derivado del gen EPSPS de petunia utilizado para controlar la expresión de una secuencia codificadora de EPSPS igualmente derivada de la petunia, es "no heterólogo" con respecto a dicha secuencia codificadora. Sin embargo, el término "no heterólogo" no significa que el promotor y la secuencia codificadora necesariamente debieron ser obtenidos del mismo (original o progenitor) polinucleótido. Lo mismo se aplica con respecto a los péptidos de transición. Por ejemplo, un péptido de transición de cloroplasto de rubisco derivado del girasol es "heterólogo" con respecto a la secuencia codificadora de un gen EPSPS igualmente derivado del girasol (la misma planta, tejido o célula). Una secuencia codificadora del péptido de transición de rubisco derivada del girasol es "no heteróloga" con respecto a una secuencia codificadora de enzima de rubisco también derivada del girasol, incluso si los orígenes de ambas secuencias son diferentes polinucleótidos que pudieran haber estado presentes en diferentes células, tejidos o plantas de girasol. Una forma preferida del polinucleótido comprende los siguientes componentes en dirección de 5' a 3' de la transcripción: (i) Cuando menos un intensificador de transcripción siendo el de la región de intensificación que está cadena arriba del inicio de transcripción de la secuencia de la cual se obtiene el intensificador y que el intensificador per se no funciona como promotor ya sea en la secuencia en la cual está comprendido endógenamente o cuando está presente heterólogamente como parte de una construcción; (ii) el promotor del gen EPSPS del arroz; (iii) la secuencia genómica del arroz que codifica para el péptido de transición de cloroplasto EPSPS del arroz; (iv) la secuencia genómica que codifica para el EPSPS del arroz; (v) un terminador de transcripción; en donde la secuencia codificadora de EPSPS del arroz está modificada en que una primera posición es mutada de tal modo que el residuo en esta posición sea lie en vez de Thr y una segunda posición es mutada de manera que el residuo en esta posición sea Ser en vez de Pro, en donde las mutaciones se introducen en secuencias EPSPS que comprenden la siguiente región conservada GNAGTAMRPLTAAV en la enzima de tipo silvestre, de tal modo que la secuencia modificada quede de la siguiente manera GNAGIAMRSLTAAV. La región de intensificación de preferencia comprende una secuencia cuyo extremo 3' está cuando menos 40 nucleótidos cadena arriba del inicio de transcripción más cercano de la secuencia de la cual se obtiene el intensificador. En otra modalidad del polinucleótido, la región de intensificación comprende una región cuyo extremo 3' está cuando menos 70 nucleótidos cadena arriba de dicho inicio más cercano y en otra modalidad del polinucleótido, dicha región de intensificación comprende una secuencia cuyo extremo 3' está cuando menos 10 nucleótidos cadena arriba del primer nucleótido del consenso TATA de la secuencia de la cual se obtiene el intensificador. El polinucleótido de conformidad con la presente invención puede comprender dos o más intensificadores de transcripción, los cuales en una modalidad particular del polinucleótido pueden estar presentes en tándem.

En el presente polinucleótido de la invención, el extremo 3' del intensificador, o el primer intensificador si es que hay más de uno presente, puede estar entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1000 nucleótidos cadena arriba del codón correspondiente al inicio de traducción del péptido de transición EPSPS o del primer nucleótido de un intrón en la región 5' no traducida en el caso en que dicha región contenga un intrón. En una modalidad más preferida del polinucleótido, el extremo 3' del intensificador, o el primer intensificador, está entre aproximadamente 150 y aproximadamente 1000 nucleótidos cadena arriba del codón que corresponde al inicio de traducción del péptido de transición EPSPS o del primer nucleótido de un intrón en la región 5' no traducida, y en todavía una modalidad más preferida, el extremo 3' del intensificador, o el primer intensificador, puede estar entre aproximadamente 300 y aproximadamente 950 nucleótidos cadena arriba del codón que corresponde al inicio de traducción del péptido de transición EPSPS o del primer nucleótido de un intrón en la región 5' no traducida. En todavía una modalidad más preferida, el extremo 3' del intensificador, o del primer intensificador, puede estar localizado entre aproximadamente 770 y aproximadamente 790 nucleótidos cadena arriba del codón que corresponde al inicio de traducción del péptido de transición EPSPS o del primer nucleótido de un intrón en la región 5' no traducida. En un polinucleótido de la presente invención alternativo, el extremo 3' del intensificador, o del primer intensificador, puede estar localizado entre aproximadamente 300 y aproximadamente 380 nucleótidos cadena arriba del codón que corresponde al inicio de traducción del péptido de transición EPSPS o del primer nucleótido de un intrón en la región 5' no traducida, y en una modalidad preferida de este polinucleótido alternativo, el extremo 3' del intensificador, o del primer intensificador, está localizado entre aproximadamente 320 y aproximadamente 350 nucleótidos cadena arriba del codón que corresponde al inicio de traducción del péptido de transición EPSPS, o del primer nucleótido de un intrón en la región 5' no traducida. En el polinucleótido de conformidad con la presente invención, la región cadena arriba del promotor del gen EPSPS del arroz puede comprender cuando menos un intensificador derivado de una secuencia que está cadena arriba del inicio de transcripción del promotor de la poliubiquitina del maíz o del promotor de la actina del arroz . De conformidad con ello, el polinucleótido podría comprender en dirección de 5' a 3' , un primer intensificador que comprende una región de intensificación de transcripción derivada de una secuencia que está cadena arriba del inicio de transcripción del promotor de la actina del arroz y un segundo intensificador que comprende una región de intensificación de transcripción derivada de una secuencia que está cadena arriba del inicio de transcripción del promotor de la actina del arroz. Cualquiera que sea la identidad y yuxtaposición de los diversos intensificadores presentes en el polinucleótido, los nucleótidos hacia 5' del codón que constituye el inicio de traducción del péptido de transición de cloroplasto EPSPS del arroz pueden ser preferidos de Kozac . Un técnico en la materia sabrá qué se quiere decir con esto - lo cual, en cualquier caso, será evidente a partir de los siguientes ejemplos. Las modalidades particularmente preferidas del polinucleótido de la presente invención, tienen una región no traducida que comprende una secuencia que funciona como intrón localizado hacia 5' de la secuencia genómica del arroz que codifica para el péptido de transición de cloroplasto EPSPS del arroz. La región no traducida puede comprender la secuencia ilustrada en la SEQ ID NO: 48. El polinucleótido de la presente invención puede comprender un intensificador de traducción derivado de virus ubicado dentro de la región no traducida hacia 5' de - la secuencia genómica del arroz, que codifica para el péptido de transición de cloroplasto EPSPS del arroz. Un técnico en la materia está consciente de la identidad de tales intensificadores de traducción adecuados -tales como las secuencias Omega y cebador Omega derivadas del TMV y que se derivan del virus de la corrosión del tabaco y cómo tales intensificadores de traducción se pueden introducir en el polinucleótido para proporcionar el resultado deseado. El polinucleótido de conformidad con la presente invención además puede comprender regiones que codifican para proteínas capaces de conferirle al material de planta que las contiene, cuando menos uno de los siguientes rasgos agronómicamente deseables: resistencia a insectos, hongos, virus, bacterias, nematodos, estrés, desecación y herbicidas. Mientras que tal polinucleótido contempla que el gen que confiere resistencia a herbicidas puede ser otro diferente al EPSPS, tal como la glifosato óxido-reductasa (GOX) por ejemplo, el herbicida puede ser diferente al glifosato, en cuyo caso los genes que confieren resistencia se pueden seleccionar del grupo que codifica para las siguientes proteínas: fosfinotricina acetil transferasa (PAT) , hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD) , glutatión S transferasa (GST) , citocromo P450, acetil-CoA carboxilasa (ACCasa) , acetolactato sintetasa (ALS) , protoporfirinógeno oxidasa (PPO) , dihidropteroato sintetasa, proteínas de transporte de poliamina, superóxido dismutasa (SOD) , bromoxinil nitrilasa, fitoeno desaturasa (PDS) , el producto del gen tfdA obtenido de Alcaligenes eutrophus y variantes de dichas proteínas que se sabe que están mutagenizadas o modificadas de alguna otra manera. En caso de que el polinucleótido proporcione múltiple resistencia a herbicidas, tales herbicidas se pueden seleccionar del grupo que consiste de herbicida de dinitroanilina, triazolopirimidinas, uracilo, una fenilurea, tricetona, isoxazol, acetanilida, oxadiazol, triazinona, sulfonanilida, amida, anuida, RP201772, fluorocloridona, norflurazona y herbicidas de tipo triazolinona, y el herbicida posemergencia se selecciona del grupo que consiste de glifosato y sales del mismo, glufosinato, asulam, bentazon, bialafos, bromacilo, setoxidim y otras ciclohexanodionas, dicamba, fosa-nina, flupoxam, fenoxipropionato, quizalofop u otros ariloxifenoxipropio-natos, picloram, fluormetron, atrazina u otras triazinas, metribuzin, clori uron, clorsulfuron, flumetsulam, halosulfuron, sulfometron, imazaquina, imazetapir, isoxaben, imazamox, metosulam, piritrobac, rimsulfuron, bensulfuron, nicosulfuron, fomesafen, fluroglicofen, KIH9201, ET751, carfentrazona, ZA1296, sulcotriona, paraquat, diquat, bromoxinilo y fenoxaprop.

- - En caso de que el polinucleótido comprenda secuencias que codifican para proteínas insecticidas, estas proteínas se pueden seleccionar del grupo que consiste de toxinas cristalinas derivadas de Bt, incluyendo toxinas Bt secretadas; inhibidores de proteasa, lectinas, toxinas de Xenhorabdus/Photorhabdus; los genes que confieren resistencia a hongos se pueden seleccionar del grupo que consiste de aquellos codificados por AFPs conocidas, defensinas, quitinasas, glucanasas, Avr-Cf9. Las proteínas insecticidas particularmente preferidas son crylAc, crylAb, cry3A, Vip ÍA, Vip IB, inhibidores de cisteína proteasa y lectina copo de nieve. En caso de que el polinucleótido comprenda genes que confieren resistencia a bacterias, éstos se podrían seleccionar del grupo que consiste de aquellos que codifican cecropinas y tequiplesina, y análogos de las mismas. Los genes que confieren resistencia a virus se pueden seleccionar del grupo que consiste de aquellos que codifican para proteínas de la cubierta del virus, proteínas de movimiento, replicasas virales y secuencias antisentido y de ribozima que se sabe que proporcionan resistencia a virus; mientras que la resistencia al estrés, la sal y a la sequía, se pueden seleccionar de aquellos que codifican para glutatión-S-transferasa y peroxidasa, cuya secuencia constituye la secuencia reguladora CBFl conocida y genes que se sabe que proporcionan acumulación de trealosa. El polinucleótido de conformidad con la presente invención se puede modificar para intensificar la expresión de las secuencias codificadoras de proteína comprendidas por el mismo, en que las porciones de inestabilidad de ARNm y/o regiones de empalmamiento fortuito se pueden remover o se pueden usar codones preferidos para que la expresión del polinucleótido así modificado en una planta, rinda una proteína sustancialmente similar que tenga una actividad/función sustancialmente similar a la obtenida mediante la expresión del polinucleótido no modificado en el organismo en el cual las regiones que codifican para la proteína del polinucleótido no modificado son endógenas. El grado de identidad entre el polinucleótido modificado y el polinucleótido endógenamente contenido dentro de dicha planta y que codifica sustancialmente la misma proteína, puede ser tal que prevenga la cosupresión entre las secuencias modificada y endógena. En este caso, el grado de identidad entre las secuencias de preferencia debe ser menor de aproximadamente 70%. La presente invención además incluye un vector biológico o de transformación que comprende al polinucleótido de la presente invención. De conformidad con ello, el término "vector" significa, inter alia, uno de los siguientes: un plásmido, virus, cósmido o una bacteria - - transformada o transfectada para que contenga al polinucleótido . La presente invención además incluye material de planta que ha sido transformado con dicho polinucleótido o vector, así como tal material de planta transformado que ha sido o es transformado adicionalmente con un polinucleótido que comprende regiones codificadoras de proteínas capaces de conferirle al material de planta que las contiene, cuando menos uno de los siguientes rasgos agronómicamente deseables: resistencia a insectos, hongos, virus, bacterias, nematodos, estrés, desecación y herbicidas. La presente invención además incluye plantas normales, completas fértiles que han sido regeneradas a partir del material descrito en el párrafo inmediatamente precedente, sus semillas y partes de progenie, cuya progenie comprende el polipéptido o vector de la presente invención incorporado de manera estable en su genoma y heredable de manera tipo Mendeliana. La presente invención además incluye plantas completas fértiles morfológicamente normales que contienen el polinucleótido de la presente invención y que son el resultado de la cruza de plantas que han sido regeneradas a partir de material transformado con el polinucleótido o vector de la presente invención, y plantas que han sido transformadas con un polinucleótido que comprende regiones codificadoras de proteínas capaces de conferirle al material de planta que las contiene, cuando menos uno de los siguientes rasgos agronómicamente deseables: resistencia a insectos, hongos, virus, bacterias, nematodos, estrés, desecación y herbicidas, la progenie de las plantas resultantes, sus semillas y partes. Las plantas de la presente invención se pueden seleccionar del grupo que consiste de campos de cultivos, frutas y vegetales tales como cañóla, girasol, tabaco, remolacha azucarera, algodón, maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, jitomate, mango, durazno, manzana, pera, fresa, plátano, melón, papa, zanahoria, lechuga, col, cebolla, soya spp, caña de azúcar, chícharo, frijol campestre, álamo, uva, limón, alfalfa, centeno, avena, césped y pastos de forraje, lino y colza de semilla oleosa, y plantas productoras de nueces, en la medida en que no estén ya específicamente mencionadas, su progenie, semillas y partes. Las plantas particularmente preferidas incluyen el maíz, soya, algodón, remolacha azucarera y cañóla. La presente invención además comprende un método para controlar selectivamente hierbas en un campo, en donde el campo comprende hierbas y plantas de la presente invención o la progenie resistente a herbicidas de las mismas, en donde el método comprende la aplicación al campo de un herbicida de tipo glifosato en una cantidad suficiente para controlar las hierbas sin afectar sustancialmente a las plantas. De conformidad con este método, se pueden aplicar al campo (y por lo tanto a las plantas contenidas en él) uno o más herbicidas, insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas y antivirales, ya sea antes o después de la aplicación del herbicida de glifosato. La presente invención además proporciona un método para producir plantas que son sustancialmente tolerantes o sustancialmente resistentes al herbicida glifosato, el cual comprende los pasos de: (i) transformar material de planta con el polinucleótido o vector de la presente invención; (ii) seleccionar el material así transformado, y (iii) regenerar el material así seleccionado en plantas completas fértiles morfológicamente normales. La transformación podría involucrar la introducción del polinucleótido en el material mediante cualquier mecanismo conocido, pero en particular por los siguientes: (i) bombardeo biolístico del material con partículas revestidas con el polinucleótido; (ii) empalamiento del material en fibras de carburo de silicio que son revestidas con una solución que comprende al polinucleótido; o (iii) mediante la introducción del polinucleótido o vector en células de Agrobacterium y la cocultivación del Agrobacteri um así transformado con el material de planta, el cual de esta manera se transforma y subsecuentemente es regenerado. Las técnicas de transformación, selección y regeneración de las plantas que podrían requerir modificaciones rutinarias con respecto a una especie de planta particular, son bien conocidas por los técnicos en la materia. El material de planta transformado de esta manera se puede seleccionar por su resistencia al glifosato. La presente invención además proporciona el uso del polinucleótido o vector de la presente invención en la producción de tejidos de planta y/o plantas completas fértiles morfológicamente normales, que son sustancialmente tolerantes o sustancialmente resistentes al herbicida glifosato. La presente invención además incluye un método para seleccionar material biológico transformado, para expresar un gen de interés, en donde el material transformado comprende al polinucleótido o vector de la presente invención, y en donde la selección comprende exponer el material transformado a glifosato o una sal del mismo y seleccionar el material sobreviviente. Dicho material puede ser de origen de planta y, en particular, se puede derivar de una monocotiledónea que se selecciona del grupo que consiste de cebada, trigo, maíz, arroz, avena, centeno, sorgo, piña, caña de azúcar, plátano, cebolla, espárrago y puerro. La presente invención además incluye un método para regenerar una planta transformada fértil para que contenga ADN extraño, que comprende los pasos de: (a) producir tejido regenerable a partir de dicha planta por ser transformada; (b) transformar el tejido regenerable con el ADN extraño, en donde dicho ADN extraño comprende una secuencia de ADN seleccionable, en donde dicha secuencia funciona en un tejido regenerable como dispositivo de selección; (c) entre aproximadamente 1 y aproximadamente 60 días después del paso del inciso (b) , colocar el tejido regenerable del paso del inciso (b) en un medio capaz de producir brotes de dicho tejido, en donde el medio además contiene un compuesto que se utiliza para seleccionar el tejido regenerable que contenga la secuencia de ADN seleccionable, para permitir la identificación o selección del tejido regenerado transformado; (d) después de que se ha formado cuando menos un brote del tejido seleccionado del paso del inciso (c) , dicho brote se transfiere a un segundo medio capaz de producir raíces del brote para producir una plántula, en donde el segundo medio opcionalmente contiene dicho compuesto; y (e) hacer crecer la plántula hasta que sea planta transgénica fértil, en donde el ADN extraño es transmitido a las plantas progenie de manera tipo Mendeliana, caracterizado porque el ADN extraño es, o la secuencia de ADN seleccionable comprendida por el ADN extraño comprende, al polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, y dicho compuesto es el glifosato o una sal del mismo. La planta puede ser monocotiledónea, tal como se indicó anteriormente -de preferencia seleccionada del grupo que consiste de plátano, trigo, arroz, maíz y cebada, y el tejido regenerable puede consistir de callos embriogénicos, embriones somáticos, embriones inmaduros, etcétera. La presente invención será más evidente a partir de la siguiente descripción, tomada en conjunto con los dibujos asociados y con los listados de secuencias. Lista de Secuencias SEQ ID NO: 1-40, cebadores de RCP SEQ ID NO: 41 Secuencia EPSPS genómica del arroz (de ATG) . SEQ ID NO: 42 Secuencia EPSPS genómica del arroz que contiene doble mutación. SEQ ID NO: 43 Intensificador de poliubiquitina del maíz. SEQ ID NO: 44 Intensificador de actina del arroz 1. SEQ ID NO: 45 EPSPS genómica del arroz Gl (hasta ATG) - - SEQ ID NO: 46 EPSPS genómica del arroz G3 (hasta ATG) SEQ ID NO: 47 EPSPS genómica del arroz G2+intrón Adh 1 del maíz . SEQ ID NO: 48 Intrón Adh 1 del maíz. Lista de Figuras Figura 1, Mapa esquemático genómico del EPSPS del arroz.

Figura 2, Vector pCR4-OSEPSPS (gen dmEPSPS del arroz en el vector pCR4-Blunt) . Figura 3, Representación esquemática de la estrategia utilizada para introducir la doble mutación. Figura 4, Vector pTCVIOOl. Figura 5, Vector pTCVIOOlOSEPSPS (comprende el gen dmEPSPS del arroz en el vector pTCVIOOl) . Figura 6, Vector pTCVIOOlEPSPSPAC (comprende el gen dmEPSPS del arroz en el vector pTCVIOOl) . Figura 7, Vector pBluSK+EPSPS (comprende el gen dmEPSPS del arroz en el vector pBluescript SK+) . Figura 8, Vector pPACl . Figura 9, Vector pTCVEPSPH. Figura 10, Vector pTCVEPSPSADH. Figura 11, Vector pBluSKEPSPSADH (comprende el gen dmEPSPS del arroz que contiene el intrón Adh 1) . Figura 12, Vector pIGPD9. Figura 13, Vector Zen 9. Figura 14, Vector Zen 8.

Figura 15, Vector Zen 19. Figura 16, Vector Zen 21. Figura 17a-J7c, Introducción de los vectores Zen en vectores superbinarios . Producción de plantas tolerantes al tratamiento con glifosato, a través de la sobreexpresión de un EPSPS mutado bajo el control de un promotor no heterólogo. El término * intensificador" tal como se utiliza en la presente descripción, significa aquellas secuencias cadena arriba del promotor que no comprenden al promotor mismo, sino que actúan para intensificar y regular la transcripción desde el promotor. El término ** deleción del promotor EPSPS" tal como se utiliza en la presente descripción de patente, se refiere al promotor EPSPS junto al promotor con nucleótidos que constituyen cuando menos una parte del intensificador que es nativo al gen EPSPS, i.e., secuencias derivadas de EPSPS cadena arriba (5') del promotor EPSPS. Con respecto a la transformación del material de planta, los "técnicos en la materia reconocerán que aunque se especifican tipos particulares de material blanco (e.g., cultivo de una suspensión de células embriogénicas o desdiferenciación de embriones inmaduros) y métodos particulares. de transformación (e.g., utilizando Agrobacteri um o bombardeo de partículas) en los ejemplos - - que se presentan a continuación, los métodos se pueden utilizar de manera intercambiable. Además, el término "células de planta" tal como se utiliza en la presente descripción de la invención, puede referirse a células aisladas, incluyendo cultivos en suspensión así como células en un tejido intacto o parcialmente intacto, tales como embriones, escutelo, microesporas, embriones derivados de microesporas o células somáticos de órganos de planta. De manera similar, aunque algunos ejemplos específicos se limitan al maíz, trigo y arroz, la presente invención es igualmente aplicable a cualquiera de un amplio rango de cultivos agrícolas y plantas ornamentales que pueden ser transformadas utilizando los métodos adecuados de transformación de células de planta. Los métodos de biología molecular generales se llevan a cabo de conformidad con Sambrook et al . (1989) "Molecular cloning: A laboratoy Manual", 2nd Edn. Cold Spring Harbour Lab. Press. EJEMPLO 1. Generación de una sonda de ADNc para el EPSPS del arroz . Se obtuvo un ADNc de longitud parcial que codifica para EPSPS del arroz utilizando RCP con transcriptasa inversa (RCP-TI) . Se aisla ARN total de plantas de arroz de dos semanas de edad ( Oryza sativa L. indica var. Koshihikari) utilizando el método de TRI-ZOL™ (Life Technologies) . La síntesis de la primera cadena de ADNc se realiza utilizando la transcriptasa inversa Superscript II (Life Technologies) con 200 ng de cebador 10 degenerado de reversa EPSPS (SEQ ID NO: 1) y 2 µg de ARN total, de conformidad con los protocolos suministrados. La síntesis de la segunda cadena y la amplificación del ADNc por RCP, se llevan a cabo utilizando cebadores degenerados de EPSPS 10 y 4 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) y cuentas de RCP (Pharmacia) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Todos los códigos de letra son abreviaturas estándar (Eur. J. Biochem. (1985) 150:15). SEQ ID NO: 1 Cebador 10 de reversa degenerado de EPSPS 5' GCACARGCIGCAAGIGARAAIGCCATIGCCAT 3' SEQ ID NO: 2 Cebador 4 hacia delante degenerado de EPSPS 5' GCWGGAACWGCATGCGICCRYTIACIGC 3' Los productos se clonan en el vector pCR2.1 (Invitrogen) utilizando un paquete comercial TEMPERATURA AMBIENTE Clinging™, tal como lo recomienda el proveedor. El plásmido se recuperó de colonias seleccionadas y la secuencia se analizó mediante un proceso que involucraba búsquedas de homología basadas en computadora (BLAST) para confirmar que el producto de RCP-TI clonado tenía una alta homología con secuencias EPSPS de planta conocidas.

