ES2345147T3 - Casete de expresion que codifica una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (epsps) y plantas tolerantes a herbicidas que lo contienen. - Google Patents
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Abstract
Un casete de expresión que comprende, en la dirección de transcripción, funcionalmente unido a otro, una secuencia reguladora del promotor que es funcional en células vegetales o plantas, una secuencia de ácido nucleico que codifica una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) y una secuencia reguladora terminal que es funcional en células vegetales o plantas, caracterizado en que la secuencia reguladora del promotor comprende, en la dirección de transcripción, las secuencias de ácido nucleico X, Y, Y y Z, según el cual x se representa por la SEQ ID NO: 1, Y se representa por la SEQ ID NO:2, y Z se representa por la SEQ ID NO: 3.
Description
Casete de expresión que codifica una
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) y plantas tolerantes a herbicidas que lo
contienen.
La presente invención se refiere a un nuevo
casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico
que codifica una
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) y a su uso para la obtención de plantas resistentes
a herbicidas que la inhiben, en particular herbicidas de la familia
de ácido fosfónico, en particular de la familia de
N-fosfonometilglicina.
\vskip1.000000\baselineskip
Uno de los principales problemas en agricultura
radica en controlar el desarrollo de plantas de autopropagación
indeseables, o malas hierbas, en áreas en las que crecen cultivos.
El desarrollo de malas hierbas conduce a un debilitamiento de las
plantas de cultivo y a una disminución en los rendimientos obtenidos
en su crecimiento. Para combatir estas plantas indeseables, se usan
herbicidas, generalmente mediante pulverizado en los cultivos.
Existen muchos tipos de herbicidas, en
particular herbicidas selectivos que actúan solo en un grupo de
plantas particulares sin afectar a las plantas de cultivo. La
desventaja de los herbicidas selectivos es que su espectro de
actividad generalmente es restringido, lo que requiere el uso de
otros herbicidas selectivos con diferentes espectros de actividad
para controlar las malas hierbas de forma eficaz. La solución a ésta
desventaja radica en el uso de herbicidas totales capaces de actuar
sobre todas las plantas. Los herbicidas totales son frecuentemente
herbicidas para los que la diana es enzimas implicadas en las rutas
metabólicas vitales de las plantas, lo que les da la ventaja de
tener un amplio espectro de actividad sobre plantas de orígenes
filogenéticos alejados. Sin embargo, dichos herbicidas tienen
también la principal desventaja de actuar también sobre las plantas
de cultivo cuando se aplican a los cultivos para eliminar malas
hierbas. Esta desventaja puede solventarse al usar plantas para
cultivos hechas tolerantes a dichos herbicidas. Dichas plantas se
obtienen generalmente por ingeniería genética, introduciendo en su
genoma un gen que codifica una enzima resistente a dicho herbicida
de manera que sobreexpresen dicha enzima en sus tejidos.
La EPSPS es una enzima de plastidio involucrada
en la ruta biosintética del shikimato, llevando a la síntesis de
aminoácidos aromáticos. La EPSPS se conoce por ser la enzima diana
para herbicidas de la familia de ácidos fosfónicos del tipo
fosfonometilglicina. Los herbicidas inhibidores de
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) son bien conocidos ya que son herbicidas foliares
altamente eficaces. El herbicida mejor conocido de esta clase de
herbicidas es glifosato [N-(fosfonometil)glicina]. También se
conocen sulfonato o fosametina. El glifosato se caracteriza por una
falta de selectividad para las especies de cultivo y se usa, por
consiguiente, generalmente bajo condiciones en las que no hay una
necesidad de selectividad, por ejemplo como un herbicida total.
Para superar el problema de selectividad del
glifosato, las plantas tolerantes a este herbicida se han
desarrollado por transformación de dichas plantas con un gen que
codifica una enzima EPSPS tolerante al glifosato. Los genes que
codifican enzimas EPSPS tolerantes al glifosato se describen en
particular en la solicitud de patente EP 0837944. En particular, se
vende maíz y soja tolerantes al glifosato respectivamente bajo las
marcas Roundup-Ready Corn^{TM} y
Roundup-Ready Soybean^{TM}. De esta manera, se
puede aplicar glifosato a los cultivos sin afectar a las plantas de
cultivo que se han hecho tolerantes.
El éxito de esta estrategia se basa
esencialmente en la calidad y la cantidad de expresión de la enzima
en los tejidos de la planta que se pretende que sea tolerante.
Estos parámetros de calidad y cantidad de expresión se controlan
por los elementos reguladores introducidos en el casete de expresión
con la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha enzima EPSPS.
Los elementos reguladores esenciales para un casete de expresión
son la secuencia reguladora del promotor y la secuencia reguladora
terminal. Los casetes de expresión pueden contener también un
péptido señal o un péptido de tránsito, y también un elemento
activador o mejorador de la transcripción. Sin embargo, el elemento
regulador que contribuye más a la calidad y la cantidad de expresión
de una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico en
un casete de expresión es el promotor. La identificación del
promotor adecuado para expresión de una proteína dada también
depende ampliamente de la naturaleza de dicha proteína, y en
particular de la cantidad y calidad deseada de la expresión de dicha
proteína. Asociado con un promotor dado, es una cantidad de
expresión del producto codificado por la secuencia de ácido
nucleico que controla, y también una calidad, en particular la
calidad espacio-temporal, de esta expresión.
Además, algunos promotores son constitutivos y otros
inducibles.
inducibles.
Una característica importante para un promotor
usado en un casete de expresión destinado a la expresión de una
enzima EPSPS en una planta es que pueda permitir una cantidad de
expresión cuantitativa suficiente para conferir tolerancia al
glifosato en todos los tejidos de la planta que puedan afectarse por
este herbicida.
El problema técnico de la presente invención
consiste en obtener un casete de expresión en el que el promotor
sea particularmente adecuado para la expresión cuantitativa y
cualitativa de un enzima EPSPS en plantas transformadas,
confiriendo entonces dicho casete de expresión una tolerancia eficaz
en dichas plantas, con respecto a un herbicida que inhibe esta
enzima, en particular un herbicida de la familia
fosfonometilglicina, en particular glifosato.
Los promotores que permiten un alto nivel de
expresión son generalmente promotores de proteínas altamente
expresadas. Entre los promotores usados más comúnmente que
satisfacen estos criterios, puede hacerse mención, por medio del
ejemplo, de promotores bacterianos, tal como el del gen de octopina
sintasa o el del gen de nopalina sintasa, promotores virales, tal
como el del gen que controla la transcripción de los ARN 35S o 19S
del virus del mosaico de la coliflor (Odell et al., 1985,
Nature, 313, 810-812), o promotores del virus del
mosaico de la vena de yuca (como se describe en la solicitud de
patente WO 97/48819). Entre los promotores de origen vegetal, se
hará mención del promotor del gen de la sub-unidad
pequeña ribulosa-biscarboxilasa/oxigenasa
(RuBisCO), el promotor de un gen de histona como se describe en la
solicitud EP 0 507 698, o el promotor de un gen de actina de arroz
(documento US 5.641.876).
Otros promotores se expresan de forma específica
en las células de ciertos tejidos. Dichos promotores son
generalmente promotores que regulan la expresión de proteínas
implicadas en la función de un tejido u órgano particular. En
plantas, se conocen promotores específicos de la raíz, tal como, por
ejemplo, los descritos en la solicitud de patente WO 00/29594,
promotores específicos de la flor, tal como los descritos en las
solicitudes de patente WO 98/22593, WO 99/15679 o WO 99/43818, y
promotores específicos de la fruta, en particular promotores
específicos de la semilla, tal como los descritos en las solicitudes
de patente WO 91/13993, WO 92/17580, WO 98/45460, WO 98/45461 o WO
99/16890.
La presente invención se refiere a un nuevo
casete de expresión que comprende, en la dirección de transcripción,
opcionalmente unido a otro, una secuencia reguladora de promotor
que es funcional en células vegetales o plantas, una secuencia de
ácido nucleico que codifica
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) y una secuencia terminal que es funcional en
células vegetales o plantas, caracterizada en que la secuencia
reguladora del promotor comprende, en la dirección de
transcripción, la secuencia de ácido nucleico x, y, y, z, según el
cual x se representa por la SEQ ID NO: 1, y se representa por la SED
ID NO: 2, y z se representa por la SEQ ID NO:3.
La expresión "funcionalmente unidos a otro"
significa que dichos elementos del gen quimérico están unidos entre
sí de tal manera que su función está coordinada y permite la
expresión de la secuencia de codificación. A modo de ejemplo, un
promotor se une de forma funcional a una secuencia de codificación
cuando es capaz de asegurar la expresión de dicha secuencia de
codificación. La estructura del gen quimérico según la invención y
el montaje de sus diversos elementos puede realizarse usando
técnicas bien conocidas de los expertos en la técnica, en
particular las descritas en Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., Nueva York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press). La expresión "funcional en células
vegetales y plantas" pretende indicar capaz de funcionar en
células vegetales y plantas.
Las secuencias reguladoras del promotor CsVMV se
describen en la solicitud de patente WO 97/48819, en particular la
secuencia reguladora del promotor que comprende una de las
secuencias de nucleótidos representada por uno de los
identificadores de secuencia SEQ ID Núms. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 de la solicitud de patente WO 97/48819,
más particularmente la secuencia de ácido nucleico representada por
el identificador de secuencia SEQ ID NO 3 de la solicitud de
patente WO 97/48819.
Preferiblemente, la secuencia reguladora del
promotor se representa por la SEQ ID NO 5 de la presente
solicitud.
La presente invención se refiere además a las
secuencias capaces de hibridar de forma selectiva con las secuencias
de ácido nucleico anteriores, las secuencias homólogas a las
secuencias anteriores y los fragmentos funcionales de dichas
secuencias.
Según la presente invención, el término
"secuencia de ácido nucleico" pretende indicar una secuencia de
nucleótidos o polinucleótidos que puede ser de tipo ADN o ARN,
preferiblemente del tipo ADN, en particular de doble hebra.
Según la invención, la expresión "secuencia
capaz de hibridar de forma selectiva" pretende indicar las
secuencias que hibridan con las secuencias anteriores a un nivel
significativamente mayor que el ruido de fondo. El ruido de fondo
puede relacionarse con la hibridación de otras secuencias de ADN
presentes, en particular otros ADNc presentes en un banco de ADNc.
El nivel de la señal generada por la interacción entre la secuencia
capaz de hibridar de forma selectiva y las secuencias definidas por
las SEQ ID anteriores según la invención es generalmente 10 veces,
preferiblemente 100 veces, más intensa que aquella de la interacción
de las otras secuencias de ADN que generan el ruido de fondo. El
nivel de interacción puede medirse, por ejemplo, marcando la sonda
con elementos radioactivos, tal como 32P. La hibridación selectiva
se obtiene generalmente usando condiciones del medio muy
astringentes (por ejemplo NaCl 0,03 M y citrato sódico 0,03 M a
aproximadamente 50ºC-60ºC). La hibridación puede
llevarse a cabo, por supuesto, según los métodos normales del estado
de la técnica (en particular Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual).
Según la invención, el término "homólogo"
pretende indicar un fragmento de ácido nucleico que muestra una o
más modificaciones de secuencia respecto a la secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína de fusión de la invención.
Estas modificaciones pueden obtenerse según las técnicas habituales
de mutación o incluso en la elección de oligonucleótidos sintéticos
usados en el preparado de dicha secuencia de hibridación. Con
respecto a las combinaciones múltiples de ácidos nucleicos que
pueden llevar a la expresión de un mismo aminoácido, las
diferencias entre la secuencia de referencia según la invención y el
correspondiente homólogo pueden ser considerables. De forma
ventajosa, el grado de homología será de al menos el 70% respecto a
la secuencia de referencia, preferiblemente al menos 80%, más
preferiblemente al menos el 90%. Estas modificaciones son general y
preferiblemente neutras, es decir, no afectan a la secuencia
primaria de la proteína de fusión.
Los métodos para medir e identificar homologías
entre secuencias de ácidos nucleicos son bien conocidas por los
expertos en la técnica. Puede hacerse uso, por ejemplo, de los
programas PILEUP o BLAST (en particular Altschul et al.,
1993, J. Mol. Evol. 36: 290-300; Altschul et
al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10).
Los métodos para medir e identificar homologías
entre polipéptidos y proteína también son conocidos por los
expertos en la técnica. Puede hacerse uso, por ejemplo, del paquete
UWGCG y el programa BESTFITT para calcular homologías (Deverexu
et al., 1984, Nucleic Acid Res. 12,
387-395).
Según la invención, el término "fragmentos"
pretende indicar fragmentos de las secuencias de ADN según la
invención, es decir, las secuencias anteriores para las que se han
eliminado partes pero que conservan la función de dichas
secuencias.
Según la invención, el término "EPSPS"
pretende indicar cualquier enzima
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa natural o mutada, cuya actividad enzimática consiste en
sintetizar
5-O-(1-carboxivinil)-3-fosfoshikimato
a partir de fosfoenolpiruvato (PEP) y
3-fosfoshikimato (E.C. 2.5.1.19; Morell et
al., 1967, J. Biol. Chem. 242, 82-90). En
particular, dicha enzima EPSPS puede originarse a partir de
cualquier tipo de organismo. Una enzima EPSPS según la invención
tiene además la propiedad de ser tolerante con respecto a herbicidas
de la familia fosfonometilglicina, en particular con respecto al
glifosato.
Se conocen secuencias que codifican EPSPS que
son tolerantes de forma natural, o usadas como tal, con respecto a
herbicidas de la familia de las fosfonometilglicina, en particular
glifosato. Por medio del ejemplo, puede hacerse mención de la
secuencia del gen AroA de la bacteria Salmonella typhimurium
(Comai et al., 1983, Science 221, 370-371),
la secuencia del gen CP4 de la bacteria Agrobacterium sp.
(documento WO 92/04449), o las secuencias de los genes que
codifican Petunia EPSPS (Shah et al., 1986, Science 233,
478-481), Tomato EPSPS (Gasser et al., 1988,
J. Biol. Chem. 263,4280-4289), o Eleusine EPSPS
(documento WO 01/66704).
También se conocen las secuencias que codifican
EPSPS que se han hecho tolerantes al glifosato por mutación. Por
medio del ejemplo, puede hacerse mención de las secuencias de los
genes que codifican EPSPS mutadas de origen bacteriano (Stalker
et al., 1985, J. Biol, Chem. 260(8),
4724-4728) o de origen vegetal (documentos EP
0293358; Ruff et al., 1991, Plant Physiol. 96(S),
Resumen 592; WO 91/04323; WO 92/06201; EP 0837944). Una secuencia
de un gen que codifica una EPSPS de la planta mutada que se prefiere
según la invención, es aquella que codifica la EPSPS de maíz
descrita en la solicitud de patente EP 0837944, que comprende una
primera mutación que reemplaza el aminoácido treonina en la
posición 102 por una isoleucina, y una segunda mutación que
reemplaza el aminoácido prolina en la posición 106 por una serina.
Debido a la fuerte homología de secuencias entre EPSPSs, y más
particularmente entre los EPSPS vegetales, se ha descrito también la
EPSPS de arroz que lleva las mismas mutaciones en las solicitudes
de patente WO 00/66746 y WO 00/66747. En general, cualquier EPSPS,
y los genes que codifican, que tienen las mutaciones
treonina/isoleucina y prolina/serina descritas anteriormente,
cualquiera que sea la posición relativa de estos aminoácidos con
respecto a las posiciones 102 y 106 de la EPSPS del maíz, pueden
usarse en la presente invención. Para aplicar este principio, los
expertos en la técnica serán capaces fácilmente de encontrar los
dos aminoácidos a mutar en cualquier secuencia EPSPS usando técnicas
estándar del alineamiento de
secuencia.
secuencia.
Según una realización preferida de la invención,
la secuencia de ácido nucleico que codifica una EPSPS incluida en
el casete de expresión es una secuencia que codifica una EPSPS que
ha sido mutada a los aminoácidos que corresponden a la treonina en
la posición 102 y la prolina en la posición 106, siendo dichas
posiciones relativas con respecto a la secuencia EPSPS de maíz.
Según otra realización preferida de la
invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica una EPSPS
incluida en el casete de expresión es una secuencia que codifica
una EPSPS que comprende una isoleucina en la posición 102 y una
serina en la posición 106, siendo dichas posiciones relativas con
respecto a la secuencia EPSPS de maíz.
Según otra realización preferida de la
invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica una EPSPS
incluida en el casete de expresión es una secuencia que codifica la
EPSPS mutada de maíz que comprende una isoleucina en la posición
102 y una serina en la posición 106.
Entre las secuencias terminales que pueden
usarse en el casete de expresión según la presente invención, puede
hacerse mención, por medio del ejemplo, de la secuencia terminal
nos del gen que codifica la Agrobacterium tumefaciens
nopalina sintasa (Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res.
11(2), 369-385), o la secuencia terminal de
un gen de histona como se describe en la solicitud EP 0 633 317.
El casete de expresión según la invención puede
comprender además una secuencia de direccionamiento
sub-celular que codifica un péptido de señal o
péptido de transición. Dicha secuencia, localizada corriente arriba
o corriente abajo de la secuencia de ácido nucleico que codifica la
EPSPS, hace posible dirigir dicha EPSPS específicamente en un
compartimiento celular del organismo huésped. Por ejemplo, el casete
de expresión puede comprender una secuencia que codifica un péptido
de señal o un péptido de transición para dirigir la EPSPS a un
compartimiento particular del citoplasma, tal como la mitocondria,
los plastos, el retículo endoplásmico o las vacuolas.
El papel de dichas secuencias se describe en
particular en el número 38 de la revista Plant Molecular Biology
(1998), dedicado en gran parte al transporte de proteínas en los
diversos compartimientos de la célula vegetal (Sorting of proteins
to vacuoles in plant cells págs. 127-144; the
nuclear pore complex págs. 145-162; protein
translocation into and across the chloroplastic enveloppe membranes
págs. 91-207; multiple pathways for the targeting
of thylakoid proteins in chloroplasts págs. 209-221;
mitochondrial protein import in plants págs.
311-338).
Según una realización, el péptido de transición
puede ser una señal para el direccionamiento cloroplástico o
mitocondrial, que se parte entonces en los cloroplastos o la
mitocondria.
Los péptidos de transición pueden ser péptidos
de transición o bien sencillos o dobles. Los péptidos de transición
dobles se separan opcionalmente por una secuencia intermedia, es
decir, comprenden, en la dirección de transcripción, una secuencia
que codifica un péptido de transición de un gen vegetal que codifica
una enzima que está situada en plástidos, una parte de la secuencia
de la parte N-terminal madura de un gen vegetal que
codifica una enzima que está situada en los plástidos, y después
una secuencia que codifica un segundo péptido de transición de un
gen vegetal que codifica una enzima que está situada en los
plástidos. Dichos péptidos de transición dobles se describen, por
ejemplo, en la solicitud de patente EP 0 508 909.
Según la invención, el casete de expresión puede
comprender además otras secuencias reguladoras, que están
localizadas entre el promotor y la secuencia de codificación, tales
como activadores ("intensificadores") de la transcripción, por
ejemplo el activador de transcripción del virus del mosaico del
tabaco (TMV) descrito en la Solicitud WO 87/07644, o del virus del
grabado del tabaco (TEV) descrito por Carrington & Freed, o del
virus de mosaico de escrofularia (documento US 5 994 521), por
ejemplo. El casete de expresión según la invención puede contener
además intrones, en particular intrones que promueven la expresión
génica en plantas monocotiledóneas, tal como el intrón 1 del gen de
actina del arroz descrito en la solicitud de patente WO 99/34005, o
el intrón adh1 del maíz, o en plantas dicotiledóneas, tal como el
intrón de histona de Arabidopsis (documento EP 0850311).
La presente invención se refiere además a un
vector de clonación y/o expresión que comprende un casete de
expresión según la invención. El vector según la invención se usa
para transformar un organismo huésped, en particular una planta, y
expresarlas en una EPSPS. El vector puede ser un plásmido, un
cósmido, un bacteriófago o un virus. Preferentemente, el vector
para transformar las células vegetales o plantas según la invención
es un plásmido. En general, las cualidades principales de este
vector serían una capacidad para mantenerse y para
auto-replicarse en las células del organismo
huésped, en particular por medio de la presencia de un origen de
replicación, y para expresar en el mismo una EPSPS. La elección de
dicho vector y también las técnicas para insertarlos en el casete
de expresión según la invención se describen ampliamente en Sambrook
et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan
C. ed., Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) y son
parte del conocimiento general del experto en la técnica.
Ventajosamente, el vector usado en la presente invención también
contiene, además del casete de expresión según la invención, otro
casete de expresión que contiene un marcador de selección. Este
marcador de selección hace posible seleccionar los organismos
huésped que se han transformado de forma eficaz, es decir aquellos
que han incorporado el vector. Según una realización particular de
la invención, el organismo huésped a transformar es una planta.
Entre los marcadores de selección que pueden usarse, puede hacerse
mención de marcadores que contienen genes resistentes a
antibióticos, tal como, por ejemplo, aquellos del gen higromicina
fosfotransferasa (Gritz et al., 1983, Gene
25:179-188), aunque también marcadores que
contienen genes para la tolerancia a los herbicidas, tal como el gen
bar (White et al., NAR 18:1062, 1990) para la
tolerancia a bialafos, el gen EPSPS (documento EP 0837944) para la
tolerancia al glifosato o también el gen HPPD (documento WO
96/38567) para la tolerancia a isoxazoles. Se puede hacer mención
también de genes que codifican enzimas fácilmente identificables tal
como la enzima GUS, y genes que codifican pigmentos o enzimas que
regulan la producción de pigmentos en las células transformadas.
Dichos genes de marcador de selección se describen en particular en
las solicitudes de patente WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 y
WO 97/04103.
La presente invención se refiere también a
células vegetales transformadas con un vector como se describe
anteriormente. El término "célula vegetal transformada"
pretende indicar una célula vegetal que ha incorporado en su genoma
el casete de expresión según la invención, y consecuentemente
produce una EPSPS. Para obtener las células vegetales transformadas
según la invención, los expertos en la técnica pueden usar uno de
los muchos métodos conocidos de transformación. Uno de estos
métodos consiste en poner las células vegetales a transformar en
contacto con polietilenglicol (PEG) y los vectores de la invención
(Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168(1),
111-115; Mercenier y Chassy, 1988, Biochimie
70(4), 503-517). La electroporación es otro
método, que consiste en someter a las células o tejidos vegetales a
transformar y los vectores de la invención a un campo eléctrico
(Andreason y Evans, 1988, Biotechniques 6(7),
650-660; Shigekawa y Dower, 1989, Aust. J.
Biotechnol. 3(1), 56-62). Otro método
consiste en inyectar directamente los vectores en las células
vegetales o los tejidos vegetales por microinyección (Gordon y
Ruddle, 1985, Gene 33(2), 121-136).
Ventajosamente, puede usarse el método "biolístico". Consiste
en bombardear células vegetales o tejidos vegetales con partículas
en los que están absorbidos los vectores de la invención (Bruce
et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24),
9692-9696; Klein et al., 1992, Biotechnology
10(3), 286-291; patente de EE.UU. Núm.
4.945.050). Preferiblemente, la transformación de las células
vegetales pueden llevarse a cabo usando bacterias del género
Agrobacterium, preferiblemente por infección de las células
o tejidos de dichas plantas con A. tumefaciens (Knopf, 1979,
Subcell. Biochem. 6, 143-173; Shaw et al.,
1983, Gene 23(3):315-330) o A.
rhizogenes (Bevan and Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet.
16:357-384 Tepfer y Casse-Delbart,
1987, Microbiol. Sci. 4(1), 24-28).
Preferiblemente, la transformación de células vegetales con
Agrobacterium tumefaciens se lleva a cabo según el protocolo
descrito por Ishida et al. (1996, Nat. Biotechnol.
14(6), 745-750). Aquellos expertos en la
técnica elegirán el método apropiado según la naturaleza de las
células vegetales a transformar.
Un tema de la presente invención es un método
para producir plantas tolerantes a herbicidas que inhiben EPSPS, en
particular a herbicidas de la familia fosfonometilglicina, en
particular glifosato. Este método consiste en regenerar plantas
transformadas a partir de las células vegetales transformadas
descritas anteriormente. Por este método, las plantas transformadas
según la invención contienen un casete de expresión según la
invención en su genoma y expresan una EPSPS en sus tejidos.
La presente invención comprende por lo tanto,
plantas transformadas que comprenden un casete de expresión según
la invención, partes de estas plantas, y los descendientes de estas
plantas. La expresión "parte de estas plantas" pretende
indicar cualquier órgano de estas plantas, bien aéreos o
subterráneos. Los órganos aéreos son los tallos, las hojas y las
flores. Los órganos subterráneos son principalmente las raíces, pero
también pueden ser tubérculos. El término "descendientes"
pretende indicar principalmente las semillas que contienen los
embriones derivados de la reproducción de estas plantas entre sí.
Por extensión, el término "descendientes" se aplica a todas
las semillas formadas en cada nueva generación derivadas de los
cruces entre una planta y la planta transformada por el método
según la invención.
Un tema de la presente invención es por lo
tanto, plantas transformadas en el genoma de las que se ha integrado
al menos un casete de expresión según la invención de una manera
estable.
Las plantas así transformadas son tolerantes a
herbicidas que inhiben EPSPS, en particular herbicidas de la
familia fosfonometilglicina, en particular a glifosato.
Las plantas transformadas según la invención
incluyen además las plantas transformadas derivadas del crecimiento
y/o cruce de las plantas anteriores, y además las semillas de dichas
plantas.
Por supuesto, las células y plantas
transformadas según la invención pueden comprender, además de un
casete de expresión según la invención, al menos otro casete de
expresión que contiene un polinucleótido que codifica una proteína
de interés. Entre los polinucleótidos que codifican una proteína de
interés, puede hacerse mención de polinucleótidos que codifican
otra enzima para la resistencia a un herbicida, por ejemplo, el
polinucleótido que codifica la enzima bar (White et
al., NAR 18:1062, 1990) para la tolerancia a bialafos, o el
polinucleótido que codifica la enzima HPPD (documentos WO 96/38567;
WO 99/24585; WO 99/24586) para la tolerancia a isoxazoles. También
puede hacerse mención de un polinucleótido que codifica una toxina
insecticida, por ejemplo un polinucleótido que codifica una toxina
de la bacteria Bacillus thuringiensis (por ejemplo, véase la
Solicitud de Patente Internacional WO 98/40490). También pueden
contenerse en estas plantas otros polinucleótidos para la
resistencia a enfermedades, por ejemplo un polinucleótido que
codifica la enzima oxalato oxidasa como se describe en la solicitud
de patente EP 0 531 498 o la patente de EE.UU. 5.866.778, o un
polinucleótido que codifica un péptido antibacteriano y/o
antifungicida tal como los descritos en las solicitudes de patente
WO 97/30082, WO 99/24594, WO 99/02717, WO 99/53053 y WO 99/91089.
También puede hacerse mención de polinucleótidos que codifican
características agronómicas vegetales, en particular un
polinucleótido que codifica una enzima
delta-6-desaturasa como se describe
en las patentes de EE.UU. 5.552.306 y EE.UU. 5.614.313 y las
solicitudes de patentes WO 98/46763 y WO 98/46764, o un
polinucleótido que codifica una enzima serina acetiltransferasa
(SAT) como se describe en las solicitudes de patentes WO 00/01833 y
WO 00/36127.
Los casetes de expresión adicionales pueden
integrarse por medio del vector según la invención. En este caso,
el vector comprende el casete de expresión según la invención y al
menos un casete de expresión que codifica otra proteína de
interés.
También pueden integrarse por medio de al menos
otro vector que comprende dicho casete de expresión adicional,
según las técnicas habituales definidas anteriormente.
Las plantas según la invención pueden obtenerse
además cruzando padres, uno que porta el casete de expresión según
la invención, el otro que porta otro casete de expresión que
codifica al menos otra proteína de interés.
Las plantas transformadas según la invención
pueden ser monocotiledóneas o dicotiledóneas. Preferiblemente,
estas plantas son plantas de interés agrónomo. Ventajosamente, las
plantas monocotiledóneas son trigo, maíz o arroz, ventajosamente,
las plantas dicotiledóneas son semillas oleaginosas de colza, soja,
tabaco o algodón.
La presente invención se refiere además a un
método para proteger plantas de cultivo con respecto a herbicidas
que inhiben la EPSPS, en particular a herbicidas de la familia
fosfonometilglicina, en particular glifosato, caracterizado en que
dichas plantas se transforman con un vector que comprende un casete
de expresión según la invención.
La presente invención se refiere también a un
método para tratar plantas según la invención, caracterizado en que
dichas plantas se tratan con un herbicida que inhibe EPSPS, en
particular un herbicida de la familia de fosfonometilglicina, en
particular glifosato.
La presente invención se refiere también a un
método para controlar las malas hierbas en cultivos, caracterizado
en que las plantas transformadas que comprenden un casete de
expresión según la invención están creciendo, y en que dichas
plantas se tratan con un herbicida que inhibe EPSPS, en particular
un herbicida de la familia de fosfonometilglicina, en particular
glifosato.
La presente invención se refiere también a un
método para hacer crecer plantas transformadas que comprenden un
casete de expresión según la invención, caracterizado en que
consiste en plantar semillas de dichas plantas transformadas en un
área de un campo adecuado para hacer crecer dichas plantas, en
aplicar a dicha área de dicho campo una composición agroquímica,
que no afecte sustancialmente dichas semillas transformadas o dichas
plantas transformadas, y luego cosechar las plantas crecidas cuando
hayan alcanzado la madurez deseada y, opcionalmente, separar las
semillas de las plantas cosechadas.
Según la invención, el término "composición
agroquímica" pretende indicar cualquier composición agroquímica
que comprende al menos un producto activo que tiene una de las
siguientes actividades: herbicida, fungicida, bactericida, viral o
insecticida.
Según una realización preferida del método de
crecimiento según la invención, la composición agroquímica comprende
al menos un producto activo que tiene al menos una actividad
herbicida, más preferentemente un herbicida que inhibe EPSPS, en
particular un herbicida de la familia fosfonometilglicina, en
particular glifosato.
Los diversos aspectos de la invención se
entenderán más claramente a partir de los ejemplos experimentales
posteriores.
Todos los métodos u operaciones descritos a
continuación en estos ejemplos se dan por medio de un ejemplo y
corresponden a una elección hecha a partir de diversos métodos
disponibles para lograr el mismo resultado. Esta elección no se
basa en la cualidad del resultado y, por consiguiente, se puede usar
cualquier método adecuado por el experto en la técnica para
alcanzar el mismo resultado. En particular, y a menos que se
especifique otra cosa en los ejemplos, todas las técnicas de ADN
recombinante usadas se llevan a cabo según los protocolos estándar
descritos en Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Segunda edición, Nolan C. ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, NY), en Sambrook y Russel (2001, Molecular
cloning: A laboratory manual, Tercera Edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, NY), en Ausubel et al. (1994, Current
Protocols in Molecular Biology, Current protocols, EE.UU. Volúmenes
1 y 2), y en Brown (1998, Molecular Biology LabFax, Segunda
edición, Academic Press, UK). Los materiales y métodos estándar para
biología molecular vegetal se describen en Croy R.D.D. (1993, Plant
Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publications Ltd (UK) y
Blackwell Scientific Publications (UK)). Los materiales y métodos
estándar para PCR (Reacción de la Cadena Polimerasa) se describen
también en Dieffenbach y Dveksler (1995, PCR Primer: A laboratory
manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) y en McPherson
et al. (2000, PCR - Basics: From background to bench, Primera
edición, Springer Verlag,
Alemania).
Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El plásmido pILTAB 357 proporcionado por The
Scripps Research Institute (La Jolla, CA, EE.UU.) contiene los
siguientes elementos en un vector pBIN 19 (Clontech):
promotor CsVMV (secuencia descrita por la SEQ ID
NO 4)
sitio de clonación múltiple
terminal NOS
\vskip1.000000\baselineskip
Se han definido tres regiones en la secuencia
del promotor CsVMV, llamadas CsVMV X, CsVMV Y y CsVMV Z.
CsVMV X: de la posición 10 a la posición 227
(SEQ ID NO 1, longitud 218 bp)
CsVMV Y: de la posición 228 a la posición 394
(SEQ ID NO 2, longitud 167 bp)
CsVMV Z: de la posición 397 a la posición 522
(SEQ ID NO 3, longitud 126 bp)
\vskip1.000000\baselineskip
En la secuencia original del promotor CsVMV, las
regiones X e Y son adyacentes y las regiones Y y Z están separadas
por la secuencia AT de 2 bp.
El vector de clonación pRD 254 corresponde al
vector comercial pBlueScript II SK (-) (Clontech) que ha sufrido
mutagénesis para así reemplazar el único sitio Sca I contenido en el
gen ApR con un sitio Pvu II.
Los 532 bp contenidos entre los sitios Hind III
y Xba I de pILTAB 357 se clonaron en el vector de clonación pRD
254, para así obtener el plásmido pRD 257.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se desarrolló un casete de expresión introducido
en un plásmido llamado pSF29.
El casete pSF29 comprende el promotor CsVMV como
se describe por el identificador de secuencia SEQ ID NO 4, la
secuencia que codifica el péptido de transición optimizado (OTP)
como se define en la solicitud de patente EP 0508909, la secuencia
que codifica la EPSPS de maíz que comprende las mutaciones
treonina102isoleucina y prolina106serina como se describe en la
solicitud de patente EP 0837944, y el terminal nos como se
describe en Bevan et al. (1983, Nucleic Acids Res.
11(2), 369-385).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Un plásmido lanzadera se usa para recombinarse
en el plásmido superbinario pTVK 291 (Jun et al., 1987). La
recombinación entre los sitios COS únicos presentes en los dos
plásmidos produce una única molécula circular que corresponde a la
fusión de los dos plásmidos.
La recombinación entre pSF29 y el plásmido
superbinario pTVK 291 se obtuvo por el cruce de tres padres con DH5
alfa [pSF29], C2110 [pTVK 291] y la cepa JC2073 (cepa "de
ayuda"). El plásmido resultante se llama pSFK29. La cepa
obtenida, C2110 [pSFK29], se seleccionó en medio LB que contenía los
3 antibióticos gentamicina, canamicina y ácido nalidíxico. El ácido
nalidíxico permite la selección de C2110 frente a DH5 alfa o JC2073;
ya que C2110 contiene una resistencia cromosómica al ácido
nalidíxico que no puede transferirse a las otras cepas durante el
cruce. La combinación de gentamicina y canamicina hace posible
seleccionar la bacteria que contiene pSF29 y pTVK 291. Además, el
pSF29 no puede replicar en C2110, a menos que se haya recombinado
con pTVK 291, ya que C2110 contiene el origen de replicación RK2
que lleva pTVK 291, aunque no el origen de replicación pBR 322 que
lleva pSF29.
El plásmido recombinante se transfirió entonces
en la cepa de Agrobacterium LBA 4404 por medio de un segundo
cruce de tres padres. La cepa resultante, LBA 4404 [pSFK29], se
seleccionó en medio AB (selectivo para Agrobacterium) que
contenía canamicina y gentamicina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
La transformación del maíz Zea mays por
Agrobacterium se lleva a cabo según el método descrito en
Ishida, Y. et al., (1996, Nature Biotechnology, 14,
745-750). La cepa desarmada de Agrobacterium
tumefaciens descrita en el Ejemplo 3 se
co-cultiva con embriones de maíz no maduros. Una
selección con glifosato 0,88 mM se aplica a los embriones. Los
sucesos de transformación obtenidos a partir de los cálices
resistentes se cruzan de vuelta después y sus descendientes se
prueban para la tolerancia al glifosato.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se sembraron 20 semillas por suceso obtenido en
un invernadero en pequeñas macetas en un compost rico, y se llevó a
cabo un tratamiento post-emergencia en la etapa de 3
a 4 hojas con una dosis de glifosato correspondiente a 4 kg/ha (es
decir, 4 kg de material activo por 500 1) usando una torre de
tratamiento calibrada. Los sucesos que sobreviven al tratamiento se
cuentan entonces. Los resultados muestran que el 90% de los sucesos
de transformación que contienen el casete de expresión
VMV-EPSPS tienen plantas capaces de tolerar una
dosis correspondiente a 4 kg/ha de glifosato. Una disparidad en el
número de plantas tolerantes para cada suceso ensayado se debe al
hecho de que estos sucesos son heterocigotos para el atributo (el
casete de expresión CsVMV-EPSPS) y tienen uno o más
locus de integración, y que algunos sucesos de integración, por
virtud de la posición de inserción del casete, proporcionan mejor
expresión de la EPSPS, y por lo tanto mejor tolerancia al
glifosato.
<110> Bayer CropScience S.A.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Casete de expresión que codifica una
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) y plantas tolerantes al herbicida que lo
contienen
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BCS 02-4012
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 219
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de mosaico de vena de yuca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de mosaico de vena de yuca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 127
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de mosaico de vena de yuca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 538
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de mosaico de vena de yuca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220> Promotor doble
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CsVMV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
Claims (15)
1. Un casete de expresión que comprende, en la
dirección de transcripción, funcionalmente unido a otro, una
secuencia reguladora del promotor que es funcional en células
vegetales o plantas, una secuencia de ácido nucleico que codifica
una
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) y una secuencia reguladora terminal que es
funcional en células vegetales o plantas, caracterizado en
que la secuencia reguladora del promotor comprende, en la dirección
de transcripción, las secuencias de ácido nucleico X, Y, Y y Z,
según el cual x se representa por la SEQ ID NO: 1, Y se representa
por la SEQ ID NO:2, y Z se representa por la SEQ ID NO: 3.
2. El casete de expresión según la
reivindicación 1, caracterizado en que la secuencia
reguladora del promotor se representa por la SEQ ID NO 5.
3. El casete de expresión según una de las
reivindicaciones 1 o 2, caracterizado en que la secuencia de
ácido nucleico que codifica una EPSPS es una secuencia que codifica
una EPSPS que ha sido mutada a los aminoácidos que corresponden a
la treonina en la posición 102 y la prolina en la posición 106,
siendo dichas posiciones relativas con respecto a la secuencia
EPSPS de maíz.
4. El casete de expresión según la
reivindicación 3, caracterizado en que la secuencia de ácido
nucleico que codifica una EPSPS es la secuencia que codifica una
EPSPS mutada que comprende una isoleucina en la posición 102 y una
serina en la posición 106, siendo dichas posiciones relativas con
respecto a la secuencia EPSPS de maíz.
5. El casete de expresión según la
reivindicación 4, caracterizado en que la secuencia de ácido
nucleico que codifica una EPSPS mutada es la secuencia que codifica
una EPSPS mutada de maíz que comprende una isoleucina en la
posición 102 y una serina en la posición 106.
6. Los casetes según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizados en que además
comprende un péptido de transición doble que comprende, en la
dirección de transcripción, una secuencia que codifica un péptido
de transición de un gen vegetal que codifica una enzima que está
situada en plástidos, una parte de la secuencia de la parte
N-terminal madura de un gen vegetal que codifica una
enzima que está situada en plástidos, y después una secuencia que
codifica un segundo péptido de transición de un gen vegetal que
codifica una enzima que está situada en plástidos.
7. Un vector de clonado y/o expresión para
transformar células vegetales o plantas, caracterizado en que
comprende al menos un casete de expresión según una de las
reivindicaciones 1 a 6.
8. Una célula vegetal transformada,
caracterizada en que comprende un casete de expresión según
una de las reivindicaciones 1 a 6.
9. Una planta transformada, caracterizada
en que comprende un casete de expresión según una de las
reivindicaciones 1 a 6.
10. Una semilla de planta transformada según la
reivindicación 9, caracterizada en que comprende un casete
de expresión según la reivindicación 6.
11. Un método para tratar plantas según la
reivindicación 9; caracterizado en que dichas plantas se
tratan con herbicida que inhibe la EPSPS.
12. El método según la reivindicación 11,
caracterizado en que dicho herbicida que inhibe la EPSPS es
glifosato.
13. Un método para controlar las malas hierbas
en los cultivos, caracterizado en que las plantas
transformadas según la reivindicación 9 se hacen crecer, y en que
dichas plantas se tratan con un herbicida que inhibe la EPSPS.
14. El método según la reivindicación 13,
caracterizado en que dicho herbicida que inhibe la EPSPS es
glifosato.
15. Un método para hacer crecer plantas
transformadas según la reivindicación 9, caracterizado en que
consiste en plantar semillas de dichas plantas transformadas en un
área de campo adecuado para hacer crecer dichas plantas, en aplicar
a dicha área de dicho campo una composición agroquímica, que no
afecte sustancialmente dichas semillas transformadas o dichas
plantas transformadas, y luego cosechar las plantas crecidas cuando
alcancen la madurez deseada y, opcionalmente, separar las semillas
de las plantas cosechadas.
Applications Claiming Priority (2)
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