ES2217446T3 - Secuencia de adn de peptido de transito. - Google Patents

Secuencia de adn de peptido de transito.

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ES2217446T3 ES98102347T ES98102347T ES2217446T3 ES 2217446 T3 ES2217446 T3 ES 2217446T3 ES 98102347 T ES98102347 T ES 98102347T ES 98102347 T ES98102347 T ES 98102347T ES 2217446 T3 ES2217446 T3 ES 2217446T3
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Abstract

1) GEN QUIMERICO PARA PROPORCIONAR A LAS PLANTAS UNA MAYOR TOLERANCIA RESPECTO A UN HERBICIDA QUE TIENE COMO OBJETIVO EL EPSPS. 2) COMPRENDE, EN EL SENTIDO DE LA TRANSCRIPCION, UNA ZONA DE PROMOCION, UNA ZONA DE PEPTIDO DE TRANSITO, UNA ZONA DE CODIFICACION DE LA TOLERANCIA AL GLIFOSATO Y UNA ZONA DE SEÑAL DE POLIADENILACION, CARACTERIZADO PORQUE LA ZONA DE PEPTIDO DE TRANSITO COMPRENDE, EN EL SENTIDO DE LA TRADUCCION ,AL MENOS UN PEPTIDO DE TRANSITO DE UN GEN VEGETAL QUE CODIFICA UNA ENZIMA CON LOCALIZACION PLASTIDIAL, UNA PARTE DE SECUENCIA DE LA PARTE MADURA N TERMINAL DE UN GEN VEGETAL QUE CODIFICA UNA ENZIMA CON LOCALIZACION PLASTIDIAL Y A CONTINUACION, UN SEGUNDO PEPTIDO DE TRANSITO DE UN GEN VEGETAL QUE CODIFICA UNA ENZIMA CON LOCALIZACION PLASTIDIAL. 3) PRODUCCION DE PLANTAS TOLERANTES AL GLIFOSATO.

Description

Secuencia de ADN de péptido de tránsito.
La presente invención se refiere a nuevas secuencias de DNA de péptidos de tránsito, a nuevos genes quiméricos y a su utilización en plantas para conferirles una tolerancia aumentada a los herbicidas de la familia de las fosfonometilglicinas. Igualmente se refiere a células vegetales transformadas por medio de estos genes, a plantas transformadas regeneradas a partir de estas células, así como a las plantas que provienen de cruzamientos que utilizan estas plantas transformadas.
El glifosato, el sulfosato o la fosametina son herbicidas sistémicos de amplio espectro de la familia de las fosfonometilglicinas. Estos herbicidas actúan esencialmente como inhibidores competitivos de la 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato-sintasa (EC 2.5.1.19) o EPSPS frente a la PEP (fosfoenolpiruvato). Después de su aplicación sobre la planta, son transportados en la planta donde se acumulan en las partes de crecimiento rápido, en especial los ápices caulinares y radiculares, provocando la alteración hasta la destrucción de las plantas sensibles.
La EPSPS plastidial, diana principal de estos productos, es una enzima de la vía de biosíntesis de los aminoácidos aromáticos, que está codificada por uno o más genes nucleares y sintetizada en forma de un precursor citoplasmático y después importada a los plastos donde se acumula en su forma madura.
La tolerancia de las plantas al glifosato y a los productos de la familia se obtiene por introducción estable en su genoma de un gen de EPSPS de origen vegetal o bacteriano mutado o no en cuanto a las características de inhibición por el glifosato del producto de este gen. Teniendo en cuenta el modo de acción del glifosato y el grado de tolerancia al glifosato del producto de los genes utilizados, es interesante poder expresar el producto de la traducción de este gen con objeto de permitir su acumulación importante en los plastos.
Se sabe, por ejemplo según la patente de EE.UU. No. 4.535.060, como conferir a una planta tolerancia a un herbicida del tipo anterior, en particular la N-fosfonometilglicina o glifosato, por introducción en el genoma de las plantas de un gen que codifica una EPSPS que lleva al menos una mutación que hace a esta enzima más resistente a su inhibidor competitivo (el glifosato) después de la localización de la enzima en el compartimiento plastidial (véanse los documentos EP-A-0189707, EP-A-0218571 o WO-A-88/02402). Estas técnicas demandan, no obstante, ser mejoradas para obtener una mayor fiabilidad con el empleo de estas plantas en condiciones agronómicas.