EJEMPLO 2. Aislamiento de secuencia genómica EPSPS del arroz y clonación del gen EPSPS del arroz Una región del ADN genómico que contenía el gen EPSPS del arroz completo y la región cadena arriba 5' , se aisló de una biblioteca genómica ? EMBLSP6/T7 construida a partir de brotes o retoños de arroz ( Oryza sa tiva L. Indica var. IR36) etiolados de cinco días de edad (Clontech) . Se seleccionaron 1 x 106 unidades formadoras de placa (ufp) utilizando la sonda de ADNc EPSPS del arroz marcada con 32P (ejemplo 1), empleando los protocolos proporcionados por el fabricante. Las placas positivas fueron sometidas a subsecuentes rondas de hibridación y selección hasta que se obtuviera una pureza de placa de una placa de hibridación cruzada. Se preparó ?-ADN de una solución concentrada de fago puro, de conformidad con el método descrito por Sambrook et al . , 1989. El ADN obtenido se analizó mediante digestión de restricción y por inmunoelectrotransferencia tipo Southern, utilizando el mismo ADNc de EPSPS del arroz marcado con 32P como sonda. Los fragmentos de restricción que presentaban hibridación cruzada, cuando fuera aplicable, se les hacían los extremos romos utilizando un método tal como el de Perfectly Blunt™ (Novagen) y se clonaron en un vector adecuado, tal como pSTBlue (Novagen) . Posteriormente, el ADN se secuenció utilizando un secuenciador de ADN automatizado ABl 377A PRISM. La Figura 1 muestra un esquema del gen EPSPS del arroz con algunos de los sitios de restricción marcados. Un fragmento de 3.86 kb del gen EPSPS del arroz, que contiene la región codificadora, el promotor de EPSPS, parte de la región cadena arriba 5' y el terminador, se obtiene por RCP. El oligonucleótido cebador 0SGRA1 (SEQ ID NO: 3) se utiliza en conjunto con el 0SEPSPS3 (SEQ ID NO: 4) para amplificar la región deseada. El 0SEPSPS3 contiene sitios de enzimas de restricción Sac 1 y Sma 1 adicionales para facilitar la subclonación del gen durante las etapas posteriores de construcción del vector. En la Figura 1 se proporciona una ubicación esquemática de estos cebadores. SEQ ID NO: 3 OSSGRA1 5' ATTTCTTCTTCTTCCTCCCTTCTCCGCCTC 3' SEQ ID NO: 4 OSEPSPS3 5' GAGCTCCCCGGGCGAGTGTTGTTGTGTTCTGTCTAATG 3' Se utilizó la polimerasa Pfu Turbo™ de alta fidelidad (Stratagene) para llevar a cabo la reacción de RCP con ADN obtenido de la preparación ? (anteriormente descrita) como plantilla de amplificación. El producto de RCP del tamaño esperado se clonó en pCRBlunt 4-TOPO™ (Invitrogen) y se secuenció para verificar la integridad. EJEMPLO 3. Mutación de T a I y de P a S en el EPSPS del arroz La mutación de T a I y de P a S se obtiene mediante la introducción de dos mutaciones puntuales. Estas mutaciones se introducen en el gen EPSPS genómico del arroz por RCP, utilizando oligonucleótidos cebadores que contienen la mutación deseada. En la Figura 3 se muestra un diagrama esquemático que indica los sitios de unión de los cebadores utilizados. Se realizaron dos reacciones de RCP por separado (ambas utilizando el ADN ? como plantilla) . 1) EcoRVEnd (SEQ ID NO: 5) + OSMutBot (SEQ ID NO: 6) 2) OsMutTop (SEQ ID NO: 7) + SalIEnd (SEQ ID NO: 8) SEQ ID NO: 5 EcoRVEnd 5' GCTTACGAAGGTATGATATCCTCCTACATGTCAGGC 3' SEQ ID NO: 6 OSMutBot 5' GCAGTCACGGCTGCTGTCAATGATCGCATTGCAATTCCAGCGTTCC 3' SEQ ID NO: 7 OsMutTop 5' GGAACGCTGGAATTGCAATGCGATCATTGACAGCAGCCGTGACTGC 3' SEQ ID NO: 8 SalIEnd 5' GGTGGGCATTCAGTGCCAAGGAAACAGTCGACATCCGCACCAAGTTGTTTCAACC 3' Los productos de RCP resultantes se unieron utilizando concentraciones equimolares de cada producto RCP como plantilla, con los dos oligos SalIEnd y EcoRVEnd, en una nueva reacción de RCP. Una alícuota del producto de reacción se analizó por electroforesis en gel de agarosa y - - se clonó en PCR-BluntlI™ (Invitrogen) . El ADN plasmídico se recuperó y se secuenció para detectar la incorporación exitosa de la doble mutación. El fragmento de ADN que contenía la doble mutación se incorporó en la clona genómica de EPSPS del arroz (Figura 1) de la siguiente manera. La clona que contenía la doble mutante se sometió a una digestión con EcoRV y Salí . El plásmido que contenía el producto de RCP de ADN de EPSPS del arroz, de manera similar, se sometió a una digestión y el fragmento EcoRV/Sall que contenía la doble mutación se ligó al gen EPSPS del arroz en el plásmido pCR4Blunt-TOPO™, utilizando los métodos de clonación estándar descritos en Sambrook et al . , 1989 y se transformó en células competentes de E. coli . El plásmido se recuperó de las colonias resultantes y se secuenció con el fin de confirmar la presencia de la doble mutación sin más alteraciones. Este plásmido, pCR4-OSEPSPS, se muestra en la Figura 2. El gen EPSPS del arroz genómico que contiene la doble mutante (Figura 2) se cortó del plásmido pCR4-Blunt-TOPO'm, utilizando las enzimas Pstl y Notl y se ligó en el vector pTCVIOOl (Figura 4), para generar el pTCVIOOlOSEPSPS (Figura 5) y éste fue transformado en E. coli para su amplificación. Posteriormente, se cortó un fragmento de restricción Pacl/iicoRV del AD? ? (Figura 1) y se insertó en el pTCVIOOlOSEPSPS (Figura 5), para generar - - el pTCVIOOlEPSPSPAC (Figura 6) . El gen dmEPSPS del arroz, que ahora contiene la secuencia de Pací a Sacl (Figura 6) , se cortó del pTCVIOOlEPSPSPAC (Figura 6) en forma de un fragmento Eagl/ Sacl y se ligó en el plásmido pBluescript SK+ similarmente digerido para obtener el pBluSK+EPSPS (Figura 7) . Las regiones cadena arriba de EPSPS del arroz y los intensificadores deseados, se ensamblaron (de la manera que se describe más adelante) y se ligaron en el vector pBluescript SK+, utilizando las enzimas Xbal/ Pací . EJEMPLO 4. Generación de fusiones de promotor EPSPS del arroz con un solo intensificador La Figura 1 indica los sitios de unión de los cebadores Gl y G2 utilizados para generar una serie de deleciones en el extremo 5' del gen EPSPS del arroz. Los cebadores Gl y G2 (SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10) se utilizan en combinación con el cebador RQCR10 (SEQ ID NO: 11), empleando la plantilla de ADN lambda de EPSPS del arroz y la polimerasa Pfu Turbo™ (Stratagene) utilizando los protocolos proporcionados por el fabricante. SEQ ID NO: 9 Gl 5' CGCCTGCAGCTCGAGGTTGGTTGGTGAGAGTGAGACACC 3' SEQ ID NO: 10 G2 5' CGCCTGCAGCTCGAGGCCACACCAATCCAGCTGGTGTGG 3' SEQ ID NO: 11 RQCR10 5' GAACCTCAGTTATATCTCATCG 3' Los productos obtenidos se analizaron por electroforesis en gel de agarosa y se clonaron en el vector PCR-BluntII-TOPO™ (Invitrogen) . La secuencia de los productos resultantes se determinó para asegurar que no hubiera alteraciones en la secuencia de la clona de EPSPS genómica del arroz. Las clonas para progresar se seleccionaron basándose en su orientación dentro del vector, al establecer si la digestión con la enzima Xhol removía o no sólo la secuencia poliligadora, en vez del inserto completo del vector. Las secuencias de los genes de poliubiquitina del maíz y de actina del arroz y sus regiones cadena arriba 5' asociadas, están publicadas en la base de datos EMBL (U29159 y X15865, respectivamente) . Los cebadores se diseñan para amplificar sólo las regiones intensificadoras cadena arriba de dichos genes. El intensificador de poliubiquitina del maíz (SEQ ID NO: 43) , de este modo, se obtiene por PCR utilizando los cebadores de la SEQ ID NO: 12 y de la SEQ ID NO: 13 en conjunto con la polimerasa Pfu Turbo™ y ADN genómico de maíz como plantilla. Estos cebadores contienen un sitio de restricción Spel para facilitar posteriores manipulaciones del intensificador (sin embargo, nótese que el sitio Xhol presente dentro del intensificador de poliubiquitina del maíz se utiliza como el sitio de restricción 3' ) . El intensificador de la - - actina del arroz (SEQ ID NO: 44) se obtiene de manera similar, empleando cebadores (SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: ) con ADN genómico del arroz como plantilla. Estos cebadores contienen un sitio de restricción Xbal y Pstl, respectivamente, para facilitar manipulaciones adicionales del intensificador. Se utilizan los siguientes oligonucleótidos cebadores. SEQ ID NO: 12 MPU5 5' GCGGCCGCACTAGTGGCCGGCCATCAGCGGCCAGCTTTTGTTC 3' SEQ ID NO: 13 MPU3 5' TTAACTAGTGAGGAGGCCGCCTGCCGTGC 3' SEQ ID NO: 14 RA5 5' CGCCTCTAGAGGCCGGCCGATATCCCTCAGCCGCCTTTCACTATC 3' SEQ ID NO: 15 RA3 5' CGCTGCAGTGCTCGCGATCCTCCTCGCTTTTCC 3' La secuencia de las moléculas amplificadas y clonadas, se confirma mediante una clonación en el vector PCR Blunt-II-TOPO (Invitrogen) . El vector pCRBlunt-II-TOPO, que fue sometido a la deleción de EPSPS 5' UTR, se somete a una digestión ya sea con Notl /Xhol (MPU) o bien con Xbal/ Pstl (RA) . El intensificador se retira de su respectivo vector pCRBlunt-II-TOPO también utilizando las enzimas de restricción requeridas y ligando en el primer vector que contiene la deleción 5' UTR.

EJEMPLO 5. Generación de fusiones de promotor EPSPS del arroz con doble intensificador Con el fin de incrementar adicionalmente la expresión del promotor EPSPS del arroz, se incorpora el intensificador de la actina en la fusión actina del arroz:EPSPS existente. Para lograr este fin, las fusiones intensificador/EPSPS se preparan inicialmente (como se describe en el Ejemplo 4) comprendiendo un solo (primer) intensificador de actina del arroz. El segundo intensificador de actina del arroz se amplifica utilizando los cebadores RAPST (SEQ ID NO: 16) y RAPAC (SEQ ID NO: 17) . Estos cebadores facilitan la introducción de un sitio Pstl en el extremo 5' y un sitio Pací en el extremo 3' del intensificador. SEQ ID NO: 16 RAPST 5' gcgctgcagGATATCCCTCAGCCGCCTTTCACTATC 3' SEQ ID NO: 17 RAPAC 5' gcgttaattaaTGCTCGCGATCCTCCTCGCTTTTCC 3' Una vez secuenciado, el producto de RCP (como Pstl : Pací) se introduce en la construcción que comprende la fusión primer intensificador de la actina del arroz: EPSPS Gl (Ejemplo 4) . EJEMPLO 6. Inserción del intrón Adhl en el UTR 5' del gen EPSPS del arroz La inserción del intrón 1 de Adhl del maíz en el promotor EPSPS del arroz sometido a deleción (e.g., preparado de la manera descrita en el Ejemplo 4), se realiza antes de la generación de la construcción de fusión con el o los intensificadores deseados. En este ejemplo particular, el intrón Adhl se introduce en el promotor EPSPS G2 sometido a deleción. Un técnico en la materia observará que se puede aplicar una metodología similar para incorporar el intrón Adhl en otros promotores EPSPS sometidos a deleción. El intrón Adhl del maíz se inserta en las construcciones por RCP. El intrón Adhl se amplifica a partir de una fuente adecuada, tal como ADN genómico de maíz o un vector tal como el pPACl (Figura 8), utilizando los cebadores Adh5 (SEQ ID NO: 18) y Adh3 (SEQ ID NO: 19) : SEQ ID NO: 18 Adh5 cccatcctcccgacctccacgccgccggcaggatcaagtgcaaaggtccgccttgtttctcctctg SEQ ID NO: 19 Adh3 gacgccatggtcgccgccatccgcagctgcacgggtccaggaaagcaatc El producto de RCP resultante se desnaturaliza y utiliza como cebador en conjunto con el Adh5Pac (SEQ ID NO: 20) para amplificar el producto deseado, utilizando el vector pTCVIOOlEPSPSPAC (Figura 2) como plantilla. SEQ ID NO: 20 Adh5Pac cgagttcttatagtagatttcaccttaattaaaac El producto RCP resultante se clona en PCR-BluntlI (Invitrogen). El fragmento Pací : Hin II I se corta de la clona genómica del arroz (Figura 1) y se inserta en el plásmido pTCVIOOl para generar el plásmido pTCVEPSPSPH (Figura 9) . Posteriormente, el producto de RCP Pacl/Ncol obtenido anteriormente y que comprende al intrón Adhl, se inserta en el plásmido pTCVEPSPH de la manera mostrada en el esquema (Figura 9). El fragmento Pacl : EcoRV presente en el gen EPSPS clonado que contiene la doble mutante (Figura 10) se corta y se reemplaza por el fragmento Pacl/í.coRV proveniente del pTCVEPSPSPH que comprende la secuencia del intrón Adhl (Figura 9) . Finalmente, el gen EPSPS completo que comprende la secuencia Adhl se corta del pTCVEPSPSPH en forma de un fragmento Eagl/Sacl y se clona en el plásmido pBluescript SK+ para obtener el pBluSKEPSPSADH (Figura 11) . EJEMPLO 7. Introducción de la secuencia consensual optimizada pre ATG (Kozak) mediante mutagénesis dirigida a sitio para obtener construcciones que comprendan el intrón Adhl del maiz Opcionalmente, se realiza una mutagénesis dirigida a sitio en las construcciones que contienen el intrón Adhl, empleando el paquete de Mutagénesis Dirigida a Sitio QuickChange (Stratagene) . Esto se realiza en el fragmento Pací/ Sacl EPSPS del pBluescript SK+ (Figura 11) antes de la fusión con las fusiones intensificador: promotor EPSPS. Se utilizan los siguientes oligonucleótidos de conformidad con los protocolos - - proporcionados, para optimizar la secuencia KOZAK. SEQ ID NO: 21 Oskozak 5' GGACCCGTGCAGCTGCGGTACCATGGCGGCGACCATGGC 3' SEQ ID NO: 22 OSkozakrev 5' GCCATGGTCGCCGCCATGGTACCGCAGCTGCACGGGTCC 3' Las clonas se analizan por análisis de restricción, utilizando JCpnl, en el plásmido recuperado. El ADN alterado de manera correcta se caracteriza mediante un sitio de restricción Kpnl adicional en comparación con el ADN inalterado. Después, la secuencia se verifica mediante una secuenciación de ADN automática. La secuencia de ADN alterada se puede transferir a construcciones originales utilizando sitios únicos de enzimas de restricción de Sphl ó Pací en el extremo 5' y Avrll ó EcoRV en el extremo 3', conforme sea apropiado para cada vector. EJEMPLO 8. Conclusión de cartuchos de expresión EPSPS que comprenden, en dirección de 5' a 3' , la región o regiones intensificadoras, la región cadena arriba del promotor EPSPS del arroz, el promotor EPSPS, el EPSPS 5'UTR + (opcional) intrón 1 de Adhl del maiz, región codificadora del péptido de transición del plástido EPSPS del arroz, la región codificadora de EPSPS madura del arroz y la región terminadora del gen EPSPS del arroz Las fusiones de promotor EPSPS del arroz con un intensificador y con doble intensificador (Ejemplos 4 y 5) contenidas en los vectores pCRBlunt-II-TOPO, se cortan utilizando las enzimas Xbal y Pací (RA) o Notl y Pací (MPU) y se insertan en la clona pBluescript SK+, digerida de manera similar, que contiene el resto de la secuencia EPSPS del arroz (Figuras 7/11) . Esta etapa de clonación final da como resultado las construcciones génicas requeridas. Ejemplos de construcciones (cartuchos de expresión EPSPS) obtenidas utilizando las estrategias anteriores, se presentan en la Tabla 1 siguiente. En las Figuras 14-16 se proporcionan mapas esquemáticos.

Ensamblaje Adicional Opcional de Construcciones de ADN Uso de promotores de EPSPS mínimos La región promotora tanto del promotor de la actina del arroz como de los promotores de poliubiquitina del maíz están bien definidas. En estos ejemplos el promotor nativo de estos genes, que comprende la caja "TATA", es reemplazado por el promotor EPSPS del arroz. En este ejemplo, el promotor EPSPS se utiliza para reemplazar la región promotora en el gen de la actina del arroz. Un técnico en la materia observará que se puede usar una metodología similar con una variedad de genes. El promotor de EPSPS se introduce en el gen de la actina del arroz por PCR. Inicialmente se realizan cuatro reacciones de PCR independientes. Se emplean los cebadores RA5E (SEQ ID NO: 23) y RA3E (SEQ ID NO: 24) con plantilla de ADN genómico del arroz para amplificar el elemento intensificador de la actina del arroz; los cebadores RA5I (SEQ ID NO: 25) y RA3I (SEQ ID NO: 26) se utilizan con ADN genómico del arroz para amplificar el intrón de la actina del arroz; los cebadores EPROM53 (SEQ ID NO: 27) y EPROM3 (SEQ ID NO: 28) se utilizan para amplificar la región de EPSPS del arroz que comprende al promotor; y los cebadores REPSPS5 (SEQ ID NO: 29) y REPSPS3 (SEQ ID NO: 30) se utilizan para amplificar el gen EPSPS del arroz entre el sitio de inicio de traducción y el sitio EcoRV (véase la Figura 1) . Cada producto de PCR individual se junta, en orden, por PCR sucesivas puesto que cada cebador utilizado para amplificar la región contiene un ligador con el siguiente. En la Figura 13 se presenta una representación esquemática del proceso.

(SEQ ID NO: 23) RA5E 5' tctctagactcagccgcctttcactac 3' (SEQ ID NO: 24) RA3E 5'aaacccgggtttggaagcggagggagGAAGGAGGAGATAAAG 3' (SEQ ID NO: 25) RA5I 5' ACCCTCCCCTCTCtaaatcgattggtgggaggggagag 3' (SEQ ID NO: 26) RA3I 5' ggtctacctacaaaaaagctccgcacgagGGTACCGCCGCTGGTAC 3' (SEQ ID NO: 27) EPROM53 5' CCTTCGCCTCCCCTCcttcctcctctatttcttc 3' (SEQ ID NO: 28) EPROM3 5' gttggtgggaggggagagATTTAGCTAACCACC 3' (SEQ ID NO: 29) REPSPS5 5' GTTTTTTCGAGGCGTGCTCccatggcggcgaccatggcgtcc 3' (SEQ ID NO: 30) REPSPS3 5' ggaggatatcataccttcgtaagc 3' El fragmento de ADN final obtenido, que comprende el intensificador de la actina del arroz, el promotor de EPSPS, el intrón de la actina del arroz y el gen EPSPS del arroz hasta el sitio EcoRV, se introduce en pBluSK+EPSPS (Figura 7), en forma de un fragmento Xbal/iScoRV para obtener, por ejemplo, el ZEN26. El cartucho de expresión completo, entonces, se puede cortar en forma de un fragmento Xmal para posterior subclonación. Un técnico en la materia observará que se pueden utilizar diferentes longitudes del promotor de EPSPS y que es posible emplear diferentes componentes, tales como el intensificador y el intrón de poliubiquitina del maíz, de una manera similar. EJEMPLO 10. Preparación de ADN para transformación de plantas El procedimiento anterior describe el ensamblaje de "cartuchos de expresión EPSPS" que comprenden, en dirección de 5' a 3', una secuencia o secuencias intensificadoras, un promotor EPSPS del arroz, una región codificadora de un péptido de transición EPSPS del arroz, una región codificadora de una enzima EPSPS del arroz madura que es resistente al glifosato ya que tiene cambios de T a I y de P a S en las posiciones especificadas, y un terminador del gen EPSPS del arroz. Opcionalmente, los cartuchos deseados además también comprenden un gen marcador de selección de fármacos (e.g., resistencia a ampicilina, resistencia a kanamicina, etc.), una región de Borde Derecha o Izquierda de ADN-T y (opcionalmente) una región de pegote agregada 5' y/ó 3' a la construcción anteriormente descrita. Un técnico en la materia reconocerá que se pueden utilizar métodos similares a los anteriormente descritos, para obtener estos componentes agregados y clonarlos en las posiciones deseadas.

EJEMPLO 11. Transformación de lineas de maiz utilizando una cepa de Agroba c ter i ?m que contiene un vector superbinario que incluye un cartucho de expresión EPSPS entre los bordes derecho e izquierdo <iel ADN-T; selección y regeneración de células de planta y plantas que son resistentes al glifosato Construcción de la cepa de Agrobacteri um El ADN de plásmido Bluescript (e.g. ZEN7, ZEN8, ZEN17, ZEN19, ZEN18, ZEN21 y ZEN22) se somete a una digestión con Xmal ó con Xbal/ Sacl y el fragmento codificador de EPSPS (~ 5.5-7 kb) obtenido de esta manera, se liga en una posición del sitio de clonación ubicada entre los bordes derecho e izquierdo del ADN-T de pSBl restringido de manera similar. En caso, por ejemplo, de utilizar el fragmento Xmal del pZENld, este ligamiento crea el plásmido pZEN18SBll (Figura 16) . La construcción del plásmido pSBll y la construcción de su progenitor, pSB21, está descrita por Komari et a-Z . (1996, Plant J. 10:165-174) . La región de ADN-T del pZEN8 se integra al vector pSBl superbinario (Saito et al . EP 672 752 Al) por un proceso de recombinación homologa (Figura 17), para crear el plásmido pSBIZENd. Para lograr esto, el plásmido pZEN8SBll es transformado en la cepa de E. coli HB101, la cual, posteriormente, de conformidad con el método de triple cruza de Ditta et al . (1980. Proc . Nat 'l Acad. Sci .

