ES2264224T3 - Promotor h3c4 de maiz asociado al primer intron de la actina de arroz, gen quimerico que lo contiene y planta transformada. - Google Patents
Promotor h3c4 de maiz asociado al primer intron de la actina de arroz, gen quimerico que lo contiene y planta transformada.Info
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Abstract
Una secuencia de ADN, elemento de regulación en 5'' que permite la expresión de un gen heterólogo en una célula vegetal de una planta monocotiledónea, caracterizada por contener en el sentido de la transcripción una primera secuencia de ADN, fragmento funcional de la secuencia del promotor H3C4 del maíz, y una segunda secuencia de ADN, fragmento funcional de la secuencia del primer intrón de la actina del arroz.
Description
Promotor H3C4 de maíz asociado al primer intrón
de la actina de arroz, gen quimérico que lo contiene y planta
transformada.
La presente invención se refiere a una nueva
secuencia de regulación en 5' que permite la expresión en las
plantas monocotiledóneas de una secuencia heteróloga a dicha
secuencia de regulación que codifica una proteína de interés. La
presente invención se refiere igualmente a un gen quimérico que
contiene dicha secuencia de regulación, una secuencia heteróloga que
codifica una proteína de interés y una secuencia de regulación en 3'
que permite la expresión de la proteína de interés en una célula
vegetal de una planta monocotiledónea, así como una planta
monocotiledónea transformada que contiene dicho gen quimérico y los
medios necesarios para la transformación de las células vegetales y
de las plantas.
Se conocen diferentes promotores que permiten la
expresión de secuencias que codifican proteínas de interés en las
plantas, están descritos en la bibliografía científica y han
permitido ya el desarrollo a escala comercial de plantas modificadas
por ingeniería genética. Se trata de secuencias promotoras de genes
que se expresan de modo natural en las plantas, en particular
promotores de origen bacteriano, viral o vegetal, tales como, por
ejemplo, el de un gen de la pequeña subunidad de
ribulosa-bifosfato carboxilasa/oxigenasa (documento
US 4.962.028) o de un gen de un virus vegetal tal como, por
ejemplo, el del mosaico de la coliflor (documento US 5.352.605).
Promotores que permiten la expresión de genes heterólogos en las
plantas están especialmente descritos en las patentes y solicitudes
de patentes siguientes: US 5.086.169, EP 0 353 908 US 5.139.954, US
5.378.619, US 5.563.328, US 5.589.583, US 5.633.363, US 5.633.439,
US 5.633.440, US 5.633.447, US 5.635.618, US 5.639.948 y US
5.639.952.
No obstante, algunos de estos promotores y más
particularmente los promotores de origen vegetal, no son funcionales
en las monocotiledóneas.
Se conocen, por ejemplo, promotores de histona
de Arabidopsis sp. descritos en la solicitud de patente EP 0
507 698, particularmente eficaces para permitir la expresión de un
gen heterólogo en plantas dicotiledóneas tales como el tabaco, la
colza o la soja, que no son funcionales en los monocotiledóneas como
el maíz.
El promotor de la actina del arroz es un
promotor conocido por permitir la expresión de genes heterólogos en
las plantas monocotiledóneas (documento US 5.641.876). Sin embargo,
subsiste el problema de identificar nuevas secuencias de regulación
en 5', funcionales para la expresión de secuencias heterólogas en
las plantas monocotiledóneas.
La presente invención se refiere a una nueva
secuencia de ADN, elemento de regulación en 5' que permite la
expresión de un gen heterólogo en una célula vegetal de planta
monocotiledónea, conteniendo dicha secuencia de ADN en el sentido de
la transcripción, una primera secuencia de ADN, fragmento funcional
de la secuencia del promotor H3C4 del maíz y una segunda secuencia
de ADN, fragmento funcional de la secuencia del primer intrón de la
actina del arroz.
La secuencia del promotor H3C4 del maíz ha sido
descrita especialmente por Brignon et al., (Plant. Mol.
Biol., 22: 1007-1015, 1993). Se trata del fragmento
AluI del promotor H3C4 del maíz, de aproximadamente 1 kb,
correspondiente a las bases -7 a -1029 relativas a la ATG de la
secuencia que codifica la histona H3C4 del maíz.
La secuencia del primer intrón de la actina del
arroz está descrita especialmente en la patente de EE.UU.
5.641.876.
Por fragmento funcional se entiende, según la
invención, cualquier secuencia de ADN que proviene de la secuencia
del promotor H3C4 del maíz o de la secuencia del primer intrón de la
actina del arroz, que reproduce la función de la secuencia de donde
es originaria.
Según un modo de realización de la invención, el
fragmento funcional de la secuencia del promotor H3C4 del maíz
comprende la secuencia de ADN descrita por el identificador de
secuencia nº 1 (SEQ ID NO:1) o una secuencia homóloga de dicha
secuencia. De modo preferente, el fragmento funcional de la
secuencia del promotor H3C4 del maíz consiste en la secuencia de ADN
descrita por el identificador de secuencia nº 1.
Según un modo de realización de la invención, el
fragmento funcional del primer intrón de la actina del arroz
contiene la secuencia de ADN descrita por el identificador de
secuencia nº 2 (SEQ ID NO:2) o una secuencia homóloga de dicha
secuencia. De modo preferente, el fragmento funcional del primer
intrón de la actina del arroz consiste en la secuencia de ADN
descrita por el identificador de secuencia nº 2.
La secuencia de ADN, elemento de regulación en
5' según la invención, puede contener además entre la primera y la
segunda secuencia de ADN, fragmentos de ADN neutros, necesarios en
general para la construcción de la secuencia según la invención. Se
trata de fragmentos de ADN que contienen hasta 30 pares de bases,
preferentemente hasta 20 pares de bases. Por fragmentos de ADN
neutros, se entiende según la invención, fragmentos de ADN que no
llegan a modificar de modo sustancial las funciones respectivas de
las primera y segunda secuencias de ADN de la secuencia según la
invención.
Según un modo preferente de realización de la
invención, la secuencia de ADN según la invención contiene la
secuencia de ADN representada por el identificador de secuencia nº 3
(SEQ ID NO:3) o una secuencia homóloga de dicha secuencia. Más
preferentemente, la secuencia según la invención consiste en la
secuencia de ADN representada por el identificador de secuencia nº
3.
Por "homólogo" se entiende según la
invención, una secuencia de ADN que presenta una o más
modificaciones de secuencia con respecto a la secuencia de ADN de
referencia descrita por los identificadores de secuencia nº 1, 2 ó
3, y que reproducen la función de las secuencias citadas. Estas
modificaciones pueden ser obtenidas según las técnicas habituales de
mutación, o también escogiendo los oligonucleótidos sintéticos que
pueden ser empleados en la preparación de dicha secuencia por
hibridación. De modo ventajoso, el grado de homología será de al
menos 70% con respecto a la secuencia de referencia, de preferencia
al menos 80% y, más preferentemente al menos 90%.
La presente invención se refiere igualmente a un
gen quimérico (o casete de expresión) que comprende una secuencia
codificadora así como elementos de regulación en posición 5' y 3'
heterológos que pueden funcionar en las células vegetales de plantas
monocotiledóneas, en la que los elementos de regulación en 5'
comprenden la secuencia de ADN según la invención definida
anteriormente.
Por "célula vegetal", se entiende según la
invención, cualquier célula que proviene de una planta
monocotiledónea y que puede constituir tejidos indiferenciados tales
como callos, tejidos diferenciados tales como embriones, partes de
plantas monocotiledóneas, plantas monocotiledóneas o semillas.
Se entiende por "planta monocotiledónea"
según la invención, todo organismo multicelular diferenciado capaz
de fotosíntesis, y cuya semilla tiene un embrión provisto de un solo
cotiledón, más particularmente plantas de cultivo destinadas o no a
la alimentación animal o humana, como por ejemplo el trigo, la
cebada, la avena, el arroz, el maíz, el sorgo, la caña de azúcar,
etc.
Según la invención, se puede utilizar
igualmente, en asociación con la secuencia de regulación promotora
según la invención, otras secuencias de regulación, que están
situadas entre el promotor y la secuencia codificadora, codificando
tales secuencias péptidos de tránsito, o bien simples, o bien
dobles, y en este caso separados opcionalmente por una secuencia
intermedia, es decir conteniendo, en el sentido de la transcripción,
una secuencia que codifica un péptido de tránsito de un gen vegetal
que codifica una enzima en localización plastidial, una parte de
secuencia de la parte madura del extremo N-terminal
de un gen vegetal que codifica una enzima en localización
plastidial, después una secuencia que codifica un segundo péptido de
tránsito de un gen vegetal que codifica una enzima en localización
plastidial constituida por una parte de secuencia de la parte madura
del extremo N-terminal de un gen vegetal que
codifica una enzima en localización plastidial, tal como se ha
descrito en la solicitud de patente EP 0 508 909. Como péptido de
tránsito se puede citar igualmente, el péptido señal del gen
PR-1a del tabaco descrito por Cornelissen et
al.
Como secuencia de regulación terminadora o de
poliadenilación, se puede utilizar cualquier secuencia
correspondiente de origen bacteriano, como por ejemplo el terminador
nos de Agrobacterium tumefaciens, o también de origen
vegetal, tal como, por ejemplo, un terminador de histona tal como se
describe en la solicitud de patente EP 0 633 317.
La secuencia codificadora del gen quimérico
según la invención, puede comprender cualquier secuencia que
codifique una proteína de interés que se desee expresar en una
célula vegetal o una planta monocotiledónea.
Puede tratarse de un gen que codifique un
marcador de selección, como de un gen que confiera a la planta
monocotiledónea transformada nuevas propiedades agronómicas o de un
gen de mejora de la calidad agronómica de la planta monocotiledónea
transformada.
Entre los genes que codifican marcadores de
selección, se pueden citar los genes de resistencia a los
antibióticos, los genes de tolerancia a los herbicidas (bialafos,
glifosato o isoxazoles), genes que codifican enzimas fácilmente
identificables tales como la enzima GUS, genes que codifican
pigmentos o enzimas que regulan la producción de pigmentos en las
células transformadas. Tales genes marcadores de selección están
descritos especialmente en la solicitudes de patente WO 91/02071 y
WO 95/06128.
Entre los genes que confieren nuevas propiedades
agronómicas a las plantas monocotiledóneas transformadas, se pueden
citar los genes que confieren tolerancia a ciertos herbicidas, los
que confieren tolerancia a ciertos insectos, los que confieren
tolerancia a ciertas enfermedades, etc. Tales genes están descritos
especialmente en las solicitudes de patente WO 91/02071 y WO
95/06128.
Como secuencia de regulación terminadora o de
poliadenilación, se puede utilizar cualquier secuencia
correspondiente de origen bacteriano, tal como, por ejemplo, el
terminador nos de Agrobacterium tumefaciens, o también de
origen vegetal, tal como, por ejemplo, un terminador de histona tal
como se describe en la solicitud de patente EP 0 633 317.
La presente invención es particularmente
apropiada para la expresión de genes que confieren tolerancia a
ciertos herbicidas a las células vegetales y a las plantas monocoti
ledóneas transformadas. Entre los genes que confieren tolerancia a
ciertos herbicidas, se puede citar el gen Bar que confiere
tolerancia al bialafos, el gen que codifica una
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) apropiada que confiere resistencia a los herbicidas
que tienen la EPSPS como diana tales como el glifosato y sus sales
(documentos US 4.535.060, US 4.769.061, US 5.094.945, US 4.940.835,
US 5.188.642, US 4.971.908, US 5.145.783, US 5.310.667, US
5.312.910, US 5.627.061, US 5.633.435, FR 2 736 926), el gen que
codifica la glifosato-óxidorreductasa (documento US 5.463.175), o
incluso un gen que codifica una hidroxi-fenil
piruvato dioxigenasa (HPPD) que confiere tolerancia a los herbicidas
que tienen por diana la HPPD, tales como los isoxazoles, en especial
el isoxafutol (documentos FR 95 06800, FR 95 13570), los
dicetonitrilos (documentos EP 496 630, EP 496 631) o las tricetonas,
en especial la sulcotriona (documentos EP 625 505, EP 625 508, US
5.506.195). Tales genes que codifican una HPPD, que confieren
tolerancia a los herbicidas que tienen por diana la HPPD, están
descritos en la solicitud de patente WO 96/38567 y en la solicitud
de patente sin publicar FR 97 14264, depositada el 7 de Noviembre de
1997.
Entre los genes que codifican una EPSPS
apropiada que confieren resistencia a los herbicidas que tienen como
diana la EPSPS, se puede citar más particularmente el gen que
codifica una EPSPS vegetal, en particular del maíz, que presenta dos
mutaciones 102 y 106, descrito en la solicitud de patente FR 2
736.926, denominado en lo sucesivo EPSPS doble mutante, o también el
gen que codifica una EPSPS aislada de Agrobacterium descrito
por las secuencias ID 2 e ID 3 de la patente de EE.UU. 5.633.435,
denominado más adelante CP4.
Entre los genes que codifican una HPPD que
confiere tolerancia a los herbicidas que tienen por diana la HPPD,
se pueden citar más particularmente la HPPD de Pseudomonas y
la de Arabidopsis descritas en la solicitud de patente WO
96/38567.
En el caso de genes que codifican EPSPS o HPPD,
y más particularmente para los genes anteriores, la secuencia que
codifica estas enzimas está precedida ventajosamente por una
secuencia que codifica un péptido de tránsito, en particular el
péptido de tránsito denominado péptido de tránsito optimizado
descrito en las patentes de EE.UU. 5.510.471 ó 5.633.448.
Según un modo preferente de realización de la
invención, el gen quimérico según la invención contiene en el
sentido de la transcripción, una secuencia de regulación en 5' según
la invención tal como se ha definido anteriormente, unida de manera
funcional a una secuencia que codifica una proteína de fusión
péptido de tránsito/proteína de interés, unido de modo funcional a
una secuencia de regulación en 3', estando definidos los diferentes
elementos del gen quimérico ante riormente, siendo la proteína de
interés, de preferencia una enzima que confiere tolerancia a ciertos
herbicidas, más preferentemente las enzimas de tipo EPSPS o HPPD
definidos anteriormente.
Las secuencias que codifican proteínas de fusión
péptido de tránsito/EPSPS, y más particularmente OTP/EPSPS doble
mutante, están descritas especialmente en las patentes de EE.UU.
4.940.835, 5.633.448 y FR 2 736 926.
Para la proteína de fusión OTP/CP4, el experto
en la materia sabrá construir el gen correspondiente tomando la
secuencia que codifica el CP4 descrito en la patente de EE.UU.
5.633.435 y siguiendo el modo operatorio descrito en las patentes de
EE.UU. 4.940.835, 5.633.448 y FR 2 736 926, o en los ejemplos que
figuran más adelante. La presente invención se refiere igualmente a
un gen quimérico que comprende en el sentido de la transcripción,
una secuencia de regulación en 5' apropiada para asegurar la
expresión de un gen heterólogo en una célula vegetal, unida de modo
funcional a una secuencia que codifica una proteína de fusión
OTP/CP4, unida de modo funcional a una secuencia de regulación en
3'. Los elementos de regulación en 5' comprenden no solamente los
elementos de regulación en 5' según la invención que se han definido
anteriormente, sino igualmente todos los elementos de regulación
apropiados para permitir la expresión de genes heterólogos en las
células vegetales de plantas monocotiledóneas conocidos por los
expertos en la materia o que han de venir, y en especial los
descritos anteriormente.
