EA002980B1 - Химерная конструкция, включающая, по крайней мере, два гена устойчивости растений к гербицидам, линия растительных клеток, содержащая указанную конструкцию, растение, устойчивое, по крайней мере, к двум гербицидам, и способ обработки растений гербицидами - Google Patents

Химерная конструкция, включающая, по крайней мере, два гена устойчивости растений к гербицидам, линия растительных клеток, содержащая указанную конструкцию, растение, устойчивое, по крайней мере, к двум гербицидам, и способ обработки растений гербицидами Download PDF

Info

Publication number
EA002980B1
EA002980B1 EA199900116A EA199900116A EA002980B1 EA 002980 B1 EA002980 B1 EA 002980B1 EA 199900116 A EA199900116 A EA 199900116A EA 199900116 A EA199900116 A EA 199900116A EA 002980 B1 EA002980 B1 EA 002980B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
herbicides
plant
chimeric
herbicide
plants
Prior art date
Application number
EA199900116A
Other languages
English (en)
Other versions
EA199900116A1 (ru
Inventor
Кен Пэллетт
Ришар Дероз
Бернар Пелиссье
Ален Сэллан
Original Assignee
Рон-Пуленк Агро
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9494283&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA002980(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Рон-Пуленк Агро filed Critical Рон-Пуленк Агро
Publication of EA199900116A1 publication Critical patent/EA199900116A1/ru
Publication of EA002980B1 publication Critical patent/EA002980B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/72—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms
    • A01N43/80—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms five-membered rings with one nitrogen atom and either one oxygen atom or one sulfur atom in positions 1,2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having alternatively specified atoms bound to the phosphorus atom and not covered by a single one of groups A01N57/10, A01N57/18, A01N57/26, A01N57/34
    • A01N57/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having alternatively specified atoms bound to the phosphorus atom and not covered by a single one of groups A01N57/10, A01N57/18, A01N57/26, A01N57/34 containing acyclic or cycloaliphatic radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8277—Phosphinotricin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)

Abstract

Изобретение относится:1. К химерному гену из нескольких генов, кодирующих устойчивость к гербицидам, линии растительных клеток и растению, устойчивым к нескольким гербицидам.2. К растению, устойчивому одновременно к нескольким гербицидам, в частности, к ингибиторам HPPD и к ингибиторам EPSPS и/или к дигалогеногидроксибензонитрилам.3. К способу получения трансформированных растений.4. К способу обработки растений гербицидами.

