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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Terminatorregionen,
die von transkribierten Pflanzengenen isoliert wurden, neue chimäre Gene,
die sie enthalten, und ihre Verwendung für die Transformation von Pflanzen.
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Zahlreiche
phänotypische
Merkmale, die mit der Expression von einem oder mehreren Genelementen in
Verbindung stehen, können
in das Genom von Pflanzen integriert werden und so diesen transgenen
Pflanzen vorteilhafte agronomische Eigenschaften verleihen. Folgende
können
kurz genannt werden: Resistenzen gegen Pflanzenpathogene, Resistenz
gegen phytotoxische Pflanzenschutzmittel, Produkt von Substanzen, die
für die
Ernährung
von Interesse sind oder von pharmakologisch interessanten Substanzen.
Außer
der Isolierung und Charakterisierung von Genelementen, die für diese
verschiedenen Merkmale codieren, muß eine entsprechende Expression
gewährleistet
sein. Diese entsprechende Expression kann qualitativ oder quantitativ
sein. Bei der qualitativen Expression kann sie zum Beispiel räumlich sein:
eine bevorzugte Expression in einem bestimmten Gewebe; oder sie
kann zeitabhängig
sein: induzierbare Expression. Quantitative Expression: angehäufte Menge
des Expressionsprodukts des eingebrachten Gens. Diese entsprechende
Expression hängt
größtenteils
vom Vorhandensein von regulatorischen Genelementen ab, die mit den
Transgenen in Verbindung stehen, insbesondere was die quantitativen
und qualitativen Elemente betrifft. Bei den wesentlichen Elementen,
die diese entsprechende Regulation gewährleisten, ist. die Verwendung
von homologen oder heterologen, einfachen oder zusammengesetzten
Promoterregionen vielfach in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben
worden. Die Verwendung einer Terminatorregion stromaufwärts von
dem Transgen wurden einzig und allein für den Zweck verwendet, einen
Abschluß einzufügen, mit
dem der Vorgang der Transkription des Transgens gestoppt werden
kann, ohne daß etwas über ihre
Rolle bei der Qualität
der Expression des Transgens oder der Expressionshöhe des Transgens
vorausgesetzt wird.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft chimäre Gene, die Terminatorregionen
von Genen, die in Pflanzen transkribiert werden, enthalten, insbesondere
Terminatorregionen von pflanzlichen Histon-Genen, sowie ihre Verwendung
für die
Transformation von Pflanzen. Genauer gesagt betrifft sie die gemeinsame
Verwendung von Terminatorregionen und Promoterregionen, die auf
ein- und demselben transkribierten Gen von Pflanzen isoliert wurden.
Sie ermöglicht
gleichzeitig die quantitative und qualitative entsprechende Expression
der Transgene unter der Kontrolle dieser Elemente dieser Genregulation.
Diese entsprechende Expression, die durch die Anwendung der vorliegenden
Erfindung erzielt wird, kann Merkmale wie folgende betreffen: Resistenz
gegen Pflanzenpathogene, Resistenz gegen phytotoxische Pflanzenschutzmittel,
Produkt von Substanzen, die für
die Ernährung
von Interesse sind oder von pharmakologisch interessanten Substanzen.
Insbesondere ermöglicht
sie durch eine vorzugsweise qualitative und quantitative Expression
des Expressionsprodukts von chimären
Genen in stark wachsenden Pflanzenregionen den transgenen Pflanzen
eine erhöhte
Herbizidtoleranz zu vermitteln. Diese bestimmte entsprechende Expression
des Herbizidresistenzgens wird dadurch erzielt, das man gemeinsam
Promoterregulationselemente und Terminatorregionselemente des Histon-Gens H4A748
Arabidopsis thaliana verwendet. Solch ein Expressionsprofil kann
für alle
Merkmale, die von Interesse sind, wie den oben beschriebenen Merkmalen,
mit den für
die Verleihung einer erhöhten
Herbizidtoleranz verwendeten Regulationselementen erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die mit diesen Genen transformierten
Pflanzenzellen und die von diesen Zellen regenerierten transformierten
Pflanzen sowie die Pflanzen, die aus Kreuzungen mit diesen transformierten
Pflanzen stammen.