En la presente descripción se entiende por "planta" cualquier organismo multicelular diferenciado capaz de fotosíntesis, y por "célula vegetal" cualquier célula que proviene de una planta y que puede constituir tejidos no diferenciados, tales como callos o tejidos diferenciados, tales como embriones o partes de plantas, plantas o semillas.
La presente invención tiene por objeto la producción de plantas transformadas que poseen una tolerancia aumentada a los herbicidas de la familia de las fosfonometilglicinas, por regeneración de células transformadas por medio de nuevos genes quiméricos que comprenden un gen de tolerancia a estos herbicidas. La invención se refiere igualmente a estos nuevos genes quiméricos, a los nuevos péptidos de tránsito codificado por dicho gen, así como a las plantas que los contienen hechas más tolerantes mediante una acumulación de la enzima mutada, bajo su forma madura, en las plantas.
Más particularmente la invención tiene por objeto un gen quimérico para comunicar a las plantas una tolerancia aumentada frente a un herbicida que tiene como diana la EPSPS, que comprende, en el sentido de la transcripción, una zona promotora, una zona de péptido de tránsito, una secuencia de un gen que codifica una enzima de tolerancia al glifosato y una zona de señal de poliadenilación no traducida en 3', caracterizado porque la zona de péptido de tránsito comprende, en el sentido de la transcripción, un péptido de tránsito de un gen vegetal que codifica una enzima de localización plastidial, una parte de la secuencia de la parte madura N terminal de un gen vegetal que codifica una enzima de localización plastidial, y después un segundo péptido de tránsito de un gen vegetal que codifica una enzima de localización plastidial.
La invención se refiere igualmente a cualquier secuencia de DNA de la zona de péptido de tránsito definida anteriormente.
Los péptidos de tránsito utilizables en la zona de péptido de tránsito pueden ser conocidos por sí mismos, de origen vegetal, por ejemplo provenientes de maíz, de girasol, de guisante, de tabaco u otros. El primero y el segundo péptidos de tránsito pueden ser idénticos, análogos o diferentes. Pueden comprender, además, cada uno de ellos una o más unidades de péptido de tránsito. De preferencia se utiliza una secuencia procedente de la PSU del gen de la ribulosa-1,5-bis-fosfato-carboxilasa (RuBisCO).
La parte de secuencia de la parte madura del extremo N terminal proviene de un gen vegetal que codifica una enzima de localización plastidial, tal como, por ejemplo, un gen del maíz, del girasol, del guisante u otros, pudiendo ser la especie vegetal de origen idéntico, análogo o diferente de la que provienen respectivamente, el primer y el segundo péptidos de tránsito. Además, la parte de secuencia de la parte madura puede comprender un número variable de aminoácidos, generalmente de 10 a 40, de preferencia de 18 a 33. De preferencia se utiliza una secuencia procedente de la PSU del gen de la ribulosa-1,5-bis-fosfato-carboxilasa (RuBisCO).
La construcción del conjunto de la zona de tránsito puede llevarse a cabo de un modo conocido por sí mismo, en especial por fusión o por cualquier otro medio conveniente. Esta zona característica tiene como papel principal el permitir la liberación de una proteína madura y nativa con una eficacia máxima.
La secuencia que codifica la tolerancia herbicida utilizable en el gen quimérico según la invención, codifica una EPSPS mutada que posee un grado de tolerancia al glifo-sato. Esta secuencia obtenida especialmente por mutación del gen EPSPS puede ser de origen bacteriano, por ejemplo proveniente de Salmonella typhymurium (y denominada en lo sucesivo ''gen AroA), o vegetal, por ejemplo de petunia o de tomate. Esta secuencia puede comprender una o más mutaciones, por ejemplo la mutación Pro. 101 en Ser o también las mutaciones Gly 96 en Ala.
La zona promotora del gen quimérico según la invención puede estar compuesta ventajosamente de al menos un promotor de un gen que se expresa naturalmente en la plantas, es decir, promotores de origen viral tales como el del RNA 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S) o de origen vegetal tales como la pequeña subunidad del gen de la ribulosa-1,5-bifosfato-carboxilasa (RubisCO) de un cultivo como el maíz o el girasol.
La zona de señal de poliadenilación, no traducida en 3' del gen quimérico según la invención, puede ser de un origen cualquiera, por ejemplo bacteriano, tal como el del gen de la nopalina-sintasa, o vegetal tal como el de la pequeña subunidad de la RuBisCO de maíz o de girasol.
El gen quimérico según la invención puede comprender, además de las partes esenciales anteriormente indicadas, una zona intermedia sin traducir (fragmento enlazador) entre la zona promotora y la secuencia codificante y que puede ser de un origen cualquiera, bacteriano, viral o vegetal.
Ejemplo 1 Construcción de un gen quimérico
Se lleva a cabo la construcción del gen quimérico según la invención, a partir de los elementos siguientes:
1) Promotor "doble CaMV" (es decir, una parte del cual ha sido duplicada): El promotor CaMV35S fue aislado por Odell et al. (1985). Un clon, pJO 5-2 que contiene aproximadamente 850 pb aguas arriba del sitio de iniciación de la transcripción se cortó por EcoRI-HindIII, haciéndose romos los extremos de este fragmento aislado mediante polimerasa de Klenow y el fragmento se inseró en el sitio Hinc II del vector pUC19 (Yannis-Perron et al.,(1985). Este promotor se digirió con ClaI, los extremos se rellenaron con polimerasa de Klenow, y después se digerió de nuevo con Hindi. Un fragmento HindIII-EcoRV, aislado a partir del mismo promotor inicial, se introdujo entre estos dos sitios. El promotor obtenido de este modo poseía una doble zona amplificadora aguas arriba de los elementos de regulación del promotor CaMV35S. Se introdujo en forma de un fragmento HindIII-EcoRI en el vector pRPA-BL 150 A alfa 2, descrito en la solicitud de patente francesa 88/04130, cortado por HindIII y EcoRI.
2) Zona de tránsito: Los dos péptidos de tránsito, así como los elementos de proteínas maduras utilizados provienen del DNAc clonado de la pequeña subunidad del gen de la RuBisCo del maíz, cuyo gen ha sido descrito por Lebrun et al (1987), y del DNAc clonado de la pequeña subunidad del gen de la RuBisCO del girasol, aislado por Waksman et al (1987). Más precisamente, la zona de tránsito, denominada péptido de tránsito optimizado, comprende, en el sentido de la traducción:
- un péptido de tránsito de la pequeña subunidad de la RuBisCO del girasol,
- una secuencia del extremo N terminal de 22 aminoácidos de la parte madura de la pequeña subunidad de la RuBisCO del maíz,
- un péptido de tránsito de la pequeña subunidad de la RuBisCO del maíz.
La construcción que utiliza este péptido de tránsito optimizado se denomina pRPA-BL 410.
Pueden ser utilizadas otras secuencias análogas que contienen respectivamente secuencias de 10 a 40 y de preferencia 18 y 33 aminoácidos.
Con el fin de proporcionar un elemento comparativo, se llevó a cabo otra construcción con un primer péptido de tránsito y la misma parte de secuencia madura pero sin segundo péptido de tránsito, según la técnica anterior (pRPA-BL 294).
3) Gen estructural : El gen proviene del gen mutado en la posición (Pro 101 en Ser) de la EPSPS de la Salmonella typhymurium aislado por Stalker et al., (1985). El clon pMG34-2 (proporcionado por Calgene) se linealizó mediante XbaI y se trató después con la nucleasa de Vigna radiata. Después de volver a cortar con SmaI, se ligaron los dos extremos romos. El clon obtenido poseía un sitio NcoI sobre el ATG iniciador, así como un sitio SalI en 17 pb aguas abajo del codón de parada. Este clon fue denominado pRPA-BL 104.
4) Zona de señal de poliadenilación: El fragmento proveniente del gen de la nopalina-sintasa de pTi37 (Bevan et al, 1983). Este sitio está contenido en un fragmento MboI de 260 pb (Fraley et al., 1983); solicitud de patente PCT 84/02913) que se trató con polimerasa de Klenow y se clonó en el sitio SmaI de M13 mp 18 para introducir sitios BamHI y EcoRI respectivamente en los extremos 5' y 3'.
Después de corte con BamHI y tratamiento con la nucleasa de Vigna radiata y luego corte con EcoRI y tratamiento con la polimerasa de Klenow, el fragmento resultante se introdujo en el vector p-BL 20 (véase solicitud de patente francesa 88/04130), se cortó con XbaI y BamHI tratados con polimerasa de Klenow. Después de volver a cortar con SalI y SstI, se obtuvo un fragmento de aproximadamente 0,4 kpb que contenía la secuencia nos 3' del lado del sitio Sal I y el margen derecho del DNA-T del lado del sitio SstI.
El empalme de los diferentes elementos se efectuó del siguiente modo:
Fusión "péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del maíz/gen AroA"
El péptido de tránsito de la PSU del gen de la RuBisCO del maíz que proviene de un fragmento EcoRI-SphI de 192 pb, procedente del DNAc correspondiente al gen de la PSU del gen de la RuBisCO del maíz, descrito por Lebrun et al (1987), que posee un sitio NcoI que recubre el codón de iniciación de la traducción y un sitio SphI que corresponde al sitio de escisión del péptido de tránsito.
Por tratamiento del extremo SphI con polimerasa del bacteriófago T4 y ligación con la extremidad NcoI, tratada con polimerasa de Klenow, del gen AroA de pRPA-BL 104 vuelto a cortar con EcoRI, se obtiene la fusión traduccional entre el péptido de tránsito del maíz y el gen de la EPSPS bacteriana.
Fusión péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del maíz/secuencia de 22 aminoácidos de la parte madura de la PSU de la RuBisCO del maíz/gen AroA
De modo similar, un fragmento EcoRI-HindII de 228 pb del DNAc de la PSU del gen de la RuBisCO del maíz se ligó con el extremo NcoI tratado con la polimerasa de Klenow del gen AroA de pRPA-BL 104 y se volvió a cortar con EcoRI. Se obtuvo una fusión traduccional entre el péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del maíz, los 22 aminoácidos de la parte madura de la PSU de la RuBisCO del maíz y el gen de la EPSPS bacteriana.
Péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del girasol
El fragmento procede del DNAc aislado por Waksman y Freyssinet (1987). Un sitio SphI fue creado según el método de Zoller y Smith (1984) en el sitio de rotura del péptido de tránsito. El péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO así obtenido es un fragmento EcoRI-SphI de 171 pb.
Fusión péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del girasol/secuencia de 22 aminoácidos de la parte madura de la PSU de la RuBisCO del maíz/gen AroA
La construcción que contiene la fusión péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del maíz/secuencia de 22 aminoácidos de la PSU de la RuBisCO del maíz de la parte madura del gen del maíz, se cortó con EcoRI-SphI de 171 pb correspondiente al péptido de tránsito de la PSU del gen de la RuBisCO de girasol. Una construcción resultante presentó una sustitución de los fragmentos EcoRI-SphI y es una fusión traduccional "péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del girasol/secuencia de 22 aminoácidos de la parte madura de la RuBisCO del maíz/gen AroA".
El fragmento EcoRI-SalI se ligó con el fragmento SalI-SstI que contiene la secuencia nos 3' y el borde derecho del DNA-T. El fragmento EcoRI-SstI resultante que comprende "péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del girasol/secuencia de 22 aminoácidos de la parte madura de la PSU de la RuBisCO del maíz/gen AroA/nos 3'/borde derecho DNA-T'' está sustituido en el fragmento EcoRI-SstI que contiene el borde derecho del DNA-T del plásmido 150 A alfa 2 que contiene el promotor doble CaMV. La fusión transcripcional "doble CaMV/péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del girasol/secuencia de 22 aminoácidos de la parte madura de la PSU de la RuBisCO del maíz/gen AroA/nos 3' en el vector 150 A alfa 2, se denominó pRPA-BL 294.
Fusión "péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del girasol/secuencia de 22 aminoácidos de la PSU de la RuBisCO del maíz/péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del maíz/gen AroA"
La construcción anterior se cortó con NcoI-HindIII liberando el gen AroA. Después se ligó con un fragmento NcoI-Hind III de 1,5 kpb que contenía la fusión "péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del maíz/gen AroA". La construcción resultante presentaba una sustitución de los fragmentos NcoI-HindIII es una fusión traduccional "péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del girasol/secuencia de 22 aminoácidos de la PSU de la RuBisCO de la parte madura del gen del maíz/péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del maíz/gen AroA".
El fragmento EcoRI-SalI se ligó con el fragmento SalI-SstI que contenía la secuencia nos 3' y el borde derecho del DNA-T. El fragmento EcoRI-SstI resultante que comprendía "péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del girasol/secuencia de 22 aminoácidos de la PSU de la RuBisCO de la parte madura del gen del maíz/péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del maíz/gen AroA/nos 3'/borde derecho DNA-T" está sustituido en el fragmento EcoRI-SstI que contenía el borde derecho del DNA-T del plásmido 150 A alfa 2 que contiene el promotor doble CaMV. La fusión transcripcional ''doble CaMV/péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del tornasol/secuencia de 22 aminoácidos de la PSU de la RuBisCO de la parte madura del gen del maíz/péptido de tránsito de la PSU de la RuBisCO del maíz/gen AroA/nos 3' en el vector 150 A alfa 2, se denominó pRPA-BL 410.
Ejemplo 2 Resistencia de las plantas transformadas 1.- Transformación
El vector se introdujo en la cepa no oncógena de Agrobacterium EHA 101 (Hood et al., 1987) portadora del cósmido pTVK 291 (Komari et al, 1986). La técnica de transformación se basa en el procedimiento operatorio de Horsh et al (1985).
2.- Regeneración
La regeneración del tabaco PBD6 (procedencia SEITA Francia) a partir de explantes foliares se realizó sobre un medio de base Murashige y Skoog (MS) que comprende 30 g/l de sacarosa así como 200 \mug/ml de kanamicina. Los explantes foliares se obtuvieron de plantas de invernadero o in vitro y se transformaron según la técnica de los discos foliares (Science 1985, Vol. 227, p.1229-1231) en tres etapas sucesivas. La primera comprende la inducción de los brotes sobre un medio MS adicionado con 30 g/l de sacarosa que contenía 0,05 mg/l de ácido naftilacético (ANA) y 2 mg/l de bencilaminopurina (BAP) durante 15 días. Los brotes formados en el transcurso de esta etapa se desarrollaron a continuación por cultivo en un medio MS adicionado con 30 g/l de sacarosa pero que no contenía hormona, durante 10 días. Después se retiraron los brotes desarrollados y se los cultivó en un medio de arraigo MS con un contenido mitad de sales, vitaminas y azúcares y que no contenía hormona. Al cabo de aproximadamente 15 días, los brotes arraigados se pasaron a tierra.
3.- Medida de la tolerancia al glifosato
a) in vitro: la tolerancia se mide por pesada de la masa de callos extrapolada para 100 discos foliares de 0,5 cm de diámetro, al cabo de 30 días de crecimiento, en un medio MS adicionado con 30 g/l de sacarosa, 0,05 mg/l de ácido naftalenoacético y 2 mg/l de BAP, conteniendo 35 ppm de glifosato y 200 microgramos/ml de kanamicina. En estas condiciones se observa que, para las plantas de tabaco modificadas por el gen quimérico de pRPA BL 410 según la invención, la masa de callos es 34 g, mientras que para las plantas modificadas por el gen quimérico sin segundo péptido de tránsito, la masa no es más que 12 g.
b) in vivo : 30 plantas que provenían de la regeneración de tabacos transformados respectivamente con pRPA-BL 294 y pRPA-BL 410, se pasaron a invernadero y se trataron en el estado de 5 hojas, por pulverización, con una suspensión acuosa a una dosis correspondiente a 0,6 kg/ha de glifosato (Round up). Al cabo de 21 días se efectuó una observación fenotípica de las plantas con respecto a plantas testigo sin transformar. En estas condiciones se comprobó que las plantas transformadas por el pRPA-BL 410 presentaban una fitotoxicidad desestimable, mientras que las plantas testigo habían sido destruidas completamente; además, las plantas transformadas con un gen quimérico diferente del anterior por la ausencia del segundo péptido de tránsito, presentaban una fitotoxicidad al menos igual al 30% de destrucción.
Estos resultados ponen de manifiesto claramente la mejora aportada mediante la utilización de un gen quimérico según la invención para un mismo gen que codifica la tolerancia al glifosato.
Las plantas transformadas según la invención pueden ser utilizadas como ascendientes para la obtención de razas y de híbridos que poseen una tolerancia aumentada al glifosato.

Claims (26)

1. Secuencia de DNA de péptido de tránsito, caracterizada porque comprende, en el sentido de la transcripción, una secuencia que codifica un primer péptido de tránsito de un gen vegetal que codifica una enzima de localización plastidial, una parte de secuencia de la parte madura N terminal de un gen vegetal que codifica una enzima de localización plastidial, y después una secuencia que codifica un segundo péptido de tránsito de un gen vegetal que codifica una enzima de localización plastidial.
2. Secuencia de DNA según la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia que codifica el segundo péptido de tránsito proviene de la misma planta que la secuencia que codifica el primer péptido de tránsito.
3. Secuencia de DNA según la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia que codifica el segundo péptido de tránsito proviene de una planta diferente de la del primer péptido de tránsito.
4. Secuencia de DNA según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque al menos una secuencia que codifica uno de los péptidos de tránsito proviene de la pequeña subunidad del gen de la ribulosa-1,5-bifosfato-vcarboxilasa/oxigenasa (RuBisCO).
5. Secuencia de DNA según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la secuencia de la parte madura N terminal proviene de la pequeña subunidad del gen de la RuBisCO.
6. Secuencia de DNA según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque al menos una secuencia que codifica uno de los péptidos de tránsito proviene del mismo gen que el de origen de la secuencia de la parte madura.
7. Secuencia de DNA según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque al menos una secuencia que codifica uno de los péptidos de tránsito proviene de un gen de maíz.
8. Secuencia de DNA según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque al menos una secuencia que codifica uno de los péptidos de tránsito proviene de un gen de girasol.
9. Secuencia de DNA según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la secuencia de la parte madura proviene de un gen de maíz.
10. Secuencia de DNA según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la secuencia de la parte madura proviene de un gen de girasol.
11. Secuencia de DNA según la reivindicación 10, caracterizada porque la secuencia de la parte madura comprende de 10 a 40 aminoácidos.
12. Secuencia de DNA según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque la secuencia de la parte madura comprende de 18 a 33 aminoácidos.
13. Gen quimérico para conferir a las plantas una tolerancia aumentada frente a un herbicida que tiene como diana la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato-sintasa (EPSPS), que comprende, en el sentido de la transcripción, una zona promotora, una zona de péptido de tránsito, una secuencia que codifica la tolerancia al glifosato y una zona de señal de poliadenilación no traducida en 3', caracterizado porque la zona de péptido de tránsito comprende una secuencia de DNA según una de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Gen quimérico según la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia que codifica la tolerancia al glifosato es de origen bacteriano.
15. Gen quimérico según la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia que codifica la tolerancia al glifosato es de origen vegetal.
16. Procedimiento de construcción de un gen quimérico según una de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque se aíslan respectivamente al menos dos zonas de péptido de tránsito y al menos una secuencia de la parte madura de genes vegetales plastidiales apropiados, así como al menos una secuencia que codifica la tolerancia al glifosato y una zona de señal de poliadenilación apropiada y porque seguidamente se les empalma en el sentido de la transcripción del gen de tolerancia.
17. Vector para la transformación de plantas, caracterizado porque comprende un gen quimérico según una de las reivindicaciones 13 a 15.
18. Célula vegetal transformada, caracterizada porque contiene un gen quimérico según una de las reivindicaciones 13 a 15.
19. Planta transformada con tolerancia mejorada a un herbicida que tiene como diana la EPSPS, caracterizada porque se ha obtenido a partir de una célula según la reivinidación 18.
20. Planta según la reivindicación 19, caracterizada porque es una dicotiledónea.
21. Planta según la reivindicación 19, caracterizada porque es una monocotiledónea.
22. Planta transformada con tolerancia mejorada a un herbicida que tiene como diana la EPSPS caracterizada porque dicha plante se ha obtenido por cruzamientos que utilizan plantas según las reivindicaciones 19 a 20.
23. Procedimiento de obtención de líneas de híbridos que tienen una tolerancia aumentada al glifosato, caracterizado porque se utilizan como precursoras plantas según una de las reivindicaciones 19 a 21.
24. Procedimiento de tratamiento de plantas según una de las reivindicaciones 19 a 22 u obtenidas por el procedimiento según la reivindicación 23, caracterizado porque se aplica sobre las plantas un herbicida que tiene como diana la EPSPS.
25. Procedimiento según la reivindicación 24, caracterizado por el herbicida es un herbicida sistémico de amplio espectro de la familia de las fosfonometilglicinas.
26. Procedimiento según la reivindicación 25, caracterizado porque el herbicida es el glifosato.
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