Description

Объектом настоящего изобретения является химерный ген нескольких генов, кодирующих устойчивость к гербицидам, растительная клетка и растение, устойчивые к нескольким гербицидам.
Далее в описании гербициды будут иметь общее название, а именно, указанное в 10-м издании Т11С Ре811С1бе Мапиа1, ΒπΙί81ι Сгор Рго1ес1юп Сонпсй.
Известны растения, которые были трансформированы с целью придания им устойчивости к некоторым гербицидам, например к дигалогеногидроксибензонитрилам, в частности к бромоксинилу и иоксинилу, благодаря гену, кодирующему нитрилазу, разрушающую эти гербициды, или растения, устойчивые к гербицидам -ингибиторам ЕР8Р8, в частности, глифозату, сульфозату или фосаметину, или к ингибиторам ацетолактатсинтетазы (ЛЬ8), типа сульфонилмочевин, или к ингибиторам дигидроптероатсинтетазы, таким как азулам, или к ингибиторам глутаминсинтетазы, таким как глуфозинат.
Известны некоторые гербициды, такие как изоксазолы, описанные, в частности, во французских заявках 95 06800 и 95 13570, и, в частности, изоксафлутол, селективный гербицид кукурузы, дицетонитрилы, описанные в европейских заявках 0 496 630, 0 496 631, в частности, 2-циано-3-циклопропил-1-(2-8О2СН3-4-СБ3 фенил)пропан-1,3-дион и 2-циано-3-циклопропил-1-(2-8О2СН3-4-2,3 С12фенил)пропан-1,3дион, трикетоны, описанные в европейских заявках 0 625 505 и 0 625 508, в частности, сулкотрион, или же трикетоны, описанные в И8Р 5 506 195, или пиразолинаты. Кроме того, был выделен ген, кодирующий НРРИ, с целью придания устойчивости к этим вышеназванным гербицидам, а полученные содержащие его трансгенные растения демонстрируют значительную устойчивость и являются объектом неопубликованных французских заявок № 95/06800, 95/13570 и 96/05944.
Однако сельскохозяйственная практика показывает, что для обработки растений фермеры предпочитают иметь у себя ассоциации гербицидов, в частности, чтобы решать различные проблемы по уничтожению сорняков, возникающие из-за ограниченного спектра отдельно взятых гербицидов. Для фермеров также представляет интерес наличие маркерного гена селекции, ассоциированного с геном, кодирующим устойчивость к гербицидам. Таким образом, сельское хозяйство нуждается в растениях, обладающих устойчивостью к нескольким гербицидам, предпочтительно, по меньшей мере, к двум или трём.
Было обнаружено, что одной растительной клетке и одному растению можно придать множественную гербицидную устойчивость.
Объектом настоящего изобретения, прежде всего, является химерный ген, содержащий, по меньшей мере, два элементарных химерных гена, каждый из которых содержит, в направлении транскрипции, элементы регуляции, необходимые для его транскрипции в растениях, то есть, по меньшей мере, одну последовательность промоторной регуляции, по меньшей мере, одну кодирующую гетерологическую часть, содержащую одну кодирующую последовательность, которая кодирует фермент, придающий растениям устойчивость к одному гербициду и, по меньшей мере, одну последовательность терминальной регуляции или полиаденилирования.
В качестве кодирующей последовательности можно использовать, в частности, все известные последовательности, придающие растениям устойчивость к некоторым ингибиторам. Это:
- последовательность ЕР8Р8, кодирующая устойчивость к глифозату, сульфозату или фосаметину, в частности, последовательности мутированного или немутированного протеина, описанные в патентах:
- И8Р 4 535 060, ЕР 115 673, И8Р 4 769 061, И8Р 5 094 945; И8Р 4 971 908, И8Р 5 145 783, ЕР 293 358; ЕР 378 985, АО 91/04323, АО 92 044 449, АО 92 06201.
В дальнейшем этот тип гена будет называться последовательностью или геном ЕР8Р8.
Также можно назвать глифозатоксидоредуктазу (см. АО 92/000377) - фермент детоксификации глифозата;
- последовательность гена нитрилазы К1еЬ81е11а 8р., кодирующего устойчивость к дигалогенобензонитрилам, описанная в И8Р 4 810 648, и, в частности, гена, полученного от К1еЬ81е11а охаепае. который в дальнейшем будет называться геном или последовательностью ОХУ;
- последовательность НРРИ, описанная в вышеназванных неопубликованных французских заявках № 95/06800, 95/13570 и 96/05944. Эта последовательность НРРИ может быть любой природы.
В частности, эта последовательность может иметь бактериальное происхождение, как, например, род Р8еибошопа8, или растительное происхождение, например, от однодольного или двудольного растения, в частности, от ЛгаЫбор818 или от зонтичных, например, моркови (Оаиси8 саго!а). Она может быть самородной или дикой или, при необходимости, мутированной, сохраняющей при этом свойство гербицидной устойчивости к ингибиторам НРРИ, таким как гербициды семейства изоксазолов или семейства трикетонов или пиразолинатов.
Можно также использовать другие последовательности:
- последовательность фосфинотрицинацетилтрансферазы или последовательность глутаминсинтетазы, кодирующая устойчивость к глуфозинату (см. ЕР 0 242 236);
- последовательность дигидроптероатсинтетазы, кодирующая устойчивость к азуламу (см. ЕР 0 369 367);
- последовательность АЬ8, кодирующая устойчивость к сульфонилмочевинам;
- последовательность Протопорфирогеноксидазы (ρτοΐοχ), кодирующая устойчивость к гербицидам семейства дифенилэфиров, таких как ацифторфен или оксифторфен, или последовательность оксадиазолов, таких как оксадиазон или оксадиаргил, или последовательность циклических имидов, таких как хлорфталим, или последовательность фенилпирразолов, таких как ΤΝΡ, или последовательности пиридинов и фенопилаты и сходные карбаматы (см. АО 95/34659).
Предпочтительно, один из химерных генов содержит кодирующую последовательность ΗΡΡΌ. В этом случае другая или другие последовательности могут быть любыми и, в частности, выбираемыми из группы, указанной выше. Предпочтительно, другие последовательности выбирают из группы, включающей ген нитрилазы, кодирующий устойчивость к дигалогеногидроксибензонитрилам или ген ΕΡ8Ρ8.
Химерные гены согласно изобретению могут содержать гены, кодирующие не только гербицидную устойчивость, но и другие свойства, например гены, кодирующие резистентность к насекомым, например, типа ВаеШиз 11п.1Г1депз1з, сообщающие резистентность к различным представителям семейства жесткокрылых, чешуекрылых, или гены, кодирующие устойчивость к нематодам, гены, кодирующие сопротивляемость к грибковым и микробным заболеваниям, или гены, сообщающие агрономические свойства, такие как гены различных десатураз, участвующих в продукции жирных кислот. Можно, в частности, назвать ген дельта-6 десатуразы, описанный в международной заявке АО 93/06712.
В качестве последовательности промоторного регулирования можно использовать любую промоторную последовательность гена, экспрессия которого осуществляется, в естественных условиях в растениях, в частности, промотор бактериального, вирусного или растительного происхождения, например, промотор гена малой субъединицы рибулоз-бискарбоксилазы (К.иВ1зСО) или промотор гена α-тубулина (европейская заявка ЕР № 0 652 286), или гена вируса растений, такого как ген мозаики цветной капусты (СаМУ 198 или 358), но может быть использован любой известный подходящий промотор. Предпочтительно, прибегают к использованию последовательности промоторного регулирования, которая способствует сверхэкспресии кодирующей последовательности, например, используют последовательность, содержащую, по меньшей мере, один промотор гистона, описанный в европейской заявке ЕР 0 507 698.
Согласно изобретению в ассоциации с последовательностью промоторной регуляции, можно также использовать другие регулирующие последовательности, которые располагаются между промотором и кодирующей последовательностью, например активаторы транскрипции епйапеег, как, например, активатор трансляции вируса е1е11 табака (ТЕУ), описанный в заявке АО 87/07644, или транзитные пептиды, либо простые, либо двойные, и в этом случае, при необходимости, разделенные промежуточной последовательностью, то есть включающие, в направлении транскрипции, последовательность, кодирующую транзитный пептид растительного гена, кодирующего фермент с пластидной локализацией, часть последовательности зрелой Ν-концевой части растительного гена, кодирующего фермент с пластидной локализацией, затем последовательность, кодирующую второй транзитный пептид растительного гена, кодирующего фермент с пластидной локализацией, состоящий из части последовательности зрелой Ν-концевой части растительного гена, кодирующего фермент с пластидной локализацией, как описано в европейской заявке № 0 508 909.
В качестве последовательности терминальной регуляции или полиаденилирования можно использовать любую соответствующую последовательность бактериального происхождения, например терминальную последовательность поз АдгоЬас!егшт ЦппеГааепз. или растительного происхождения, например терминальную последовательность гистона, описанную в европейской заявке ЕР № 0 633 317.
Объектом изобретения является также линия растительных клеток однодольных или двудольных растений, а именно, культурных растений, устойчивых, по меньшей мере, к двум гербицидам, из которых, по меньшей мере, один является ингибитором ΗΡΡΌ. Эта клетка может содержать, по меньшей мере, одну химерную конструкцию, описанную выше, включающую, по меньшей мере, два химерных гена, каждый из которых содержит последовательность, кодирующую устойчивость к одному гербициду, и один из которых содержит последовательность, кодирующую ΗΡΡΌ. Указанная химерная конструкция может либо переноситься вектором, либо вноситься путем введения в клетку физическими или физико-химическими средствами, например, микроинъекцией, электропорацией или бомбардировкой, в соответствии с известными методами.
Объектом изобретения является также трансформированное растение, устойчивое, по меньшей мере, к двум гербицидам, одним из которых является ингибитор ΗΡΡΌ. Это растение может быть получено регенерацией клетки согласно изобретению, описанной выше. Растения могут быть однодольными или двудольными, в частности, культурными растениями в крупном земледелии, неограничительными примерами двудольных растений являются табак, хлопок, рапс, соя, свекла, а однодольных растений - кукуруза и злаки; также это могут быть овощные культуры или цветы.
Объектом изобретения является также способ получения растений с множественной гербицидной устойчивостью путем растительного трансгеназа, при этом первая стадия включает встраивание в растительные клетки, по меньшей мере, двух генов устойчивости к гербициду, из которых, по меньшей мере, один является ингибитором ΗΡΡΌ, вторая стадия включает регенерацию растения из трансформированных клеток согласно изобретению.
Трансформация может быть получена любым известным соответствующим способом, широко описанным в специальной литературе и, в частности, в заявках и патентах, приведенных в данной заявке.
Одна серия методов состоит в бомбардировке клеток или протопластов частицами, к которым прикреплены последовательности ДНК. Согласно изобретению, эти ДНК могут переноситься одними и теми же частицами или разными. Другая серия методов состоит в том, что в качестве средства переноса в растение используют химерный ген, введённый в плазмиду Τι АдгоЬас1епит 1итеГас1епк или Κι АдгоЬас!егшт г1пходепек.
Могут быть использованы и другие методы, например, микроинъекция или электропорация.
Специалист может выбрать подходящий метод в зависимости от растения, в частности, от того, является оно однодольным или двудольным.
Было обнаружено, что растения, трансформированные согласно изобретению, обладают значительной устойчивостью к ингибиторам гидроксифенилпируватдиоксигеназы, например, к некоторым из последних гербицидов, таким как, изоксазолы, описанные, в частности, во французских заявках 9506800 и 95 13570, а именно 4-[4-СЕ3-2-(метилсульфонил)бензоил]-5циклопропилизоксазол, или изоксафлутол, селективный гербицид кукурузы, дицетонитрилы, описанные в европейских заявках 0 496 630, 0 496 631, в частности 2-циано-3-циклопропил1-(2-8О2СН3-4-СЕ3фенил)пропан-1,3-дион и 2циано-3-циклопропил-1-(2-8О2СН3-4-2,3С12фенил)пропан-1,3-дион, трикетоны, описанные в европейских заявках 0 625 505 и 0 625 508, в частности, сулкотрион и пиразинолаты. Эти же растения, согласно изобретению, обладают значительной устойчивостью к другим гербицидам, например, таким как дигалогено бензонитрилы, а именно бромоксинил и иоксинил, глуфозат и его аналоги, глуфозинат.
Объектом данного изобретения являются также растения, регенерированные из трансформированных клеток. Регенерацию получают любым соответствующим способом, который зависит от природы вида, например, как описано в вышеназванных заявках. Растения согласно изобретению могут также быть получены путём скрещивания родителей, каждый из которых является носителем одного из описанных генов, кодирующих устойчивость к гербициду.
Наконец, объектом данного изобретения является способ обработки растений, в частности, культур, с помощью гербицида данного типа, отличающийся тем, что гербицид наносят на растения, трансформированные согласно изобретению, как перед посевом, перед всходом, так и после всхода культуры. Под гербицидом в настоящем изобретении подразумевают активное гербицидное вещество, взятое одно или в ассоциации с добавкой, которая изменяет его эффективность, такой как вещество, повышающее активность (синергический агент), или вещество, ограничивающее активность (поанглийски каГепег).
Разумеется, что вышеназванные гербициды при их практическом применении сочетают с добавками такого состава, как обычно используют в агрохимии.
Согласно изобретению один из генов гербицидной устойчивости, присутствующих в растениях, может быть использован в качестве маркера селекции, либо ίη νίΙΐΌ. либо ίη νίνο.
Различные аспекты изобретения станут более понятны с помощью экспериментальных примеров, приведенных ниже.
Пример 1: Выделение гена ΗΡΡΌ Ρ. Г1иогексепк А 32.
Из последовательности аминокислот ΗΡΡΌ Ρкеиάοтοηак кр. Ρ. 1. 874 (опубликовано К«е1 ксЫ и. и др. 1992. Еиг. I. Вюсйет. 205: 459-466), выводят последовательность различных олигонуклеотидов, чтобы амплифицировать с помощью ПЦР часть кодирующей последовательности ΗΡΡΌ Ρ. Г1иогексепк А 32 (выделена МсКе11аг, К.С. 1982, I. Арр1. Вас!етю1., 53: 305-316). Фрагмент амплификации гена ΗΡΡΌ был использован для просеивания частичного геномного банка Р. Диотексепк А 32, чтобы выделить таким образом ген, кодирующий этот фермент.
А) Получение геномной ДНК Р. Диогексепк А 32.
Бактерию культивировали в 40 мл минимальной среды М63 (КН2РО4 13,6 г/л, (ЫЛ4)28О4 2 г/л, Мд8О4 0,2 г/л, Ее8О4 0,005 г/л рН 7 плюс Ь - тирозин 10 мМ в качестве единственного источника углерода) при 28°С в течение 48 ч.
После промывания клетки помещают в 1 мл лизирующего буферного раствора (Ггбк Ж1 100 мМ рН 8,3, ХаС1 1,4 М и ЕСТА 10 мМ) и инкубируют 10 мин при 65°С. После обработки смесью фенол/хлороформ (24/1) и обработки хлороформом, нуклеиновые кислоты осаждают добавлением одного объёма изопропанола, затем помещают в 300 мкл стерильной воды и обрабатывают в растворе рибонуклеазы 10 мкг/мл конечн. ДНК снова обрабатывают смесью фенол/хлороформ, хлороформом и осаждают добавлением 1/10 объёма ацетата натрия 3М рН5 и 2-х объёмов этанола. Затем ДНК помещают в стерильную воду и дозируют.
Б) Выбор олигонуклеотидов и синтезов.
Из последовательности аминокислот ΗΡΡΌ Ркеиботоиак зр. Ρ.1.874 выбирают пять олигонуклеотидов, из которых два - в направлении от концевой группы ΝΗ2 к концевой группе СООН протеина, а три - в противоположном направлении (см. фиг. 1). Этот выбор был продиктован двумя следующими правилами:
- стабильный 3' - конец олигонуклеотида, то есть, по меньшей мере, два основания без амбивалентности,
- как можно более слабая дегенерация.
Выбранные олигонуклеотиды имеют следующие последовательности:
Р1: 5'ТА(С/Т)СА(С/А)АА(С/Т)СС1АТССС3'
Р2: 5'СА(С/А)АС1СС1СС1АТССА3' Р3: 5'АА(С/Т)ТССАИА(С/А)(С/А)АА(С/Т)ТС(С/Т) ТС3'
Р4 : 5'АА1СС1АС(С/А)ТС(С/Т)ТС(Т/С/А)АПСС3' Р5:5'СС(С/Т)ТТ(А/С)АА(А/С)ТТ1СС(С/Т)ТС1С С3'
Они были синтезированы на синтезаторе Сус1опе р1из ΌΝΛ 8уп111ез1/ег марки МШЬРОКЕ.
С этими 5 олигонуклеотидами, амплифицированными с помощью ПЦР, фрагменты амплификации, которые теоретически должны быть получены из последовательности 8Е0 ΙΌ №1, имеют следующие размеры:
с Р1 и Р3 приблизительно 690 нп с Р1 и Р4 приблизительно 720 нп с Р1 и Р5 приблизительно 1000 нп с Р2 и Р3 приблизительно 390 нп с Р2 и Р4 приблизительно 420 нп с Р2 и Р5 приблизительно 700 нп
В) Амплификация кодирующей части ΗΡΡΌ Р. Диогезсепз А 32.
Амплификация была проведена на приборе ΡΟΗ ΡΕΚΚΙΝ ЕЬМЕК 9600 и с Тад полимеразой ΡΕΚΚΙΝ ЕЬМЕК с её буферным раствором в стандартных условиях, то есть на 50 мкл реакции имеется 6ΝΓΡ в 200 мкМ, праймеры в 20 мкМ, Тад полимераза 2,5 единицы и ДНК Р. Диогезсепз А 32 2,5 мкг.
Используемая программа амплификации: 5 мин при 95°С, затем 35 циклов (45 с 95°С, 45 с 49°С, 1 мин 72°С), затем 5 мин при 72°С.
В этих условиях все полученные фрагменты амплификации имеют размер, соответствующий вышеприведенным теоретическим размерам, что является хорошим показателем специфичности амплификации.
Фрагменты амплификации, полученные с Р1/Р4, Р1/Р5 и Р2/Р4, объединяют в рВ8Д 8Κ (-) после расщепления этой плазмиды с помощью
Есо КУ и обработки конечной трансферазой в присутствии άάΊ”ΓΡ, как описано ΗΟ^ΟΝ Т.А. и СКАНАМ М.А., 1991, КА.К., том 19, п°5, стр. 1156.
Один клон каждого из трёх типов частично секвенируют, это позволяет подтвердить, что в этих трёх случаях амплифицировали часть кодирующего участка ΗΡΡΌ Ρ. Диогезсепз А 32. Фрагмент Р1/Р4 сохраняют как зонд для просеивания частичного геномного банка Р. Диогезсепз А 32 и выделения полного гена ΗΡΡΌ.
Г) Выделение гена.
С помощью 8ои1йетп можно показать, что фрагмент в 7 Кнп после расщепления ДНК Р. Диогезсепз А 32 с помощью рестрикционного фермента ВатШ гибридизуется с зондом ΗΡΡΌ Р1/Р4. Таким образом, 400 мкг ДНК Р. Диогезсепз А 32 расщепили с помощью рестрикционного фермента ВатШ и очистили на геле агарозы фрагменты ДНК, составляющие примерно 7 Кнп.
Эти фрагменты объединяют в ρΒδΙΙ 8Κ (-), в свою очередь расщеплённом с помощью ВатШ и дефосфорилированном обработкой щелочной фосфатазой. После трансформации в Е. со11 ΌΗ106. частичный геномный банк просеивают с помощью зонда ΗΡΡΌ Ρ1/Ρ4.
Был выделен положительный клон, названный ρΚΡ А. Его упрощенная карта представлена на фиг. 2. На этой карте указано положение кодирующей части гена ΗΡΡΌ. Она состоит из 1077 нуклеотидов, которые кодируют 358 аминокислот (см. 8Е0 ΙΌ №1). Аминокислотная последовательность ΗΡΡΌ Ρ. Диогезсепз А 32 в значительной степени гомологична последовательности ΗΡΡΌ Ρзеиботопаз зр. з!тат Ρ.1.874; действительно, имеется 92% совпадений между этими двумя протеинами (см. фиг. 3).
Пример 2. Конструкция двух химерных генов с одной последовательностью ΗΡΡΌ.
Чтобы придать растениям устойчивость к гербицидам, ингибирующим ΗΡΡΌ, конструируют два химерных гена.
Первый состоит в том, чтобы поставить кодирующую часть гена ΗΡΡΌ Ρ. Диогезсепз А 32 под контроль двойного гистонного промотора (Европейская заявка на патент № 0 507 698), за которым следует ТоЬассо е!сй уииз 1тапз1а!юпа1 епйапсет (ТЕУ)(рКТЬ-СИ8 (Сатпд1оп и Егееб, 1990; 1. Уио1. 64: 1590-1597)) с терминальной последовательностью гена нопалинсинтетазы. Тогда ΗΡΡΌ будет локализована в цитоплазме.
Второй будет идентичен первому, за исключением того, что между активатором трансляции ТЕУ и кодирующей частью ΗΡΡΌ встраивают оптимизированный транзитный пептид (ОТП) (Европейская заявка ЕР п° 0 508 909). Тогда ΗΡΡΌ будет локализована в хлоропласте.
А) Конструкция вектора ρКΡА-К^-153.
- рКРА-КЭ-11: Производное рВ8-П δ К (-) (8!га!адепе са!а1од # 212206), содержащее сайт полиаденилирования нопалинсинтетазы (N08 ро1уА)(Европейская заявка п° 0 652 286), клонируют между сайтами Крп1 и 8аИ. Сайт Крп1 трансформируют в сайт ΝοΐΙ обработкой с помощью Т4 ДНК полимеразы I в присутствии 150 мкМ с деоксинуклеотидтрифосфатов, затем связывают с линкером ΝοΐΙ (8!га!адепе са!а1од # 1029). Таким образом получают кассету клонирования N08 ро1уА.
- рКРА-КЭ-127: Производное рКРА-ВЬ466х (Европейская заявка ЕР п° 0 337 899), клонированное в рКРА-КЭ-11, создающее кассету экспрессии гена оху и содержащее промотор малой субъединицы рибулозы-бискарбоксилазы:
промотор (88И) - оху ген - N08 ро1уА
Чтобы создать эту плазмиду рКРА-ВЬ-488 расщепили с помощью ХЬа1 и ΗίπάΙΙΙ. чтобы выделить фрагмент в 1,9 кнп, содержащий промотор 88и и ген оху, который был объединён с плазмидой рКРА-КЭ-11, расщеплённой соответствующими ферментами.
- рКРА-КЭ-132: Это производное рКРАВЬ-488 (Европейская заявка ЕР п° 0 507 698), клонированное в рКРА-КЭ-127 с созданием кассеты экспрессии гена оху с двойным гистонным промотором:
двойной гистонный промотор - оху ген N08 ро1уА Чтобы получить эту плазмиду, рКРА-ВЬ-466 расщепляют с помощью НшбШ, обрабатывают с помощью К1епоте, затем снова расщепляют с помощью №оГ Фрагмент в 1,35 кнп, очищенный, содержащий двойной гистонный промотор Н3А748, соединяют с плазмидой рКРА-КЭ-127, предварительно расщеплённой с помощью ХЬа1, обработанной К1епо\\· и снова разложена с помощью №оЬ рКРА-КЭ-153: Это производное рКРА-КО132, содержащее активатор трансляции вируса е1с11 табака (ТЕУ). рКТЬ-0и8 (СагппдЮп и Еееб, 1990; 1. Упо1. 64: 1590-1597) расщепляют с помощью №о1 и ЕсоШ и фрагмент в 150 нп встраивают в рКРА-КЭ-132, расщеплённую теми же ферментами. Создают кассету экспрессии, содержащую промотор:
двойной гистонный промотор - ТЕУ- оху и - N08 ро1уА.
Б) Конструкция вектора рКРА-КЭ-185.
рИС19/0ЕСА: Производное рИС-19 (01Ьсо са1а1од # 15364-011), содержащее множество сайтов клонирования. рИС-19 расщепляют с помощью ЕсоК! и объединяют с линкерным олигонуклеотидом 1.
Линкер 1:
ААТтессссА етсАсессет ттааассста ссссссссе
СССССТ САСТСС5ССА ААТТТСССАТ ССССССССС ΤΤΆΑ
Селекционированный клон содержит сайт ЕсоК1, за которым следует полилинкер, который содержит следующие сайты: ЕсоК1, Ара1, АугП,
Рте1, 8ίϊΙ, 8ас1, Крп1, 8та1, ВатН1, ХЬа1, 8а11, РкП, 8рЫ и НтбШ.
рКРА-КЭ-185: это производное рИС19/ ОЕСА, содержащее модифицированный полилинкер. рИС19/0ЕСА расщепляют с помощью НтбШ и объединяют с линкерным олигонуклеотидом 2:
Линкер 2:
АССТТТТААТ ТААССССССС ССТССАЗССТ ССТТСАССС ΑΆΑΤΤΑ АТТССССеСС ееАССТСССА ССААСТССС ТССА
Селекционированный клон содержит сайт НтбШ в середине полилинкера, который теперь содержит следующие сайты: ЕсоШ, Ара!, АугП, Ртеф 8ίϊΙ, 8аск КрпЕ, 8так ВатШ, Хьак 8аП, РкП, 8рЫ, НтбШ, Раск Азск ХМ и ЕсоМ.
В) Конструкция вектора рКР Т.
- рКР О: производное рКРА-КЭ-153, содержащее кассету экспрессии НРРЭ, двойной гистонный промотор - ТЕУ - ген НРРЭ терминальная последовательность Чтобы получить рКР О, рКРА-КЭ-153 расщепляют с помощью НшбШ, обрабатывают с помощью К1епоте, затем опять расщепляют с помощью №ок чтобы удалить ген оху и заменить его геном НРРЭ, взятым из плазмиды рКР А путём расщепления с Вк!ЕП, обработки с помощью К1епо\\· и повторного расщепления с помощью №оЕ
- рКР К: чтобы его получить, плазмиду рКР О расщепили с помощью РуцП и 8аск химерный ген был очищен, а затем объединён с рКРА-КП-185, расщеплённой, в свою очередь, с помощью РуцП и 8асЕ
- рКР Т: был получен встраиванием химерного гена, взятого из рКР К после расщепления с помощью 8аЛ и НтбШ, в плазмиду рКРА-ВЬ 150 альфа 2, расщеплённую теми же ферментами (Европейская заявка Ер п° 0 508 909).
Таким образом, химерный ген вектора рКР
Т имеет следующую ст руктуру:
Двойной гистонный промотор ТЕУ Кодирующий участок НРРЭ Терминальная последовательность поз
Г) Конструкция вектора рКР У.
- рКР Р: это производное рКРА-КЭ-7 (Европейская заявка ЕР п° 0 652 286), содержащая оптимизированный транзитный пептид, за которым следует ген НРРЭ. Оно было получено объединением кодирующей части НРРЭ, взятой из рКР А расщеплением Вк!ЕП и №ок обработкой с помощью К1епоте, и плазмиды рКРА-КЭ7, расщеплённой с помощью 8рЫ и АсеI и обработанной ДНК-полимеразой Т4.
- рКР Р: производное рКРА-КЭ-153, содержащее кассету экспрессии НРРЭ, двойной гистонный промотор - ТЕУ - ОТР - ген НРРЭ терминальная последовательность Для его конструирования плазмиду рКРА-КЭ-153 расщепляют с помощью 8а1 Ι, обрабатывают с помощью К1епоте, затем повторно расщепляют с помощью ΝοοΙ, чтобы удалить ген оху и заменить его геном ΗΡΡΌ, взятым из плазмиды рКР путём расщепления с помощью ΒδίΕΙΙ, обработкой с помощью К1спо\у и повторным расщеплением с помощью ΝοοΙ.
- рКР 8: чтобы его получить, плазмиду рКР О расщепили с помощью РуиП и 8ас1, и выделили химерный ген, который был объединён с рКРА-КЭ-185, в свою очередь, расщеплённый с помощью РуиП и 8ас1.
- рКР V: был получен путём встраивания химерного гена, взятого из рКР 8 после расщепления с помощью 8ас1 и ΗίηάΙΙ, в плазмиду рКРА-ВЬ 150 альфа 2 (Европейская заявка ЕР п° 0 508 909).
Химерный ген вектора рКР О имеет следующую структуру:
Двойной гистонный промотор ΤΕV ОТР Кодирующий участок ГОРЭ Терминальная последовательность ηοκ
Пример 3. Трансформация промышленного табака РВЭ6.
Чтобы определить эффективность этих двух химерных генов их перенесли в промышленный табак РВЭ6. в соответствии с процедурами трансформации и регенерации, уже описанными в европейской заявке ЕР п° 0 508 909.
1) Трансформация.
Вектор вводят в неонкогенный штамм АдгоЬаСегшш ЕНА 101 (Ηοοά и др., 1987) - носитель космиды рТ^ 291 (Κοта^^ и др., 1986). Техника трансформации основана на процедуре ΗοιΠι К. и др. (1985), 8с1епсе, 227, 1229-1231.
2) Регенерация.
Регенерацию табака РВЭ6 (происхождение 8ΕΙΤΛ Ргапсе) из листовых эксплантатов осуществляют на базовой среде МцгакЫде и 8кοοд (М8), содержащей 30 г/л сахарозы, а также 100 мкг/мл канамицина. Листовые эксплантаты отбирают у растений в теплице или ίη νίίτο и трансформируют согласно технике листовых пластинок (8с1епсе 1985, νοί. 227, р. 1229-1231) в три последовательных стадии: первая стадия включает индукцию побегов на среде М8, к которой добавлено 30 г/л сахарозы, содержащей 0,05 мг/л нафтилуксусной кислоты (АNА) и 2 мг/л бензиламинопурина (ВАР), в течение 15 дней. Затем, образовавшиеся на этой стадии ростки в течение 10 дней выращивают на среде М8, к которой добавлено 30 г/л сахарозы, но в которой не содержится гормон. Затем отбирают развившиеся побеги и культивируют их на укореняющей среде М8 с половинным содержанием солей, витаминов и сахаров и не содержащей гормон. Примерно через 15 дней укоренившиеся побеги переносят в землю. Полученные растения называются Со 17.
Трансформированные всходы табака после перенесения из условий ίη νίίτο в теплицу (60% относительной влажности, температура: 20°С ночью и 23 °С днём) акклиматизировали в тече ние пяти недель, затем они были обработаны 4[4-СЕ3-2-(метилсульфонил)бензоил]-5-циклопропил изоксазолом.
У контрольной пробы табака, не трансформированного и обработанного 4-[4-СЕ3-2(метилсульфонил)бензоил]-5-циклопропил изоксазолом дозами от 50 до 400 г/га, примерно за 72 ч развиваются хлорозы, которые в течение одной недели усиливаются и переходят в очень ярко выраженные некрозы (покрывающие около 80% концевых листьев).
После трансформации этот же табак, в котором происходит сверхэкспрессия №РЭ Р. Πиο^е8сеη8. очень хорошо защищен от обработки 4-[4-СЕ3-2-(метилсульфонил)бензоил]-5-циклопропил изоксазолом дозой 400 г/га.
В случае сверхэкспрессии гена фермента, локализующегося в хлоропласте, т.е. если трансформация была произведена с помощью гена, находящегося на векторе рКР V, то растение полностью защищено и не проявляет никаких симптомов (заболевания).
Пример 4. Трансформация промышленного табака РВЭ6 с помощью гена ЕР8Р8 для конструкция 173.
Выделение кДНК, кодирующей ЕР8Р8 кукурузы.
Ниже описаны различные стадии, которые привели к получению кДНК ЕР8Р8 кукурузы, в которой были осуществлены два изменения. Все описанные ниже операции даны в качестве примеров и соответствуют одному методу, выбранному из многих, при которых достигается один и тот же результат. Этот выбор никак не влияет на качество результата и, таким образом, для достижения того же результата, специалист может использовать любую подходящую методику. Большая часть методов инженерии фрагментов ДНК описана в СиггегИ РюШтоЕ ίη Μο1еси1аг Вю^ду, том 1 и 2, АикиЬе1 Е.М. и др., изданном Сгеепе РиЬйкЫпд Λ88οс^аίе8 и Айеу Шегкаепсе (1989). (Далее ссылки на протоколы, описанные в этом сборнике, будут обозначаться геГ. СРМВ). Были проведены следующие операции, касающиеся ДНК, в соответствии с протоколами, описанными в этом сборнике, в частности: сшивание фрагментов ДНК, обработки с помощью ДНК полимеразы Ι<Εηο\ν и Т4 ДНК полимеразы, получение ДНК плазмид и бактериофагов λ в виде мини- или максипрепаратов, анализы ДНК и РНК, соответственно, согласно методикам 8οιιί1κΓΠ и ΝογΙΙκγπ. Были также использованы другие методы, описанные в этом сборнике, и ниже приводится описание только изменений или значительных добавлений к этим протоколам.
А 1. Получение фрагмента ЕР8Р8 АгаЬ1άοр8^8 (Найапа.
а) два олигонуклеотида 20-тегк с соответствующими последовательностями:
5'-ССТСТССТСАТСТСТССТСС-3' 5'-ССССССССТТСАСАААСААА-3' были синтезированы из последовательности гена ЕР8Р8 АгаЫборкй Шайапа (К1ее Н.Е и др., (1987), Мо1. Сеп. Сене!.. 210, 437-442). Эти два олигонуклеотида находятся соответственно в положении от 1523 до 1543 и от 1737 до 1717 опубликованной последовательности и имеют конвергентную ориентацию.
б) полная ДНК АгаЫбор818 1йайапа (уаг. Со1ишЫа) была получена у С1оп1есй (каталожная ссылка: 6970-1)
в) Смешивают 50 нанограмм (нг) ДНК с 300 нг каждого из олигонуклеотидов и подвергают 35 циклам амплификации с помощью прибора Регкш-Е1тег 9600, в условиях стандартной среды для амплификации, рекомендованных поставщиком. В результате получают фрагмент в 204 нм, который составляет фрагмент ЕР8Р8 АгаЫбор818 Шайапа.
2. Конструирование библиотеки кДНК из клеточного ряда кукурузы ВМ8.
а) Измельчают 5 г фильтрованных клеток в жидком азоте и экстрагируют полные нуклеиновые кислоты, согласно методу, описанному 8йиге и др., со следующими модификациями:
- рН лизирующего буферного раствора доводят до 9,0;
- после осаждения с помощью изопропанола осадок собирают в воде и, после растворения, доводят до 2,5 М ЫС1. После инкубации в течение 12 ч при °С, осадок, образовавшийся при центрифугировании 15 мин при 30000 д при 4°С растворяют. Затем повторяют осаждение с помощью ЫС1. Вновь растворённый осадок составляет фракцию РНК полных нуклеиновых кислот.
б) Фракцию РНК-ро1уА + фракция РНК получают хроматографией на колонке олиго-бТ целлюлозы, описанной в Сиггеп! Рго1оеок ш Мо1еси1аг Вю1оду.
в) Синтез двухцепочечной кДНК на синтезированном конце ЕсоШ: он выполняется в соответствии с протоколом поставщика различных реактивов, необходимых для этого синтеза, в комплекте: сору кй компании 1п Уйгодеп.
Два одноцепочечных олигонуклеотида, частично дополненных соответствующими последовательностями:
5'-ААТТСССССС-3'
5'-СССССС-3' (причём эта последовательность является фосфорилованной) сшивают с двухцепочечной кДНК с открытыми концами. Результатом этого сшивания является создание сайтов 8та1, прикрепленных к двухцепочечной кДНК, и ЕсоК1 в виде сцепления на каждом конце двухцепочечной кДНК.
г) Создание библиотеки:
кДНК, имеющие на концах искусственные связующие сайты ЕсоКб, сшивают с кДНК бактериофага 10, разрезанной с помощью ЕсоЕ!
и дефосфорилованной согласно протоколу поставщика Иете Епд1апб Вю1аЬк.
Аликвотная часть реакции сшивания была капсидирована ш уйго с экстрактами капсидирования: С1дараск Со 16 согласно инструкциям поставщика, эта библиотека была титрована с использованием бактерии Е. сой С600Ш1., полученную таким образом библиотеку амплифицируют и сохраняют согласно инструкции того же поставщика, и она составляет библиотеку кДНК клеточной суспензии кукурузы ВМ8.
3. Просеивание библиотеки кДНК клеточной суспензии кукурузы ВМ8 с помощью зонда ЕР8Р8 ЛгаЬШор515 1йайапа:
Используется протокол Сиггеп! Рго1осо1к ίπ Мо1еси1аг Вю1оду, том 1 и 2, Ац8иЬе1 Е.М. и др., опубликованный Сгеепе РиЬНкЫпд Аккоаа!ек и 8 (1989) (СРМВ). Коротко говоря, примерно 106 рекомбинантных фагов распределены на коробке ЬВ со средней плотностью 100 фаг/см2 Области лизиса реплицируют в двойном экземпляре на мембране НуЬопб N Атегкйат.
д) ДНК зафиксировали на фильтрах УФобработкой 1600 кДж (8йа1айпкег (81га1адепе)). Фильтры были предварительно гидратированы в 6х88С/0, 1% 8Ό8/0,25 обезжиренного молока в течение 2 ч при 65°С. Зонд ЕР8Р8 АгаЫбор818 1йайапа был маркирован 32Р-бСТР с помощью гапбот-рйтщд согласно инструкциям поставщика (Кй Ееабу !о Со, Рйагтааа). Полученная удельная активность составляет порядка 108 имп/мин на мкг фрагмента. После денатурирования в течение 5 мин при 100°С, зонд добавляют в среду предварительной гибридизации, и гибридизация продолжается в течение 14 ч при 55°С. Фильтры флуорографируют в течение 48 ч при 80°С на плёнку Кобак ХАЕ5, используя усиливающие экраны Нурегксгееп ΕΓΝ б'Атегкйат, Проецирование положительных пятен (бликов) на фильтре на кассеты, из которых они получены, позволяет отобрать на кассете зоны, соответствующие фагам, имеющим положительный ответ гибридизации с зондом ЕР8Р8 АгаЬ1бор818 1йайапа. Этот этап распределения, переноса, гибридизации, рекуперирования повторяется до тех пор, пока все пятна кассеты последовательно очищенных фагов не станут положительными на 100% при гибридизации. Область лизиса независимым фагом отбирают в разбавляющей среде Ь(Тп8-С1 рН=7,5; Мд8О4 10 мМ; №1С1 0,1М; желатина 0,1%), причём эти фаги в растворе составляют положительные клоны ЕР8Р8 клеточной суспензии кукурузы ВМ8.
4. Получение и анализ ДНК клонов ЕР8Р8 клеточной суспензии кукурузы ВМ8.
Добавляют примерно 5Ί08 фагов к 20 мл бактерий С600Ы1 (2 ΟΌ 600 нм/мл) и инкубируют 15 мин при 37°С. Затем эту суспензию вводят в 200 мл среды роста бактерий в Ег1еп 11 и перемешивают в ротационном смесителе при
250 об/мин. Лизис констатируют по осветлению среды, соответствующему лизису взвешенных бактерий, и это происходит примерно после 4 ч перемешивания. Всплывшие на поверхность продукты лизиса затем обрабатывают, как описано в Сштеп! Рго1осо18 ίη Мо1еси1аг Вю1оду. Полученная ДНК соответствует клонам ЕР8Р клеточной суспензии кукурузы ВМ8.
Один из двух мкг этой ДНК разрезают с помощью ЕсоК1 и разделяют на геле агарозы ЬОТА/ТВЕ (геГ. СРМВ) 0,8%. Последняя проверка состоит в том, чтобы убедиться, что очищенная ДНК несёт сигнал гибридизации с зондом ЕР8Р8 АгаЫборкщ 1йайапа. После электрофореза фрагменты ДНК переносят на мембрану НуЬопб Ν, Атегайат, в соответствии с протоколом 8ои1йегп, описанным в Сштеп! Рго1осо18 ίη Мо1еси1аг Вю1оду. Фильтр гибридизуют с зондом ЕР8Р8 АгаЬ1бор818 1йайапа, согласно условиям, описанным в параграфе 3. Клон, несущий сигнал гибридизации с зондом ЕР8Р8 АгаЫйор818 1йайапа и содержащий самый длинный фрагмент ЕсоК1, имеет размер, определенный на геле, равный приблизительно 1,7 кнп.
5. Получение клона рКРА-МЬ-711.
Десять мкг ДНК клона фагов, содержащего включение из 1,7 кнп расщепляют с помощью ЕсоК1 и разделяют на геле агарозы ЬОТА/ТВЕ (геГ. СРМВ) 0,8%. Фрагмент геля, содержащий включение из 1,7 кнп, удаляют из геля окрашиванием ВЕТ и этот фрагмент обрабатывают βагаразой согласно протоколу поставщика №\ν а Вю1аЬ8. Очищенную ДНК фрагмента в 1,7 кнп, сшивают при 12°С в течение 14 ч с ДНК плазмиды рИС 19 (Νο\ν ЕпДапб Вю1аЬ8), разрезанной с помощью ЕсоК1 согласно протоколу сшивания, описанному в Сштеп! Рго1осо18 ίη Мо1еси1аг Вю1оду. Два мкл указанной смеси сшивания используют для трансформации аликвотной части электро компетентных Е. сой ЭН10В: трансформация производится путем электропорации с использованием следующих условий: смесь компетентных бактерий и среды сшивания вводят в кювету для электропорации толщиной 0,2 см (Вюгаб), предварительно охлажденную до 0°С. Физические условия электропорации при использовании электропоратора марки Вюгаб являются следующими: 2500 В, 25 мкФ и 200 Ω. В этих условиях среднее время разряда конденсатора составляет порядка 4,2 мс. Затем бактерии помещают в 1 мл среды 8ОС (геГ. СРМВ) и перемешивают в течение 1 ч в ротационном смесителе при 200 об/мин в трубках Согшпд (15 мл). После распределения на среде ЬВ/агар, к которой добавлено 100 мкг/мл карбеницилина, мини-препараты бактериальных клонов вырастают за одну ночь при 37°С, согласно протоколу, описанному в Сштеп! Рго1осо18 1п Мо1еси1аг Вю1оду. После расщепления ДНК с помощью ЕсоК1 и разделения в электрофорезе на геле агарозы ЬОТА/ТВЕ (геГ. СрМв)
0,8%, сохраняют клоны, имеющие включение в 1,7 кнп. Последняя проверка состоит в том, чтобы убедиться, что очищенная ДНК имеет знак гибридизации с зондом ЕР8Р8 АгаЬ1бор818 111айапа. После электрофореза фрагменты ДНК переносят на мембрану НуЬопб Ν, Атегайат в соответствии с протоколом 8ои1йегп, описанным в Сштеп! Рго1осо18 ш Мо1еси1аг Вю1оду. Фильтр гибридизируют с зондом ЕР8Р8 АгаЬ1йор818 1йайапа, согласно условиям, описанным выше в пункте 3. Плазмидный клон, имеющий включение из 1,7 кнп и гибридизирующийся с зондом ЕР8Р8 АгаЫйор818 1йайапа, получают в больших количествах, а ДНК, полученную в результате лизиса бактерий, очищают на градиенте С8С1 так, как описано в Сштеп! Рго1осо18 ш Мо1еси1аг Вю1оду. Очищенная ДНК была частично секвенирована набором Рйагташа в соответствии с инструкциями поставщика и с использованием универсальных праймеров М13, прямых и обратных, заказанных у того же поставщика. Полученная частичная последовательность включает примерно 0,5 кнп. Производная последовательность аминокислот на участке зрелого протеина (около 50 аминокислотных остатков) имеет 100%-ную идентичность с соответствующей аминированной последовательностью зрелого ЕР8Р8 кукурузы, описанной в американском патенте И8Р 4 971 908. Этот клон, соответствующий фрагменту ЕсоК1 в 1,7 кнп ДНК ЕР8Р клеточной суспензии кукурузы ВМ8 был назван рКРА-МЬ-711. Полная последовательность этого клона была получена на двух нитях с использованием протокола набора Рйагтааа и при синтезе комплементарных олигонуклеотидов с обращением направления через каждые 250 нп. Полная последовательность этого клона из полученных 1713 нп представлена 8ЕО ГО № 2.
6. Получение клона рКРА-МЬ-715.
Анализ последовательности клона рКРАМЬ-711 и, в частности, сравнение последовательности производных аминокислот с аминокислотной последовательностью кукурузы показывает расширение последовательности на 92 нп выше кодона ОСО, кодирующего Ν42концевой Аланин зрелой части ЕР8Р8 кукурузы (американский патент И8Р 4 971 908). Также наблюдается расширение на 288 нп ниже кодона ААТ, кодирующего СООН-концевой аспарагин зрелой части ЕР8Р8 кукурузы (американский патент И8Р 4 971 908). Эти две части соответствуют, очевидно, для NН2-концевого расширения части последовательности транзитного пептида для пластидной локализации, и для СООНконцевого расширения нетранслируемого 3'участка кДНК.
Чтобы получить кДНК, кодирующую зрелую часть кДНК ЕР8Р8 кукурузы, как описано в И8Р 4 971 908, были выполнены следующие операции:
а) Удаление нетранслируемого участка 3': конструкция рКРА-МЬ-712.
Клон рКРА-МЬ-711 был разрезан рестрикционным ферментом А§е1, и концы, образовавшиеся в результате этого разрезания, были активированы обработкой фрагментом 1<1епо\т ДНК-полимеразы I, согласно протоколу, описанному в СРМВ. Затем было выполнено разрезание рестрикционным ферментом 8асП. ДНК, полученная в результате этих операций, была разделена электрофорезом на геле агарозы ЬОТА/ТВЕ (геГ. СРМВ) 1%.
Фрагмент геля, содержащий включение АкеЬоткрытые концы/8асП в 0,4 кнп был удален из геля и очищен согласно протоколу, описанному выше в пункте 5. ДНК клона рКРАМЬ-711 была разрезана рестрикционным ферментом ΗίηάΙΙ, расположенным в полилинкере вектора клонирования рИС19, и концы, образованные в результате этого разрезания, были активированы обработкой фрагментом 1<1епо\у ДНК-полимеразы I. Затем было выполнено разрезание рестрикционным ферментом 8асП. ДНК, полученная в результате этих действий, была разделена электрофорезом на геле агарозы ЬОТА/ТВЕ (геГ. СРМВ) 0,7%.
Фрагмент геля, содержащий включение ΉίηάΙΙΙ-открытые концы/8асП приблизительно в 3,7 кнп, был удален из геля и очищен согласно протоколу, описанному выше в пункте 5.
Оба включения были сшиты, и 2 мкл смеси сшивания были использованы для трансформации Е. сой БНЮВ. как описано выше в пункте
5.
Проводят анализ плазмидной ДНК различных клонов согласно процедуре, описанной для рКРА-МЬ-711. Один из сохраненных плазмид ных клонов содержит включение ЕсоШ-НшбШ приблизительно в 1,45 кнп. Концевая последовательность этого клона показывает, что 5'конец включения в точности соответствует соответствующему концу рКРА-МЬ-711 и что 3'конец содержит последовательность: 5'-...ААТТААОСТСТАОАОТСОАССТОСАОО САТОСААОСТТ-3' .
Подчеркнутая последовательность соответствует кодону аминокислоты СООНконцевой аспарагин, причём следующий кодон соответствует кодону остановки трансляции. Нуклеотиды, следующие за ним, соответствуют элементам последовательности полилинкера рИС19. Этот клон, включающий последовательность рКРА-МЬ-711 до сайта остановки трансляции зрелого ЕР8Р8 кукурузы и за которым следуют последовательности полилинкера рИС 19 до сайта ΗίηάΙΙΙ, был назван рКРА-МЬ-712.
б) Модификация 5'-конца рКРА-МЬ-712: конструкция рКРА-МЬ-715.
Клон рКРА-МЬ-712 был разрезан рестрикционными ферментами РкП и ΗίηάΙΙΙ. ДНК, полученная в результате этих операций, была разделена электрофорезом на геле агарозы
ЬОТА/ТВЕ (геГ. СРМВ) 0,8%. Фрагмент геля, содержащий включение РкП/ЕсоК! в 1,3 кнп, бьш удалён из геля и очищен согласно протоколу, описанному выше в пункте 5. Это включение было сшито в присутствии эквимолекулярного количества каждого из двух олигонуклеотидов, частично комплементарных, и имеющих следующие последовательности:
Олиго 1: 5'-ОАОССОАОСТССАТООССООСОС СОАООАОАТСОТОСТОСА-3'
Олиго 2: 5'-ОСАСОАТСТССТСООСОССООСС АТООАОСТСООСТС-3' а также в присутствии ДНК плазмиды рИС19, расщеплённой рестрикционными ферментами ВашШ и ΗίηάΙΙΙ.
Два мкл смеси сшивания послужили для трансформации Е. сой БШОВ, как описано выше в пункте 5. После анализа содержания плазмидной ДНК в различных клонах согласно процедуре, описанной выше в пункте 5, один из клонов, имеющий включение приблизительно из 1,3 кнп, был сохранён для дальнейших анализов. 5' -концевая последовательность сохраненного клона показывает, что последовательность ДНК на этом участке является следующей: последовательность полилинкера рИС19, включающая сайты от ЕсоК! до ВашШ, затем последовательность олигонуклеотидов, использованных во время клонирования, затем остаток последовательности, присутствующей в рКРАМЬ-712. Этот клон был назван рКРА-МЬ-713. Этот клон содержит кодон метионина АТС, включенный в сайт Ν^Ι раньше кодона Ν’концевой Аланин зрелой ЕР8Р8 синтетазы. Кроме того, Ν-концевые кодоны аланина и глицина были сохранены, но модифицированы по третьему изменяемому основанию: начальный ОСОООТ приводит к модифицированной ОССООС.
Клон рКРА-МЬ-713 был разрезан рестрикционным ферментом ΗίηάΙΙΙ, и концы этого разрезания были активированы с помощью обработки фрагментом 1<1епо\у ДНК-полимеразы Ι. Затем было выполнено разрезание рестрикционным ферментом 8ас!. ДНК, полученная в результате этих операций, была разделена электрофорезом на геле агарозы ЬОТА/ТВЕ (геГ. СРМВ) 0,8%. Фрагмент геля, содержащий включение ΗίηάΙΙΙ-открытые концы/8асП в 1,3 кнп, был удален из геля и очищен согласно протоколу, описанному выше в пункте 5. Это включение было сшито в присутствии ДНК плазмиды рИС19, расщеплённой рестрикционным ферментом ХЬа! и концы этого разрезания были активированы с помощью обработки фрагментом 1<1епо\у ДНК-полимеразы Ι. Затем было выполнено разрезание рестрикционным ферментом 8асЬ Два мкл смеси сшивания послужили для трансформации Е.сой БШОВ, как описано выше в п. 5. После анализа содержания плазмидной ДНК в различных клонах согласно процедуре, описанной выше в параграфе 5, один из клонов, имеющий включение приблизительно в 1,3 кнп, был сохранён для дальнейших анализов. Концевая последовательность сохраненного клона показывает, что последовательность ДНК является следующей: последовательность полилинкера рИС19, включающая сайты от ЕсоК! до 8ас1, затем последовательность олиго нуклеотидов, использованных во время клонирования, из которой удалены 4 нп САТСС из описанного выше олигонуклеотида I, затем остаток последовательности, присутствующей в рКРА-МЬ-712, до сайта ΗίηάΙΙΙ, и последовательность полилинкера рИС19 от ХЬа1 до ΗίηάΙΙΙ. Этот клон был назван рКРА-МЬ-715.
7) Получение кДНК, кодирующей мутированную ЕР8Р8 кукурузы.
Все этапы мутагенеза были выполнены с помощью набора для мутагенеза И.8.Е. Рйагшас1а в соответствии с инструкциями поставщика. Принцип этой системы мутагенеза является следующим: плазмидную ДНК денатурируют температурной обработкой и снова ассоциируют в присутствии молярного избытка, с одной стороны, олигонуклеотида мутагенеза, и, с другой стороны, олигонуклеотида, позволяющего удалить единственный сайт рестрикционного фермента, присутствующий в полилинкере. После этапа реассоциации, синтез комплементарной цепочки выполняют с помощью действия Т4 ДНК-полимеразы в присутствии Т4 ДНКлигазы и протеина гена 32 в соответствующем поставляемом буферном растворе. Продукт синтеза инкубируют в присутствии рестрикционного фермента, сайт которого, предположительно, исчез в результате мутагенеза. Штамм Е.со11, представляющий, в частности, мутацию ши18, используется в качестве хозяина для трансформации этой ДНК. После роста в жидкой среде получают полную плазмидную ДНК и инкубируют в присутствии рестрикционного фермента, использованного ранее. После этих обработок штамм Е.со11 ΌΗΙΟΒ используют как хозяина для трансформации. Получают плазмидную ДНК выделенных клонов и проверяют секвенированием наличие введённой мутации.
А) Модификация сайтов или последовательности без влияния априори на характер устойчивости ЕР8Р8 кукурузы к конкурентным ингибиторам активности ЕР8Р синтетазы: удаление внутреннего сайта №οΙ из рКРА-МЬ-715.
Последовательность рКРА-МЬ-715 нумеруют произвольно, помещая первое основание кодона Ν-концевого Аланина ССС в положение
1. Эта последовательность содержит сайт №οΙ в положении 1217. Олигонуклеотид модификации сайта содержит последовательность: 5'-ССАСАССАТССССАТССССТТСТСС-3'
После секвенирования согласно приведенной выше ссылке, последовательность, определяемая после мутагенеза, соответствует последовательности использованного нуклеотида. Сайт №οΙ был удалён, и трансляция на этом участке сохраняет начальную последовательность, имеющуюся на рКРА-МЬ-715.
Этот клон был назван рКРА-МЬ-716.
Последовательность в 1340 нп этого клона представлена 8ЕО ΙΌ № 3 и 8ЕО ΙΌ № 4.
Б) Модификации последовательности, позволяющие увеличить характер устойчивости ЕР8Р кукурузы к конкурентным ингибиторам активности ЕР8Р синтетазы.
Были использованы следующие олигонуклеотиды:
а) мутация Т1п 102^Пе.
5'-СААТССТССААТСССААТССССССАТТСАСАСС-3'
б) мутация Рго 106^8ег.
5'-СААТССТССААСТССААТССССТССТТСАСАСС-3'
в) мутации С1у 10ЖА1а и Т1г 102^Пе.
5'-СТТССССААТССТСССАТСССААТССССССАТТС-3'
г) мутации Т1г 102^Пе и Рго 106^8ег.
5'-ССССААТССТССААТСССААТССССТССТТСАСАСС-3'
После секвенирования последовательность, определяемая после мутагенеза на трех мутированных фрагментах, является идентичной последовательности родительской ДНК рКРА-МЬ-716 за исключением участка, подвергнутого мутагенезу, который соответствует участку использованных олигонуклеотидов мутагенеза. Эти клоны были названы: рКРА-МЬ717 для мутации Т1г 102^Пе, рКРА-МЬ-718 для мутации Рго 106^8ег, рКРА-МЬ-719 для мутаций С1у 101^А1а и Т1г 102^Пе и рКРАМЬ-720 для мутаций Т1г 102^Пе и Рго 106^8ег.
Последовательность рКРА-МЬ-720 в 1340 нп представлена 8ЕО ΙΌ № 5 и 8ЕО ΙΌ № 6.
Включение Ν^Ι-ΗίηάΙΙΙ в 1395 нп лежит в основе всех конструкций, используемых для трансформации растений, для введения устойчивости к гербицидам - конкурентным ингибиторам ЕР8Р8, и в частности, устойчивости к глифозату. Это включение будет далее в описании называться двойной мутант ЕР8Р8 кукурузы.
Б. Устойчивость к глифозату различных мутантов ίη уйго.
2.а: Экстрагирование ЕР8Р синтетазы.
Различные гены ЕР8Р синтетазы вводятся в виде кассеты Ν^Ι-ΗίηάΙΙΙ в плазмидный вектор рТгс99а (Рйагшааа, геГ: 27-5007-01), разрезанный с помощью Ν^Ι и ΗίηάΙΙΙ. Рекомбинантные Е.сой ΌΗ10Β, способные к сверхэкспрессии различных ЕР8Р синтетаз, обрабатывают ультразвуком в 40 мл буферного раствора на 10 г осаждённых клеток и промывают тем же буферным раствором (1г15 ΗΟ 200 мМ рН 7,8, меркаптоэтанол 50 мМ, ЕЬТА 5 мМ и РМ8Р 1 мМ), куда добавляют 1 г поливинилпирролидона. Суспензию перемешивают в течение 15 мин при 4°С, затем центрифугируют 20 мин при 27000д и 4°С. К отделённой жидкости добавляют сульфат аммония, чтобы довести раствор до 40% насыщенности сульфатом аммония. Смесь центрифугируют 20 мин при 27000д и 4°С. К вновь отделённой жидкости добавляют сульфат аммония, чтобы довести раствор до 70% насыщенности сульфатом аммония. Смесь центрифугируют 30 мин при 27000д и 4°С. ЕРЗР синтетазу, присутствующую в этом белковом осадке, помещают в 1 мл буферного раствора (йтк НС1 20 мМ рН 7,8 и меркаптоэтанол 50 мМ). В течение одной ночи проводят диализ этого раствора, используя два литра этого же буферного раствора при 4°С.
2.б: Ферментная активность.
Активность каждого фермента, так же, как и его устойчивость к глифозату измеряют ίη νίίτο за 10 мин при 37°С в следующем реакционном растворе: малеиновая кислота 100мМ рН 5,6, фосфоэнол пируват 1 мМ, шикимат-3фосфат 3 мМ (получен согласно 1<лю\\!ек Р.Е. и δρτίηκοη Ό.Β. 1970. МеФобк ίη Еп7уто1 17А, 351-352 из АетоЬас1ет ае годе пек Чгат АТСС 25597) и фторид калия 10 мМ. Ферментный экстракт добавляют в последний момент, после добавления глифозата, конечная концентрация которого варьируется от 0 до 20 мМ.
Активность измеряют по количеству освобождённого фосфата согласно технике Таикку Н.А. и ЗЬогг Е, 1953, 1. Вю1. СЬет., 202, 675-685.
В этих условиях дикий фермент (\УТ) ингибируется на 85% начиная с концентрации глифозата, равной 0,12 мМ. При этой концентрации известный мутантный фермент Зег106 ингибируется только на 50%, а три других мутанта 11е 102, 11е 102/Зег 106, А1а 101/11е 102 не ингибируются или мало ингибируются.
Нужно увеличить концентрацию глифозата в десять раз, до 1,2 мМ, чтобы ингибировать мутантный фермент 11е 102 на 50%, при этом мутанты 11е 102/Зег 106, А1а/11е и А1а не ингибируются.
Нужно отметить, что активность мутантных ферментов А1а/11е и А1а не ингибируется вплоть до концентрации глифозата, равной 10 мМ, а активность мутанта 11е 102/Зег 106 не уменьшается, даже если концентрацию глифозата увеличить в два раза, и она будет равна 20 мМ.
В. Устойчивость трансформированных растений табака.
0-1 Конструкция плазмид:
рВРА-ВО-124: Добавление знака полиаденилирования пок к рВРА-МЬ-720, полученному ранее, с созданием кассеты клонирования, содержащей двойной мутантный ген ЕР8Р8 кукурузы (ТЬг 102 11е и Рго 106 ^8ет). рРРАМЬ-720 расщепляют с помощью ΗίηάΙΙΙ, обрабатывают фрагментом ККпоу ДНК-полимеразы I Е. сой, чтобы получить открытый конец. Осуществляют второе расщепление с помощью Ысо1, и очищают фрагмент ЕР8Р8. Затем ген ЕР8Р8 соединяют с очищенным рВРА-ВО-12 (кассета клонирования, содержащая знак олиадениляции нопалинсинтетазы), чтобы получить рКРА-КЛ-124. Чтобы получить очищенный полезный вектор рКРА-КЛ-12, нужно, чтобы он был предварительно расщеплен с помощью За11, обработан с помощью ДНК-полимеразы К1епо\у. затем расщеплён второй раз с помощью ЫсоТ рВРА-КЭ-125: Добавление оптимизированного транзитного пептида (ОТП) к рРРАΚΌ-124 с созданием кассеты клонирования, содержащей ген ЕР8Р8, взятый из плазмид рРРАΡΌ-7 (европейская заявка на патент ЕР 652 286) расщепляют с помощью 8рЫ, обрабатывают Т4 ДНК полимеразой, затем расщепляют с помощью 8реЕ и очищают фрагмент ОТП. Этот фрагмент ОТП клонируют в рВРА-ВО-124, предварительно расщеплённой с помощью Ысо1, обработанной с ДНК полимеразой ККпоу, чтобы удалить выступающую часть 3', затем расщеплённой с помощью 8ре1. Затем этот клон секвенируют, чтобы обеспечить правильное соединение между ОТП и геном ЕР8Р8. Таким образом получают рВРА-ВО-125.
рВРА-КО-159: Добавление двойного гистонного промотора агаЬ1борк1к Н4А748 (заявка ЕР 507 689) к рВРА-КО-125, с созданием кассеты экспрессии в растениях для экспрессии гена ОТП - двойной мутантный ген ЕР8Р8 в тканях двудольных растений. рКРА-КЛ-132 (кассета, содержащая двойной промотор) Н4А748 (заявка на патент ЕР 507698) расщепляют с помощью Ысо1 и 8ас1. Очищенный фрагмент промотора затем клонируют в расщепленной с помощью Есо1 и 8ас1.
рВРА-КО-173: Добавление гена промотор Н4А748-ОТП-двойной мутантный ген ЕР8Р8 из рВРА-ВО-159 в плазмиду рРРА-ВЬ-150А (европейская заявка на патент 508909) с созданием вектора трансформации АдгоЬас1епит ШтеГащеш!. рВРА-КО-159 расщепляют с помощью №1 I и обрабатывают полимеразой К^поу. Затем этот фрагмент клонируют в рКРА-ВЬ150А с помощью 8та1.
1-1 Трансформация.
Вектор рВРА-КЭ-173 вводят в штамм АдгоЬас1епит 1иптеГас1е1тк ЕНА101 (Нооб и др., 1987), который является носителем космиды рТУК291 (Котай и др., 1986). Техника трансформации основана на методике НогкЬ и др., (1985).
1-2 Регенерация.
Регенерацию табака РВЭ6 (происхождение 8Е1ТА Франция) из листовых эксплантатов осуществляют на базовой среде МитакЫде е1 Зкоод (МЗ), содержащей 30 г/л сахарозы, а также 200 мкг/мл канамицина. Листовые эксплантаты отбирают у растений, выращенных в теплице или ίη νίΙΐΌ. и трансформируют согласно технике листовых дисков (Зие^е, 1985, Уо1. 226, р.р. 1229-1231) в три последовательных стадии: первая стадия включает индукцию побегов на питательной среде, к которой добавлено 30 г/л сахарозы, содержащей 0,05 мг/л наф тилуксусной кислоты (ΑΝΑ) и 2 мг/л бензиламинопурина (ВАР), в течение 15 дней. Затем образовавшиеся на этом этапе ростки выращивают в течение 10 дней на среде М8, к которой добавлено 30 г/л сахарозы, но в которой не содержится гормон. Затем отбирают развившиеся побеги и культивируют их на укореняющей среде М8, с половинным содержанием солей, витаминов и сахаров и не содержащей гормон. Примерно через 15 дней укоренившиеся побеги переносят в землю.
1-3 Устойчивость к глифозату.
Двадцать трансформированных растений были регенерированы и переведены в теплицу для конструирования ρΚΡΑ-ΚΌ-173. Эти растения были обработаны в теплице на пятилистовой стадии водной суспензией Коиийир, соответствующей 0,8 кг активного вещества глифозата на гектар.
Результаты соответствуют наблюдению признаков фитотоксичности, отмеченных через 3 недели после обработки. В этих условиях констатируют, что растения, трансформированные конструкцией ρΚΡΑ-ΚΠ-173, имеют очень хорошую устойчивость, тогда как нетрансформированные контрольные растения были полностью уничтожены.
Эти результаты ясно показывают улучшение, вызванное использованием химерного гена согласно изобретению, для того же гена, кодирующего устойчивость к глифозату.
Пример 5. Трансформация промышленного табака ΡΒΌ6 геном нитрилазы (для конструкция 238).
Этот табак получен согласно европейской заявке п° 0 337 899, страница 6, строка 50 и следующие, из конструкции 238, которая описана под названием ρΚΡΑ-ВЬ 238.
Пример 6. Скрещивание опылением.
В теплице проводят скрещивание опылением, соответственно, линий Со 17, 173 и 238:
- Со 17 с 238, чтобы получить растения табака ΡΒΌ6 для тестирования на двойную устойчивость к изоксафлутолу и бромоксинилу (растения ΗΡΡΌ + ΟΧΥ) и - Со 17 с 173, чтобы получить растения табака ΡΒΌ6 для тестирования на двойную устойчивость к изоксафлутолу и глифозату (растения ΗΡΡΌ + ΕΡ8Ρ8).
Три клона являются гомозиготными по задействованному гену, следовательно, потомство является гемизиготным для каждого из двух генов, введенных скрещиванием.
Скрещенные растения получают через шесть недель.
Пример 7. Измерение устойчивости табака при обработке проросшего растения изоксафлутолом и бромоксинилом или глифозатом.
В этой пробе каждый тест проводят на образце из 10 растений, причем ещё 10 растений оставляют необработанными.
Все виды обработки осуществляют пульверизацией из расчета 500 л раствора на гектар.
Для обработки проросших растений производят посев, затем пересаживают растения в чаши размером 9 см х 9 см.
Обработка проросших растений производится на стадии хорошего развития (3-4 листочка). Партии растений, соответственно, дикие и генетически трансформированные, как описано выше, разделяют на несколько частей:
а) необработанная партия,
б) другие партии, обработанные, соответственно, только одним гербицидом,
- проросшие растения, обработанные 2 дозами изоксафлутола (соответственно 200 и 400 г/га),
- проросшие растения, обработанные 2 дозами бромоксинила (соответственно 400 и 800 г/га),
- проросшие растения, обработанные 2 дозами глифозата (соответственно 800 и 1200 г/га),
в) другие партии, обработанные соответственно двумя гербицидами, в проросшей стадии, смесью, приготовленной перед самым использованием:
- двумя дозами изоксафлутола и бромоксинила (соответственно 200/400 и 400/800 г/га),
- двумя дозами изоксафлутола и глифозата (соответственно 200/800 и 400/1200 г/га).
Обработку проводят, используя следующие составы: изоксафлутол 75%, бромоксинил (товарный продукт ΡΑΚΟΝΕΚ.) в виде октаноата в эмульгирующемся концентрате 225 г/л и глифозат (Κοπηά-υΡ).
В этих условиях через 17 дней после обработки наблюдают следующие признаки фитотоксичности, которые указаны в таблице, в процентах деструкции, а также в таблице указано число растений на партию и дозы гербицидов, выраженные в граммах активного вещества на гектар:
Обработка проросших растений изоксафлутолом и бромоксинилом или глифозатом
Гербицид в г/л Растения с геном устойчивости
* ΗΡΡΌ +ΟΧΥ * ΗΡΡΌ+ ΕΡ8Ρ8 * без обработки = дикие
Контрольные дозы 10 10 10
Изоксафлутол один 200 20 4% 20 2% 10 75%
400 20 5% 20 3% 85%
Бромоксинил один 400 10 3% 10 0%
800 10 0% 10 0%
Глифозат один 800 20 0% 10 100%
1200 20 0% 10 100%
Изоксафлутол + бромоксинил 200 20 20% 10 100%
800
Изоксафлутол + бромоксинил 400 20 30% 10 100%
800
Изоксафлутол + глифозат 200 40 5% 10 100%
800
Изоксафлутол + глифозат 400 40 10% 10 100%
1200
* количество растений
Пример 8. Чтобы узнать, может ли ген ΗΡΡΌ Ρзеиάοтοηаз Диогезсепз быть использован в качестве маркерного гена во время цикла трансформация-регенерация какого-нибудь растительного вида, табак был трансформирован с помощью химерного гена, состоящего из гена ΗΡΡΌ и из дважды мутированного гена ΕΡ8Ρ8 устойчивости к глифозату, и были получены трансформированные растения, устойчивые одновременно к изоксафлутолу и к глифозату, после селекции на изоксафлутоле.
Материал и методы, результаты
Химерный ген ρΚΡ 2012, описанный выше, переносят в промышленный табак ΡΒΌ6 согласно процедурам трансформации и регенерации, уже описанным в европейской заявке ЕР п° 0 508 909.
Химерный ген вектора ρΚΡ 2012 имеет
следующую структуру А-В, в кото рой А - это:
Двойной гистонный промотор ТЕУ ОТП Кодирующий участок ΗΡΡΏ Терминальная последовательность поз
а В - это:
Двойной гистонный промотор ТЕУ ОТП Кодирующий участок ΕΡ8Ρ8 Терминальная последовательность поз
как ген, используемый в векторе ρΚΡΑΚΌ-173. Химерный ген ρΚΡ 2012 вводят в табак.
1) Трансформация.
Вектор вводят в неонкогенный штамм АдгоЬас!егшт ΕΗΑ 101 (Ηοοά и др., 1987), который является носителем космиды ρΤνΚ 291 (Котап и др., 1986) . Техника трансформации основана на методике Ногзй и др., (1985).
2) Регенерация.
Регенерацию табака ΡΒΌ6 (происхождение 8ΕΙΤΑ Франция) из 7 листовых эксплантатов осуществляют на базовой среде МигазЫде и 8коод (М8), включающей 30 г/л сахарозы, а также 350 мг/л цефотаксима и 1 мг/л изоксафлутола. Листовые эксплантаты отбирают у растений в теплице или ш νίΙΐΌ и трансформируют согласно технике листовых пластинок (8с1епсе 1985, Уо1. 227, ρ.ρ. 1229-1231) в три последовательных этапа: первый этап включает индукцию побегов на среде М8, к которой добавлено 30 г/л сахарозы, содержащей 0,05 мг/л нафтилуксусной кислоты (ΑΝΑ) и 2 мг/л бензиламинопу рина (ВАР) и 1 мг/л изоксафлутола в течение 15 дней. Затем зеленые ростки, образовавшиеся на этом этапе, культивируют в течение 10 дней на среде М8, к которой добавлено 30 г/л сахарозы и 1 мг/л изоксафлутола, но которая не содержит гормон. Затем отбирают развившиеся побеги и выращивают их на укореняющей среде М8, с половинным содержанием солей, витаминов и сахаров и 1 мг/л изоксафлутола и не содержащей гормон. Примерно через 15 дней укоренившиеся побеги переносят в землю.
Все всходы, полученные в соответствии с этим протоколом, анализируют с помощью ПЦР со специфичными праймерами ΗΡΡΌ Р. Пиогезсепз. Этот анализ ПЦР позволил подтвердить, что все всходы, полученные таким образом, хорошо интегрировали ген ΗΡΡΌ и что они устойчивы одновременно к изоксафлутолу и глифозату, в условиях, описанных в примере 7.
Это испытание подтверждает, что ген ΗΡΡΌ может быть использован как маркерный ген и что, в ассоциации с этим геном, изоксафлутол может быть хорошим агентом селекции.
Пример 9. Растение с геном ΗΡΡΌ и геном Ьаг, устойчивое одновременно к изоксафлутолу и фосфинотрицину.
1. Конструкция химерного гена с последовательностью ΗΡΡΌ. Плазмида ρΚΡΑ-ΚΌ-1004, представленная на фиг. 4, получена введением химерного гена устойчивости к изоксазолам в плазмиду 19 в 2686 нп, поставляемую фирмой №х Епд1апй Вю1аЬз (Υаηη^зй-Ρе^^οη, С. У1ега, I. и Маззтд, I. (1985) Сепе 33, 103-119) и имеющую устойчивость к ампициллину.
Различными элементами химерного гена в направлении расшифровки являются:
- гистонный промотор Н3С4 кукурузы в 1020 нп, описанный в заявке ЕР 0 507 698;
- интрон гена спирта дегидрогеназы Ι кукурузы, описанный 8ас11з М. и др.. СепеЕсз 113: 449-467 (1986) и состоящий из 536 нп;
- оптимизированный транзитный пептид (ОТП), описанный в заявке на патент ЕР 0 508 909, этот ОТП состоит из 171 нп транзитного пептида малой субъединицы Рибулозы 1,5 бисфосфат карбоксилазы/оксигеназы ИеНапЦз аппииз (Аакзтап С. и др., 1987. №с1еюз аскз Кез. 15: 7181), за которыми следуют 66 нп зрелой части малой субъединиды Рибулозы 1,5 бис27 фосфат карбоксилазы/ оксигеназы 2еа таук (ЬеЬтип и др., 1987. Йис1е1ск асйк Кек. 15: 4360), за ними следуют 150 нп транзитного пептида малой субъединицы Рибулозы 1,5 бисфосфат карбоксилазы/оксигеназы 2еа таук (ЬеЬтип и др., 1987. Ыисйюк асйк Кек. 15: 4360). Все вместе составляет 387 нп;