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Unter
den für
den Schutz von Kulturen verwendeten Pflanzenschutzprodukten sind
die systemischen Produkte dadurch gekennzeichnet, das sie nach der
Ausbringung in der Pflanze transportiert werden und das sie in gewissen
Fällen
sich in den Teilen mit raschem Wachstum, insbesondere den Sproß- und Wurzelapices anhäufen, was
bei Herbiziden die Veränderung
bis hin zur Zerstörung
von empfindlichen Pflanzen verursacht. Bei gewissen dieser Herbizide,
die sich derart verhalten, ist der primäre Wirkungsmechanismus bekannt
und beruht auf einer Inaktivierung von charakterisierten Enzymen,
die an den Biosynthesewegen von Verbindungen, die für die gute
Entwicklung der Zielpflanzen erforderlich sind, beteiligt sind.
Die als Angriffspunkt dienenden Enzyme dieser Produkte können in
unterschiedlichen subzellulären
Kompartimenten lokalisiert sein, und durch Beobachtung der Wirkungsweise
von bekannten Produkten erkennt man am häufigsten, daß diese
im Kompartiment der Plastiden lokalisiert sind.
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Die
Toleranz von Pflanzen, die für
ein Produkt, das zu dieser Herbizidgruppe zählt, empfindlich sind und deren
primäres
Ziel bekannt ist, läßt sich
durch ein stabiles Einbringen eines Gens, das für das als Angriffspunkt dienende
Enzym codiert und das beliebigen phylogenetischen Ursprungs ist
und in Bezug auf die Hemmeigenschaften des Expressionsprodukts dieses
Gens durch das Herbizid mutiert oder nicht mutiert ist, in ihr Genom
erzielen. Ein anderer Ansatz besteht darin, das man ein Gen beliebigen
phylogenetischen Ursprungs, das für ein Enzym codiert, das eine
Verstoffwechselung des Herbizids zu einer nicht aktiven Verbindung,
die für
die Entwicklung der Pflanze nicht toxisch ist, zu verursachen vermag,
stabil in das Genom von empfindlichen Pflanzen einbringt. Im letztgenannten
Fall ist es nicht erforderlich, daß der Angriffspunkt des Herbizids
charakterisiert worden ist.
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Bei
einem gegebenen Translokations- und Anhäufungsmodus von Produkten dieser
Art in den behandelnden Pflanzen ist es von Interesse, das Translationsprodukt
dieser Gene exprimieren zu können,
um ihre bevorzugte Expression und ihre Anhäufung in den Regionen der Pflanze
mit raschem Wachstum, wo sich diese Produkte anhäufen, zu gestatten. Weiterhin
ist es in dem Fall, wo der Angriffspunkt dieser Produkte in einem Zellkompartiment,
bei dem es sich nicht um das Zytoplasma handelt, lokalisiert ist,
von Interesse, das Translationsprodukt dieser Gene in Form eines
Vorläufers,
der eine Polypeptidsequenz enthält,
die die Zielsteuerung des Proteins, das die Toleranz vermittelt,
in das entsprechende Kompartiment gestattet, insbesondere in das Kompartiment
der Plastiden, exprimieren zu können.
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Als
Beispiel, das diesen Ansatz veranschaulicht, sind Glyphosate, Sulfosate
oder Fosametine zu nennen, bei denen es sich um systemische Breitbandherbizide
aus der Familie der Phosphonomethylglycine handelt. Sie wirken im
wesentlichen als kompetitive Hemmer von PEP (Phosphoenolpyruvat)
der 5-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphat-Synthase
(EPSPS, EC 2.5.1.19). Nach ihrer Ausbringung auf die Pflanze werden
sie in die Pflanze transportiert, wo sie sich in Teilen mit raschem
Wachstum, insbesondere den Sproß-
und Wurzelapices, anhäufen
und zu einer Veränderung
bis hin zur Zerstörung
von empfindlichen Pflanzen führen.