- USA. 77:7347:7351), se casa con un Agrobacteri um LBA4404 portador de pSBl, para crear la cepa transformada de Agrobacteri um LBA4404 (pSBIZENd), en la cual la presencia del plásmido cointegrado pSBlZENd se selecciona con base en la resistencia a la espectinomicina. La identidad del pSBIZENd también se confirma con base en un análisis de restricción con Sal 1 (Figura 17) . Las cepas LBA4404 que contienen las construcciones análogas directamente PSB1ZEN7, pSBlZEN17, pSBlZEN19, pSBZEN21 y pSBZEN22 se construyen de manera similar partiendo de los fragmentos Xmal de pZEN7, ZEN17, ZEN19, ZEN21 y ZEN22. Alternativamente, utilizando métodos similares a los anteriormente descritos, un fragmento similar de pZEN7, ZEN8, etc., se recombina homólogamente en una posición entre los bordes derecho e izquierdo del vector superbinario pTOKl62 (Fig. 1 en la Patente Norteamericana US 5591616) para generar un conjunto similar de plásmidos cointegrados seleccionados en Agrobacteri um con base en la resistencia combinada a kanamicina y espectinomicina. La cepa de Agrobacteri um LBA4404 que tiene un plásmido cooperador PAL4404 (que tiene una región vir completa) , está disponible en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo (ATCC 37349) . Una cepa útil alternativa es Agrobacteri um EHA101 (1966, Hood et al . , J. Bacteriol., 168(3): 1283-1290), la cual tiene un plásmido cooperador que tiene la región vir de la cepa fuertemente virulenta de Agrobacteri um tumefaciens A2dl. Preparación de suspensiones de Agrobacteri um Las cepas de Agrobacterium LBA4404 (pSBlZEN7), LBA4404 (pSBIZENd), etc., se inoculan en placas que contienen medio sólido "PHI-L" y se cultivan a 2d°C en la oscuridad durante 3 a 10 días. El medio PHI-L es como el que se describe en la página 26 (Ejemplo 4) de la Publicación Internacional WO 9d/32326. El medio PHI-L preparado con agua doblemente destilada, comprende 25 mL/L de solución concentrada A, 25 mL/L de solución concentrada B, 450.9 mL/L de solución concentrada C y 50 mg/L de espectinomicina. Las soluciones concentradas se esterilizan por autoclave o filtración. La solución concentrada A comprende 60 g/L de K2HP04 y 20 g/L de NaH2P04, ajustados a pH 7.0 con KOH: la solución concentrada B comprende 6 g/L de MgS04 - 7H20, 3 g/L de KCl, g/L de NH4C1, 0.2 g/L de CaCl2 y 50 mg/L de FeS04 - 7H20: la solución concentrada C contiene 5.56 g/L de glucosa y 16.67 g/L de agar (A-7049, Sigma Chemicals, St. Louis, Mo. EUA) . Alternativamente, las Agrobacteria se cultivan durante 3 a 10 días en una placa conteniendo medio YP (5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de peptona, 5 g/L de NaCl , 15 g/L de agar, a pH 6.d) de la manera descrita por Ishida et al . (1996, Nature Biotechnology, 14, 745-750) o, alternativamente, de la manera descrita por Hei et al . en la Patente Norteamericana No. 5,591,616 (medio AB (Drlica y Kado, 1974; Proc. Nat ' 1 Acad. Sci . USA. 71:3677-3661)) pero, en cada caso, modificado para proporcionar la selección de antibiótico apropiada (e.g., con un contenido de 50 mg/mL de espectinomicina en el caso de la cepa de Agrobacterium LBA4404 (pSBlZEN7), etc., o con un contenido de 50 mg/mL de espectinomicina y 50 mg/mL de kanamicina en el caso de que Agrobacteri um contenga un vector superbinario derivado de pTOK 162) . Las placas de Agrobacteri um preparadas de la manera anteriormente descrita, se almacenan a 4°C y se utilizan dentro de un periodo de un mes después de su preparación. Para la preparación de las suspensiones, una sola colonia de la placa maestra se inocula en una placa que contiene, a pH 6.8, 5 g/L de extracto de levadura (Difco), 10 g/L de peptona (Difco), 5 g/L de NaCl, 15 g/L de agar (Difco) y 50 mg/L de espectinomicina (o como sea apropiado para la cepa de Agrobacteri um particular) . Las placas se incuban a 28°C en la oscuridad durante 2 días. Las suspensiones de Agrobacterium para la transformación de material de planta, se preparan de manera similar a la descrita en la Patente Norteamericana No. 5,591,616. (Utilizando buenas prácticas microbiológicas para evitar contaminación de cultivos asépticos, asadas de 3 x 5 mm de Agrobacteri um se toman de las placas, se transfieren y se suspenden en 5 mL de medio líquido AA estéril en un tubo de Falcon de 14 mL. Tal como se utiliza en la presente, el medio líquido AA a pH 5.2 contiene las principales sales inorgánicas, aminoácidos y vitaminas definidas por Toriyama y Hinata (1965) en Plant Science 41, 179-163) , las sales inorgánicas menores del medio Murashige y Skoog (Murashige y Skoog, 1962 en Physiol. Plant 15, 473-497), 0.5 g/L de casaminoácidos (hidrolizado de caseína), 1 mg/L de ácido 2, 4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 0.2 mg/L de cinetina, 0.1 mg/L de giberelina, glucosa 0.2M, sacarosa 0.2M y acetosiringona 0.1 mM. Alternativamente, se preparan suspensiones de Agrobacteri um para la transformación de material de planta de manera similar a la descrita en la Publicación Internacional WO 96/32326. Se toman de las placas asadas de 3 x 5 mm de Agrobacteri um, se transfieren y se suspenden en 5 L del medio básico PHI-A estéril de la manera descrita en el Ejemplo 4 de la página 26 de la Publicación Internacional WO 9d/32326 ó, alternativamente, se suspenden en 5 mL de medio PHI-I combinado estéril también descrito en el Ejemplo 4 de la página 26 de la Publicación Internacional WO 9d/32326. En cualquier caso, también se agregan 5 mL de 3' , 5' -dimetoxi-4' -hidroxiacetofenona 100 mM. El medio básico PHI-A a pH 5.2, comprende 4 g/L de sales básales CHU(N6) (Sigma C-1416), 1.0 mL/L de mezcla vitamínica de Eriksson (1000X, Sigma E-1511), 0.5 mg/L de tiamina-HCl, 1.5 mg/mL de 2,4-D, 0.69 g/L de L-prolina, 66.5 g/L de sacarosa y 68.5 g/L de glucosa. El medio PHI-I combinado, también ajustado a pH 5.2 con KOH y esterilizado por filtración, comprende 4.3 g/L de sales MS (GIBCO-BRL) , 0.5 mg/mL de ácido nicotínico, 0.5 mg/mL de piridoxina-HCl, 1.0 mg/mL de tiamina-HCl, 100 mg/L de mioinositol, 1 g/L de casaminoácidos con ensayo de vitaminas (Difco), 1.5 mg/mL de 2,4-D, 0.69 g/L de L-prolina, 68.5 g/L de sacarosa y 36 g/L de glucosa. Alternativamente, las suspensiones de Agrobacterium para la transformación de material de planta también se preparan de manera similar a la descrita por Ishida et a-Z. (1996) Nature Biotechnology, 14, 745-750. Se toman de las placas asadas de 3 x 5 mm de Agrobacteri um, se transfieren y se suspenden en 5 mL de medio LS-inf. El medio LS-inf (Linsmaier y Skoog, 1965, Physiol. Plant 16, 100-127) ajustado a pH 5.2 con KOH, contiene las sales inorgánicas mayores y menores LS, 0.5 mg/mL de ácido nicotínico, 0.5 mg/mL de piridoxina-HCl, 1.0 mg/mL de tiamina-HCl, 100 mg/L de mioinositol, 1 g/L de casaminoácidos con ensayo de vitaminas (Difco), 1.5 mg/mL de 2,4-D, 68.5 g/L de sacarosa y 36 g/L de glucosa. De cualquier manera que sea producida, la suspensión de Agrobacteri um se mezcla en vórtex para obtener una suspensión pareja y la población de células se ajusta a un valor entre 0.5 x 109 y 2 x 109 ufc/mL (de preferencia el valor inferior) . 1 x 109 ufc/mL corresponde a un DO (1 cm) de -0.72, a 550 nm. Se hacen alícuotas de las suspensiones de Agrobacterium en lotes de 1 mL, en tubos de microcentrífuga estériles de 2 mL y se utilizan tan pronto como sea posible. Lineas de maiz para transformación Las líneas de maíz adecuadas para la transformación incluyen, pero no se restringen a, A188, Fl P3732, Fl (A188 x B73Ht) , Fl (B73Ht x A186), Fl (Al88 x BMS) . Las variedades A188, BMS (Black Mexican S eet) y B73 Ht, se obtienen en el Ministerio de Agricultura, Foresta y Pesca. La línea P3732 se obtiene en IWATA RAKUNOU KYODOKUMIAI . Las líneas de maíz adecuadas también incluyen una variedad de A18d x cruzas endogámicas (e.g., PHJ90 x A166, PHN46 x A188, PHPP8 x A188 en la Tabla 8 de la Publicación Internacional WO 98/32326) , así como cruzas élite de diferentes grupos heteróticos (e.g., PHN46, PHP28 y PHJ90 en la Tabla 9 de la Publicación Internacional WO 98/32326) .

Por ejemplo, se producen embriones inmaduros del maíz "Hi-II". "Hi-II" es un híbrido entre cruzas endogámicas (A188 x B73) generadas por cruzas recíprocas entre Hi-II progenitor A y Hi-II progenitor B disponibles en el Centro de Cepas para Cooperación en Genética del Maíz, Universidad de Illinois en Champaign, Urbana, Illinois) . Las semillas, denominadas semillas "Hi-II" obtenidas de estas cruzas, se plantan en un invernadero o en un campo. Las plantas Hi-II resultantes se autopolinizan o se polinizan de manera cruzada con plantas hermanas . Preparación de embriones inmaduros, infección y cocultivo La transformación de embriones inmaduros del maíz, se lleva a cabo poniendo en contacto los embriones inmaduros con las cepas recombinantes adecuadas de Agrobacterium anteriormente descritas. El término "embrión inmaduro" significa el embrión de una semilla inmadura que está en etapa de maduración después de la polinización. Los embriones inmaduros son un tejido intacto que es capaz de realizar división celular para dar origen a células de callo, las que posteriormente se pueden diferenciar para producir los tejidos y órganos de una planta completa. El material preferido para la transformación también incluye la escutelo de los embriones, la cual también es capaz de inducir callos diferenciados con la capacidad de regenerarse hasta plantas fértiles normales habiendo sido inicialmente transformados. El material preferido para la transformación, entonces, también incluye callos derivados de tales embriones zigóticos inmaduros diferenciados o escutelos . Los embriones de maíz inmaduros se aislan asépticamente de las espigas en desarrollo, de la manera descrita por Green y Phillips (1976, Crop. Sci. 15:417-421) o, alternativamente, por los métodos de Neuffer et al . (1982, "Growing Maize for genetic purposes" in Maize for biological research, W.F. Sheridan ed., University Press, University of North Dakota, Grand Forks, North Dakota, EUA) . Por ejemplo, embriones de maíz inmaduros entre 1-2 mm (de preferencia de 1-1.2 mm) de longitud, se aislan asépticamente de las espigas hembra, de 9 a 12 días (de preferencia 11) después de la polinización, empleando una espátula estéril. Típicamente, se esteriliza la superficie de las espigas con hipoclorito de sodio al 2.63% durante 20 minutos, antes de lavar con agua desionizada estéril y de la remoción aséptica de los embriones inmaduros. Los embriones inmaduros (de preferencia ~100 en número) se dejan caer directamente en un tubo de microcentrífuga de 2 mL que contiene aproximadamente 2 mL del mismo medio utilizado para la preparación de la suspensión de Agrobacteri um (cuyas alternativas se describieron - 4. anteriormente) . La tapa del tubo se cierra y el contenido se mezcla en vórtex durante algunos segundos. El medio se decanta, se agregan 2 mL de medio fresco y se repite la mezcla en vórtex. Posteriormente, todo el medio es retirado hasta dejar los embriones inmaduros lavados en el fondo del tubo. Habiendo preparado los embriones de maíz inmaduros, la siguiente fase del proceso, la etapa de infección, es ponerlos en contacto con la cepa transformada de Agrobacteri um. En un ejemplo de este proceso, la etapa de infección se lleva a cabo en un medio líquido que incluye las principales sales inorgánicas y vitaminas del medio N6 (1987, Chu C.C. Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking. pp 43-50) , tal como se describe en el Ejemplo 4 de la Publicación Internacional WO 98/32326. 1.0 mL de la suspensión de Agrobacteri um preparada de la manera anteriormente descrita en medio PHI-A, se agrega a los embriones en el tubo de microcentrífuga y se mezcla con vórtex durante aproximadamente 30 segundos.

Alternativamente, se agrega 1.0 mL de la suspensión de Agrobacterium preparada, también de la manera anteriormente descrita, en medio PHI-I ó en medio LS-inf. Después de reposar durante 5 minutos, la suspensión de Agrobacteri um y embriones se vacía en una placa de Petri que contiene ya sea 1) medio PHI-B, ó 2) medio PHI-J- ó 3) medio LS-AS, de acuerdo a si la suspensión original de Agrobacterium fue preparada en medio PHI-A, PHI-I ó LS-inf, respectivamente. La suspensión de Agrobacteri um se retira utilizando una pipeta Pasteur, los embriones se manipulan de tal manera que queden con el eje lateral hacia abajo en el medio, la placa se sella con película parafilm y se incuba en oscuridad a 23-25°C durante 3 días de cocultivo. El medio PHI-B a pH 5.8 comprende 4 g/L de sales básales CHU(N6) (Sigma C-1416), 1.0 mL/L de mezcla vitamínica de Eriksson (1000X, Sigma E-1511), 0.5 mg/L de tiamina-HCl, 1.5 mg/mL de 2,4-D, 0.69 g/L de L-prolina, 0.85 mg/L de nitrato de plata, 30 g/L de sacarosa, acetosiringona 100 mM y 3 g/L de geirite (Sigma). El medio PHI-J, también ajustado a pH 5.8, comprende 4.3 g/L de sales MS (GIBCO-BRL) , 0.5 mg/mL de ácido nicotínico, 0.5 mg/mL de piridoxina-HCl, 1.0 mg/mL de tiamina-HCl, 100 mg/L de mioinositol, 1.5 mg/L de 2,4-D, 0.69 g/L de L-prolina, 20 g/L de sacarosa, 10 g/L de glucosa, 0.5 g/L de MES (Sigma) , acetosiringona 100 mM y 8 g/L de agar purificado (Sigma A-7049) . El medio LS-AS (Linshmaier y Skoog, 1965, Physiol. Plant 18, 100-127), ajustado a pH 5.8 con KOH, contiene las sales inorgánicas mayores y menores LS, 0.5 mg/mL de ácido nicotínico, 5 mg/mL de - - piridoxina-HCl, 1.0 mg/mL de tiamina-HCl, 700 mg/L de L-prolina, 100 mg/L de mioinositol, 1.5 mg/mL de 2,4-D, 20 g/L de sacarosa, 10 g/L de glucosa, 0.5 g/L de MES, acetosiringona 100 mM y 8 g/L de agar purificado (Sigma A-7049) . Después de la preparación de los embriones inmaduros, de la manera anteriormente descrita, un método alternativo para lograr la transformación es infectarlos durante y después de un periodo de desdiferenciación, tal como se describe en la Patente Norteamericana 5,591,616. Los embriones inmaduros se colocan en medio sólido LSD 1.5 que contiene sales inorgánicas LS y vitaminas junto con 100 mg/mL de casaminoácidos, 700 mg/L de L-prolina, 100 mg/L de mioinositol, 1.5 mg/mL de 2,4-D, 20 g/L de sacarosa y 2.3 g/L de geirite. Después de 3 semanas a 25°C, los callos originados de las escutelos se colectan en un tubo de microcentrífuga de 2 mL y se sumergen en 1 mL de suspensión de Agrobacterium preparada de la manera anteriormente descrita, en medio AA. Después de reposar durante 5 minutos, los callos resultantes se transfieren a un medio sólido 2N6 que contiene acetosiringona 100 µM y se incuban en oscuridad a 25°C durante un periodo de 3 días de cocultivo. El medio sólido 2N6 comprende las sales inorgánicas y vitaminas del medio N6 (Chu C.C., 1978; Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking, pp. 43-50) conteniendo 1 g/L de casaminoácidos, 2 mg/L de 2,4-D, 30 g/L de sacarosa y 2 g/L de geirite. "Reposo y Selección de las transformantes" Después del cocultivo, los embriones, opcionalmente, son transferidos a una placa que contiene medio PHI-C, se sellan con película parafilm y se incuban en oscuridad durante 3 días, para una "etapa de reposo" antes de la selección. El medio PHI-C a pH 5.8 comprende 4 g/L de sales básales CHU(N6) (Sigma C-1416), 1.0 mL/L de mezcla vitamínica de Eriksson (1000X, Sigma E-1511) , 0.5 mg/L de tiamina-HCl, 1.5 mg/mL de 2,4-D, 0.69 g/L de L-prolina, 0.85 mg/L de nitrato de plata, 30 g/L de sacarosa, 0.5 g/L de MES, 100 mg/L de carbenicilina y 8 g/L de agar purificado (Sigma A-7049) . Tal como se describe en la Publicación Internacional WO 98/32326, lo deseable de incluir esta etapa de reposo en el proceso total de transformación varía de conformidad con la línea de maíz y es materia de experimento. Para la etapa de selección, se transfieren aproximadamente 20 embriones en cada una de un número de placas frescas que contienen medio de selección PHI-D ó medio de selección LSD 1.5, se sellan con película parafilm y se incuban en oscuridad a 28°C. El medio de selección PHI-D, ajustado a pH 5.8 con KOH, comprende 4 g/L de sales básales CHU(N6) (Sigma C-1416), 1.0 mL/L de mezcla vitamínica de Eriksson (1000X, Sigma E-1511), 0.5 mg/L de tiamina-HCl, 1.5 mg/mL de 2,4-D, 0.69 g/L de L-prolina, 0.65 mg/L de nitrato de plata, 30 mg/L de sacarosa, 0.5 g/L de MES, 100 mg/L de carbenicilina, 8 g/L de agar purificado (Sigma A-7049) y entre 0.1 mM y 20 mM de N- (fosfonometil) -glicina de grado para cultivos de tejidos (Sigma P-9556) . El medio de selección LSD 1.5, ajustado a pH 5.8 con KOH, comprende las sales inorgánicas mayores y menores de LS (Linsmaier and Skoog, 1965, Physiol. Plant 16, 100-127), 0.5 mg/mL de ácido nicotínico, 0.5 mg/mL de piridoxina-HCl, 1.0 mg/mL de tiamina-HCl, 700 mg/L de L-prolina, 100 mg/L de mioinositol, 1.5 mg/mL de 2,4-D, 20 g/L de sacarosa, 0.5 g/L de MES, 250 mg/L de cefotaxima, 8 g/L de agar purificado (Sigma A-7049) y entre 0.1 y 20 mM de N- (fosfonometil) -glicina de grado para cultivo de tejidos (Sigma P-9556) . Alternativamente, en caso de que la materia prima para la selección sean callos derivados de embriones inmaduros, tal como se describe en la Publicación Internacional WO 5,591,616, entonces tales callos se lavan con agua esterilizada que contiene 250 mg/L de cefotaxima antes de cultivar en medio de selección LSD 1.5. Los embriones o grupos de células que proliferan de los embriones inmaduros se transfieren (si es necesario utilizando un escalpelo estéril) a placas que contienen medio de selección fresco a intervalos de 2 semanas, por un periodo total de aproximadamente 2 meses. Los callos resistentes al herbicida, posteriormente, se abultan por el crecimiento continuo en el medio hasta que el diámetro de los callos seleccionados exceda aproximadamente 1.5 cm. La concentración de N- (fosfonometil) -glicina en el medio de selección, se elige apropiadamente para seleccionar un número deseable de transformantes genuinas y de preferencia está en el rango de 0.3 a 5 mM. De preferencia, la concentración de N- (fosfonometil) -glicina utilizada en el medio de selección, es de aproximadamente 1 mM para las dos primeras semanas de selección y de aproximadamente 3 mM en lo posterior. Regeneración de transformantes/propagación y análisis del material de planta transformado Los callos seleccionados se regeneran en plantas fértiles normales de acuerdo, por ejemplo, con los métodos descritos por Duncan et ai. (1985, Planta, 165, 322-332) por Kamo et al . (1985, Bot. Gaz. 146(3), 327-334) y/o por West et al . (1993, The Plant Cell, 5, 1361-1369) y/o por Shillito et al . (1969) Bio/Technol. 7, 581-5d7. Por ejemplo, los callos seleccionados de diámetro de 1.5 a 2 cm se transfieren al medio de regeneración/maduración y se incuban en oscuridad durante aproximadamente 1 a 3 semanas para permitir que los embriones somáticos maduren. Un medio de regeneración adecuado, el medio PHI-E (Publicación Internacional WO 98/32326) se ajusta a pH 5.6 con KOH y comprende 4.3 g/L de sales MS (GIBCO-BRL) , 0.5 mg/mL de ácido nicotínico, 0.5 mg/mL de piridoxina-HCl, 0.1 mg/mL de tiamina-HCl, 100 mg/L de mioinositol, 2 mg/L de glicina, 0.5 mg/L de zeatina, 1.0 mg/mL de ácido indolacético, ácido abscísico 0.1 mM, 100 mg/L de carbenicilina, 60 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar purificado (Sigma A-7049) y, opcionalmente, entre 0.02 mM y 1 mM de N- (fosfonometil) -glicina de grado para cultivo de tejidos (Sigma P-9556) . Después, los callos se transfieren al medio de enraizamiento/regeneración y se hacen crecer a 25°C bajo un programa de 16 horas de luz diurna (270 mE pf2 s"1) y 8 horas de oscuridad, o bajo iluminación continua (~250 mE pf- s"1) , hasta un momento en el cual se desarrollen brotes y raíces. Los medios de enraizamiento/regeneración adecuados son ya sea medio LSZ, tal como se describe en el párrafo siguiente (que opcionalmente no contiene fosfonometilglicina) o bien, medio PHI-F a pH 5.6, el cual comprende 4.3 g/L de sales MS (GIBCO-BRL) , 0.5 mg/mL de ácido nicotínico, 0.5 mg/mL de piridoxina-HCl, 0.1 mg/mL de tiamina-HCl, 100 mg/L de mioinositol, 2 mg/L de glicina, 40 g/L de sacarosa y 1.5 g/L de geirite.

