JPH078278A - 植物の形質転換に使用し得るキメラ遺伝子においてターミネーター領域として作用し得る単離ｄｎａ配列 - Google Patents
植物の形質転換に使用し得るキメラ遺伝子においてターミネーター領域として作用し得る単離ｄｎａ配列Info
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- JPH078278A JPH078278A JP6143487A JP14348794A JPH078278A JP H078278 A JPH078278 A JP H078278A JP 6143487 A JP6143487 A JP 6143487A JP 14348794 A JP14348794 A JP 14348794A JP H078278 A JPH078278 A JP H078278A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 植物の形質転換に使用し得るキメラ遺伝子に
おけるターミネーター領域として作用し得る単離ＤＮＡ
配列を提供する。 【構成】 １）植物の形質転換のためのキメラ遺伝子。 ２）転写方向で、プロモーター領域、トランス遺伝子及
びターミネーター領域を少なくとも含み、前記ターミネ
ーター領域が、急成長領域におけるタンパク質の発現を
可能にする植物ヒストン遺伝子由来の少なくとも１つの
ターミネーター領域からなることを特徴とする。 ３）トランスジェニック植物の生産。
おけるターミネーター領域として作用し得る単離ＤＮＡ
配列を提供する。 【構成】 １）植物の形質転換のためのキメラ遺伝子。 ２）転写方向で、プロモーター領域、トランス遺伝子及
びターミネーター領域を少なくとも含み、前記ターミネ
ーター領域が、急成長領域におけるタンパク質の発現を
可能にする植物ヒストン遺伝子由来の少なくとも１つの
ターミネーター領域からなることを特徴とする。 ３）トランスジェニック植物の生産。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、植物の被転写遺伝子か
ら単離されたターミネーター領域及びそれらを含む新規
キメラ遺伝子の使用、並びに植物の形質転換における該
キメラ遺伝子の使用に係わる。
ら単離されたターミネーター領域及びそれらを含む新規
キメラ遺伝子の使用、並びに植物の形質転換における該
キメラ遺伝子の使用に係わる。
【０００２】１つまたは幾つかの遺伝子エレメントの発
現に関連する多数の表現型特性を植物ゲノムに組込み、
かかるトランスジェニック植物に有利な農業特性を与え
ることができる。狭義には、作物の病原性物質に対する
耐性、殺草性植物防疫生成物に対する耐性、食品または
医薬的重要性を有する物質の生産が挙げられる。かかる
種々の特性をコードする遺伝子エレメントの単離及び特
性分析にほかに、適当な発現が保証される必要がある。
この適当な発現は質的にも量的にも優れたレベルにある
必要がある。質的レベルでは、例えば空間的には特定の
組織における優先的発現、時間的には誘導性発現が考慮
され、量的レベルでは、導入された遺伝子の発現産物の
蓄積量が考慮される。この適当な発現は、特に量的及び
質的要素に関しては、トランス遺伝子に関連する調節遺
伝子エレメントの存在に多分に依存する。この適当な調
節を与える始原エレメントのなかで、同種または異種
の、単一または組合わせたプロモーター領域の使用が科
学文献に広範に記載されている。トランス遺伝子の下流
のターミネーター領域は、トランス遺伝子の発現の質ま
たは量におけるそれらの役割について前提要件なしに、
トランス遺伝子転写プロセスを停止することができる境
界を置くためのみに使用される。
現に関連する多数の表現型特性を植物ゲノムに組込み、
かかるトランスジェニック植物に有利な農業特性を与え
ることができる。狭義には、作物の病原性物質に対する
耐性、殺草性植物防疫生成物に対する耐性、食品または
医薬的重要性を有する物質の生産が挙げられる。かかる
種々の特性をコードする遺伝子エレメントの単離及び特
性分析にほかに、適当な発現が保証される必要がある。
この適当な発現は質的にも量的にも優れたレベルにある
必要がある。質的レベルでは、例えば空間的には特定の
組織における優先的発現、時間的には誘導性発現が考慮
され、量的レベルでは、導入された遺伝子の発現産物の
蓄積量が考慮される。この適当な発現は、特に量的及び
質的要素に関しては、トランス遺伝子に関連する調節遺
伝子エレメントの存在に多分に依存する。この適当な調
節を与える始原エレメントのなかで、同種または異種
の、単一または組合わせたプロモーター領域の使用が科
学文献に広範に記載されている。トランス遺伝子の下流
のターミネーター領域は、トランス遺伝子の発現の質ま
たは量におけるそれらの役割について前提要件なしに、
トランス遺伝子転写プロセスを停止することができる境
界を置くためのみに使用される。
【０００３】本発明は、植物の被転写遺伝子から単離さ
れたターミネーター領域及びそれらを含む新規キメラ遺
伝子の使用、並びに植物の形質転換における該キメラ遺
伝子の使用に係わる。特に本発明は、同じ植物被転写遺
伝子から単離されたターミネーター領域及びプロモータ
ーの同時使用に係わる。かかる遺伝子調節エレメントの
制御下で、量及び質が共に適当なトランス遺伝子の発現
が可能になる。本発明の使用により得られるこの適当な
発現は、作物の病原性物質に対する耐性、殺草性植物防
疫生成物に対する耐性、及び食品及び医薬的に重要な物
質の生産のごとき特性に係わり得る。特に、植物の急成
長領域におけるキメラ遺伝子の発現産物の量的及び質的
に優先的な発現によって、トランスジェニック植物に高
い除草剤耐性を付与し得る。この除草剤耐性遺伝子の特
異的且つ適当な発現は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈ
ａｌｉａｎａ由来のＨ４Ａ７４８ヒストン遺伝子のプロ
モーター及びターミネーター領域調節エレメントを同時
使用することにより得られる。かかる発現パターンは、
高い除草剤耐性を与えるために使用される調節エレメン
トを用い、上述のごとき問題の全ての特性に対して得る
ことができる。本発明は更に、かかる遺伝子によって形
質転換された植物細胞、かかる細胞から再生された形質
転換植物、及び、かかる形質転換植物を使用する交雑か
ら誘導される植物にも係わる。
れたターミネーター領域及びそれらを含む新規キメラ遺
伝子の使用、並びに植物の形質転換における該キメラ遺
伝子の使用に係わる。特に本発明は、同じ植物被転写遺
伝子から単離されたターミネーター領域及びプロモータ
ーの同時使用に係わる。かかる遺伝子調節エレメントの
制御下で、量及び質が共に適当なトランス遺伝子の発現
が可能になる。本発明の使用により得られるこの適当な
発現は、作物の病原性物質に対する耐性、殺草性植物防
疫生成物に対する耐性、及び食品及び医薬的に重要な物
質の生産のごとき特性に係わり得る。特に、植物の急成
長領域におけるキメラ遺伝子の発現産物の量的及び質的
に優先的な発現によって、トランスジェニック植物に高
い除草剤耐性を付与し得る。この除草剤耐性遺伝子の特
異的且つ適当な発現は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈ
ａｌｉａｎａ由来のＨ４Ａ７４８ヒストン遺伝子のプロ
モーター及びターミネーター領域調節エレメントを同時
使用することにより得られる。かかる発現パターンは、
高い除草剤耐性を与えるために使用される調節エレメン
トを用い、上述のごとき問題の全ての特性に対して得る
ことができる。本発明は更に、かかる遺伝子によって形
質転換された植物細胞、かかる細胞から再生された形質
転換植物、及び、かかる形質転換植物を使用する交雑か
ら誘導される植物にも係わる。
【０００４】作物保護に使用される植物防疫生成物のな
かで浸透性（ｓｙｓｔｅｍｉｃ）生成物は、施用後植物
中に輸送され、一部は急成長部分、特に茎及び根端に蓄
積し、除草剤の場合には、感受性植物を壊滅するほど劣
化させる原因となり得ることを特徴とする。この種の挙
動を示す幾つかの除草剤においては、主たる作用態様は
公知であり、標的植物の適正な発育に必要な化合物の生
合成経路に関与すると特性分析されている酵素の失活が
原因となる。かかる生成物の標的酵素は種々の細胞内分
画に存在し得るが、公知の生成物の作用の態様を観察す
ると、最も多くはプラスチド分画内に存在することが判
る。
かで浸透性（ｓｙｓｔｅｍｉｃ）生成物は、施用後植物
中に輸送され、一部は急成長部分、特に茎及び根端に蓄
積し、除草剤の場合には、感受性植物を壊滅するほど劣
化させる原因となり得ることを特徴とする。この種の挙
動を示す幾つかの除草剤においては、主たる作用態様は
公知であり、標的植物の適正な発育に必要な化合物の生
合成経路に関与すると特性分析されている酵素の失活が
原因となる。かかる生成物の標的酵素は種々の細胞内分
画に存在し得るが、公知の生成物の作用の態様を観察す
ると、最も多くはプラスチド分画内に存在することが判
る。
【０００５】上記種類の除草剤に属し、その主標的が既
知である生成物に感受性の植物の耐性は、遺伝子の発現
産物が除草剤によって阻害される特性に関して突然変異
したまたはしていない任意系統起源の、標的酵素をコー
ドする遺伝子をゲノム中に安定導入することにより得ら
れる。別の方法は、除草剤を、植物発育に対して不活性
及び無毒性の化合物に変換（ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅ）し
得る酵素をコードする任意系統起源の遺伝子を、感受性
植物のゲノム中に安定導入することからなる。後者の場
合、除草剤の標的を特性分析することは不要である。
知である生成物に感受性の植物の耐性は、遺伝子の発現
産物が除草剤によって阻害される特性に関して突然変異
したまたはしていない任意系統起源の、標的酵素をコー
ドする遺伝子をゲノム中に安定導入することにより得ら
れる。別の方法は、除草剤を、植物発育に対して不活性
及び無毒性の化合物に変換（ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅ）し
得る酵素をコードする任意系統起源の遺伝子を、感受性
植物のゲノム中に安定導入することからなる。後者の場
合、除草剤の標的を特性分析することは不要である。
【０００６】処理した植物における上記種類の生成物の
分布及び蓄積の態様を鑑み、かかる生成物が蓄積する植
物の急成長領域において優先的に発現及び蓄積するよう
に、かかる遺伝子の翻訳産物を発現し得ることが有利で
ある。更に、かかる生成物の標的が細胞質以外の細胞分
画中に局在する場合には、耐性付与タンパク質を適当な
分画、特にプラスチド分画に割り当て得るようなポリペ
プチド配列を含む前駆体の形態で、遺伝子の翻訳産物を
発現し得ることが有利である。
分布及び蓄積の態様を鑑み、かかる生成物が蓄積する植
物の急成長領域において優先的に発現及び蓄積するよう
に、かかる遺伝子の翻訳産物を発現し得ることが有利で
ある。更に、かかる生成物の標的が細胞質以外の細胞分
画中に局在する場合には、耐性付与タンパク質を適当な
分画、特にプラスチド分画に割り当て得るようなポリペ
プチド配列を含む前駆体の形態で、遺伝子の翻訳産物を
発現し得ることが有利である。
【０００７】上記方法を示す例として、ホスホノメチル
グリシン系の広域スペクトルの浸透性除草剤であるグリ
ホセート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、スルホセート（ｓ
ｕｌｐｈｏｓａｔｅ）またはホサメチン（ｆｏｓａｍｅ
ｔｉｎ）を挙げることができる。これらは実質的に、５
−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシン
ターゼ（ＥＰＳＰＳ，ＥＣ２．５．１．１９）のＰＥＰ
（ホスホエノールピルベート）に対する競合阻害剤とし
て作用する。植物に施用後、これらは植物中に輸送さ
れ、急成長部分、特に幹及び根端に蓄積し、感受性植物
を壊滅するほど劣化させる原因となる。
グリシン系の広域スペクトルの浸透性除草剤であるグリ
ホセート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、スルホセート（ｓ
ｕｌｐｈｏｓａｔｅ）またはホサメチン（ｆｏｓａｍｅ
ｔｉｎ）を挙げることができる。これらは実質的に、５
−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシン
ターゼ（ＥＰＳＰＳ，ＥＣ２．５．１．１９）のＰＥＰ
（ホスホエノールピルベート）に対する競合阻害剤とし
て作用する。植物に施用後、これらは植物中に輸送さ
れ、急成長部分、特に幹及び根端に蓄積し、感受性植物
を壊滅するほど劣化させる原因となる。
【０００８】上記生成物の主標的であるＥＰＳＰＳは、
プラスチド分画中に局在する芳香族アミノ酸生合成経路
の酵素である。この酵素は１つ以上の核遺伝子によって
コードされ、細胞質前駆体の形態で合成され、次いでプ
ラスチド中に輸送され、そこに成熟形態で蓄積される。
プラスチド分画中に局在する芳香族アミノ酸生合成経路
の酵素である。この酵素は１つ以上の核遺伝子によって
コードされ、細胞質前駆体の形態で合成され、次いでプ
ラスチド中に輸送され、そこに成熟形態で蓄積される。
【０００９】グリホセート及び該系の生成物に対する植
物の耐性は、遺伝子産物のグリホセート阻害特性に関し
て突然変異しているまたはしていない植物または細菌起
源のＥＰＳＰＳ遺伝子をゲノム中に安定導入することに
より得られる。グリホセートの作用態様を鑑み、プラス
チド中、更に生成物が蓄積する植物の急成長領域中に高
度に蓄積し得るようこの遺伝子の翻訳産物を発現し得る
ことが有利である。
物の耐性は、遺伝子産物のグリホセート阻害特性に関し
て突然変異しているまたはしていない植物または細菌起
源のＥＰＳＰＳ遺伝子をゲノム中に安定導入することに
より得られる。グリホセートの作用態様を鑑み、プラス
チド中、更に生成物が蓄積する植物の急成長領域中に高
度に蓄積し得るようこの遺伝子の翻訳産物を発現し得る
ことが有利である。
【００１０】例えば米国特許第４，５３５，０６０号に
よれば、酵素をプラスチド分画中に局在した後、この酵
素を競合阻害物質（グリホセート）に対してより耐性に
する少なくとも１つの突然変異を有するＥＰＳＰＳをコ
ードする遺伝子を、植物のゲノム中に導入することによ
り、上記タイプの除草剤、特にＮ−ホスホノメチルグリ
シンまたはグリホセートに対する耐性を植物に与えられ
ることが知られている。しかしながらかかる方法は、農
業条件下でかかる生成物を用いて処理したとき、かかる
植物を使用することにおいてより高い信頼性を与えるよ
うに改善される必要がある。
よれば、酵素をプラスチド分画中に局在した後、この酵
素を競合阻害物質（グリホセート）に対してより耐性に
する少なくとも１つの突然変異を有するＥＰＳＰＳをコ
ードする遺伝子を、植物のゲノム中に導入することによ
り、上記タイプの除草剤、特にＮ−ホスホノメチルグリ
シンまたはグリホセートに対する耐性を植物に与えられ
ることが知られている。しかしながらかかる方法は、農
業条件下でかかる生成物を用いて処理したとき、かかる
植物を使用することにおいてより高い信頼性を与えるよ
うに改善される必要がある。
【００１１】本明細書において“植物”とは、光合成し
得る任意の分化多細胞有機体を意味し、“植物細胞”と
は、植物から誘導されるもので、カルスのごとき未分化
組織、或いは胚もしくは植物部分、植物または種子のご
とき分化組織を構成し得る任意の細胞を意味すると理解
されたい。“ターミネーター領域”なる用語は、コーデ
ィング部分の下流に位置し、被転写遺伝子の構造部分に
対応する可変長の単離ＤＮＡ配列を意味すると理解され
たい。除草剤耐性遺伝子とは、除草剤による阻害特性に
関して１つ以上の突然変異を有するか又は有さない除草
剤の標的酵素、または植物に対して不活性または無毒性
の化合物に除草剤を変換し得る酵素をコードする任意系
統起源の任意の遺伝子を意味すると理解されたい。植物
の急成長領域とは、実質的な細胞複製部位である領域、
特に頂端領域を意味すると理解されたい。
得る任意の分化多細胞有機体を意味し、“植物細胞”と
は、植物から誘導されるもので、カルスのごとき未分化
組織、或いは胚もしくは植物部分、植物または種子のご
とき分化組織を構成し得る任意の細胞を意味すると理解
されたい。“ターミネーター領域”なる用語は、コーデ
ィング部分の下流に位置し、被転写遺伝子の構造部分に
対応する可変長の単離ＤＮＡ配列を意味すると理解され
たい。除草剤耐性遺伝子とは、除草剤による阻害特性に
関して１つ以上の突然変異を有するか又は有さない除草
剤の標的酵素、または植物に対して不活性または無毒性
の化合物に除草剤を変換し得る酵素をコードする任意系
統起源の任意の遺伝子を意味すると理解されたい。植物
の急成長領域とは、実質的な細胞複製部位である領域、
特に頂端領域を意味すると理解されたい。
【００１２】本発明は、除草剤耐性遺伝子を含む新規キ
メラ遺伝子によって形質転換された細胞を再生すること
により、処理された植物の急成長領域に蓄積する除草剤
に対し特に高い耐性を有する形質転換植物を生産するこ
とに係わる。更に本発明は、ホスホノメチルグリシン系
除草剤耐性遺伝子を含む新規キメラ遺伝子によって形質
転換された細胞を再生することにより、前記除草剤に対
して高い耐性を有する形質転換植物を生産することにも
係わる。本発明は、上記新規のキメラ遺伝子、植物の急
成長部分における優れた耐性の故により耐性のある形質
転換植物、かかる形質転換植物を使用する交雑から誘導
される植物にも係わる。本発明は更に、上記キメラ遺伝
子を構築するための新規のターミネーター領域にも係わ
る。
メラ遺伝子によって形質転換された細胞を再生すること
により、処理された植物の急成長領域に蓄積する除草剤
に対し特に高い耐性を有する形質転換植物を生産するこ
とに係わる。更に本発明は、ホスホノメチルグリシン系
除草剤耐性遺伝子を含む新規キメラ遺伝子によって形質
転換された細胞を再生することにより、前記除草剤に対
して高い耐性を有する形質転換植物を生産することにも
係わる。本発明は、上記新規のキメラ遺伝子、植物の急
成長部分における優れた耐性の故により耐性のある形質
転換植物、かかる形質転換植物を使用する交雑から誘導
される植物にも係わる。本発明は更に、上記キメラ遺伝
子を構築するための新規のターミネーター領域にも係わ
る。
【００１３】特に本発明は、ＥＰＳＰＳを標的とする除
草剤に対する特に高い耐性を植物に与えるためのキメラ
遺伝子であって、転写方向で、プロモーター領域、トラ
ンジットペプチド領域、ホスホノメチルグリシン系生成
物に対する耐性のための酵素をコードする配列、及びタ
ーミネーター領域を含み、前記ターミネーター領域が、
それが誘導された遺伝子の当初向きに対して任意の向き
の、植物ヒストン遺伝子のターミネーター領域のフラグ
メントからなり、前記除草剤が蓄積する領域における除
草剤耐性のためのタンパク質の優先的な発現及び蓄積を
可能にすることを特徴とするキメラ遺伝子を提供する。
草剤に対する特に高い耐性を植物に与えるためのキメラ
遺伝子であって、転写方向で、プロモーター領域、トラ
ンジットペプチド領域、ホスホノメチルグリシン系生成
物に対する耐性のための酵素をコードする配列、及びタ
ーミネーター領域を含み、前記ターミネーター領域が、
それが誘導された遺伝子の当初向きに対して任意の向き
の、植物ヒストン遺伝子のターミネーター領域のフラグ
メントからなり、前記除草剤が蓄積する領域における除
草剤耐性のためのタンパク質の優先的な発現及び蓄積を
可能にすることを特徴とするキメラ遺伝子を提供する。
【００１４】本発明のターミネーター領域が誘導される
ヒストン遺伝子は、コムギ、トウモロコシまたはコメの
ごとき単子葉植物、好ましくは、アルファルファ、ヒマ
ワリ、ダイズ、アブラナのごとき双子葉植物、より好ま
しくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａから
得られるものである。Ｈ３型または好ましくはＨ４型ヒ
ストン遺伝子を使用するのが好ましい。
ヒストン遺伝子は、コムギ、トウモロコシまたはコメの
ごとき単子葉植物、好ましくは、アルファルファ、ヒマ
ワリ、ダイズ、アブラナのごとき双子葉植物、より好ま
しくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａから
得られるものである。Ｈ３型または好ましくはＨ４型ヒ
ストン遺伝子を使用するのが好ましい。
【００１５】トランジットペプチド領域は、転写方向
で、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子由来の
少なくとも１つのトランジットペプチド、プラスチド局
在酵素をコードする植物遺伝子のＮ末端成熟部分の配列
の一部、更に、プラスチド局在酵素をコードする植物遺
伝子由来の第２のトランジットペプチド、好ましくは欧
州特許出願／ＰＣＴ ５０８ ９０９号に記載のリブロ
ース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オ
キシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）小サブユニット遺伝子
を含む。この特徴的な領域の役割は、成熟ポリペプチド
をプラスチド分画中に最大効率で、好ましくは天然形態
で放出することである。
で、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子由来の
少なくとも１つのトランジットペプチド、プラスチド局
在酵素をコードする植物遺伝子のＮ末端成熟部分の配列
の一部、更に、プラスチド局在酵素をコードする植物遺
伝子由来の第２のトランジットペプチド、好ましくは欧
州特許出願／ＰＣＴ ５０８ ９０９号に記載のリブロ
ース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オ
キシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）小サブユニット遺伝子
を含む。この特徴的な領域の役割は、成熟ポリペプチド
をプラスチド分画中に最大効率で、好ましくは天然形態
で放出することである。
【００１６】本発明のキメラ遺伝子に使用し得るコーデ
ィング配列は、任意系統起源の除草剤耐性遺伝子に由来
する。この配列は特に、ある程度のグリホセート耐性を
有する突然変異ＥＰＳＰＳのものとし得る。
ィング配列は、任意系統起源の除草剤耐性遺伝子に由来
する。この配列は特に、ある程度のグリホセート耐性を
有する突然変異ＥＰＳＰＳのものとし得る。
【００１７】欧州特許出願／ＰＣＴ ５０７ ６９８号
に記載のプロモーター領域は、単独もしくは重複形態
の、または植物において天然に発現される遺伝子と組合
わせた任意起源のものとし得る。植物において天然に発
現される遺伝子としては、例えば細菌起源のもの（ノパ
リンシンターゼ遺伝子）、ウイルス起源のもの（例えば
カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ転写物）、好ま
しくは植物起源のもの（例えばリブロース−１，５−ビ
スホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サ
ブユニット、好ましくは植物ヒストン遺伝子、好ましく
はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）が挙げ
られる。Ｈ３型または好ましくはＨ４型ヒストン遺伝子
を使用するのが好ましい。
に記載のプロモーター領域は、単独もしくは重複形態
の、または植物において天然に発現される遺伝子と組合
わせた任意起源のものとし得る。植物において天然に発
現される遺伝子としては、例えば細菌起源のもの（ノパ
リンシンターゼ遺伝子）、ウイルス起源のもの（例えば
カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ転写物）、好ま
しくは植物起源のもの（例えばリブロース−１，５−ビ
スホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サ
ブユニット、好ましくは植物ヒストン遺伝子、好ましく
はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）が挙げ
られる。Ｈ３型または好ましくはＨ４型ヒストン遺伝子
を使用するのが好ましい。
【００１８】本発明のキメラ遺伝子は、上述の必須部分
に加え、プロモーター領域とコーディング領域の間、及
びコーディング領域とターミネーター領域との間に非翻
訳中間領域（リンカー）を含み得、この非翻訳領域は任
意の系統起源のものとし得る。
に加え、プロモーター領域とコーディング領域の間、及
びコーディング領域とターミネーター領域との間に非翻
訳中間領域（リンカー）を含み得、この非翻訳領域は任
意の系統起源のものとし得る。
【００１９】
【実施例】実施例１：キメラ遺伝子の構築 本発明のキメラ遺伝子を以下のエレメントから出発して
構築した。
構築した。
【００２０】１）ヒストン遺伝子プロモーター：該プロ
モーターを、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎ
ａ，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ種のＨ４Ａ７４８ヒストンク
ローン（Ｍ．Ｅ．Ｃｈａｂｏｕｔｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ ｏｆ Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，ｔｈｅｓｉｓ，１
９８７ 及び Ｍ．Ｅ．Ｃｈａｂｏｕｔｅ ら，（１９
８７） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８，１７９−
１９１）から単離した。単離するために使用したＡｖａ
Ｉ部位間に約９００ｂｐを含むこのプロモーターを、ク
レノウポリメラーゼを使用してＳａｌＩ及びＡｖａＩ突
出末端を充填した後、カタログ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
＃２７−４９４９−０１）において入手可能なｐＵＣＩ
８のＳａｌＩ部位中にサブクローニングした。ｐＵＣＩ
８ポリリンカーのＨｉｎｄIII部位に近いほうにプロモ
ーターの５’末端を有し、ｐＵＣＩ８ポリリンカーのＸ
ｂａＩ部位に近いほうにプロモーターの３’末端を有す
る、得られたサブクローンの１つをあとで使用し、ｐｒ
ｏｍ．Ｈ４Ａ７４８／ＡｖａＩ／ＳａｌＩ−ｐＵＣＩ８
と命名した。
モーターを、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎ
ａ，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ種のＨ４Ａ７４８ヒストンク
ローン（Ｍ．Ｅ．Ｃｈａｂｏｕｔｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ ｏｆ Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，ｔｈｅｓｉｓ，１
９８７ 及び Ｍ．Ｅ．Ｃｈａｂｏｕｔｅ ら，（１９
８７） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８，１７９−
１９１）から単離した。単離するために使用したＡｖａ
Ｉ部位間に約９００ｂｐを含むこのプロモーターを、ク
レノウポリメラーゼを使用してＳａｌＩ及びＡｖａＩ突
出末端を充填した後、カタログ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
＃２７−４９４９−０１）において入手可能なｐＵＣＩ
８のＳａｌＩ部位中にサブクローニングした。ｐＵＣＩ
８ポリリンカーのＨｉｎｄIII部位に近いほうにプロモ
ーターの５’末端を有し、ｐＵＣＩ８ポリリンカーのＸ
ｂａＩ部位に近いほうにプロモーターの３’末端を有す
る、得られたサブクローンの１つをあとで使用し、ｐｒ
ｏｍ．Ｈ４Ａ７４８／ＡｖａＩ／ＳａｌＩ−ｐＵＣＩ８
と命名した。
【００２１】２）トランジットペプチド領域：使用した
２つのトランジットペプチド及び成熟タンパク質エレメ
ントは、組立てと一緒に記載されている（Ｍ．Ｌｅｂｒ
ｕｎら，欧州特許出願／ＰＣＴ ５０８ ９０９号）。
この領域は約３５０ｂｐからなり、最適化トランジット
ペプチド（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｔｒａｎｓｉｔ Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ，ＯＴＰ）と命名した。
２つのトランジットペプチド及び成熟タンパク質エレメ
ントは、組立てと一緒に記載されている（Ｍ．Ｌｅｂｒ
ｕｎら，欧州特許出願／ＰＣＴ ５０８ ９０９号）。
この領域は約３５０ｂｐからなり、最適化トランジット
ペプチド（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｔｒａｎｓｉｔ Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ，ＯＴＰ）と命名した。
【００２２】３）除草剤耐性ＣＴ７遺伝子：これは、Ｓ
ｔａｌｋｅｒら（１９８５） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６０，４７２４−４７２８によって単離された
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｈｙｐｈｙｍｕｒｉｕｍ由来
のＥＰＳＰＳの突然変異ＣＴ７遺伝子（Ｐｒｏ１０１か
らＳｅｒまで）から誘導した。Ｃａｌｇｅｎｅによって
与えられるクローンｐＧＭ３４−２をＸｂａＩを用いて
直線化し、Ｖｉｇｎａｒａｄｉａｔａヌクレアーゼを用
いて処理した。ＳａｍＩで再度切断した後、２つのブラ
ント末端を連結した。得られたクローンは翻訳イニシエ
ーターＡＴＧ上にＮｃｏＩ部位を有すると共に、終結コ
ドンの１７ｂｐ下流にＳａｌＩ部位を有した。このクロ
ーンをｐＲＰＡ−ＢＬ−１０４と命名した。
ｔａｌｋｅｒら（１９８５） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６０，４７２４−４７２８によって単離された
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｈｙｐｈｙｍｕｒｉｕｍ由来
のＥＰＳＰＳの突然変異ＣＴ７遺伝子（Ｐｒｏ１０１か
らＳｅｒまで）から誘導した。Ｃａｌｇｅｎｅによって
与えられるクローンｐＧＭ３４−２をＸｂａＩを用いて
直線化し、Ｖｉｇｎａｒａｄｉａｔａヌクレアーゼを用
いて処理した。ＳａｍＩで再度切断した後、２つのブラ
ント末端を連結した。得られたクローンは翻訳イニシエ
ーターＡＴＧ上にＮｃｏＩ部位を有すると共に、終結コ
ドンの１７ｂｐ下流にＳａｌＩ部位を有した。このクロ
ーンをｐＲＰＡ−ＢＬ−１０４と命名した。
【００２３】４）ＯＴＰ／ＣＴ７融合：ＣＴ７遺伝子と
読取り枠内で融合された最適化トランジットペプチド
（ＯＴＰ）を含む発現カセット（Ｂ．Ｌｅｒｏｕｘら，
欧州特許出願／ＰＣＴ ５０７ ６９８号）をベクター
ｐＢＳII ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ
＃２１２２０６）中にクローニングした。この５’−Ｏ
ＴＰ／ＣＴ７−３’カセットは５’末端にＸｂａＩ、
３’末端にＳｓｔＩ部位を含んでいた。
読取り枠内で融合された最適化トランジットペプチド
（ＯＴＰ）を含む発現カセット（Ｂ．Ｌｅｒｏｕｘら，
欧州特許出願／ＰＣＴ ５０７ ６９８号）をベクター
ｐＢＳII ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ
＃２１２２０６）中にクローニングした。この５’−Ｏ
ＴＰ／ＣＴ７−３’カセットは５’末端にＸｂａＩ、
３’末端にＳｓｔＩ部位を含んでいた。
【００２４】５）ＧＵＳレポーター遺伝子：これは、カ
タログ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ＃６０１７−１）において入
手可能なプラスミドｐＢＩ１０１−Ｉ中に存在するβ−
グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子であ
る。
タログ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ＃６０１７−１）において入
手可能なプラスミドｐＢＩ１０１−Ｉ中に存在するβ−
グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子であ
る。
【００２５】６）ヒストンターミネーター領域：これ
は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来の
Ｈ４Ａ７４８ヒストン遺伝子（Ｍ．Ｅ．Ｃｈａｂｏｕｔ
ｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｒａｓｂｏｕｒ
ｇ，ｔｈｅｓｉｓ，１９８７及び Ｍ．Ｅ．Ｃｈａｂｏ
ｕｔｅ ら，（１９８７） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．８，１７９−１９１）から単離した。６６１ｂｐ
のＳａｕ３ＡＩフラグメントを単離し、クレノウポリメ
ラーゼで処理することによりブラント末端化し、カタロ
グ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ＃２１２２０７）において入
手可能なファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄｅ）ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）II ＫＳ（＋）のＳｍａＩ
部位中にサブクローニングした。このフラグメントの配
列は後述の“配列表”に示す。Ｓ１マッピングによる
と、単離されたフラグメントは、２００ｂｐの５’末端
領域内に元の転写方向で、該遺伝子の転写から誘導され
るｍＲＮＡのポリアデニル化部位の前に存在するものに
対応する配列を含むことが判った。６６１ｂｐの配列の
１６５位にあるヌクレオチドＡが転写物中に存在するポ
リアデニル化末端の付加部位に対応する（Ｃｈａｂｏｕ
ｔｅ Ｍ．Ｅ．ら，（１９８８） Ｇｅｎｅ，７１，２
１７−２２３）。２つのサブクローンを保存し、このう
ちの一方は、ＳｓｔＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの形態
の挿入物をＨ４Ａ７４８遺伝子の元の転写方向の向きで
有しており、ｔ−ｄｉｒｅｃｔＨ４Ａ７４８／Ｓａｕ３
ＡＩ／ＳａｍＩ−ｐＫＳと命名し、他方は、ＳｓｔＩ−
ＥｃｏＲＩフラグメントの形態の挿入物を逆方向に有し
ており、ｔ−ｉｎｖｅｒｓｅＨ４Ａ７４８／Ｓａｕ３Ａ
Ｉ／ＳｍａＩ−ｐＫＳと命名した。
は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来の
Ｈ４Ａ７４８ヒストン遺伝子（Ｍ．Ｅ．Ｃｈａｂｏｕｔ
ｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｒａｓｂｏｕｒ
ｇ，ｔｈｅｓｉｓ，１９８７及び Ｍ．Ｅ．Ｃｈａｂｏ
ｕｔｅ ら，（１９８７） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．８，１７９−１９１）から単離した。６６１ｂｐ
のＳａｕ３ＡＩフラグメントを単離し、クレノウポリメ
ラーゼで処理することによりブラント末端化し、カタロ
グ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ＃２１２２０７）において入
手可能なファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄｅ）ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）II ＫＳ（＋）のＳｍａＩ
部位中にサブクローニングした。このフラグメントの配
列は後述の“配列表”に示す。Ｓ１マッピングによる
と、単離されたフラグメントは、２００ｂｐの５’末端
領域内に元の転写方向で、該遺伝子の転写から誘導され
るｍＲＮＡのポリアデニル化部位の前に存在するものに
対応する配列を含むことが判った。６６１ｂｐの配列の
１６５位にあるヌクレオチドＡが転写物中に存在するポ
リアデニル化末端の付加部位に対応する（Ｃｈａｂｏｕ
ｔｅ Ｍ．Ｅ．ら，（１９８８） Ｇｅｎｅ，７１，２
１７−２２３）。２つのサブクローンを保存し、このう
ちの一方は、ＳｓｔＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの形態
の挿入物をＨ４Ａ７４８遺伝子の元の転写方向の向きで
有しており、ｔ−ｄｉｒｅｃｔＨ４Ａ７４８／Ｓａｕ３
ＡＩ／ＳａｍＩ−ｐＫＳと命名し、他方は、ＳｓｔＩ−
ＥｃｏＲＩフラグメントの形態の挿入物を逆方向に有し
ており、ｔ−ｉｎｖｅｒｓｅＨ４Ａ７４８／Ｓａｕ３Ａ
Ｉ／ＳｍａＩ−ｐＫＳと命名した。
【００２６】遺伝子の元の転写方向におけるＡｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａＨ４Ａ７４８ヒストン
の６６１ｂｐターミネーター領域の配列：
ｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａＨ４Ａ７４８ヒストン
の６６１ｂｐターミネーター領域の配列：
【００２７】
【表１】
【００２８】７）ターミネーター領域“ｎｏｓ”：これ
は、カタログ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ＃６０１７−Ｉ）にお
いて入手可能なプラスミドｐＢＩ１０１−１中に存在す
るｐＴｉ３７のノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子
（Ｂｅｖａｎ Ｍ．ら，（１９８３） Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１１，３６９−３８５）のターミネ
ーター領域のシグナルを含むフラグメントである。
は、カタログ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ＃６０１７−Ｉ）にお
いて入手可能なプラスミドｐＢＩ１０１−１中に存在す
るｐＴｉ３７のノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子
（Ｂｅｖａｎ Ｍ．ら，（１９８３） Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１１，３６９−３８５）のターミネ
ーター領域のシグナルを含むフラグメントである。
【００２９】上記全てのエレメントの組立ては、カタロ
グ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ＃６０１７−１）において入手可
能なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ，ｐＢＩ １０１−１による植物の形質転換のため
の二成分ベクターの骨格構造に基づき、下記の方法にお
いて実施した。
グ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ＃６０１７−１）において入手可
能なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ，ｐＢＩ １０１−１による植物の形質転換のため
の二成分ベクターの骨格構造に基づき、下記の方法にお
いて実施した。
【００３０】ｐＲＡ−１の構築：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＨ４Ａ７４８ヒストンプロ
モーターを、プラスミドｐｒｏｍ．Ｈ４Ａ７４８／Ａｖ
ａＩ／ＳａｌＩ−ｐＵＣ１８から約９００ｂｐのＨｉｎ
ｄIII／ＸｂａＩフラグメントの形態で切り出した。こ
のフラグメントを、ＨｉｎｄIII／ＸｂａＩで消化した
プラスミドｐＢＩ１０１−１中に連結することにより挿
入した。得られた組換えプラスミドは、キメラ遺伝子の
転写方向で、Ｈ４Ａ７４８プロモーター／ＧＵＳ／ｎｏ
ｓターミネーター領域を含み、ｐＲＡ−１と命名した。
ｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＨ４Ａ７４８ヒストンプロ
モーターを、プラスミドｐｒｏｍ．Ｈ４Ａ７４８／Ａｖ
ａＩ／ＳａｌＩ−ｐＵＣ１８から約９００ｂｐのＨｉｎ
ｄIII／ＸｂａＩフラグメントの形態で切り出した。こ
のフラグメントを、ＨｉｎｄIII／ＸｂａＩで消化した
プラスミドｐＢＩ１０１−１中に連結することにより挿
入した。得られた組換えプラスミドは、キメラ遺伝子の
転写方向で、Ｈ４Ａ７４８プロモーター／ＧＵＳ／ｎｏ
ｓターミネーター領域を含み、ｐＲＡ−１と命名した。
【００３１】ｐＲＡ−２の構築：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＨ４Ａ７４８ターミネータ
ー領域をプラスミドｔ−ｄｉｒｅｃｔＨ４Ａ７４８／Ｓ
ａｕ３ＡＩ／ＳｍａＩ−ｐＫＳから約６７０ｂｐのＳｓ
ｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントの形態で切り出した。こ
のフラグメントを、プラスミドｐＲＡ−１をＳｓｔＩ／
ＥｃｏＲＩで消化した後にｎｏｓターミネーター領域と
置換すべく、連結することにより挿入した。得られた組
換えプラスミドは、キメラ遺伝子の転写方向で、Ｈ４Ａ
７４８プロモーター／ＧＵＳ／順方向のＨ４Ａ７４８タ
ーミネーター領域を含み、ｐＲＡ−２と命名した。
ｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＨ４Ａ７４８ターミネータ
ー領域をプラスミドｔ−ｄｉｒｅｃｔＨ４Ａ７４８／Ｓ
ａｕ３ＡＩ／ＳｍａＩ−ｐＫＳから約６７０ｂｐのＳｓ
ｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントの形態で切り出した。こ
のフラグメントを、プラスミドｐＲＡ−１をＳｓｔＩ／
ＥｃｏＲＩで消化した後にｎｏｓターミネーター領域と
置換すべく、連結することにより挿入した。得られた組
換えプラスミドは、キメラ遺伝子の転写方向で、Ｈ４Ａ
７４８プロモーター／ＧＵＳ／順方向のＨ４Ａ７４８タ
ーミネーター領域を含み、ｐＲＡ−２と命名した。
【００３２】ｐＲＡ−３の構築：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＨ４Ａ７４８ターミネータ
ー領域を、プラスミドｔ−ｉｎｖｅｒｓｅＨ４Ａ７４８
／Ｓａｕ３ＡＩ／ＳｍａＩ−ｐＫＳから約６７０ｂｐの
ＳｓｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントの形態で切り出し
た。このフラグメントを、プラスミドｐＲＡ−１をＳｓ
ｔＩ／ＥｃｏＲＩで消化した後にｎｏｓターミネーター
領域と置換すべく、連結することにより挿入した。得ら
れた組換えプラスミドは、キメラ遺伝子の転写方向で、
Ｈ４Ａ７４８プロモーター／ＧＵＳ／逆方向のＨ４Ａ７
４８ターミネーター領域を含み、ｐＲＡ−３と命名し
た。
ｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＨ４Ａ７４８ターミネータ
ー領域を、プラスミドｔ−ｉｎｖｅｒｓｅＨ４Ａ７４８
／Ｓａｕ３ＡＩ／ＳｍａＩ−ｐＫＳから約６７０ｂｐの
ＳｓｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントの形態で切り出し
た。このフラグメントを、プラスミドｐＲＡ−１をＳｓ
ｔＩ／ＥｃｏＲＩで消化した後にｎｏｓターミネーター
領域と置換すべく、連結することにより挿入した。得ら
れた組換えプラスミドは、キメラ遺伝子の転写方向で、
Ｈ４Ａ７４８プロモーター／ＧＵＳ／逆方向のＨ４Ａ７
４８ターミネーター領域を含み、ｐＲＡ−３と命名し
た。
【００３３】ｐＲＰＡ−ＲＤ−１４６の構築：ＯＴＰ／
ＣＴ７を含む約１．７５ｋｂｐのＸｂａＩ／ＳｓｔＩフ
ラグメントを、プラスミドｐＲＡ−１をＸｂａＩ／Ｓｓ
ｔＩで消化した後にＧＵＳ遺伝子と置換すべく、連結す
ることにより挿入した。得られた組換えプラスミドは、
キメラ遺伝子の転写方向で、Ｈ４Ａ７４８プロモーター
／ＯＴＰ／ＣＴ７／ｎｏｓターミネーター領域を含み、
ｐＲＰＡ−ＲＤ−１４６と命名した。
ＣＴ７を含む約１．７５ｋｂｐのＸｂａＩ／ＳｓｔＩフ
ラグメントを、プラスミドｐＲＡ−１をＸｂａＩ／Ｓｓ
ｔＩで消化した後にＧＵＳ遺伝子と置換すべく、連結す
ることにより挿入した。得られた組換えプラスミドは、
キメラ遺伝子の転写方向で、Ｈ４Ａ７４８プロモーター
／ＯＴＰ／ＣＴ７／ｎｏｓターミネーター領域を含み、
ｐＲＰＡ−ＲＤ−１４６と命名した。
【００３４】ｐＲＰＡ−ＲＤ−１４７の構築：ＯＴＰ／
ＣＴ７を含む約１．７５ｋｂｐのＸｂａＩ／ＳｓｔＩフ
ラグメントを、プラスミドｐＲＡ−２をＸｂａＩ／Ｓｓ
ｔＩで消化した後にＧＵＳ遺伝子と置換すべく、連結す
ることにより挿入した。得られた組換えプラスミドは、
キメラ遺伝子の転写方向で、Ｈ４Ａ７４８プロモーター
／ＯＴＰ／ＣＴ７／順方向のＨ４Ａ７４８ターミネータ
ー領域を含み、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１４７と命名した。
ＣＴ７を含む約１．７５ｋｂｐのＸｂａＩ／ＳｓｔＩフ
ラグメントを、プラスミドｐＲＡ−２をＸｂａＩ／Ｓｓ
ｔＩで消化した後にＧＵＳ遺伝子と置換すべく、連結す
ることにより挿入した。得られた組換えプラスミドは、
キメラ遺伝子の転写方向で、Ｈ４Ａ７４８プロモーター
／ＯＴＰ／ＣＴ７／順方向のＨ４Ａ７４８ターミネータ
ー領域を含み、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１４７と命名した。
【００３５】ｐＲＰＡ−ＲＤ−１４８の構築：ＯＴＰ／
ＣＴ７を含む約１．７５ｋｂｐのＸｂａＩ／ＳｓｔＩフ
ラグメントを、プラスミドｐＲＡ−３をＸｂａＩ／Ｓｓ
ｔＩで消化した後にＧＵＳ遺伝子と置換すべく、連結す
ることにより挿入した。得られた組換えプラスミドは、
キメラ遺伝子の転写方向で、Ｈ４Ａ７４８プロモーター
／ＯＴＰ／ＣＴ７／逆方向のＨ４Ａ７４８ターミネータ
ー領域を含み、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１４８と命名した。
ＣＴ７を含む約１．７５ｋｂｐのＸｂａＩ／ＳｓｔＩフ
ラグメントを、プラスミドｐＲＡ−３をＸｂａＩ／Ｓｓ
ｔＩで消化した後にＧＵＳ遺伝子と置換すべく、連結す
ることにより挿入した。得られた組換えプラスミドは、
キメラ遺伝子の転写方向で、Ｈ４Ａ７４８プロモーター
／ＯＴＰ／ＣＴ７／逆方向のＨ４Ａ７４８ターミネータ
ー領域を含み、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１４８と命名した。
【００３６】実施例２：レポーター遺伝子の活性の発現 １）形質転換及び再生 Ｂｅｖａｎ Ｍ．（１９８４） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，１２，８７１１−８７２１によって記載さ
れている方法に従い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ＨＢ１０１において“ヘルパー”プラスミドｐＲＫ２
０１３によって三系交雑（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｃ
ｒｏｓｓｉｎｇ）することにより、カタログ（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ＃６０２７−１）において入手可能なＡｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ
４４０４の非腫瘍原性株中にベクターを導入した。
Ｒｅｓ．，１２，８７１１−８７２１によって記載さ
れている方法に従い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ＨＢ１０１において“ヘルパー”プラスミドｐＲＫ２
０１３によって三系交雑（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｃ
ｒｏｓｓｉｎｇ）することにより、カタログ（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ＃６０２７−１）において入手可能なＡｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ
４４０４の非腫瘍原性株中にベクターを導入した。
【００３７】Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ Ｄ．ら，（１９８
８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８５，５５３６−５５４０に記載の方法に従い、Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｌ．−生態
型Ｃ２４由来の外植根から出発する形質転換方法を実施
した。簡単に述べると、２，４−Ｄ及びカイネチンを補
充したＧａｍｂｏｒｇＢ５培地においてカルスの形成を
誘導するステップ；２ｉＰ及びＩＡＡを補充したＧａｍ
ｂｏｒｇＢ５培地において芽を形成するステップ；及
び、ホルモン非含有ＭＳにおいて発根及び種子形成する
ステップの３つのステップが必要である。
８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８５，５５３６−５５４０に記載の方法に従い、Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｌ．−生態
型Ｃ２４由来の外植根から出発する形質転換方法を実施
した。簡単に述べると、２，４−Ｄ及びカイネチンを補
充したＧａｍｂｏｒｇＢ５培地においてカルスの形成を
誘導するステップ；２ｉＰ及びＩＡＡを補充したＧａｍ
ｂｏｒｇＢ５培地において芽を形成するステップ；及
び、ホルモン非含有ＭＳにおいて発根及び種子形成する
ステップの３つのステップが必要である。
【００３８】２）植物におけるＧＵＳ活性の測定 ａ−組織化学的観察 種々のトランスジェニック植物器官中でのＧＵＳ活性の
解明（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｒ．Ａ．ら，（１９８７）
ＥＭＢＯ Ｊ．，６，３９０１−３９０７）から、構
築物ｐＲＡ−２及び３を用いた場合は分裂組織領域にお
いて優先的発現が保存されていることが判った。更に、
構築物ｐＲＡ−２によると、構築物ｐＲＡ−１を用いて
は見られない活性が、成体組織（葉、根、穂）において
認められ得る。
解明（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｒ．Ａ．ら，（１９８７）
ＥＭＢＯ Ｊ．，６，３９０１−３９０７）から、構
築物ｐＲＡ−２及び３を用いた場合は分裂組織領域にお
いて優先的発現が保存されていることが判った。更に、
構築物ｐＲＡ−２によると、構築物ｐＲＡ−１を用いて
は見られない活性が、成体組織（葉、根、穂）において
認められ得る。
【００３９】ｂ−蛍光測定 構築物ｐＲＡ−１、２及び３の各々に対して個々の形質
転換事象に対応する１２植物由来のロゼット（Ｊｅｆｆ
ｅｒｓｏｎ Ｒ．Ａ．ら，（１９８７） ＥＭＢＯ
Ｊ．，６，３９０１−３９０７）の花芽及び葉の抽出物
において蛍光測定することにより、ＧＵＳ活性を測定し
た。
転換事象に対応する１２植物由来のロゼット（Ｊｅｆｆ
ｅｒｓｏｎ Ｒ．Ａ．ら，（１９８７） ＥＭＢＯ
Ｊ．，６，３９０１−３９０７）の花芽及び葉の抽出物
において蛍光測定することにより、ＧＵＳ活性を測定し
た。
【００４０】累積平均結果（ｐｍｏｌ ＭＵ／分．ｍｇ
ｐｒｏｔ．）を以下に示す。
ｐｒｏｔ．）を以下に示す。
【００４１】構築物 葉（Ｌ） 芽（Ｂ） Ｂ／Ｌ比 ｐＲＡ−１ ８５０．２５ ３９６５．３３ ４．６６ ｐＲＡ−２ ４８９０．６７ ３３６８３．７５ ６．８９ ｐＲＡ−３ ４２１１．７３ ２７７５２．４５ ６．５９ 上記測定値から、順方向または逆方向のＨ４Ａ７４８タ
ーミネーター領域は、特に植物の急成長領域においてキ
メラ遺伝子の発現の活性の上昇を誘導することが明らか
に判る。
ーミネーター領域は、特に植物の急成長領域においてキ
メラ遺伝子の発現の活性の上昇を誘導することが明らか
に判る。
【００４２】実施例３：除草剤に対するトランスジェニ
ック植物の耐性 １）形質転換及び再生 Ｂｅｖａｎ Ｍ．（１９８４） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，１２，８７１１−８７２１に記載されてい
る方法に従い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｈ
Ｂ１０１において“ヘルパー”プラスミドｐＲＫ２０１
３によって三系交雑することにより、カタログ（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ＃６０２７−１）において入手可能なＡｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢ
Ａ ４４０４の非腫瘍原性株中にベクターを導入した。
ック植物の耐性 １）形質転換及び再生 Ｂｅｖａｎ Ｍ．（１９８４） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，１２，８７１１−８７２１に記載されてい
る方法に従い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｈ
Ｂ１０１において“ヘルパー”プラスミドｐＲＫ２０１
３によって三系交雑することにより、カタログ（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ＃６０２７−１）において入手可能なＡｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢ
Ａ ４４０４の非腫瘍原性株中にベクターを導入した。
【００４３】外植タバコ葉から出発する形質転換方法
は、Ｈｏｒｓｈ Ｒ．ら，（１９８５） Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２２７，１２２９−１２３１に記載の方法に基づい
ていた。外植葉からのＰＢＤ６タバコ（供給源ＳＥＩＴ
Ａ−フランス）の再生は、３０ｇ／ｌのサッカロースと
２００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭｕｒａｓｈｉ
ｇｅ及びＳｋｏｏｇ（ＭＳ）基礎培地において次の３つ
の連続ステップにおいて実施した。第１に、０．０５ｍ
ｇのナフチル酢酸（ＮＡＡ）及び２ｍｇ／ｌのベンジル
アミノプリン（ＢＡＰ）を含む３０ｇのサッカロースを
補充したＭＳ培地において苗条を１５日間誘導した。こ
の間に形成された苗条を、次に、３０ｇ／ｌのサッカロ
ースは補充したがホルモンは含まないＭＳ培地において
１０日間培養することにより発育させた。発育した苗条
を採集し、塩、ビタミン及び糖の含有量が半分でありホ
ルモンは含まない、半分に希釈したＭＳ発根培地におい
て培養した。約１５日後、発根した苗条を土壌に植付け
た。
は、Ｈｏｒｓｈ Ｒ．ら，（１９８５） Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２２７，１２２９−１２３１に記載の方法に基づい
ていた。外植葉からのＰＢＤ６タバコ（供給源ＳＥＩＴ
Ａ−フランス）の再生は、３０ｇ／ｌのサッカロースと
２００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭｕｒａｓｈｉ
ｇｅ及びＳｋｏｏｇ（ＭＳ）基礎培地において次の３つ
の連続ステップにおいて実施した。第１に、０．０５ｍ
ｇのナフチル酢酸（ＮＡＡ）及び２ｍｇ／ｌのベンジル
アミノプリン（ＢＡＰ）を含む３０ｇのサッカロースを
補充したＭＳ培地において苗条を１５日間誘導した。こ
の間に形成された苗条を、次に、３０ｇ／ｌのサッカロ
ースは補充したがホルモンは含まないＭＳ培地において
１０日間培養することにより発育させた。発育した苗条
を採集し、塩、ビタミン及び糖の含有量が半分でありホ
ルモンは含まない、半分に希釈したＭＳ発根培地におい
て培養した。約１５日後、発根した苗条を土壌に植付け
た。
【００４４】２）グリホセートに対する耐性の測定 構築物ｐＲＰＡ−ＲＤ−Ａ、Ｂ及びＣの各々に対して２
０の形質転換植物を再生し、温室内に移した。温室内で
これらの植物を、５葉期に、１ヘクタール当たり０．８
ｋｇのグリホセート活性物質に対応するＲｏｕｎｄＵｐ
の水性懸濁液を用いて処理した。処理の３週間後に認め
られる植物毒性値を実測し、これを結果とした。かかる
条件下で、上記構築物によって形質転換された植物は平
均して容認可能な耐性（ｐＲＰＡ−ＲＤ−１４６）また
は場合によっては優れた耐性（ｐＲＰＡ−ＲＤ−１４７
及び１４８）を示すが、非形質転換対照植物は完全に壊
滅することが判った。これらの結果から、本発明のキメ
ラ遺伝子を使用することにより、グリホセートに対する
耐性をコードする同じ遺伝子において改善があったこと
は明らかである。
０の形質転換植物を再生し、温室内に移した。温室内で
これらの植物を、５葉期に、１ヘクタール当たり０．８
ｋｇのグリホセート活性物質に対応するＲｏｕｎｄＵｐ
の水性懸濁液を用いて処理した。処理の３週間後に認め
られる植物毒性値を実測し、これを結果とした。かかる
条件下で、上記構築物によって形質転換された植物は平
均して容認可能な耐性（ｐＲＰＡ−ＲＤ−１４６）また
は場合によっては優れた耐性（ｐＲＰＡ−ＲＤ−１４７
及び１４８）を示すが、非形質転換対照植物は完全に壊
滅することが判った。これらの結果から、本発明のキメ
ラ遺伝子を使用することにより、グリホセートに対する
耐性をコードする同じ遺伝子において改善があったこと
は明らかである。
【００４５】本発明の形質転換植物は、導入されたキメ
ラ遺伝子の発現に対応する表現型を有する系統及びハイ
ブリッドを生産するための親として使用し得る。
ラ遺伝子の発現に対応する表現型を有する系統及びハイ
ブリッドを生産するための親として使用し得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジヨルジユ・フレイスイネ フランス国、69450・サン・スイル・オ・ モン・ドール、リユ・ドウ・ネルビユー、 21 (72)発明者 クロード・ジゴ フランス国、67000・ストラスブール、ブ ルバール・ウイルソン、13・ア (72)発明者 ミシエル・ルブラン フランス国、69009・リヨン、リユ・ド ウ・サン−スイル、224
Claims (28)
- 【請求項１】 植物の形質転換に使用し得るキメラ遺伝
子においてターミネーター領域として作用し得る単離Ｄ
ＮＡ配列であって、前記キメラ遺伝子の転写方向におい
て、特に植物の急成長領域において該キメラ遺伝子の翻
訳産物の発現を可能にする、植物ヒストン遺伝子の少な
くとも１つのターミネーター領域を含むことを特徴とす
るＤＮＡ配列。 - 【請求項２】 前記ターミネーター領域が、前記キメラ
遺伝子の転写方向において、それが誘導された遺伝子の
転写方向である当初向きに対して順方向または逆方向を
向いていることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ配
列。 - 【請求項３】 前記ヒストンターミネーター領域が双子
葉植物から得られることを特徴とする請求項１または２
に記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項４】 前記ヒストンターミネーター領域が、Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａから得られるこ
とを特徴とする請求項３に記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項５】 前記ヒストンターミネーター領域が単子
葉植物から得られることを特徴とする請求項１または２
に記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項６】 前記ヒストンターミネーター領域が、Ｚ
ｅａ ｍａｙｓから得られることを特徴とする請求項５
に記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項７】 前記ヒストンターミネーター領域がＨ４
植物ヒストン遺伝子から得られることを特徴とする請求
項１から６のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項８】 前記ヒストンターミネーター領域がＨ３
植物ヒストン遺伝子から得られることを特徴とする請求
項１から６のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項９】 前記ターミネーター領域が幾つかの関連
ターミネーター領域エレメントを含むことを特徴とする
請求項１から８のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項１０】 前記ターミネーター領域が、植物中で
天然に発現され得る遺伝子のターミネーター領域と一緒
に、ヒストン遺伝子ターミネーター領域を含むことを特
徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載のＤＮＡ
配列。 - 【請求項１１】 植物における除草剤蓄積領域におい
て、除草剤耐性遺伝子産物の発現を可能にすることを特
徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載のＤＮ
Ａ配列。 - 【請求項１２】 転写方向で、プロモーター領域と除草
剤耐性遺伝子配列とターミネーター配列とを少なくとも
含む植物の形質転換のためのキメラ遺伝子であって、前
記ターミネーター領域が請求項１から１１のいずれか一
項に記載の配列を含むことを特徴とするキメラ遺伝子。 - 【請求項１３】 前記プロモーター領域が、植物ヒスト
ン遺伝子プロモーターから得られることを特徴とする請
求項１２に記載のキメラ遺伝子。 - 【請求項１４】 前記プロモーター領域が、前記ターミ
ネーター領域と同じ植物ヒストン遺伝子から得られるこ
とを特徴とする請求項１２または１３に記載のキメラ遺
伝子。 - 【請求項１５】 前記プロモーター領域が重複植物ヒス
トンプロモーターを含むことを特徴とする請求項１２か
ら１４のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子。 - 【請求項１６】 前記プロモーター領域が、植物におい
て天然に発現され得る遺伝子から誘導された異なるプロ
モーターと一緒に、少なくとも１つの植物ヒストン遺伝
子のプロモーターを含むことを特徴とする請求項１２か
ら１５のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子。 - 【請求項１７】 コーディング遺伝子が、除草剤に対す
る高い耐性を植物に付与し得ることを特徴とする請求項
１２から１６のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子。 - 【請求項１８】 前記除草剤耐性遺伝子が、前記除草剤
耐性遺伝子の翻訳産物の細胞分画内蓄積を可能にするト
ランジットペプチド領域をコードするＤＮＡ配列に融合
されていることを特徴とする請求項１７に記載のキメラ
遺伝子。 - 【請求項１９】 前記トランジットペプチド領域が、前
記除草剤耐性遺伝子の翻訳産物のプラスチド分画内蓄積
を可能とすることを特徴とする請求項１８に記載のキメ
ラ遺伝子。 - 【請求項２０】 前記トランジットペプチド領域が、転
写方向で、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子
由来の少なくとも１つのトランジットペプチドと、必要
によってはプラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子
のＮ末端成熟部分の配列の一部と、更に必要によっては
プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子由来の第２
のトランジットペプチドとを含むことを特徴とする請求
項１８に記載のキメラ遺伝子。 - 【請求項２１】 前記除草剤耐性遺伝子が、その標的が
ＥＰＳＰＳである除草剤に対して活性な酵素をコードす
ることを特徴とする請求項１３から２０のいずれか一項
に記載のキメラ遺伝子。 - 【請求項２２】 前記除草剤耐性遺伝子が、グリホセー
トに対して活性な酵素をコードすることを特徴とする請
求項２１に記載のキメラ遺伝子。 - 【請求項２３】 前記除草剤耐性遺伝子が、任意系統起
源のものであることを特徴とする請求項２１に記載のキ
メラ遺伝子。 - 【請求項２４】 請求項１３から２３のいずれか一項に
記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする植物の形質
転換用ベクター。 - 【請求項２５】 請求項２４に記載のベクターを含むこ
とを特徴とするＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の株。 - 【請求項２６】 請求項１２から２３のいずれか一項に
記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする形質転換植
物細胞。 - 【請求項２７】 請求項２６に記載の細胞から得られた
形質転換植物。 - 【請求項２８】 請求項１３から２３のいずれか一項に
記載のキメラ遺伝子を構築する方法であって、請求項１
から９のいずれか一項に記載の植物ヒストン遺伝子由来
のターミネーター領域、少なくとも１つのトランジット
ペプチド領域、少なくとも１つのトランス遺伝子、及び
プロモーター領域をそれぞれ単離し、次いで、これらを
トランス遺伝子の転写方向で組立てることを特徴とする
方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9308029 | 1993-06-25 | ||
| FR9308029A FR2706909B1 (ja) | 1993-06-25 | 1993-06-25 | |
| CNB941076555A CN1253570C (zh) | 1993-06-25 | 1994-06-27 | 分离的在植物转化中可作为嵌合基因终止区的dna顺序 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH078278A true JPH078278A (ja) | 1995-01-13 |
| JP3628723B2 JP3628723B2 (ja) | 2005-03-16 |
Family
ID=36928380
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14348794A Expired - Lifetime JP3628723B2 (ja) | 1993-06-25 | 1994-06-24 | 植物の形質転換に使用し得るキメラ遺伝子においてターミネーター領域として作用し得る単離ｄｎａ配列 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3628723B2 (ja) |
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| AU (1) | AU680899B2 (ja) |
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| ES (1) | ES2236689T3 (ja) |
| FR (1) | FR2706909B1 (ja) |
| IL (1) | IL110069A (ja) |
| ZA (1) | ZA944508B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| HUT76355A (en) * | 1995-11-24 | 1997-08-28 | Bay Zoltan Alkalmazott Kutatas | Plant gene-expression vector family based on dna fragments regulating alfalfa h3 histon gene variant (ms h3g1) |
| FR2815969B1 (fr) | 2000-10-30 | 2004-12-10 | Aventis Cropscience Sa | Plantes tolerantes aux herbicides par contournement de voie metabolique |
| AU2002249270B2 (en) | 2001-02-22 | 2006-07-06 | Biogemma S.A.S. | Constitutive promoter from arabidopsis |
| DE10219983B4 (de) | 2002-05-03 | 2004-03-18 | Bego Medical Ag | Verfahren zum Herstellen von Produkten durch Freiform-Lasersintern |
| FR2848570B1 (fr) | 2002-12-12 | 2005-04-01 | Bayer Cropscience Sa | Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) et plantes tolerantes aux herbicides la contenant |
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| FR2914652B1 (fr) | 2007-04-03 | 2013-01-18 | Librophyt | Genes codant pour z,z-farnesyl diphosphate synthase et une sesquiterpene synthase a produits multiples et leurs utilisations |
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| UY33142A (es) | 2009-12-23 | 2011-07-29 | Bayer Cropscience Ag | Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd |
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| AR080105A1 (es) | 2010-02-02 | 2012-03-14 | Bayer Cropscience Ag | Transformacion de soja usando inhibidores de hidrofenil piruvato dioxigenasa (hppd) como agentes de seleccion |
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-
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