CZ11399A3 - Chimérické geny s několika geny rezistence k herbicidům, rostlinné buňky a rostliny rezistentní k herbicidům a způsob přípravy takových rostlin - Google Patents

Chimérické geny s několika geny rezistence k herbicidům, rostlinné buňky a rostliny rezistentní k herbicidům a způsob přípravy takových rostlin Download PDF

Info

Publication number
CZ11399A3
CZ11399A3 CZ99113A CZ11399A CZ11399A3 CZ 11399 A3 CZ11399 A3 CZ 11399A3 CZ 99113 A CZ99113 A CZ 99113A CZ 11399 A CZ11399 A CZ 11399A CZ 11399 A3 CZ11399 A3 CZ 11399A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
plants
alas
leo
glee
wall
Prior art date
Application number
CZ99113A
Other languages
English (en)
Inventor
Ken Pallett
Richard Derose
Bernard Pelissier
Alain Sailland
Original Assignee
Rhone-Poulenc Agro
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9494283&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ11399(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Rhone-Poulenc Agro filed Critical Rhone-Poulenc Agro
Publication of CZ11399A3 publication Critical patent/CZ11399A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/72—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms
    • A01N43/80—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms five-membered rings with one nitrogen atom and either one oxygen atom or one sulfur atom in positions 1,2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having alternatively specified atoms bound to the phosphorus atom and not covered by a single one of groups A01N57/10, A01N57/18, A01N57/26, A01N57/34
    • A01N57/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having alternatively specified atoms bound to the phosphorus atom and not covered by a single one of groups A01N57/10, A01N57/18, A01N57/26, A01N57/34 containing acyclic or cycloaliphatic radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8277—Phosphinotricin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)