Alternativamente, los callos seleccionados se transfieren directamente al medio de regeneración LSZ ajustado a pH 5.8 con KOH y que comprende las sales inorgánicas mayores y menores LS (Linsmaier y Skoog, 1965, Physiol. Plant 18, 100-127), 0.5 mg/mL de ácido nicotínico, 0.5 mg/mL de piridoxina-HCl, 1.0 mg/mL de tiamina-HCl, 700 mg/L de L-prolina, 100 mg/L de mioinositol, 5 mg/mL de zeatina, 20 g/L de sacarosa, 0.5 g/L de MES, 250 mg/L de cefotaxima, 8 g/L de agar purificado (Sigma A-7049) y, opcionalmente, entre 0.02 mM y 1 mM de N- (fosfonometil) -glicina de grado para cultivo de tejidos (Sigma P-9556) . Después de un periodo de incubación en oscuridad, las placas se someten a iluminación (continua o en ciclos de luz/día, tal como se describió anteriormente) y las plántulas se regeneran. Las plántulas pequeñas se transfieren a tubos de vidrio individuales que contienen ya sea medio PHI-F, o medio LSF de media fuerza, a pH 5.8, que comprende las sales principales LS (Linsmaier y Skoog, 1965, Physiol. Plant 18, 100-127) a media fuerza, sales menores LS, 0.5 mg/mL de ácido nicotínico, 0.5 mg/mL de piridoxina-HCl, 1.0 mg/mL de tiamina-HCl, 100 mg/L de mioinositol, 20 g/L de sacarosa, 0.5 g/L de MES, 8 g/L de agar purificado (Sigma A-7049) y se hacen crecer durante aproximadamente otra 6 - semana. Posteriormente, las plántulas se transfieren a macetas de tierra, se endurecen en una cámara de crecimiento (85% de humedad relativa, 600 ppm de C02 y 250 mE pf2 s~± ) y se hacen crecer hasta la madurez en una mezcla de suelo en un invernadero. La primera generación (TO) de plantas obtenida de la manera anteriormente descrita, son semifertilizadas para obtener semillas de la segunda generación (TI) . Alternativamente (y de preferencia) la primera generación de plantas se cruza recíprocamente con otra línea de maíz no transgénica con el fin de obtener semillas de segunda generación. La progenie de estas cruzas (TI), entonces, se espera que se segregue 1:1 para el rasgo de resistencia al herbicida. Las semillas TI se siembran, se hacen crecer en un invernadero o en un campo y se evalúa el nivel de resistencia, herencia de la resistencia y segregación de la resistencia al herbicida glifosato a través de ésta y de generación subsecuentes, mediante la observación de la supervivencia diferencial de las plantas, la fertilidad y síntomas de necrosis en el tejido después de un tratamiento por rocío con glifosato (formulado de manera adecuada y, opcionalmente, en forma de sal) a un rango entre 25 y 2000 g/ha y a un rango de etapas de crecimiento entre, incluyendo, V2 y V8 (o, alternativamente, a los 7-21 días posteriores a la germinación) . Estos ensayos se llevan a cabo con relación a las segregantes susceptibles y con relación a líneas similares no transformadas de maíz que no comprenden los genes de la presente invención o invenciones similares capaces de conferir resistencia al glifosato. Las líneas transgénicas que exhiben resistencia al glifosato se seleccionan y nuevamente se autocruzan o se retrocruzan con una endogámica no transgénica. En todas las etapas del proceso anterior, opcionalmente se toman muestras de tejido de los callos transformados, plántulas, material de planta TO y TI y se analizan por 1) inmunoelectrotransferencia tipo Southern y RCP con el fin de indicar la presencia, número de copias e integridad de los transgenes, 2) inmunoelectrotransferencia tipo Northern (o similar) con el fin de medir la expresión del ARNm de los transgenes, 3) inmunoelectrotransferencia tipo Western cuantitativa de geles de SDS con el fin de medir los niveles de expresión de EPSPS y 4) medición de la actividad de la enzima EPSPS en presencia y ausencia de glifosato, con el fin de evaluar con más exactitud cuánta de la EPSPS que se expresa se deriva del transgén. Tales métodos de análisis son conocidos en la técnica. Los métodos adecuados para probar la presencia, integridad y expresión del transgén por RCP, para llevar a cabo análisis de inmunoelectrotransferencia tipo Southern, para la clonación y expresión de EPSPS del arroz madura en E. coli , para la purificación de EPSPS del arroz, para la generación de anticuerpos policlonales contra EPSPS del arroz purificada, para el análisis de inmunoelectrotransferencia tipo Western de la concentración de EPSPS en tejidos de callo y de plantas y para la medición de la actividad de EPSPS en extractos derivados de plantas, a una concentración de glifosato que discrimina entre el producto de EPSPS susceptible al glifosato endógeno y el producto resistente al glifosato del transgén codificador de EPSPS, se describen con mayor detalle más adelante, en los Ejemplos 17 a 20. EJEMPLO 12. Transformación de lineas de maiz por bombardeo con partículas revestidas con ADN que incluye un cartucho de expresión de EPSPS; selección y regeneración de células de planta y plantas que son resistentes al glifosato En otro ejemplo, un callo embriogénico friable derivado de embriones de maíz inmaduros se inicia en un medio sólido y se transforma biolísticamente. De manera similar al proceso descrito en el Ejemplo 11, el callo transformado se selecciona con base en la velocidad de crecimiento diferencial en un medio que contiene un rango de concentraciones de glifosato. El callo resistente se selecciona y se regenera para obtener plántulas TO, las cuales son transferidas a macetas, se hacen crecer hasta la madurez y se autofertilizan o se fertilizan cruzadamente en - - el invernadero. Las semillas progenie (TI), posteriormente, se hacen crecer para obtener posteriores generaciones de plantas que son evaluadas con respecto a la resistencia al glifosato y analizadas con respecto a la presencia del transgén, a la integridad y a la expresión del mismo, de la manera descrita en el Ejemplo 11. Inicio del callo desde embriones inmaduros Un callo tipo II embriogénico friable adecuado para la transformación, se deriva a partir de embriones inmaduros de, por ejemplo, maíz Aldd X B73. La endogamia alternativa tal como B73-derivada y líneas híbridas de maíz, también se utilizan incluyendo, por ejemplo, aquellas listadas en el Ejemplo 11. Los embriones inmaduros de maíz entre 1-2 mm de longitud se aislan asépticamente de las espigas hembra, típicamente aproximadamente 11 días después de la polinización, empleando los métodos indicados en el Ejemplo 11. Los embriones inmaduros se plantan en, por ejemplo, un medio basado en N6 (Chu et al . , 1975, Scientia Sínica, 16, 659-66d) ajustando con KOH a un pH de 5.8, en donde el medio contiene 1 mg/L de 2,4-D, 2.9 g/L de L-prolina, 2 mg/L de L-glicina, 100 mg/L de hidrolizado de caseína, sales mayores de N6, sales menores de N6, vitaminas de N6, 2.5 g/L de geirite (ó 2 g/L de "Gelgro") y 20 g/L de sacarosa. Los medios adecuados alternativos incluyen, por ejemplo, un medio similar pero que contenga sales MS (Murashige y Skoog, 1962, Physiol. Plant, 15, 473-497) en lugar de sales N6. Alternativamente, el medio puede contener ~10 mg/L de dicamba, en lugar de 2,4-D. Los embriones inmaduros se incuban en oscuridad en el medio anterior, a ~25°C con el fin de iniciar el callo. El material de callo tipo II se selecciona por selección visual de las células embriogénicas friables de rápido crecimiento, por métodos conocidos en la técnica y como se describe, por ejemplo, en la Publicación Internacional WO 9d/44140. Por ejemplo, las células receptoras adecuadas se seleccionan manualmente eligiendo las células preferidas, las cuales pueden estar en la superficie de un grupo de células y que son identificables por su falta de diferenciación, tamaño pequeño y alta relación de volumen de núcleo/citoplasma. Se inicia un cultivo en suspensión del tejido dentro del callo que parece menos diferenciado, más blando y más friable. El tejido con esta morfología es transferido a placas frescas de medio de cultivo aproximadamente 8-16 días después del inoculo inicial de los embriones inmaduros. Después, el tejido rutinariamente es subcultivado cada 14-21 días, tomando ~10% de las piezas que alcanzan aproximadamente un gramo. En cada etapa sólo se subcultiva material que tiene la morfología tipo II ó tipo III deseada. Preparación de cultivos en suspensión celular De preferencia, en un periodo de 6 meses del inicio del callo anteriormente descrito, se inician cultivos en suspensión dispersa en medio líquido que contiene hormonas adecuadas tales como 2,4-D y NAA, opcionalmente suministrado en forma de tratamientos con cápsulas de hormonas de liberación lenta, de la manera que se describe, por ejemplo, en los Ejemplos 1 y 2 de la Patente Norteamericana US 5,550,318. Opcionalmente, los niveles de hormona en los cultivos se mantienen mediante la aplicación adicional de suplemento hormonal fresco. Los cultivos en suspensión se inician, por ejemplo, agregando aproximadamente 0.5 g de tejido de callo a un matraz de 100 mL que contiene 10 mL de medio de cultivo en suspensión. Cada 7 días el cultivo es subcultivado transfiriendo, mediante el uso de una pipeta de punta ancha estéril, 1 mL de células sedimentadas y 4 mL de medio condicionado, a un matraz fresco que contiene medio fresco. Los agregados grandes de células que no pueden pasar a través de la punta de la pipeta son excluidos en cada etapa de subcultivo. Opcionalmente, los cultivos en suspensión se pasan a través de un tamiz adecuado (e.g. malla ~0.5-l mm) en cada etapa de subcultivo. Después de 6 a 12 semanas, el cultivo se dispersa. Los medios de cultivo adecuados para la - - suspensión celular incluyen, por ejemplo, un medio ajustado a pH 6, el cual contiene sales mayores y menores de Murashige y Skoog (1962) (opcionalmente modificado para contener una cantidad reducida, 1.55 g/L de nitrato de amonio), 30 g/L de sacarosa, 0.25 mg/L de tiamina, 10 mg/L de dicamba, L-prolina 25 mM, 200 mg/L de hidrolizado de caseína, 100 mg/L de mioinositol, 500 mg/L de sulfato de potasio y 400 mg/L de fosfato ácido de potasio. Alternativamente, en lugar de dicamba, el medio de suspensión celular contiene 2,4-D y/o NAA. Crioconservación de los cultivos en suspensión celular Opcionalmente, los cultivos en suspensión obtenidos de la manera anteriormente descrita se crioconservan utilizando crioprotectores y métodos descritos, por ejemplo, en el Ejemplo 2 de la Patente Norteamericana US 5,550,316. La crioconservación requiere de la adición del crioprotector a temperatura de hielo para un enfriamiento previo de las células, también a temperatura de hielo, de una manera por pasos en un periodo de una a dos horas. La mezcla se mantiene a temperatura de hielo y el volumen eventual de crioprotector es igual al volumen de suspensión celular. Las concentraciones finales de crioprotectores son, por ejemplo, 10% de dimetiisulfóxido, 10% de polietilenglicol (peso molecular 6000), L-prolina 0.23M y glucosa 0.23M. Después de un - - periodo de 30 minutos de equilibración a temperatura de hielo, la mezcla se divide en alícuotas de ~0.5 mL, se transfiere a tubos de microcentrífuga de 2 mL y se enfría lentamente a una velocidad de 0.5°C/minuto, hasta llegar a una temperatura de -8°C. Después de un periodo de nucleación, la muestra se enfría adicionalmente y lentamente hasta -35°C y después se sumerge en nitrógeno líquido. Cuando sean requeridas para su uso, las muestras congeladas se descongelan primero bañándolas en sus recipientes con agua a ~40°C durante 2 minutos y después dejándolas derretir lentamente hasta que lo hagan por completo. La mezcla de células y crioprotectores, posteriormente, se pipetea en un filtro sobre una capa de células "alimentadoras" BMS a 25°C. Una vez que el tejido descongelado empieza a crecer, se transfiere nuevamente a medio de cultivo sólido fresco y, una vez establecido (en un periodo de 1 a 2 semanas), es transferido a medio de cultivo de suspensión celular. Una vez que el crecimiento en cultivo en suspensión líquida se restablece, las células se utilizan para la transformación. Transformación mediada por partículas El ADN derivado del plásmido pIGPD9 (Figura 12) que contiene cartuchos de expresión EPSPS Xmal (i.e., pZEN6i, ZENlOi, etc.) se purifica, se acumula (e.g. por cromatografía de intercambio aniónico o aislamiento - - densitométrico en gradiente de CsCl2 de ADN plasmídico a partir de células de una cepa huésped adecuada de E. coli HisB-, Rec A- (e.g., DH5a: hisB-) después de crecer hasta la fase estacionaria en un medio mínimo 5xA (K2HP04 52.5 g, K2HP04 22.5 g, (NH4)2S04, 5 g, y citrato de sodio-2H20, 2.5 g por litro) ) y se obtiene en forma de una solución concentrada (de preferencia ~1 mg/mL) en agua estéril. El ADN se proporciona como un ADN plasmídico circular o, alternativamente, se corta con la enzima de restricción Xmal para obtener un fragmento lineal que contiene el cartucho de expresión de EPSPS y se utiliza después de una purificación por electroforesis en gel de agarosa y electroelución. El aparato adecuado para el bombardeo es, por ejemplo, la pistola de helio PDS1000 de Biorad. El recipiente se coloca 5-6 cm por debajo de la pantalla de detención utilizada para detener el macroproyectil de Kapton. La construcción de ADN se precipita en partículas de tungsteno o de oro con un diámetro promedio ~1.0 µm de manera similar a la descrita por Klein et a-Z. 1987, Nature, 327, 70-73. Por ejemplo, 1.25 mg de partículas de tungsteno o de oro (lavadas previamente con etanol a 65°C durante 12 horas) se mezclan, en orden sucesivo, con ~20-30 mg de ADN, CaCl2 1. ÍM y espermidina 8.7 mM, hasta un - - volumen final de ~0.6 mL. La mezcla se agita en un vórtex durante 10 minutos a 0- °C, se somete a centrifugación a baja velocidad (~500 x g) durante 5 minutos y el sobrenadante se decanta para dejar las partículas de tungsteno suspendidas en un volumen final de ~30 mL. Se pipetean alícuotas de 1-10 µL en el macroproyectil de la pistola de partículas. Los cultivos en suspensión derivados del callo tipo II y/o tipo III se mantienen en cultivo durante 3-5 meses (o, alternativamente, se recuperan de una crioconservación) , se subcultivan y después se tamizan a través de una malla de acero inoxidable de ~0.5-1.0 mm. Aproximadamente 0.5 mL de células empacadas recuperadas del filtrado, se pipetean en papeles filtro de 5 cm y se secan al vacío antes de transferirlos a una caja de Petri que contiene una pila de tres papeles filtro de 7 cm humedecidos con medio de cultivo en suspensión. Cada placa o caja de células en suspensión se centra en la charola de muestras, se quita la tapa de la caja de Petri y se bombardea dos veces a un vacío de 28 pulgadas de mercurio. Se colocan pantallas de 0.1 ó 1.0 mm se colocan opcionalmente a aproximadamente 2.5 cm por debajo de la placa de detención, con el fin de disminuir los daños al tejido bombardeado. Después del bombardeo, las células de - planta se retiran del filtro, se resuspenden en medio de cultivo de suspensión celular y se cultivan durante 2 a 21 días. Alternativamente, el callo bombardeado se transfiere, de caja a caja, a una caja que contiene un medio sólido similar (por ejemplo, que contiene d g/L de agar purificado) y se cultiva de manera similar, a ~25°C en oscuridad. Selección de las transformantes Después de la transformación, las células que crecen en cultivo líquido o sólido no seleccionado, se transfieren a filtros y se les pone una sobrecapa de medio sólido que contiene un rango (de 0.1 a 20 mM) de concentraciones de selección de N- (fosfonometil) -glicina de grado para cultivo de tejidos (Sigma) . Los medios de selección sólidos adecuados incluyen medios, ajustados a pH 5.6 ó 6.0 con KOH, que contienen ya sea sales MS o sales N6 (tales como aquellas anteriormente descritas para el inicio del callo o, con una adición adecuada de agar, aquellas descritas anteriormente para el crecimiento de células en suspensión líquida) y N- (fosfonometil) -glicina. Los medios de selección adecuados también incluyen, por ejemplo, los medios de selección descritos en el Ejemplo 11, pero en este caso modificados para que carezcan de antibióticos. Los callos transformados que expresan la enzima EPSP sintetasa resistente se seleccionan con base en su - - crecimiento a concentraciones inhibitorias de preparaciones similares de células no transformadas. Los grupos en crecimiento se subcultivan en medio selectivo fresco. De preferencia, la concentración de N- (fosfonometil) -glicina utilizada en el medio de selección, es de aproximadamente 1 mM durante las primeras dos semanas de selección y aproximadamente 3 mM en lo sucesivo. Después de 6 a 16 semanas, los callos resistentes putativos se identifican y se seleccionan. Regeneración de transformantes/Propagación y Análisis del material de planta transformado Los callos seleccionados se regeneran en plantas fértiles normales de conformidad, por ejemplo, con los métodos descritos por Duncan et al . (1985, Planta, 165, 322-332) por Kamo et al . (1985, Bot . Gaz. 146(3), 327-334) y/o por Est et a-Z. (1993, The Plant Cell, 5, 1361-1369) y/o por Shillito et al . (1989) Bio/Technol. 7, 561-587. Por ejemplo, las plantas se regeneran eficientemente mediante la transferencia del callo embriogénico a un medio de Murashige y Skoog ajustado a pH 6.0, que contiene 0.25 mg/L de 2,4-D, 10 mg/L de 6-bencilaminopurina y, opcionalmente, N- (fosfonometil) -glicina de 0.02 a 1 mM. Después de ~2 semanas, el tejido se transfiere a un medio similar pero que carece de hormonas. Opcionalmente, el nivel de hormonas se disminuye - - por etapas a través de más transferencias y por un periodo más prolongado de tiempo hasta de 6 a 8 semanas. Los brotes que se desarrollan después de 2 a 4 semanas, se transfieren a medio MS que contiene 1% de sacarosa y solidificado con 2 g/L de Gelgro, en donde los brotes echan raíces. Alternativamente, los métodos y medios utilizados para la regeneración son como los del Ejemplo 11, excepto que el medio utilizado no contiene antibiótico. Los métodos para hacer crecer las plantas hasta la madurez, para la posterior propagación de las plantas por generaciones, para el análisis de la herencia de la resistencia al glifosato y para el análisis de la presencia, integridad y expresión del transgén EPSPS, se describen en el Ejemplo 11. EJEMPLO 13. Transformación de lineas de maiz con ADN que incluye un cartucho de expresión de EPSPS revestido en filamentos de carburo de silicio; selección y regeneración de células de planta y plantas que son resistentes al glifosato En un ejemplo adicional, líneas de maíz incluyendo, por ejemplo, líneas híbridas que tienen el genotipo A188 x B73, se preparan en forma de suspensiones celulares y se transforman poniendo en contacto las células con filamentos de carburo de silicio revestidos con ADN, utilizando los métodos esencialmente descritos por Frame et al . (1994, Plant J. 6, 941-948) . Como se describe en los ejemplos previos, los callos transformados así generados se seleccionan con base en la velocidad de crecimiento diferencial en un medio de cultivo que contiene un rango de concentraciones de glifosato, se regeneran hasta obtener plántulas (TO) las cuales se hacen crecer hasta la madurez y ya sea se autofertilizan o se fertilizan de manera cruzada para obtener semillas progenie (TI) para cruzas adicionales. Las plantas y material de planta se ensayan con respecto a su resistencia al glifosato y se analizan con respecto a la presencia, integridad y expresión del transgén, tal como se describe en los ejemplos previos. Inicio del callo a partir de embriones inmaduros, preparación de cultivos en suspensión celular Las suspensiones de células de maíz adecuadas para la transformación, opcionalmente son crioconservadas y se proporcionan de la misma manera que la descrita en el Ejemplo 2. Transformación Se purifica ADN derivado del plásmido pIGPD9 (Figura 12) que contiene cartuchos de expresión de EPSPS Xmal (i.e., pZEN7i, ZENdi, etc.), se concentra (e.g. por cromatografía de intercambio aniónico o aislamiento densitométrico en gradiente de CSCI2 de ADN plasmídico - - proveniente de células de una cepa huésped adecuada de E. coli HisB-, Rec A- (e.g., DH5a: hisB-) después de crecer hasta la fase estacionaria en un medio de cultivo mínimo 5xA (K2HP04 52.5 g, K2HP04 22.5 g, (NH4)2S04, 5 g, y citrato de sodio-2H20, 2.5 g por litro)) y se obtiene en forma de una solución concentrada (de preferencia ~1 mg/mL) en agua estéril. El ADN se proporciona como un ADN plasmídico circular o, alternativamente, se corta con la enzima de restricción Xmal para obtener un fragmento lineal que contiene el cartucho de expresión de EPSPS y se utiliza después de una purificación por electroforesis en gel de agarosa y electroelución. La transformación se lleva a cabo exactamente de la manera descrita por Frame et al . 1994. Alternativamente, el procedimiento se modifica un poco de la manera que se describe a continuación. Las células crecidas en cultivo líquido en medio de suspensión celular un día después del subcultivo, se dejan reposar en un matraz en agitación. El medio de cultivo se decanta y se elimina y se agregan 12 mL de medio N6 a pH 6.0 (Chu et al . 1975) modificado para contener L-prolina 6 mM, 20 g/L de sacarosa, 2 mg/L de 2,4-D, sorbitol 0.25M y manitol 0.25M, se agrega por cada 4 mL de volumen de células empacadas. El matraz se regresa al agitador - - (agitador rotatorio a .125 rpm e incubado a 26-2d°C) durante 45 minutos. Al final de este periodo, se toman alícuotas de 1 mL de la suspensión celular utilizando una pipeta de punta ancha y se colocan en una serie de tubos de microcentrífuga estériles. Después de dejar que las células de cada tubo se sedimenten, se toman 0.6 mL del sobrenadante del medio para dejar la mayoría del resto del contenido en forma de células sedimentadas. Se suspenden 50 mg de filamentos de carburo de silicio (filamentos Silar SC-9, Advanced Composite Materials Corp., Greer, SC. EUA) mezclando en vórtex en 1 mL de medio N6 modificado de la manera anteriormente descrita. 40 µL de estos filamentos suspendidos y 25 mg del plásmido o de ADN lineal que incluye el cartucho de expresión de EPSPS, se agregan a cada tubo de células sedimentadas. Los tubos se mezclan en un vórtex manual 2-3 veces, se mezclan en un aparato mixomated (Mixomat dental amalgam mizer (Degussa, Ontario, Canadá) durante 1 segundo y después se agregan 0.3 mL de medio N6 (modificado de la manera anteriormente descrita) a cada tubo de microcentrífuga. Después, las células suspendidas se inoculan (200 µL/placa) en un disco de papel filtro colocado sobre medio N6 sólido (el mismo medio N6 modificado anteriormente descrito, pero sin sorbitol, sin manitol y conteniendo 30 g/L de sacarosa y 30 g/L de geirite) . Después, cada placa se envuelve con cinta Urgopore (Stelrico, Bruselas) y se incuba en oscuridad durante 1 semana a 26-28°C. Selección de transformantes Los callos transformados se seleccionan de la manera descrita en el Ejemplo 12 ó, alternativamente, de la manera descrita en Frame et al . , 1994, excepto que se utiliza N- (fosfonometil) -glicina, a un rango de concentraciones entre 1 y 5 mM en lugar del bialafos especificado en la publicación de Frame et al . Regeneración de transformantes/propagación y análisis del material de planta transformado Las plantas se regeneran, propagan y crían de la manera descrita en el Ejemplo 12. Las plantas se analizan con respecto a su resistencia al glifosato y el material de planta se analiza con respecto a la presencia, integridad y expresión del transgén, de la manera descrita en el Ejemplo 12. TABLA 2. Expresión del transgén EPSPS en callos regenerables después de la transformación utilizando filamentos de carburo de silicio La tabla muestra los resultados del ensayo de la enzima EPSPS (+/- glifosato 100 µM a PEP 100 µM) basados en ensayos enzimáticos de extractos de callos transformados de manera estable de maíz A188 regenerable x maíz B73 regenerable, transformados por, filamentos con ADN de ZEN13.

- Cada línea de callo representa un solo evento que es ensayado por duplicado. Se calcula la relación de la actividad enzimática tolerante verdadera (permitiendo ~8% de inhibición) (expresada por el transgén) , con respecto a la actividad susceptible endógena (>98% inhibido + glifosato) . La EPSPS mutante se expresa relativamente fuerte en una línea particular, la 90921sw3-l, en donde, permitiendo la Vmax reducida de la enzima tolerante con relación a w/t (aproximadamente un tercio) , se puede estimar que la enzima tolerante se expresa a 3-10 X del nivel normal de la EPSPS endógena (este cálculo se complica por el hecho de que, en este evento particular, el nivel susceptible endógeno de actividad de EPSPS parece desusualmente bajo) . Los mismos extractos también se analizaron por inmunoelectrotransferencia tipo Western (en este caso utilizando anticuerpos policlonales dirigidos contra EPSPS purificada de Brassica napus) y la cantidad de EPSPS cuantificada con base en la reacción con una segunda curva estándar de EPSPS del arroz purificada. Los datos de inmunoelectrotransferencia tipo Western se expresan como los múltiplos de incremento de la cantidad total de EPSPS con relación a los callos de maíz no transformados. En un buen acuerdo con los datos enzimáticos, los datos de inmunoelectrotransferencia tipo Western indican un alto nivel de expresión de EPSPS en, por ejemplo, las líneas - - 9092dsw3-l.

EJEMPLO 14. Transformación de lineas de arroz utilizando una cepa de AgrroJbacterium que contiene un vector superbinario que incluye un cartucho de expresión de EPSPS entre los bordes derecho e izquierdo del ADN-T; selección y regeneración de células de plantas y plantas que son resistentes al glifosato En otro ejemplo, se aislan escutelos de las semillas maduras de las líneas adecuadas de arroz (incluyendo por ejemplo, las variedades Koshihikari, Tsukinohikari y Asanohikari) diferenciadas y los callos obtenidos de esta manera se transforman por infección con Agrobacteri um. Después de la selección y regeneración, se obtienen las plántulas transgénicas (TO) las cuales se hacen crecer hasta la madurez y se autofertilizan o se fertilizan de manera cruzada para obtener las semillas progenie (TI) para cruzas adicionales. Las plantas y el material de planta se evalúan con respecto a su resistencia al glifosato y se analizan con respecto a la presencia, integridad y expresión del transgén, de la manera descrita en los ejemplos previos. Como alternativa a los métodos que se describen más adelante, los métodos descritos en el Ejemplo 1 de la Patente Norteamericana US 5,591,616, adaptados de manera adecuada para utilizar glifosato en vez de higromicina para la selección, también se pueden utilizar. Construcción de la cepa de Agrobacteri um; preparación de la suspensión de Agrobacteri um Una cepa de Agrobacteri um que contiene el vector superbinario que tiene el cartucho de expresión de EPSPS deseado entre los bordes derecho e izquierdo, se construye (utilizando electroporación para transformar Agrobacterium con ADN plasmídico) de la manera descrita en el Ejemplo 11.

Se preparan suspensiones de conformidad con los métodos descritos en el Ejemplo 11. Alternativamente, la cepa transformada de Agrobacteri um se hace crecer durante 3 días - - en medio AB (Chilton et al . , 1974, Proc. Nat 'l Acad. Sci . USA, 71, 3672-3676) que contiene una selección de antibióticos apropiados (e.g., 50 mg/L de espectinomicina en el caso de la cepa LBA4404 (pSBlZEN13, etc.)) y se toma de la placa con un asa para formar una suspensión en un medio AAM (Hiei et al . , 1994, The Plant Journal, 6(2), 271-282) a una densidad de 1-5 x 109 células/mL. Cultivares de arroz, preparación de callo a partir de escutelo Los cultivares de arroz son, por ejemplo, Oryza sativa L. Tsukinohikari, Asanohikari y Koshihikari. A las semillas maduras se les quita la cascara, se esteriliza su superficie mediante un lavado con etanol al 70% y después se sumergen durante 30 minutos en NaOCl al 1.5%. Después de enjuagar con agua estéril, se cultivan a 37°C en oscuridad durante 3 semanas, en medio 2N6 a pH 5.8, el cual contiene las sales mayores, sales menores y vitaminas del medio N6 (Chu 1978, in Proc. Symp. Plant Tissue Culture., Peking: Science Press, pp. 43-50), 30 g/L de sacarosa, 1 g/L de hidrolizado de caseína, 2 mg/L de 2,4-D y 2 g/L de geirite. Los callos proliferados derivados de las escutelos de semilla se subcultivan durante 3 a 7 días en medio 2N6 fresco. Los callos en crecimiento (1-2 mm de diámetro) se seleccionan, se suspenden en medio 2N6 líquido (sin geirite) y se cultivan - li ¬ en matraces, es oscuridad, en un agitador rotatorio a 125 rpm y a 25°C. El medio se cambia cada 7 días. Las células en la fase log del crecimiento después de 3-4 transformaciones, se utilizan para la transformación. Infección, transformación y selección Se deja que células de callo de arroz suspendidas se sedimenten de la suspensión y después se resuspenden en la suspensión de Agrobacteri um, se dejan en contacto durante varios minutos y después se dejan sedimentar nuevamente y, sin enjuagar, se inoculan en medio 2N6-AS (medio 2N6 ajustado a pH 5.2 y que contiene 10 g/L de D-glucosa y acetosiringona 100 µM) y se incuba en oscuridad a °C durante 3-5 días. El material en crecimiento se enjuaga bien con 250 mg/L de cefotaxima en agua estéril y después se transfiere a medio 2N6-CH (medio 2N6 ajustado a pH 5.6 con KOH y que contiene 250 mg/L de cefotaxima y 0.5 a 5 mM de N- (fosfonometil) -glicina de grado de cultivo de tejidos) o, alternativamente, medio 2N6K-CH (medio 2N6 modificado de la manera descrita por Hiei et al . , 1994, pero en lugar de higromicina contiene 0.5 a 5 mM de N- (fosfonometil) -glicina de grado para cultivo de tejidos) y se cultiva durante 3 semanas en oscuridad a 25°C. Las colonias proliferantes se subcultivan en una segunda placa de medio selectivo durante un periodo adicional de 7 a 14 días.

- Regeneración y análisis de las plantas Las colonias en crecimiento se inoculan en un medio de regeneración a pH 5.6 que contiene las sales mayores N6 a media fuerza, las sales menores N6, los aminoácidos N6, las vitaminas del medio 7AA (Chilton et al . , 1974), 1 g/L de hidrolizado de caseína, 20 g/L de sacarosa, 0.2 mg/L de ácido naftalenacético, 1 mg/l de cinetina, 3 g/L de geirite y, opcionalmente, N- (fosfonometil) -glicina 0.04-0.1 mM. Estas placas se incuban a 25°C y se mantienen bajo condiciones de iluminación (~2000 lux) . Como se describe en el Ejemplo 1, las plantas regeneradas eventualmente son transferidas a tierra en macetas y maduradas en un invernadero. Las plantas se propagan y se crían (por ejemplo, las plantas transgénicas por endogamia) esencialmente de la manera descrita en el Ejemplo 11. Las plantas se analizan con respecto a su resistencia al glifosato y el material de planta se analiza con respecto a la presencia, integridad y expresión del transgén, esencialmente de la manera descrita en el Ejemplo 11. EJEMPLO 15. Transformación de líneas de trigo con ADN que incluye un cartucho de expresión de EPSPS, mediante el uso de bombardeo con microproyectiles; selección y regeneración de células de planta y plantas que son resistentes al glifosato - - En otro ejemplo, se aislan embriones inmaduros de líneas adecuadas de trigo (incluyendo, por ejemplo, trigo de primavera» cv BobWhite ó Jaggar) , se incuban en un medio que contiene hormonas (2,4-D) durante 2 días y se transforman por bombardeo con partículas revestidas con ADN. Después de un periodo de recuperación y crecimiento continuo del callo, los embriones que forman callo son subcultivados a través de una serie de medios que contienen un nivel fijo de glifosato y (diluidos en serie) niveles decrecientes de 2,4-D, de tal modo que se induzca la embriogénesis somática. El material seleccionado se regenera para formar brotes en un medio que también contiene glifosato, se transfieren a un medio para enraizamiento y, al igual que en los ejemplos previos referidos al maíz, se regeneran en plántulas (TO) , las cuales se hacen crecer hasta la madurez y son autofertilizadas o fertilizadas de manera cruzada para obtener semillas de progenie (TI) para cruzas adicionales. Las plantas y el material de planta se evalúan con respecto a su resistencia al glifosato y se analizan con respecto a la presencia, integridad y expresión del transgén, de la manera descrita en los ejemplos previos. Como alternativa a los métodos que se describen a continuación, se utilizan los métodos descritos en el Ejemplo 1 de la Patente Norteamericana US 5,631,152.

- - Preparación de embriones inmaduros Se hacen crecer líneas de plantas de trigo (por ejemplo, trigo de primavera TRi ticum aestivum cv BobWhite) hasta la madurez en un invernadero y se aislan los cariopsis de 11 a 15 semanas posantesis. Los cariopsis se esterilizan en su superficie mediante un tratamiento durante 15 minutos con NaOCl al 5% y después se lavan repetidas veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se aislan asépticamente en cuadrados de 3 cm de red de nylon (tamaño de malla 1.5 mm) sobre un medio de cultivo A2. El medio A2 ajustado a pH 5.8 contiene 4.32 g/L de sales de Murashige y Skoog, 20 g/1 de sacarosa, 0.5 g/L de L-glutamina, 2 mg/L de 2,4-D, 100 mg/L de hidrolizado de caseína, 2 mg/L de glicina, 100 mg/L de mioinositol, 0.5 mg/L de ácido nicotínico, 0.1 mg/L de tiamina-HCl y 2.5 g/L de geirite. Los embriones se acomodan en un disco sólido de 2.5 cm, en una cantidad de aproximadamente 50. Las placas se sellan con cinta leukopore y se incuban a 25°C en oscuridad durante 2 días. Cuatro horas antes del bombardeo, los embriones son transferidos a placas que contienen medio A2 fresco suplementado con 36.44 g/L de D-sorbitol y 36.44 g/L de D-manitol. Los embriones se transfieren de placa en placa por medio de la red de nylon hasta que se asienten. Los embriones son asentados en este medio con mayor fuerza osmótica durante 4 horas a 25°C en - - oscuridad, antes de ser bombardeados. Transformación mediada por partículas Se purifica ADN .derivado del plásmido pIGPD9 (Figura 12) que contiene cartuchos de expresión de EPSPS Xmal (i.e., pZEN6i, ZENlOi, etc.), se concentra (e.g. por cromatografía de intercambio aniónico o aislamiento densitométrico en gradiente de CsCl? del ADN plasmídico proveniente de células de una cepa adecuada de E. coli HisB-, Rec A- (e.g. DH5a: hisB-) después de crecer hasta la fase estacionaria en un medio de cultivo mínimo 5xA (K2HP04 52.5 g, KH2P04 22.5 g, (NH4)2S04 5 g y citrato de sodio-2H20 2.5 g por litro)) y se proporciona en forma de solución concentrada (de preferencia ~ 1 mg/mL) en agua estéril. El ADN se proporciona en forma de ADN plasmídico circular o, alternativamente, se corta con la enzima de restricción Xmal para obtener un fragmento lineal que contiene el cartucho de expresión de EPSPS y se utiliza después de una purificación por electroforesis en gel de agarosa y electroelución. Se preparan partículas y se revisten con ADN de una manera similar a la descrita por Klein et ai., 1987, Nature, 327, 70-73. La preparación de partículas revestidas con ADN y la operación de la pistola de partículas, se describen en el Ejemplo 2.

- - Alternativamente, los detalles son los siguientes. Por ejemplo, 60 mg de partículas de oro o de tungsteno (-1.0 µm) en un tubo de microcentrífuga, se lavan repetidas veces con etanol de grado para CLAR y después, repetidas veces, con agua estéril. Las partículas se resuspenden en 1 mL de agua estéril y se distribuyen en alícuotas de 50 µL en tubos de microcentrífuga. Las partículas de oro se almacenan a 4°C, las partículas de tungsteno a -20°C. Se agregan 3 mg de ADN a cada alícuota de partículas (descongeladas) y los tubos se mezclan en un vórtex a su máxima velocidad. Mientras que se mantienen en agitación continua con vórtex, se agregan 50 µL de CaCl2 2.5M y 20 µL de espermidina 0.1M. Después de 10 minutos de agitación con vórtex adicionales, las muestras se centrifugan durante 5 segundos en una microcentrífuga de Eppendorf, el sobrenadante se retira y las partículas se lavan con adiciones sucesivas de etanol de grado para CLAR. Las partículas se resuspenden bien en 60 µL de etanol y después se distribuyen en alícuotas de 10 µL en la superficie de cada uno de los macroacarreadores de membrana Kapton que van a ser utilizados en la pistola de partículas PDS1000. Los componentes de la pistola de partículas PDS1000 son esterilizados en su superficie mediante una inmersión en etanol al 70% y secado al aire. Las placas blanco se preparan, de la manera anteriormente descrita, - - con ~50 embriones arreglados en un disco de ~2 .5 cm, se colocan a 6 cm de la pantalla de detención. Después se utilizan discos de ruptura de 1100 psi (77.33 Kg/cpvJ para el bombardeo. Cada placa es bombardeada una o dos veces. Las placas bombardeadas se seleccionan con cinta porosa y se mantienen a 25°C en oscuridad durante ~16 horas. Los embriones desalojados de la superficie del medio por la onda de choque de helio se recuperaron y también se incubaron durante una noche en placas frescas del mismo medio A2 suplementado con manitol y sorbitol. Los embriones bombardeados, entonces, se transfirieron a placas nuevas de medio A2 y se incubaron durante una semana a 25°C en oscuridad antes de la selección. Selección y Regeneración de Transformantes Después de este periodo de recuperación, los embriones que formaron callo se removieron de las redes y se transfirieron a medio A2 2P (medio A2, ajustado a pH 5.8 que contenía N- (fosfonometil) -glicina 2 mM) , a una densidad de 20 tejidos/placa. Después de una semana en medio A2 2P, los callos fueron cambiados a medio Al 2P (medio A2 que sólo contiene l.p mg/L de 2,4-D y N- (fosfonometil) -glicina 2 mM) durante dos semanas y después a medio A 0.5 2P (medio A2 que contiene solamente 0.5 mg/L de 2,4-D y N- (fosfonometil) -glicina 2mM) durante otras dos semanas. Opcionalmente, los periodos de incubación de 2 semanas se - - redujeron a 1 semana y/o la etapa media de incubación en medio Al 2P se omitió. Opcionalmente, la concentración de selección de N-fosfonometilglicina está entre 0.5 y 10 mM, aunque se prefiere una concentración 2 mM. El tiempo global para este periodo de inducción de callo con niveles descendientes de 2,4-D en el medio de cultivo, es de 2 a 10 semanas, de preferencia de 3 a 6 semanas y más preferiblemente ~4 semanas. Para fomentar el máximo crecimiento de brotes y desalentar el desarrollo de raíces, los callos se transfirieron a medio Z. El medio Z es medio A2 pero que contiene 10 mg/L de zeatina en lugar de 2,4-D y también contiene N- (fosfonometil) -glicina 0.1 mM. Opcionalmente, la N- (fosfonometil) -glicina está en el rango de 0.04 a 0.25 mM. Los callos en regeneración se mantuvieron en este medio durante un periodo de 3 semanas antes del subcultivo, punto en el cual los brotes bien desarrollados fueron extirpados. Como es probable que sólo se produzca un evento en un solo callo (lo que representa un solo embrión) , el callo completo fue removido a una placa fresca y mantenido con el brote o los brotes extirpados para asegurar que las múltiples clonas que surgieran del mismo callo no se contaran como eventos por separado. Los callos con brotes parcialmente desarrollados o sin sectores regenerados, se devolvieron a medio Z durante otras 3 - - semanas. Al final de este periodo, los callos no regenerados se desecharon. Los brotes se mantuvieron en medio Z hasta que se hubieran formado 4 ó más hojas bien desarrolladas (extendiéndose hasta ~2 cm de longitud) . El material de planta regenerado, posteriormente, se transfirió cuidadosamente a tubos de plástico que contenían medio 0.5 MS. el medio 0.5 MS a pH 5.8 contiene 2.16 g/L de sales de Murashige y Skoog, 15 g/L de sacarosa, 2.5 de carbón activado, 2.5 g/L de geirite, 1 mg/L de glicina, 50 mg/L de mioinositol, 0.25 mg/L de ácido nicotínico, 0.25 mg/L de piridoxina-HCl, 0.05 mg/L de tiamina-HCl y N- (fosfonometil) -glicina 0.1 mM (opcionalmente de 0.0 a 0.25 mM) . Una vez que las plantas habían echado raíces, se podían plantar en tierra o remover a tubos de vidrio individuales que contenían medio 0.5 MS (sin N- ( fosfonometil) -glicina) y 2.5 g/L de carbón. Se prefiere que haya carbón presente en el medio de enraizamiento para adsorber cualquier PGR o compuesto químico de selección remanente transferido con la plántula y para crear un ambiente de enraizamiento oscuro, evitando de esta manera la formación de raíces verdes fisiológicamente aberrantes. La inducción de callos y la primera semana de regeneración ocurrió a 25° en oscuridad. La segunda semana de regeneración ocurrió a baja intensidad de luz a 25°C, y - - después las semanas subsecuentes a aproximadamente 2500 lux en periodos de luz de 16 horas. Propagación, cruza y análisis del material de planta transformado Los métodos para producir progenie TI y progenie adicional son bien conocidos en la técnica y se describen esencialmente en los ejemplos previos. Los métodos para el análisis de la herencia de la resistencia al glifosato y la presencia, integridad y expresión de los transgenes, son como los de los ejemplos previos. EJ?MPLO 16. Transformación de líneas de trigo con ADN que incluye un cartucho de expresión de EPSPS por electroporación de protoplastos; selección y regeneración de células de planta y plantas que son resistentes al glifosato En otro ejemplo, ADN plasmídico o lineal que comprende un cartucho de expresión de EPSPS idéntico al utilizado en los Ejemplos 12, 13 y 15, se utilizó para la transformación directa de protoplastos de una línea de trigo capaz de regenerarse en plantas fértiles ( cf Patente Norteamericana US 5,231,019). Los protoplastos aislados del trigo, de preferencia de tejido de hoja o células en cultivo ( cf Gamborg, O.L. and Wetter, L.R., Plant Tissue Culture Methods, 1975, 11-21) se prepararon a razón ~ca 2 X 106 protoplastos/mL en manitol 0.4M, a pH 5.8. A esta - - suspensión se le agregaron primero 0.5 mL de polietilenglicol (PEG) al 40% p/v con un peso molecular de 6000 en medio F modificado (Nature, (1982), 296, 72-74) a pH 5.8 y, segundo, 65 mL de agua que contenía 15 mg del ADN plasmídico o lineal deseado y 50 mg de ADN de timo de ternera. La mezcla se incubó durante 30 minutos a 26°C con agitación ocasional y subsecuentemente se diluyó en medio F (Nature (1982), 296, 72-74). El protoplasto se aisló por centrifugación a baja velocidad, se recogió en 4 mL de medio de cultivo CC (Potrykus, Harms, Lorz, (1979) Theor. Appl. Genet. 54, 209-214) y se incubó en oscuridad a 24°C. Alternativamente, además del tratamiento con PEG, la transformación de protoplastos de cereal se llevó a cabo utilizando etapas adicionales de choque término y/o electroporación (Neumann, E. et a-Z., (1982), the EMBO J., 7, 841-845) . Así pues, por ejemplo, se incubaron protoplastos de trigo en solución acuosa de ADN y manitol, se calentaron a 45°C durante 5 minutos y después se enfriaron a 0°C en un periodo de 10 segundos. Después, se agregó el polietilenglicol (Mr 3K-8K) hasta que la concentración final fuera de ~8% p/v. Después de una agitación suave pero completa, el tratamiento se llevó a cabo en un electroporador. La cámara de un "Porator" Dialog (Dialog, Dusseldorf, Alemania) se esterilizó mediante un lavado con etanol al 70% y después se secó con - - aire estéril. Suspensiones de protoplastos (~ca 2 X 106 protoplastos/mL en manitol 0.4M + el ADN) se ajustaron con cloruro de manganeso hasta una resistencia eléctrica medida de ~1.4 Kohm. Muestras de ~0.4 mL de volumen se sometieron, a intervalos de 10 segundos, a 3 impulsos de voltajes aplicados entre 1000 y 2000 V. Los protoplastos transformados de esta manera se colectaron y diluyeron en medio de cultivo CC. Los técnicos en la materia reconocerán que es posible realizar numerosas permutaciones y variaciones de estos procedimientos de transformación y que, por ejemplo, la transformación también podría mejorar al elevar el pH a 9.5 y/o al incrementar la concentración de iones calcio en la solución en la cual se lleva a cabo la transformación. Después de 3 a 14 días, alícuotas de los cultivos celulares en desarrollo se transfirieron a un medio de cultivo alternativo con concentraciones selectivas de N- ( fosfonometil) -glicina de grado para cultivo de tejidos (Sigma) entre 1 y 5 mM (de preferencia 2 mM) . Las colonias de células resistentes identificadas de esta manera (que exhibían crecimiento a concentraciones de glifosato cuando menos dos veces más grandes que las toleradas por los controles no transformados) se transfirieron a un medio de agar fresco que también contenía un rango de concentraciones selectivas de glifosato y, tal como se - - describe en el Ejemplo 15, se subcultivaron entre placas que contenían concentraciones sucesivamente descendientes de 2,4-D. Las colonias resistentes en crecimiento se podían analizar (por RCP, etc.) con respecto a la presencia del ADN recombinante. Podía ser o no posible efectuar gran parte de la selección en la etapa de callo. En cualquier caso, todos los callos en crecimiento se hicieron continuar. Entonces, los callos en crecimiento se transfirieron a un medio de regeneración de brotes que contenía zeatina y N- (fosfonometil) -glicina y después a medio de enraizamiento, exactamente de la manera descrita en el Ejemplo 15. Las plantas transgénicas fértiles que expresaban la EPSP sintetasa resistente al glifosato, posteriormente se regeneraron, seleccionaron y probaron de la manera conocida en la técnica y de la manera descrita en el Ejemplo 15, empleando los métodos analíticos descritos en el Ejemplo 11. EJEMPLO 17. Método para ensayar la actividad de EPSPS y determinación de constantes cinéticas. Método para ensayar actividades de EPSPS en materiales de planta crudos y para discriminar la proporción del total que es resistente al glifosato Ensayo de la Enzima EPSPS Los ensayos se llevaron a cabo generalmente de - - conformidad con el método radioquímico de Padgette et al . , 1987 (Archives of Biochemistry and Biphysics, 258(2) 564-573) con iones K+ como la principal especie de contraión catiónico. Los ensayos en un volumen total de 50 µL, en Hepes (KOH) 50 mM, pH 7.0 a 25°C, contenían la enzima purificada o extracto de planta (véase más adelante) diluida apropiadamente en Hepes pH 7.0 que contenía 10% de glicerol, y DTT 5 mM, 14C PEP ya sea como sustrato variable (para las determinaciones cinéticas) o fijo a 100 ó 250 µM y shikimato 3-fosfato (sal K+) a 2 ó 0.75 mM, tal como fuera indicado. Opcionalmente, para los ensayos de extractos de planta crudos, las muestras también contenían KF 5 mM y/o molibdato de amonio 0.1 mM. Los ensayos se iniciaron con la adición de 14C-fosfoenolpiruvato (sal ciclohexilamonio+) y se detuvieron después de 2-10 minutos (de preferencia 2 minutos) mediante la adición de 50 µL de una solución de 1 parte de ácido acético ÍM y 9 partes de etanol. Después de detener la rea'cción, se tomaron 20 µL y se colocaron en una columna synchropak AX100 (25 cm x 4.6 mm) y se cromatografiaron utilizando elución isocrática con una fase móvil de fosfato de potasio 0.28M, pH 6.5, fluyendo a 0.5 mL/min durante 35 minutos. Bajo estas condiciones, los tiempos de retención para PEP y EPSP fueron de ~19 y 25 minutos, respectivamente. Un contador de centelleo CP 525TR se conectó al extremo de la columna AX 100. Éste se ajustó con 0.5 mL de flujo celular y la velocidad de flujo de centelleo (Ultima Fio AP) se ajustó a 1 mL/minuto. Las áreas de los picos relativos de PEP y EPSP se integraron para determinar el porcentaje de conversión de PEP marcada a EPSP. Los valores Km y Vmax aparentes se determinaron mediante ajuste de mínimos cuadrados a una hipérbola con peso simple utilizando el software Grafit 3.09b de Erithacus Software Ltd. Los valores de Kra generalmente se verificaron utilizando 8-9 concentraciones de sustrato variable, que iban de Km/2 a 10 Km y en puntos por triplicado. Excepto cuando se especifique de otra manera, sólo se incluyeron en el análisis los puntos de datos en los cuales hubiera <30% de conversión de sustrato en EPSP. El medio Shikimato-3-Pi (S3P) se preparó de la siguiente manera. A 7 mL de TAPS 0.3M, pH 8.5 conteniendo Shikimato 0.05M, ATP 0.0665M (sal sódica), KF 10 mM, DTT 5 mM y MgCl2-6H20 0.05M, se le agregaron 75 µL de 77 unidades (µmol min_1)mL_1 de solución de Shikimato cinasa. Después de 24 horas a temperatura ambiente, la reacción se detuvo mediante un breve calentamiento a 95°C. La solución de reacción se diluyó 50 veces con Tris-HCl 0.01M, pH 9 y se sometió a cromatografía de intercambio aniónico en una columna Dowex 1 X 8-400, empleando un gradiente de LiCl2 de 0 a 0.34M. Las fracciones S3P se combinaron, se - 2 - liofilizaron y después se redisolvieron en 7 mL de H20 destilada. Después se agregaron 28 mL de Ba(CH3COOH)2 0. ÍM y 189 L de etanol absoluto. Esta solución se dejó en agitación durante una noche a 4°C. El precipitado resultante de tri-bario S3P, se recogió y se lavó con 30 mL de etanol al 67%. Después, el precipitado lavado se disolvió en ~30 mL de H20 destilada. Al agregar K2S04, se produjo la sal K+ o TMA+ de S3P, tal como fuera necesario. Se debe tener cuidado en agregar un mínimo exceso de sulfato. El BaS04 precipitado se removió y el sobrenadante que contenía la sal requerida de S3P, se liofilizó. Cada sal se pesó y se analizó por RMN de protón. Las preparaciones de S3P obtenidas de esta manera, tienen >90% de pureza de conformidad con la RMN y (de conformidad con sus pesos e integración de 31P RMN) contienen sólo una pequeña cantidad de residuos de sulfato de potasio. Preparación de extractos de material de planta adecuado para el ensayo de EPSPS Callos o material de planta (0.5-1.0 g) se trituraron hasta obtener un polvo congelado fino en un mortero con pistilo enfriado con nitrógeno líquido. Este polvo se recogió en un volumen igual de una solución reguladora de extracción fría (por ejemplo, solución reguladora Hepes 50 mM/KOH a pH 7.5 que contenía AEDT 1 mM, DTT 3 mM, "pefabloc" 1.7 mM (inhibidor de serina proteasa), - - leupeptina 1.5 mM, pepstatina A 1.5 mM, glicerol al 10% v/v y polivinilpirrolidona al 1%), se resuspendió, se mezcló y se centrifugó en una centrífuga refrigerada, para acumular los restos en el fondo. El sobrenadante se intercambió en una columna PD10 fría de Sephadex G25 en solución reguladora Hepes 25 mM/KOH a pH 7.5 conteniendo AEDT 1 mM, DTT 3 mM y glicerol al 10% v/v. La proteína se estimó por el método de Bradford estandarizado, utilizando albúmina sérica bovina. Una porción del extracto se congeló en nitrógeno líquido; una porción se ensayó de inmediato. Los ensayos de EPSPS de extractos de planta se llevan a cabo de manera estándar, como se describió anteriormente, con 14C-PEP 0.1 mM y Shikimato-3-Pi 0.75 mM, ya sea en ausencia o en presencia de N- (fosfonometil) -glicina 0.1 mM. Bajo estas condiciones de ensayo, la forma resistente de EPSPS (véase más adelante) se estimó que era inhibida por <8.5%, mientras que la forma w/t sensible se inhibió esencialmente por completo (>98%) . Así pues, el nivel de actividad observado en presencia de glifosato (A) se considera que representa ~92% del nivel de enzima resistente derivado de la expresión del transgén, mientras que el nivel de EPSPS 2/t susceptible se considera como el nivel total de actividad EPSPS observada en ausencia de glifosato, menos el valor de A x ~ 1.08. Debido a que la Vmax de la enzima mutante se estima en sólo aproximadamente - 4 - una tercera parte de la Vmax de la enzima w/t (y debido a que los valores Km para PEP tanto de la forma w/t como de la forma mutante se estima que son de aproximadamente 20 µM o menos) , el nivel de expresión de la enzima mutante con relación al nivel de expresión de la EPSPS w/t endógena se considera aproximadamente tres veces mayor que la relación calculada con base en la relación de sus actividades relativas observadas. El nivel total de expresión del polipéptido EPSPS (mutante + w/t) también se estima utilizando técnicas Western (véase más adelante) . EJEMPLO 18. Clonación y expresión de ADNc de w/t y mutado que codifica para EPSPS del arroz madura en E. coli . Purificación y caracterización de EPSPS del arroz w/t y mutante Expresión, purificación y caracterización de EPSPS del arroz w/t madura Se amplificó ADNc de EPSPS del arroz utilizando RCP-TI a partir de ARN aislado de la variedad de arroz Koshigari, empleando RT Superscript de BRL, de conformidad con las recomendaciones proporcionadas por el fabricante. La RCP se realizó empleando la Pfu turbo polimerasa de Stratagene, de conformidad con los métodos proporcionados por el fabricante. Los oligonucleótidos que se presentan a continuación se utilizaron en las etapas de reacción de amplificación y transcripción inversa.

SEQ ID NO: 31 Arroz 3' oligo 5' GCGCTCGAGTCAGTTCCTGACGAAAGTGCTTAGAACGTCG 3' SEQ ID NO: 32 Arroz 5' oligo 5' GCGCATATGAAGGCGGAGGAGATCGTGC 3' El producto de RCP se clonó en pCRBluntlI, utilizando el paquete Zero Blunt TOPO de Invitrogen. La secuencia del inserto se confirmó mediante secuenciación y se verificó que el marco de lectura abierta correspondiera al de la proteína EPSPS del arroz cloroplástica madura predicha, con excepción de la presencia de una Met inicial. La secuencia de EPSPS del arroz clonada y verificada se cortó utilizando las enzimas Ndel y Xhol y el fragmento purificado se clonó en pET24a (?ovagen) digerido de manera similar. Las clonas recombinantes se introdujeron en BL21 (DE3), que es una cepa de E. coli RP con codón optimizado, proporcionada por Stratagene. La proteína EPSPS se expresó en esta cepa después de la adición de IPTG 1 mM al medio de fermentación (medio LB suplementado con 100 µg/mL de kanamicina) . La proteína recombinante de la masa predicha correcta, se identificó i) con base en una tinción de Coomassie de geles SDS de extractos celulares y comparación lado a lado con geles teñidos con Coomassie de extractos de células de E. coli similares transformadas con un vector pET24a vacío y ii) por análisis de inmunoelectrotransferencia tipo Western, utilizando un - - anticuerpo policlonal dirigido contra la proteína EPSPS de planta previamente purificada. La proteína EPSPS del arroz madura se purificó a ~4°C de la siguiente manera. Se pesaron 25 g de células en húmedo y se lavaron con 50 mL de solución reguladora Hepes 0.1M/KOH a pH 7.5 conteniendo DTT 5 mM, AEDT 2 mM y glicerol al 20% v/v. Después de una centrifugación a baja velocidad, la pella de células se resuspendió en 50 mL de la misma solución reguladora, pero también conteniendo "Pefabloc" 2 mM, que es un inhibidor de la serina proteasa. Las células se suspendieron homogéneamente utilizando un homogeneizador de vidrio y después se rompieron a 10000 psi (703 Kg/cm2) utilizando un aparato para rompimiento de células Basic Z de Constant Systems (Budbrooke Rd, Warwickk, la Gran Bretaña) . El extracto crudo se centrifugó a ~30,000 g durante 1 hora y la pella se desechó. Se agregó sulfato de protamina (salmina) hasta una concentración final de 0.2%, se mezcló y la solución se dejó en reposo durante 30 minutos. El material precipitado se removió por centrifugación durante 30 minutos a ~30, 000 x g. Se agregó sulfato de amonio de grado Aristar hasta una concentración final de 40% de saturación, se agitó durante 30 min y después se centrifugó a ~27,000 x g durante 30 minutos. La pella se resuspendió en ~10 mL de la misma solución reguladora utilizada para - - romper las células, se añadió más sulfato de amonio para llevar la solución a ~70% de saturación, la solución se agitó durante 30 minutos y se centrifugó nuevamente para obtener una pella, la cual se resuspendió en ~15 mL de solución reguladora S200 (Hepes 10 mM/KOH (pH 7.8) conteniendo DTT 1 mM, AEDT 1 mM y glicerol al 20% v/v) . Esta solución se filtró (0.45 mieras) se cargó en una columna K26/60 conteniendo Superdex 200, equilibrada con solución reguladora S200 y se sometió a cromatografía. Las fracciones que contenían EPSPS se detectaron con base en la actividad de la enzima EPSPS, se combinaron y se cargaron en una columna xkl6 conteniendo 20 mL de HP Q-Sepharose, equilibrada con solución reguladora S200. La columna se lavó con solución reguladora S200 y después se eluyó la EPSPS en un gradiente lineal de 0.0M a 0.2M de KCl en la misma solución reguladora. La EPSPS eluye con un solo pico que corresponde a una concentración de sal en o por debajo de 0.1M. Las fracciones que contenían EPSPS se detectaron con base en la actividad de la enzima EPSPS, se combinaron y se cargaron en una columna HiLoad xk26/60 de Superdex 75, equilibrada con solución reguladora Superdex 75 (Hepes 25 mM/KOH (pH 7.5) conteniendo DTT 2 mM, AEDT 1 mM y glicerol al 10% v/v) . La EPSPS eluye de la columna a un tiempo posterior del que se habría esperado con base en el peso molecular del dímero supuesto. Esto puede deberse a la - - interacción de la proteína con la matriz del gel a una fuerza iónica baja. Las fracciones que contenían EPSPS se identificaron con base en la actividad de la enzima, se combinaron y se cargaron en una columna de 1 mL de monoQ equilibrada con la misma solución reguladora Superdex 75. La columna se lavó con solución reguladora inicial y la EPSPS eluyó en forma de un solo pico en el transcurso de un gradiente lineal de 15 mL entre 0.0 y 0.2M de KCl. La EPSPS se obtiene en esta etapa de purificación (>90% de pureza) . Opcionalmente, la EPSPS se purifica adicionalmente por intercambio en una solución reguladora Superdex 75 que contiene sulfato de amonio l.OM (Aristar) y se carga en una columna de 10 mL de fenilsefarosa equilibrada con la misma solución reguladora. La EPSPS eluye en forma de un solo pico en una etapa temprana durante el transcurso de un gradiente lineal de disminución de concentración de sulfato de amonio entre 1.0 y 0.0M de sulfato de amonio. Clonación, expresión, purificación y caracterización de EPSPS de arroz mutante resistente al glifosato El ADNc de EPSPS del arroz en pCRBlunt se utilizó como plantilla para otras dos RCP, utilizando los siguientes pares de cebadores diseñados para introducir cambios específicos.

- - SEQ ID NO: 33 Arroz 5' oligo 5' GCGCATATGAAGGCGGAGGAGATCGTGC 3' SEQ ID NO: 34 Mutante reversa a RV del arroz 5' GCAGTCACGGCTGCTGTCAATGATCGCATTGCAATTCCAGCGTTCC 3' SEQ ID NO: 35 Arroz 3' oligo 5' GCGCTCGAGTCAGTTCCTGACGAAAGTGCTTAGAACGTCG 3' SEQ ID NO: 36 Mutante hacia delante a Sal 5' GGAACGCTGGAATTGCAATGCGATCATTGACAGCAGCCGTGACTGC 3' Los productos resultantes se purificaron en gel y se colocaron en un tubo en concentraciones equimolares para servir como plantilla para otra ronda de RCPs con los oligos 5' y 3' de arroz. Los productos resultantes se clonaron en el plásmido pCRBluntlI, utilizando el paquete Zero Blunt TOPO de Invitrogen. Se confirmó que la secuencia de ADN del inserto y su marco de lectura abierta correspondieran a la proteína EPSPS del arroz cloroplástica madura predicha (con excepción de la presencia de una Met inicial) y también que los cambios deseados (la mutación específica de T a I y de P a S, en posiciones específicas de la secuencia de EPSPS) se hubieran codificado. La secuencia de la EPSPS del arroz clonada y verificada de esta manera, se cortó utilizando las enzimas Ndel y Xhol y el fragmento purificado se clonó en pET24a (?ovagen) -1 - digerido de manera similar. Las clonas recombinantes se introdujeron en BL21 (DE3) , que es una cepa de E. coli RP con codón optimizado, proporcionada por Stratagene. La proteína EPSPS se expresó en esta cepa después de la adición de IPTG 1 mM al medio fermentador (medio LB suplementado con 100 µg/mL de kanamicina) . La proteína recombinante de la masa predicha correcta se identificó i) con base en una tinción con azul de Coomassie de geles SDS de extractos celulares y comparación lado a lado con geles teñidos con azul de Coomassie de extractos de células de E. coli similares transformadas con un vector pET24a vacío y ii) por análisis de inmunoelectrotransferencia tipo Western, utilizando un anticuerpo policlonal dirigido contra la proteína EPSPS de planta previamente purificada. Esta mutante de la EPSPS del arroz se purificó y caracterizó de manera similar al método descrito anteriormente para la EPSPS del arroz w/t. La forma mutante de EPSPS del arroz obtenida de esta manera, se ensayó de la manera anteriormente descrita en presencia de shikimato-3-Pi 2 mM, tiene una Vmax aparente de ~ 10 µmol/min/mg y una Km para PEP de 22 µM. A PEP 40 µM, el valor IC5o para la sal potásica de glifosato es ~0.6 mM. El valor Ki estimado para el glifosato de potasio de la mutante EPSPS es de -0.2 mM.

- - EJEMPLO 19. Preparación de anticuerpos contra EPSPS del arroz purificada y métodos de análisis tipo Western Se utilizaron los métodos estándar para la generación de antisueros policlonales en conejos. Los conejos fueron hembras jóvenes de raza albina de Nueva Zelanda. Los programas de inmunización consistieron de cuatro dosis, cada una de ~100 mg, administradas a intervalos mensuales. Cada dosis en solución salina reguladora de fosfatos se administró en forma de una emulsión con adyuvante completo de Freund (dosis 1) o con adyuvante incompleto (dosis 2-4) y se inyectaron en cuatro sitios subcutáneos. Se tomó una sangría previa antes de la administración de la dosis 1. Se tomó una muestra de sangre de prueba 14 días después de la segunda dosis, para confirmar la respuesta inmunitaria. La muestra de sangre terminal se tomó 14 días después de las cuatro dosis y se utilizó para la experimentación. Una quinta y dosis final se administró después de cuando menos 6 semanas posteriores a la cuarta dosis y la muestra de sangre final (también utilizada para experimentación) se tomó 14 días después. Se indujeron anticuerpos contra i) EPSPS del arroz w/t madura nativa purificada (Ejemplo 8) y también contra ii) polipéptido EPSPS del arroz desnaturalizado con SDS, el cual eluyó de una banda cortada de un gel SDS al 12% (en donde la posición correcta de la proteína se marcó con exactitud mediante una tinción con azul de Coomassie lado a lado de la banda) . Se utilizaron geles de poliacrilamida al 12% para electroforesis en gel SDS y las pruebas de inmunoelectrotransferencia tipo Western (Western blot) . la electroforesis se realizó a una corriente constante de 100V durante 90 minutos. Los geles se transfirieron contra hojas de nitrocelulosa durante una noche a 4°C, a 30V constantes. Las hojas se bloquearon con solución salina reguladora de fosfatos Marvel al 5% conteniendo Tween al 0.1% (PBS-Tween) durante 1 ó 2 horas, se lavaron tres veces con PBS-Tween y se incubaron con el anticuerpo primario EPSPS del arroz-Rbl, a -1.3 mg de IgG/mL (normalmente equivalente a una dilución 1:4000 a 1:20,000 de la muestra de sangre) . Estas diluciones de anticuerpos se aplicaron en PBS (solución reguladora de fosfatos) conteniendo Marvel al 1% y Tween 20 al 0.05% durante 2 horas. El anticuerpo secundario, un anticuerpo de cabra contra conejo marcado con HRP (Sigma A6154) se aplicó a 1:10,000 ó 1:20,000 en PBS conteniendo Tween al 0.05% y Marvel al 1%. La incubación con el anticuerpo secundario se continuó durante 1 hora, la mancha se lavó tres veces con PBS (0.05% de Tween) , se aplicó el sustrato ECL durante 1 minuto y la película se expuso durante 10 a 60 segundos. Las manchas control negativo son manchas con (1) suero preinmune a una - - dilución calculada para proporcionar la misma [IgG] que un suero inmune de prueba (la IgG rutinariamente se purifica a partir de una alícuota de cada suero y se cuantifica de manera que estas diluciones puedan ser calculadas directamente) y también (2) suero inmune contra el adyuvante de Freund solo. La concentración de IgG en los sueros inmunes control se ajustó para que los controles quedaran a una concentración apropiada de IgG. Con el fin de realizar estos cálculos, la IgG se purificó del antisuero crudo por filtración a través de un filtro de 0.45 µm en una jeringa y se hizo pasar por una columna HiTrap Protein G de 1 mL (Pharmacia, no. de catálogo: 17-0404-01) . La IgG unida se eluyó de la columna con glicina-HCl 0. ÍM, pH 2.9 y se dializó vs PBS durante una noche. La concentración de IgG se estimó por determinación UV (una trayectoria de 1 cm de largo de una solución 1 mg mg"1 de IgG pura, tiene una absorbancia, a una longitud de onda de 280 nm, de 1.35). A partir de la IgG obtenida se puede realizar un cálculo de la concentración de IgG en el antisuero crudo y, de conformidad con ello, se pueden calcular las diluciones para Western blot. Las muestras de tejido de planta se preparan, por ejemplo, de la manera descrita en el Ejemplo 17. Alternativamente, para el análisis Western se utiliza un procedimiento mucho más simple. De 100 a 200 mg de tejido de planta por ser analizado se homogeneizan rápidamente (por ejemplo utilizando un homogeneizador ultra turrax, homogeneizador de cuentas o de vidrio) en un volumen igual de solución reguladora (similar al Ejemplo 7) , se centrifuga durante 5 minutos en una microcentrífuga de Eppendorf refrigerada y el sobrenadante a) una pequeña alícuota se analiza con respecto al contenido de proteínas utilizando el método de Bradford y b) para la mayor parte, se mezcla 1:1 con "solución reguladora de muestra" SDS de Laemli, se calienta y después se almacena lista para cargarse en geles. Típicamente, los geles de SDS se cargan con 10 muestras de proteína en 10 pozos. Típicamente, estas muestras son de 1 a 10 µg de extractos crudos del material de planta para análisis a lo largo de una curva estándar de entre 0 y 20 ng de EPSPS del arroz pura. En algunos casos las pruebas Western se realizan utilizando anticuerpos inducidos contra EPSPS w/t purificada de Brassica napus (expresada y purificada utilizando métodos similares a los anteriormente descritos) . En este caso, la fuerza de la reacción cruzada de los anticuerpos es menor con la EPSPS del arroz (o con EPSPS endógena de una planta de trigo o de maíz) que en el caso cuando se utilizan anticuerpos dirigidos contra EPSPS del arroz pero que todavía, sin embargo, proporcionan una reacción suficiente para obtener información cuantitativa útil en relación a la curva estándar para que sea derivable. EJEMPLO 20. Aislamiento de ADN genómico de material de planta transgénico. Análisis por RCP. Preparación de sondas de ADN e hibridación. Número de copias e integridad del transgén Se aisló ADN genómico de plantas, plántulas y material de callo, utilizando por ejemplo el método de Dellporta et al . (1983) en Chromosome Sctructure and Function: Impact of New Concepts, 18' th Stadler Genetics Symposium. J.P. Gustafson and R. Appels, eds.) New York: Plenum Press) pp. 263-282 ó, alternativamente, utilizando un paquete DNAeasy (Qiagen) . Los callos transgénicos y las plantas segregantes que contienen el transgén de EPSPS del arroz mutado, se identifican utilizando RCP de fluorescencia con cebadores oligonucleotídicos de las SEQ ID NOS: 39 y 40, que son específicos contra las mutaciones de la secuencia genómica de EPSPS del arroz. El colorante fluorescente verde SYBR, el cual se intercala con el ADN de doble cadena, se incluye en la RCP para que las muestras que contengan el gen EPSPS del arroz mutado sean identificadas por un incremento de fluorescencia en la muestra, lo cual se detecta mediante una máquina ABl 3377. Alternativamente, los técnicos en la materia sabrán que los cebadores se pueden marcar fluorescentemente y que se dispone de tecnologías tales como "faros" y "escorpiones" moleculares . SEQ ID NO: 37 DM del Arroz Sentido2-3A 5'- gtg gaa cgc tgg aat tgc aat gca at -3' SEQ ID NO: 38 Reversa (antisentido) Universal 5'- gtt gca ttt cea cea gca gca gt -3' Una reacción de RCP típica, preparada en placas ópticas de 96 pozos y selladas con pestañas ópticas (PE Biosystems) , consiste de los siguientes componentes en un volumen total de 25 µL: 5.0 µL g de ADN de plantilla (Qiagen DNeasy prep) 12.5 µL 2x verde SYBR premezclado 2.5 µL 5 pmol/µL de Cebador Hacia Delante Concentrado 2.5 µL 5 pmol/µL de Cebador de Reversa Concentrado 2.5 µL ddH20 25.0 µL Volumen total Se aplicaron los siguientes parámetros ciclo: Etapa 1: 50°C por 2 minutos Etapa 2: 95°C por 10 minutos Etapa 3: 95°C por 15 segundos 60°C por 45 segundos Los cambios de fluorescencia en las muestras se registraron cada siete segundos en la etapa 3 de la reacción. Para los ensayos de inmunoelectrotransferencia tipo Southern (Southern blot), se utilizaron aproximadamente 10 µg de ADN por cada digestión de restricción. Se sometió a digestión ADN genómico con las enzimas de restricción adecuadas (e.g., HindI I I ) de conformidad con las instrucciones del - fabricante (e.g. Promega) . Se eligen enzimas de restricción que corten tanto dentro como fuera de la secuencia EPSPS mutante. Se separó el ADN utilizado geles TAE (tris-acetato 0.04M, AEDT 1 mM) con 0.8% de agarosa. Los ensayos de Southern blot se llevaron a cabo de conformidad con los métodos dados por Sambrook et al . , 1989, utilizando una membrana ?yBond N+ de nitrocelulosa (Amersham Pharmacia) . El ADN se retícula en la membrana por exposición a luz TJV. Los fragmentos de ADN utilizados para generar sondas específicas se aislaron mediante una purificación, en geles de restricción, de ADN plasmídico digerido o generado por RCP. Por ejemplo, un fragmento de 700 pb que contiene un intrón del gen EPSPS del arroz, se generó por RCP utilizando los cebadores que se muestran a continuación. SEQ ID NO: 39 INT1/5 5' cccttcctcttgcgtgaattccatttc 3' SEQ ID NO: 40 INT1/3 5' gttgtgcccctaataaccagag 3' Tales sondas se marcan con 3P utilizando el método de cebamiento aleatorio, por ejemplo con cuentas de marcado de ADN listas para usar (Amersham Pharmacia) y se purificaron utilizando, por ejemplo, columnas MicroSpin G-25 (Amersham Pharmacia) . Las manchas de los geles de ADN se hibridizaron previamente a 5°C en 5x SSC, 0.5% de SDS, 2x solución de Denhardt, 0.15 mg/mL de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, durante cuando menos una hora. Después, la mancha se hibridizó con la sonda desnaturalizada durante 16-24 horas a 65°C, en solución prehibridación fresca. Se secaron las manchas de las membranas y se visualizaron por autorradiografía . Cuando el Southern blot indica un solo evento de integración del transgén en un solo locus, indicado por la hibridación de la sonda con sólo un fragmento de restricción de tamaño específico, entonces el resultado se confirma mediante una rehibridación de la mancha utilizando una sonda alternativa. Para los controles, se utilizó material no transformado. Adicionalmente, la mancha se puede sondear adicionalmente con sondas de hibridación específicas contra otras regiones de la construcción transgénica (por ejemplo, el promotor, el intrón 5' UTR o las secuencias intensificadoras cadena arriba) con el fin de verificar la integridad de la construcción. Adicionalmente, en caso de que se utilizara la transformación de Agrobacteri um, se utilizan sondas específicas para indicar la presencia o ausencia de cualquier ADN que se extienda más allá de RB y LB del vector superbinario.

- - SEQ ID NO: 41 EPSPS genómico del arroz (de la secuencia ATG-WT) atggcggcgaccatggcgtccaacgccgcggctgcggcggcggcgtccctggaccaggccgtggcggcgtcggcggcgccctc gtcgcggaagcagctgcggctgcccgccgcggcgcgcggggggatgcgggtgcgggtgcgggcgckggggcggcgggaggcgg tggtggtggcgtccgcgtcgtcgtcgtcggtggcagcgccggcggcgaaggcggaggagatcgtgctccagcccatcagggag atctccggggcggetcagctgccagggtccaagtcgctctccaacaggatcctcctcctctccgccctctccgaggtgagacg cggatcccttcctcttgcgtgaattccatttctggagatgagactttagggggtttattaggtgaggtggctgtgtttgegaa atcctaggaattatctcccaagtcaatccaacgatgagatataactgaggttctggccttaaccacacactcatataaccaat ttattgaaacattttggtttggcataagaaactgcttacgaaggtatgatat.cctcctacatg-.caggctactaaattttcac gacggcatgatccactcaaaacaagcttcctaacgagectggcgaggcctgtcatgaaactcgcgtaaactaaggcaaccctg gaggccccgcactgtaccaa gctatgcctgaacattttgcaagcagcgccctctcccaaaatcacgcaattttgaggctcct ctacatcattataattccccaatacattgctctttattcttaatagctttgatcgcgaaatttaacattttaattcttgagct gttattttgtagcatcagtttatcatgagccatgtttggtactaaatatacaatcccttgggtttatttgtttccaagcacgt cattaacttatcttaatgtggacaagaaactgatgcctgcttacattgctattatttcaagcgggeattgatcctttgacatg tgattga catttttttttctctggttattagggcacaacagtggtggacaacttgctgaacagtgaggatgttcactacatg cttgaggccctgaaagcccccgggctctctgcggaagcagataaagttgcaaaaagagctgtagtcgttggccgtggtggcaa gtttcctgttgagaaggatgcgaaagaggaagtgcaactcttcttggggaacgctggaactgcaatgcgaccattgacagcag ccgtgactgctgctggtggaaatgcaacgtatgtttttttttttaatgtttatgaaaatatgtatggaattcatggggtatgt tttatgacctttttctetaccatcagttatgtgcttgatggagtgccacgaatgagggagagaccgattggtgacttggttgt cgggttgaaacaacttggtgcggatgtcgactgtttccttggcactgaatgcccacctgttcgtgtcaagggaattggaggac ttcctggtggcaaggttagttactcctaaactgcatcctttgtacttctgtatgcaccccaattctttgccaaccttctgcat ttataaggaacattctatgatgcaatecgaccttacactgcacagtaacttgaaatgtttcatgcttaaecaatatgccatat tcctgccaagctcaagcgagcaatatttgtttgaateeggtaccatatttttgtatatttgggcattcctttttggtcttgat gtcttct ttgaattagcacttaactgaattacactcaacaggttaagctccctggttccatcagcagtcagtacttgagtgc cttgctgatggccgctcctttggcccetggggatgtggagatcgaaatcattgacaaactaatctccattccttacgttgaaa tgacattgagattgatggagcgttttggtgcgaaggcagagcattctgacagttgggacagactctatattaagggagggcag aagtacaagtaagcttctacctgccttactgagctgaattattcgggtgtctatgattaactccctaaactaaccctttttct tttctccggcattgacagatctcctggaaatgcctatgttgaaggtgacgccccaagcgcgagctatctcttggctggtgctg caatcactggaggcactgtgacagttcaaggttgtggtacgaccagtttgcaggtacaactgtagtgcctgttttgacattct accgcctagtcaagttcagtcagtagtcacatattcagaatatagcacaatctgtattatgccactgttaatcaaatacgctt gacceagagagegceaeaeaccceagceeaaeceecaaactaaacageececetgeggceegcegegcegetaegttccctga cctacatgttaatattacagggtgatgtcaaatctgctgaggtacttgagacgatgggagcaaaggttacatggaccgacacc agcgcaaccgtaactggcccaccacgtgagccttacgggaagaaacacctgaaagctgttgatgtcaacatgaacaaaatgcc egaegeegccaegaccceegccgeegeegcaceceecgcegaeggeccaacegceaecagagaeggeaaacaetaaggcctae tacacctgttctaccatactagcaaccaccgcttagcattgcgacaaaacaaataaccaaactttcttcaaaataacttagaa atataagaaaggttcgttttgtgtggtaaacagtactactgtagtctcagctatgaagtttgctgctggcaatcttctgaacg gtcccagctaaattgcatgcctgttcatcatacctatccattgccttccacagtggcttcccggagagtaaaggaaaccgaaa ggatggtcgcaattcggaccgagctaacaaaggtaaattcattaggtcccgtgtcctttcactcttcaagtagtttgctcata agttgaattctccttcaatgatgtttaaattcatcatcttcttttttggtgttgtgccagccgggagcaccggtcgaagaagg tcctgactaccgcatcatcaccccaccggagaagctgaacatcacggcaatcgacacctacgatgatcacaggatggcca gg cct ctccctcgctgcctgcgccgacgtgcccgtgacgatcagggaccctggttgcacccgcaagaccttccccaactacttc gacgttctaagcactttcgtcaggaactgaactgagcttttaaaagagtgaggtctaggttctgttgtctgtctgtccatcat ccatgtgttgactgttgagggaactcgtttcttcttttcttcacgagatgagcttttgtgtgcctgtaatactagtttgtagc aaaggctgcgccacataaggtgacgagaattgaggtaaaacgagatctgtacactaaattcactcagactgttctggcataaa gaataatttggccttctgcgatttcagaagccacaaattgccatctcactaaactctccttggtcctcatggcaatgcaacga cagtgcgaagcactgaagcccgtaatgctctatcaccaccatgtacgacagaaccatatatgtccatatgtacaactcgagtg eegeeegageggccagcaaaceggcegaccaagccacacgagagagaaeaceaeaaacecaaecatacaeaacaagcccaagc aacattagacagaacacaacaacactcg SEQ ID NO: 42 (de ATG incluyendo la doble mutante - mostrada) aeggcggcgaccaeggcgeccaacgccgcggcegcggcggcggegeccceggaccaggccgeggcggcgecggcggcgttcec gecgcggaagcagcegcggcegcccgccgcggcgcgcggggggaegcgggegcgggegcgggcgckggggcggcgggaggcgg eggeggeggcgeccgcgecgecgecgecggeggcagcgccggcggcgaaggcggaggagaecgegceccagcccaecagggag aececcggggcggeecagcegccagggeccaagecgcececcaacaggaeccecceccececcgcccececcgaggegagacg cggaeccceecceceegcgegaaeeccaeeeceggagaegagaeeeeagggggeeeaeeaggegaggeggcegtgeeegegaa aecceaggaaeeaecececaagecaaeceaacgaegagaeaeaacegaggeeceggeeeeaaecacacacecaeaeaaccaae eeaeegaaacaeeeeggeeeggcaeaagaaacegceeacgaaggeaegaeaeccecceacaegecaggceaceaaaeeeecac gacggeaegaeccacecaaaacaageeeceeaacgageceggegaggecegeeaegaaaeeegegeaaaceaaggcaaceeeg gaggeeecgcacegeaccaaegeeaegeeegaacaeeeegcaagcagegceeececccaaaaeeaegcaaeeeegaggcecce ceacaecaeeaeaaeeccccaaeacaeegceceeeaeeceeaaeagceeegaecgcgaaaeeeaacaeeeeaaeeceegagce geeaeeeegeagcaecageeeaecaegagccaegeeeggeaceaaaeaeacaaeccceegggeeeaeeegeeeccaagcaege caeeaaceeaeceeaaegeggacaagaaacegacgccegceeacaeegceaeeaeeecaagcgggeaeegaecceeegacaeg egaeegaecaeeeeeeeeececeggeeaeeagggcacaacageggeggacaaceegcegaacagegaggaegeecaceacaeg ceegaggcccegaaagcccecgggcececegeggaagcagaeaaageegcaaaaagagcegeagecgeeggcegeggeggcaa geeeccegeegagaaggaegcgaaagaggaagegcaaceceeceeggggaacgceggaaTegcaaegcgaTcaeegacagcag ccgegacegcegceggeggaaaegcaacgeaegeeeeeeeeeeeaaegeeeaegaaaaeaegeaeggaaeecaeggggeaege eeeaegacceeeeeceeeaccaecageeaegegceegaeggagegccacgaaegagggagagaccgaeeggegaceeggeege cgggeegaaacaaceeggegcggaegecgacegeeecceeggcacegaaegcccaccegeecgegecaagggaaeeggaggac eecceggeggcaaggeeageeacecceaaacegcaecceeegeaceecegeaegcaccecaaeeceeegecaacceecegcae eeaeaaggaacaeeceaegaegcaaeecgacceeacacegcacageaaceegaaaegeeecaegceeaaecaaeaegccaeae eccegccaagcecaagcgagcaaeaeeegeeegaaeeeggeaccaeaeeeeegeaeaeeegggcaeecceeeeeggeceegae geceeceeeegaaeeagcaeeeaacegaaeeacacecaacaggeeaagcececeggeeccaecagcagecageaceegagegc ceegcegaeggcegcecceeeggccceeggggaegeggagaecgaaaecaeegacaaaceaaececcaeecceeacgeegaaa egacaeegagaeegaeggagcgeeeeggegegaaggcagagcaeecegaeageegggacagaeeceaeaeeaagggagggcag aageacaageaagceeceaccegcceeacegagcegaaeeaeecgggegeeeaegaeeaaceccceaaaceaaccceeetect eeeceeeggcaeegacagaececceggaaaegcceaegeegaaggegaegccecaagcgcgagceaeeecetggceggegceg caaecaceggaggcacegegacageecaaggeegeggeacgaccageetgcaggeaeaacegeagegccegeeeegacaeece accgeeeagecaageeeagecageagecacaeaeecagaaeaeagcacaaecegeaeeaegccacegeeaaecaaaeacgccc gacceagagagegceaeaeaccceagceeaatceecaaaceaaacageececeegeggceegcegegcegeeaegtecccega cceacaegeeaaeaeeacagggegaegecaaaeeegcegaggeacetgagaegaegggagcaaaggeeacaeggacegacacc agegeaaccgeaaceggeccaccacgegagcceeaegggaagaaacaccegaaagcegeegaegecaacaegaacaaaaegcc 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gaaeaaeeeggcceecegcgaeeecagaagceaeaaaeegccaececaceaaaeececceeggeccecaeggcaaegcaacga cagtgegaagcacegaagcccgeaaegceceaecaccaccatgeacgacagaaccatatatgtccataegtacaactcgagtg eegeeegageggccagcaaactggcegaccaagccacacgagagagaaeaceaeaaacecaaecaeacaeaacaagcccaagc aacaeeagacagaacacaacaacacecg SEQ ID NO: 43 Intensificador PoliU del maíz eecagcceecgaegeggaegcaacagceecacaggaeeccaeeaaaecgeagccaeegegecaaageeegceeegccaacget aeeeaeeeaeeeaeeeagaaaaccagceeegaccagccgccceceeeacgeeeggcacaaeeeagcegaaeccggcggcaegg caaggeagacegcagegcagcgegacccggecgegccccececeagagaeaaegagcaeegcaegeceaageeaeaaaaaaee accacaeaeceeeeegecacaceegeeegaagegcageeeaeceaeceeeaeacaeaeaeeeaaaceeeaceceacgaaeaae aeaaeceaeageaceacaaeaaeaecagegeeeeagagaaecaeaeaaaegaacageeagacaeggeceaaaggacaaeegag eaeeeegacaacaggaceceacageeeeaeceeeeeagegegcaegegeececceeeeeeeeeegcaaaeagceecacceaea eaaeaceecaeccaeeeeaeeageacaeccaeeeagggeeeagggeeaaeggeeeeeaeagaceaaeeeeeeeageacaecea eeeeaeeceaeeeeagcceceaaaeeaagaaaaceaaaaceceaeeeeageeeeeeeaeeeaaeaaeeeagaeaeaaaaeaga 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aaeeeaaaaaaeaaaaccaeeeeaaaaaceeaeceecaaaeacaaaeceeeeaaaaacaceaacacgegacacacagcgggca cgecacccaaacgggcgegacaaeaeegeeeegccacaccaaeccagceggegeggacaaaaegeecataeaeegaaaaeaaa aeeeaaaacaaeeeaeaeeeeeeaeceaeaecaeeaeaaaaaeegaagaegeeeeeaccggeaeeeegeeactcaeeegegca egagecggeeeeeaageeegeecgceeeeggaaaeacaeaeccgeaeeegageaegeeeeeaageecgeecgeeeeeegaaat acaaaaggaaecgeaaaaeaaaeceaeeetaaaaaacecgcaegceaaceegagacgaecgaacegceaaeegcagcecataa eeeeccaaaaaaaaaeaeaeccaaacgageeceeaeageagaeeecacceeaaeeaaaacaeaeaaaegeecacccggeacaa cgcacgageaeeeeeataageaaaaeeaaaageeeaaaaeaaaeaaaaaecccgccaccacggcgcgaeggeaaaagggggac gceeceaaacgggccgggcacgggacgaecggccccgaacccggcccaeceaaccgcegeaggcccaccgcccaccaatccaa - - ctccgeaceacgegaagcgceggaeccgcaacccgeeaagcageccacacgacecgactcgacecgcgcacecgccgtggtaq geggcaaccceeceeccecceceaeeeceeceeceecceccceececcgccecaccacaccaaccgcaccaaccccaaccccg cgcgcgcececcccececcccecccaccaaccccaccccaeccecccgacceccacgccgccggcaaeg SEQ ID NO: 46 EPSPS G3 genómico del arroz (hasta ATG) eeaaeeaaaacaeaeaaaegeecacccggeacaacgcacgageaeeeeeaeaageaaaaeeaaaageeeaaaaeaaaeaaaaa ecccgccaccacggcgcgaeggeaaaagggggacgceeceaaacgggccgggcacgggacgaecggccccgaacccggcccae ceaaccgcegeaggcccaccgcccaccaaeccaaceccgeaceacgegaagcgceggaeccgcaacccgeeaagcageccaca cgacecgacecgacecgcgcacecgccgeggeaggeggcaaccceeceeccecceceaeeeceeceeceecceccceececcg ccecaccacaccaaccgcaccaaccccaaccccgcgcgcgcececcccececcccecccaccaaccccaccccaeccecccga cceccacgccgccggcaaeg SEQ ID NO: 47 EPSPS G2 genómico del arroz + Intrón Adhl del maíz gccacaccaaeccagceggegeggacaaaaegeecaeaeaeegaaaaeaaaaeeeaaaacaateeaeaeeeeetaeceaeaec aeeaeaaaaaeegaagaegeeeeeaccggeaeeeegeeacecaeeegegcaegagecggeeeeeaageeegeecgceeeegga aaeacaeaeccgeaeeegageaegeeeteaageecgeecgeeeeeegaaaeacaaaaggaaecgeaaaaeaaaeceaeeeeaa aaaacecgcaegceaaceegagacgaecgaacegceaaeegcagcecaeaaeeeeccaaaaaaaaaeaeaeccaaacgageec eeaeageagaeeecacceeaaeeaaaacaeaeaaaegeecacccggeacaacgcacgageaeeeeeaeaageaaaaeeaaaag 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geccgcceegeeececcecegececeegaecegaceaaeceeggeeeaegaeecgeegageaaeeeeggggaaagceagceec geccacageeeeeeeeecgaegaacagegccgcageggcgcegaeceegeaegceaeccegcaaecgeggegaacetaeeect eeeaeaecceecacecccaegaaaaggceageaaeceeececgaegeaacaecgeccagcacegceaeeaccgegeggtccat ccgacageceggcegaacacaecaeacgaeaeegagcaaagaeceaeccecccegeeceeeaaegaaagacgecaetttcaec ageaegaeceaagaaegeegcaaceegcaaggaggcgeeeceeeceeegaaeeeaaceaacecgeegageggcccegettcec ggacgeaaggcceeegcegceccacacaegeccaeecgaaeeeeaccgegeeeagcaagagcgaaaageeegcaectegaega eeeagceegaceaegcgaeegceeecceggacccgegcag - 14- Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

- - LISTADO DE SECUENCIAS <110> Zeneca Ltd <120> Plantas Resistentes a Herbicidas <130> ppd50450 <160> 48 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador <400> 1 gcacargcig caagigaraa igccatigcc at <210> 2 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador <400> 2 gcwggaac g cmatgcgicc ryeiacigc _- <210> 3 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 3 atttcttctt cttcctccce tctccgcctc 30 <210> 4 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador <400> 4 gagctccccg ggcgagtgtt gttgtgttct gtctaatg <210> 5 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 5 gcetacgaag gtaegaeatc ctcctacaeg ecaggc , - <210> 6 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 6 gcagtcacgg cegcegtcaa tgatcgcaee gcaaeeccag cgeecc <210> 7 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 7 ggaacgctgg aategcaaeg cgaecattga cagcagccgt gacegc 4ß <210> 8 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 8 ggtgggcatt cagegccaag gáaacagtcg acatccgcac caagttgttt caacc » <210> 9 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 9 cgcctgcagc tcgaggttgg ttggegagag egagacacc <210> 10 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 10 cgcctgcagc tcgaggccac accaatccag ctggtgegg 39 <210> 11 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 11 gaacctcagt tatatctcat cg 2- <210> 12 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 12 gcggccgcac eagtggccgg ccatcagcgg ccagcttttg etc <210> 13 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 13 eeaactageg aggaggccgc cegccgegc <210> 14 <211> 45 <212> ADN - - <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador <400> 14 cgcctctaga ggccggccga taeccctcag ccgcctttca ctatc <210> 15 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 15 cgctgcagtg ctcgcgatcc tcctcgcttt tec ^ <210> 16 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 16 gcgcegcagg aeatccctca gccgccettc actaec 36 <210> 17 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 17 gcgeeaatea aegcecgcga eccecctcgc etttcc -< - - <210> 18 <211> 66 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador <400> 18 cccaecctcc cgacctccac gccgccggca ggatcaagtg caaaggtccg ccttgttece 60 cctceg 66 <210> 19 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 19 gacgccatgg tcgccgccae ccgcagctgc acgggtccag gaaagcaatc 50 <210> 20 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial cebador <400> 20 cgagetctta tagtagatte caccetaatt aaaac 35 <210> 21 <211> 39 <212> ADN - - <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador <400> 21 ggacccgtgc agctgcggta ccatggcggc gaccaeggc 39 <210> 22 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 22 gccaeggtcg ccgccaegge accgcagceg cacgggecc 39 <210> 23 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 23 tctceagace cagccgccte tcactac 27 <210> 24 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 24 aaacccggge eeggaagcgg agggaggaag gaggagaeaa ag 42 - - <210> 25 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador <400> 25 accctcccct ceceaaatcg attggtggga ggggagag 38 <210> 26 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador <400> 26 ggtctaccta caaaaaagct ccgcacgagg gtaccgccgc tggtac 46 <210> 27 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 27 ccetcgcctc cccecceecc tcceceaete cttc 3 <210> 28 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial - - <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador <400> 28 getggtggga ggggagagae ttagctaacc acc 33 <210> 29 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 29 gttttttcga ggcgtgcecc catggcggcg accatggcgt cc 42 <210> 30 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 30 ggaggatatc ataccttcgt aagc <210> 31 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 31 gcgctcgage cagttccega cgaaagtgct tagaacgtcg 0 <210> 32 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador <400> 32 gcgcatatga aggcggagga gatcgtgc 2ß <210> 33 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador <400> 33 gcgcaeatga aggcggagga gatcgtgc 28 <210> 34 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador <400> 34 gcagtcacgg ctgcegecaa egatcgcatt gcaattccag cgttcc 46 <210> 35 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 35 gcgctcgagt cagttcctga cgaaagtgct tagaacgtcg 40 <210> 36 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 36 ggaacgctgg aattgcaatg cgatcattga cagcagccgt gactgc 6 <210> 37 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial : cebador <400> 37 gt gaacgct ggaattgcaa tgcaat 26 <210> 38 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador <400> 38 gtegcatetc caccagcagc age 23 <210> 39 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador <400> 39 cccteccect egcgtgaatt ccatttc 27 <210> 40 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador <400> 40 gttgtgcccc taataaccag ag 22 <210> 41 <211> 3763 <212> ADN <213> Oryza sp. <400> 41 atggcggcga ccatggcgtc caacgccgcg gctgcggcgg cggtgtccct ggaccaggcc 60 gtggcggcgt cggcggcgtt ctcgtcgcgg aagcagctgc ggctgcccgc cgcggcgcgc 120 ggggggatgc gggegcgggt gcgggcgckg gggcggcggg aggcggtggt ggtggcgtcc 180 gcgecgtcge cgecggtggc agcgccggcg gcgaaggcgg aggagatcgt gctccagccc 240 atcagggaga tctccggggc ggttcagctg ccagggtcca agtcgctctc caacaggatc 300 ctcctcctct ccgccctctc cgaggtgaga cgcggatccc ttcctcttgc gtgaattcca 360 tttctggaga tgagatttta gggggtttat taggegaggt ggctgtgttt gtgaaatcct 420 aggaattatc tctcaagtca atctaacgat gagatataac tgaggttctg gttttaatca 480 cacactcata taaccaattt attgaaacat tttggtttgg cataagaaac tgcttacgaa 540 ggtatgatat cctcctacat gtcaggctac taaattttca cgacggtatg atccactcaa 600 aacaagtttc ttaacgagtc tggtgaggtc tgttatgaaa tttgtgtaaa ceaaggcaac 660 t tggaggtt tcgcactgta ccaatgttat gtttgaacat tttgcaagca gtgctttctc 720 ccaaaattat gcaattttga ggctcctcta catcattata attccccaat acattgcect 780 ttattcttaa tagctttgat cgcgaaatte aacattetaa ttcttgagce gttatetegt 840 agcatcagtt tatcatgagc catgtttgge actaaatata caatcccttg ggtttatttg 900 tttccaagca tgtcattaac ttatcttaat gtggacaaga aactgatgcc tgcttacatt 960 gctattattt caagcgggta etgatccttt gacatgtgat tgatcatttt ttttecectg 1020 gttaeeaggg cacaacagtg gtggacaact tgcegaacag tgaggatgtt cactacatgc 1080 tegaggccct gaaagccctc gggctctctg tggaagcaga taaagttgca aaaagagctg 1140 tagtcgttgg ctgtggtggc aagtttcctg ttgagaagga tgcgaaagag gaagtgcaac 1200 tctt::ttggg gaacgctgga actgcaatgc gaccattgac agcagccgtg actgctgctg 1260 gtggaaatgc aacgtatgtt ttttttttta atgtttatga aaatatgtat ggaattcatg 1320 gggtatgttt tatgaccttt ttctttacca tcagttatgt gcttgatgga gtgccacgaa 1380 tgagggagag accgattggt gacttggttg tcgggttgaa acaacttggt gcggatgecg 1440 actgtttcct tggcactgaa tgcccacctg ttcgtgtcaa gggaattgga ggacttcctg 1500 gtggcaaggt tagttactcc taaactgcat cctttgtact tctgtatgca cctcaattct 1560 ttatcaacct tctgcattta taaggaacat tctatgatgc aattcgacct tacactacac 1620 agtaacttga aatgtttcat gcttaatcaa tatgccatat tcctgccaag ctcaagcgag 1680 caatatttgt ttgaatttgg taccatattt ttgtatattt gggcattcct ttttggtctt 1740 gatgtcttct tttgaattag catttaactg aattacactc aacaggttaa gctctctggt 1800 tccatcagca gtcagtactt gagtgccttg ctgatggctg ctcctttggc ccttg ggat 1860 gtggagatcg aaatcattga caaactaatc tccattcctt acgttgaaat gacatt aga 1920 ttgatggagc gttttggtgt gaaggcagag cattctgata gttgggacag attceaeatt 1980 aagggagggc agaagtacaa gtaagctece acctgcctta ctgagctgaa ttattcgggt 2040 gtttatgatt aactccctaa actaaccctt tttcttttct ttggcattga cagatctcce 2100 ggaaatgcct atgttgaagg tgatgcctca agcgcgagct atttcttggc tggtgctgca 2160 atcactggag gcactgtgac agttcaaggt tgtggtacga ccagtttgca ggtataactg 2220 tagtgcctgt tttgacattc taccgtttag tcaagtttag tcagtagtca catattcaga 2280 atatagcaca atctgtatta tgccactgtt aatcaaatac gcttgaccta gagagtgcta 2340 tataccctag cttaatcttc aaactaaaca gttctcttgt ggcttgctgt gctgttatgt 2400 tccctgacct acatgttaat attacagggt gatgtcaaat ttgctgaggt acttgagatg 2460 atgggagcaa aggttacatg gactgacacc agtgtaaccg taactggtcc accacgtgag 2520 ccttatggga agaaacacct gaaagctgtt gatgtcaaca tgaacaaaat gcctgatgtt 2580 gccatgaccc tegccgetgt tgcastcttc gctgatggtc caactgctat cagagatggt 2640 aaacattaag gcctattata cctgttctat catactagca attactgctt agcattgtga 2700 caaaacaaat aaccaaactt tcttcaaaat aacttagaaa tataagaaag gttcgttttg 2760 tgtggtaaac agtactactg tagtttcagc tatgaagttt gctgctggca attttctgaa 2820 cggtttcagc taaattgcat gtttgttcat catacttatc cattgtcttc cacagtggct 2880 tcctggagag taaaggaaac cgaaaggatg gttgcaattc ggaccgagct aacaaaggta 2940 aattcattag gtcccgtgtc ctttcattct tcaagtagtt tgttcataag ttgaattctc 3000 cttcaatgae gtttaaattc atcatcttct tttttggtgt tgtgccagct gggagcatcg 3060 gttgaagaag gtcctgacta ctgcatcatc accccaccgg agaagctgaa catcacggca 3120 atcgacacct acgatgatca casgatggcc atggccttct ccctcgctgc ctgcgccgac 3180 gtg ccgtga cgatcaggga ccctggttgc acccgcaaga ccttccccaa ctacttcgac 3240 gttctaagca ctttcgtcag gaactgaact gagcttttaa aasagtgagg tctaggttct ".300 gttgtctgtc tgtccatcat ccatgtgttg actgttgagg gaa tcgttt cttcttttct 3360 tcacgagatg agtttttgtg tgcctgtaat actagtttgt agcaaaggct gcgttacata 3420 aggtgatgag aattgaggta aaatgagatc tgtacactaa attcattcag actgtttegg 3480 cataaagaat aatttggcct tctgcgattt cagaagctat aaatcgccat ctcactaaat 3540 tctccttsgt cctcatggca atgcaacgac agtgtgaagc actgaagccc gtaatgctct 3600 atcaccacca tgtacgacag aaccatatat gtccatatgt acaactcgag tgttgtttga 3660 gtggccagca aactggctga ccaagccaca cgagagagaa tactataaac tcaatcatac 3720 ataacaagcc caagcaacat tagacagaac acaacaacac teg 3763 <210> 42 <211> 3763 <212> ADN <213> Oryza sp <400> 42 atggcggcga ccatggcgtc caacgccgcg gc gcggcgg gtggcggcgt cggtgtccct ggaccaggcc 60 cggcggcgtt ctcgtcgcgg aagcagctgc ggctgcccgc cgcggcgcgc 120 ggggggatgc gggtgcgggt gcgggcgckg gggcggcggg aggcggtggt ggtggcgtcc 180 gcgtcgtcgt cgtcggtggc agcgccggcg gcgaaggcgg aggagatcgt gctccagccc 240 aecagggaga tctccggggc ggttcagctg ccagggtcca agtcgctctc caacaggatc 300 cecceccect ccgccctctc cgaggtgaga cgcggatccc ttcctcttgc gtgaattcca 360 tttctggaga tgagatttta gggggtttat taggtgaggt ggctgtgttt gtgaaatcct 420 aggaattatc tetcaagtca atetaaegat gagatataac tgaggttctg gttttaatca 480 cacactcata taaccaattt attgaaacat tttggtttgg cataagaaac tgcttacgaa 540 ggtatgatat cctcctacat gtcaggctac taaattttca cgacggtatg atccactcaa 600 aacaagtttc ttaacgagtc tggtgaggtc tgttatgaaa tttgtgtaaa ctaaggcaac 660 tttggaggtt tcgcactgta ccaatgttat gtttgaacat tttgcaagca gtgctttctc 720 ccaaaattat gcaattttga ggctcctcta catcattata attccccaat acattgctct 780 ttattcttaa tagctttgat cgcgaaattt aacattttaa ttcttgagct gttattttgt 840 ageatcagtt tatcatgage catgtttggt actaaatata caatcccttg ggtttatttg 900 tttecaagea tgtcattaac ttatcttaat gtggacaaga aactgatgcc tgettacatt 960 gctattattt caagcgggta ttgatccttt gacatgtgat tgatcatttt tttttctctg 1020 gttattaggg cacaacagtg gtggacaact tgctgaacag tgasgat gtt cactacatgc 1080 ttgaggccct gaaagccctc gggctctctg tggaagcaga taaagttgca aaaagagctg 1140 tagtcgttgg ctgtggtggc aagtttcctg ttgagaagga tgcgaaagag gaagtgcaac 1200 tcttcttggg gaacgctgga attgcaatgc gatcattgac agcagccgtg actgctgctg 1260 gtggaaatgc aacgtatgtt ttttttttta atgtttatga aaatatgtat ggaattcatg 1320 gggtatgttt tatgaccttt ttctttacca tcagttatgt gcttgatgga gtgccacgaa 1380 tgagggagag accgattggt gacttggttg tcgggttgaa acaacttggt gcggatgtcg 1440 actgtttcct tggcactgaa tgcccacctg ttcgtgtcaa gggaattgga ggacttcctg 1500 gtggcaaggt tagttactcc taaactgcat cctttgtact tctgtatgca cctcaattct 1560 ttgtcaacct tctgcattta taaggaacat tctatgatgc aattcgacct tacactgcac 1620 agtaacttga aatgtttcat gcttaatcaa tatgccatat tcctgccaag ctcaagcgag 1680 caatatttgt ttgaatttgg taccatattt ttgtatattt sggcattcct ttttggtctt 1740 gatgtcttct tttgaattag catttaactg aattacactc aacaggttaa gctctctggt 1800 tccatcagca gtcagtactt gagtgccttg ctgatggctg ctcctttggc ccttggggat 1860 gtggagatcg aaatcattga caaactaatc tccattcctt acgttgaaat gacattgaga 1920 ttgatggagc gttttggtgt gaaggcagag cattctgata gttgggacag attetatatt 1980 aagggagggc agaagtacaa gtaagcttct acctgcctta ctgagctgaa ttattcgggt 2040 gtttatgatt aactccctaa actaaccctt tttcttttct ttggcattga cagatctcct 2100 ggaaatgcct atgttgaagg tgatgcctca agcgcgagct atttcttggc tggtgctgca 2160 atcactggag gcactgtgac agttcaaggt tgtggtacga ccagtttgca ggtataactg 2220 tagtgcctgt tttgacattc taccgtttag tcaagtttag tcagtagtca catatteaga 2280 atatagcaca atctgtatta tgccactgtt aatcaaatac gcttgaccta gagagtgeta 2340 tataccctag cttaatcttc aaactaaaca gttctcttgt ggcttgctge gctgttatgt 2400 tccctgacct acatgttaat attacagggt gatgtcaaat ttgctgaggt acttgagatg 2460 atgggagcaa aggttacatg gactgacacc agtgtaaccg taactggtcc accacgtgag 2520 ccttatggga agaaacacct gaaagctgtt gatgtcaaca tgaacaaaat gcctgatgtt 2580 gccatgaccc ttgccgttgt tgcactcttc gctgatggtc caactgctat cagagatggt 2640 aaacattaag gcctattata cctgttctat cata tagca attactgctt agcattgtga 2700 caaaacaaat aaccaaactt tcttcaaaat aacttagaaa tataagaaag gttcgttttg 2760 egtggtaaac agtactactg tagtttcagc tatgaagttt gctgctggca attttctgaa 2820 cggtttcagc taaattgcat gtttgttcat catacttatc cattgtcttc cecagtggct 2880 tcceggagag taaaggaaac cgaaaggatg gttgcaattc ggaccgagct aacaaaggta 2940 aattcattag gtcccgtgtc ctttcattct tcaagtagtt tgttcataag ttgaattctc 3000 cttcaatgat gtttaaattc atcatcttct tttttggtgt tgtgccagct gcgagcatcg 3060 gttgaagaag gtcctgacta ctgcatcatc accccaccgg agaagctgaa catcacggca 3120 atcgacacct acgatgatca caggátggcc atggccttct ccctcgctgc ctgcgccgac 3180 gtgcccgtga cgatcaggga ccctggttgc acccgcaaga ccttccccaa ctacttcgac 3240 gttctaagca cttecgtcag gaactgaact gagcttttaa aagagtgagg tctaggttct 3300 gttgtcegtc tgtccatcat ccatgtgeeg actgttgagg gaactcgtet cttctettct 3360 tcacgagatg agtttttgtg tgcctgtaat actagtttgt agcaaaggct gcgttacata 3420 aggtgatgag aattgaggta aaatgagatc tgtacactaa attcattcag actgttttgg 3480 cataaagaat aatttggcce tctgcgaett cagaagctat aaattgccat ctcactaaat 3540 tctccttggt cctcatggca atgcaacgac agtgtgaagc actgaagccc gtaatgctct 3600 atcaccacca tgtacgacag aaccatatat gtccatatgt acaactcgag tgttgtttga 3660 gtggccagca aactggctga ccaagccaca cgagagagaa tactataaac tcaatcatac 3720 ataacaagcc caagcaacat tagacagaac acaacaacac teg 3763 <210> 43 <211> 870 <212> ADN <213> Zea mays <400> 43 ttcagcctec gatgtggatg caacagcttc acaggattcc attaaatcgt agccattgtg 60 tcaaagtttg ctttgccaac gttatttatt tatttattta gaaaaccagc tttgaccasc 120 cgccctcttt acgtttggca caatttagct gaatccggcg gcatggcaag gtagactgca 180 gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta 240 taaaaaatta ccacatattt ttttgtcaca cttgtttgaa gtgcagttta tetatettta 300 tacatatatt taaactttac tctacgaata atataateta tagtactaca ataatatcag 360 tgttttagag aatcatataa atgaacagtt agacatggtc taaaggacaa ttgagtattt 420 tgacaacagg actctacagt tttatctttt tagtgtgcat gtgttctcct tttttttttg 480 caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacat ccat ttagggttta 540 gggttaatgg tttttataga ctaaettttt tagtacatct attttattce attttagcct 600 ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt agatataaaa 660 tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta 720 aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtccacgagt 780 ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcacacggcg 840 cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct 870 <210> 44 <211> 1501 <212> ADN <213> Oryza sp. <400> 44 gatatccctc agccgccttt cactatcttt tttgcccgag tcattgtcat gtgaaccttg 60 gcatgtataa tcggtgaatt gcgtcgattt tectet ata ggtgggccaa tgaatccgtg 120 tgatcgcgtc tgattggcta gagatatgtt tcttccttgt tggatgtatt ttcar acata 180 atcatatgca tacaaatatt tcattacact ttatagaaat ggtcagtaat aaac ctatc 240 actatgtctg gtgtttcatt ttatttgctt ttaaacgaaa attgacttcc tgattcaata 300 tttaaggatc gtcaacggtg tgcagttact aaattctggt ttgtaggaac tatagtaaac 360 tattcaagtc ttcacttatt gtgcactcac ctctcgccac atcaccacag atgttattca 420 cgtcttaaat ttgaactaca catcatattg acacaatatt ttttttaaat aagcgattaa 480 aacctagcct ctatgtcaac aatggtgtac ataaccageg aagtt aggg agtaaaaaac 540 atcgccttac acaaagttcg ctttaaaaaa taaagagtaa attttacttt ggaccaccct 600 tcaaccaatg tttcacttta gaacgagtaa ttttattatt gtcactttgg accaccctca 660 aatctttttt ccatctacat ccaatttatc atgtcaaaga aatggtctac atacagetaa 720 ggagatttat cgacgaatag tagctagcat actcgaggtc attcatatgc ttgagaagag 780 agtcgggata gtccaaaata aaacaaaggt aagattacct ggtcaaaagt gaaaacatca 840 gttaaaaggt ggtataaagt aaaatatcgg taataaaagg tggcccaaag tgaaatttac 900 tcttttctac tattataaaa attgaggatg tttttgtcgg tactttgata cgtcattttt 960 gtatgaattg gtttttaagt ttattcgctt ttggaaatgc atatctgtat ttgagtcggg 1020 ttttaagttc gtttgctttt gtaaatacag agggaettgt ataagaaata tctttaaaaa 1080 aacccatatg ctaatttgac ataatttttg agaaaaatat atattcaggc gaattetcae 1140 aatgaacaat aataagatta aaatagcttt cccccgttgc agcgcatggg tattttttct 1200 agtaaaaata aaagataaac ttagaetcaa aacatttaca aaaacaaccc ctaaagttcc 1260 taaagcccaa agtgctatcc aegatecata gcaagcccag cccaacccaa cccaacccaa 1320 cccaccccag tccagccaac tggacaatag tctccacacc cccccactat caccgtgagt 1380 tgtccgcacg caccgcacgt ctcgcagcca aaaaaaaaaa aagaaagaaa aaaaagaaaa 1440 agaaaaaaca gcaggtgggt ccgggtcgtg ggggccggaa acgcgaggag gatcgcgagc 1500 a 1501 <210> 45 <211> 982 -1 - <212> ADN <213> Oryza sp. <400> 45 gttggttggt gagagtgaga caccgacgga acggaaggag aaccacgccg cttggatttt 60 tcttttttac cttttcaaat tttaatttaa aaaataaaac cattttaaaa acttatcttc 120 aaatacaaat cttttaaaaa cactaacacg tgacacacag cgggcacgtc acccaaacgg 180 gcgtgacaat attgttttgc cacaccaatc casctggtgt ggacaaaatg ttcatatatt 240 gaaaataaaa tttaaaacaa tttatatttt ttatctaeat cattataaaa attgaagatg 300 tttttaccgg tattttgtta ctcatttgtg catgagtcgg tttttaagtt tgttcgcttt 360 tggaaataca tatccgtatt tgagtatgtt tttaagttcg tecgtttttt gaaatacaaa 420 aggaatcgta aaataaatct attttaaaaa actcgcatgc taacttgaga cgatcgaact 480 gctaattgca gctcataatt ttccaaaaaa aaatatatcc aaacgagttc ttatagtaga 540 tttcacctta attaaaacat ataaatgttc acccggtaca acgcacgagt atttttataa 600 gtaaaattaa aagtttaaaa taaataaaaa tcccgccacc acggcgcgat ggtaaaaggg 660 ggacgcttct aaacgggccg ggcacgggac gatcggcccc gaacccggcc catctaaccg 720 ctgtaggccc accgcccacc aatccaactc cgtactacgt gaagcgctgg atccgcaacc 780 cgttaagcag tccacacgac tcgactcgac tcgcgcactc gccgtggtag gtggcaaccc 840 ttcttcctcc tctatttctt cttcttcctc ccttctccgc ctcaccacac caaccgcacc 900 aaccccaacc ccgcgcgcgc tctcccctct cccctcccac caaccccacc ccatcctccc 960 gacctccacg ccgccggcaa tg 982 <210> 46 <211> 435 <212> ADN <213> Oryza sp. <400> 46 ttaattaaaa catataaatg ttcacccggt acaacgcacg agtattttta taagtaaaat 60 taaaagttta aaataaataa aaatcccgcc accacggcgc gatggtaaaa gggggacgct 120 tceaaacggg ccgggcacgg gacgatcggc cccgaacccg gcccatctaa ccgctgtagg 180 cccaccgccc accaatccaa ctccgtacta cgtgaagcgc tggatccgca acccgttaag 240 cagtccacac gactcgactc gactcgcgca ctcgccgtgg taggtggcaa ccct cttcc 300 tcctctattt cttcttcttc ctcccttctc cgcctcacca caccaaccgc accaacccca 360 accccgcgcg cgctctcccc tctcccctcc caccaacccc accccatcct cccgacctcc 420 acgccgccgg caatg 435 <210> 47 <211> 1343 <212> ADN <213> Oryza sp. <400> 47 gccacaccaa tccagctggt gtggacaaaa tgttcatata ttgaaaataa aatttaaaac 60 aatttatatt ttttatctat atcattataa aaattgaaga tgtttttacc ggtattttgt 120 tactcatttg tgcatgagtc ggtttttaag tttgttcgct tttggaaata catatccgta 180 tttgagtatg tttttaagtt cgttcgtttt ttgaaataca aaaggaatcs taaaataaat 240 ctattttaaa aaactcgcat gceaacttga gacgatcgaa ctgctaattg cagctcataa 300 ttttccaaaa aaaaatatat ccaaacgagt tcttatagta gatttcacct taattaaaac 360 atataaatgt tcacccggta caacgcacga gtatttttat aagtaaaatt aaaagtttaa 420 aataaataaa aatcccgcca ccacggcgcg atggtaaaag ggggacgctt ctaaacgggc 480 cgggcacggg acgatcggcc ccgaacccgg cccatctaac cgctgtaggc ccaccgccca 540 ccaatccaac tccgtaceac gegaagcgce ggatccgcaa cccgttaagc agtccacacg 600 actcgactcg actcgcgcac tcgccgtggt aggtggcaac ccttcttcct cctctatttc 660 ttcttcttcc tcccttctcc gcctcaccac accaaccgca ccaaccccaa ccccgcgcgc 720 gctctcccct cecccctccc accaacccca ccccatcctc ccgacctcca cgccgccggc 780 aggatcaagt gcaaaggtcc gccttgtttc tcctctgtct cttgatctga ctaatcttgg 840 tttatgattc gttgagtaat tttggggaaa gctagcttcg tccacagttt ttttttcgat 900 gaacagtgcc gcagtggcgc tgatcttgta tgctatcctg caatcgtggt gaacttattt 960 cttttatatc cttcactccc atgaaaaggc tagtaatctt tctcgatgta acatcgecca 1020 gcactgctat tacegtgtgg tccatccgac agtctggctg aacacatcat acgatattga 1080 gcaaagatct atcctccctg ttctttaatg aaagacgtca ttttcatcag tatgatctaa 1140 gaatgttgca acttgcaagg aggcgtttct ttctttgaat ttaactaace cgttgagtgg 1200 ccctgtttct cggacgtaag gcctttgctg ctccacacat gtecattega attttaccgt 1260 gtttagcaag agcgaaaagt ttgcatcttg atgatttagc ttgactatgc gattgctttc 1320 ctggacccgt gcagctgcgg atg 1343 <210> 48 <211> 538 <212> ADN <213> Zea mays <400> 48 gtccgccttg tttctcctct gt tcttgat ctgactaatc ttggtttatg attcgttgag 60 taattttggg gaaagctagc ttcgtccaca gttttttttt cgatgaacag tgccgcagtg 120 gcgctgatct tgtatgctat cctgcaatcg tggtgaactt atttctttta tatccttcac 180 tcccatgaaa aggctagtaa tetttetega tgtaacatcg tccagcactg etattacegt 240 gtggtccatc cgacagtctg gctgaacaca teataegata ttgagcaaag atctatcctc 300 cctgttcttt aatgaaagac gtcattttca tcagtatgat ctaagaatgt tgcaacttgc 360 aaggaggcgt ttctttcttt gaatttaact aactcgttga gtggccctgt ttctcggacg 420 taaggccttt gctgctccac acatgtccat tcgaatttta ccgtgtttag caagagcgaa 480 aagtttgcat cttgatgatt tagcttgact atgcgattgc tttcctggac ccgtgcag 538

Claims (52)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende la secuencia ilustrada en la SEQ ID NO: 41.
2. 2. Un polinucleótido que codifica para una EPSPS, excluyendo el ADNc que codifica para la EPSPS del arroz y del maíz, caracterizado porque el polinucleótido es complementario a uno tal que cuando se incuba a una temperatura entre 65 y 70°C en solución salina reguladora de citratos de 0.1 de fuerza conteniendo SDS al 0.1%, seguido por un enjuague a la misma temperatura con solución salina reguladora de citratos al 0.1 de fuerza conteniendo SDS al 0.1%, todavía se hibridiza con la secuencia ilustrada en la SEQ ID NO: 41.
3. 3. Un polinucleótido que codifica para una EPSPS diferente a la EPSPS del maíz, caracterizado porque se obtiene mediante la selección de bibliotecas de ADN genómico de plantas con un polinucleótido que constituye un intrón dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 41.
4. 4. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una región que codifica para un péptido de transición de cloroplasto y una 5-enolpiruvilshikimato fosfato sintetasa (EPSPS) resistente al glifosato, hacia 3' del péptido, en donde la región está bajo el control de expresión de un promotor operable de planta, con las condiciones de que dicho promotor no sea heterólogo con respecto a la región y que el péptido de transición de cloroplasto no sea heterólogo con respecto a la sintetasa.
5. 5. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende los siguientes componentes en la dirección de 5' a 3' de la transcripción: i) cuando menos un intensificador de transcripción que es aquella región intensificadora que está cadena arriba del inicio de transcripción de la secuencia de la cual se obtiene el intensificador y en la cual el intensificador per se no funciona como promotor, ya sea en la secuencia en la cual está comprendido endógenamente, o bien, cuando está presente heterólogamente como parte de una construcción; (ii) el promotor del gen EPSPS del arroz; (iii) la secuencia genómica del arroz que codifica para el péptido de transición de cloroplasto de EPSPS del arroz; (iv) la secuencia genómica que codifica para la EPSPS del arroz; (v) un terminador de transcripción; en donde la secuencia codificadora de EPSPS del arroz está modificada en que una primera posición es mutada para que el residuo en esa posición sea lie en vez de Thr y una segunda posición está mutada para que el residuo en esa posición sea Ser en vez de Pro, en donde las mutaciones se introducen en secuencias EPSPS que comprenden la siguiente región conservada GNAGTAMRPLTAAV en la enzima de tipo silvestre, de tal modo que la secuencia modificada quede de la siguiente manera GNAGIAMRSLTAAV.
6. 6. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el intensificador comprende una secuencia cuyo extremo 3' está cuando menos 40 nucleótidos cadena arriba del inicio de transcripción más cercano de la secuencia de la cual se obtiene el intensificador.
7. 7. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque el intensificador comprende una región cuyo extremo 3' está cuando menos 60 nucleótidos cadena arriba del inicio más cercano.
8. 8. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el intensificador comprende una secuencia cuyo extremo 3' está cuando menos 10 nucleótidos cadena arriba del primer nucleótido del consenso TATA de la secuencia de la cual se obtiene el -13 - intensificador .
9. 9. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende el primero y el segundo intensificadores de transcripción.
10. 10. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el primero y segundo intensificadores están presentes en tándem en el polinucleótido .
11. 11. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el extremo 3' del intensificador, o primer intensificador, está entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1000 nucleótidos cadena arriba del codón correspondiente al inicio de traducción del péptido de transición EPSPS, o del primer nucleótido de un intrón en la región 5' no traducida.
12. 12. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el extremo 3' del intensificador, o primer intensificador, está entre aproximadamente 150 y aproximadamente 1000 nucleótidos cadena arriba del codón correspondiente al inicio de traducción del péptido de transición de EPSPS, o del primer nucleótido de un intrón en la región 5' no traducida.
13. 13. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el extremo 3' del intensificador, o primer intensificador, está entre aproximadamente 300 y aproximadamente 950 nucleótidos cadena arriba del codón correspondiente al inicio de traducción del péptido de transición de EPSPS, o del primer nucleótido de un intrón en la región 5' no traducida.
14. 14. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el extremo 3' del intensificador, o primer intensificador, está entre aproximadamente 770 y aproximadamente 790 nucleótidos cadena arriba del codón correspondiente al inicio de traducción del péptido de transición de EPSPS, o del primer nucleótido de un intrón en la región 5' no traducida.
15. 15. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el extremo 3' del intensificador, o primer intensificador, está entre aproximadamente 300 y aproximadamente 380 nucleótidos cadena arriba del codón correspondiente al inicio de traducción del péptido de transición de EPSPS, o del primer nucleótido de un intrón en la región 5' no traducida.
16. 16. Un polinucleótido de conformidad con - - cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y 15, caracterizado porque el extremo 3' del intensificador, o primer intensificador, está entre aproximadamente 320 y aproximadamente 350 nucleótidos cadena arriba del codón correspondiente al inicio de traducción del péptido de transición de EPSPS, o del primer nucleótido de un intrón en la región 5' no traducida.
17. 17. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque la región cadena arriba del promotor del gen EPSPS del arroz, comprende cuando menos un intensificador derivado de una secuencia que está cadena arriba del inicio de traducción del promotor de la poliubiquitina del maíz o del promotor de la actina del arroz.
18. 18. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende, en dirección de 5' a 3', un primer intensificador que comprende una región de intensificación de transcripción derivada de una secuencia que está cadena arriba del inicio de transcripción del promotor de la actina del arroz y un segundo intensificador que comprende una región de intensificación de transcripción derivada de una secuencia que está cadena arriba del inicio de transcripción de un promotor de la actina del arroz.
19. 19. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque los nucleótidos hacia 5' del codón que constituye el inicio de traducción del péptido de transición de cloroplasto EPSPS del arroz, son preferidos de Kozack.
20. 20. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque hacia 5' de la secuencia genómica del arroz que codifica para el péptido de transición de cloroplasto EPSPS del arroz, está localizada una región no traducida que comprende una secuencia que funciona como intrón.
21. 21. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la región no traducida comprende un intrón, en donde el intrón es el intrón ADHI del maíz.
22. 22. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 20, caracterizado porque la región no traducida comprende la secuencia ilustrada en la SEQ ID NO: 48.
23. 23. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la región no traducida comprende un intrón, en donde el intrón es un intrón de la actina del arroz 1 ó un intrón de poliubiquitina del maíz.
24. 24. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque comprende un intensificador de traducción derivado de virus localizado en la región 5' no traducida de la secuencia genómica del arroz que codifica para el péptido de transición de cloroplasto EPSPS del arroz.
25. 25. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque además comprende regiones codificadoras de proteínas capaces de conferirle al material de planta que las contiene, cuando menos uno de los siguientes rasgos agronómicamente deseables: resistencia a insectos, hongos, virus, bacterias, nematodos, estrés, desecación y herbicidas .
26. 26. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el herbicida es diferente al glifosato.
27. 27. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 ó 26, caracterizado porque las regiones que confieren resistencia a insectos codifican para toxinas cristalinas derivadas de Bt, incluyendo toxinas Bt secretadas; inhibidores de proteasa, lectinas, toxinas de Xenhorabdus/Photorhabdus; las regiones que confieren resistencia a hongos se seleccionan del grupo que consiste de aquellas que codifican para sustancias conocidas como AFPs, defensinas, quitinasas, glucanasas, Avr-Cf9 ; las regiones que confieren resistencia a bacterias se seleccionan del grupo que consiste de aquellas que codifican para cecropinas y tequiplesina y análogos de las mismas; las regiones de resistencia a virus se seleccionan del grupo que consiste de genes que codifican para proteínas de la cubierta de virus, proteínas de movimiento, replicasas virales y secuencias antisentido y de ribozima, que se sabe que proporcionan resistencia a virus; las regiones que confieren resistencia al estrés, a la sal y a la desecación, se seleccionan de aquellas que codifican para Glutatión-S-transferasa y peroxidasa, cuya secuencia constituye la secuencia reguladora CBFl conocida y genes que se sabe que proporcionan acumulación de trehalosa.
28. 28. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque las regiones que confieren resistencia a insectos se seleccionan del grupo que consiste de genes crylAc, crylAb, cry3A, Vip la, Vip IB, inhibidor de cisteína proteasa y lectina copo de nieve.
29. 29. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque está modificado en que se remueven las porciones de ARNm de inestabilidad y/o regiones de empalmamiento no deseado, o se utilizan codones preferidos para que la expresión del polinucleótido así modificado en una planta produzca una proteína sustancialmente similar que tenga una actividad/función similar a aquella obtenida mediante la expresión de las regiones codificadoras de proteína del polinucleótido no modificado, en el organismo en el cual sean endógenas.
30. 30. Un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el grado de identidad entre el polinucleótido modificado y un polinucleótido endógenamente contenido en la planta y que codifica sustancialmente para la misma proteína, es tal que previene la cosupresión entre las secuencias modificada y endógena.
31. 31. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque el grado es menor de aproximadamente 70%.
32. 32. Un vector caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
33. 33. Material de planta caracterizado porque ha sido transformado con el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, o el vector de la reivindicación 32.
34. 34. Material de planta caracterizado porque ha sido transformado con el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, o el vector de conformidad con la reivindicación 32, y que ha sido, o es transformado adicionalmente, con un polinucleótido que comprende regiones codificadoras de proteínas capaces de conferirle al material de planta que las contiene, cuando menos uno de los siguientes rasgos agronómicamente deseables: resistencia a insectos, hongos, virus, bacterias, nematodos, estrés, desecación y herbicidas.
35. 35. Plantas completas fértiles, morfológicamente normales, caracterizadas porque han sido regeneradas a partir de material de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 ó 34, sus semillas de progenie y partes.
36. 36. Plantas completas, fértiles, morfológicamente normales, caracterizadas porque comprenden el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 y que son el resultado de la cruza de plantas que han sido regeneradas a partir de material transformado con el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 ó el vector de la reivindicación 32, y plantas que han sido transformadas con un polinucleótido que comprende regiones codificadoras de proteína capaces de conferirle al material de planta que las contiene, cuando menos uno de los siguientes rasgos agronómicamente deseables: resistencia a insectos, hongos, virus, bacterias, nematodos, estrés, desecación y herbicidas, la progenie de las plantas resultantes, sus semillas y partes.
37. 37. Plantas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 ó 36, caracterizadas porque se seleccionan del grupo que consiste de campos de cultivo, frutas y vegetales tales como cañóla, girasol, tabaco, remolacha azucarera, algodón, maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, jitomate, mango, durazno, manzana, pera, fresa, plátano, melón, papa, zanahoria, lechuga, col, cebolla, soya spp, caña de azúcar, chícharo, frijol de campo, álamo, uva, limón, alfalfa, centeno, avena, césped y pastos de forraje, lino y colza de semilla oleosa, y plantas productoras de nueces, en la medida en que no hayan sido ya mencionadas específicamente, su progenie, semillas y partes.
38. 38. Plantas de maíz de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37.
39. 39. Un método para controlar selectivamente hierbas en un campo, en donde el campo comprende hierbas y plantas o progenie de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, caracterizado el método porque comprende la aplicación al campo de un herbicida de tipo glifosato en una cantidad suficiente para controlar las hierbas sin afectar sustancialmente a las plantas.
40. 40. Un método de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque además comprende la aplicación al campo, antes o después de la aplicación del herbicida de glifosato, de uno o más de los siguientes: un herbicida, insecticida, fungicida, nematicida, bactericida y antiviral.
41. 41. Un método para producir plantas que son sustancialmente tolerantes o sustancialmente resistentes al herbicida glifosato, caracterizado porque comprende los pasos de: i) transformar material de planta con el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 ó el vector de la reivindicación 32; ii) seleccionar el material así transformado; y iii) regenerar el material así seleccionado para obtener plantas completas, fértiles, morfológicamente normales.
42. 42. Un método de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque la transformación incluye la introducción del polinucleótido en el material, por medio de: (i) bombardeo biolístico del material con partículas revestidas con el polinucleótido; o (ii) empalamiento del material en fibras de carburo de silicio que están revestidas con una solución que comprende al polinucleótido; o (iii) la introducción del polinucleótido o vector en Agrobacteri um y la cocultivación del Agrobacteri um así transformado con el material de planta, el cual de esta manera se transforma y subsecuentemente es regenerado.
43. 43. Un método de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque el material transformado se selecciona por su resistencia al glifosato.
44. 44. El uso del polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 ó el vector de la reivindicación 32, en la producción de tejidos de planta y/o plantas completas fértiles, morfológicamente normales, que son sustancialmente tolerantes o sustancialmente resistentes al herbicida glifosato.
45. 45. El uso del polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 ó el vector de la reivindicación 32, en la producción de un herbicida blanco para la selección in vi tro de alto rendimiento de herbicidas potenciales.
46. 46. Un método para seleccionar material biológico transformado para expresar un gen de interés, caracterizado porque el material transformado comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 ó el vector de la reivindicación 32 y en donde la selección comprende exponer al material transformado a glifosato o a una sal del mismo y seleccionar el material sobreviviente.
47. 47. Un método de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque el material biológico es de origen de planta.
48. 48. Un método de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque la planta es una planta monocotiledónea.
49. 49. Un método de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque la planta monocotiledónea se selecciona del grupo que consiste de cebada, trigo, maíz, arroz, avena, centeno, sorgo, piña, caña de azúcar, plátano, cebolla, espárrago, puerro.
50. 50. Un método para regenerar una planta transformada fértil para contener ADN extraño, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) producir tejido regenerable a partir de la planta por ser transformada; (b) transformar el tejido regenerable con el ADN extraño, en donde el ADN extraño comprende una secuencia de ADN seleccionable, en donde la secuencia funciona en un tejido regenerable como dispositivo de selección; (c) entre aproximadamente 1 y aproximadamente 60 días después del paso del inciso (b) , colocar el tejido regenerable del paso del inciso (b) en un medio de cultivo capaz de producir brotes del tejido, en donde el medio además comprende un compuesto que se utiliza para seleccionar el tejido regenerable que contenga la secuencia de ADN seleccionable, para permitir la identificación o selección del tejido regenerado transformado; (d) después de que se ha formado cuando menos un brote del tejido seleccionado del paso del inciso (c) , transferir el brote a un segundo medio de cultivo capaz de producir raíces a partir del brote para producir una plántula, en donde el segundo medio opcionalmente contiene dicho compuesto; y (e) hacer crecer la plántula hasta que sea planta transgénica fértil, en donde el ADN extraño sea transmitido a las plantas progenie de manera Mendeliana, en donde entre el paso del inciso (b) y el paso del inciso (c) hay un paso opcional de colocar el material transformado en un medio inductor de callos, caracterizado porque el ADN extraño o la secuencia de ADN seleccionable comprendida por el ADN extraño, comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 ó el vector de la reivindicación 32, y el compuesto es glifosato o una sal del mismo.
51. 51. Un método de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque la planta es una planta monocotiledónea que se selecciona del grupo que consiste de plátano, trigo, arroz, maíz y cebada.
52. 52. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50 ó 51, caracterizado porque el tejido regenerable se selecciona del grupo que consiste de callos embriogénicos, embriones somáticos, embriones inmaduros, etcétera.