- кодирующий участок ΗΡΡΌ Ркеиботопак йиотексепк, описанный выше;
- терминальная последовательность гена нопалин синтетазы (пок) (зона полиаденилирования гена пок, выделенного из ρΤί 37, 250 нп) (Веуап М. и др., Ыис1е1ск асйк Кек., 11: 369-385);
2. Конструкция химерного гена устойчивости к фосфинотрицину (ген Ьаг):
Фосфинотрицин ацетил трансфераза (ФАТ), кодируемая геном Ьаг, является ферментом, который дезактивирует один гербицид, фосфинотрицин (ФФТ). ФФТ ингибирует синтез глутамина и вызывает быструю аккумуляцию аммиака в клетках, ведущую к их умиранию (ТасЫЬапа и др., 1986).
Плазмиду, используемую для введения устойчивости к фосфинотрицину в качестве селективного агента, получают введением химерного гена ρΌΜ 302 в вектор ρ8Ρ72 из 2426 нп, поставляемый фирмой Рготеда Согр. (СепЬапк/ΏΌΒΙ ба!аЬаке ассеккюп питЬег Х65332) и содержащий ген устойчивости к ампициллину.
Плазмида ρΌΜ 302, состоящая из 4700 нп, была описана Сао 1. и др., Р1ап1 Се11 Кеρой II: 586-591 (1992).
Различными элементами этой плазмиды являются:
- промотор гена актина риса, описанный Мс Е1гоу Ό. и др. Р1ап1 Мо1еси1аг Вю1оду 15: 257-268 (1990), состоящий из 840 нп;
- первый экзон гена актина риса, состоящий из 80 нп;
- первый интрон гена актина риса, состоящий из 450 нп;
- кодирующий участок гена Ьаг в 600 нп, удаленный из плазмиды РП41404, описанной \У1Ше 1. и др., Ыис. Аабк Кек., 18: 1862 (1990);
- терминальная последовательность гена нопалин синтетазы (пок) (зона полиаденилирования гена пок, выделенного из ρΤί 37, 250 нп) (Веуап М. и др., Ыискюк асйк Кек., 11: 369-385).
3. Трансформация.
Для ввода генетической конструкции используют технику бомбардировки. Плазмиды очищают на колонке Ц1адеп и соосаждают на частицах вольфрама М10 согласно способу К1еш (ХаИие 327: 70-73, 1987).
Затем смесь металлических частиц и двух плазмид, описанных выше, бомбардируют на эмбриогенных клетках кукурузы.
4. Регенерация и использование гена Ьаг в качестве агента селекции:
Бомбардируемые каллюсы селекционируют на глуфозинате до появления зеленых секторов.
Положительные каллюсы конвертируют в соматические эмбрионы, затем помещают в условия, благоприятствующие прорастанию.
Молодые растения переносят в теплицу для производства семян.
Молекулярные анализы этих растений показывают, что
- по меньшей мере, 4 каллюса, селекционированные на фосфинотрицине, породили растения, проявляющие, с помощью ПЦР, наличие гена НРРЭ;
- по меньшей мере, 5 каллюсов, селекционированных на фосфинотрицине, породили растения, проявляющие, с помощью 8оШ11егп Ь1оЬ наличие гена НРРЭ;
- по меньшей мере, 5 каллюсов, селекционированных на фосфинотрицине, породили растения, проявляющие, с помощью \Уек1егп Ь1оЬ наличие рекомбинантного протеина;
- химерный ген НРРЭ и гетеролитический протеин отсутствуют в нетрансформированных каллюсах.
Эти результаты показывают эффективность химерного гена Ьаг для селекции трансформированных каллюсов, содержащих другой ген, представляющий интерес для агрономии.
5. Анализ потомства трансформированных растений.
Полученные выше трансформированные растения выделили пыльцу, которая, предположительно, является частично трансгенной, которая оплодотворила зародышевые клетки дикой не трансгенной кукурузы.
Полученные зерна селекционировали на песке после обработки изоксафлутолом. Ниже приводится протокол селекции:
800 мл песка Фонтенбло помещают в лоток с размером сторон 15 х 20 см. Эти лотки поливают водой и поддерживают влажными с помощью питательного раствора, состоящего из 5 мл Цитой^о (Хинолина) на литр воды. Двадцать зерен кукурузы помещают в лотки, которые затем обрабатывают изоксафлутолом путем пульверизации из расчета 100-200 г активного вещества на гектар (300 или 600 мкг активного вещества на лоток). Затем эти лотки помещают в теплицу.
Полученные результаты собраны в следующей таблице:
Генотипы Изоксафлутол (г/га) Число просеянных зерен Число проросших растений Число погибших растений Число уцелевших растений
Не трансгенные 0 20 20 0 20
100 20 20 20 0
261 2В 459 100 10 10 5 5
200 10 9 4 5
261 2Ό2 100 10 9 6 3
200 10 10 7 3
261 2А2 100 10 5 3 2
200 10 7 7 0
Эти результаты показывают эффективность гена НРРЭ для селекции устойчивых растений кукурузы. Они показывают также, что экспрессия НРР8 Р8еиботопа8 в тканях кукурузы придает им устойчивость к изоксафлутолу.
Представлены следующие последовательности:
8ЕО ΙΌ № 1 последовательность гена НРРЭ Р8еиботопа8 Диоге8сеп8 А 32.
8ЕО ΙΌ № 2 последовательность кДНК ЕР8Р8 АгаЬ1бор818 Шакала
8ЕО ΙΌ № 3 и 4 последовательности, соответственно, гена и протеина ЕР8Р8 мутированной кукурузы, часть из 1340 нп клона рКРА-МЬ-716
8ЕС) ΙΌ п° 5 и 8ЕО ΙΌ п° 6 последовательности, соответственно, гена и протеина ЕР8Р8 мутированной кукурузы, часть из 1340 нп клона рКРА-МЬ-720.
Для сведения прилагаются фигуры, в качестве иллюстрации изобретения.
На фиг. 1 представлена белковая последовательность НРРЭ Р8еиботопа8 8р. 81гаШ Р.1. 874 и теоретическая нуклеотидная последовательность соответствующей кодирующей части; пять олигонуклеотидов, выбранных для амплификации одной части этого кодирующего участка, обозначены пятью стрелками.
На фиг. 2 представлена картография плазмиды с фрагментом геномной ДНК из 7 кЬ, содержащей ген НРРЭ Р. Пцоге8сеп8 А 32.
На фиг. 3 приводится сравнение аминокислотных последовательностей НРРЭ Р.Пцоге8сеп8 А 32 и НРРЭ Р8еиботопа8 8р. 81гаш Р.1. 874 (указаны только аминокислоты, различающиеся у двух последовательностей), а также консенсусная последовательность.
Ызсе аез зёдиепсез
5Ξς ΙΟ ΝΟ: 1:
АТС6САЗАТС ТАТАСЗАААА СССААТСЗСС СТЗАТЗЗЗСТ ТТЗААТТСАТ СЗААТТСЗСЗ 60 ТСССССАСЗС СЗЗОТАСССТ ЗСАЗСССАТС ТТССАСАТСА ТССССТТСАС САААСТСССС 120 АСССАССЗТТ ССААЗААСЗТ ЗСАССТЗТАС СЗССАЗСЗСВ АСАТСААССТ САТССТСААС 1В0 ААС8АЗСССА АСАССАТССС СТССТАСТТТ ЗСЗЗССЗААС АСССССССТС ВЗТЗТЗССЗС 240 АТОССЗТТСС ЗСЗТЗААЗЗА СТСЗСААААЗ СССТАСААСС ССССССТСОА АСТССЗСЗСС 300 САССССАТСС АТАТТЗАСАС ССОССССАТ6 ЗААТТЗААСС ТЗССЗЗСЗАТ СААЗЗЗСАТС 360 сассссссас СЗТТВТАССТ ЗАТССАСССТ ТТСЗЗСЗААЗ ЗСАЗСТСЗАТ СТАССАСАТС 420 САСТТСЗТЗТ АССТССААСО ТВТЗЗАЗСЗС ААТССЗЗТСЗ ЗТЗСАССТСТ САААСТСАТС 480 ЗАССАССТЗА СССАСААСЗТ СТАТСССЗЗС СССАТСЗТСТ АСТСЗСССАА СТТСТАСЗАЗ 540 АААТТЗТТСА АСТТСССТСА АСССССТТАС ТТСЗАТАТСА АСЗЗССАЗТА САССЗЗССТЗ 600 АСТТССААЗЗ ССАТЗАЗТСС СССЗЗАСССС АТЗАТССЗСА ТСССССТЗАА ССААЗАСТСС 660 ТССААЗСЗСЗ СЗЗСССАВАТ СЗААЗАЗТТС СТСАТССАСТ ТСААСЗЗССА АЗЗСАТССАЗ 720 САСЗТЗССЗТ ТССТСАССЗА СЗАССТЗСТС ААЗАССТЗЗЗ АССССТТЗАА ЗААААТСЗЗС 780 АТССЗСТТСА ТЗАССССССС ОССАСАСАСТ ТАТТАСЗААА ТЗСТССААСЗ ССЗССТСССТ 840 ЗАССАСЗЗСЗ АЗССЗЗТЗЗА ТСААСТССАЗ ЗСАСЗССЗТА ТССТЗСТЗЗА СЗЗАТСТТСС 900 ЗТЗЗААЗЗСЗ АСАААС8ССТ ЗСТЗСТВСАЗ АТСТТСТССЗ АААСССТЗАТ ЗЗЗСССЗЗТЗ 960 ТТСТТСЗААТ ТСАТССАССС СААЗЗВСЗАС ЗАТЗЗЗТТТС ЗСЗАЗСЗСАА СТТСААООСЗ 1020 СТЗТТССАЗТ ССАТСЗААСЗ ТЗАССАЗЗТС ССТССТЗЗТС ТАТТЗАСССС СЗАТТАА 1077 5Е<2 ΙΟ ΝΟ: 2 : .
ААТСААТТТС АСАСАСЗААА САЗСТАТЗАС САТЗАТТАСЗ ААТТССЗССС СЗЗЗСССЗТЗ 60 АТССЗСССЗС ЗЗСАЗСЗЗСЗ ЗССССЗЗТЗС АЗССЗЗОТСС СЗАЗЗАЗАТС ЗТЗСТССАСС 120 ССАТСААЗЗА ЗАТСТССЗЗС АСССТСААСС ТССССЗЗСТС СААСТСЗСТТ ТССААССССА 180 ТССТССТАСТ СЗССЗСССТЗ ТССЗАЗЗСЗА СААСАСТЗЗТ ТЗАТААССТЗ СТСААСАЗТЗ 240 АВЗАТСТССА СТАСАТССТС СЗЗЗССТТСА ЗСАСТСТТСС ТСТСТСТЗТС ЗААСССЗАСА 300 ААЗСТЗССАА ААЗАЗСТЗТА СТТЗТТЗЗСТ СТССТЗЗААА ЗТТСССАСТТ ЗАЗЗАТЗСТА 360 ААСАОЗААСТ ССАССТСТТС ТТЗЗЗЗААТ6 СТЗЗААСТСС ААТСССЗССА ТТСАСАВСАС 420 СТСТТАСТЗС ТССТСЗТССА ААТЗСААСТТ АСЗТССТТСА ТЗЗАСТАССА АСААТЗАЗЗЗ 480 АЗАЗАСССАТ ТЗССЗАСТТЗ СТТСТСССАТ ТЗААССАССТ ТСЗТЗСАЗАТ СТТЗАТТЗТТ 540 ТССТТСССАС ТЗАСТОСССА' ССТЗТТССТЗ ТСААТЗЗААТ СВЗАЗЗССТА ССТЗЗТЗЗСА 600 АССТСААЗСТ СТСТСЗСТСС АТСАЗСАСТС АЗТАСТТСАВ ТСССТТССТС АТСССТССТС 660 СТТТСССТСТ ТЗССЗАТСТЗ ЗАЗАТТСААА ТСАТТСАТАА АТТААТСТСС АТТССЗТАСЗ 720 ТССАААТЗАС АТТЗАЗАТТЗ АТССАЗСЗТТ ТТСВТЗТЗАА АЗСАЗАЗСАТ ТСТЗАТАЗСТ 780 С-ЗЗАСАЗАТТ СТАСАТТААЗ ЗЗАССТСААА ААТАСААЗТС СССТАААААТ ЗССТАТСТТЗ 840 ААСЗТСАТСС СТСААЗСССА АЗСТАТТТСТ ТЗЗСТЗСТСС ТЗСААТТАСТ ЗЗАЗЗЗАСТЗ 900 ТЗАСТСТСЗА АЗЗТТСТССС АССАССАЗТТ ТССА336ТСА ТСТЗААЗТТТ ЗСТЗАЗЗТАС 960 ТЗЗАЗАТЗАТ СЗВАЗСЗААЗ ЗТТАСАТЗЗА ССЗАЗАСТАЗ ССТААСТСТТ АСТЗЗСССАС 1020 ССССВЗАЗСС АТТТЗСЗАСО АААСАССТСА АСЗСЗАТТЗА ТСТСААСАТЗ ААСААЗАТЗС 1080 СТЗАТСТСЗС САТЗАСТСТТ ССТЗТСЗТКЗ СССТСТТТСС СЗАТ6ССССС АСАЗССАТСА 1140 ЗАЗАСЗТЗЗС ТТССТЗЗАЗА СТАААЗЗАЗА СССАЗАЗЗАТ СЗТТССЗАТС СЗЗАСЗЗАЗС 1200 ТААССААЗСТ ЗЗЗАЗСАТСТ ЗТТСАЗЗААЗ ЗСССЗЗАСТА СТССАТСАТС АСЗССЗСССС 1260 АСААЗСТСАА СЗТЗАССССС АТССАСАССТ АС8АСЗАССА САЗЗАТСССС АТССССТТСТ 1320 СССТТЗССЗС СТЗТЗССЗАЗ ЗТССССЗТСА ССАТССЗСЗА СССТЗЗЗТЗС АССССЗААЗА 1380 ССТТССССЗА СТАСТТСЗАТ СТЗСТЗАССА СТТТСЗТСАА ЗААТТААТАА АОССТССЗАТ 1440 АСТАССАСЗС А8СТТСАТТЗ ААЗТЗАТАЗЗ СТТЗТЗСТСА С8АААТАСАТ ТТСТТТТЗТТ 1500 СТСТТТТТСТ СТТТСАСССС АТТААСТТТТ ЗАСТСТЗТАА СЗТТАЗТТЗТ ТТЗТАЗСААС 1560 ТТТСТАТТТС ВЗАТСТТААЗ ТТТСТВСАСТ ЗТААЗССААА ТТТСАТТТСА АЗАЗТЗЗТТС 1620 ЗТТЗЗААТАА ТААСААТААТ АААТТАСЗТТ ТСАЗТЗАААА АААААААААА АААААААААА 1680 АААААААААА АААААААААА ААСССЗЗЗАА ТТС 1713
5ες Ю N0: 3
ССАТС ССС ССС ССС САС САС АТС СТС СТС САС ССС АТС ААС САС АТС А1а С1у А1а С1и СХи Не Уа1 Ьеи С1п Рго Не Ьуз С1и Не 47 95
1 5 10 ТСС СТТ ТСС ААС ССС АТС Зег Ьеи Зег Азп Агд Не
ТСС 5ег 15 ССС АСС СТС ААС СТС Ьеи 20 ССС ССС ТСС ААС
С1у ТЬг УаХ Ьуз Рго С1у Зег Ьуз
25 30
СТС СТА СТС ссс ссс СТС ТСС САС ССС АСА АСА СТС СТТ САТ ААС СТС 143
Ьеи Ьеи Ьеи АХа А1а Ьеи Зег С1и С1у ТЬг ТЬг Уа1 Уа1 Азр Азп Ьеи
35 40 45
СТС ААС АСТ САС САТ СТС САС тле АТС СТС ССС ссс ТТС АСС АСТ СТТ 191
Ьеи Азп Зег С1и Азр Уа1 НХз Туг МеС Ьеи С1у А1а Ьеи Агд ТЬг Ьеи
50 •55 60
ССТ СТС ТСТ СТС САА ССС САС ААА ССТ ССС ААА АСА ССТ СТА СТТ СТТ 239
С1у Ьеи Зег Уа1 С1и А1а Азр Ьуз АХа А1а Ьуз Агд АХа Уа1 Уа1 Уа1
65 70 75
ссс ТСТ ОСТ ССА ААС ТТС ССА СТТ САС САТ ССТ ААА САС САА СТС САС 287
СХу Суз С1у <Э1у Ьуз РНе Рго Уа1 С1и Азр А1а Ьуз С1и С1и УаХ О1п
80 85 90
СТС ТТС ТТС ССС ААТ ССТ ССА АСТ ССА АТС ССС ССА ТТС АСА ССА ССТ 335
Ьеи РНе Ьеи С1у Азп А1а С1у ТЬг А1а МеС Агд Рго Ьеи ТЬг А1а А1а
95 100 105 110
СТТ АСТ ССТ ССТ ССТ ССА ААТ ССА АСТ ТАС СТС СТТ САТ ССА СТА ССА 383
Уа1 ТЬг А1а А1а СХу С1у АЗП А1а ТЫ туг Уа1 Ьеи Азр С1у Уа1 Рго
115 120 125
АСА АТС АСС САС АСА ССС АТТ ССС САС ТТС СТТ СТС ССА ТТС ААС САС 431
Агд МеС Агд С1и Агд Рго Не 61у Азр Ьеи Уа1 Уа1 С1у Ьеи Ьуз СХп
130 135 140
СТТ ССТ ССА САТ СТТ САТ ТСТ ТТС СТТ ССС АСТ САС ТСС ССА ССТ СТТ 479
Ьеи С1у А1а Азр Уа1 Азр Суз РНе Ьеи СХу ТЫ Азр Суз Рго Рго Уа1
145 150 155
ССТ СТС ААТ ССА АТС ССА ССС СТА ССТ ССТ ССС ААС СТС ААС СТС ТСТ 527
Агд Уа1 Азп С1у Не С1у С1у Ьеи Рго С1у С1у Ьуз Уа1 Ьуз Ьеи Зег
160 165 170
ССС ТСС АТС АСС АСТ САС ТАС ТТС АСТ ССС ТТС СТС АТС ССТ ССТ ССТ 575
СХу Зег Не Зег Зег С1п Туг Ьеи Зег А1а Ьеи Ьеи Меи А1а АХа Рго
175 180 185 190
ТТС ССТ СТТ ССС САТ СТС САС АТТ САА АТС АТТ САТ ААА ТТА АТС ТСС 623
Ьеи А1а Ьеи С1у Азр Уа1 С1и Не С1и Не Не Азр Ьуз Ьеи Не Зег
195 200 205
АТТ ССС ТАС СТС САА АТС АСА ТТС АСА ТТС АТС САС СОТ ТТТ ССТ СТС 671
Не РГО Туг Уа1 61и МеС ТЬг Ьеи Агд Ьеи МеЪ С1и Агд РНе С1у УаХ
210 215 220
ААА ССА САС САТ ТСТ ОАТ АСС ТСС САС АСА ТТС ТАС АТТ ААС ССА ССТ 719
Ьуз А1а С1и Нхз Зег Азр Зег Тгр Азр Агд РЬе Туг Не Ьуз С1у СХу
225 230 235
САА ААА ТАС ААС ТСС ССТ ААА ААТ ССС ТАТ СТТ САА ССТ САТ ССС ТСА 767
С1п Ьуз Тух Ьуз Зег Рго Ьуз Азп А1а Туг Уа1 С1и С1у Азр А1а Зег
240 245 250
5Ε<2 10 N0: 3(8иахе)
АСС ССА АСС ТАТ ТТС Туг РЬе ТТС Ьеи 260 ССТ ост А1а СХу ССТ ССА АТТ АСТ ССА ССС АСТ СТС 815
255 АХа Зег А1а АХа Не 265 ТЬг СХу СХу ТЬг УаХ 270
АСТ СТС САА ССТ ТСТ ССС АСС АСС АСТ ТТС САС ССТ САТ СТС ААС ТТТ 863
ТЬг Уа1 СХи СХу Суз <31у ТЬг ТЬг Зег Ьеи СХп СХу Азр Уа1 Ьуз РЬе
275 280 285
ССТ САС СТА СТС САС АТС АТС ССА ССС ААС СТТ АСА ТСС АСС САС АСТ 911
АХа СХи Уа1 Ьеи СХи Мес МеС СХу А1а Ьуз УаХ ТЬг Тгр ТЬг СХи ТЬг
290 295 300
АСС СТА АСТ СТТ АСТ ССС ССА ССС ССС САС ССА ТТТ ССС АСС ААА САС 959
Зег УаХ ТЬг УаХ ТЬг С1у Рго Рго Агд СХи Рго РЬе С1у Агд Ьуз Н13
305 310 315
СТС ААС ССС АТТ САТ СТС ААС АТС ААС ААС АТС ССТ САТ СТС ССС АТС 1007
Ьеи Ьуз АХа Не Азр Уа1 Азп Меп Азп Ьуз Мек Рго Азр УаХ А1а МеЬ
320 325 330
АСТ СТТ ССТ СТС СТТ ССС СТС ТТТ ССС САТ ССС ССС АСА ССС АТС АСА 1055
ТЬг Ьеи АХа Уа1 УаХ АХа Ьеи РЬе А1а Азр СХу Рго ТЬг А1а Не Агд
335 340 345 350
САС СТС ССТ ТСС ТСС АСА СТА ААС САС АСС САС АСС АТС СТТ ССС АТС 1103
Азр УаХ АХа Зег Тго Агд Уа1 Ьу5 С1и ТЬг С1и Агд МеЬ Уа1 А1а Не
355 360 365
ССС АСС САС СТА АСС ААС СТС ССА ССА ТСТ СТТ САС САА ССС ССС САС 1151
Агд ТЬг СХи Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи С1у АХа Зег Уа1 СХи С1и С1у Рго Азр
370 375 380
ТАС ТСС АТС АТС АСС ССС ССС САС ААС СТС ААС СТС АСС ССС АТС САС 1199
Туг Суз Не Не ТЬг Рго Рго С1и Ьуз Ьеи Азп Уа1 ТЬг А1а Не Азр
385 390 395
АСС ТАС САС САС САС АСС АТС ССС АТС ССС ТТС ТСС СТТ ССС ССС ТОТ 1247
ТЬг Туг Азр Азр ΗΪ8 Агд Мег А1а МеС АХа РЬе Зег Ьеи А1а А1а Суз
400 405 410
ССС САС СТС ССС стс АСС АТС ССС САС ССТ ССС ТСС АСС ССС ААС АСС 1295
А1а С1и УаХ Рго УаХ ТЬг Не Агд Азр Рго СХу Суз ТЬг Агд Ьуз ТЬг
415 420 425 430
ТТС ССС САС ТАС ТТС САТ СТС СТС АСС АСТ ТТС СТС ААС ААТ 1337
РНе Рго Азр Туг РЬе Азр Уа1 Ьеи Зег ТЬг РЬе УаХ Ьуз Азп
435 440
ТАА 1340
2Ε<3 Ιϋ N0: 4
АХа С1у А1а СХи С1и 5 Не Уа1 Ьеи С1п Рго 10 Не Ьуз СХи Не Зег СХу 15
ТЬг УаХ Ьуз Ьеи Рго С1у Зег Ьуэ Зег Ьеи Зег Азп Агд Не Ьеи Ьеи
20 25 30
Ьеи АХа А1а Ьеи Зег С1и СХу ТЬг ТЬг УаХ УаХ Азр Азп Ьеи Ьеи Азп
35 40 45
Зег СХи Азр Уа1 ΗΪ3 Туг Мее Ьеи С1у А1а Ьеи Агд ТЬг Ьеи С1у Ьеи
50 55 60
Зег Уа1 СХи АХа Азр Ьуз А1а АХа Ьуз Агд АХа УаХ УаХ УаХ СХу Суз
65 70 75 80
СХу С1у Ьуз РЬе Рго УаХ СХи Азр АХа Ьуз С1и С1и УаХ СХп Ьеи РЬе
85 90 95
Ьеи С1у Азп А1а СХу ТЬг АХа Мее Агд Рго Ьеи ТЫ АХа А1а УаХ ТЬг
100 105 110
АХа АХа СХу СХу Азп АХа ТЬг Туг УаХ Ьеи Азр СХу Уа1 Рго Агд Мее
115 120 125
Агд С1и Агд Рго Не С1у Азр Ьеи Уа1 Уа1 С1у Ьеи Ьуз С1п Ьеи СХу
130 135 140
АХа Азр Уа1 Азр Суз РНе Ьеи С1у ТЬг Азр Суз Рго Рго Уа1 Агд Уа1
145 150 155 160
А8П СХу 11е СХу С1у Ьеи Рго С1у С1у Ьуз Уа1 Ьуз Ьеи Зег СХу Зег
165 Х70 175
Не Зег Зег СХп Туг Ьеи Зег АХа Ьеи Ьеи Мее А1а А1а Рго Ьеи А1а
180 185 190
Ьеи С1у Азо УаХ СХи Не С1и Не 11е Азр Ьуз Ьеи Не Зег Не Рго
195 200 205
Туг УаХ СХи Мее ТЬг Ьеи Агд Ьеи Мее СХи Агд РЬе С1у УаХ Ьуз А1а
210 215 220
С1и ΗΪ5 Зег Азр Зег Тгр Азр Агд РНе Туг 11е Ьуз СХу СХу С1п Ьуз
225 230 235 240
Туг Ьуз Зег Рго Ьуз Азп АХа Туг Уа1 СХи С1у Азр АХа Зег Зег А1а
245 250 255
Зег Туг РНе Ьеи АХа С1у АХа АХа Не ТЬг СХу С1у ТЬг Уа1 ТЬг УаХ
260 265 270
СХи СХу Суз С1у ТЬг ТЬг Зег Ьеи С1п СХу Азр УаХ Ьуз РЬе АХа С1и
275 280 285
Уа1 Ьеи СХи Мее Меи С1у АХа Ьуз УаХ ТЬг Тгр ТЬг СХи ТЬг Зег Уа1
290 295 300
ТЫ УаХ ТЬг СХу Рго Рго Агд СХи Рго РЬе СХу Агд Ьуз ΗΪ3 Ьеи Ьуз
305 310 315 320
АХа Не Азр УаХ Азп мее Азп Ьуз Мее Рго Азр УаХ АХа Мее ТЬг Ьеи
325 330 335
А1а УаХ УаХ АХа Ьеи РЬе АХа Азр СХу Рго ТЬг АХа Не Агд Азр Уа1
340 345 350
3Ε0 Ιϋ N0: 4 (зихее)
АХа Зег Тгр 355 Агд УаХ Ьуз СХи ТЫ СХи 360 Агд Мее Уа1 А1а 365 Не Агд ТЬг
СХи Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи сху АХа Зег Уа1 СХи С1и С1у Рго Азр Туг Суз
370 375 380
Не Не ТЬг Рго Рго СХи Ьуз Ьеи Азп УаХ ТЬг А1а Не Азр ТЬг Туг
385 390 395 400
Азр Азр Ηίδ Агд мее АХа Мее АХа РЬе Зег Ьеи А1а А1а Суз АХа С1и
405 - 410 415
УаХ Рго УаХ ТЫ Не Агд Азр Рго С Ху Суз ТЬг Агд Ьуз ТЬг РЬе Рго
420 425 430
Азр Туг РЬе Азр Уа1 Ьеи Зег ТЫ РНе Уа1 Ьуз Азп
435 440
5Εζ) Ю N0:
ССАТС ССС ССС
АХа СХу
ССС САС САС АТС
АХа СХи СХи Не
СТС СТС УаХ Ьеи
САС С1п
ССС АТС ААС САС АТС
Рго 11е Ьуз СХи Не 10
ТСС Зег 15
ССС АСС СТС ААС СТС
С1у ТНг Уа1 Ьуз Ьеи
ССС
Рго
ССС ТСС ААС
С1у Зег Ьуз
ТСС СТТ ТСС ААС ССС АТС
Зег Ьеи Зег Азп Агд 11е
30
СТС Ьеи
СТА СТС ССС ССС СТС Ьеи Ьеи А1<
А1а Ьеи
ТСС 5ег
САС ССС АСА СХи СХу ТЫ
АСА СТС СТТ САТ ААС СТС ТНг УаХ УаХ Азр Азп Ьеи 45
143
СТС Ьеи
ААС АСТ САС САТ СТС
Азп Зег СХи Азр \7аХ
САС ΗΪ3
ТАС АТС СТС Туг Мек Ьеи
ССС ССС ТТС АСС АСТ СТТ
СХу А1а Ьеи Агд ТНг Ьеи
191
ССТ
С1у
САС
СТС ТСТ СТС САА ССС Ьеи Зег УаХ СХи А1а Азр ·
ААА ССТ ССС
Ьуз А1а А1а 70
ААА АСА ССТ СТА СТТ СТТ
Ьуз Агд АХа Уа1 УаХ УаХ
239
Уа1 С1и Азр
ССТ ААА
АХа Ьуз
САС САА СТС САС 31и С1и Уа1 С1п
287
СТС Ьеи
ССС ТСС
Агд Зег
105
ТТС АСА ССА ССТ
Ьеи ТНг АХа АХа
1X0
335
СТТ
Уа1
АСТ ССТ ССТ ССТ ССА ААТ ССА АСТ ТАС
ТНг АХа АХа СХу СХу Азп А1а ТНг Туг
Х15 120
СТС СТТ САТ ССА СТА ССА
Уа1 Ьеи Азр С1у Уа1 Рго
125
383
АСА Агд
СТТ СТС ОСА ТТС ААС САС
СТТ
АТС АСС САС АСА ССС АТТ ССС САС ТТС_________________ ____
МеС Агд С1и Агд Рго Не СХу Азр Ьеи Уа1 Уа1 СХу Ьеи Ьуз С1п — --- 140
1зо
135
ССТ ССА САТ СТТ САТ ТСТ ТТС СТТ ССС АСТ САС ТСС
СХу АХа Азр Уа1 Азр Суз РНе Ьеи СХу ТЫ Азр Суз
145 150 155
ССА ССТ СТТ
Рго Рго Уа1
431
479
ССТ Агд
527
ССС
С1у
175
ТСС АТС АСС АСТ САС ТАС ТТС АСТ ССС ТТС СТС АТС ССТ ССТ ССТ
Зег Не Зег Зег СХп Туг Ьеи Зег АХа Ьеи Ьеи Мес АХа А1а Рго
1В0 185 190
575
ТТС Ьеи
ССТ СТТ ССС САТ СТС САС АТТ САА АТС АТТ САТ ААА ТТА АТС ТСС
АХа Ьеи СХу Азр УаХ СХи Не С1и ХХе Не Азр Ьуз Ьеи 11е Зег
195 200 205
623
АТТ
11е
ССС ТАС СТС САА АТС АСА ТТС АСА ТТС АТС САС ССТ ТТТ ССТ СТС Рго Тут Уа1 С1и МеС ТНг Ьеи Агд Ьеи Мес С1и Агд РЬе С1у Уа1 210 215 220
671
ААА Ьуз
ССА САС САТ ТСТ САТ АСС ТСС САС АСА ТТС ТАС АТТ ААС ССА ССТ
А1а С1и Н1з Зег Азр Зег Тгр Азр Агд РЬе Туг 11е Ьуз С1у С1у 225 230 235
719
ААА ТАС ААС ТСС ССТ ААА ААТ ССС ТАТ СТТ САА ССТ САТ ССС ТСА Ьуз Туг Ьуз Зег Рго Ьуз Азп А1а Туг Уа1 СХи СХу Азр АХа Зег 240 245 250
ЗЕ<Э Ю ΝΟ: 5 (зихсе)
САА С1п
767
АСС ССА
Зег АХа
255
АСС ТАТ Зег Туг
ТТС ТТС ССТ ССТ ССТ ССА АТТ АСТ ССА ССС АСТ СТС
РЬе Ьеи А1а (31у А1а А1а 11е ТНг <31у О1у ТЫ Уа1
260 265 270
315
АСТ СТС
ТНг Уа1
270
САА ССТ
С1и С1у
ТСТ ССС АСС АСС АСТ ТТС САС ССТ САТ СТС ААС ТТТ
Суз С1у ТНг ТНг Зег Ьеи СХп СХу Азр Уа1 Ьуз РЬе
275 280 285
863
ССТ САС АХа СХи
СТА СТО УаХ Ьеи
290
САС АТС АТС ССА ССС ААС СТТ АСА ТСС АСС САС АСТ
С1и Мес МеС С1у АХа Ьуз УаХ ТНг Тгр ТНг СХи ТНг
295 300
911
А1а 1 С1у АХа С1и С1и 5 Не Уа1 Ьеи С1п Рго 10 Не Ьуз С1и Не Зег 15 С1у
ТНг νβΐ Ьуз Ьеи Рго СХу Зег Ьуз Зег Ьеи Зег А5П Агд Не Ьеи Ьеи
20 25 30
Ьеи АХа А1а Ьеи Зег С1и С1у ТНг ТНг Уа1 Уа1 Азр Азп Ьеи Ьеи Азп
35 40 45
Зег <31и Азр ν<ι ΗΪ3 Туг МеС Ьеи С1у А1а Ьеи Агд ТНг Ьеи СХу Ьеи
50 55 60
Зег Уа1 <31и АХа Азр Ьуз А1а А1а Ьуз Агд А1а Уа1 Уа1 УаХ С1у Суз
65 70 75 80
С1у С1у Ьуз РЬе Рго УаХ СХи Азр А1а Ьуз С1и С1и Уа1 С1п Ьеи РНе
85 90 95
Ьеи С1у Азп А1а С1у Не АХа Мес Агд Зег Ьеи ТНг АХа А1а УаХ ТНг
СХи ΗΪ5 225 Зег Азр Зег Тгр 230 Азр Агд РЬе Туг 11е Ьуз С1у С1у С1п Ьуз
235 240
Туг Ьуз Зег Рго Ьуз Азп А1а Туг Уа1 СХи СХу Азр А1а Зег Зег А1а
245 250 255
Зег Туг РЬе Ьеи АХа С1У А1а АХа Не ТЫ СХу СХу ТЫ УаХ ТЫ Уа1
260 265 270
СХи С1у Суз СХу ТНг ТНг Зег Ьеи СХп СХу Азр УаХ Ьуз РЬе АХа С1и
275 280 285
УаХ Ьеи СХи МеС мес <31у АХа Ьуз УаХ ТНг Тгр ТНг СХи ТНг Зег Уа1
290 295 300
ТЬг УаХ ТЫ СХу РГО Рго Агд СХи Рго РЬе С1у Агд Ьуз Ηίε Ьеи Ьуз
305 310 3X5 320
АХа Не Азр Уа1 Азп МеС Азп Ьуз МеЕ Рго Азр Уа1 АХа МеС ТЫ Ьеи
325 330 335
АХа Уа1 УаХ АХа Ьеи РЬе АХа Азр СХу Рго ТНг АХа 11е Агд Авр Уа1
340 345 350
АСС СТА
Зег Уа1
АСТ СТТ
ТНг Уа1
305
АСТ ССС ССА ССС ССС САС ССА ТТТ ССС АСС ААА САС
ТЬг С1у Рго Рго Агд СХи Рго РЬе СХу Агд Ьуз Ηί3 310 315
959
СТС ААС
Ьеи Ьуз
320
ССС АТТ А1а Не
САТ СТС ААС АТС ААС ААС АТС ССТ САТ СТС ССС АТС
Азр \7а1 Азп Мес Азп Ьуз МеС Рго Азр \7аХ А1а МеС 325 330
1007
АСТ СТТ ТНг Ьеи 335
ССТ СТС АХа Уа1
СТТ ССС СТС ТТТ ССС САТ ССС ССС АСА ССС АТС АСА
Уа1 А1а Ьеи РНе А1а Азр С1у Рго ТНг А1а 11е Агд
340 345 350
1055
САС СТС
Азр Уа1
ССТ ТСС А1а Зег
ТСС АСА СТА ААС САС АСС САС АСС АТС СТТ ССС АТС
Тгр Агд УаХ Ьуз СХи ТНг СХи Агд Мес УаХ АХа 1Хе
355 360 365
1103
ССС АСС Агд ТНг
САС СТА
СХи Ьеи
370
АСС ААС СТО ССА ССА ТСТ СТТ САС САА ССС ССС САС
ТНг Ьуз Ьеи СХу АХа Зег УаХ СХи СХи С1у Рго Азр
375 380
1151
ТАС ТСС Туг Суз
АТС АТС
11е Не
385
АСС ССС ССС САС ААС СТС ААС СТС АСС ССС АТС САС ТНг Рго Рго С1и Ьуз Ьеи Азп УаХ ТНг А1а 11е Азр 390 395
1199
А1а Зег Тго 355 Агд Уа1 Ьуз С1и ТЫ 360 С1и Агд Мес Уа1 А1а 365 Не Агд ТНг
С1и Ьеи ТНг Ьуз Ьеи С1у А1а Зег Уа1 СХи С1и С1у Рго Азр Туг Суз
370 375 380
Не Не ТНг Рго Рго СХи Ьуз Ьеи Азп νβΐ ТНг А1а Не Азр ТНг Туг
385 390 395 400
Азр Азр Н13 Агд МеС АХа Мес АХа РНе Зег Ьеи А1а А1а Суз А1а С1и
405 410 415
νβΐ Рго Уа1 ТНг Не Агд Азр Рго С1у Суз ТНг Агд Ьуз ТЫ РНе Рго
420 425 430
Аэр Туг РНе Азр Уа1 Ьеи Зег ТНг РНе УаХ Ьуз АЗП
435 440
АСС ТАС
ТНг Туг
400
САС САС Азр Азр
САС АСС АТС ССС АТС ССС ТТС ТСС СТТ ССС ССС ТСТ
Н15 Агд МеС А1а МеС А1а РЬе Зег Ьеи А1а АХа Суз 405 410
1247
ССС САС АХа СХи
415
СТС ССС Уа1 Рго
СТС АСС АТС ССС САС ССТ ССС ТСС АСС ССС ААС АСС
Уа1 ТНг Не Агд Азр Рго СХу Суз ТНг Агд Ьуз ТНг
420 425 430
1295
ТТС ССС РЬе Рго
САС ТАС Азр Туг
ТТС САТ СТС СТС АСС АСТ ТТС СТС ААС ААТ
РЬе Азр Уа1 Ьеи Зег ТЬг РЬе УаХ Ьуз Азп
435 440
1337
ТАА
1340

Claims (33)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Химерная конструкция, включающая, по меньшей мере, два элементарных химерных гена, каждый из которых содержит элементы регулирования, необходимые для его транскрипции в растениях, и кодирующую последовательность, которая кодирует фермент, сообщающий растениям устойчивость к одному гербициду, отличающаяся тем, что одна из кодирующих последовательностей кодирует гидроксифенил пируват диоксигеназу (ΗΡΡΌ).
  2. 2. Химерная конструкция по п.1, отличающаяся тем, что она также включает третий элементарный химерный ген, содержащий последовательность, кодирующую фермент, сообщающий растениям устойчивость к гербициду.
  3. 3. Химерная конструкция по любому из пп.1 или 2, отличающаяся тем, что вторая кодирующая последовательность происходит из гена нитрилазы К1сЬ51с11а 5р.. сообщающей растениям устойчивость к одному гербициду из группы дигалогеногидроксибензонитрилов.
  4. 4. Химерная конструкция по п.3, отличающаяся тем, что гербицидом является бромоксинил.
  5. 5. Химерная конструкция по п.3, отличающаяся тем, что гербицидом является иоксинил.
  6. 6. Химерная конструкция по любому из пп.1 или 2, отличающаяся тем, что вторая кодирующая последовательность кодирует фермент, придающий растениям устойчивость к глифозату.
  7. 7. Химерная конструкция по любому из пп.1 или 2, отличающаяся тем, что вторая кодирующая последовательность кодирует фермент 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (ΕΡ8Ρ8), сообщающий растениям устойчивость к гербициду - ингибитору ΕΡ8Ρ8.
  8. 8. Химерная конструкция по п.7, отличающаяся тем, что вторая кодирующая последовательность кодирует фермент ΕΡ8Ρ8, сообщающий растениям устойчивость к глифозату.
  9. 9. Химерная конструкция по п.6, отличающаяся тем, что вторая кодирующая последовательность кодирует глифозатоксиредуктазу, фермент детоксификации глифозата.
  10. 10. Химерная конструкция по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что последовательность, кодирующая ΗΡΡΌ, происходит из Ρ50ΐ.ι6οιηοη;·ΐ5 5р.
  11. 11. Химерная конструкция по п.10, отличающаяся тем, что последовательность, кодирующая ΗΡΡΌ, происходит из Ρ5еиάοтοηа5 Диоге5сеп5.
  12. 12. Химерная конструкция по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что последовательность, кодирующая ΗΡΡΌ, имеет растительное происхождение.
  13. 13. Химерная конструкция по п.12, отличающаяся тем, что последовательность, кодирующая ΗΡΡΌ, происходит из ЛгаЫйор515 111айапа.
  14. 14. Химерная конструкция по п.12, отличающаяся тем, что последовательность, кодирующая ΗΡΡΌ, происходит из Оаиси5 саго!а.
  15. 15. Химерная конструкция по любому из пп.1-14, отличающаяся тем, что она встроена в подходящий экспрессионный вектор.
  16. 16. Химерная конструкция по п.15, отличающаяся тем, что вектор представлен плазмидой.
  17. 17. Линия растительных клеток, содержащих, по меньшей мере, одну химерную конструкцию по любому из пп.1-14.
  18. 18. Растение, регенерированное из трансформированной клетки, отличающееся тем, что оно регенерировано из клетки, принадлежащей к линии клеток по п.17.
  19. 19. Способ получения трансформированных растений, устойчивых, по меньшей мере, к двум гербицидам, отличающийся тем, что в растительную клетку вводят химерную конструкцию по любому из пп.1-14 и трансформированные клетки подвергают регенерации.
  20. 20. Способ обработки растений по п.18 гербицидами.
  21. 21. Способ по п.20, отличающийся тем, что используют, по меньшей мере, два гербицида.
  22. 22. Способ по п.20, отличающийся тем, что используют, по меньшей мере, три гербицида.
  23. 23. Способ по любому из пп.20-22, отличающийся тем, что один из гербицидов является ингибитором ΗΡΡΌ.
  24. 24. Способ по любому из пп.21-23, отличающийся тем, что гербициды применяют одновременно.
  25. 25. Способ по п.24, отличающийся тем, что гербициды применяют в виде одной композиции, готовой к использованию.
  26. 26. Способ по п.25, отличающийся тем, что гербициды применяют в виде смеси, приготовленной перед самым использованием.
  27. 27. Способ по любому из пп.20-23, отличающийся тем, что гербициды применяют последовательно.
  28. 28. Способ по любому из пп.20-27, отличающийся тем, что гербицидом - ингибитором ΗΡΡΌ является изоксафлутол.
  29. 29. Способ по любому из пп.20-27, отличающийся тем, что гербицидом - ингибитором ΗΡΡΌ является сулкотрион.
  30. 30. Способ по любому из пп.20-29, отличающийся тем, что второй гербицид принадлежит к группе дигидрогеногидроксибензонитрилов.
  31. 31. Способ по п.30, отличающийся тем, что гербицид выбирают из группы, включающей бромоксинил и иоксинил.
  32. 32. Способ по одному из пп.20-31, отличающийся тем, что второй гербицид является ингибитором фермента ΕΡ8Ρ8.
  33. 33. Способ по п.32, отличающийся тем, что ингибитором фермента ΕΡ8Ρ8 является глифозат или сульфозат.
EA199900116A 1996-07-16 1997-07-10 Химерная конструкция, включающая, по крайней мере, два гена устойчивости растений к гербицидам, линия растительных клеток, содержащая указанную конструкцию, растение, устойчивое, по крайней мере, к двум гербицидам, и способ обработки растений гербицидами EA002980B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9609137A FR2751347B1 (fr) 1996-07-16 1996-07-16 Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides
PCT/FR1997/001256 WO1998002562A2 (fr) 1996-07-16 1997-07-10 Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA199900116A1 EA199900116A1 (ru) 1999-08-26
EA002980B1 true EA002980B1 (ru) 2002-12-26

Family

ID=9494283

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA199900116A EA002980B1 (ru) 1996-07-16 1997-07-10 Химерная конструкция, включающая, по крайней мере, два гена устойчивости растений к гербицидам, линия растительных клеток, содержащая указанную конструкцию, растение, устойчивое, по крайней мере, к двум гербицидам, и способ обработки растений гербицидами
EA200001219A EA003140B1 (ru) 1996-07-16 1997-07-10 Способ получения растения, устойчивого к нескольким гербицидам, растение, полученное указанным способом, и способ обработки растений гербицидами

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200001219A EA003140B1 (ru) 1996-07-16 1997-07-10 Способ получения растения, устойчивого к нескольким гербицидам, растение, полученное указанным способом, и способ обработки растений гербицидами

Country Status (20)

Country Link
US (5) US7250561B1 (ru)
EP (1) EP0937154A2 (ru)
JP (1) JP2000517166A (ru)
KR (1) KR20000023830A (ru)
CN (1) CN1154741C (ru)
AR (1) AR007884A1 (ru)
AU (1) AU734878B2 (ru)
BR (2) BR9710340B1 (ru)
CA (1) CA2261094C (ru)
CO (1) CO4770898A1 (ru)
CU (1) CU22809A3 (ru)
CZ (1) CZ11399A3 (ru)
EA (2) EA002980B1 (ru)
FR (1) FR2751347B1 (ru)
HU (1) HU223788B1 (ru)
NZ (1) NZ334188A (ru)
PL (1) PL190393B1 (ru)
TR (1) TR199900117T2 (ru)
WO (1) WO1998002562A2 (ru)
ZA (1) ZA976296B (ru)

Families Citing this family (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2736926B1 (fr) * 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
CA2269666A1 (en) * 1996-11-07 1998-05-14 Zeneca Limited Herbicide resistant plants
US7193128B2 (en) 1997-06-03 2007-03-20 Chromatin, Inc. Methods for generating or increasing revenues from crops
US6900012B1 (en) 1997-06-03 2005-05-31 The University Of Chicago Plant artificial chromosome compositions and methods
US7227057B2 (en) 1997-06-03 2007-06-05 Chromatin, Inc. Plant centromere compositions
US7119250B2 (en) 1997-06-03 2006-10-10 The University Of Chicago Plant centromere compositions
US7235716B2 (en) 1997-06-03 2007-06-26 Chromatin, Inc. Plant centromere compositions
AU8583798A (en) * 1997-07-23 1999-02-16 Centro De Investigacion Y De Estudios Avanzados Del I.P.N. Improved plastid transformation of higher plants and production of trans genic plants with herbicide resistance
US7161064B2 (en) 1997-08-12 2007-01-09 North Carolina State University Method for producing stably transformed duckweed using microprojectile bombardment
US6069115A (en) * 1997-11-12 2000-05-30 Rhone-Poulenc Agrochimie Method of controlling weeds in transgenic crops
FR2771104B1 (fr) * 1997-11-17 2000-12-08 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere ayant un promoteur lumiere dependant conferant la tolerance aux inhibiteurs del'hppd
JP4788011B2 (ja) * 1998-04-30 2011-10-05 住友化学株式会社 雑草防除剤耐性の付与方法
AU771958B2 (en) 1998-08-04 2004-04-08 Cargill Incorporated Plant fatty acid desaturase promoters
DE19836673A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Zuckerrübenkulturen
FR2785148B1 (fr) * 1998-11-02 2000-12-15 Rhone Poulenc Agrochimie Nouvelles compositions herbicide a base de glyphosate et d'isoxazoles
JP4570706B2 (ja) * 1999-03-09 2010-10-27 バイエルクロップサイエンス株式会社 水田雑草の防除方法
US7989202B1 (en) 1999-03-18 2011-08-02 The University Of Chicago Plant centromere compositions
JP4821038B2 (ja) * 1999-10-29 2011-11-24 住友化学株式会社 除草剤耐性植物
AU2000274256A1 (en) * 2000-09-08 2002-03-22 Bayer Cropscience S.A. Hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase fused with a signal peptide, DNA sequence and use for obtaining plants containing herbicide-tolerant plants
CA2434059C (en) 2001-02-22 2011-05-24 Rhobio Constitutive promoter from arabidopsis
CA2808328C (en) 2001-08-09 2019-08-06 Northwest Plant Breeding Company Wheat plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
WO2005083096A1 (en) 2004-02-23 2005-09-09 Chromatin, Inc. Plants modified with mini-chromosomes
MXPA06011412A (es) 2004-03-30 2007-01-23 Monsanto Technology Llc Metodos para controlar patogenos en plantas utilizando n-fosfonometilglicina.
ES2408244T5 (es) * 2004-04-30 2017-08-08 Dow Agrosciences Llc Nuevo gen de resistencia a los herbicidas
CA2621874C (en) 2005-09-08 2014-12-16 Chromatin Inc. Plants modified with mini-chromosomes
BRPI0618025B1 (pt) * 2005-10-28 2016-12-27 Dow Agrosciences Llc método para controlar ervas daninhas em uma área, polinucleotídeo isolado, célula de planta e planta resistente a herbicida
SI2465341T1 (sl) 2006-01-12 2015-04-30 Cibus Europe B.V. Mutantni epsps
WO2008063755A2 (en) * 2006-10-03 2008-05-29 Monsanto Technology Llc Methods for hybrid corn seed production and compositions produced therefrom
HUE031454T2 (en) * 2006-12-07 2017-07-28 Dow Agrosciences Llc New selectable marker genes
US8614089B2 (en) 2007-03-15 2013-12-24 Chromatin, Inc. Centromere sequences and minichromosomes
AR066787A1 (es) * 2007-05-30 2009-09-09 Syngenta Participations Ag Genes del citocromo p450 que confieren resistencia a los herbicidas
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
CL2009001048A1 (es) * 2008-05-02 2010-10-01 Pioneer Hi Bred Int Metodo para producir lineas endogamicas de maiz con rasgos de alta pureza, y procedimiento para generar semillas hibridas de maiz.
EP2299804A4 (en) * 2008-06-11 2011-05-18 Dow Agrosciences Llc RECOMBINANT PRODUCTS FOR EXPRESSION OF HERBICIDE TOLERANT GENES, ASSOCIATED PLANTS, AND COMBINATIONS OF ASSOCIATED CHARACTERS
GB0816880D0 (en) * 2008-09-15 2008-10-22 Syngenta Ltd Improvements in or relating to organic compounds
WO2010135324A1 (en) * 2009-05-18 2010-11-25 Monsanto Technology Llc Use of glyphosate for disease suppression and yield enhancement in soybean
WO2011011693A1 (en) 2009-07-23 2011-01-27 Chromatin, Inc. Sorghum centromere sequences and minichromosomes
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
AU2010321584C1 (en) * 2009-11-23 2016-12-22 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Elite event EE-GM3 and methods and kits for identifying such event in biological samples
EP2503873B1 (en) 2009-11-23 2017-02-08 Bayer CropScience NV Herbicide tolerant soybean plants and methods for identifying same
EP2504442B1 (en) 2009-11-24 2014-07-16 Katholieke Universiteit Leuven, K.U. Leuven R&D Banana promoters
JP5871814B2 (ja) * 2009-12-23 2016-03-01 バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲーエムベーハーＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｇｍｂｈ Ｈｐｐｄ阻害型除草剤に耐性を有する植物
AR079972A1 (es) * 2009-12-23 2012-03-07 Bayer Cropscience Ag Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd
CA2785208A1 (en) * 2009-12-23 2011-06-30 Bayer Intellectual Property Gmbh Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides
CN102762724A (zh) * 2009-12-23 2012-10-31 拜尔知识产权有限公司 对hppd抑制剂型除草剂耐受的植物
MX2012007358A (es) * 2009-12-23 2012-11-06 Bayer Ip Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd.
JP2010070578A (ja) * 2010-01-05 2010-04-02 Rhone Poulenc Yuka Agro Kk 水田雑草の防除方法
JP5925701B2 (ja) 2010-03-08 2016-05-25 モンサント テクノロジー エルエルシー 植物における遺伝子調節のためのポリヌクレオチド分子
US9139842B2 (en) 2010-08-13 2015-09-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for targeting sequences of interest to the chloroplast
EP2625276B1 (en) * 2010-10-08 2018-03-28 Fraunhofer USA Inc. Closterovirus-based nucleic acid molecules and uses thereof
CN103562392B (zh) * 2010-12-03 2016-07-20 Ms技术有限责任公司 植物细胞中草甘膦抗性编码核酸分子的优化表达
CN105861524B (zh) * 2010-12-28 2019-07-02 日本史迪士生物科学株式会社 对4-hppd抑制剂的抵抗性或敏感性提高了的植物
BR112014005975A8 (pt) 2011-09-13 2017-09-12 Monsanto Technology Llc Método de controle de planta, método de redução de expressão de um gene pds em uma planta, cassete de expressão microbiana, método de fazer um polinucleotídeo, método de identificação de polinucleotídeos, e composições para controle de erva daninha
CN109997852A (zh) 2011-09-13 2019-07-12 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
UA116091C2 (uk) 2011-09-13 2018-02-12 Монсанто Текнолоджи Ллс Способи та композиції для боротьби з бур'янами
UA116088C2 (uk) 2011-09-13 2018-02-12 Монсанто Текнолоджи Ллс Спосіб та композиція для боротьби з бур'янами (варіанти)
EP3434779A1 (en) 2011-09-13 2019-01-30 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
CN103957697B (zh) 2011-09-13 2017-10-24 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
MX343072B (es) 2011-09-13 2016-10-21 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para controlar malezas.
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
WO2013039990A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
WO2013109754A1 (en) 2012-01-17 2013-07-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transcription factors, promoters and uses thereof
CA2863201A1 (en) * 2012-02-01 2013-08-08 Dow Agrosciences Llc Glyphosate resistant plants and associated methods
WO2013138309A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
CA2867385A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
WO2013175480A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 A.B. Seeds Ltd. Compositions and methods for silencing gene expression
WO2013188291A2 (en) 2012-06-15 2013-12-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods and compositions involving als variants with native substrate preference
US10041087B2 (en) 2012-06-19 2018-08-07 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
AR091489A1 (es) 2012-06-19 2015-02-11 Basf Se Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo)
CA2884895A1 (en) * 2012-09-14 2014-03-20 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
MX364070B (es) 2012-10-18 2019-04-10 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para el control de plagas vegetales.
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
EP2941488B1 (en) 2013-01-01 2023-03-22 Monsanto Technology LLC Methods of introducing dsrna to plant seeds for modulating gene expression
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
US9789511B2 (en) * 2013-03-12 2017-10-17 Nordson Corporation Jetting devices
EP2971185A4 (en) 2013-03-13 2017-03-08 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
CA2905104A1 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Monsanto Technology Llc Control of lolium species by topical application of herbicidal composition comprising dsrna
CN105143248A (zh) 2013-03-14 2015-12-09 先锋国际良种公司 玉蜀黍胁迫相关转录因子18及其用途
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CA2903555A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods of use of acc oxidase polynucleotides and polypeptides
PL3030663T3 (pl) 2013-07-19 2020-04-30 Monsanto Technology Llc Kompozycje i sposoby kontroli leptinotarsa
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
AU2014341879B2 (en) 2013-11-04 2020-07-23 Beeologics, Inc. Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
MX368629B (es) 2014-01-15 2019-10-08 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para el control de malezas utilizando polinucleotidos de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (epsps).
RS62608B1 (sr) 2014-01-31 2021-12-31 Agbiome Inc Modifikovano sredstvo za biološku kontrolu i njegove primene
EP3125676A4 (en) 2014-04-01 2018-02-14 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for controlling insect pests
EP3158067B1 (en) 2014-06-23 2020-08-12 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference
US11807857B2 (en) 2014-06-25 2023-11-07 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
US10378012B2 (en) 2014-07-29 2019-08-13 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
CA2974101A1 (en) 2015-01-22 2016-07-28 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling leptinotarsa
AU2016270870A1 (en) 2015-06-02 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
WO2016196782A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
EP3475411A1 (en) 2016-06-24 2019-05-01 AgBiome, Inc. Methods and compositions for spray drying gram-negative bacteria
WO2019023226A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 AgBiome, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING PLANT HEALTH AND CONTROL OF PLANT DISEASES AND PLANT PESTS
WO2019074813A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 AgBiome, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING PLANT HEALTH AND CONTROL OF PLANT DISEASES AND PLANT PESTS
CA3026528A1 (en) * 2017-12-15 2019-06-15 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for ppo herbicide tolerance
WO2019241370A1 (en) 2018-06-12 2019-12-19 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
WO2020006555A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 AgBiome, Inc. Compositions comprising bacteria and methods for controlling plant pests and improving plant health
CN113163771B (zh) 2018-10-10 2023-01-31 农业生物群落股份有限公司 用于防治植物有害生物和改善植物健康的组合物和方法
CN113631040B (zh) 2018-10-30 2023-07-07 农业生物群落股份有限公司 控制植物害虫和改善植物健康的组合物和方法
WO2020232103A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 AgBiome, Inc. Dried biological control agents and their uses
AU2020287168A1 (en) 2019-06-07 2022-01-20 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
EP4326070A1 (en) 2021-04-19 2024-02-28 Agbiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
WO2022245786A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
WO2023211979A2 (en) 2022-04-26 2023-11-02 AgBiome, Inc. Use of bacterial strains to solubilize phosphorus for agriculture
WO2024026305A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 AgBiome, Inc. Compositions and methods based on pseudomonas chlororaphis for improving plant health and controlling plant disease

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
DK175922B1 (da) 1985-08-07 2005-07-04 Monsanto Technology Llc Glyphosat-resistente planter
FR2591069B1 (fr) * 1985-12-09 1988-03-18 Produits Ind Cie Fse Produits herbicides a base d'esters de bromoxynil et/ou d'ioxynil
US7705215B1 (en) * 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
DE69033764T2 (de) * 1989-08-10 2002-05-23 Aventis Cropscience Nv Pflanzen mit modifizierten Blüten
EP0536330B1 (en) * 1990-06-25 2002-02-27 Monsanto Technology LLC Glyphosate tolerant plants
AU655945B2 (en) * 1990-08-31 1995-01-19 Monsanto Technology Llc Glyphosate tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
FR2673642B1 (fr) 1991-03-05 1994-08-12 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere comprenant un promoteur capable de conferer a une plante une tolerance accrue au glyphosate.
FR2673643B1 (fr) 1991-03-05 1993-05-21 Rhone Poulenc Agrochimie Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide.
DE59209968D1 (de) * 1991-03-12 2002-10-31 Bayer Cropscience Gmbh Gegen Herbizide von Aryloxy-Phenoxy-Alkancarbonsäuretyp resistenter Mais
GB9218664D0 (en) * 1992-09-03 1992-10-21 Rhone Poulenc Agrochimie Herbicidal compositions
CA2146113A1 (en) * 1992-10-15 1994-10-15 Adrianus Johannes Van Tunen Genetic moderation of restoration or plant phenotypes
DE4305696A1 (de) 1993-02-25 1994-09-01 Hoechst Ag Nachweisverfahren zur Identifizierung von Inhibitoren
US5530187A (en) 1993-07-16 1996-06-25 The Salk Institute For Biological Studies Transgenic plants containing multiple disease resistance genes
US5491076A (en) * 1993-11-01 1996-02-13 The Texas A&M University System Expression of foreign genes using a replicating polyprotein producing virus vector
FR2712302B1 (fr) 1993-11-10 1996-01-05 Rhone Poulenc Agrochimie Eléments promoteurs de gènes chimères de tubuline alpha.
GB9515941D0 (en) * 1995-08-03 1995-10-04 Zeneca Ltd DNA constructs
FR2734842B1 (fr) 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
CN1238008A (zh) * 1996-07-25 1999-12-08 美国氰胺公司 Hppd基因和抑制剂
US6245968B1 (en) 1997-11-07 2001-06-12 Aventis Cropscience S.A. Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, DNA sequence and isolation of plants which contain such a gene and which are tolerant to herbicides
US6069115A (en) * 1997-11-12 2000-05-30 Rhone-Poulenc Agrochimie Method of controlling weeds in transgenic crops

Also Published As

Publication number Publication date
AU3625997A (en) 1998-02-09
US20120005769A1 (en) 2012-01-05
US7250561B1 (en) 2007-07-31
HU223788B1 (hu) 2005-01-28
AU734878B2 (en) 2001-06-21
EA003140B1 (ru) 2003-02-27
CA2261094A1 (fr) 1998-01-22
EA200001219A1 (ru) 2001-06-25
FR2751347A1 (fr) 1998-01-23
CA2261094C (fr) 2005-06-28
CZ11399A3 (cs) 1999-05-12
WO1998002562A2 (fr) 1998-01-22
BR9710340B1 (pt) 2009-12-01
HUP9903774A3 (en) 2000-04-28
EA199900116A1 (ru) 1999-08-26
BRPI9710340B8 (pt) 2018-02-27
FR2751347B1 (fr) 2001-12-07
NZ334188A (en) 2000-09-29
PL190393B1 (pl) 2005-12-30
HUP9903774A2 (hu) 2000-03-28
PL331165A1 (en) 1999-06-21
US20080028481A1 (en) 2008-01-31
CN1154741C (zh) 2004-06-23
WO1998002562A3 (fr) 1998-04-30
US20130157854A1 (en) 2013-06-20
TR199900117T2 (xx) 1999-03-22
JP2000517166A (ja) 2000-12-26
BR9710340A (pt) 1999-08-17
CN1230996A (zh) 1999-10-06
CO4770898A1 (es) 1999-04-30
CU22809A3 (es) 2002-12-19
AR007884A1 (es) 1999-11-24
US20100029481A1 (en) 2010-02-04
KR20000023830A (ko) 2000-04-25
ZA976296B (en) 1998-08-19
EP0937154A2 (fr) 1999-08-25
US7935869B2 (en) 2011-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA002980B1 (ru) Химерная конструкция, включающая, по крайней мере, два гена устойчивости растений к гербицидам, линия растительных клеток, содержащая указанную конструкцию, растение, устойчивое, по крайней мере, к двум гербицидам, и способ обработки растений гербицидами
US20220267788A1 (en) Creation of herbicide resistant gene and use thereof
RU2099422C1 (ru) Способ получения устойчивых к сульфонилмочевинным гербицидам двудольных растений
EP3394272B1 (en) Compositions and methods for efficient targeting of transgenes
WO2021051265A1 (zh) 突变的羟基苯丙酮酸双加氧酶多肽、其编码基因及用途
CN110621154A (zh) 用于植物的除草剂耐受性的方法和组合物
US20200362360A1 (en) Modified plants with enhanced traits
Ortega et al. An intragenic approach to confer glyphosate resistance in chile (Capsicum annuum) by introducing an in vitro mutagenized chile EPSPS gene encoding for a glyphosate resistant EPSPS protein
BRPI0717904B1 (pt) &#34;método para controlar as ervas daninhas, método para produzir uma linhagem vegetal de híbrido de sorgo e método para identificar linhagens vegetais de sorgo&#34;.
BR112020017500A2 (pt) Modulação do teor de aminoácidos em uma planta
WO2020117837A1 (en) Methods and compositions for improving silage
US11946061B2 (en) Methods and compositions for herbicide tolerance in plants
US20230416769A1 (en) Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
WO2022237541A1 (zh) 原卟啉原氧化酶的用途
WO2023225475A2 (en) Methods and compositions for generating dominant brachytic alleles using genome editing
JP2024516323A (ja) プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用
DE60028751T2 (de) Herbizidresistente pflanzen
Arunraj et al. Transgenics in agriculture
CN114174518A (zh) 非生物胁迫耐受性植物及方法
Babu Transgenics in Agriculture

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU