ES2236689T3 - Secuencia aislada de adn que puede servir como zona terminal en un gen quimerico utilizable para la transformacion de plantas. - Google Patents
Secuencia aislada de adn que puede servir como zona terminal en un gen quimerico utilizable para la transformacion de plantas.Info
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Abstract
Gen quimérico que comprende, en el sentido de la transcripción, una zona promotora, una secuencia que codifica una proteína de interés agronómico y una zona terminal, caracterizado porque la zona terminal es una zona terminal de un gen de histona vegetal.
Description
Secuencia aislada de ADN que puede servir como
zona terminal en un gen quimérico utilizable para la transformación
de plantas.
La presente invención se refiere a la utilización
de zonas terminales aisladas de genes transcritos de plantas, a
nuevos genes quiméricos que las contienen y a su utilización para
la transformación de plantas.
Numerosos caracteres fenotípicos asociados a la
expresión de uno o varios elementos génicos pueden ser integrados en
el genoma de plantas y conferir así a estas plantas transgénicas
propiedades agronómicas ventajosas. De forma no extensiva se puede
citar: las resistencias a agentes patógenos de los cultivos, la
resistencia a productos fitosanitarios fitotóxicos, la producción de
sustancias de interés alimentario o farmacológico. Además del
aislamiento y la caracterización de los elementos génicos que
codifican estos diferentes caracteres, se debe asegurar una
expresión apropiada. Esta expresión apropiada se puede situar tanto
a nivel cualitativo como cuantitativo. A nivel cualitativo, por
ejemplo espacial: expresión preferencial en un tejido concreto, o
temporal: expresión inducible. A nivel cuantitativo, por la cantidad
acumulada del producto de expresión del gen introducido. Esta
expresión apropiada depende en gran medida de la presencia de
elementos génicos de regulación asociados a los transgenes, en
particular en lo que se refiere a los elementos cuantitativos y
cualitativos. Entre los elementos primordiales que aseguran esta
regulación apropiada, la utilización de zonas promotoras homólogas
o heterólogas, sencillas o combinadas, ha sido profusamente
descrita en la literatura científica. La utilización de zonas
terminales secuencia abajo con respecto al transgén ha sido
empleada con el único fin de colocar una barrera que permita parar
el proceso de transcripción del transgén, sin asunciones previas en
cuanto a su papel en la calidad o la cantidad de expresión del
transgén.
La presente invención se refiere a genes
quiméricos que contienen zonas terminales de genes transcritos de
plantas, en particular zonas terminales de genes de histona
vegetal, y a su utilización para la transformación de plantas. Más
en particular, se refiere a la utilización conjunta de zonas
terminales y promotores aislados de un mismo gen transcrito de
plantas. Permite la expresión apropiada de transgenes, cuantitativa
y cualitativa a la vez, de transgenes bajo el control de estos
elementos de regulación génica. Esta expresión apropiada obtenida
mediante la utilización de la presente invención puede hacer
referencia a caracteres tales como: la resistencia a agentes
patógenos de los cultivos, la resistencia a productos fitosanitarios
fitotóxicos, la producción de sustancias de interés alimentario o
farmacológico. En particular, permite conferir a las plantas
transgénicas una tolerancia aumentada a herbicidas mediante una
expresión preferencial, cualitativa y cuantitativa, del producto de
expresión de genes quiméricos en las regiones de la planta de
crecimiento rápido. Esta expresión apropiada concreta del gen de
resistencia a herbicidas se obtiene mediante la utilización conjunta
de elementos de regulación tipo promotor y zona terminal del gen de
la histona H4A748 de Arabidopsis thaliana. Tal perfil de
expresión se puede obtener para todos los caracteres que presenten
interés, tales como los anteriormente descritos, con los elementos
de regulación utilizados para conferir una tolerancia aumentada a
los herbicidas. La presente invención se refiere igualmente a las
células vegetales transformadas con ayuda de estos genes y a las
plantas transformadas regeneradas a partir de estas células, así
como a las plantas surgidas de cruces que utilizan estas plantas
transformadas.
Entre los productos fitosanitarios utilizados
para la protección de cultivos, los productos sistémicos se
caracterizan por ser transportados por el interior de la planta
después de su aplicación y, en el caso de algunos de ellos, por
acumularse en las partes de crecimiento rápido, especialmente en los
ápices de los tallos y las raíces, provocando, en el caso de los
herbicidas, la alteración, hasta la destrucción, de las plantas
sensibles. En el caso de algunos herbicidas que presentan este tipo
de comportamiento, se conoce el modo de acción primario y es el
resultado de una inactivación de enzimas caracterizadas implicadas
en las rutas de biosíntesis de compuestos necesarios para el buen
desarrollo de las plantas diana. Las enzimas diana de estos
productos pueden estar localizadas en diferentes compartimentos
subcelulares y la observación del modo de acción de productos
conocidos muestra con la mayor frecuencia una localización en el
compartimento plastidial.
La tolerancia de las plantas sensibles a un
producto que pertenezca a este grupo de herbicidas, y cuya diana
primaria es conocida, se puede obtener mediante la introducción
estable en su genoma de un gen que codifique la enzima diana, de
cualquier origen filogenético, mutado o no en cuanto a las
características de inhibición por el herbicida del producto de la
expresión de este gen. Otra estrategia consiste en introducir de
manera estable en el genoma de plantas sensibles un gen de
cualquier origen filogenético que codifique una enzima capaz de
realizar la metabolización del herbicida para dar un compuesto
inactivo y no tóxico para el desarrollo de la planta. En este
último caso, no es necesario haber caracterizado la diana del
herbicida.
Conocido el modo de distribución y acumulación de
los productos de este tipo en las plantas tratadas, es interesante
poder expresar el producto de la traducción de estos genes de tal
manera que se permita su expresión preferencial y su acumulación en
las regiones de la planta de crecimiento rápido en donde se
acumulan estos productos. Además, y en el caso en el que la diana de
estos productos esté localizada en un compartimento celular
distinto del citoplasma, es interesante poder expresar el producto
de la traducción de estos genes en forma de un precursor que
contenga una secuencia polipeptídica que permita dirigir la
proteína que confiere tolerancia al compartimento adecuado, y en
particular al compartimento plastidial.
A título de ejemplo ilustrativo de esta
estrategia se pueden citar el glifosato, el sulfosato o la
fosametina, que son herbicidas sistémicos de amplio espectro de la
familia de las fosfonometilglicinas. Se comportan esencialmente como
inhibidores competitivos frente al PEP (fosfoenolpiruvato) de la
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS, EC 2.5.1.19). Tras su aplicación sobre la planta,
son transportados por el interior de la planta, donde se acumulan
en las partes de crecimiento rápido, especialmente los ápices de
los tallos y las raíces, provocando la alteración, hasta su
destrucción, de las plantas sensibles.
La EPSPS, diana principal de estos productos, es
una enzima de la vía de biosíntesis de los aminoácidos aromáticos,
que se localiza en el compartimento plastidial. Esta enzima está
codificada por uno o más genes nucleares y es sintetizada en forma
de un precursor citoplasmático y después importada a los plastos,
donde se acumula en su forma madura.
La tolerancia de las plantas al glifosato y a los
productos de la familia se obtiene por introducción estable en su
genoma de un gen de EPSPS de origen vegetal o bacteriano, mutado o
no en cuanto a las características de inhibición por el glifosato
del producto de este gen. Teniendo en cuenta el modo de acción del
glifosato, es interesante poder expresar el producto de la
traducción de este gen de forma que se permita su acumulación
importante en los plastos y, además, en las regiones de la planta de
crecimiento rápido donde se acumulan los productos.
Se sabe, por ejemplo, según la patente de EE.UU.
No. 4.535.060, cómo conferir a una planta tolerancia a un herbicida
del tipo anterior, en particular la
N-fosfonometilglicina o glifosato, por introducción
en el genoma de las plantas de un gen que codifica una EPSPS que
lleva al menos una mutación que hace a esta enzima más resistente a
su inhibidor competitivo (el glifosato), después de la localización
de la enzima en el compartimiento plastidial. Estas técnicas
demandan, no obstante, ser mejoradas para obtener una mayor
fiabilidad en el empleo de estas plantas tras un tratamiento con
estos productos en condiciones agronómicas.
En la presente descripción se entiende por
"planta" cualquier organismo multicelular diferenciado capaz de
realizar la fotosíntesis, y por "célula vegetal" cualquier
célula que proviene de una planta y que puede constituir tejidos no
diferenciados, tales como callos, o tejidos diferenciados, tales
como embriones o partes de plantas, plantas o semillas. Se entiende
por "zona terminal" una secuencia de ADN aislada de longitud
variable, situada secuencia abajo con respecto a la parte
codificante, y que señala el final de la transcripción. Se entiende
por gen de tolerancia a un herbicida todo gen, de cualquier origen
filogenético, que codifica o bien la enzima diana del herbicida,
presentando o no una o varias mutaciones relacionadas con las
características de inhibición por el herbicida, o bien una enzima
capaz de metabolizar el herbicida para dar un compuesto inactivo y
no tóxico para la planta. Se entiende por zonas de la planta de
crecimiento rápido, las regiones donde tienen lugar
multiplicaciones celulares importantes, en particular las regiones
apicales.
La presente invención se refiere a la producción
de plantas transformadas que poseen particularmente una tolerancia
aumentada a los herbicidas que se acumulan en las zonas de
crecimiento rápido de las plantas tratadas, por regeneración de
células transformadas por medio de nuevos genes quiméricos que
contienen un gen de tolerancia a estos herbicidas. La invención
tiene igualmente por objeto la producción de plantas transformadas
que tienen una tolerancia aumentada a los herbicidas de la familia
de las fosfonometilglicinas mediante la regeneración de células
transformadas con la ayuda de nuevos genes quiméricos que contienen
un gen de tolerancia a estos herbicidas. La invención se refiere
igualmente a estos nuevos genes quiméricos, así como a las plantas
transformadas convertidas en más tolerantes gracias a una mejor
tolerancia en las partes de crecimiento rápido de estas plantas,
así como a las plantas surgidas de cruces que utilizan estas
plantas transformadas. Más particularmente, la invención tiene por
objeto un gen quimérico que comprende, en el sentido de la
transcripción, una zona promotora, una secuencia que codifica una
proteína de interés agronómico y una zona terminal, caracterizado
porque la zona terminal es una zona terminal de un gen de histona
vegetal.
Según una forma particular de realización, la
invención tiene por objeto un gen quimérico para conferir a las
plantas en especial una tolerancia aumentada frente a un herbicida
que tiene como diana la EPSPS, que comprende, en el sentido de la
transcripción, una zona promotora, una zona de péptido de tránsito,
una secuencia que codifica una enzima de tolerancia a productos de
la familia de las fosfonometilglicinas y una zona terminal,
caracterizado porque la zona terminal está constituida por un
fragmento de una zona terminal de un gen de histona vegetal en una
orientación cualquiera en relación a su orientación inicial en el
gen del cual proviene, que permite la expresión preferencial y la
acumulación de la proteína de tolerancia al herbicida en las zonas
de acumulación de dicho herbicida.
El gen de histona, del que proviene la zona
terminal según la invención, proviene de una planta monocotiledónea
tal como, por ejemplo, trigo, maíz o arroz o preferentemente de una
planta dicotiledónea tal como, por ejemplo, alfalfa, girasol, soja,
colza o preferentemente Arabidopsis thaliana. Se utiliza
preferentemente un gen de histona del tipo H3 o preferentemente del
tipo H4.
La zona del péptido de tránsito comprende, en el
sentido de la transcripción, al menos un péptido de tránsito de un
gen vegetal que codifica una enzima de localización plastidial, una
parte de la secuencia de la parte madura N-terminal
de un gen vegetal que codifica una enzima de localización
plastidial, y después un segundo péptido de tránsito de un gen
vegetal que codifica una enzima de localización plastidial,
preferentemente el gen de la subunidad menor de la
ribulosa-1,5-bifosfato-carboxilasa/oxigenasa
(RuBisCO) según la solicitud de patente europea 508 909. Esta zona
característica tiene como papel permitir la liberación al
compartimento plastidial de un polipéptido maduro con una eficacia
máxima, preferentemente en forma nativa.
La secuencia codificante utilizable en el gen
quimérico según la invención proviene de un gen de tolerancia a
herbicidas de cualquier origen filogenético. Esta secuencia puede
ser especialmente la de la EPSPS mutada que tiene un cierto grado
de tolerancia al glifosato.
La zona promotora según la solicitud de patente
europea 507 698 puede ser de cualquier origen, en forma sencilla o
duplicada o combinada con un gen que se expresa en las plantas de
forma natural, es decir, por ejemplo, bacteriana, como la del gen
de la nopalina sintasa, o viral, como la del transcrito de 35S del
virus del mosaico de la coliflor, preferentemente, vegetal, como la
de la subunidad menor del gen de la
ribulosa-1,5-bifosfato-carboxilasa/oxigenasa
o de preferentemente como la de un gen de histona vegetal o de
preferentemente de Arabidopsis thaliana. Se utiliza
preferentemente un gen de histona del tipo H3 o preferentemente
H4.
El gen quimérico según la invención puede
comprender, además de las partes esenciales anteriormente indicadas,
una zona intermedia sin traducir (fragmento enlazador) entre la zona
promotora y la zona codificante, así como entre la zona codificante
y la zona terminal, y que puede ser de cualquier origen
filogenético.
Se lleva a cabo la construcción de genes
quiméricos según la invención a partir de los elementos
siguientes:
1) Promotor de gen de histona: Se aísla el
promotor a partir de un clon de la histona H4A748 de Arabidopsis
thaliana de la cepa Estrasburgo (M.E. Chaboute, Tesis de la
Universidad de Estrasburgo, 1987 y M.E.Chaboute et al.
(1987) Plant Mol.Biol., 8, 179-191). Este promotor,
que comprende aproximadamente 900 pb entre los sitio Aval
utilizados para aislarlo, se subclonó en el sitio Sall de pUC18,
disponible en catálogo (Pharmacia
#27-4949-01) después del relleno de
las extremidades protuberantes Sall y Aval con la polimerasa de
Klenow. Uno de los subclones obtenidos, que presentaba el extremo
5' del promotor cerca del sitio HindIll del fragmento polienlazador
de pUC18 y el extremo 3' del promotor cerca del sitio Xbal del
fragmento polienlazador de pUC18, se utilizó a continuación y se le
denominó: prom.H4A748/Aval/Sall-pUC18.
2) Zona de péptido de tránsito: los dos
péptidos de tránsito, así como los elementos de proteínas maduras
utilizados, han sido ya descritos, así como su ensamblaje (M.
Lebrun et al., solicitud de patente europea 508 909). Esta
zona comprende aproximadamente 350 pb y se le denomina Péptido de
Tránsito Optimizado (PTO).
3) Gen de tolerancia a herbicidas CT7:
proviene del gen CT7 mutado (Pro101 en Ser) de la EPSPS de
Salmonella typhymurium aislado por Stalker et al.
(1985) J.Biol.Chem., 260, 4724-4728. El clon
pGM34-2, proporcionado por Calgene, se linearizó
con XbaI y se trató después con la nucleasa de Vigna
radiata. Después de volver a cortar con SmaI, se ligaron los dos
extremos romos. El clon obtenido posee un sitio NcoI sobre el ATG
iniciador de la traducción, así como un sitio SalI 17 pb secuencia
abajo con respecto al codón de parada. Este clon fue denominado
pRPA-BL-104.
4) Fusión TPO/CT7: un casete de expresión
que contiene el péptido de tránsito optimizado (TPO) fusionado en
marco de lectura con el gen CT7 (B.Leroux et al., solicitud
de patente europea 507 698) se clonó en el vector pBSII SK(-)
(catálogo de Stratagene #212206). Este casete
5'-TPO/CT7-3' contiene un sitio
Xbal en su extremo 5' y un sitio Sstl en su extremo 3'.
5) Gen indicador GUS: se trata del gen que
codifica la \beta-glucuronidasa (GUS) presente en
el plásmido pBl 101-1, disponible en catálogo
(Clontech #6017-1).
6) Zona terminal de histona: se aisló del
gen de la histona H4A748 de Arabidopsis thaliana (M.E.
Chaboute, Tesis de la Universidad de Estrasburgo, 1987 y
M.E.Chaboute et al. (1987) Plant Mol.Biol., 8,
179-191). Se aisló un fragmento Sau3Al de 661 pb,
se convirtieron sus bordes en romos por tratamiento con la
polimerasa de Klenow y se subclonó en el sitio Smal del fagémido
pBluescript® II KS (+), disponible en catálogo (Stratagene #212207;
Short et al., 1988, Nucleic Acid Research 16(15),
7583-7600). La secuencia de este fragmento se
presenta más adelante en la sección: "listado de secuencias".
Se demostró mediante cartografía S1 que este fragmento aislado
comprende, en el interior de una región de 200 pb de su extremo 5',
en el sentido original de la transcripción, la secuencia
correspondiente a la presente antes del sitio de poliadenilación
del ARNm que deriva de la transcripción de este gen.
Correspondiente el nucleótido A de la posición 165 de la secuencia
de 661 pb al sitio de adición de Ia extremidad poliadenilada
presente en el transcrito (Chaboute M.E. et al. (1988) Gene,
71, 217-223). Se conservaron dos subclones, que
presentan, el uno: el inserto orientado en el sentido original de
la transcripción del gen H4A748 en forma de un fragmento
Sstl-EcoRl y denominado
t-directH4A748/Sau3Al/Smal-pKS, y el
otro en sentido inverso, en forma de un fragmento
Sstl-EcoRl y denominado
t-inverseH4A748/Sau3AI/Smal-pKS.
Secuencia de 661 pb de la zona terminal de la
histona H4A748 de Arabidopsis thaliana en el sentido
original de la transcripción del gen:
7) Zona terminal "nos": se trata del
fragmento que contiene la señal de zona terminal del gen de la
nopalina sintasa (nos) de pTi37 (Bevan M. et al. (1983)
NucI.Acids Res., 11, 369-385) presente en el
plásmido pBl 101-1, disponible en catálogo
(Clontech #6017-1).
El ensamblaje de todos estos elementos se efectuó
de la manera siguiente, sobre la base del esqueleto del vector
binario para la transformación de plantas mediante Agrobacterium
tumefaciens pBl 101-1, disponible en catálogo
(Clontech #6017-1):
El promotor de la histona H4A748 de
Arabidopsis thaliana se escindió del plásmido prom.
H4A748/Aval/SalI-pUC18 en forma del fragmento
Hindlll/Xbal de aproximadamente 900 pb. Este fragmento se insertó
mediante ligación en el plásmido pBl 101-1 digerido
con Hindlll/Xbal. El plásmido recombinante obtenido contiene, en el
sentido de la transcripción del gen quimérico: promotor
H4A748/GUS/zona terminal nos, y se le denominó
pRA-1.
La zona terminal H4A748 de Arabidopsis
thaliana se escindió del plásmido
t-directH4A748/Sau3AI/Smal-pKS en
forma de un fragmento Sstl/EcoRI de aproximadamente 670 pb. Este
fragmento se insertó mediante ligación en sustitución de la zona
terminal nos tras la digestión del plásmido pRA-1
con Sstl/EcoRl. El plásmido recombinante obtenido contiene, en el
sentido de la transcripción del gen quimérico: promotor
H4A748/GUS/zona terminal H4A748 en orientación directa, y se le
denominó pRA-2.
La zona terminal H4A748 de Arabidopsis
thaliana se escindió del plásmido
t-inverseH4A748/Sau3AI/Smal-pKS en
forma de un fragmento Sstl/EcoRI de aproximadamente 670 pb. Este
fragmento se insertó mediante ligación en sustitución de la zona
terminal nos tras la digestión del plásmido pRA-1
con Sstl/EcoRl. El plásmido recombinante obtenido contiene, en el
sentido de la transcripción del gen quimérico: promotor
H4A748/GUS/zona terminal H4A748 en orientación inversa, y se le
denominó pRA-3.
El fragmento Xbal/Sstl de aproximadamente 1,75
kpb que contiene PTO/CT7 se insertó mediante ligación en sustitución
del gen GUS tras la digestión del plásmido pRA-1
con Xbal/Sstl. El plásmido recombinante obtenido contiene, en el
sentido de la transcripción del gen quimérico: promotor
H4A748/PTO/CT7/zona terminal nos, y se le denominó
pRPA-RD-146.
El fragmento Xbal/Sstl de aproximadamente 1,75
kpb que contiene PTO/CT7 se insertó mediante ligación en
sustitución del gen GUS tras la digestión del plásmido
pRA-2 con Xbal/Sstl. El plásmido recombinante
obtenido contiene, en el sentido de la transcripción del gen
quimérico: promotor H4A748/PTO/CT7/zona terminal H4A748 en
orientación directa y se le denominó
pRA-RD-147.
El fragmento Xbal/Sstl de aproximadamente 1,75
kpb que contiene PTO/CT7 se insertó mediante ligación en
sustitución del gen GUS tras la digestión del plásmido
pRA-3 con Xbal/Sstl. El plásmido recombinante
obtenido contiene, en el sentido de la transcripción del gen
quimérico: promotor H4A748/PTO/CT7/zona terminal H4A748 en
orientación inversa y se le denominó
pRA-RD-148.
El vector se introdujo en la cepa no oncogénica
de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, disponible en
catálogo (Clontech #6027-1), por cruce triparental
con ayuda del plásmido auxiliar pRK 2013, en Escherichia
coli HB101 según el procedimiento descrito por Bevan M. (1984)
Nucl.Acids Res., 12, 8711-8721.
Se llevó a cabo la técnica de transformación a
partir de explantes radiculares de Arabidopsis
thaliana L.-ecotipo C24 según el procedimiento descrito por
Valvekens D. et al. (1988) Proc.Natl.Acad.Sci USA, 85,
5536-5540. Brevemente, son necesarias 3 etapas:
inducción de la formación de callos en medio B5 de Gamborg
suplementado con 2,4-D y cinetina; formación de
brotes en medio B5 de Gamborg suplementado con 2iP e IAA;
enraizamiento y formación de granos en MS sin hormonas.
La puesta de manifiesto de la actividad GUS
(Jefferson R.A. et al. (1987) EMBO J., 6,
3901-3907) en diferentes órganos de plantas
transgénicas muestra que la expresión preferencial en las regiones
meristemáticas se conserva con las construcciones
pRA-2 y 3. Además, la construcción
pRA-2 permite observar una actividad en los tejidos
adultos (hojas, raíces, pedúnculos florales) que no aparece con la
construcción pRA-1.
La actividad GUS se midió por fluorometría en
extractos de botones florales y de hojas en roseta (Jefferson R.A.
et al. (1987) EMBO J., 6, 3901-3907) a
partir de 12 plantas, correspondientes a eventos individuales de
transformación, para cada una de las construcciones
pRA-1, 2 y 3.
Los resultados medios calculados, en pmol
MU/min.mg prot., son los siguientes:
| Construcciones, | Hojas (H) | Brotes (B) | Relaciones B/H |
| pRA-1 | 850,25 | 3965,33 | 4,66 |
| pRA-2 | 4890,67 | 33683,75 | 6,89 |
| pRA-3 | 4211,73 | 27752,45 | 6,59 |
Estas medidas demuestran claramente que la zona
terminal H4A748, en sentido directo o inverso, induce un aumento de
la actividad de la expresión del gen quimérico, en particular en
las regiones de la planta de crecimiento rápido.
El vector se introduce en la cepa no oncogénica
de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, disponible en
catálogo (Clontech #6027-1), por cruce triparental
con ayuda del plásmido auxiliar pRK 2013, en Escherichia
coli HB101 según el procedimiento descrito por Bevan M. (1984)
Nucl.Acids Res., 12, 8711-8721.
La técnica de transformación a partir de
explantes foliares de tabaco se basa en el procedimiento descrito
por Horsh R. et al. (1985) Science, 227, 1229- 1231. La
regeneración del tabaco PBD6 (procedencia SEITA Francia) a partir de
explantes foliares se realizó sobre un medio de base Murashige y
Skoog (MS) que comprendía 30 g/l de sacarosa, así como 200
\mug/ml de kanamicina en tres etapas sucesivas: la primera
comprende la inducción de brotes sobre un medio MS al que se le
habían adicionado 30 g de sacarosa que contenía 0,05 mg de ácido
naftilacético (ANA) y 2 mg/l de bencilaminopurina (BAP) durante 15
días. Los brotes formados en el transcurso de esta etapa se
desarrollaron a continuación por cultivo en un medio MS al que se
le habían adicionado 30 g/l de sacarosa, pero que no contenía
ninguna hormona, durante 10 días. Después se retiraron los brotes
desarrollados y se cultivaron en un medio de enraizamiento MS
diluido a la mitad, con la mitad del contenido en sales, vitaminas
y azúcares y que no contenía ninguna hormona. Al cabo de
aproximadamente 15 días, los brotes enraizados se pasaron a
tierra.
Veinte plantas transgénicas se regeneraron y
transfirieron a invernadero por cada una de las construcciones
pRPA-RD-A, B y C. Estas plantas se
trataron en el invernadero, en el estadio de 5 hojas, con una
suspensión acuosa de Roundup® que correspondía a 0,8 kg de materia
activa de glifosato por hectárea. Los resultados corresponden a la
observación de los índices de fitotoxicidad recogidos 3 semanas
después del tratamiento. En estas condiciones, se comprobó que las
plantas transformadas por las construcciones presentaban como media
una tolerancia aceptable
(pRPA-RD-146) o incluso buena
(pRPA-RD-147 y 148), mientras que
las plantas testigo no transformadas habían sido destruidas
completamente. Estos resultados ponen de manifiesto claramente la
mejora aportada mediante la utilización de un gen quimérico según
la invención para un mismo gen que codifica la tolerancia al
glifosato.
Las plantas transformadas según la invención
pueden ser utilizadas como ascendientes para la obtención de líneas
y de híbridos que poseen el carácter fenotípico correspondiente a
la expresión del gen quimérico introducido.
Claims (23)
1. Gen quimérico que comprende, en el sentido de
la transcripción, una zona promotora, una secuencia que codifica
una proteína de interés agronómico y una zona terminal,
caracterizado porque la zona terminal es una zona terminal de
un gen de histona vegetal.
2. Gen quimérico según la reivindicación 1,
caracterizado porque la zona terminal está orientada, en el
sentido de la transcripción del gen quimérico, de manera directa o
inversa con respecto a su orientación inicial en el sentido de la
transcripción del gen del que proviene.
3. Gen quimérico según una de las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la zona
terminal de histona proviene de una planta dicotiledónea.
4. Gen quimérico según la reivindicación 3,
caracterizado porque la zona terminal de histona proviene de
Arabidopsis thaliana.
5. Gen quimérico según una de las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la zona
terminal de histona proviene de una planta monocotiledónea.
6. Gen quimérico según la reivindicación 5,
caracterizado porque la zona terminal de histona proviene de
Zea mays.
7. Gen quimérico según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la zona
terminal de histona proviene de un gen de la histona vegetal H4.
8. Gen quimérico según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la zona
terminal de histona proviene de un gen de la histona vegetal H3.
9. Gen quimérico según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la zona
promotora proviene de un promotor de gen de histona vegetal.
10. Gen quimérico según la reivindicación 9,
caracterizado porque la zona promotora proviene del mismo gen
de histona vegetal que la zona terminal.
11. Gen quimérico según una de las
reivindicaciones 9 ó 10, caracterizado porque la zona
promotora comprende un promotor de histona vegetal duplicado.
12. Gen quimérico según una de las
reivindicaciones 9 ó 10, caracterizado porque la zona
promotora contiene al menos una zona promotora de un gen de histona
vegetal asociada a una zona promotora diferente proveniente de un
gen que se puede expresar de forma natural en plantas.
13. Gen quimérico según una de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la secuencia
codificante permite conferir a las plantas una tolerancia aumentada
frente a un herbicida.
14. Gen quimérico según la reivindicación 13,
caracterizado porque la secuencia codificante que confiere
tolerancia a herbicidas está fusionada a una secuencia de ADN que
codifica una zona de péptido de tránsito que permite la acumulación
del producto de la traducción del gen de tolerancia a herbicidas en
un compartimento subcelular.
15. Gen quimérico según la reivindicación 14,
caracterizado porque la zona de péptido de tránsito permite
la acumulación del producto de la traducción del gen de tolerancia
a herbicidas en el compartimento plastidial.
16. Gen quimérico según la reivindicación 15,
caracterizado porque la zona de péptido de tránsito
comprende, en el sentido de la transcripción, al menos un péptido
de tránsito de un gen vegetal que codifica una enzima de
localización plastidial, opcionalmente una parte de la secuencia de
la parte madura N-terminal de un gen vegetal que
codifica una enzima de localización plastidial y después,
opcionalmente, un segundo péptido de tránsito de un gen vegetal que
codifica una enzima de localización plastidial.
17. Gen quimérico según una de las
reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque el gen de
tolerancia a herbicidas codifica una enzima activa frente a
herbicidas cuya diana es la EPSPS.
18. Gen quimérico según la reivindicación 17,
caracterizado porque el gen de tolerancia a herbicidas
codifica una enzima activa frente al glifosato.
19. Gen quimérico según la reivindicación 18,
caracterizado porque el gen de tolerancia a herbicidas es de
cualquier origen filogenético.
\newpage
20. Vector para la transformación de plantas,
caracterizado porque comprende un gen quimérico según una de
las reivindicaciones 1 a 19.
21. Cepa de Agrobacterium sp.,
caracterizada porque contiene un vector según la
reivindicación 20.
22. Célula vegetal transformada,
caracterizada porque contiene un gen quimérico según una de
las reivindicaciones 1 a 19.
23. Planta transformada obtenida a partir de una
célula según la reivindicación 22, conteniendo dicha planta el gen
según las reivindicaciones 1 a 19 o el vector según la
reivindicación 20.
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