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Die
EPSPS, der Hauptangriffspunkt dieser Produkte, ist ein Enzym des
aromatischen Aminosäure-Biosynthesewegs,
der in dem Kompartiment der Plastiden lokalisiert ist. Dieses Enzym
wird von einem oder mehreren im Kern befindlichen Genen codiert
und in Form eines zytoplasmischen Vorläufers synthetisiert, der anschließend in
die Plastiden importiert wird, wo er sich in seiner reifen Form
anhäuft.
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Eine
Toleranz von Pflanzen gegenüber
Glyphosate und Produkten dieser Familie wird dadurch erzielt, das
man ein EPSPS-Gen pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs, das
in bezug auf die Merkmale der Hemmung des Produkts dieses Gens durch
Glyphosate mutiert oder nicht mutiert ist, stabil in das Genom dieser Pflanzen
einbringt. Bei dem gegebenen Wirkungsmodus von Glyphosate ist es
von Interesse, das Produkt der Translation dieses Gens exprimieren
zu können,
um seine starke Anhäufung
in den Plastiden und auch in den Regionen der Pflanze mit raschem
Wachstum, wo sich die Produkte anhäufen, zu gestatten.
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So
ist zum Beispiel aus dem Amerikanischen Patent 4,535,060 bekannt,
einer Pflanze eine Toleranz gegen ein Herbizid des oben genannten
Typs, insbesondere N-Phosphonomethylglycin oder Glyphosate, dadurch
zu verleihen, das man ein Gen, das für eine EPSPS codiert, die mindestens
eine Mutation trägt,
die dieses Enzym nach Lokalisierung des Enzyms in dem Kompartiment
der Plastiden stärker
resistent gegen seinen kompetitiven Hemmer (Glyphosate) macht, in
das Genom von Pflanzen einbringt. Diese Techniken müssen jedoch
noch verbessert werden, um eine bessere Verläßlichkeit bei der Verwendung
von diesen Pflanzen bei Behandlung mit diesen Produkten unter agronomischen
Bedingungen zu gewährleisten.
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In
der vorliegenden Erfindung versteht man unter „Pflanze" jeglichen differenzierten mehrzelligen
Organismus, der zur Photosynthese befähigt ist, und unter „pflanzlicher
Zelle" jegliche
Zelle, die von einer Pflanze stammt und die undifferenzierte Gewebe
wie Kalli oder differenzierte Gewebe wie Embryonen oder Pflanzenteile
oder Pflanzen oder Samen darstellen kann.
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Unter „Terminatorregion" versteht man eine
isolierte DNA-Sequenz mit unterschiedlicher Länge, die sich stromaufwärts von
einer Codierregion befindet und die das Ende der Transkription signalisiert.
Unter Gen für
Toleranz gegen ein Herbizid versteht man jegliches Gen eines beliebigen
phylogenetischen Ursprungs, das entweder für das für das Herbizid als Angriffspunkt
dienende Enzym, das eine oder mehrere Mutationen in bezug auf die
Eigenschaften der Hemmung durch das Herbizid aufweist oder nicht
mutiert ist, oder für
ein Enzym, das zur Verstoffwechselung des Herbizids zu einer nicht
aktiven Verbindung, die für
die Pflanze nicht toxisch ist, fähig
ist, codiert. Unter Regionen der Pflanze mit raschem Wachstum versteht
man diejenigen Regionen, wo eine starke Zellteilungsaktivität vorliegt,
insbesondere die Regionen der Sproßspitze.
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Die
vorliegende Erfindung betriff die Herstellung von transformierten
Pflanzen, die insbesondere eine erhöhte Toleranz gegen Herbizide,
die sich in den Regionen mit raschem Wachstum bei den behandelten Pflanzen
anhäufen,
aufweisen, und zwar dadurch, das man die mit Hilfe von neuen chimären Genen,
die ein Gen für
Toleranz gegen diese Produkte umfassen, transformierte Zellen regeneriert.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Herstellung von transformierten
Pflanzen mit einer erhöhten
Toleranz gegen Herbizide der Familie der Phosphonomethylglycine,
und zwar dadurch, das man die mit Hilfe von neuen chimären Genen,
die ein Gen für
Toleranz gegen diese Herbizide umfassen, transformierten Zellen
regeneriert. Die Erfindung betrifft außerdem diese neuen chimären Gene,
sowie transformierte Pflanzen, die in bezug auf eine bessere Toleranz in
den Teilen mit starkem Wachstum bei diesen Pflanzen toleranter sind,
sowie die Pflanzen, die aus Kreuzungen mit diesen transformierten
Pflanzen hervorgehen. Genauer gesagt betrifft die Erfindung ein
chimäres
Gen, das in Transkriptionsrichtung eine Promoterregion, eine Sequenz,
die für
ein interessierendes agronomisches Protein codiert, und eine Terminatorregion
umfaßt,
dadurch gekennzeichnet, daß es
sich bei der Terminatorregion um eine Terminatorregion eines pflanzlichen
Histon-Gens handelt.
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Gemäß einer
bestimmten Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein chimäres
Gen dafür,
daß Pflanzen insbesondere
eine erhöhte
Toleranz gegen ein Herbizid, dessen Angriffspunkt die EPSPS ist,
verliehen wird wobei das Gen in Transkriptionsrichtung eine Promoterregion,
eine Transitpeptidregion, eine Sequenz, die für ein Enzym für Toleranz
gegenüber
Produkten der Familie der Phosphonomethylglycine codiert, sowie
eine Terminatorregion enthält,
dadurch gekennzeichnet, daß die
Terminatorregion aus einem Fragment einer Terminatorregion eines
pflanzlichen Histon-Gens in beliebiger Orientierung in bezug auf
ihre ursprüngliche
Orientierung in dem Gen, von dem sie abstammt, besteht, wodurch
die bevorzugte Expression und Anhäufung des Herbizidtoleranzproteins
in den Zonen, in denen das Herbizid angehäuft wird, gestattet wird.
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Das
Histon-Gen, von dem die erfindungsgemäße Terminatorregion stammt,
stammt von einer monokotylen Pflanze wie zum Beispiel Weizen, Mais
oder Reis oder vorzugsweise von einer dikotylen Pflanze wie zum
Beispiel Luzerne, Sonnenblume, Sojabohne, Raps oder vorzugsweise
Arabidopsis thaliana. Vorzugsweise verwendet man ein Histon-Gen
des H3-Typs oder vorzugsweise des H4-Typs.
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Die
Transitpeptidregion umfaßt
in Transkriptionsrichtung mindestens ein Transitpeptid eines pflanzlichen
Gens, das für
ein plastidär
lokalisiertes Enzym codiert, einen Teil der Sequenz des reifen N-terminalen Abschnitts
eines pflanzlichen Gens, das für
ein plastidär
lokalisiertes Enzym codiert, sowie ein zweites Transitpeptid eines
pflanzlichen Gens, das für
ein plastidär
lokalisiertes Enzym codiert, vorzugsweise das Gen der kleinen Untereinheit
der Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (RuBisCO) gemäß der Europäischen Patentanmeldung
508 909. Aufgabe dieser charakteristischen Region ist es, die Abgabe
eines reifen Polypeptids mit maximaler Wirksamkeit, vorzugsweise
in nativer Form, in das Kompartiment der Plastiden zu gestatten.
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Die
Codiersequenz, die bei dem erfindungsgemäßen chimären Gen verwendet werden kann,
stammt von einem Herbizidtoleranzgen beliebigen phylogenetischen
Ursprungs. Bei dieser Sequenz kann es sich insbesondere um die mutierte
EPSPS-Sequenz mit einem gewissen Grad an Toleranz gegenüber Glyphosate handeln.
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Die
Promoterregion gemäß der Europäischen Patentanmeldung
507 698 kann beliebigen Ursprungs sein, in einfacher oder duplizierter
Form oder in Form einer Kombination mit einem Gen, das natürlicherweise in
den Pflanzen exprimiert wird, vorliegen, das heißt sie kann zum Beispiel bakteriellen
Ursprungs sein, wie diejenige des Nopalinsynthasegens, oder viralen
Ursprungs sein, wie diejenige des 35S-Transkripts des Blumenkohlmosaikvirus,
oder vorzugsweise pflanzlichen Ursprungs sein, wie diejenige der
kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase,
oder vorzugsweise wie diejenige eines pflanzlichen Histon-Gens,
vorzugsweise von Arabidopsis thaliana. Vorzugsweise verwendet man
ein Histon-Gen des Typs H3 oder vorzugsweise des Typs H4.
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Das
erfindungsgemäße chimäre Gen kann
zusätzlich
zu den essentiellen oben genannten Teilen eine nicht translatierte
Zwischenregion (Linker) zwischen der Promoterregion und der Codierregion
sowie zwischen der Codierregion und der Terminatorregion umfassen,
die beliebigen phylogenetischen Ursprungs sein kann.
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BEISPIEL 1: Konstruktion
von chimären
Genen
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Erfindungsgemäße chimäre Gene
werden mit folgenden Elementen konstruiert:
- 1)
Histongenpromoter: Der Promoter wird aus einem Histonklon mit der
Bezeichnung H4A748 von Arabidopsis thaliana, Rasse Strasbourg (M.
E. Chaboute, Doktorarbeit der Universität Strasbourg, 1987, und M. E.
Chaboute et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8, 179–191) isoliert. Dieser Promoter,
der ungefähr
900 Bp zwischen den für
seine Isolierung verwendeten AvaI-Stellen umfaßt, wurde nach Auffüllen der
SalI- und AvaI-Überhänge mit
Klenow-Polymerase
in die per Katalog (Pharmacia Nr. 27-4949-01) erhältliche SalI-Stelle von pUC18
subkloniert. Einer der erhaltenen Subklone, dessen 5'-Ende des Promoters
in der Nähe der
HindIII-Stelle des Polylinkers von pUC18 und das 3'-Ende des Promoters
in der Nähe
der XbaI-Stelle des Polylinkers von pUC18 aufweist, wurde für die folgenden
Arbeiten verwendet und erhält
die folgende Bezeichnung: prom. H4A748/AvaI/SalI-pUC18.
- 2) Transitpeptidregion: Die beiden verwendeten Transitpeptide
und die verwendeten reifen Proteinelemente sowie ihr Zusammenbau
sind beschrieben worden (M. Lebrun et al., Europäische Patentanmeldung 508 909).
Diese Region umfaßt
ungefähr
350 Bp und erhält
die Bezeichnung Optimiertes Transitpetid (OTP).
- 3) Herbizidtoleranzgen CT7: Dieses stammt von dem mutierten
Gen CT7 (Pro101 → Ser)
der von Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem., 260, 4724–4728 isolierten
EPSPS aus Salmonella typhimurium. Der Klon pGM34-2, der von Calgene
stammt, wurde mit XbaI linearisiert und anschließend mit Vigna radiata-Nuklease
behandelt. Nach erneutem Schneiden mit SmaI wurden die beiden stumpfen
Enden ligiert. Der erhaltene Klon besitzt eine NcoI-Stelle auf dem
Translationsinitiator ATG sowie eine 17 Bp große SalI-Stelle stromaufwärts des
Stop-Codons. Dieser
Klon erhielt die Bezeichnung pRPA-BL-104.
- 4) Fusion TPO/CT7: Eine Expressionskassette, die das optimierte
Transitpeptid (OTP) leserastergerecht in Fusion mit dem CT7-Gen
enthält
(B. Leroux et al., Europäische
Patentanmeldung 507 698), wird in den Vektor pBSII SK(–) (Katalog
Stratagene Nr. 212206) kloniert. Diese Kassette 5'-TPO/CT7-3' enthält an ihrem
5'-Ende eine XbaI-Stelle
und an ihrem 3'-Ende
eine SstI-Stelle.
- 5) GUS-Reportergen: Es handelt sich um das Gen, das für die β-Glucuronidase
(GUS) codiert und das in dem über
Katalog (Clontech Nr. 6017-1) erhältlichen Plasmid pBl 101-1
vorliegt.
- 6) Histon-Terminatorregion: Diese wird von dem Histon-Gen H4A748 aus Arabidopsis
thaliana (M. E. Chaboute, Doktorarbeit der Universität Strasbourg,
1987, und M. E. Chaboute et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8, 179–191) isoliert.
Es wurde ein 661 Bp großes
Sau3AI-Fragment isoliert, durch Behandlung mit Klenow-Polymerase
stumpfendig gemacht und in die SmaI-Stelle des Phasmids pBluescript® II
KS(+), das über
Katalog erhältlich
ist (Stratagene Nr. 212207, Short et al., 1988, Nucleic Acid Research
16(15), 7583–7600)
subkloniert. Die Sequenz dieses Fragments ist unten in dem Abschnitt „Sequenzbeschreibung" dargestellt. Durch
S1-Kartierung wurde gezeigt, das dieses isolierte Fragment innerhalb
einer 200 Bp großen
Region ihres 5'-Endes
in ursprünglicher
Transkriptionsrichtung die Sequenz enthält, die der Sequenz vor der mRNA-Polyadenilierungsstelle,
die von der Transkription dieses Gens stammt, entspricht. Das Nukleotid
A in Position 165 der 661 Bp großen Sequenz entsprechend der
Stelle der Hinzufügung
des polyadenilierten Endes liegt auf dem Transkript vor (Chaboute
M. E. et al. (1988) Gene, 71, 217–223). Es wurden zwei Subklone
zurückbehalten,
von denen der eine das in der ursprünglichen Transkriptionsrichtung
des Gens H4A748 vorliegende Insert in Form eines SstI-EcoRI-Fragments-
mit der Bezeichnung t-directH4A748/Sau3AI/SmaI-pKS-
und der andere in umgekehrter Richtung in Form eines SstI-EcoRI-Fragments- mit der
Bezeichnung t-inverseH4A748/Sau3AI/SmaI-pKS- aufweist. Die
661 Bp lange Sequenz der Histon-Terminatorregion H4A748 von Arabidopsis
thaliana in der ursprünglichen
Transkriptionsrichtung des Gens:
- 7) „nos"-Terminatorregion:
Es handelt sich um das Fragment, das das Terminatorregionssignal
des Nopalinsynthasegens (nos) von pTi37 (Bevan M. et al. (1983)
Nucl. Acids Res., 11, 369–385)
enthält,
das auf dem Plasmid pBl 101-1, das über Katalog erhältlich ist
(Clontech Nr. 6017-1), vorliegt.
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Der
Zusammenbau von allen diesen Elementen erfolgte folgendermaßen auf
Grundlage des Skeletts des Binärenvektors
für die
Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens, pBl
101-1, der über
Katalog erhältlich
ist (Clontech Nr. 6017-1).
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Konstruktion von pRA-1:
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Der
Histonpromoter H4A748 von Arabidopsis thaliana wurde von dem Plasmid
prom.H4A748/AvaI/SalI-pUC18 in Form des ungefähr 900 Bp großen HindIII/XbaI-Fragments
herausgeschnitten. Dieses Fragment wurde durch Ligation in das mit
HindIII/XbaI verdaute Plasmid pBl 101-1 insertiert. Das erhaltene
rekombinante Plasmid enthält
in Transkriptionsrichtung des chimären Gens: Promoter H4A748/GUS/nos-Terminatorregion und
erhielt die Bezeichnung pRA-1.
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Konstruktion von pRA-2:
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Die
Terminatorregion H4A748 von Arabidopsis thaliana wurde in Form eines
ungefähr
670 Bp großen SstI-EcoRI-Fragments aus dem
Plasmid t-directH4A748/Sau3AI/SmaI-pKS herausgeschnitten. Dieses Fragment
wurde mittels Ligation durch Ersetzen der nos-Terminatorregion nach
Verdau des Plasmids pRA-1 mit SstI-EcoRI insertiert. Das erhaltene
rekombinante Plasmid enthält
in Transkriptionsrichtung des chimären Gens: Promoter H4A748/GUS/Terminatorregion
H4A748 in direkter Orientierung und erhielt die Bezeichnung pRA2.
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Konstruktion von pRA3.
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Die
Terminatorregion H4A748 von Arabidopsis thaliana wurde in Form eines
ungefähr
670 Bp großen SstI-EcoRI-Fragments aus dem
Plasmid t-inverseH4A748/Sau3AI/SmaI-pKS herausgeschnitten. Dieses Fragment
wurde mittels Ligation durch Ersetzen der nos-Terminatorregion nach
Verdau des Plasmids pRA-1 mit SstI-EcoRI insertiert. Das erhaltene
rekombinante Plasmid enthält
in Transkriptionsrichtung des chimären Gens: Promoter H4A748/GUS/Terminatorregion
H4A748 in umgekehrter Orientierung und erhielt die Bezeichnung pRA3.
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Konstruktion von pRPA-RD-146:
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Das
ungefähr
1,75 k Bp große
XbaI/SstI-Fragment, das OPT/CT7 enthält, wurde durch Ligation durch Ersetzen
des GUS-Gens nach Verdau des Plasmids pRA-1 mit XbaI/SstI insertiert.
Das erhaltene rekombinante Plasmid enthält in der Transkriptionsrichtung
des chimären
Gens: Promoter H4A748/OPT/CT7/nos-Terminatorregion und erhielt die
Bezeichnung pRPA-RD-146.
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Konstruktion von pRPA-RD-147:
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Das
ungefähr
1,75 k Bp große
XbaI/SstI-Fragment, das OPT/CT7 enthält, wurde durch Ligation durch Ersetzen
des GUS-Gens nach Verdau des Plasmids pRA-2 mit XbaI/SstI insertiert.
Das erhaltene rekombinante Plasmid enthält in der Transkriptionsrichtung
des chimären
Gens: Promoter H4A748/OPT/CT7/Terminatorregion H4A748 in direkter
Orientierung und erhielt die Bezeichnung pRPA-RD-147.
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Konstruktion von pRPA-RD-148:
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Das
ungefähr
1,75 k Bp große
XbaI/SstI-Fragment, das OPT/CT7 enthält, wurde durch Ligation durch Ersetzen
des GUS-Gens nach Verdau des Plasmids pRA-3 mit XbaI/SstI insertiert.
Das erhaltene rekombinante Plasmid enthält in der Transkriptionsrichtung
des chimären
Gens: Promoter H4A748/OPT/CT7/Terminatorregion H4A748 in umgekehrter
Orientierung und erhielt die Bezeichnung pRPA-RD-148.
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BEISPIEL 2: Expression
der Aktivität
eines Reportergens
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1) Transformation und
Regeneration
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Der
Vektor wird in der über
Katalog (Clontech Nr. 6027-1) erhaltenen nicht onkogenen Agrobacterium tumefaciens-Stamm
LBA 4404 dadurch eingeführt,
daß man
eine Drei-Eltern-Kreuzung mit Hilfe des „helper"-Plasmids
pRK 2013 in Escherichia coli HB101 nach dem von Bevan M. (1984)
Nucl. Acids Res., 12, 8711–8721
beschriebenen Verfahren durchführt.
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Die
von Wurzelexplantaten von Arabidopsis thaliana L. Ökotyp C24
ausgehende Transformationstechnik wurde nach dem von Valvekens D.
et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85, 5536–5540 beschriebenen Verfahren
durchgeführt.
Kurzgesagt sind drei Schritte erforderlich: die Induktion der Kallusbildung
auf Gamborgs B5-Medium und mit Zusatz von 2,4-D und Kinetin, die
Bildung von Knospen auf Gamborgs B5-Medium mit einem Zusatz von
2iP und IAA, und die Bewurzelung und Samenbildung auf MS ohne Hormone.
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2) Bestimmung der GUS-Aktivität in den
Pflanzen
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a – Histochemische Beobachtungen
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Der
Nachweis von GUS-Aktivität
(Jefferson R. A. et al. (1987) EMBO J. 6, 3901–3907) an unterschiedlichen
Organen von transgenen Pflanzen zeigt, daß die bevorzugte Expression
in den Meristemregionen mit den Konstrukten pRA-2 und 3 erhalten
bleibt. Weiter läßt sich
mit dem Konstrukt pRA-2 eine Aktivität in den ausgewachsenen Geweben
(Blättern,
Wurzeln, Blütenstielen)
beobachten, eine Aktivität,
die mit dem Konstrukt pRA-1 nicht aufscheint.
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b – Fluorimetrische Messungen
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Die
GUS-Aktivität
wurde fluorimetrisch an Blütenknospenextrakten
und Extrakten der Rosettenblätter (Jefferson
R. A. et. Al. (1987) EMBO J., 6, 3901–3907) an zwölf Pflanzen,
die einzelnen Transformationsereignissen entsprechen, gemessen,
und zwar für
jedes Konstrukt pRA-1, 2 und 3.
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Die
in pmol MU/min. mg Protein berechneten durchschnittlichen Ergebnisse
lauten folgendermaßen:
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Diese
Meßergebnisse
zeigen deutlich, daß die Terminatorregion
H4A748 in direkter oder umgekehrter Richtung zu einer Erhöhung der
Expressionsaktivität
des chimären
Gens, insbesondere in den Pflanzenregionen mit raschem Wachstum,
führt.
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BEISPIEL 3: Toleranz von
transgenen Pflanzen gegenüber
einem Herbizid
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1) Transformation und
Regeneration
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Der
Vektor wird in den über
Katalog (Clontech Nr. 6027-1) erhaltenen nicht onkogenen Agrobacterium tumefaciens-Stamm
LBA 4404 dadurch eingeführt,
daß man
eine Drei-Eltern-Kreuzung mit Hilfe des „helper"-Plasmids
pRK 2013 in Escherichia coli HB101 nach dem von Bevan M. (1984)
Nucl. Acids Res., 12, 8711–8721
beschriebenen Verfahren durchführt.
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Die
Transformationstechnik ausgehend von Tabakblattexplantaten beruht
auf der von Horsh R. et al. (1985) Science, 227, 1229–1231 beschriebenen
Vorgehensweise. Die Regeneration von Tabak PBD6 (Herkunft SEITA-France)
aus Blattexplantaten wird auf einem Murashige und Skoog-Basismedium
(MS), das 30 g/l Saccharose sowie 200⊂g/ml Kanamycin enthält, in drei
aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt: der erste umfaßt die Induktion
von Sprossen auf MS-Medium unter Zusatz von 30 g Saccharose, das
0,05 mg Naphtylessigsäure
(ANA) und 2 mg/l Benzylaminopurin (BAP) enthält, über einen Zeitraum von 15 Tagen.
Die während
dieses Schritts gebildeten Sprosse werden anschließend durch
Kultivierung auf einem MS-Medium unter Zusatz von 30 g/l Saccharose,
jedoch ohne Hormone, über
einen Zeitraum von 10 Tagen entwickeln gelassen. Anschließend entfernt
man die entwickelten Sprosse und kultiviert sie auf einem halbkonzentrierten
MS-Bewurzelungsmedium, mit dem halben Gehalt an Salzen, Vitaminen
und Zuckern sowie ohne Hormone. Nach ungefähr 15 Tagen werden die bewurzelten
Sprosse in Erde umgesetzt.
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2) Messung der Glyphosatetoleranz:
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Für jedes
der Konstrukte pRPA-RD-A, B und C wurden 20 transformierte Pflanzen
regeneriert und ins Gewächshaus
umgesetzt. Diese Pflanzen wurden im 5-Blatt-Stadium im Gewächshaus
mit einer wässrigen Roundup®-Suspension,
die 0,8 kg Glyphosate-Wirkstoff pro Hektar entspricht, behandelt.
Die Ergebnisse stimmen mit der Beobachtung von Phytotoxizitätsindices,
die 3 Wochen nach der Behandlung bestimmt wurden, überein.
Unter diesen Bedingungen beobachtet man, daß die mit den Konstrukten transformierten
Pflanzen im Durchschnitt eine annehmbare Toleranz (pRPA-RD-146),
ja sogar eine gute Toleranz (pRPA-RD-147 und 148) aufweisen, während die
nicht transformierten Kontrollpflanzen völlig abgestorben sind.
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Diese
Ergebnisse zeigen deutlich die Verbesserung, die durch Verwendung
eines erfindungsgemäßen chimären Gens
für ein
gleiches Gen, das für
Glyphosatetoleranz codiert, bewirkt wird.
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Die
erfindungsgemäß transformierten
Pflanzen können
als Elternpflanzen für
die Gewinnung von Linien und von Hybriden mit dem phänotypischen
Merkmal, das der Expression des eingeführten chimären Gens entspricht, verwendet
werden.