Las secuencias que codifican proteínas de fusión
péptido de tránsito/HPPD están descritas en las solicitud de patente
WO 96/38567.
La presente invención se refiere igualmente a un
vector de clonación o de expresión para la transformación de una
célula vegetal o de una planta monocotiledónea, conteniendo las
células vegetales y las plantas transformadas al menos un gen
quimérico tal como se ha definido anteriormente, El vector según la
invención comprende, además del gen quimérico anterior, por lo menos
un origen de replicación. Este vector puede estar constituido por un
plásmido, un cósmido, un bacteriófago o un virus, transformados por
la introducción del gen quimérico según la invención. Tales
vectores de transformación de células vegetales y de plantas
monocotiledóneas son bien conocidos de los expertos en la materia y
están profusamente descritos en la bibliografía científica. De modo
preferente, el vector de transformación de células vegetales o de
plantas, según la invención, es un plásmido.
La invención tiene todavía por objeto un
procedimiento de transformación de células vegetales por integración
de al menos un fragmento de ácido nucleico o un gen quimérico tales
como los definidos anteriormente, transformación que puede ser
obtenida por cualquier medio conocido apropiado con el vector según
la invención.
Una serie de métodos consiste en bombardear
células o tejidos celulares con partículas a las que están fijadas
las secuencias de ADN. Otra serie de métodos consiste en utilizar
como medio de transferencia a la planta un gen quimérico insertado
en un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens o Ri de
Agrobacterium rhizogenes. Otros métodos pueden
ser utilizados tales como la microinyección o la electroporación, o incluso la precipitación directa por medio de PEG.
ser utilizados tales como la microinyección o la electroporación, o incluso la precipitación directa por medio de PEG.
El experto en la materia hará la elección del
método apropiado en función de la naturaleza de la célula vegetal o
de la planta.
La presente invención tiene aún por objeto las
células vegetales o plantas, transformadas, y que contienen al menos
un gen quimérico según la invención que se ha definido
anteriormente.
La presente invención tiene todavía por objeto
las plantas que contienen células transformadas, en particular las
plantas regeneradas a partir de las células transformadas. La
regeneración se obtiene por cualquier procedimiento apropiado que
depende de la naturaleza de la especie.
Para los procedimientos de transformación de
células vegetales y de regeneración de las plantas monocotiledóneas,
se hace mención en especial de Gordon-Kamm, W.J.
et al., (Transformation of Maize Cells and Regeneration of
Fertile Transgenic Plants, The Plant Cell. vol. 2,
603-618, Julio 1990) y las patentes y las
solicitudes de patentes siguientes: US 5.177.010, US 5.187.073, EP
267.159, EP 604.662, EP 672.752, US 4.945.050, US 5.036.006, US
5.100.792, US 5.371.014, US 5.478.744, US 5.484.956, US 5.508.468,
US 5.538.877, US 5.554.798, US 5.489.520, US 5.510.318, US
5.204.253, US 5.405.765, EP 442.174, EP 486.233, EP 486.234, EP
539.563, EP 674.725, WO 91/02071 y WO 95/06128.
La presente invención se refiere igualmente a
las plantas transformadas que provienen del cultivo y/o del
crecimiento de las plantas regeneradas anteriores, así como las
semillas de plantas transformadas.
En el caso de que el gen quimérico según la
invención contenga una secuencia que codifique una enzima que
confiere tolerancia a un herbicida particular, la presente invención
se refiere igualmente a un procedimiento de control de malas hierbas
en una superficie de un campo que comprende semillas o plantas
transformadas con dicho gen quimérico según la invención,
procedimiento que consiste en aplicar a dicha superficie del campo
una dosis de dicho herbicida particular, tóxico para dichas malas
hierbas, sin afectar no obstante de modo sustancial a las semillas o
a las plantas transformadas con dicho gen quimérico según la
invención que contiene dicha secuencia que codifica una enzima que
confiere tolerancia a dicho herbicida particular.
La presente invención se refiere igualmente a un
procedimiento de cultivo de las plantas transformadas según la
invención con un gen quimérico según la invención, que contiene una
secuencia que codifica una enzima que confiere tolerancia a un
herbicida particular definido anteriormente, procedimiento que
consiste en plantar las semillas de dichas plantas transformadas en
una superficie de un campo apropiado para el cultivo de dichas
plantas, en aplicar sobre dicha superficie de dicho campo una dosis
tóxica para las malas hierbas de dicho herbicida particular en caso
de la presencia de malas hierbas, sin afectar de modo sustancial a
dichas semillas o dichas plantas transformadas, después recolectar
las plantas cultivadas cuando alcanzan la madurez deseada y
opcionalmente separar las semillas de las plantas recolectadas.
En los dos procedimientos anteriores, la
aplicación del herbicida particular puede llevarse a cabo según la
invención, tanto antes de la siembra, antes del brote o después del
brote del cultivo.
De modo ventajoso, la enzima de tolerancia a un
herbicida es una EPSPS apropiada, y en este caso el herbicida es el
glifosato o sus sales, o la enzima es una HPPD y el herbicida se
escoge entre los isoxazoles, en especial el isoxafutol, los
dicetonitrilos o las tricetonas, en especial la sulcotriona.
Los ejemplos que figuran seguidamente ilustran
la invención sin pretender limitar su alcance.
Los plásmidos que siguen se preparan para crear
una casete de expresión que comprende un promotor histona H3C4 del
maíz asociado con la región 5' sin traducir del primer intrón del
gen de actina del arroz (ActI) descrito por McElroy D. et
al., (Plant Molecular Biology, 15: 257-268
(1990)) que conducen la expresión del gen OTP-HPPD
de Pseudomonas fluorescens.
El plásmido
pRPA-RD-195 es un derivado del
plásmido pUC-19 que contiene un sitio de clonación
múltiple modificado. Los oligonucleótidos complementarios 1 y 2 que
siguen son hibridados a 65ºC durante 5 minutos, seguido de un
enfriamiento lento hasta 30ºC durante 30 minutos:
- Óligo 4: 5' AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGG GGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3'
- Óligo 5: 5' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGT CGACTC TAGAGG 3'
Los oligonucleótidos hibridados se hacen de
doble hebra empleando el fragmento de Klenow de la DNA polimerasa 1
de E.coli para extender los extremos 3' de cada óligo
empleando las condiciones estándar recomendadas por el fabricante
(New England Biolabs). El óligo de doble hebra obtenido se une a
continuación en el plásmido pUC-19 previamente
sometido a digestión con las enzimas de restricción EcoRI e
HindIII y hechos de bordes romos empleando el fragmento de
Klenow de la DNA polimerasa 1 de E.coli. Se obtiene de este
modo un vector de clonación que contiene un sitio de clonación
múltiple para facilitar la introducción de casetes de expresión en
un vector plasmídico de Agrobacterium tumefaciens (figura
1).
Inserción de la secuencia "promotor
H4A748-OTP-gen de EPSPS doble
mutante" de pRPA-RD-159 en el
plásmido pRPA-RD-195.
El plásmido
pRPA-RD-195 es sometido a digestión
con la enzima de restricción SacI y desfosforilado con la
fosfatasa alcalina del intestino de ternera (New England Biolabs).
El plásmido pRPA-RD-173 (descrito en
la patente FR 2 736 926) es digerido con la enzima de restricción
SacI y el fragmento de ADN que contiene el gen de EPSPS es
purificado y unido al plásmido
pRPA-RD-195 preparado anteriormente.
El fragmento de ADN obtenido contiene varios sitios de restricción
únicos que enmarcan el gen de EPSPS doble mutante.
Creación de un casete de expresión
OTP-HPPD para usar en las monocotiledóneas. El
plásmido pRP-P contiene el péptido de tránsito
optimizado (OTP) unido a la HPPD de Pseudomonas fluorescens
seguido del sitio de poliadenilación de la
nopalina-sintasa tal como figura descrito en la
solicitud de patente WO 96/38567. Los elementos del plásmido
pRP-P son los siguientes:
- el péptido de tránsito optimizado (OTP)
descrito en las patentes de EE.UU. 5.510.471 y 5.633.448; estando
constituido este OTP por 171 pb del péptido de tránsito de la
pequeña subunidad de la
Ribulosa-1,5-bifosfato-carboxilasa/oxigenasa
de Helianthus annuus (Waksman G. et al., 1987.
Nucleics acids Res. 15: 7181) seguidos de las 66 pb de la parte
madura de la pequeña subunidad de la
Ribulosa-1,5-bifosfato-carboxilasa/oxigenasa
de Zea mays (Lebrun et al. 1987. Nucleics acids Res.
15: 4360) seguidas ellas mismas por los 150 pb del péptido de
tránsito de la pequeña subunidad de la
Ribulosa-1,5-bifosfato-carboxilasa/oxigenasa
de Zea mays (Lebrun et al., 1987. Nucleics acids Res.
15:4360); el conjunto tiene, por tanto, 387 pb.
- la región codificadora de la HPPD de
Pseudominas fluorescens descrita en la solicitud de patente
WO 96/38567; y
- el terminador del gen de la
nopalina-sintasa (nos) (zona de poliadenilación del
gen nos aislado de pTi 37,250 pb; Bevan M. et al.,
Nucleics Acids Res. 11:369-385).
El plásmido pRP-P es sometido a
digestión con la enzima de restricción BstEII, tratado con el
fragmento de Klenow de la DNA polimerasa I de E.coli para
hacer el fragmento con bordes romos, y seguido por una digestión con
la enzima de restricción NcoI. El fragmento de ADN obtenido
que contiene la región codificadora OTP-HPPD de
aproximadamente 1,5 kb es purificado a continuación. El plásmido
pRPA-RD-2010 obtenido anteriormente
es sometido a digestión con la enzima de restricción BlpI,
tratado con el fragmento de Klenow de la DNA polimerasa I de E.
coli para obtener un fragmento con bordes romos, y después
sometido a digestión con la enzima de restricción NcoI. El
fragmento de ADN obtenido que contiene las secuencias del vector
plasmídico, el promotor H3C4 asociado con la región 5' sin traducir
y el primer intrón del gen de actina del arroz, es purificado y el
sitio de poliadenilación NOS es purificado. Los dos fragmentos de
ADN purificados son unidos para crear una casete de expresión
OTP-HPPD que comprende el promotor de histona H3C4
del maíz (Brignon et al.) asociado con la región sin traducir
en 5' y el primer intrón del gen de actina del arroz (ActI)
(Act1 5' UTR + intrón 1) para controlar la expresión de la región
codificadora OTP-HPPD que incorpora el sitio de
poliadenilación NOS (NOS polyA) (Figura 2).
Creación de una casete de expresión
OTP-EPSPS doble mutante para uso en las
monocotiledóneas.
El plásmido
pRPA-RD-109 contiene el gen de
\beta-glucuronidasa (GUS) de E. coli
controlado por el promotor de histona H3C4 del maíz (Brignon et
al.) asociado con la región sin traducir en 5' y el primer
intrón del gen de actina del arroz (ActI) descrito por
McElroy D. et al. (Plant Molecular Biology 15:
257-268, 1990). Un diagrama de este plásmido está
representado en la figura 3. El plásmido
pRPA-RD-109 se somete a digestión
con las enzimas de restricción NcoI y EcoRI, y el
fragmento grande de ADN (aproximadamente 5 kb) que contiene la
secuencia vector, el gen GUS y el sitio de poliadenilación NOS, es
purificado. El plásmido pRPA-RD-2010
es digerido con las enzimas de restricción NcoI y
EcoRI, y el fragmento de ADN (aproximadamente 1,6 kb) que
contiene el promotor H3C4 asociado con la región sin traducir en 5'
y el primer intrón del gen de actina del arroz (ActI), es
purificado. Los dos fragmentos de ADN purificados son unidos para
crear una casete de expresión OTP-EPSPS doble
mutante que contiene el promotor de histona H3C4 del maíz (Brignon
et al.) asociado con la región sin traducir en 5' y el primer
intrón del gen de actina del arroz (ActI) para controlar la
expresión de la región codificadora OTP-EPSPS doble
mutante que incorpora el sitio de poliadenilación NOS.
La
fosfinotricina-acetil-transferasa
(PAT) codificada por el gen bar es una enzima que inactiva un
herbicida, la fosfinotricina (PPT). La PPT inhibe la síntesis de la
glutamina y provoca una acumulación rápida de amoniaco en las
células conduciendo a su muerte (Tachibana et al. 1986).
El plásmido utilizado para introducir la
tolerancia a la fosfinotricina como agente de selección se obtiene
por inserción del gen quimérico pDM 302 en el vector pSP72 de 2462
pb comercializado por Promega Corp. (Genbank/DDBJ número de catálogo
de la base de datos X65332) y que contiene el gen de resistencia a
la ampicilina.
El plásmido pDM 302 de 4700 pb ha sido descrito
por Cao, J., et al., Plant Cell Report
11:586-591 (1992).
Los diferentes elementos del gen quimérico
contenido en este plásmido son:
- el promotor del gen actina del arroz descrito
por McElroy D. et al., Plant Molecular Biology 15:
257-268 (1990) constituido por 840 pb;
- el primer exón del gen actina del arroz
constituido por 80 pb;
- el primer intrón del gen actina del arroz
constituido por 450 pb;
- la región codificadora del gen bar de
600 pb escindida del plásmido pIJ41404 descrito por White J. et
al., Nuc. Acids res. 18:1862 (1990);
- el terminador del gen de la
nopalina-sintasa (nos) (zona de poliadenilación del
gen nos aislado de pTi 37,250 pb (Bevan M. et al.
Nucleics Acids Res. 11:369-385).
\vskip1.000000\baselineskip
La técnica del bombardeo de partículas se
utiliza para introducir la construcción genética. Los plásmidos son
purificados sobre una columna Qiagen y coprecipitados sobre
partículas de wolframio M10 según el procedimiento Klein (Nature
327: 70-73, 1987).
Una mezcla de partículas metálicas, del plásmido
pRPA-RD-1002 y del plásmido del
ejemplo 3 descritos anteriormente, se bombardeada seguidamente sobre
células embriógenas del maíz según el protocolo descrito por
Gordon-Kamm W.J et al. (Transformation of
Maize Cells and Regeneration of Fertile Transgenic Plants, The
Plant Cell, vol. 2, 603-618, Julio 1990).
\vskip1.000000\baselineskip
Los callos bombardeados son seleccionados sobre
glufosinato hasta la aparición de sectores verdes. Los callos
positivos resistentes al glufosinato son convertidos entonces en
embriones somáticos, y después puestos en condiciones que favorecen
la germinación según las condiciones operatorias descritas por
Gordon-Kamm, W.J. et al., (Transformation
of Maize Cells and Regeneration of Fertile Transgenic Plants,
The Plant Cell, vol. 2, 603-618, Julio 1990). Las
plantas jóvenes son hechas pasar a invernadero para la producción de
semillas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las plantas transformadas obtenidas
anteriormente son supuestamente en parte transgénicas, conteniendo
un gen heterólogo que codifica OTP/HPPD que confiere tolerancia a
los isoxazoles tales como el isoxafutol. Estas plantas transformadas
han emitido polen, que ha fecundado óvulos de un maíz salvaje, no
transgénico. Las semillas obtenidas son seleccionadas sobre arena
después de tratamiento con isoxaflutol.
El protocolo de selección es el siguiente:
800 ml de arena de Fontainebleau se colocan en
una barquilla de 15 x 20 cm de lados. Estas barquillas se riegan
después con agua y se mantienen hidratadas por aporte de una
solución nutritiva constituida por 5 ml de Quinoligo (La
Quionoléine) por litro de agua. Veinte granos de maíz se colocan en
la barquillas, que luego se tratan con isoxaflutol, por
pulverización, a razón de 100 g de materia activa por hectárea (300
\mug de materia activa por barquilla). Seguidamente las barquillas
se colocan en cultivo en invernadero. La fitotoxicidad se determina
14 días después de realizar la plantación. Según las condiciones
anteriores, las plantas sin transformar presentan el 100% de
fitotoxicidad mientras que las plantas transformadas no presentan
fitotoxicidad alguna.
Se realizó un estudio comparativo con 20 linajes
de maíz transformado según la invención y 20 linajes de maíz
transformado con un gen correspondiente para el que la secuencia que
codifica el primer intrón de la actina del arroz había sido
reemplazada por la secuencia que codifica el intrón adh I del maíz.
Después de tratamiento por pulverización de dosis muy fuertes de
isoxafutol a razón de 200 g de materia activa por hectárea (600
\mug de materia activa por barquilla), se obtuvieron los
resultados siguientes:
| Intrón actina del arroz | 8/20 linajes son tolerantes |
| Intrón adh I del maíz | 3/20 linajes son tolerantes |
Los resultados anteriores demuestran que la
asociación del promotor H3C4 del maíz con el primer intrón de la
actina del arroz según la invención, mejora de modo sustancial la
expresión de una proteína de interés en las plantas monocotiledóneas
transformadas con respecto a la asociación del mismo promotor H3C4
del maíz con otro intrón del estado de la técnica.
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1021 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOM/CLE: Promotor H3C4 del maíz
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 1..1021
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD : 454 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo : Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS : Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN : Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA :
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOM/CLE: Intrón 1 de la actina del arroz
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 1..454
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO:3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1565 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOM/CLE: Promotor H3C4 del maíz
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 27..1047
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOM/CLE: Intrón 1 de la actina del arroz
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 1102..1555
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOM/CLE: sitio de clonación sintético
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 1..26
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOM/CLE: Secuencia de enlace sintético
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 1048..1069
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 85 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Oligonucleótido sintético
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Oligonucleótido sintético
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (29)
1. Una secuencia de ADN, elemento de regulación
en 5' que permite la expresión de un gen heterólogo en una célula
vegetal de una planta monocotiledónea, caracterizada por
contener en el sentido de la transcripción una primera secuencia de
ADN, fragmento funcional de la secuencia del promotor H3C4 del maíz,
y una segunda secuencia de ADN, fragmento funcional de la secuencia
del primer intrón de la actina del arroz.
2. Una secuencia según la reivindicación 1,
caracterizada porque la secuencia del promotor H3C4 del maíz
es el fragmento AluI del promotor H3C4 del maíz.
3. Una secuencia según la reivindicación 1,
caracterizada porque el fragmento funcional de la secuencia
del promotor H3C4 del maíz contiene la secuencia de ADN descrita por
el identificador de secuencia nº 1 (SEQ ID NO:1) o una secuencia
homóloga que presenta un grado de homología de al menos 70% con
relación a dicha secuencia.
4. Una secuencia según la reivindicación 3,
caracterizada porque el fragmento funcional de la secuencia
del promotor H3C4 del maíz consiste en la secuencia de ADN descrita
por el identificador de secuencia nº 1.
5. Una secuencia según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el fragmento
funcional del primer intrón de la actina del arroz contiene la
secuencia de ADN descrita por el identificador de secuencia nº 2
(SEQ ID NO:2) o una secuencia homóloga que presenta un grado de
homología de la menos 70% con relación a dicha secuencia.
6. Una secuencia según la reivindicación 5,
caracterizada porque el fragmento funcional del primer intrón
de la actina del arroz consiste en la secuencia de ADN descrita por
el identificador de secuencia nº 2.
7. Una secuencia de ADN, elemento de regulación
en 5' que permite la expresión de un gen heterólogo en una célula
vegetal de una planta monocotiledónea, caracterizada porque
contiene la secuencia de ADN representada por el identificador de
secuencia nº 3 (SEQ ID NO:3) o una secuencia homóloga que presenta
un grado de homología de al menos 70% con relación a dicha
secuencia.
8. Una secuencia de ADN según la reivindicación
7, caracterizada porque consiste en la secuencia de ADN
representada por el identificador de secuencia nº 3.
9. Un gen quimérico que contiene una secuencia
codificadora así como elementos de regulación en posición 5' y 3'
heterólogos que pueden actuar en las células vegetales de plantas
monocotiledóneas o las plantas monocotiledóneas,
caracterizado porque los elementos de regulación en 5'
comprenden la secuencia de ADN según una de las reivindicaciones 1 a
8.
10. Un gen quimérico según la reivindicación 9,
caracterizado porque la secuencia codificadora se escoge
entre un gen que codifica un marcador de selección, un gen que
confiere a la planta monocotiledónea transformada nuevas propiedades
agronómicas, y un gen de mejora de la calidad agronómica de la
planta monocotiledónea transformada.
11. Un gen quimérico según la reivindicación 10,
caracterizado porque el gen que confiere nuevas propiedades
agronómicas a las plantas monocotiledóneas transformadas, se escoge
entre un gen que confiere tolerancia a ciertos herbicidas, un gen
que confiere tolerancia a ciertos insectos y un gen que confiere
tolerancia a ciertas enfermedades.
12. Un gen quimérico según la reivindicación 11,
caracterizado porque el gen que confiere tolerancia a ciertos
herbicidas se escoge en el gen Bar que confiere tolerancia al
bialafos, un gen que codifica una enzima
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) apropiada que confiere resistencia a los herbicidas
que tienen como diana la EPSPS, el gen que codifica la
glifosato-óxidorreductasa y un gen que codifica una
hidroxi-fenil piruvato dioxigenasa (HPPD) que
confiere tolerancia a los herbicidas que tienen por diana la
HPPD.
13. Un gen quimérico según la reivindicación 12,
caracterizado porque el gen que confiere tolerancia a ciertos
herbicidas se escoge entre un gen que codifica una EPSPS y un gen
que codifica una HPPD.
14. Un gen quimérico según la reivindicación 13,
caracterizado porque el gen que codifica una EPSPS se escoge
entre la EPSPS doble mutante y el CP4.
15. Un gen quimérico según una de las
reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado porque la secuencia
que codifica una EPSPS o una HPPD está precedida por una secuencia
que codifica un péptido de tránsito.
16. Un gen quimérico según la reivindicación 15,
caracterizado porque la secuencia que codifica un péptido de
tránsito es una secuencia que codifica un péptido de tránsito doble
que contiene, en el sentido de la transcripción, una secuencia que
codifica un péptido de tránsito de un gen vegetal que codifica una
enzima en localización plastidial, una parte de secuencia de la
parte madura del extremo N-terminal de un gen
vegetal que codifica una enzima en localización plastidial, después
una secuencia que codifica un segundo péptido de tránsito de un gen
vegetal que codifica una enzima en localización plastidial.
17. Un gen quimérico, caracterizado
porque contiene en el sentido de la transcripción, una secuencia de
regulación en 5' definida según una de las reivindicaciones 1 a 8,
unida de modo funcional a una secuencia que codifica una proteína de
fusión péptido de tránsito/proteína de interés, unida de modo
funcional a una secuencia de regulación en 3'.
18. Un gen quimérico según la reivindicación 17,
caracterizado porque la proteína de interés es una enzima que
confiere tolerancia a ciertos herbicidas, según una de las
reivindicaciones 12 a 14.
19. Un gen quimérico según la reivindicación 18,
caracterizado porque la secuencia que codifica una proteína
de fusión péptido de tránsito/proteína de interés, se escoge entre
la secuencia que codifica la proteína de fusión OTP/EPSPS doble
mutante y la secuencia que codifica la proteína de fusión
OTP/CP4.
20. Un vector de clonación o de expresión para
la transformación de una célula vegetal o de una planta,
caracterizado porque contiene, además del gen quimérico según
una de las reivindicaciones 9 a 19, al menos un origen de
replicación.
21. Un vector según la reivindicación 20,
caracterizado porque es un plásmido.
22. Un procedimiento de transformación de
células vegetales, caracterizado porque se la integra un gen
quimérico según una de las reivindicaciones 9 a 19.
23. Una célula vegetal caracterizada
porque contiene al menos un gen quimérico según una de las
reivindicaciones 9 a 19.
24. Una planta transformada,
caracterizada porque es regenerada a partir de células según
la reivindicación 23.
25. Una planta transformada,
caracterizada porque proviene del cultivo y/o del crecimiento
de una planta transformada según la reivindicación 24.
26. Una semilla de una planta transformada según
una de las reivindicaciones 24 o 25.
27. Un procedimiento de control de malas hierbas
en una superficie de un campo que comprende semillas o plantas
transformadas con un gen quimérico que contiene una secuencia que
codifica una enzima que confiere tolerancia a un herbicida
particular, procedimiento que consiste en aplicar en dicha
superficie del campo una dosis de dicho herbicida particular, tóxico
para dichas malas hierbas, sin afectar, no obstante, de modo
sustancial a las semillas o plantas transformadas con dicho gen
quimérico, caracterizado porque dicho gen quimérico está
definido según una de las reivindicaciones 12 a 19.
28. Un procedimiento de cultivo de plantas
transformadas con un gen quimérico que contiene una secuencia que
codifica una enzima que confiere tolerancia a un herbicida
particular, procedimiento que consiste en plantar las semillas de
dichas plantas transformadas en una superficie de un campo apropiado
para el cultivo de dichas plantas, aplicar sobre dicha superficie de
dicho campo una dosis tóxica para las malas hierbas de dicho
herbicida particular en el caso de presencia de malas hierbas, sin
afectar de modo sustancial a dichas semillas o dichas plantas
transformadas, recolectar después las plantas cultivadas cuando
alcanzan la madurez deseada y separar opcionalmente las semillas de
las plantas recolectadas, caracterizado porque dicho gen
quimérico es un gen quimérico según una de las reivindicaciones 12 a
19.
29. Un procedimiento según la reivindicación 28,
caracterizado porque se aplica el herbicida particular antes
de la siembra, antes del brote o después del brote del cultivo.
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