Description

(57) Anotace:
Řešení se týká: 1.Chimérických genů s několika geny rezistence k herbicidům, rostlinné buňky a rostliny rezistentní k herbicidům. 2. Rostlin rezistentních najednou k více herbicidům, zejména k inhibitorům HPPD a k inhibitorům EPSPS nebo/a k dihalogenhydroxybenzonitrilům. 3. Jejich použití pro odplevelování rostlin několika herbicidy.
176 760/HK
Chimérické geny s několika geny rezistence k herbicidům, rostlinné buňky a rostliny rezistentní k herbicidům a způsob přípravy takových rostlin
Oblast techniky
Předložený vynález se týká chimérického genu s několika geny rezistence k herbicidům, rostlinné buňky a rostliny rezistentní k několika herbicidům.
V následujícím popisu, herbicidy budou označeny podle běžného názvu zejména tak, jak jsou uvedeny v The Pesticide Manual v desátém vydání British Crop Protection Council.
Dosavadní stav techniky
Jsou známy rostliny, které byly transformovány proto, aby byly rezistentní k určitým herbicidům, například k dihalogenhydroxybenzonitrilům, zejména k bromoxynilu díky genu kódujícímu nitrilasu, která degraduje tyto herbicidy nebo jsou také známy rostliny tolerující inhibiční herbicidy EPSPS zejména glyphosat, sulfosat nebo fosametin nebo tolerantní k inhibitorům acetolaktatsynthasy (ALS) typu sulfonylmočovina nebo také tolerantní k inhibitorům dihydropteroatsynthasy takovým, jako asulam nebo také k inhibitorům glutaminsynthasy takovým, jako glufosinat.
Jsou známy určité herbicidy takové, jako isoxazoly popsané zejména ve francouzských přihláškách vynálezů 95 06800 a 95 13570 a zejména isoxaflutol, selektivní herbicid kukuřice, diketonitrily takové, které jsou popsány evropských přihláškách vynálezů 0 496 630, 0 496 631, zejména
2-kyano-3-cyklopropyl-l- (2-SO2CH3-4-CF3fenyl)propan-1,3-dion a
2-kyano-3-cyklopropyl-l- (2-SO2CH3-4-2,3-Cl2fenyl) propan-1,3• ·
-dion, triketony popsané v evpopských přihláškách vynálezů 0 625 505 a 0 625 508, zejména sulcotrinon nebo také ty, které jsou popsány v USP 5 506 195, nebo také pyrazolinaty. Byl izolován gen kódující HPPD vyjadřující toleranci k těmto posledně jmenovaným herbicidům a získané transgenní rostliny ho obsahující vykazují významnou toleranci a tvoří tak předmět nepublikovaných francouzkých přihlášek vynálezů N°95/06800, 95/13570 a 96/05944.
Ačkoliv zemědělská praxe ukazuje, že zemědělci rádi používají pro ošetření rostlin, zejména kulturních, spojení herbicidů zejména pro vyřešení různých problémů odplevelení, které jsou zaviněné omezením spektra herbicidů použitých izolovaně. Mimo jiné může být zajímavé disponovat značeným genem selekce spojeným s genem tolerantním k herbicidům. Ukazuje se, že je tedy potřeba rostlin a zejména kultur, které vyjadřují rezistenci k více herbicidům, přednostně alespoň ke dvěma nebo třem.
Nyní se ukázalo, že by se mohla udělit rostlinným buňkám a rostlinám několikanásobná tolerance k herbicidům.
Podstata vynálezu
Předložený vynález má za předmět vynálezu chimérický gen obsahující alespoň dva základní chimérické geny, které obsahují každý ve směru transkripce elementy regulace nezbytné pro transkripci v rostlinách, totiž obsahující alespoň regulační sekvenci promotoru, alespoň heterologní kódovanou část obsahující kódovanou sekvenci, která kóduje enzym udělující rostlinám toleranci k herbicidům a alespoň sekvenci regulace terminace nebo polyadenylace.
Jako kódovaná sekvence se může zejména použít každá známá sekvence pro udělení rostlinám tolerance k určitými inhibitorům, zejména:
-sekvence EPSPS pro toleranci ke glyphosatu, k sulfosatu nebo k fosametinu, zejména sekvence mutovaných nebo
nemutovaných dokumentech; proteinů, sekvence uvedené v následuj ících
-USP 4 535060, EP 115 673, USP 4 769 061, USP 5 094
945; USP 4 97 1 908, USP 5 145 783, EP 293 358; EP 378 985, WO
91/04323; WO 91/04323; WO 92 044 449; WO 92 06201. Později
tento typ genu bude označen sekvencí nebo genem EPSPS.
Může se také uvést glyphosatoxydoreduktasa (viz WO 92/000 377) enzym detoxyfikace glyphosatu.
-sekvence genu nitrilasy Klebsíella sp. pro toleranci k dihalogenbenzonitrilům popsaný v USP 4 810 648, zejména sekvence pocházející z Klebsíella ozaneae, která bude dále označena genem nebo sekvencí OXY,
-sekvence HPPD popsaná v nepublikovaných francouzských přihláškách vynálezů N°95/06800, 95/13570 a 96/05944 uvedených dále. Tento HPPD může být přírodní.
Tato sekvence může být zejména bakteriálního původu, zejména rodu Pseudomonas nebo také rostlinného původu, zejména jednoděložných nebo dvouděložných rostlin, zejména Arabidopsis nebo okoličnatých rostlin jako je například karotka (Daucus carota). Mohou být přírodní, divoké nebo případně mutované při zachování rezistence k herbicidům proti inhibitorům HPPD takovým, jako jsou herbicidy skupiny isoxazolů nebo herbicidy skupiny triketonů nebo pyrazolinatů.
Mohou být použity další sekvence:
-sekvence phosphinotrycinacetyltransferasy nebo sekvence glutaminsynthasy pro toleranci ke glufosinatu (viz EP 0 242 236)
-sekvence dihydropteroatsynthasy pro toleranci k asulamu (viz EP 0 369 367) · 9 ·»···· ·· ·· • · · · ·· * · · · · • · · · 9 · · · ······ « · 9 · · · · · ·
-sekvence ALS pro toleranci k sulfonylmočovině
-sekvence Protoporphyrogenoxydasy (protox) pro toleranci k herbicidům skupiny difenyletherů takových, jako je acifluorfen nebo oxyfluorfen nebo skupiny oxadiazolů takových., jako je oxadiazon nebo oxadiargyl nebo skupiny cyklických imidů takových, jako je chlorophthalim nebo skupiny fenyipyrrazolů takových, jako je TNP nebo skupiny pyridinů a fenopylatů a karbamátových analogů (viz WO 95/34659).
Jeden z chimérických genů přednostně obsahuje sekvenci kódující HPPD. V tom případě druhá nebo druhé sekvence mohou být jakékoliv, zejména vybrané z množiny sekvencí, která je uvedena dále. Druhé sekvence jsou přednostně vybrané ze skupiny zahrnující gen nitrilasy tolerantní k dihalogenhydroxybenzonitrilům a gen EPSPS.
Chimérické geny podle vynálezu mohou mimo jiné obsahovat geny kódující vlastnosti jiné než je herbicidní tolerance, například geny rezistence ke hmyzu, například geny typu Bacillus thurigensis udělující rezistenci k různým představitelům čeledi Coleoptera a Lepidoptera nebo také geny rezistence ke hlístům, geny rezistence k fungicidním a mikrobiálním nemocem nebo také geny udělující agronomické vlastnosti a to geny různých desaturas působících při tvorbě mastných kyselin. Mohou se uvést zejména geny delta-6desaturasy popsané v mezinárodní přihlášce vynálezu WO 93/06712.
Jako sekvence regulace promotoru se může použít každá sekvence promotoru genu, který se exprimuje přirozeně v rostlinách, zejména se může uvést promotor bakteriálního, virového nebo rostlinného původu, jako například promotor genu malých podjednotek ribulosbiskarboxylasy (RuBisCO) nebo promotor genu cc-tubulinu (Evropská přihláška vynálezu EP n°0 652 286), nebo také genu rostlinného viru, například promotor
mozaiky květáku (CaMV 19S nebo 356S), ale může být použit i každý jiný vhodný známý promotor. Zejména se obracíme k na sekvenci regulace promotoru, který upřednostňuje silnou expresi kódující sekvence takové, jako například sekvence, která obsahuje alespoň histonový promotor takový, jako je popsán v evropské přihlášce vynálezu EP 0507698.
Podle předloženého vynálezu se mohou také použít ve spojení se sekvencí regulace promotoru další sekvence regulace, které jsou umístěny mezi promotorem a kódující sekvencí takové jako jsou aktivátory transkripce enhancer, například aktivátor translace viru etch tabáku (TEV) popsaný v přihlášce vynálezu WO87/07644 nebo tranzitní peptidy, buď jednoduché nebo dvojité, v tom případě případně oddělené intermediární sekvencí, totiž sekvencí obsahující ve směru transkripce sekvenci kódující tranzitní peptid rostlinného genu, který kóduje enzym v plastidiální lokalizaci, část sekvence vyzrálé části N-konce rostlinného genu, který kóduje enzym v plastidiální lokalizaci a potom sekvenci, která kóduje druhý tranzitní peptid rostlinného genu, který kóduje enzym v plastidiální lokalizaci, tvořený částí sekvence vyzrálé části N-konce rostlinného genu, který kóduje enzym v plastidiální lokalizací takový, jaký je popsán v evropské přihlášce vynálezu n°0 508 909.
Jako sekvence regulace terminace nebo polyadenylace se může uvést každá odpovídající sekvence bakteriálního původu, jako například terminátor nos Agrobacterium tumefaciens nebo také sekvence rostlinného původu jako například histonový terminátor takový, jaký je popsán v evropské přihlášce vynálezu EP n°0 633 317.
Předložený vynález má také za předmět rostlinnou buňku jednoděložných a dvouděložných rostlin, zejména kulturních tolerantních alespoň ke dvěma herbicidům, z nichž alespoň jeden je inhibitor HPPD. Tato buňka může obsahovat alespoň dva chimérické geny obsahující každou sekvenci, která kóduje
toleranci k jednomu herbicidu a z kterých alespoň jeden obsahuje sekvenci kódující HPPD. Tyto dva chimérické geny mohou být neseny stejným vektorem nebo každý může být nesen jiným, vektotrem nebo také mohou být neseny takové, jako jsou a mohou být vloženy do buňky fyzikálně nebo chemickofyzikálně například mikroin j ekcí, elektroporac.i nebo bombardováním podle známých metod.
Předložený vynález se také týká rostliny transformované pro toleranci alespoň ke dvěma herbicidům, z nichž jeden je inhibitor HPPD. Tato rostlina může být získána bud’ křížením alespoň dvou rostlin, které obsahují gen kódující toleranci k herbicidu nebo regenerací buňky podle vynálezu tak, jak je dále popsáno. Rostliny mohou být jednoděložné 'nebo dvouděložné, zejména kulturní, zejména velké kulturní rostliny takové, jako například, neomezeně pro dvouděložné, tabák, bavlna, řepka, sója, řepa a pro jednoděložné jako je kukuřice a slámové obiloviny nebo také zelinářské rostliny nebo květiny.
Předložený vynález se také týká metody získání rostlin tolerantních k herbicidům několikanásobnou rostlinnou transgenezí, vyznačenou tím, že:
- v první etapě se vloží do několika buněk jeden ze základních genů, který obsahuje element regulace nezbytný pro tanskripci v rostlinách a kódovanou sekvenci kódující enzym, který uděluje toleranci k herbicidu,
- potom jsou rostliny kříženy, aby se získaly rostliny s několikanásobnou tolerancí.
Předložený vynález se také týká jiné metody získání rostlin s několikanásobnou herbicidní tolerancí rostlinnou transgenezí, týká se první etapy zahrnující integraci alespoň dvou genů tolerantních k herbicidu do rostlinné buňky, z nichž alespoň jeden je inhibitor HPPD a druhé etapy zahrnující regenerací rostliny z transformovaných buněk podle
vynálezu .
Transformace může být získána prostřednictvím vhodných známých metod důkladně popsaných ve specializované literatuře a zejména v přihláškách vynálezů a v nárocích v předloženém vynálezu.
Série metod spočívá v bombardování buněk nebo protoplastů částicemi, ve kterých jsou zachyceny sekvence DNA. Podle předloženého vynálezu tyto DNA mohou být neseny stejnými částicemi nebo různými částicemi. Jiná série metod spočívá v použití jako prostředníka přenosu chimérického genu vloženého do plazmidů Ti Agrobacterium tumefaciens nebo Ri Agrobacterium rhizogenes do rostliny.
Mohou být použity další metody, a to metody, jako je mikroinjekce nebo elektroporace.
Odborník vybírá vhodnou metodu s ohledem na vlastnosti rostliny, zejména s ohledem na její charakter, zda se jedná o jednoděložnou nebo dvouděložnou rostlinu.
Bylo pozorováno, že rostliny transformované podle vynálezu mají významnou toleranci k inhibitorům hydroxyfenylpyruvátdioxygenasy takovým, jako jsou nejnovější herbicidy například isoxazoly popsané zejména v francouzských přihláškách vynálezů 9506800 a 95 13570 a zejména 4 - [4-CF3-2-(methylsulfony1)benzoyl]-5-cyklopropyl-izoxazol nebo izoxaflutol diketonitrily takové, přihláškách vynálezů kukuřice, evropských 631 zejména selektivní herbicid jako jsou popsány 0 496 630, 0496
2-kyano-3-cyklopropyl-l-(2-SO2CH3-4-CF3fenyl)propan-1,3-dion a 2-kyano-3-cyklopropyl-l- (2-SO,CH3-4-2,3-Cl,fenyl) propan-1,3-di on, triketony popsané v evpopských přihláškách vynálezů 0 625 505 a 0 625 508, zejména sulcotrinon a pyranosilaty. Rostliny podle vynálezu představují významnou toleranci k dalším herbicidům takovým, jako jsou například dihalogenodinitrily, zejména bromoxynil a ioxynil, glyphosat a jejich analogy a
glufosinat.
Předložený vynález se také týká rostlin regenerovaných z transformovaných buněk. Regenerace se získá všemi vhodnými metodami, které odpovídají povaze vzorku jako například metodou popsanou v předloženém vynálezu. Rostliny podle vynálezu mohou být také získány křížením rodičovských rostlin, které nesou jeden z popsaných genů herbicidní tolerance.
Předložený vynález se týká metody odplevelení rostlin, zejména kulturních rostlin, pomocí herbicidu tohoto typu vyznačeného tím, že se tento herbicid aplikuje na rostliny transformované podle vynálezu, jak v době po vysetí, před vzklíčením, tak po vzklíčení kultury. Herbicidem ve smyslu předloženého vynálezu se rozumí samotný aktivní herbicid nebo herbicid spojený s přídavkem, který modifikuje jeho účinnost jako například přídavek zvyšující aktivitu (synergizmus) nebo omezující aktivitu (anglicky safener).
Pro praktickou aplikaci herbicidů jsou dále uvedené herbicidy spojené známým způsobem s přídavkem obvykle používajícím se pro agrochemickou formulaci.
Podle předloženého vynálezu může být použit jeden z genů herbicidní tolerance vyjádřené v rostlinách jako márkr selekce buď in vitro nebo in vivo.
Následující obrázky a příklady blíže ilustrují vynález, aniž by však v jakémkoliv směru omezovaly jeho rozsah.
• ·
Příklady
Příklad 1: Izolace genu HPPD Pseudomonas fluorescens A32
Od sekvence aminokyselin HPPD Pseudomonas sp. P.J. 874 (publikované Ríietschi U. et al. , 1992. Eur. J. Biochem. 205: 459-466) se ovozuje sekvence kódující HPPD Pseudomonas fluorescens A32 (izolována McKellarem, R.C. 1982 J. Appl. Bacteriol. 53: 305-316). Amplifikační fragment genu tohoto HPPD se použije pro křížení genomické banky Pseudomonas fluorescens A32 a také pro izolaci genu kódujícího tento enzym.
A) Příprava genomické DNA P. fluorescens A32.
Bakterie se kultivuje ve 40 ml minimální kultivační půdy M63 (13,6 g/1 KH2PO4, 2 g/1 (NH4)2SO4, 0,2 g/1 MgSO4, 0, 005 g/1 FeSO4 pH 7 a 10 mM! L-tyrosinu jako jediný zdroj uhlíku) při teplotě okolo 28°C po dobu 48 hodin.
Po promytí se buňky vloží do 1 ml lyzovacího pufru (100 mM tris HCl pH 8,3, 1,4 M NaCl a 10 mM EDTA) a inkubují po dobu 10 minut při teplotě 65°C. Po působení směsi fenol/chloroform (24/1) a působení chloroformu se nukleové kyseliny sráží přídavkem objemu isopropanolu, potom se vnesou do 300 μΐ sterilní vody a nakonec ošetří 10 mg/ml RNAasy. DNA se znovu vystaví působení směsi fenol/chloroform a působení chloroformu a znovu sráží přídavkem desetinového objemu 3M octanu sodného pH 5 a dvěma objemy ethanolu. DNA se potom vloží do sterilní vody a změří.
B) Výběr oligonukleotidů a syntéz
Ze sekvence aminokyselin HPPD Pseudomonas sp. P.J. 874 se vybere pět oligonukleotidů, dva řízené ve směru NH,-konce k COOH-konci proteinu a tři řízené ve směru obráceném (viz Obrázek 1). Výběr se řídí následujícími dvěma pravidly:
- 3'konec stabilního nukleotidu, to znamená alespoň dvě base bez dvoujsmyslnosti.
- co možná nejmenší degenerace.
Vybrané oligonukleotidy mají následující sekvenci:
PÍ:5'TA(C/T)GA(G/A)AA(C/T)CCIATGGG3'
P2:5'GA(G/A)ACIGGICCIATGGA3'
P3:5'AA(C/T)TGCATIA(G/A)(G/A)AA(C/T)TC(C/T)TC3'
P4:5'AAIGCIAC(G/A.) TG (C/T) TG (T/G/A) ATICC3 '
P5:5'GC(C/T)TT(A/G)AA(A/G)TTICC(C/T)TCICC3'
Tyto oligonukleotidy se syntetizují na syntetizátoru Cyclone plus DNA Synthesizer značky MILLIPORE.
S těmito pěti oligonukleotidy pomocí metody PCR ampliřikační fragmenty, které se musely teoreticky získat podle sekvence SEQ IDN°1, měly následující velikost.
se sekvencemi PÍ a P3 -- ---> okolo 690 bp
se sekvencemi PÍ a P4 -- ---> okolo 720 bp
se sekvencemi PÍ a P5 -- ---> okolo 1000 bp
se sekvencemi P2 a P3 -- ---> okolo 390 bp
se sekvencemi P2 a P4 -- ---> okolo 420 bp
se sekvencemi P2 a P5 -- ---> okolo 700 bp
• · ···· ·· ··· ··· ··· ···· · ·
C) Amplifikace kódující části HPPD bakterie Pseudomonas fluorescens A32.
Amplifikace byla provedena na přístroji PCR PERKIN ELMER 9600 a s enzymem Taq-polymerase PERKIN ELMER, s vlastním pufrem za standartních podmínek, to znamená, že pro 50 μΐ reakce je to 200 μΜ NTP, 2,5 jednotek Taq-polymerasy a 5 μα DNA bakterie Pseudomonas fluorescens A32.
Použitý amplifikační program byl následující: 5 minut při teplotě 95°C, potom 35 cyklů <45 sekund při teplotě 95°C, 45 sekund při teplotě 49°C, 1 minuta při teplotě 72°C> následovaných 5 minutami při teplotě 72°C.
Za těchto amplifikace měly velikostí uvedenou amplifikaci.
podmínek velikost déle, což všechny získané srovnatelnou s naznačuje dobrou fragmenty teoretickou specificitu
Fragmenty amplifikace získané kombinací sekvencí P1/P4, P1/P5 a P2/P4 jsou spojeny v pBSII SK(-) po digesci tohoto plazmidů působením Eco RV a nakonec působením transferasy v přítomnosti ddTTP, jak je popsáno v HOLTON T.A. a GRAHAM M.W. 1991 N.A.R. vol 19, n°5 pll56.
Klon všech těchto třech typů je částečně sekvenován; to umožňuje potvrdit, že byla dobře amplifikována ve všech třech případech část kódující oblasti HPPD Pseudomonas fluorescens A32. Fragment P1/P4 se získá jako sonda pro křížení doplňkové genomické banky Pseudomonas fluorescens A32 a pro izolování úplného genu HPPD.
D) Izolace genu
Southernovým přenosem se ukazuje, že fragment o 7 Kbp po digesci DNA Pseudomonas fluorescens A32 restrikčním
enzymem BamHI se hybriduje se sondou HPPD P1/P4 . Digeruje se 400 pg DNA Pseudomonas fiuorescens A32 restrikřním enzymem BamHI a na agarosovém gelu se purifikují fragmenty DNA, které mají okolo 7 Kbp.
Tyto fragmenty jsou ligovány v pBSII SK(-), který je digerován Bam HI a defosforylován působením alkalické fosfatasy. Po transformaci do Escherichia coli DHlOb doplňková genomická banka se kříží se sondou HPPD P1/P4.
Izoloval se pozitivní klon a nazval se pRP A. Jeho zjednodušená mapa je uvedena na Obrázku 2. Na této mapě je naznačena pozice kódující části genu HPPD. Je tvořena 1077 nukleotidy, které kódují 358 nukleových kyselin (viz SEQ ID N°l). HPPD bakterie Pseudomonas fiuorescens A32 představuje homologii aminokyselin s aminokyselinami Pseudomonas sp. druh P.J. 874, je zde až 92% identických kyselin mezi těmito dvěma proteiny (viz Obrázek 3).
Příklad 2: Konstrukce dvou chimérických genů se sekvenci
HPPD.
Aby byla udělena· rostlinám tolerance k herbicidům inhibujícím HPPD byly konstruovány dva chimérické geny:
První gen spočívá ve vložení kódující části genu HPPD Pseudomonas fiuorescens A32 pod řízení dvojitého histonového promotoru (Evropská přihláška vynálezu N°0 507 698) následující Tabacco etch virus translační enhancer (TEV) (pRTL-GUS (Carrigton and Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597)) s terminátorem genu nopalinsynthasy. HPPD bude tedy umístěna v cytoplazmě.
Druhý gen bude identický k prvnímu genu až na to, že mezi aktivátor translace TEV a kódující část HPPD se vkádá optimální tranzitní peptid (OPT) (Evropská přihláška vynálezu
N°0 508 909). HPPD bude tedy umístěna v chloroplastu.
A) Konstrukce vektoru pRPA-RD-153;
- pRPA-RD-11:
Derivát pBS-II SK(-) (Stratagen katalog #212206) obsahující místo polyadenylace nopalinsynthasy (NOS polyA) (Evropská přihláška vynálezu N°0 652 286) se klonuje mezi místy KpnI a Sáli. Místo KpnI se transformuje v místě Notl působením T4 DNA-polymerasy za přítomnosti 150 μΜ deoxynukleotidtrifosfátů potom liguje s linkerem Notl (Stratagen katalog #1029). Tak se získá kazeta klonování NOS polyA.
- pRPA-RD-127:
Derivát pRPA-BL-466 (Evropská přihláška vynálezu N°0 0337 899) klonován v pRPA-RD-11 vytvářející kazetu exprese genu oxy a obsahující promotor peptidové podjednotky ribulosobikarboxylasy:
promotor (SSU) - oxy gen - NOS polyA
Aby se vytvořil tento plazmid byl pRPA-BL-488 digerován Xbal a HindlII, aby se izoloval fragment o 1,9 kpb obsahující propmotor SSU a gen oxy, který byl ligován v plazmidů pRPA-RD-11 řízený kompatibilními enzymy.
-pRPA-RD-132:
Je to derivát pRPA-BL-488 (Evropská přihláška vynálezu N°0 507 698) klonován v pRPA-RD-127 s vytvořením kazety exprese genu oxy s dvojitým histonovým promotorem:
dvojitý histonový hístone - oxy gen - NOS polyA
Pro vytvoření tohoto plazmidů byl pRPA-BL-466 digerován pomocí HindlII, ošetřený Klenowem, potom znovu digerován pomocí Ncol.· Purif ikovaný fragment o 1,35 kbp obsahující ·· · 000000 0 0 ·· • 000 0 0 0 0000 00 0 00 0 0000 00 0000 00 000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 dvojitý histonový promotor H3A748 byl ligován s plazmidem pRPA-RD-127, který by mohl být digerován pomocí Xbal, ošetřen Klenowem a znovu digerován pomocí Ncol.
-pRPA-RD-153:
Je to derivát pRPA-BL-132 obsahující aktivátor translace tabákového viru etch (TEV). pRTL-GUS (Carrigton and Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597) byl digerován pomocí Ncol a EcoRI a fragment o 150 bp byl ligován v pRPA-RD-132 digerovaném stejnými enzymy. Tak byla vytvořena kazeta exprese obsahující promotor:
dvojitý histonový promotor - TEV - oxy u - NOS polyA
B) Konstrukce vektoru pRPA-RD-185
- pUC19/GSGA:
Je to derivát pUC-19 (Gibco katalog #15364-011) obsahující počet klonovacích míst. pUC-19 byl digerován EcoRI a ligován s oligonukleotidovým linkerem 1:
Linker 1: AATTGGGCCA GTCAGGCCGT TTAAACCCTA GGGGGCCCG
CCCGGT CAGTCCGGCA AATTTGGGAT CCCCCGGGC
TTAA
Vybraný klon obsahuje místo EcoRI následované polylinkerem, který obsahuje následující místa: EciRI, Apal, AvrlI, Pmel, Sfil, Sací, KpnI, Smál, BamHI, Xbal, Sáli, Pstl, Sphl a HindiII.
- pRPA-RD-185:
je to derivát pUC19/GECA obsahující modifikovaný polylinker. pUC19/GECA je digerován pomocí HindlII a ligován s oligonukleotidovým linkerem 2:
·· · ······ ·· ·· • · · · · · · ···· • · «··· · · ·*· ··· • · · * · · · · ·
Linker 2: AGCTTTTAAT TAAGGCGCGC CCTCGAGCCT GGTTCAGGG
AAATTA ATTCCGCGCG GGAGCTCGGA CCAAGTCCC
TCGA
Vybraný klon obsahuje místo HindlII, místo v prostředí polylinkeru, který obsahuje zejména následující místa: EciRI, Apal, AvrlI, Pmel, Sfil, Sací, KpnI, Smál, BamHI, Xbal, Sáli, Pstl, Sphl, HindlII, PacI, AscI Xhol a EcoNI.
C) Konstrukce vektoru pRP T:
- pRP 0:
je to derivát pRPA-RD-153 obsahující kazetu exprese HPPD, dvojitý histonový promotor - TEV - gen HPPD terminátor NOS. Tiby se vytvořil pRP 0 byl pRPA-RD153 digerován pomocí Hind III, ošetřený Klenowem potom opět digerován pomocí Ncol, aby se odstranil gen oxy a nahradil genem HPPD vzniklým z plazmidu pRP A digescí BstEII, působením Klenowa a opětnou digescí pomocí Ncol.
- pRP R:
pro jeho získání byl plazmid pRP 0 digerován pomocí PvuII a Sací, chimérický gen byl purifikován potom ligován v pRPA-RD, který byl digerován pomocí PvuII a Sací.
- pRP T:
byl získán ligací chimérického genu vzniklého z pRP R po digescí pomocí Sací a HindlII v plazmidu pRPA-BL 150 alpha2 digerovaný stejnými enzymy (Evropská přihláška vynálezu EP N°0 508 909).
·· · ·· ···· ·· ·· ···· · · · ···· ··· ··· ···· • · · · · · · · ··· ··· • · · · · · · · · ·· ··· 99 ·· ·· ··
Chimérický gen vektoru má následující strukturu:
dvoj itý TEV kóduj ící terminátor nos
histonový oblast HPPD
promotor
D) Konstrukce vektoru pRP V
- pRP P:
je to derivát pRPA-RD-7 (Evropská přihláška vynálezu EP n°0 652 286) obsahující optimalizovaný tranzitní peptid následovaný genem HPPD. Byl získán ligací kódující části HPPD vzniklé z pRP A digescí BstEII a Ncol působením 'Klenowa a plazmidu pRPA-RD-7, který byl digerován Sphl a AccI a ošetřen DNA-polymerasou T4.
- pRP Q:
pRP Q byl odvozen od pRPA-RD-153 obsahující optimální kazetu exprese HPPD, dvojitý histonový promotor - TEV - OTP gen HPPD - terminátor NOS. Aby se vytvořil pRP 0 byl pRPA-RD-153 digerován pomocí Sai I ošetřený Klenowem potom opět digerován pomocí Ncol, aby se odstranil gen oxy a nahradil genem HPPD vzniklým z plazmidu pRP A digescí BstEII, působením Klenowa a opětnou digescí pomocí Ncol.
- pRP S:
pro jeho získání byl plazmid pRP Q digerován pomocí PvuII a Sací, aby vznikl chimérický gen, který byl ligován v pRPA-RD-185, který byl digerován pomocí PvuII a Sací.
- pRP V:
byl získán ligací chimérického genu vzniklého z pRP S po digesci pomocí Sací a HindlII v plazmidu pRPA-BL 150 alpha2 (Evropská přihláška vynálezu EP N°0 508 909) .
Chimérický gen vektoru má následující strukturu:
dvoj itý TEV OTP kóduj ící terminátor nos
histonový oblast HPPD
promotor
Příklad 3: Transformace průmyslového tabáku PBD6
Aby se určil účinek těchto dvou chimérických genů, byly tyto geny transformovány do průmyslového tabáku PBD6 podle transformačních postupů a podle postupů regenerace již popsaných v evropské přihlášce vynálezu EP N°0 508 909.
1) Transformace:
Vektor byl vložen do neonkogenního kmene Agrobacterium EHA 101 (Hood et al., 1987) nesoucího kosmid pTVK 29 (Komáři et al., 1986). Technika transformace je založena na metodě popsané Horshem et al., (1985) v Science, 227, 1229-1231°.
2) Regenerace:
Regenerace tabáku PBD6 (pochází z SEITA France) z listových fragmentů byla provedena v kultivačním prostředí Murashige et Skoog (MS) obsahujícím 30 g/1 sacharosy stejně jako 100 pg/ml kanamycinu. Listové části přeneseny na rostliny ve skleníku nebo rostlin byly in vitro a transformovány podle techniky listových terčů (Science 1985, Vol 227, p. 1229-1231) ve třech následných etapách: První etapa zahrnuje indukci výhonků na kultivační půdě MS obohacené o 30 g/1 sacharosy obsahující 0,05 mg/1 naftyloctové kyseliny (ANA) a 2 mg/1 benzylaminopurinu (BAP) po dobu 15 dní. Výhonky vytvořené v průběhu této etapy byly
potom podrobeny kultivaci v mediu MS, které bylo obohaceno o 30 g/1 sacharosy, ale neobsahovalo žádný hormon, po dobu 10 dní. Potom byly vyvinuté výhonky odebrány a kultivovány v kultivační půdě pro zakořenění MS s polovičním obsahem solí, vitamínů a cukrů a s žádným obsahem hormonů. Po 15 dnech byly zakořeněné výhonky vloženy do půdy. Získané rostliny byly nazvány Co 17.
Transformované rostliny tabáku byly aklimatizovány ve skleníku (60% relativní vlhkost; teplota: 20°C přes noc a 23 °C během dne) po dobu pěti týdnů a pak ošetřeny
4-[4-CF3-2-(methylsulfonyl)benzoyl]-5-cyklopropyl-izoxazolem.
Kontrolní tabák, netransformovaný a ošetřený 4-[4-CF3-2-(methylsulfonyl)benzoyl]-5-cyklopropyl-izoxazolem v dávkách od 50 do 400 g/ha vyvinul během 72 hodin chlorózy, které se zvětšily, aby se vyvinuly velmi výrazné nekrózy v jednom týdnu (pokrývající okolo 80% listů).
Po transformaci tohoto tabáku, který silně exprimuje HPPD P. fluorences je tato rostlinavelmi dobře ochráněn proti ošetření 4-[4-CF3-2-(methylsulfonyl)benzoyl]-5-cyklopropyl-izoxazolem v dávce 400 g/ha.
Jestliže je tento silně exprimovaný enzym v chloroplastu, totiž je-li jeho transformace provedena s genem neseným vektorem pRP V, tak je rostlina úplně ochráněna a nevyjadřuje žádný sympton.
Příklad 4: Transformace průmyslového tabáku PBD6 s genem
EPSPS pro => konstrukce 173
Izolace cDNA kódující EPSPS kukuřice:
Byly popsány různé etapy, které vedly k získání cDNA
EPSPS kukuřice, které sloužily substrátu k vložení dvou
• · • · · · · · • · mutací. Každá tato operace popsaná dále je uvedená v příkladech a odpovídá výběru mezi účinnými metodami vhodnými pro získání stejných výsledků. Tento výběr nemá žádný vliv na kvalitu výsledků a naopak, každá přizpůsobená metoda může být odborníky použita pro získání stejných výsledků. Většina metod komplexních projektových studií fragmentů DNA je popsána v Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1 a 2, Ausubel F.M. et al., publikovaný Greene Publishing Associates et Wiley - Interscience (1989) (V další části práce budou odkazy citovány jako ref. CPMB). Operace zahrnující DNA, které byly provedeny podle protokolů popsaných v této práci jsou zejména následující: ligace fragmentů DNA, působení DNA-polymerasy podle Klenowa a působení T4 DNA-polymerasy, příprava DNA plazmidu a bakteriofágů λ bud’ minipreparací nebo maxipreparací, analýza DNA a RNA podle technik Southern a Northern. V této práci byly popsány i jiné metody a jejich modifikace nebo významné úpravy těchto metod v protokolech.
1. Získání fragmentu EPSPS Arobidopsis thaliana
a) dva oligonukleotidy 20 mer následujících sekvencí
5'-GCTCTGCTCATGCTGCTCC-3'
5'-GCCCFCCCTTGACAAAGAAA-3' se syntetizují od sekvence genu EPSPS Arobidopsis thaliana (Klee H.J. et al. , (1987) Mol. Gen. Genet., 210, 437-442). Tyto dva oligonukleotidy jsou v poloze 1523 až 1543 a 1737 až 1717 publikované sekvence a v konvergentní orientaci.
b) úplná DNA Arobidopsis thaliana (var. Columbia) se získá od Clontech (katalogový odkaz: 6970-1)
c) Smíchá se 50 nanogramů (ng) DNA s 300 ng každého • · • Φ • · · a · oligonukleotidu a podrobí se 35 amplifikačním cyklům pomocí přístroje Perkin-Elmer 9600 za podmínek standardního prostředí pro amplifikaci podle doporučení výrobce. Výsledný fragment o 204 pb obsahuje fragment EPSPS Arobidops is thaliana.
2. Konstrukce knihovny cDNA od buněčné linie kukuřice BMS.
a) Rozmačká se 5g filtrovaných buněk do kapalného dusíku a nukleové kyseliny se extrahují podle metody popsané Shure et al., s následujícími modifikacemi:
- pH lyzovacího pufru je udržováno na hodnotě 9,0
- po srážení isopropanolem, sraženina se vloží do vody a po rozpuštění se koncentrace upraví na 2,5 M LiCl. Po inkubaci po dobu 12 hodin při °C se sraženina po odstřeďování po dobu 15 minut při 30000g při teplotě 4°C se znovu rozpustí. Opakuje se srážení pomocí LiCl. Znovu rozpuštěná sraženina obsahuje frakci RNA nukleových kyselin.
b) Frakce RNA-polyA-ř frakce RNA se získá chromatograficky na celulosové koloně oligo-dT takové, jaká je popsána v Current Protocols in Molecular Biology.
c) · Syntéza dvouvláknové cDNA se syntetickým koncem
EcoRI: se provede podle protokolu dodavatele nezbytných reagentů pro tuto syntézu ve formě soupravy: copy kit společnosti In Vitrogen.
Dva jednovláknové oligonukleotidy komplamentární sekvencím:
5'-AATTCCCGGG-3'
5'-CCCGGG-3'(tato sekvence byla fosforylována) se ligují s dvouvláknovou cDNA s přesahujícími konci.
• · * « · · • · *> · ·
Tato ligace adaptorů vytvoří místo Smsa I spojené s dvouvláknovou cDNA a EcoRI v kohezní formě ke každému konci dvouvláknové cDNA.
d) Vytvoření knihovny:
cDNA, které mají na svých koncích umělá kohezní místa EcoRI se ligují s- cDNA bakteriofága ÁgtlO štěpeného EcoRI a defosforylovaného podle protokolu dodavatele New England Biolabs.
Alikvotní část ligační reakce se enkapsiduje in vitro s extrakty enkapsidace. : Gigapak Gold podle doporučení dodavatele, tato knihovna se označí za použití bakterie E. coli CčQOhfl. Takto získaná knihovna se amplifikuje a skladuje podle doporučení výrobce a tvořila knihovnu cDNA buněčné suspenze kukuřice BMS.
3. Třídění knihovny cDNA buněčné suspenze kukuřice BMS se sondou EPSPS Arobidopsis thaliana·.
Následující protokol je protokol Current Protocols in Molecular Biology Vol. 1 a 2, Ausubel' F.M.et al. , publikován Greene Publishing Associates a S (1989) (CPMB). Ve zkratce: okolo 106 rekombinantních fágů se rozprostře na kultivační misce LB s průměrnou denzitou 100 fágů / cm2. Fágy po lyse se replikují dvojnásobně na membráně Hybond N Amersham.
h) DNA se fixuje na filtrech působením UV 1600kJ (Stratalinker Stratagene). Iontové filtry se předem hydridují v 6xSSC/0,l% SDS/0,25 odtučněného mléka po dobu 2 hodin při teplotě 65°C. Sonda EPSPS Arobidopsis thaliana se značí 32p-dCTP random-primiting podle doporučení výrobce (Kit Ready to Go Pharmacia). Získaná specifická aktivita se upraví na hodnotu 108 cpm na pg fragmentu. Po denaturaci během 5 minut při teplotě.. 100°C, se sonda přidá do prostředí
prehybridace, hybridace se sleduje po dobu 14 hodin při teplotě 55°C. Filtry se fluorografují 48 hodin při teplotě -80°C filmem Kodak XAR5 a zesilovačem Hyperscreen RPN Amersham. Postavení pozitivních bodů na filtru s miskami, kde vznikly umožňuje odebrat na misce zónu odpovídající fágům, které vyjadřují pozitivní hybridační odpověď se sondou EPSPS Arobidopsis thaliana. Tato etapa rozložení, přenuos, hybridace, získání je opakována až do doby, kdy všechny body fágů na kultivační misce postupně purifikované se ukazují pozitivní ve 100% hybridace. Plak lysy samostatným fágem se vloží do rozředěné půdy λ (Tris-Cl pH=7,5; 10 mM MgSO4; 0,1 M NaCl; 0,1% želatiny), tyto fágy v roztoku tvoří pozitivní klony EPSP buněčné suspenze kukuřice BMS.
4. Příprava a analýza DNA klonů EPSPS buněčné suspenze kukuřice BMS .
Přibližně 5.108 fágů se přidá ke 20 ml bakterií C600hfl o 2 OD 600 nm/ml a inkubuj e po dobu 15 minut při teplotě 37°C. Tato suspenze se rozředí v 200 ml bakteriální kultivační půdy v Erlenmayerově baňce o obsahu 1 litr a míchá na rotačním míchadle při 250 rpm. Lysá se zjišťuje vyčeřením půdy, což odpovídá lyse bakteriálního zákalu a objevuje se po 4 hodinách míchání. Supernatant se zpracuje tak, jak je popsáno v Current Protocols in Molecular Biology. Získaná DNA odpovídá klonům EPSP buněčné suspenze- kukuřice BMS.
Jeden až dva pg této DNA se štěpí pomocí EcoRI a separuje na . 0,8% agarosovém gelu LGTA/TBE (ref. CPMB). Poslední ověření spočívá v ujištění, že purifikovaná DNA představuje signál hybridizace se sondou EPSPS Arabidopsis thaliana. Po elektroforéze se fragmenty DNA přenesou na membránu Hybond N Amersham podle protokolu Southern popsaného v Current Protocols in Molecular Biology. Filtr se hybriduje se sondou EPSPS Arabidopsis thalianapodle podmínek « · • · ·« · ·
• · · * • · · · • · · · · · • · • · · · 23 popsaných v paragrafu 3. Klon představující signál hybridizace se sondou EPSPS Arabidopsís thaliana a obsahující nejdelší fragment EcoRI má velikost stanovenou na gelu okolo
1,7 kpb.
5. Získání klonu pRPA-ML-711
Deset μσ DNA fágového klonu obsahujícího inzert o 1,7 kpb se digeruje pomocí EcoRI a separuje na 0,8% agarosovém gelu LGTA/TBE (ref. CPMB). Fragment gelu, který obsahuje inzert c 1,7 kpb se vyřízne z gelu zbarveného BET a fragment se ošetří β-agarosou podle doporučení dodavatele New a Biolabs. Purifikovaná DNA fragmentu o 1,7 kpb se liguje při teplotě 12 °C po dobu 14 hodin s DNA plazmidů pUC 19 (New England Biolabs), štěpí pomocí EcoRI podle protokolu ligace popsaného v Current Protocols in Molecular Biology. Dva μΐ ligační směsi se použije pro transformaci alikvotní části E. coli DH10B elektrokompetentní; transformace se provádí elektroporací za použití následujících podmínek: směs příslušných bakterií a ligační půda se vloží do kyvety pro elektroporací o tloušťce 0,2 cm (Biorad) předem zchlazené na 0°C. Fyzikální podmínky elektroporace využívající elektoporátor značky Biorad jsou: 2500 Voltů, 25 pg Faradů a 200 Ω. Za těchto podmínek čas výboje kondenzátoru je okolo 4,2 milisekund. Bakterie se vloží do 1 ml půdy SOC (ref.
CPMB) a míchají se po dobu jedné hodiny při 200 rpm na rotačním míchadle ve zkumavkách Corning o objemu 15 ml. Po rozložení na půdě LB/agar doplněné 100 pg/ml carbenicilinu, se provede minipreparace bakteriálních klonů po noci při teplotě 37 °C podle protokolu popsaného v Current Protocols in Molecular Biology. Po digesci pomocí EcoRI DNA a separaci pomocí elektroforézy na 0,8 % agarosovém gelu LGTA/TBE (ref.
CPMB) jsou klony představující inzert o 1,7 kpb konzervovány.
Poslední ověření spočívá v ujištění, že purifikovaná DNA představuje signál hybridizace se sondou EPSPS Arabidopsis thaliana. Po elektroforéze se fragmenty DNA přenesou na membránu Hybond N Amersham podle protokolu Southern popsaného v Current Protocols in Molecular Biology. Filtr se hybriduje se sondou EPSPS Arabidopsis thaliana podle podmínek popsaných v paragrafu 3. Plazmidový klon představující inzert o 1,7 kpb se sondou EPSPS Arabidopsis thaliana se připraví v největším množství a výsledná DNA pocházející z lysy bakterií se purifikuje v gradientu CsCl tak, jak je popsáno v Current Protocols in Molecular Biology. Purifikovaná DNA se částečně sekvenuje soupravou Pharmacia za dodržení doporučení dodavatele a za použití jako nástrojů univerzálních nástrojů M13, přímých a inverzních, objednaných od stejného dodavatele. Vytvořená částečná sekvence pokrývá okolo 0,5 kpb. Aminokyseliny odvozené sekvence v oblasti vyzrálého proteinu (okolo 50 zbytkových aminokyselin) představují 100% identitu s aminovou sekvencí odpovídající vyzrálé EPSPS kukuřice popsané v americké přihlášce vynálezu USP 4 971 908). Tento klon odpovídající fragmentu EcoRI o 1,7 kpb kyseliny DNA EPSP kukuřičné buněčné susupenze BMS byl nazván pRPA-ML-711. Úplná sekvence tohoto klonu se provádí na dvou vláknech za použití protokolu soupravy Pharmacia a za syntézy komplementárních oligonukleotidů a všech opačných směrů o 250 pb. Získaná úplná sekvence klonu o 1713 pb je vyjádřena SEQ ID N°2.
6. Získání klonu pRPA-ML-715:
Analýza sekvence klonu pRPA-ML-711 a zejména porovnání odvozených sekvence aminokyselin se sekvencí aminokyselin kukuřice ukazuje rozšíření sekvence o 92 pb proti směru kodonu GCG kódujícího Alanin NH2-konce části zralého EPSPS kukuřice (americká přihláška vynálezu USP 4 971 908) . Lze dokonce pozorovat rozšíření o 288 pb po směru kodonu AAT
kódujícího asparagin COOH-konce vyzrálé části EPSPS kukuřice (americká přihláška vynálezu USP 4 971 908) . Tyto dvě části by měly odpovídat pro rozšíření HN2-konce části sekvence tranzitního peptidů plastidiální lokalizaci a pro extenzi 3'oblasti COOH-konce nepřeložené cDNA.
Aby se získala cDNA kódující vyzrálou část cDNA EPSPS kukuřice tak, jak je popsáno v USP 4 971 908, byly provedeny následující operace:
a) Eliminace nepřeložené 3'oblasti: konstrukce pRPA-ML-712 :
Klon pRPA-ML-711 se štěpí restrikčním enzymem Asel a vzniklé konce tohoto štěpení se zbaví přesahů působením Klenowa fragmentu DNA-polymerasy I podle protokolu popsaného v CPMB. Potom se provede štěpení restrikčním- enzymem SacII. Výsledná DNA pocházející z těchto operací se separuje elektroforeticky na 1% agarosovém gelu LGTA/TBE (ref. CPBM).
Fragment gelu obsahující inzert Asel-přesahující konce/SacII o 0,4 kpb se vyřízne z gelu a purifikuje podle protokolu popsaného v paragrafu 5. DNA klonu pRPA-ML-71i se štěpí restrikčním enzymem HindlII umístěným v polylinkeru vektoru klonovaném pUC19 a výsledné konce tohoto štěpení se zbaví přesahů působením Klenowa fragmentu DNA-polymerasy I. Potom se provede štěpení restrikčním enzymem SacII. Výsledná DNA pocházející z těchto operací se separuje elektroforeticky na 0,7 % agarosovém gelu LGTA/TBE (ref. CPBM).
Fragment gelu obsahující inzert HindlII-přesahující konce/SacII o 3,7 kpb se vyřízne z gelu a purifikuje podle protokolu popsaného v paragrafu 5.
Ligují se dva inzerty a 2 μΐ ligační směsi pak slouží k transformaci E. coli DHIOB tak, jak je výše popsáno v paragrafu 5.
Analyzoval se obsah plazmidové DNA různých klonů podle
protokolu popsaného pro pRPA-ML-711. Jeden z plazmidových klonů obsahuje inzert EcoRI-HindlII o 1,45 kpb. Konce sekvence tohoto klonu prozrazují, že 5'konec inzertu přesné odpovídá konci odpovídajícímu pRPA-ML-711 a že 3'konec je vyjádřen následující sekvencí:
5'-AATTAAGCTCTAGAGTCCTGCAGGCATGCAAGCTT-3'.
Podtržená sekvence odpovídá kodonu aminokyseliny COOH-konce asparaginu, následující kodon odpovídá terminačnímu kodonu translace. Nukleotidy po směru odpovídají elementům sekvence polylinkeru pUC19. Tento klon obsahující sekvenci pRPAML-711 až k místu terminace translace vyzrálého EPSPS kukuřice a následné sekvence poylinkeru pUC19 až k místu HindlII byl pojmenován pRPA-ML-712.
b) Modifikace 5'konce pRPA-ML-712: konstrukce pRPA-ML-715
Klon pRPA-ML-712 se štěpí restrikčními enzymy Pstl a HindlII. DNA pocházející z této manipulace se separuje elektroforeticky na 0,8 % agarosovém gelu LGTA/TBE (ref.
CPBM) . Fragment gelu obsahující inzert Pstl/EcoRI o 1,3 kpb se vyřízne z gelu a purifikuje podle protokolu popsaného v paragrafu 5. Tento inzert se podrobí ligaci za přítomnosti ekvimolárního množství každého oligonukletidu částečně komplementárního následující sekvence:
Oligo 1:
5'-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3'
Oligo 2:
5'-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3' stejně jako v přítomnosti DNA plazmidu pUC19 digerovanéno restrikčními enzymy BamHI a HindlII.
Dva μΐ ligační směsi se podrobí transformaci E. coli
DHIOB tak, jak je popsáno výše v paragrafu 5. Po analýze obsahu plazmidové DNA různých klonů, podle postupu popsaného v paragrafu 5, klony vyjádřené v inzertu o 1,3 kpb se konzervují pro pozdější analýzu. Sekvence 5'konce zachovaného klonu odhaluje, že sekvence DNA v této oblasti je následující: sekvence polylinkeru pUC19 míst EcoRI až BamKI následovaná sekvencí oligonukleotidů použitých ke klonování a následovaná zbytkem sekvence přítomné v pRPAML-712. Tento klon byl pojmenován pRPA-ML-713. Tento klon vyjadřuje kodon methioninu ATG obsažený v místě Ncol proti směru kodonu alaninu N-konce vyzrálé EPSPSsynthasy. Navíc kodony alaninu a glycinu N-konce se zachovávají s modifikací na třetí proměnlivé basi: počáteční GCGGGT dává modifikovaný GCCGGC.
Klon pRPA-ML-713 se štěpí restrikčním enzymem HindlII a přesahující konce tohoto štěpení se odstraní působením Klenowovou DNA polymerasou I. Potom se provede štěpení restrikčním enzymem Sací. DNA, která vznikla těmito operacemi se separuje elektroforeticky na 0,8% agarosovém gelu LGTA/TBE (ref. CPBM) . Fragment gelu obsahující inzert HindlII-přesahující konce/SacI o 1,3 kpb se vyřízne z gelu a purifikuje podle protokolu popsaného v paragrafu 5. Tento inzert se podrobí ligaci za přítomnosti DNA plazmidů pUC19 digerovaného restrikčním enzymem Xbal a přesahující konce se odstraní tímto štěpením působením Klenowovou DNA polymerasou I. Potom se provede štěpení restrikčním enzymem Sací. Dva μΐ ligační směsi se podrobí transformaci E. coli DHIOB tak, jak je popsáno výše v paragrafu 5, klony vyjádřené v inzertu o 1,3 kpb se konzervují pro pozdější analýzu. Sekvence konců zachovaného klonu naznačuje, že sekvence DNA je následující: sekvence polylinkeru pUC19 míst EcoRI až Sací následovaná· sekvencí oligonukleotidů použitých ke klonování deletovaných 4 pb GATCC popsaného oligonukleotidů 1 následovaná zbytkem sekvence přítomné v pRPAML-712 až k místu HindlII a sekvencí polylinkeru pUC19 Xbai až HindlII. Tento klon byl pojmenován
pRPA-ML-715.
7) Získání cDNA kódující mutovaný EPSPS kukuřice
Všechny etapy mutageneze se provedou s USE mutagenní soupravou Pharmacia za dodržení podmínek určených dodavatelem. Princip systému mutageneze je následující: plazmidová DNA se denaturuje teplem a znovu spojí v přítomnosti molárního nadbytku části oligonukleotidu mutageneze a další části oligonukleotidu umožňujícího eliminovat místo restrikčního enzymu přítomného v polylinkeru. Po této etapě opětného spojení se provede syntéza komplementárního vlákna působením T4 DNA-polymerasy v přítomnosti T4 DNA.-ligasy a proteinu genu 32 v pufru doporučeném dodavatelem. Produkt syntézy se inkubuje v přítomnosti restrikčního enzymu, jehož místo se předpokládá odstanit mutagenezí. Kmen E. coli vyjadřující zejména mutaci mutS se použije jako hostitel pro transformaci této DNA. Po růstu v kapalné kultivačnípůdě je plazmidová DNA připravena a inkubovaná v přítomnosti restrikčního enzymu použitého předem. Po tomto ošetření kmen E. coli DHIOB se použije jako hostitel pro transformaci. Plazmidová DNA izolovaných klonů je připravena a přítomnost mutace se ověří sekvenováním.
A) modifikace míst nebo sekvence bez vlivu na vlastnosti rezistence EPSPS kukuřice ke kompetitivním inhibitorům aktivity EPSP synthasy: eliminace místa Ncol interního pRPA-ML-715.
Sekvence pRPA-ML-715 se očísluje arabskými číslicemi při umístění první base kodonu alaninu N-konce GCC v poloze 1. Tato sekvence vyjadřuje Ncol v poloze 1217. Modifikovaný oligonukleotid místa představuje sekvence:
5'-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3'.
β · • · * • · · • · · * · » β ·
Po sekvenování podle odkazů na odbornou literaturu uvedenou dále sekvence lue po mutagenezí odpovídá sekvenci použitého oligonukleotidu. Místo Ncol se eliminuje a translace nukleových kyselin v této oblasti zachovává počáteční sekvenci přítomnou v pRPA-ML-715.
Tento klon je pojmenován jako pRPA-ML-716.
Sekvence o 1340 bp tohoto klonu je vyjádřena sekvencí SEQ ID N°3 a SEQ ID N°4.
B) modifikace sekvence umožňující zlepšení rezistenčních vlastností EPSPS kukuřice k kompetitivním inhibitorům aktivity EPSP-synthasy.
Použily se následující oligonukleotidy:
a) mutace Thr 102 => Ile.
5'-GAATGCCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3'
b) mutace Pro 106 => Ser.
5'-GAATGCCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'
c) mutace Gly 101 => Ala a Thr 102 => Ile.
' -CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3'
d) mutace Thr 102 => Ile a Pro 106 => Ser.
5'-GGGGAATGATCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'
Po sekvenování sekvence lue po mutagenezí na třech mutovaných fragmentech je identická rodičovské sekvenci DNA pRPA-ML-716 kromě mutagenizované oblasti, která odpovídá sekvenci použité oligonukleotidové oblasti. Tyto klony jsou nazvány: pRPA-ML-717 pro mutaci Thr 102 => Ile, pRPA-ML-718 pro mutaci Pro 106 => Ser, pRPA-ML-719 pro mutace Gly 101 => Ala a Thr 102 => Iie, pRPA-ML-720 pro mutace Thr 102 => Ile a Pro 106 => Ser.
Sekvence o 1340 bp pRPA-ML-720 je vyjádřena SEQ ID N°5 • · · ·· · ·· • o · · · · • · · · · ·····* ··· ···· · · a a a·· ·· ·· ·· ** a SEQ ID N°6.
Inzert NcoI-HindlII o 1395 pb je základem všech konstrukcí použitých pro transformaci rostlin pro vložení rezistence ke kompetitivním herbicidním inhibitorům EPSPS a zejména resistence ke glyphosatu. Tento inzert bude dále pojmenován, jako dvoujnásobný mutant EPSPS kukuřice.
B·Tolerance ke glyphosatu různých mutantů in vitro.
2a: Extrakce EPSP-synthasy
Do plazmidového vektoru pTrc99a (Pharmacia, ref. 27-5007-01) štěpeného Ncol a HindlII se vloží se různé geny EPSP-synthasy ve formě kazety NcoI-HindlII. Rekombinantní E. coli. DH10B silně exprimující různé EPSP-synthasy se sonifikují ve 40 ml pufru pomocí 10 g usazených buněk a promyjí stejným pufrem (200 mM tris HCl pH 7,8, 50 mM merkaptoethanol, 5 mM EDTA a 1 mM PMSF) , ke kterému se přidá 1 g polyvinylpyrolidonu. Suspenze se míchá po dobu 15 minut při teplotě 4°C a potom se odstřeďuje po dobu 20 minut při 27000 g a teplotě 4°C.
Supernatant se přidá k síranu amonnému až po dosažení 40% nasycenosti síranu amonného. Směs se odstředí po dobu 20 minut při 27000 g a teplotě 4°C.
Nový supernatant se přidá k síranu amonnému až po dosažení 70% nasycenosti roztoku síranu amonného. Směs se odstředí po dobu 30 minut při 27000 g a teplotě 4°C. EPSP-synthasa přítomná v proteinové usazenině se vloží do 1 ml pufru (200 mM tris HCl pH 7,8, 50 mM merkaptoethanol).
Tento roztok se dialyzuje přes noc proti dvěma litrům tohoto pufru při teplotě 4°C.
2b: Enzymová aktivita
Aktivita každého enzymu stejně, jako jeho rezistence ke glyphosatu se měří in vitro po dobu 10 minut při teplotě 37°C
v následující reakční směsi: 100 mM kyselina maleinová pH 5,6, 1 mM fosfoenolpyruvát, 3 mM šikimát-3-fosfát (připravený podle Knowles P. F. et Sprinson D. 3. 1970. Methods in Enzymol 17A, 351-352 od Aerobacter aerogenes druh ATCC 25597) a 10 mM fluorid vápenatý. Enzymový extrakt se přidá na poslední chvíli po přidání glyphosatu, jehož konečná koncentrace se pohybuje od 0 do 20 mM.
Aktivita se měří množstvím uvolněného fosfátu podle techniky Tausky H. A. et Shorr E. 1953. J. Biol. Chem. 202, 675-685. Za těchto podmínek divoký enzym (WT) se inhibuje 85 % při koncentraci 0,12 mM glyphosatu. V této koncentraci mutovaný enzym známý jako Serl06 se inhibje jen z 50% a tři další mutanti Ile 102, Ile 102/Serl06, Alal01/Ilel02 nejsou nebo jsou málo inhibované.
Je tedy potřeba znásobit koncentraci glyphosatu desetkrát, a to až na 1,2 mM, pro 50% inhibici mutovaného enzymu Ilel02 u třech dalších mutantů Ilel02, Ilel02/Serl06 a Alal01/Ilel02 a nelyla nikdy inhibice pozorována.
Je potřeba poznamenat, že aktivita mutantů Ala/Ile a Ala nebyla inhibována až do koncentrace 10 mM glyphosatu, a že aktivita mutantu Ilel02/Serl06 se nesnížila dokonce ani byla-li koncentrace glyphosatu násobena dvakrát, tedy na 20 mM.
C. Rezistence transformovaných tabákových rostlin
0-1 Konstrukce plazmidů:
pRPA-RD-124:
K předem získanému pRPA-ML-720 se přidá polyadenylační signál nos za vytvoření kazety klonování obsahující gen EPSPS dvojnásobného mutantu kukuřice (Thr 102 -> Ile a Pro 106 -> Ser) . pRPA-ML-720 se.· digeruje pomocí HindlII « · · · • · · · • · · · · · • ·
ošetřeného Klenowovým fragmentem DNA-polymerasy I E. coli, aby se vytvořil přesahující konec. Provede se druhá digesce pomocí Nco I a fragment EPSPS se purifíkuje. Gen EPSPS se potom liguje s purifikovaným pRPA-RD-12 (kazeta klonování obsahující polyadenylační signál nopalin-synthasy), aby se vytvořil pRPA-RD-124. Aby se získal purifikovaný vektor pRPA-RD-12, bylo potřeba, aby tento vektor byl předem digerován pomocí Sáli, ošetřen pomocí DNA-plymerasou podle Klenowa, potom podruhé digerován pomocí Ncol.
pRPA-RD-125:
Přídavek optimalizovaného transportního peptidu (OTP) k pRPA-RD-124 za vytvoření kazety klonování obsahující cílový gen EPSPS na plazmidech.
pRPA-RD-7 (evropská přihláška vynálezu EP 652 286) se digeruje pomocí Sph I, ošetří pomocí T4 DNA-polymerasou potom digeruje pomocí Spe I a fragment OTP se purifíkuje. Fragment OTP se klonuje v pRPA-RD-124, který se předem digeruje pomocí Ncol, ošetří DNA-polymerasou podle Klenowa, aby se zvýšila protuberance 3', potom digeruje pomocí Spe I. Tento klon se tedy sekvenuje, aby se zajistila přesná překladová fúze mezi OTP a genem EPSPS. Takto se získá pRPA-RD-125.
pRPA-RD-159:
Přídavek dvounásobného promotoru histonu arabinopsis H4A748 (přihláška vynálezu EP 507 698) kpRPA-RD-125, aby se vytvořila kazeta exprese v rostlinách pro expresi genu OTP-gen EPSPS dvounásobný mutant ve tkáni dvouděložných rostlin. pRPA-RD-132 (kazeta obsahující promotor dvounásobný H4A748 (přihláška vynálezu EP 507 698) se digeruje pomocí Ncol a Sac I. Purifikovaný fragment promotoru se potom klonuje a digeruje se pomocí Eco I a Sac I.
pRPA-RD-173:
Přídavek genu promotor H4A748-OTP-gen EPSPS • ·
dvounásobný mutant pRPA-RD-159 do plazmidu pRPA-BL-150A (evropská přihláška vynálezu EP 508 909), aby se vytvořil vektor transformace Agrobacterium tumefaciens. pRPA-RD-159 se potom digeřuje pomocí Not I a ošetří pomocí polymerasy podle Klenowa. Tento fragment se potom klonuje v pRPA-BL-150A pomocí Srna I.
1-1 Transformace
Vektor pRPA-RD-173 se vloží do kmene Agrobacterium tumefaciens EHA101 (Hood et al., 1987) nosiče kosmidu pTVK291 (Komáři et al., 1986). Metoda transformace je založena na postupu Horshe et al. (1985) .
1-2 Regenerace
Regenerace tabáku PBD6 (SEITA France) z listových částí rostlin se provádí na základním médiu Murashige et Skoog (MS) obsahujícím 30 g/1 sacharosy stejně jako 200 gg/ml kanamycinu. Listnaté části rostlin jsou odebrány z rostlin kultivovaných ve skleníku nebo in vivo a transformovány podle techniky listových disků (Science, 1985, Vol 227, 1229-1231) ve třech následných etapách: první etapa zahrnuje indukci výhonků na médiu s přídavkem 30 g/1 sacharosy obsahující 0,05 mg/1 kyseliny naftyloctové (ANA) a 2 mg /1 benzylaminopurinu (BAP) po dobu 15 dnů. Výhonky vytvořené v průběhu této etapy se vyvíjejí po dobu 10 dnů kultivací na kultivační půdě MS obohacené 30 g/1 sacharosy, ale bez obsahu hormonu. Vytvořené výhonky se potom odeberou a kultivují na půdě MS pro zakořenění s polovičním obsahem solí, vitamínů a cukrů a neobsahující hormon. Po 15 dnech se zakořeněné výhonky vloží do země.
• · · ·
1-3 Rezistence ke glyphosatu
Dvacet transformovaných rostlin se regeneruje a vloží do skleníku, aby se vytvořila konstrukce pRPA-RD-173. Tyto rostliny se ve skleníku ošetří ve stádiu pěti listů vodnou suspenzí RoundUp v dávce 0,3 kg aktivního glyphosatu na hektar.
Výsledky zvýšeného tři konstatovat, odpovídají pozorování indexu fytotoxicity týdny po ošetření. Za těchto podmínek lze že rostliny transformované konstrukcí pRPA-RD-173 vyjadřují velmi dobrou toleranci a to takovou, že kontrolní netransformované rostliny jsou úplně zničeny.
Tyto výsledky jasně ukazují zlepšení, které přináší použití chimérického genu podle vynálezu pro stejný gen kódující rezistenci ke glyphosatu.
Příklad 5: Transformace průmyslového tabáku PBD6 genem nitrilasy (pro =>konstrukce 238):
Tento tabák se získá podle evropské přihlášky vynálezu n°0 337 899 na straně 6, řádku 50 a od konstrukce 238, která je popsána pod jménem pRPA-BL238.
Příklad 6: Křížení opylením
Křížení linií Co 17, 173 a 238 se provádí opylením ve skleníku:
Co 17 se kříží s 238, aby se získaly tabákové rostliny PBD6 pro testování na dvounásobnou toleranci k isoxaflutolu a ke bromoxynilu (rostliny HPPD + OXY) a
Co 17 se kříží s 173, aby se získaly tabákové rostliny PBD6 pro testování na dvounásobnou toleranci k
isoxaflutolu a ke glyphosatu (rostliny HPPD + EPSPS).
Tyto tři linie jsou homozygoty oproti původnímu genu: potomstvo je hemizygota pro každý ze dvou genů vložených křížením.
Křížené rostliny se získají na konci šesti týdnů.
Příklad 7: Měření tolerance tabáku po vzklíčení při ošetření isoxaflutolem a bromoxynilem nebo glyphosatem
V této zkoušce každý test se provádí na vzorku deseti rostlin, deset rostlin zůstane neošetřeno.
Všechna ošetření se provádějí rozstřikováním v dávce 500 1 přípravku na hektar.
Pro ošetření v době po vzklíčení se provádí setí a potom se rostliny přepichují do květináčků o rozměrech 9 cm x 9 cm.
Ošetření po vzklíčení se provádí ve stádiu dobře vyvinutých třech až čtyřech lístků. Podíl divokých rostlin a rostlin získaných geneticky transformovaných se dělí na více částí:
a) neošetřený podíl
b) další podíly, které jsou ošetřeny samotnými herbicidy,
-isoxaflutolem po vzklíčení ve dvou dávkách (200 a 400 g/ha),
-bromoxynilem po vzklíčení ve dvou dávkách (400 a 800 g/ha),
-glyphosatem po vzklíčení ve dvou dávkách (800 a 1200 g/ha),.
c) další podíly, které jsou ošetřeny dvěma herbicidy, po vzklíčení v připravené směsi:
-isoxaflutol a bromoxynil ve dvou dávkách (200/400 a 400/800 g/ha),
-isoxaflutol a glyphosat ve dvou dávkách (200/800 a 400/1200 g/ha).
Ošetření se provádí s následujícími formulacemi látek: 75% isoxaflutol, bromoxynil (komerční produkt PARDNER) v koncentované emulgované formě 225 g/1 a glyphosat (Roud-UP).
Za těchto podmínek lze pozorovat v následující tabulce 17 dní po ošetření následujícími fytotoxiny vyvolanou destrukci v procentech, stejně jako počet rostlin na podíl a dávku herbicidu či herbicidů vyjádřených v gramech aktivní hmoty na hektar:
Ošetření po vzklíčení isoxaflutolem a bromoxynilem nebo glyphosatem
Herbicid v g/1 Rostliny s tolerantními geny
* HPPD + OXY * HPPD + EPSPS * bez genu = divoké
Kontroly 10 10 10
isoxaflutol 200 samotný 400 20 20 4% 5% 20 20 2% 3% 10 75% 85%
bromoxynil 400 samotný 800 10 10 3% 0% 10 10 0% 0%
Glyphosat 800 samotný 1200 20 20 0% 0% 10 10 100% 100%
isoxaflutol 200 + bromoxynil 400 20 20% 10 100% 100%
isoxaflutol 400 + bromoxynil 800 20 30% 10 100%
isoxaflutol 200 + Glyphosat 800 40 5% 10 100%
isoxaflutol 400 + Glyphosat 1200 40 10% 10 100%
*počet rostlin
Příklad 8
Za účelem studie, může-li být gen HPPD Pseudomonas fluorescens použit jako značící gen v průběhu cyklu transformace - -regenerace rostlinného druhu, se tabák transformuje chimérickým genem tvořeným genem HPPD a genem EPSPS dvounásobně mutovaným pro rezistenci ke glyphosatu a transformované rostliny rezistentní současně ke isoxaflutolu
a glyphosatu se získají po selekci na isoxaflutol.
Materiál, metody a výsledky
Chimérický gen pRP2012, popsaný dále, se transformuje do průmyslového tabáku PBD6 podle transformačních a regeneračních postupů již dříve popsaných v evropské přihlášce vynálezu EP n°0 508 909.
Chimérický gen vektoru pRP 2012 má následující strukturu A-B, ve které:
A je:
Dvoj itý TEV OTP kóduj ící terminátor
histonový promotor oblast HPPD nos
a B j e :
Dvoj itý TEV OTP kóduj ící terminátor
histonový oblast nos
promotor EPSPS
jako ve vektoru pRPA-RD-173.
Chimérický gen pRP 2012 se vloží do tabáku.
1) Transformace
Vektor pRPA-RD-173 se vloží do neonkogenního kmene Agrobacterium EHA101 (Hood et al. , 1987) nosiče kosmidu pTVK291 (Komáři et al., 1986) . Metoda transformace je založena na postupu Horshe et al. (1985).
1-2 Regenerace
Regenerace tabáku PBD6 (SEITA France) z listových částí rostlin se provádí na základním médiu Murashige et Skoog (MS) obsahujícím 30 g/1 sacharosy stejně jako 350 pg/ml cefotaximu a 1 mg/1 isoxaflutolu. Listnaté části rostlin jsou odebrány z • · ·· · ··« rostlin kultivovaných ve skleníku nebo z rostlin kultivovaných in vivo a transformovány podle techniky listových disků (Science, 1985, Vol 227, 1229-1231) ve třech následných etapách: první etapa obsahuje indukci výhonků na médiu s přídavkem 30 g/1 sacharosy obsahující 0,05 mg/1 kyseliny naftyloctové (ANA) a 2 mg/1 benzylaminopurinu (BAP) po dobu 15 dnů. Výhonky vytvořené v průběhu této etapy se vyvýjejí po dobu 10 dnů kultivací na kultivační půdě MS obohacené 30 g/1 sacharosy a 1 mg/1 isoxaflutolu, ale bez obsahu hormonu. Vytvořené výhonky se potom odeberou a kultivují na půdě MS pro zakořenění s polovičním obsahem solí, vitamínů a cukrů a neobsahující hormon. Po 15 dnech se zakořeněné výhonky vloží do země.
Všechny klíčící rostliny získané podle tohoto protokolu se analyzují pomocí PCR se specifickými nástroji HPPD P. fluorescens. Tato PCR analýza umožňuje potvrdit, že všechny takto získané klíčící rostliny dobře začlenily gen HPPD, a že mají toleranci současně k isoxaflutolu a ke glyphosatu za podmínek popsaných v příkladu 7.
Závěrem, tato zkouška potvrzuje, že gen HPPD může být použit jako značící gen, a že spojení tohoto genu s isoxaflutolem může být dobrý činitel selekce.
Příklad 9: Rostlina s genem HPPD a genem bar rezistentní současně k isoxaflutolu a k phosphinothrycinu
1. Konstrukce chimérického genu se sekvencí HPPD:
Plazmid pRPA-RD-1004 vyjádřený na obrázku 4 se získá vložením chimérického genu rezistence k isoxazolu do plazmidů pUC 19 o 2686 pb vytvořeného v New England Biolabs (Yannish-Perron, C. Viera, J. a Massing, J. (1985) Gene 33, 103-119 a obsahujícího rezistenci k ampicilinu.
9999
9 9 chimérického genu jsou ve smyslu
Různé elementy translace:
- histonový promotor H3C4 kukuřice o 1020 pb popsaný v přihlášce vynálezu EP 0 507 698;
- intron genu alkoholdehydrogenasy 1 kukuřice popsaný
Sachsem et al., Genecics 113: 449-467 (1987) a tvořený 536 pb optimalizovaný tranzitní peptid (OTP) popsaný v přihlášce vynálezu EP 0 508 909; tento OTP je tvořen 171 pb tranzitního peptidu peptidové podjednotky Ribulosy 1,5 bifosfatkarboxylasy / oxygenasy Helianthus annuus (Waksman G. et al., 1987, Nucleic acids Res. 15: 7181) následované 66 pb vyzrálé části malé podjednotky Ribulosy 1,5 bifosfatkarboxylasy / oxygenasy Zea mays (Lebrun et al. , Res. 15:
peptidové bifosfatkarboxylasy / oxygenasy Zea mays (Lebrun et al., 1987, Nucleic acids Res. 15: 4360); dohromady tvoří tedy 387 pb;
kódující oblast HPPD Pseudomonas fluorescens dále popsaná;
4360) následované 150 pb podjednotky Ribulosy 1,5
1987, Nucleic acids tranzitního peptidu
- terminátor genu nopalinsynthasy (nos) (polyadenylační oblast genu nos izolovaného z pTi 37,- 250 pb (Bevan M. et al. , Nucleic Acids Res. 11: 369-385)) ,Ο. Konstrukce chimérického genu rezistence k phosphinothricinu (gen bar):
Phosphinothricinacetyltransferasa (PAT) kódovaná genem bar je enzym, který inaktivuje herbicid phosphinothricin (PPT) . PPT inhibuje syntézu glutaminu a vyvolává rychlou akumulaci amoniaku v buňkách, což vede k jejich smrti • 0 0 00 0000 00 00 0000 «0 0 0000 00 Φ 00 0 0000
0000 00 000 000 000 0000 * 0 (Tachibana et al., 1986).
Plazmid použitý pro vloženi tolerance k phosphinothricinu jako činiteli selekce se získá vložením chimérického genu pDM 302 do vektoru pSP72 o 2462 pb vyrobeného firmou Promega Corp. (Genbank/DDBJ database číslo X65332) a obsahujícího gen rezistence k ampicilinu.
Plazmid pDM 302 o 4700 pb byl popsán odborníky Cao, J. et al., Plant Cell Report 11: 586-591 (1992).
Různé elementy toho plazmidu jsou:
- promotor genu aktinu rýže popsaný Mc Elroy D. et al., Plant Molecular Biology 15: 257-268 (1990) tvořený 840 pb;
- první exon genu aktinu rýže tvořený 80 pb;
- první intron genu aktinu rýže tvořený 450 pb;
kódovaná oblast genu bar o 600 pb vyříznutá z plazmidu pIJ41404 popsaná odborníky White et al., Nuc. Acids res. 18: 1862 (1990);.
- terminátor genu nopalinsynthasy (nos) (polyadenylační oblast genu nos izolovaného z pTi 37, 250 pb (Bevan M. et al., Nucleic Acids Res. 11: 369-385).
3. Transformace:
Pro vložení genetické konstrukce se použije technika bombardování. Plazmidy se purifikují na koloně Qiagen a společně srážejí na wolframové částice M10 podle metody popsané Kleinem (Nátuře 327: 70-73, 1987).
Směs kovových částic a dvou plazmidu popsaných dále se potom bombarduje na embryogenních buňkách kukuřice podle protokolu.
4. Regenerace a použití genu bar jako činitele selekce
44
4 4 4
4 4 4 • 444 444
4 ·· ··
4· ···· ·· • · • · • · • · ··
444 · 4
4 4
4 4 4
4 4 4 «4
Bombardované podíly se selekují na glufosinat až do objevení zeleného sekretu.
Pozitivní podíly jsou tedy obrácené v somatických embryonálních buňkách a jsou uloženy za upřednostňovaných podmínek klíčení.. Mladé rostliny se přenesou do skleníku za účelem vytvoření semen.
Molekulární analýza provedená na rostlinách ukazuje, že:
- alespoň 4 kalusy selekované na phosphinothricin byly vyvolány na rostlinách prozrazujících přítomnost genu HPPD pomocí PCR;
alespoň 5 kalusů selekovaných na phosphinothricin byly vyvolány na rostlinách prozrazujících přítomnost genu HPPD pomocí Southern blot;
- alespoň 5 kalusů selekovaných na phosphinothricin byly vyvolány na rostlinách prozrazujících přítomnost rekombinantního proteinu pomocí Western blot;
- chimérický gen HPPD a heterologní gen nejsou přítomny v transformovaných kalusech.
Tyto výsledky ukazují účinek chimérického genu bar pro selekci transformovaných kalusů obsahujících jiný gen agronomického zájmu.
5. Analýza potomků transformovaných rostlin
Transformované rostliny získané dále byly vytvořeny z pilu zčásti transgenního, který oplodnil ovule netransgenní divoké kukuřice. Získaná semena se selektují na písku po ošetření isoxaflutolem. Protokol selekce je následující:
800 ml písku z Fontainebleau se umístí do lodičky o stranách 15 x 20 cm. Tyto lodičky se zalévají vodou a hydratují zejména přiváděním živného roztoku tvořeného 5 ml Quinoligo (La Quinoléine) na litr vody. Dvacet kukuřičných semen se umístí na lodičky, které jsou ošetřeny isoxaflutolem rozprašováním v dávce 100 až 200 g aktivního materiálu na hektar (300 nebo 600 pg aktivního materiálu na lodičku). Lodičky se potom umístí do skleníku ke kultivaci.
Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:
genotypy isoxaflut ol (g/D počet vysetých semen počet vzklíče- ných rostlin počet uhynulých rostlin počet přežitých rostlin
ne- transgenní 0 20 20 0 20
100 20 20 20 0
261 2B 459 100 10 10 5 5
200 10 9 4 ' 5
261 2D2 100 10 9 6 3
200 . 10 10 7 3
261 2A2 100 10 5 3 2
200 10 7 7 0
Tyto výsledky ukazují účinnost genu HPPD pro selekci kukuřičných rezistentních rostlin. Ukazují také, že silná exprese HPPD Pseudomonas v kukuřičné tkáni potvrzuje toleranci k isoxafluolu.
Seznam sekvencí
SEQ ID N°l:
sekvence genu HPPD Pseudomonas fluorescens A32
SEQ ID N°2:
sekvence cDNA EPSPS Arabidopsis thalia
SEQ ID N°3 a 4:
sekvence genu a proteinu EPSPS mutované kukuřice, část 1340 pb klonu pRPA-ML-716
SEQ ID N°5 a SEQ ID N°6:
sekvence genu a proteinu EPSPS mutované kukuřice, část 1340 pb klonu pRPA-ML-720
Legenda k obrázkům
Obrázek 1: Proteinová sekvence HPPD Pseudomonas sp. druhu P.J. 874 a teoretická nukleotidové sekvence odpovídající kódované části; pět oligonukleotidů vybraných pro provedení amplifakce části této kódované oblasti je naznačeno pěti šipkami.
Obrázek 2: Mapa plazmidu s fragmentem genomické DNA o 7 kb kódující gen HPPD Pseudomonas fluorescens A32.
Obrázek 3: PorovnáníDvojitý histonový aminokyselin sekvencí HPPD Pseudomonas fluorescens A32 a HPPD Pseudomonas sp. druhu P.J. 874 (jedině divergentní aminokyseliny mezi dvěma sekvencemi jsou identické) stejně jako konsensuální sekvence.
TTGAATTCAT CGAATTCGCG 60 :ttcac caaagtcgcg 120
5
Seznam sekvencí
SEQ ID NO: 1:
ATGGCAGATC TATACGAAAA CCCAATGGGC CTGATGGGCT
TCCCCGACGC CGGGTACCCT GGAGCCGATC TTCGAGATCA
ACCCACCGTT CCAAGAACGT GCACCTGTAC CGCCAGGGCG AGATCAACCT GATCCTCAAC 180
AACGAGCCCA ACAGCATCGC CTCCTACTTT GCGGCCGAAC ACGGCCCGTC GGTGTGCGGG 240
ATGGCGTTCC GCGTGAAGGA CTCGCAAAAG GCCTACAACC GCGCCCTGGA ACTCGGCGCC 300
CAGCCGATCC ATATTGACAC CGGGCCGATG GAATTGAACC TGCCGGCGAT CAAGGGCATC 360
GGCGGCGCGC CGTTGTACCT GATCGACCGT TTCGGCGAAG GCAGCTCGAT CTACGACATC 420
GACTTCGTGT ACCTCGAAGG TGTGGAGCGC AATCCGGTCG GTGCAGGTCT CAAAGTCATC 480
GACCACCTGA CCCACAACGT CTATCGCGGC CGCATGGTCT ACTGGGCCAA CTTCTACGAG 540
AAATTGTTCA ACTTCCGTGA AGCGCGTTAC TTCGATATCA. AGGGCGAGTA CACCGGCCTG 600
ACTTCCAAGG CCATGAGTGC GCCGGACGGC ATGATCCGCA TCCCGCTGAA CGAAGAGTCG 660
TCCAAGGGCG CGGGGCAGAT CGAAGAGTTC CTGATGCAGT TCAACGGCGA AGGCATCCAG 720
CACGTGGCGT TCCTCACCGA CGACCTGGTC AAGACCTGGG ACGCGTTGAA GAAAATCGGC 730
ATGCGCTTCA TGACCGCGCC GCCAGACACT TATTACGAAA TGCTCGAAGG CCGCCTGCCT ' 840
GACCACGGCG AGCCGGTGGA TCAACTGCAG GCACGCGGTA TCCTGCTGGA CGGATCTTCC 900
GTGGAAGGCG ACAAACGCCT GCTGCTGCAG ATCTTCTCGG AAACCCTGAT GGGCCCGGTG 960
TTCTTCGAAT TCATCCAGCG CAAGGGCGAC GATGGGTTTG GCGAGGGCAA CTTCAAGGCG 1020
GAGT CCATCGAACG tgaccaggtg cgtcgtggtg TATTGACCGC CGATTAA
1077
4 6 • · • · · • · • · • 4 • · 4 « · · · · · • · · • · · • · · · · • · · · • · · · · • · · • · · • 4 · • · 4 4 • • · ·
SČQ XD NO: 2 ;
AATCAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG aattcgggcc CGGGCGCGTG 60
ATCCGGCGGC GGCAGCGGCG GCGGCGGTGC AGGCGGGTGC CGAGGAGATC GTGCTGCAGC 120
CCATCAAGGA GATCTCCGGC ACCGTCAAGC TGCCGGGGTC CAAGTCGCTT TCCAACCGGA iao
TCCTCCTACT CGCCGCCCTG TCCGAGGGGA CAACAGTGGT TGATAACCTG CTGAACAGTG 240
AGGATGTCCA CTACATGCTC GGGGCCTTGA GGACTCTTGG TCTCTCTGTC GAAGCGGACA 300
AAC-CTGCCAA AAGAGCTGTA GTTGTTGGCT GTGGTGGAAA GTTCCCAGTT GAGGATGCTA 360
AAGAGGAAGT GCAGCTCTTC TTGGGGAATG CTGGAACTGC AATGCGGCCA TTGACAGCAG 420
CTGTTACTGC TGCTGGTGGA AATGCAACTT ACGTGCTTGA TGGAGTACCA AGAATGAGGG 480
AGAGACCCAT TGGCGACTTG GTTGTCGGAT TGAAGCAGCT TGGTGCAGAT GTTGATTGTT 540
TCCTTGGCAC TGACTGCCCA CCTGTTCGTG TCAATGGAAT CGGAGGGCTA CCTGGTGGCA 600
AGGTCAAGCT GTCTGGCTCC ATCAGCAGTC AGTACTTGAG TGCCTTGCTG ATGGCTGCTC 650
CTTTGGCTCT TGGGGATGTG GAGATTGAAA TCATTC-ATAA ATTAATCTCC ATTCCGTACG 720
TCGAAATGAC ATTGAGATTG ATGGAGCGTT TTGGTGTGAA AGCAGAGCAT TCTGATAGCT 780
GGGACAGATT CTACATTAAG GGAGGTCAAA AATACAAGTC CCCTAAAAAT GCCTATGTTG 840
AAGGTGATGC CTCAAGCGCA AGCTATTTCT TGGCTGGTGC TGCAATTACT GGAGGGACTG 900
TGACTGTGGA AGGTTGTGGC ACCACCAGTT TGCAGGGTGA TGTGAAGTTT GCTGAGGTAC 960
TGGAGATGAT GGGAGCGAAG GTTACATGGA CCGAGACTAG CGTAACTGTT ACTGGCCCAC 1020
CGCGGGAGCC ATTTGGGAGG AAACACCTCA AGGCGATTGA TGTCAACATG AACAAGATGC 1080
CTGATGTCGC CATGACTCTT GCTGTGGTTG CCCTCTTTGC CGATGGCCCG ACAGCCATCA 1140
C-AGACGTGGC TTCCTGGAGA GTAAAGGAGA CCGAGAGGAT GGTTGCGATC CGGACGGAGC 1200
TAACCAAGCT GGGAGCATCT GTTGAGGAAG GGCCGGACTA CTGCATCATC ACGCCGCCGG 1260
AGAAGCTGAA CGTGACGGCG ATCGACACGT ACGACGACCA CAGGATGGCC ATGGCCTTCT 1320
CCCTTGCCGC CTGTGCCGAG GTCCCCGTCÁ CCATCCGGGA CCCTGGGTGC ACCCGGAAGA 1380
CCTTCCCCGA CTAGTTCGAT GTGCTGAGCA CTTTCGTCAA GAATTAATAA AGCGTGCGAT 1440
ACTACCACGC AGCTTGATTG AAGTGATAGG CTTGTGCTGA GGAAATACAT TTCTTTTGTT 1500
CTGTTTTTCT CTTTCACGGG ATTAAGTTTT GAGTCTGTAA CGTTAGTTGT TTGTAGCAAG 1560
TTTCTATTTC GGATCTTAAG TTTGTGCACT GTAAGCCAAA TTTCATTTCA AGAGTGGTTC 1620
GTTGGAATAA TAAGAATAAT AAATTACGTT TCAGTGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1680
1713 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa AACCCGGGAA TTC • ·
SEQ ID NO: 3:
CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC Ais Gly Ala Glu Glu ílc
5
GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC Val Leu Gin Pro Ile Lys Glu Ile
TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ATC
Ser 15 Gly Val Lys Leu 20 Pro Gly Ser Lys Ser 25 Leu Ser Asn Arg Ile 30
CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG
Leu Leu Leu Ala Ala 35 Leu Ser Glu Gly Thr 40 Thr Val Val Asp Asn 45 Leu
CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT
Leu Asn Ser Glu 5 0. Asp Val His Tyr Met 55 Leu Gly Ala Leu Arg 60 Leu
GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT
Gly Leu Ser 65 Val Glu Ala Asp Lys 70 Ala Ala Lys Arg Ala 75 Val Val Val
GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA GTT GAG C-AT GCT AAA GAG GAA GTG CAG
Gly Cvs 80 Gly Gly Lys Phe Pro 85 Val Glu Asp Ala Lys 90 Glu Glu Val C-ln
CTC TTC TTG GGG AAT GCT GGA ACT GCA ATG CGG CCA TTG ACA GCA GCT
Leu 9 5 Phe Leu Gly Asn Ala 100 Gly Thr Ala Met Arg 105 Pro Leu Thr Ala Ala 110
GTT ACT GCT GCT GGT GGA AAT GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA
Val Thr Ala Ala Gly 115 Gly Asn Ala Thr Tyr 120 Val Leu Asp Gly Val 125 Pro
AGA ATG AGG GAG AGA CCC ATT GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG
Arg Met Arg Glu 130 Arg Pro Ile Gly Asp 135 Leu Val Val Gly Leu 140 Lys Gin
CTT GGT GCA GAT GTT GAT TGT TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT
LjSíí Gly Ala 145 Λ t“i rxop Val Asp Cys Phe 150 Leu Gly Thr Asp Cys 155 Pro Pro Val
CGT GTC AAT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT
Ar g Val 160 Asn Gly Ile Gly Gly 165 Leu Pro Gly Gly Lys 170 Val Lys Leu Ser
GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT
Gly 175 Ser Ile Ser Ser Gin 180 Tyr Leu Ser Ala Leu 185 Leu Met Ala Ala Pro 190
TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC
Leu Ala Leu Gly Asp 195 Val Glu Ile Glu Ile 200 Ile Asp Lys Leu Ile 205 Ser
ATT CCG TAC GTC GAA ATG ACA TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG
Ile Pro Tyr Val 210 Glu Met Thr Leu Arg 215 Leu Met Glu Arg Phe 220 Gly Val
AAA GCA GAG CAT TCT GAT AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT
Lys Ala Glu 225 His Ser Asp Ser Trp 230 Asp Arg Phe Tyr Ile 235 Lys Gly Gly
CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA
Gin Lys 240 Tyr Lys Ser Pro Lys 245 Asn Ala Tyr Val Glu 250 Gly Asp Ala Ser
143
191
239
287
335
383
431
479
527
575
623
671
719
767
0 · 0 0 0 0 0 0 ·· 0 0 • 000 00 0 0000 00 0 0 0 0 0000 0 0 0 00 · 00 000000 00 0' 0000 0 · seq id no: 3 (pokračování)
AGC GCA AGC TAT TTC TTG GCT GGT GCT GCA ATT
Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala lle
255 260 265
ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC AGC AGT TTG CAG
Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gin Gly Asp Val Lys Phe
275 280 285
ACT GGA GGG ACT GTG Thr Gly Gly Thr Val 270
GGT GAT GTG AAG TTT
815
863
GCT Ala GAG Glu GTA CTG GAG Glu ATG Met ATG Met GGA Gly GCG Ala 295 AAG Lys GTT ACA TGG * t-7 ACC Thr 300 GAG Glu ACT Thr 911
Val Leu 290 Val Th.·*
AGC GTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959
Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His
305 310 315
CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG 1007
Leu Lvs Ala lle Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met
320 325 330
ACT CTT GCT GTG GTT GCC CTC TTT GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA 1055
Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Glv Pro Thr Ala lle Arg
335 340 3 45 350
GAC GTG GCT TCC TGG AGA GTA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 1103
Asp Val Ala Ser Tro Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala lle
355 3S0 3 55
CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 1151
Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp
370 375 380
TAC TGC ATC ATC ACG CCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199
Tyr Cys lle lle Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala lle Asp
385 390 395
ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCC ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 1247
Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys
400 405 410
GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 1295
Ala Glu Val Pro Val Thr lle Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr
415 420 425 430
TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 1337
Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
435 440
TAA
1340
« ·
SEQ ID NO: 4
Ala 1. Gly Ala Glu Glu 5 Ile Val Leu Gin Pro 10 Ile Lys C-in Ile Ser 15 Gly
Thr Val Lys Leu . 20 Pro Gly Ser Lys Ser 25 Leu Ser Asn Arg Ile 30 Leu Leu
Leu Ala Ala 35 Leu Ser Glu Gly Thr 40 Thr Val Val Asp Asn 45 Leu Leu Asn
Ser Glu Asp 50 Val His Tyr Met 55 Leu Gly Ala Leu Arg 60 Thr Leu Gly Leu
Ser 65 Val Glu Ala Asp Lys 70 Ala Ala Lys Arg Ala 75 Val Val Val Gly Cys 80
Gly Gly Lys Phe Pro 85 Val Glu Asp Ala Lys 90 Glu Glu Val Gin Leu 95 Phe
Leu Gly Asn Ala 100 Gly Thr Ala Met Arg 105 Pro Leu Thr Ala Ala 110 Val Thr
Ala Ala Glv 115 Gly Asn Ala Thr Tyr 120 Val Leu Asp Gly Val 125 Pro Arg Met
Arg Glu Arg 130 Pro Ile Gly Aso 13 5 Leu Val Val Gly Leu 140 Lys Gin Leu Glv
Ala 145 Asp Val Asp Cys Pns 150 Leu Gly Thr Asp Cvs 155 Pro Pro Val Arg Val 160
Asn Gly Ile Glv Gly 165 Leu Pro Gly Gly Lys 170 Val Lys Leu Ser C-lv 175 Ser
Ile Ser Ser Gin 180 Tyr Leu Ser Ala Leu 185 Leu Met Ala Ala Pro 190 Leu Ala
Leu Gly Aso 195 Val Glu Ile Glu Ile 200 Ile Asp Lys Leu Ile 205 Ser Ile Pro
Tyr Val Glu 210 Met Thr Leu Arg 215 Leu Met Glu Arg Phe 220 Gly Val Lys Ala
Glu 225 His Ser Asp Ser Trp 230 Asp Arg Phe Tyr Ile 235 Lys Gly Gly Gin Lvs 240
Tyr Lys Ser Pro Lys 245 Asn Ala Tyr Val Glu 250 Gly Asp Ala Ser Ser 255 Ala
Ser Tyr Phe Leu 260 Ala Gly Ala Ala Ile 265 Thr Gly Gly Thr Val 270 Thr Val
Glu Gly Cys 275 Gly Thr Thr Ser Leu 280 Gin Gly Asp Val Lys 285 Phe Ala Glu
Val Leu Glu 290 Met Met Gly Ala 295 Lys Val Thr Trp Thr 300 Glu Thr Ser Val
Thr 305 Val Thr Gly Pro Pro 310 Arg Glu Pro Phe Gly 315 Arg Lys His Leu Lys 320
Ala Ile Asp Val Asn 325 Met Asn Lys Met Pro 330 Asp Val Ala Met Thr 335 Leu
Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val
340 345 350 • ·
SEQ id no: 4 (pokračování )
Ala Ser Trp 355 Arg Val Lys Glu Thr 360 Glu Δ r*/-r • gj Met Val Ala 365 Ile Arg Thr
Glu Leu· 370 Thr Lys Leu Gly Ala 375 Ser Val Glu Glu Gly 380 Pro Asp Tyr cys
Ile 3 8 5 Ile Thr Pro Pro Glu Lys 390 Leu Asn Val Thr 395 Ala Ile Asp Thr Tyr 400
Asp Asp His Arg Met 405 Ala Met Ala Phe Ser 410 Leu Ala Ala Cys Ala 415 Glu
Val Pro Val Thr 420 Ile Arg Asp Pro Gly 425 Cys mu v Arg Lys Thr 430 Plis Pro
Asp Tyr Phe 435 Asp Val Leu Ser Thr 440 Phe Val Lvs Asn
• · · · · · · · · · • · ···· ·· ··· ··· ··· · · · · · · • · ··· ·· · · · · · ·
Μ xj USEQ ID NO: 5:
CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC 47
Ala Gl'/ Ala Glu Glu Ile Val Leu Gin Pro Ile Lys Glu Ile
5 10
TCC Ser 15 GGC r' i , - ACC Tb Γ GTC Val AAG Lys CTG Leu 20 CCG Pro GGG Gly TCC Ser AAG Lys TCG Ser 25 gyp Leu TCC Ser AAC Asn CGG Arg ATC Ile 30 95
CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG 143
Leu Leu Leu Ala Ala 35 Leu Ser Glu Gly Tri Σ’ 40 Thr Val Val Asp Asn 45 Leu
CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191
Leu Asn. Ser Glu 50 Asp Val His Tyr Met 55 Leu Gly Ala Leu Arg 60 Thr Leu
GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239
Glv Leu Ser 65 Val Glu Ala Asp Lys 70 Ala Ala Lys Arg Ala 75 Val Val Val
GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA GTI1 GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287
οίν- Cys 80 Gly Gly T ν'· Pro 85 Val Glu Asp Ala Lys 90 Glu Glu Val Gin
στο TTG GGG AAT GCT GGA ATC GCA ATG CGG TCC TTG ACA GCA GCT 335
Leu 95 Phe Leu Gly Asn Ala 100 Gly Ile Ala Mo ť Arg 105 Ser Leu Thr Ala Ala 110
GTT ACT GCT GCT GGT GGA AAT GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 383
Val Thr Ala Ala Gly 115 Gly Λ Ala Tyr 120 Val Leu Asp Gly Val 125 Pro
AGA ATG AGG GAG AGA CCC ATT GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431
Arg Meh Arg Glu 130 Arg Pro Ile x,a.y Asp 135 Leu Val Val Gly Leu 140 Lys Gin
CTT GGT GCA GAT GTT GAT TGT TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 479
Leu Gly Ala 145 Asp Val Asp Cys Phe 150 Leu Gly Thr Asp Cvs 155 Pro Pro Val
CGT GTC AAT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT 527
Arg Val 160 Asn Gly Ile Gly Gly 165 Leu Pro Gly Gly Lys 170 Val Lys Leu Ser
GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT 575
Gly 175 Ser Ile Ser Ser Gin 180 Tyr Leu Ser Ala Leu 185 Leu Met Ala Ala Pro 190
TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC 623
Leu Ala Leu Gly Asp 195 Val Glu Ile Glu Ile 200 Ile Asp Lys Leu Ile 205 Ser
ATT CCG TAC GTC GAA ATG ACA TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG 671
Ile Pro i Ύ ~ Val 210 Glu Met Thr Leu Arg 215 Leu Me tz Glu Arg Phe 220 Gly Val
AAA GCA GAG CAT TCT GAT AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 719
Lys Ala Glu 225 His Ser Asp Ser Trp 230 Asp Arg Phe Tyr Ile 235 Lys Gly Gly
CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA 767
Gin Lys 240 Tyr Lys Ser Pro Lys 245 Asn Ala Tyr Val Glu 250 Gly Asp Ala Ser
seq id no: 5 (pokračování)
AGC Ser 255 GCA Ala AGC Ser TAT Tyr TTC Phie TTG Leu 260 GCT Ala GGT Gly GCT Ala GCA Ala ATT ACT GGA GGG Gly Gly ACT Thr GTG Val 270 915
Ile 265 Thr
ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 863
Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gin Gly Asp Val Lys Phe
270 275 280 235
GCT GAG GTA CTG GAG ATG ATG GGA GCG AmG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 911
Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr
290 295 300
AGC GTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959
Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His
305 310 315
CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG 1007
Leu Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met
320 325 330
ACT Qryrp GCT GTG GTT GCC CTC ΦΤΤ GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA 1055
Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Aro
335 340 345 35Ó
GAC GTG GCT TCC TGG AGA GTA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 1103
Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Iie
355 360 365
CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 1151
Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp
370 375 380
TAC TGC ATC ATC ACG CCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199
Tvr cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp
385 390 395
ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCG ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 1247
Thr Tyr A.sp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys
400 405 410
GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 1295
Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr
415 420 425 430
TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 1337
Pro Δ cn * ·-=>£- Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
435 440
TAA.
1340 • ·
SEQ ID NO : 6:
Ala 1 Gly Ala Glu Glu 5 Ile Val Leu Gin Pro 10 Ile Lys Glu Ile Ser i 5 Gly
Thr Val Lys Leu 20 Pro Gly Ser Lys Ser 25 Leu Ser Asn Arg Ile 30 Leu Leu
Leu Ala Ala Leu 3 5 Ser Glu Gly Thr 40 Thr Val Val Asp Asn 45 Leu Leu Asn
Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu
55 60
Ser 65 Val Glu Ala Asp Lys 70 Ala Ala Lys Arg Ala 75 Val Val Val Gly Cys 80
Gly Gly Lys Phe Pro 85 Val Glu Asp Ala Lys 90 Glu Glu Val Gin Leu 95 Phe
Leu Gly Asn Ala 100 Gly Ile Ala Met Arg 105 Ser Leu Thr Ala Ala 110 Val Thr
Ala Ala Gly 115 Gly Asn Ala Thr Tyr 120 Val Leu Asp Gly Val 125 Pro Arg Met
Arg Glu 130 Arg Pro Ile Gly Asp 135 Leu Val Val Gly Leu 140 Lys Gin Leu Gly
Ala 145 Asp Val Asp Cys Phe 150 Leu Gly Thr Asp Cys 155 Pro Pro Val Arg Val 160
Asn Gly Ile Gly Gly 165 Leu Pro Gly Gly Lys 170 Val Lys Leu Ser Gly 175 Ser
Ile Ser Ser Gin 180 Tyr Leu Ser Ala Leu 185 Leu Met Ala Ala Pro 190 Leu Ala
Leu Gly As o 195 Val Glu Ile Glu Ile 200 Ile Asp Lys Leu Ile 205 Ser τ 2. θ Pro
Tyr Val 210 Glu Met Thr Leu Arg 215 Leu Met Glu Arg Phe 220 Gly Val Lys Ala
Glu 225 His Ser Asp Ser Trp 230 Asp Arg Phe Tyr Ile 235 Lys Gly Gly Gin Lys 240
Tyr Lys Ser Pro Lvs 245 Asn Ala Tyr Val Glu 250 Gly Asp Ala Ser Ser 255 Ala
Ser Tyr Phe Leu 260 Ala Gly Ala Ala Ile 265 Thr Gly Gly Thr Val 270 Thr Val
Glu Gly Cys 275 Gly Thr Thr Ser Leu 280 Gin Gly Asp Val Lys 285 Phe Ala Glu
val Leu 290 Glu Met Met Gly Ala 295 Lys Val Thr Trp Thr 300 Glu Thr Ser Val
Thr 305 Val Thr Gly Pro Pro 310 Arg Glu Pro Phe Gly 315 Arg Lys His Leu Lys 320
Ala Ile Asp Val Asn 325 Met Asn Lys Met Pro 330 Asp Val Ala Met Thr 335 Leu
Ala Val Val Ala 340 Leu Phe Ala Asp Gly 345 Pro Thr Ala Ile Arg 350 Asp Val
seq id no: 6 (pokračování) • · · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · ·· ··· ··· • · · · · ·
Ala Ser Trn 355 Arg Val Lys Glu Thr Glu 360 Arg Met Val Ala 365 I le Arg Thr
Glu Leu 370 Thr Lys Leu Gly Ala 375 Ser Val Glu Glu Gly 380 Pro Asp Tyr Cys
Ile 335 Ile Thr Pro Pro Glu 390 Lys Leu Asn Val Thr 395 Ala Ile Asp Thr Tyr 400
Aso Asp His Arg Met 405 Ala Met Ala Phe Ser 410 Leu Ala Ala Cys Ala 415 vj x u
Val Pro Val Thr Ile 420 Arg Asp Pro Gly 425 Cvs Thr Arg Lys Thr 430 Phe Pro
Asp Tyr Phe 435 Asp Val Leu Ser Thr Phe 440 Val Lys Asn

Claims (34)

  1. Patentové nároky
    1. Chimérický gen obsahující alespoň dva základní chimérické geny obsahující elementy regulace nezbytné pro replikaci v rostlinách a sekvenci kódující enzym udělující rezistenci k herbicidům vyznačený tím, že jedna kódující sekvence kóduje hydroxyfenylpyruvat- dioxygenasu (HPPD).
  2. 2. Chimérický gen podle nároku 1 vyznačený tím, že obsahuje mimo jiné třetí chimérický gen obsahující sekvenci kódující enzym udělující rostlinám rezistenci k herbicidům.
  3. 3. Chimérický gen podle nároku 1 a 2 vyznačený tím, že druhá kódující sekvence pochází z genu nitrilasy Klebsiella sp. udělující rezistenci k herbicidům druhu dihalogenhydroxybenzonitrily.
  4. 4. Chimérický gen podle nároku 3 vyznačený tím, že herbicid je bromoxynil.
  5. 5. Chimérický gen podle nároku 3 vyznačený tím, že herbicid je oxynil.
  6. 6. Chimérický gen podle nároků 2 až 5 vyznačený t i m, že druhá kódující sekvence kóduje rezistenci ke glyphosatu.
  7. 7. Chimérický gen podle jednoho z nároků 2 až 6 vyznačený t í m, že druhá kódující sekvence kóduje EPSPS udělující rezistenci herbicidu inhibitoru EPSPS.
  8. 8. Chimérický gen podle nároku 7 vyznačený tím, že druhá kódující sekvence kóduje EPSPS udělující rezistenci k glyphosatu.
  9. 9. Chimérický gen podle nároku 6 vyznačený tím, že druhá kódující sekvence kóduje
    Λ glyphosatoxydoreduktasu, enzym detoxyf-ikace glyphosatu.
  10. 10. Chimérický gen podle jednoho z nároků 1 až 9 vyznačený t i m, že sekvence kódující HPPD pochází z Pseudomonas sp.
  11. 11. Chimérický gen podle nároku 10 vyznačený tím, že sekvence kódující 'HPPD pochází z Pseudomonas fluorescens.
  12. 12. Chimérický gen podle nároků 1 až 9 vyznačený t i m, že sekvence kódující HPPD je rostlinného původu.
  13. 13. Chimérický gen podle nároku 12 vyznačený tím, že sekvence kódující HPPD pochází z Arabidopsis thaliana.
  14. 14. Chimérický gen podle nároku 11 vyznačený tím, že sekvence kódující HPPD pochází z Daucus carota.
  15. 15. Vektor vyznačený tím, že obsahuje chimérický gen podle jednoho z nároků 1 až 14.
  16. 16. Vektor podle nároku 15 vyznačený tím, že je tvořen plazmidem.
  17. 17. Rostlinná buňka vyznačená tím, že obsahuje alespoň dva geny obsahující každý sekvenci kódující enzym udělující rostlinnám rezistenci k herbicidům, z nichž jeden je inhibitor hydroxyfenylpyruvátdioxygenasy (HPPD).
  18. 18. Rostlinná buňka podle nároku 17. vyznačený t í m, že obsahuje tři základní chimérické geny obsahující každý elementy regulace a sekvenci kódující enzym udělující rostlinnám rezistenci k herbicidu.
  19. 19. Rostlinná buňka podle jednoho z nároků 17 a 18 vyznačená tím, že obsahuje alespoň chimérický gen podle jednoho z nároků 1 až 14.
  20. 20. Rostlina vyznačená tím, že obsahuje rostlinnou buňku podle jednoho z nároků 17 až 19.
  21. 21. Postup transformace rostlin, aby získaly rezistenci k herbicidům vyznačený tím, že se vloží do rostlinné buňky gen podle nároků 1 až 14, a tím že • · · · · ·
    I · · I ··· ··· transformované buňky se podrobí regeneraci.
  22. 22; Postup získání rostlin s několikanásobnou rezistencí k herbicidům vyznačený tím, že:
    - v první etapě se vloží do více buněk jeden ze základních genů obsahující elementy regulace nezbytné k transkripci v rostlinách a sekvenci kódující enzym udělující rostlinám rezistenci k herbicidům, a že
    - potom se rostliny kříží, aby se získaly rostlin s několikanásobnou rezistencí.
  23. 23. Postup herbicidního ošetření rostlin podle nároku 20 vyznačený tím, že se aplikují alespoň dva herbicidy.
  24. 24. Postup podle nároku 23 vyznačený tím, že se aplikují alespoň tři herbicidy.
  25. 25. Postup podle jednoho z nároků 21 až 24 vyznačený t í m, že jeden z herbicidů je inhibitor HPPD.
  26. 26. Postup podle jednoho z nároků 21 až 25 vyznačený t í m, že jsou dva herbicidy aplikovány současně.
  27. 27. Postup podle nároku 26 vyznačený tím, že dva herbicidy jsou aplikovány ve formě kompozice připravené k použití.
    ·· · ·· ··*· ·· ·· ···· · · · · · « · ··· ··· « · · · • · ···· · · ··· ··· • « · 9 9 9 9 9 9 ·· ··· ·· ·· ·· ··
  28. 28. Postup podle nároku 25 vyznačený tím, že dva herbicidy jsou aplikovány ve formě připravené směsi.
  29. 29. Postup podle nároků 22 až 24 vyznačený tím, že dva herbicidy jsou aplikovány postupně.
  30. 30. Postup podle nároků 22 až 29 vyznačený t í m, že herbicid inhibitor HPPD je isoxaflutol.
  31. 31. Postup podle nároků 22 až 29 vyznačený tím, že herbicid inhibitor HPPD je sulcotrion.
  32. 32. Postup podle jednoho z nároků 22 až 31 vyznačený t í m, že herbicid patří do skupiny dihalogenhydroxynitrilů.
  33. 33. Postup podle nároku 32 vyznačený tím, že herbicid je vybrán z množiny herbicidů zahrnující bromoxyl a ioxynil.
  34. 34. Postup podle nároků 22 až 33 vyznačený tím, že herbicid inhibitor HPPD je glyphosat nebo ‘ sulohosat.
    • ·» • · • · · · · · • · · ·
CZ99113A 1996-07-16 1997-07-10 Chimérické geny s několika geny rezistence k herbicidům, rostlinné buňky a rostliny rezistentní k herbicidům a způsob přípravy takových rostlin CZ11399A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9609137A FR2751347B1 (fr) 1996-07-16 1996-07-16 Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ11399A3 true CZ11399A3 (cs) 1999-05-12

Family

ID=9494283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ99113A CZ11399A3 (cs) 1996-07-16 1997-07-10 Chimérické geny s několika geny rezistence k herbicidům, rostlinné buňky a rostliny rezistentní k herbicidům a způsob přípravy takových rostlin

Country Status (20)

Country Link
US (5) US7250561B1 (cs)
EP (1) EP0937154A2 (cs)
JP (1) JP2000517166A (cs)
KR (1) KR20000023830A (cs)
CN (1) CN1154741C (cs)
AR (1) AR007884A1 (cs)
AU (1) AU734878B2 (cs)
BR (2) BR9710340B1 (cs)
CA (1) CA2261094C (cs)
CO (1) CO4770898A1 (cs)
CU (1) CU22809A3 (cs)
CZ (1) CZ11399A3 (cs)
EA (2) EA002980B1 (cs)
FR (1) FR2751347B1 (cs)
HU (1) HU223788B1 (cs)
NZ (1) NZ334188A (cs)
PL (1) PL190393B1 (cs)
TR (1) TR199900117T2 (cs)
WO (1) WO1998002562A2 (cs)
ZA (1) ZA976296B (cs)

Families Citing this family (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2736926B1 (fr) * 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
CA2269666A1 (en) * 1996-11-07 1998-05-14 Zeneca Limited Herbicide resistant plants
US7235716B2 (en) 1997-06-03 2007-06-26 Chromatin, Inc. Plant centromere compositions
US7119250B2 (en) 1997-06-03 2006-10-10 The University Of Chicago Plant centromere compositions
US7193128B2 (en) 1997-06-03 2007-03-20 Chromatin, Inc. Methods for generating or increasing revenues from crops
US6900012B1 (en) 1997-06-03 2005-05-31 The University Of Chicago Plant artificial chromosome compositions and methods
US7227057B2 (en) 1997-06-03 2007-06-05 Chromatin, Inc. Plant centromere compositions
WO1999005265A2 (en) * 1997-07-23 1999-02-04 Sanford Scientific, Inc. Improved plastid transformation of higher plants and production of transgenic plants with herbicide resistance
US7161064B2 (en) 1997-08-12 2007-01-09 North Carolina State University Method for producing stably transformed duckweed using microprojectile bombardment
US6069115A (en) * 1997-11-12 2000-05-30 Rhone-Poulenc Agrochimie Method of controlling weeds in transgenic crops
FR2771104B1 (fr) * 1997-11-17 2000-12-08 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere ayant un promoteur lumiere dependant conferant la tolerance aux inhibiteurs del'hppd
JP4788011B2 (ja) * 1998-04-30 2011-10-05 住友化学株式会社 雑草防除剤耐性の付与方法
BR9912745A (pt) 1998-08-04 2001-11-06 Cargill Inc Promotores da desnaturase de ácido graxo de plantas
DE19836673A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Zuckerrübenkulturen
FR2785148B1 (fr) * 1998-11-02 2000-12-15 Rhone Poulenc Agrochimie Nouvelles compositions herbicide a base de glyphosate et d'isoxazoles
JP4570706B2 (ja) * 1999-03-09 2010-10-27 バイエルクロップサイエンス株式会社 水田雑草の防除方法
US7989202B1 (en) 1999-03-18 2011-08-02 The University Of Chicago Plant centromere compositions
JP4821038B2 (ja) * 1999-10-29 2011-11-24 住友化学株式会社 除草剤耐性植物
EP1315801A1 (fr) * 2000-09-08 2003-06-04 Bayer CropScience S.A. Hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase fusionnee a un peptidesignal, sequence d 'adn et obtention de plantes contenant un tel gene,tolerantes aux herbicides
EP1362113B1 (en) 2001-02-22 2011-01-12 Biogemma Constitutive promoter from arabidopsis
TR201816453T4 (tr) 2001-08-09 2018-11-21 Northwest Plant Breeding Company İmidazolinon herbisitlerine karşi direnci arttirilmiş buğday bitkileri.
US8729341B2 (en) 2004-02-23 2014-05-20 University Of Chicago Plants modified with mini-chromosomes
MXPA06011412A (es) 2004-03-30 2007-01-23 Monsanto Technology Llc Metodos para controlar patogenos en plantas utilizando n-fosfonometilglicina.
EP2308977B2 (en) 2004-04-30 2017-04-26 Dow AgroSciences LLC Novel herbicide resistance gene
EP1929019A2 (en) 2005-09-08 2008-06-11 Chromatin, Inc. Plants modified with mini-chromosomes
BRPI0618025B1 (pt) * 2005-10-28 2016-12-27 Dow Agrosciences Llc método para controlar ervas daninhas em uma área, polinucleotídeo isolado, célula de planta e planta resistente a herbicida
ES2531882T3 (es) * 2006-01-12 2015-03-20 Cibus Europe B.V. EPSPS mutantes
PE20080886A1 (es) * 2006-10-03 2008-08-21 Monsanto Technology Llc Metodo para la produccion de semilla de maiz hibrido y composiciones producidas a partir del mismo
EP2094831B1 (en) * 2006-12-07 2015-09-16 Dow AgroSciences LLC Novel selectable marker genes
WO2008112972A2 (en) 2007-03-15 2008-09-18 Chromatin, Inc. Centromere sequences and minichromosomes
CN101998988A (zh) * 2007-05-30 2011-03-30 先正达参股股份有限公司 赋予除草剂抗性的细胞色素p450基因
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
AR071237A1 (es) * 2008-05-02 2010-06-02 Pioneer Hi Bred Int Seleccion quimica de gametos resistentes a glifosato de plantas a campo
EP2299804A4 (en) * 2008-06-11 2011-05-18 Dow Agrosciences Llc RECOMBINANT PRODUCTS FOR EXPRESSION OF HERBICIDE TOLERANT GENES, ASSOCIATED PLANTS, AND COMBINATIONS OF ASSOCIATED CHARACTERS
GB0816880D0 (en) * 2008-09-15 2008-10-22 Syngenta Ltd Improvements in or relating to organic compounds
WO2010135324A1 (en) * 2009-05-18 2010-11-25 Monsanto Technology Llc Use of glyphosate for disease suppression and yield enhancement in soybean
CA2767724A1 (en) 2009-07-23 2011-01-27 Chromatin, Inc. Sorghum centromere sequences and minichromosomes
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
CA2781598C (en) 2009-11-23 2020-06-02 Bayer Cropscience N.V. Herbicide tolerant soybean plants and methods for identifying same
KR101951958B1 (ko) 2009-11-23 2019-02-25 바이엘 크롭사이언스 엔.브이. 우량 이벤트 ｅｅ－ｇｍ３, 그리고 생물학적 시료에서 이러한 이벤트를 동정하기 위한 방법 및 키트
US9057072B2 (en) 2009-11-24 2015-06-16 Katholieke Universiteit Leuven, K.U. Leuven R&D Banana promoters
BR112012015690A2 (pt) * 2009-12-23 2015-08-25 Bayer Intelectual Property Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inibidores de hppd.
BR112012015692A2 (pt) * 2009-12-23 2015-08-25 Bayer Intelectual Property Gmbh Plantas tolerantes a herbicida inibidor de hppds.
AU2010334808B2 (en) * 2009-12-23 2015-07-09 Bayer Intellectual Property Gmbh Plants tolerant to HPPD inhibitor herbicides
CN102869769A (zh) * 2009-12-23 2013-01-09 拜尔知识产权有限公司 耐受hppd抑制剂型除草剂的植物
ES2659086T3 (es) * 2009-12-23 2018-03-13 Bayer Intellectual Property Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de HPPD
JP2010070578A (ja) * 2010-01-05 2010-04-02 Rhone Poulenc Yuka Agro Kk 水田雑草の防除方法
WO2011112570A1 (en) 2010-03-08 2011-09-15 Monsanto Technology Llc Polynucleotide molecules for gene regulation in plants
WO2012021785A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods comprising sequences having hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (hppd) activity
US20140056908A1 (en) * 2010-10-08 2014-02-27 Fraunhofer Usa Inc. Closterovirus-based nucleic acid molecules and uses thereof
US9018451B2 (en) * 2010-12-03 2015-04-28 M S Technologies, LLC Optimized expression of glyphosate resistance encoding nucleic acid molecules in plant cells
BR122019027736B1 (pt) * 2010-12-28 2021-04-27 Incorporated Administrative Agency, National Agriculture And Food Research Organization Vetor e processo para a produção de uma planta
EP3434780A1 (en) 2011-09-13 2019-01-30 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
WO2013040005A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
BR112014005795A2 (pt) 2011-09-13 2020-12-08 Monsanto Technology Llc métodos de controle de plantas, de redução da expressão de um gene de hppd de uma planta, de preparação de um nucleotídeo, e de identificação de polinucleotídeos úteis na modulação da expressão do gene de hppd no tratamento externo de uma planta, composições e cassete de expressão microbiana
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CN104160028A (zh) 2011-09-13 2014-11-19 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
BR112014005954A2 (pt) 2011-09-13 2020-12-01 Monsanto Technology Llc métodos e composições químicas agrícolas para controle de planta, método de redução de expressão de um gene dhps em uma planta, cassete de expressão microbiana, método para fazer um polinucleotídeo, método de identificação de polinucleotídeos úteis na modulação de expressão do gene dhps
UA116089C2 (uk) 2011-09-13 2018-02-12 Монсанто Текнолоджи Ллс Спосіб та композиція для боротьби з бур'янами (варіанти)
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
EP2755467B1 (en) 2011-09-13 2017-07-19 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
BR112014005951A2 (pt) 2011-09-13 2017-04-04 Monsanto Technology Llc métodos e composições para controle de erva daninha
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
WO2013109754A1 (en) 2012-01-17 2013-07-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transcription factors, promoters and uses thereof
MX344968B (es) * 2012-02-01 2017-01-12 Dow Agrosciences Llc Peptido de transito al cloroplasto.
CN104703998B (zh) 2012-03-13 2020-08-21 先锋国际良种公司 植物中雄性育性的遗传减少
WO2013138309A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
MX360866B (es) 2012-05-24 2018-11-09 A B Seeds Ltd Composiciones y métodos para silenciar la expresión genética.
WO2013188291A2 (en) 2012-06-15 2013-12-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods and compositions involving als variants with native substrate preference
US10041087B2 (en) 2012-06-19 2018-08-07 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
AR091489A1 (es) 2012-06-19 2015-02-11 Basf Se Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo)
AR092564A1 (es) * 2012-09-14 2015-04-22 Bayer Cropscience Lp Variantes de la enzima 4-hidroxifenil piruvato deoxigenasa (hppd) y metodos de uso para conferir tolerancia a herbicidas en plantas
CN104870647A (zh) 2012-10-18 2015-08-26 孟山都技术公司 用于植物害虫控制的方法和组合物
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
UY35251A (es) 2013-01-01 2014-07-31 Seeds Ltd Ab MOLÉCULAS DE dsRNA AISLADAS Y MÉTODOS PARA USARLAS PARA SILENCIAR MOLÉCULAS DIANA DE INTERÉS
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
US9789511B2 (en) * 2013-03-12 2017-10-17 Nordson Corporation Jetting devices
WO2014164797A2 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
UY35379A (es) 2013-03-13 2014-09-30 Monsanto Technology Llc ?métodos y composiciones para el control de malezas?.
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
CA2903693A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize stress related transcription factor 18 and uses thereof
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CN105143454A (zh) 2013-03-15 2015-12-09 先锋国际良种公司 Acc氧化酶多核苷酸和多肽的组合物和使用方法
MX359191B (es) 2013-07-19 2018-09-18 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para controlar leptinotarsa.
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
UA120426C2 (uk) 2013-11-04 2019-12-10 Монсанто Текнолоджі Елелсі Композиція та спосіб для боротьби з членистоногими паразитами та зараженням шкідниками
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
EP3116303B1 (en) 2014-01-15 2020-07-22 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control using epsps polynucleotides
PT3099172T (pt) 2014-01-31 2021-11-08 Agbiome Inc Agentes modificados de controlo biológico e seus usos
WO2015153339A2 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
CA2953347A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference
EP3161138A4 (en) 2014-06-25 2017-12-06 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
CN114009454A (zh) 2014-07-29 2022-02-08 孟山都技术公司 用于控制昆虫害虫的组合物和方法
PL3256589T3 (pl) 2015-01-22 2022-02-21 Monsanto Technology Llc Kompozycje i sposoby kontrolowania leptinotarsa
AU2016270870A1 (en) 2015-06-02 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
AU2016270913A1 (en) 2015-06-03 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
WO2016203377A1 (en) * 2015-06-17 2016-12-22 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
WO2017223501A1 (en) 2016-06-24 2017-12-28 AgBiome, Inc. Methods and compositions for spray drying gram-negative bacteria
WO2019023226A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 AgBiome, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING PLANT HEALTH AND CONTROL OF PLANT DISEASES AND PLANT PESTS
AR113436A1 (es) 2017-10-09 2020-05-06 Agbiome Inc Composiciones y métodos para mejorar la salud de la planta y controlar fitoenfermedades y plagas
CA3026528A1 (en) * 2017-12-15 2019-06-15 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for ppo herbicide tolerance
WO2019241370A1 (en) 2018-06-12 2019-12-19 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
WO2020006555A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 AgBiome, Inc. Compositions comprising bacteria and methods for controlling plant pests and improving plant health
JP2022512655A (ja) 2018-10-10 2022-02-07 アグバイオーム， インコーポレイテッド 植物有害生物を制御し、植物の健康状態を改善するための組成物および方法
JP2022509508A (ja) 2018-10-30 2022-01-20 アグバイオーム， インコーポレイテッド 植物有害生物を制御するおよび植物の健康状態を改善するための細菌組成物および方法
WO2020232103A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 AgBiome, Inc. Dried biological control agents and their uses
WO2020247848A1 (en) 2019-06-07 2020-12-10 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
WO2022225925A1 (en) 2021-04-19 2022-10-27 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
US20240251801A1 (en) 2021-05-18 2024-08-01 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
WO2023211979A2 (en) 2022-04-26 2023-11-02 AgBiome, Inc. Use of bacterial strains to solubilize phosphorus for agriculture
WO2024026305A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 AgBiome, Inc. Compositions and methods based on pseudomonas chlororaphis for improving plant health and controlling plant disease

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
CA1313830C (en) 1985-08-07 1993-02-23 Dilip Maganlal Shah Glyphosate-resistant plants
FR2591069B1 (fr) * 1985-12-09 1988-03-18 Produits Ind Cie Fse Produits herbicides a base d'esters de bromoxynil et/ou d'ioxynil
US7705215B1 (en) * 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
DE69034268D1 (de) * 1989-08-10 2011-03-03 Bayer Bioscience Nv Pflanzen mit modifizierten Blüten
AU655197B2 (en) * 1990-06-25 1994-12-08 Monsanto Technology Llc Glyphosate tolerant plants
WO1992004449A1 (en) * 1990-08-31 1992-03-19 Monsanto Company Glyphosate tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
FR2673643B1 (fr) 1991-03-05 1993-05-21 Rhone Poulenc Agrochimie Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide.
FR2673642B1 (fr) 1991-03-05 1994-08-12 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere comprenant un promoteur capable de conferer a une plante une tolerance accrue au glyphosate.
CA2105990A1 (en) * 1991-03-12 1992-09-13 Gunter Donn Maize resistant to aryloxyphenoxyalkanecarboxylic acid herbicides
GB9218664D0 (en) * 1992-09-03 1992-10-21 Rhone Poulenc Agrochimie Herbicidal compositions
CA2146113A1 (en) * 1992-10-15 1994-10-15 Adrianus Johannes Van Tunen Genetic moderation of restoration or plant phenotypes
DE4305696A1 (de) 1993-02-25 1994-09-01 Hoechst Ag Nachweisverfahren zur Identifizierung von Inhibitoren
US5530187A (en) 1993-07-16 1996-06-25 The Salk Institute For Biological Studies Transgenic plants containing multiple disease resistance genes
US5491076A (en) * 1993-11-01 1996-02-13 The Texas A&M University System Expression of foreign genes using a replicating polyprotein producing virus vector
FR2712302B1 (fr) 1993-11-10 1996-01-05 Rhone Poulenc Agrochimie Eléments promoteurs de gènes chimères de tubuline alpha.
GB9515941D0 (en) * 1995-08-03 1995-10-04 Zeneca Ltd DNA constructs
FR2734842B1 (fr) * 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
EP0938546A4 (en) * 1996-07-25 2003-07-30 Basf Ag HPPD GENES AND INHIBITORS
US6245968B1 (en) 1997-11-07 2001-06-12 Aventis Cropscience S.A. Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, DNA sequence and isolation of plants which contain such a gene and which are tolerant to herbicides
US6069115A (en) * 1997-11-12 2000-05-30 Rhone-Poulenc Agrochimie Method of controlling weeds in transgenic crops

Also Published As

Publication number Publication date
NZ334188A (en) 2000-09-29
US20080028481A1 (en) 2008-01-31
HUP9903774A2 (hu) 2000-03-28
JP2000517166A (ja) 2000-12-26
HU223788B1 (hu) 2005-01-28
FR2751347A1 (fr) 1998-01-23
KR20000023830A (ko) 2000-04-25
US20120005769A1 (en) 2012-01-05
CN1230996A (zh) 1999-10-06
TR199900117T2 (xx) 1999-03-22
PL190393B1 (pl) 2005-12-30
US20130157854A1 (en) 2013-06-20
US7935869B2 (en) 2011-05-03
EA002980B1 (ru) 2002-12-26
US20100029481A1 (en) 2010-02-04
CA2261094C (fr) 2005-06-28
US7250561B1 (en) 2007-07-31
EA200001219A1 (ru) 2001-06-25
AU3625997A (en) 1998-02-09
CN1154741C (zh) 2004-06-23
WO1998002562A2 (fr) 1998-01-22
ZA976296B (en) 1998-08-19
CA2261094A1 (fr) 1998-01-22
AR007884A1 (es) 1999-11-24
HUP9903774A3 (en) 2000-04-28
BR9710340A (pt) 1999-08-17
WO1998002562A3 (fr) 1998-04-30
EA003140B1 (ru) 2003-02-27
AU734878B2 (en) 2001-06-21
FR2751347B1 (fr) 2001-12-07
EP0937154A2 (fr) 1999-08-25
EA199900116A1 (ru) 1999-08-26
BRPI9710340B8 (pt) 2018-02-27
BR9710340B1 (pt) 2009-12-01
CO4770898A1 (es) 1999-04-30
PL331165A1 (en) 1999-06-21
CU22809A3 (es) 2002-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ11399A3 (cs) Chimérické geny s několika geny rezistence k herbicidům, rostlinné buňky a rostliny rezistentní k herbicidům a způsob přípravy takových rostlin
US6268549B1 (en) DNA sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides
US6566587B1 (en) Mutated 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, gene coding for said protein and transformed plants containing said gene
JP2511036B2 (ja) グルタチオンｓ−トランスフェラ−ゼ遺伝子及び該遺伝子を含有する除草剤耐性植物
CA2269666A1 (en) Herbicide resistant plants
MXPA97009310A (en) Dna sequence of a hydroxypenyl-piruvate-dioxygenase gene and obtaining plants containing a gene of hydroxypenyl-piruvate-dioxygenase, tolerants at certain herbici
US6750378B2 (en) Maize H3C4 promoter combined with the first intron of rice actin, chimeric gene comprising it and transformed plant
RU2797237C2 (ru) Способы и композиции для ppo-гербицидной толерантности
MXPA99000639A (en) Chemical gene for various genes of herbicide tolerance, cell vegetable plants tolerantesa various herbici
DE60028751T2 (de) Herbizidresistente pflanzen
KR100480479B1 (ko) 프로토포르피리노겐 옥시다아제의 엽록체 및 미토콘드리아동시발현을 이용한 작물의 제초제 저항성 증대 방법 및 이유전자를 제초제 저항성 선발 마커로 사용하는 형질전환세포주 선발 방법
AU760662B2 (en) DNA sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic