HU223788B1 - Több herbicidtolerancia-gént tartalmazó kiméragének, több herbiciddel szemben toleráns növényi sejtek és növények - Google Patents

Több herbicidtolerancia-gént tartalmazó kiméragének, több herbiciddel szemben toleráns növényi sejtek és növények Download PDF

Info

Publication number
HU223788B1
HU223788B1 HU9903774A HUP9903774A HU223788B1 HU 223788 B1 HU223788 B1 HU 223788B1 HU 9903774 A HU9903774 A HU 9903774A HU P9903774 A HUP9903774 A HU P9903774A HU 223788 B1 HU223788 B1 HU 223788B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plants
herbicide
sequence
gene
tolerance
Prior art date
Application number
HU9903774A
Other languages
English (en)
Inventor
Richard Derose
Ken Pallett
Bernard Pelissier
Alain Sailland
Original Assignee
Rhone-Poulenc Agrochimie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9494283&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU223788(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Rhone-Poulenc Agrochimie filed Critical Rhone-Poulenc Agrochimie
Publication of HUP9903774A2 publication Critical patent/HUP9903774A2/hu
Publication of HUP9903774A3 publication Critical patent/HUP9903774A3/hu
Publication of HU223788B1 publication Critical patent/HU223788B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/72—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms
    • A01N43/80—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms five-membered rings with one nitrogen atom and either one oxygen atom or one sulfur atom in positions 1,2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having alternatively specified atoms bound to the phosphorus atom and not covered by a single one of groups A01N57/10, A01N57/18, A01N57/26, A01N57/34
    • A01N57/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having alternatively specified atoms bound to the phosphorus atom and not covered by a single one of groups A01N57/10, A01N57/18, A01N57/26, A01N57/34 containing acyclic or cycloaliphatic radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8277—Phosphinotricin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)

Abstract

A találmány tárgyát több herbicidtolerancia-gént tartalmazókiméragének képezik, továbbá a kiméragéneket tartalmazó vektorok,valamint a kiméragéneket tartalmazó, több herbiciddel, közelebbről,HPPD-inhibitorokkal és EPSPS-inhibitorokkal szemben toleráns növényisejtek és növények. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások is,növények transzformálására, valamint több herbiciddel szemben toleránsnövények előállítására növényi transzgenezissel. A találmány tárgyátképezik még eljárások a találmány szerinti növények herbicidkezeléséreis. A találmány szerinti megoldás alkalmazásával előnyös agronómiaitulajdonságokkal bíró új haszonnövények állíthatók elő. ŕ

Description

A találmány tárgyát több herbicidtolerancia-gént tartalmazó kiméragének képezik, továbbá a kiméragéneket tartalmazó vektorok, valamint a kiméragéneket tartalmazó, több herbiciddel, közelebbről, HPPD-inhibitorokkal és EPSPS-inhibitorokkal szemben toleráns növényi sejtek és növények.
A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások is, növények transzformálására, valamint több herbiciddel szemben toleráns növények előállítására növényi transzgenezissel. A találmány tárgyát képezik még eljárások a találmány szerinti növények herbicidkezelésére is.
A találmány szerinti megoldás alkalmazásával előnyös agronómiái tulajdonságokkal bíró új haszonnövények állíthatók elő.
A leírás további részében az egyes herbicidek közismert nevét használjuk, közelebbről a herbicidekre azon a néven utalunk, amelyen azok a „The Pesticid Manual” kézikönyvben szerepelnek [10. kiadás, „British Crop Protection Council”].
Ismertek olyan növények, amelyeket transzformációval toleránsakká tettek bizonyos herbicidekkel szemben, például dihalo-hidroxi-benzonitrilekkel, közelebbről, bromoxinillel és ioxinillel szemben, oly módon, hogy azokba a fenti herbicideket lebontó nitrilázenzimet kódoló gént juttattak; vagy amelyeket toleránssá tettek EPSPS-gátló herbicidekkel, közelebbről, glifozát-, szulfozát- vagy foszametinherbicidekkel szemben; vagy szulfonilurea típusú acetolaktátszintetáz („acetolactatesynthase”, ALS)-gátló herbicidekkel szemben; vagy dihidropteorátszintetáz-gátlókkal, például aszulámmal szemben; vagy a glutaminszintetázgátlókkal, például glufozinát-herbiciddel szemben.
Számos herbicid ismert, például az izoxazolok, amelyeket közelebbről a 273 4840 és 273 4841 számú, 1996. december 6-án közzétett francia szabadalmi bejelentésekben ismertetnek, közelebbről, az izoxaflutol, amely kukoricára szelektív; a diketonitrilek, például a 0 496 630 és 0 496 631 számú európai közzétételi iratokban ismertetett herbicidek, még közelebbről, a 2-ciano-3-ciklopropil-1-(2-S02CH3-4-CF3-fenil)-propán-1,3-dion és 2-ciano-3-ciklopropil-1-(2S02CH3-4-2,3-CI2-fenil)-propán-1,3-dion; a 0 625 505 és 0 625 508 számú európai közzétételi iratokban leírt triketonok, közelebbről, szulkotrion vagy az USP 5 506 195 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett herbicidek; vagy a pirazolinátok. Továbbá, az utóbbi herbicidekkel szemben toleranciát létrehozó HPPD-t kódoló gént izolálták, és az említett gént tartalmazó transzgenikus növényekről kimutatták, hogy szignifikáns mértékű toleranciát mutatnak a fenti herbicidekkel szemben; ilyen génre vonatkoznak az 1996. december 6-án közzétett 273 4840, 273 4841 és 273 4842 számú francia szabadalmi bejelentések.
A mezőgazdasági gyakorlat azonban azt mutatja, hogy a gazdálkodók szívesebben alkalmaznak növények, elsősorban terménynövények kezelésére több herbicidből álló vegyszer-kombinációkat, az egyes herbicidek alkalmazásával elérhető gyomirtó hatás korlátáiból adódó különböző problémák miatt. Előnyös lehet továbbá, ha szelektálható markergént kombinálunk herbicidtolerancia-génnel. Szükség van tehát növényekre, közelebbről terménynövényekre, amelyek több herbiciddel, előnyösen legalább két vagy három herbiciddel szemben toleránsak.
Kimutattuk, hogy növényi sejtekben és növényben tolerancia hozható létre egyszerre több herbiciddel szemben.
Először, a találmány tárgyát képezik legalább két alapkiméragént tartalmazó kiméragének, amelyek mindegyike - a transzkripció irányába haladva - a következőket tartalmazza: a gén növényekben végbemenő transzkripciójához szükséges szabályozóelemeket, azaz, legalább egy szabályozó promoterszekvenciát; legalább egy heterológ kódolórészt, amely növényekben herbicidtoleranciát létrehozó enzimet kódoló szekvenciát tartalmaz; és legalább egy szabályozó terminátorszekvenciát vagy poliadenileződési szekvenciát.
Kódolószekvenciaként alkalmazhatunk bármely szekvenciát, amelyről ismert, hogy növényekben toleranciát hoz létre bizonyos inhibitorokkal szemben; alkalmazhatjuk például a következőket:
EPSPS kódolószekvenciát, glifozáttal, szulfozáttal vagy foszametinnel szembeni tolerancia létrehozására; közelebbről, mutációt hordozó vagy mutációt nem hordozó proteint kódoló szekvenciát, például a felsorolt szabadalmi leírásokban és bejelentésekben ismertetett szekvenciákat:
USP 4 535 060 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, EP 115 673 számú európai szabadalmi leírás, 4 796 061, 5 094 945, 4 971 908 5 145 783 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások, EP 293 358, EP 378 985 számú európai szabadalmi leírások, valamint WO 92 044 449 és WO 92 06201 számú nemzetközi közzétételi iratok. A leírás további részében ezt a típusú gént „EPSPSszekvenciának” vagy „EPSPS-génnek” nevezzük.
Megemlítendő továbbá a glifozát-oxidoreduktáz (lásd a WO 92/000 377 számú nemzetközi közzétételi iratot), amely a glifozát-detoxifikálódását eredményező enzim.
Klebsiella fajból származó nitrilázt kódoló gén, amely toleranciát hoz létre dihalo-benzonitrilekkel szemben, és amelyet a 4 810 648 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetnek; közelebbről, a Klebsiella ozaneae baktériumból származó ilyen gén, amelyet a leírásban „OXYgénnek” vagy „OXY-szekvenciának” nevezünk.
A HPPD-gént, amelynek leírását a fent idézett 273 4840, 273 4841 és 273 4842 számú, 1996. december 6-án közzétett francia szabadalmi bejelentésekben találjuk. Ez a HPPD bármely típusú HPPD lehet.
Még közelebbről, alkalmazhatunk bakteriális eredetű ilyen szekvenciát, közelebbről, például Pseudomonas nemzetségbe tartozó baktériumból származó; vagy növényi eredetű, például egyszikű vagy kétszikű növényekből, közelebbről, Arabidopsisbó\ vagy ernyős virágzatú növényekből, például répákból (Daucus carota) származó szekvenciákat. Alkalmazhatunk natív
HU 223 788 Β1 vagy vad típusú szekvenciát; vagy olyan szekvenciát, amelyben mutációt hoztunk létre, de amely alapvetően megtartotta HPPD-inhibitorokkal, például izoxazolok vagy triketonok vagy pirazolinátok családjába tartozó herbicidekkel szembeni herbicidtoleranciát létrehozó tulajdonságát.
Alkalmazhatók továbbá egyéb szekvenciák: glufozinát herbiciddel szemben toleranciát eredményező, foszfinotricin-acetil-transzferázt vagy glutaminszintetázt kódoló gének;
aszulámtoleranciát előidéző dihidropteorátszintetázt kódoló gént;
ALS-gént, amely szulfonilureákkal szembeni toleranciát eredményez;
protoporfirogén oxidázt („protox”) kódoló gént, amely difenil-éterek családjába tartozó herbicidekkel, például acil-flurofennel vagy oxi-flurofennel szemben; vagy oxadiazolokkal, például oxadiazonnal vagy oxadiargillal szemben; valamint ciklikus imidekkel, például kloroftalimmal; vagy fenil-pirrazolokkal, például TNPvel; vagy piridinekkel és a fenopilátokkal, valamint karbamátanalógokkal szemben hoz létre toleranciát (lásd WO 95/34 659 számú nemzetközi közzétételi irat).
Előnyösen, a kiméragének egyike HPPD-kódoló szekvenciát tartalmaz. Ebben az esetben, a további szekvencia (szekvenciák) bármely típusú szekvencia lehet (lehetnek); előnyösen az a fent felsorolt csoportok valamelyikébe tartozik. Egyéb szekvenciaként (szekvenciákként) előnyösen, a nitrilázgént tartalmazó csoportba tartozó, dihalo-hidroxi-benzonitrilekkel szemben toleranciát létrehozó szekvenciát és EPSPS-gént alkalmazunk.
A találmány szerinti kiméragének a herbicidtoleranciát kódoló géneken felül tartalmazhatnak egyéb sajátságokat kódoló géneket is, például rovarokkal szembeni rezisztenciát létrehozó gént, például Bacillus thurigensis típusú, a fedelesszárnyúak és pikkelyesszárnyúak családjának különböző képviselőivel szemben rezisztenciát eredményező gént; vagy nematodákkal (fonalférgekkel) szembeni rezisztenciát előidéző gént; gombás vagy mikrobiális eredetű betegségekkel szemben rezisztenciát létrehozó géneket; vagy előnyös mezőgazdasági jelleget eredményező géneket, például zsírsavak termelődésében szerepet játszó különböző deszaturázokat kódoló géneket. Ezzel kapcsolatban megemlítendő a WO 93/06712 számú nemzetközi közzétételi iratban leírt, delta-6-deszaturázt kódoló gén.
Szabályozó promoterszekvenciaként alkalmazhatjuk bármely, növényekben természetesen expresszálódó gén promoterszekvenciáját, közelebbről, bakteriális, vírus- vagy növényi eredetű promotereket, például a ribulóz-biszkarboxiláz (RuBisCO) kis alegységét kódoló gén promoterét; vagy az α-tubulin-gén promoterét (EP 0 652 286 számú európai közzétételi irat); vagy valamely növényvírus, például a karfiol-mozaikvírus (CaMV 19S vagy 35S) génjének promoterét; de alkalmazható bármely ismert alkalmas promoter. Előnyösen a kódolószekvencia magas szintű expresszálódását elősegítő szabályozó promoterszekvenciát alkalmazunk, például, legalább egy hisztonpromotert tartalmazó ilyen szekvenciát alkalmazunk. Ilyen promoter leírását lásd például a 0 507 698 számú európai közzétételi iratban.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a szabályozó promoterszekvenciával kombinálva, a promoter és a kódolószekvencia közt elhelyezve, alkalmazhatunk más szabályozószekvenciákat is, például transzkripciós aktivátor szekvenciákat, „enhanszereket”, mint például a dohánykarcoló vírus („tobacco etch vírus”, TEV) transzlációs aktivátorát, amelynek ismertetését a WO 87/07 644 számú nemzetközi leírásban találjuk; vagy tranzitpeptideket, amelyek lehetnek egyesével elhelyezett vagy kettős tranzitpeptidek, az utóbbiakat - adott esetben - közbeiktatott szekvencia választhatja el; ilyen szekvencia - a transzkripció irányába haladva - például a következőket tartalmazza: plasztidlokalizációs enzimet kódoló növényi gén tranzitpeptidjét kódoló szekvenciát; plasztidlokalizációs enzimet kódoló növényi gén érett formájának N-terminális részét kódoló szekvencia egy részét; majd egy további plasztidlokalizációs enzimet kódoló növényi génhez tartozó második tranzitpeptidet, amely plasztidlokalizációs enzimet kódoló növényi gén érett formájának Nterminális szekvenciarészét tartalmazza; ilyen szekvencia ismertetését találjuk például a 0 508 909 számú európai közzétételi iratban.
Szabályozó terminátorszekvenciaként vagy poliadenilezési szekvenciaként alkalmazhatunk bármely megfelelő bakteriális eredetű szekvenciát, például Agrobacterium tumefaciens nos-terminátorát; vagy alkalmazhatunk növényi eredetű szekvenciákat, például hisztonterminátort, például az EP 0 633 317 számú európai közzétételi iratban ismertetett ilyen szekvenciát.
A találmány tárgyát képezik továbbá egyszikű vagy kétszikű növényi sejtek, elsősorban terménynövénysejtek, amelyek legalább két herbiciddel szemben toleránsak, amely herbicidek legalább egyike HPPD-inhibitor. Ilyen sejtek legalább két kiméragént tartalmaznak, amelyek mindegyike herbicidtoleranciát kódoló szekvenciát tartalmaz, és amelyek egyike HPPD-kódoló szekvenciát tartalmaz. A két kiméragént hordozhatja ugyanazon vektor vagy két különböző vektor; vagy azokat bejuttathatjuk a sejtekbe fizikai vagy fizikokémiai eljárásokkal, például mikroinjektálással, elektroporációval vagy bombázással, a technika állása szerint ismert módszerekkel.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezik transzformált növények, amelyek legalább két herbiciddel szemben toleránsak, amely herbicidek legalább egyike HPPDinhibitor. Ilyen növényeket előállíthatunk legalább két növény keresztezésével, amelyek mindegyike herbicidtoleranciát kódoló gént tartalmaz; vagy azokat előállíthatjuk a találmány szerinti sejtek regenerációjával. A növények lehetnek egyszikűek vagy kétszikűek, elsősorban terménynövények, fő terménynövények, például de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - kétszikűek esetében: dohány, gyapot, repce, szója és répa; egyszikűek esetében: kukorica és szalmás szárú gabonanövények; vagy lehetnek bolgárkertészetben termesztett vetemény- vagy virágos növények.
HU 223 788 Β1
Ezenfelül, a találmány tárgyát képezik eljárások több herbiciddel szemben toleráns növények előállítására növényi transzgenezissel, amelyek szerint:
első lépésben, az alapgéneket külön-külön sejtekbe juttatjuk, amely gének azok növényekben történő transzkripciójához szükséges szabályozóelemeket, valamint növényekben herbicidtoleranciát eredményező enzimet kódoló szekvenciát tartalmaznak; majd a növényeket keresztezzük, miáltal többszörös toleranciával jellemzett növényeket kapunk.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezik eljárások több herbiciddel szemben toleráns növények előállítására növényi transzgenezissel, az alábbiak szerint:
első lépésben, növényi sejtekbe legalább két, herbiciddel szembeni toleranciát kódoló gént juttatunk, amely herbicidek legalább egyike HPPD-inhibitor;
második lépésben, a találmány szerinti transzformáit sejteket növényekké regeneráljuk.
A transzformációt bármely ismert alkalmas eljárással végezhetjük, amelyekre vonatkozó leírás bőségesen található a szakirodalomban, közelebbről, például a leírásban idézett szabadalmi leírásokban és bejelentésekben.
Például, sejteket vagy protoplasztokat bombázhatunk olyan részecskékkel, amelyekre DNSszekvenciákat vittünk fel. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, ezeket a DNS-eket hordozhatják ugyanazon részecskék, vagy azokat bejuttathatjuk különböző bombázások során. Más eljárás szerint, gének növényekbe történő bejuttatására Agrobacterium rhizogenes Ri- vagy Agrobacterium tumefaciens Tiplazmidba inszertált kiméragéneket alkalmazunk.
Alkalmazhatók más eljárások is, például mikroinjektálás vagy elektroporáció.
Szakember képes a növények természetének, közelebbről azok egyszikű vagy kétszikű jellegének megfelelő eljárás kiválasztására.
Azt találtuk, hogy a találmány szerinti transzformált növények jelentős mértékű toleranciát mutatnak hidroxi-fenil-piruvát-dioxigenáz-inhibitorokkal szemben, például több újabb herbiciddel szemben, úgymint izoxazolokkal szemben, amelyeket közelebbről a 273 4840 és 273 4841 számú, 1996. december 6-án közzétett francia szabadalmi bejelentésekben ismertetnek, és még közelebbről, 4-[4-CF3-2-(metil-szulfonil)benzoil]-5-ciklopropil-izoxazollal vagy „izoxaflutollal” szemben, amely kukoricára szelektív; diketonitrilekkel, például a 0 496 630 és 0 496 631 számú európai közzétételi iratokban ismertetett herbicidekkel, még közelebbről, a 2-ciano-3-ciklopropil-1-(2-SO2CH3-4-CF3fenil)-propán-1,3-dion és 2-ciano-3-ciklopropil-1-(2SO2CH3-4-2,3-CI2-fenil)-propán-1,3-dion herbicidekkel szemben; a 0 625 505 és 0 625 508 számú európai közzétételi iratokban leírt triketonokkal, közelebbről, szulkotrionnal szemben; és pirazinolátokkal szemben. A találmány szerinti növények ugyanakkor jelentős mértékű toleranciát mutatnak más herbicidekkel szemben is, például dihalo-benzonitrilátokkal, közelebbről, bromoxinillel és ioxinillel, glifozáttal és annak analógjával, glufozináttal szemben.
A fentieken felül, a találmány tárgyát képezik a transzformált sejtekből regenerált növények is. A regenerációt bármely alkalmas eljárással végezhetjük, az adott faj természetétől függően; eljárhatunk például a fenti szabadalmi bejelentésekben leírtak szerint. A találmány szerinti növényeket előállíthatjuk továbbá olyan szülői növények keresztezésével, amelyek a fenti, herbicidtoleranciát kódoló gének egyikét tartalmazzák.
Végül, a találmány tárgyát képezik eljárások gyomtalanításra növénytermesztő területen, közelebbről, terménynövény-termesztő területen, a fenti típusú herbicidek alkalmazásával, amelyek szerint a találmány szerinti transzformált növényeket a herbicidekkel kezeljük, vetés előtt, és/vagy a terménynövények kelése előtt és/vagy azok kelését követően. A leírásban herbicideken herbicidhatású szereket értünk, egymagukban vagy azok hatékonyságát módosító adalékokkal, például azok aktivitását fokozó anyagokkal (szinergistákkal) kombinálva, vagy azok aktivitását korlátozó anyagokkal („safeners”) kombinálva.
Természetesen, azok gyakorlatban történő alkalmazására, a fenti herbicideket a mezőgazdasági kémiában szokásosan alkalmazott adjuvánsok hozzáadásával kombináljuk, a technika állása szerint ismert módon.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a növényekben jelen lévő egyik herbicidtoleranciagént szelektálható markerként alkalmazzuk, in vitro vagy in vivő.
A találmány szerinti megoldás lényege még világosabbá válik az alábbi konkrét megvalósítási példák alapján.
1. példa
HPPD-gén izolálása P. fluorescens A-32baktériumból
A P. J. 874 jelzésű Pseudomonas törzs HPPDgénjének aminosavszekvenciája alapján [lásd Rüetschi U. és munkatársai: Eur. J. Biochem. 205, 459 (1992)] különböző oligonukleotidszekvenciákat terveztünk, a P. fluorescens Α-32-törzs [McKellar R. C. által izolált baktérium: J. Appl. Bacteriol. 53, 305 (1982)] HPPDgén kódolószekvenciája fragmentumainak PCReljárással történő amplifikálására. A fenti HPPD-gén egy amplifikált fragmentumát alkalmaztuk P. fluorescens Α-32-törzs alapján előállított részleges genomi génkönyvtár szűrésére, és ezáltal a fenti enzimet kódoló gén izolálására.
A) Genomi eredetű DNS előállítása P. fluorescens
Α-32-törzsből
A baktériumot 40 ml, M63 jelzésű minimál tápfolyadékban tenyésztettük [amelynek összetétele a következő volt: KH2PO4 13,6 g/l; (NH4)2SO4 2 g/l; MgSO4 0,2 g/l; FeSO4 0,005 g/l; (pH=7); valamint egyedüli szénforrásként 10 mmol/l tirozin] 28 °C-on, 48 órán át.
Mosást követően a sejteket 1 ml lízispufferben szuszpendáltuk [100 mmol/l Tris-HCI (pH=8,3); 1,4 mol/l NaCI; és 10 mmol/l EDTA], majd 10 percig, 65 °C-on inkubáltuk. Miután a lizátumot fenol/kloroform eleggyel (24/1), majd kloroformmal kezeltük, a nukleinsavakat az elegy térfogatával megegyező térfogatú
HU 223 788 Β1 izopropanollal precipitáltuk, végül 300 μΙ steril vízben szuszpendáltuk, és 10 pg/ml végkoncentrációjú ribonukleázzal kezeltük. Ezt követően a DNS-t ismételten fenol/kloroform eleggyel, majd kloroformmal kezeltük, és 1/10 térfogatnyi 3 mol/l nátrium-acetát (pH=5), valamint 2 térfogatnyi etanol hozzáadásával precipitáltuk. A DNS-t steril vízben szuszpendáltuk és analizáltuk.
B) Oligonukleotidok kiválasztása és azok szintézise
A P. fluorescens P. J. 874-törzs HPPD-aminosavszekvenciája alapján öt oligonukleotidot terveztünk, amelyek közül kettő a protein NH2-terminusa felől annak COOH-terminusa felé haladó kódolószekvenciának, három pedig az ellenkező irányú komplementerszekvenciának felelt meg (lásd 1. ábra). A választásnál a következő két szabályt tartottuk szem előtt:
a stabil oligonukleotid 3’-végének szekvenciáját úgy választottuk meg, hogy annak legalább két utolsó bázisa ne tartalmazzon bizonytalan bázist;
a lehető legkisebb mértékű degenerációt kelljen figyelembe venni.
A következő szekvenciájú oligonukleotidokat választottuk:
P1:5’-TA(C/T)GA(G/A)AA(C/T)CCIATGGG-3’;
P2: 5'-GA(G/A)ACIGGICCIATGGA-3’;
P3: 5'-AA(C/T)TGCATIA(G/A)(G/A)AA(C/T)TC(C/T)TC-3’; P4:5’-AAIGCIAC(G/A)TG(C/T)TG(T/G/A)ATICC-3’;
P5: 5’-GC(C/T)TT(A/G)AA(A/G)TTICC(C/T)TCICC-3’.
Az oligonukleotidokat „Cyclone Plus DNA Synthesizer” készülékkel szintetizáltuk (Millipore).
A fenti öt oligonukleotid alkalmazásával, az 1. azonosító számú szekvencia alapján, PCR-eljárással elméletileg a következő méretű amplifikációs fragmentumokat kell kapnunk:
a P1 és P3 láncindító oligonukleotidok kombinációjának alkalmazásával -> mintegy 690 bázispár (bp) fragmentumot;
a P1 és P4 láncindító oligonukleotidok kombinációjának alkalmazásával -> mintegy 720 bp fragmentumot;
a P1 és P5 láncindító oligonukleotidok kombinációjának alkalmazásával -> mintegy 1000 bp fragmentumot;
a P2 és P3 láncindító oligonukleotid kombinációjának alkalmazásával -> mintegy 390 bp fragmentumot;
a P2 és P4 láncindító oligonukleotidok kombinációjának alkalmazásával -> mintegy 420 bp fragmentumot; és a P2 és P5 láncindító oligonukleotidok kombinációjának alkalmazásával -> mintegy 700 bp fragmentumot.
C) A P. fluorescens Α-32-törzs HPPD-gén kódolórészletének amplifikációja
Az amplifikációt „Perkin-Elmer 9600” típusú PCRkészülékkel végeztük, „Perkin-Elmer” Taq-polimeráz és a megfelelő puffer alkalmazásával, standard körülmények mellett, azaz, 50 μΙ össztérfogatú reakcióelegyben, amely az egyes dNTP-ket 200 μηηοΙ/Ι koncentrációban, az egyes láncindító oligonukleotidokat
20-20 μπιοΙ/Ι koncentrációban tartalmazta, ezenfelül
2,5 egység Taq-polimerázt és 2,5 μg, P. fluorescens
Α-32-törzsből származó DNS-t tartalmazott.
Az alábbi amplifikációs program szerint jártunk el: 5 perc 95 °C-on; majd 35 ciklusban, 45 másodperc 95 °C-on; 45 másodperc 49 °C-on; 1 perc 72 °C-on; végül, 5 perc 72 °C-on.
A fenti körülmények mellett, valamennyi amplifikációs fragmentum mérete megfelelt a fent jelölt elméletileg várt méretnek, ami az amplifikációs reakció megfelelő specifitására utal.
A P1/P4, P1/P5 és P2/P4 láncindító oligonukleotidok kombinációjával kapott amplifikációs fragmentumokat pBSIISK(-)-plazmidba ligáltuk, miután a plazmidot EcoRV-enzimmel emésztettük, és ddTTP jelenlétében terminális transzferázzal kezeltük, Holton T. A. és Graham M. W. eljárása szerint [N. A. R. 19/5, 1156 (1991)].
Mindhárom típusú kiónt részlegesen szekvenáltuk; ez lehetővé teszi annak bizonyítását, hogy mindhárom esetben valóban P. fluorescens Α-32-törzs HPPDkódoló régiójának egy részét amplifikáltuk. A P1/P4 fragmentumot választottuk próbaként, P. fluorescens A-32törzs-eredetű részleges genomi génkönyvtár szűrésére, és a teljes HPPD-gén izolálására.
D) A gén izolálása
Southern-hibridizációval egy 7 kbp fragmentumot mutattunk ki, amely P. fluorescens Α-32-törzsből izolált DNS BamHl restrikciós enzimmel történő emésztését követően hibridizálódott a HPPD-P1/P4-próbával. Ezért 400 pg P. fluorescens Α-32-törzsből származó DNS-t emésztettünk BamHl restrikciós enzimmel, és a mintegy 7 kbp DNS-fragmentumokat agarózgélen tisztítottuk.
Ezeket a fragmentumokat előzőleg BamHIenzimmel emésztett, és alkalikus foszfatázzal történő kezeléssel defoszforilezett pBSII-SK(-)-plazmidba ligáltuk. Miután a plazmidokkal E. coli DH10b-sejteket transzformáltunk, a részleges genomi génkönyvtárat a HPPD-P1/P4 próbával szűrtük.
Pozitív kiónt izoláltunk, amelyet pRP-A-klónnak neveztünk. Annak egyszerűsített térképét a 2. ábrán mutatjuk be. Az ábrán jelöltük a HPPD-gén kódolórészének helyét. Ez 1077 nukleotidból áll, amely 358 aminosavat kódoló szekvenciának felel meg (lásd 1. azonosító számú szekvencia). A P. fluorescens Α-32-törzs HPPD aminosavszekvenciája jelentős mértékű homológiát mutat a P. fluorescens P. J. 874-törzs megfelelő génjének szekvenciájával; a két protein közt valójában 92% azonosság mutatható ki (lásd 3. ábra).
2. példa
HPPD-szekvenciát tartalmazó két kiméragén előállítása
Abból a célból, hogy növényekben HPPD-gátló herbicidekkel szembeni toleranciát hozzunk létre, két kiméragént állítottunk elő:
Az első kiméragént úgy állítottuk elő, hogy a P. fluorescens Α-32-törzs HPPD-génjének kódolórészét a kettős hisztonpromoter (EP 0 507 698 számú európai
HU 223 788 Β1 közzétételi irat) szabályozása alá helyeztük, amelyet a konstrukcióban a dohány-mozaikvírus („tobacco etch vírus, TEV) transzlációs enhanszerszekvenciája követett [pRTL-GUS; Carrington és Freed: J. Virol. 64, 1590 (1990)], majd a HPPD-kódoló szekvenciát követően, a noplainszintetáz-gén terminátorát inszertáltuk. A fenti kiméragén alkalmazása azt eredményezi, hogy a HPPD a citoplazmában lesz jelen.
A második kiméragén megegyezett az elsővel, csupán azzal az eltéréssel, hogy a TEV transzlációs aktivátor szekvenciája és a HPPD-gén kódolórésze közé az optimalizált tranzitpeptidet (OTP) inszertáltuk (EP 0 508 909 számú európai közzétételi irat). Ez a kiméragén azt eredményezi, hogy a HPPD a kloroplasztokban lesz jelen.
A) A pRPA-RD-153-vektor előállítása pRPA-RD-11: ez a vektor a pBS-ll-SK(—) (Stratagene; katalógusszám: #212 206) származéka, amely a nopalinszintetáz-poliadenilezési helyet (NOS-poliA) (EP 0 652 286) tartalmazza a Kpnl- és Sall-helyek közé klónozva. A Kpnl-helyet Notl-hellyé alakítottuk úgy, hogy azt T4 DNS-polimeráz-l-enzimmel kezeltük, az egyes dezoxinukleotid-trifoszfátok 150 pmol/l koncentrációjának jelenlétében, majd Notl-linkerrel ligáltuk (Stratagene; katalógusszám: #1029). Ily módon NOSpoliA klónozóegységet kaptunk.
pRPA-RD-127: ez a plazmid a pRPA-BL^t66 (EP 0 337 899 számú európai közzétételi irat) pRPARD-11-vektorba klónozott származéka, amelynek előállításával az oxy-gén expresszáltatására alkalmas, a ribulóz-biszkarboxiláz kis alegységének („small subunit”, SSU) promoterét tartalmazó egységet [„promoter (SSU) - oxy-gén - NOS-poliA”] kaptuk.
A fenti plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a pRPABL-488-plazmidot Xbal- és Hindill-enzimekkel emésztettük, majd abból az SSU-promotert és az oxy-gént tartalmazó 1,9 kbp (kilobázispár) fragmentumot izoláltuk, és azt kompatibilis enzimekkel emésztett pRPARD-11-vektorba ligáltuk.
pRPA-RD-132: a pRPA-BL-488-vektor (EP 0 507 698 számú európai közzétételi irat) pRPARD-127-vektorba klónozott származéka, amelynek előállításával az oxy-gént a kettős hisztonpromoter szabályozása alatt expresszáló egységet kaptunk („kettős hisztonpromoter - oxy-gén - NOS-poliA”).
A fenti plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a pRPABL-466-plazmidot Hindlll-enzimmel emészettük, Klenow-fragmentummal kezeltük, majd Ncol-enzimmel emésztettük. A H3A748 jelzésű kettős hisztonpromotert tartalmazó, tisztított, 1,35 kbp fragmentumot előzőleg Xbal-enzimmel emésztett, Klenow-fragmentummal kezelt és Ncol-enzimmel ismételten emésztett pRPARD-127-plazmiddal ligáltuk.
pRPA-RD-153: a pRPA-RD-132-plazmid dohánymozaikvírus (TEV) transzlációs aktivátorát tartalmazó származéka. A pRTL-GUS-plazmidot [Carrington és Freed: J. Virol. 64, 1590 (1990)] Ncol- és EcoRIenzimekkel emésztettük, és a 150 bp fragmentumot a fenti enzimekkel emésztett pRPA-RD-132-plazmidba ligáltuk. Ily módon a promotert tartalmazó, alábbi struktúrájú expressziós egységet kaptuk: „kettős hisztonpromoter - TEV - oxy-gén - NOS-poliA”.
B) A pRPA-RD-185-vektor előállítása pUC19/GECA: a pUC-19-vektor (Gibco; katalógusszám: #15364-011) számos klónozóhelyet tartalmazó származéka. A pUC-19-vektort EcoRI-enzimmel emésztettük, és az alábbi szekvenciájú #1. oligonukleotidlinkerrel ligáltuk:
1. linken AATTGGGCCA GTCAGGCCGT TTAAACCCTA GGGGGCCCG CCCGGT CAGTCCGGCA AATTTGGGAT CCCCCGGGC TTAA.
A szelektált klón egy EcoRI-helyet tartalmaz, amelyet a következő hasítási helyeket magában foglaló többszörös klónozórégió követ: EcoRI, Apai, Avrll, Pmel, Sfil, Sacl, Kpnl, Smal, BamHI, Xbal, Sáli, Pstl, Sphl és Hindlll.
pRPA-RD-185: a pUC19/GECA módosított többszörös klónozórégiót tartalmazó származéka. A pUC19/GECA-plazmidot Hindlll-enzimmel emésztettük, és a #2. számú, következő szekvenciájú oligonukleotidlinkerrel ligáltuk:
2. linker: AGCTTTTAAT TAAGGCGCGC CCTCGAGCCT GGTTCAGGG AAATTA ATTCCGCGCG GGAGCTCGGA CCAAGTCCC TCGA.
A szelektált klón Hindlll-helyet tartalmazott a többszörös klónozórégió közepén, amely ezúttal a következő hasítási helyeket foglalta magában: EcoRI, Apai, Avrll, Pmel, Sfil, Sacl, Kpnl, Smal, BamHI, Xbal, Sáli, Pstl, Sphl, Hindlll, Paci, Ascl, Xhol és EcoNI.
C) A pRP-T-vektor előállítása pRP-O: a pRPA-RD-153 származéka, amely a következő struktúrájú HPPD expressziós egységet tartalmazza: „kettős hisztonpromoter - TEV - HPPD-gén Nos-terminátor”. A pRP-O-vektort úgy állítottuk elő, hogy a pRPA-RD-153-vektort Hindlll-enzimmel emésztettük, Klenow-fragmentummal kezeltük, majd Ncolenzimmel ismételten emésztettük, hogy abból az oxygént eltávolítsuk, majd azt a pRP-A-plazmidból BstEIIemésztéssel nyert, Klenow-fragmentummal kezelt és Ncol-enzimmel ismételten emésztett HPPD-génnel helyettesítettük.
pRP-R: ezt a plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a pRP-O-plazmidot Pvull- és Sacl-enzimekkel emésztettük, a kiméragént tisztítottuk, és azt Pvull- és Saclenzimekkel emésztett pRPA-RD-185-vektorba ligáltuk.
pRP-T: ezt a plazmidot úgy kaptuk, hogy a pRP-Rplazmidból származó kiméragént Sacl- és Hindlllenzimekkel történő emésztést követően, ugyanezekkel az enzimekkel emésztett pRPA-BL-150-alpha2plazmidba (EP 0 508 909 számú európai közzétételi irat) ligáltuk.
A pRP-T-vektorban található kiméragén tehát a következő struktúrájú volt:
Kettős hisztonpromoter TEV HPPDkódoló régió Nos- terminátor
D) A pRP-V-vektor előállítása pRP-P: a pRPA-RD-7 származéka (EP
652 286 számú európai közzétételi irat), amely az optimalizált tranzitpeptid szekvenciáját követően a
HU 223 788 Β1
HPPD-gént tartalmazza. A fenti vektort úgy kaptuk, hogy a pRPA-vektorból BstEII- és Ncol-emésztéssel izoláltuk a HPPD-gén kódolórészét, azt Klenowfragmentummal kezeltük, majd Sphl- és Acclenzimekkel emésztett és T4-DNS-polimerázzal kezelt 5 pRPA-RD-7-vektorral ligáltuk.
pRP-Q: a pRPA-RD-153 származéka, amely a következő struktúrájú HPPD expressziós egységet tartalmazza: „kettős hisztonpromoter - TEV - OTP HPPD-gén - Nos-terminátor”. A fenti plazmidot úgy ál- 10 irtottuk elő, hogy a pRPA-RD-153-plazmidot Sallenzimmel emésztettük, Klenow-fragmentummal kezeltük, majd Ncol-enzimmel ismételten emésztettük, hogy abból az oxy-gént eltávolítsuk, majd azt a pRP-Pplazmidból BstEII-emésztéssel nyert, Klenow- 15 fragmentummal kezelt és Ncol-enzimmel ismételten emésztett HPPD-génnel helyettesítettük.
pRP-S: ezt a plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a pRP-Q-plazmidot Pvull- és Sacl-enzimekkel emésztettük, abból a kíméragént eltávolítottuk, majd azt Pvullés Sacl-enzimekkel emészett pRPA-RD-185-vektorba ligáltuk.
pRP-V: ezt a plazmidot úgy kaptuk, hogy a pRP-Splazmidból Sacl- és Hindlll-enzimekkel történő emésztéssel nyert kíméragént ugyanezekkel az enzimekkel emésztett pRPA-BL-150-alpha2-plazmidba (EP 0 508 909 számú európai közzétételi irat) ligáltuk.
A pRP-Q-vektorban található kiméragén tehát a következő struktúrájú volt:
Kettős hisztonpromoter
TEV OTP HPPD-kódoló régió Nos-terminátor
3. példa
A PBD6 jelzésű ipari dohánynövény transzformációja
A fenti két kiméragén hatékonyságának meghatározására azokat PBD6 jelzésű ipari dohánynövénybe juttattuk, az EP 0 508 909 számú európai közzétételi iratban már ismertetett transzformációs és regenerációs eljárások szerint.
1. Transzformáció
A vektort a pTVK-291-kozmidot hordozó [Komari és munkatársai: (1986)] nem onkogén Agrobacterium EHA-101-törzsbe juttattuk [Hood és munkatársai: (1987)]. A Horsch R. és munkatársai eljárásán alapuló transzformációs eljárást alkalmaztuk [Science 227, 1229 (1985)].
2. Regeneráció
A PBD6 jelzésű dohánynövények (SEITA; Franciaország) levélexplantátumokból történő regenerációját 30 g/l szacharózt és 100 pg/ml kanamycint tartalmazó „Murashige and Skoog” (MS) alaptáptalajon végeztük. A levélexplantátumokat üvegházi növényekről vagy in vitro tenyésztett növényekről távolítottuk el, és azokat a levélkorong-technológiával transzformáltuk [Science 227, 1229 (1985)], három egymás követő lépésben: az első lépésben, 30 g/l szacharózzal kiegészített, 0,05 mg/l naftilecetsavat (ANA) és 2 mg/l benzil-aminopurit (BAP) tartalmazó MS-táptalajon, 15 nap alatt csírák kifejlődését váltottuk ki. Az erre az időpontra kialakult csírákat ezután 30 g/l szacharózzal kiegészített, de hormonokat nem tartalmazó MS-táptalajon tenyészve, 10 napig fejlődni hagytuk. A kifejlődött csírák egy részét eltávolítottuk, és azokat az eredeti táptalajhoz képest feleannyi sót, vitamint és cukrot tartalmazó, de hormonokat nem tartalmazó MS gyökereztető táptalajon tenyésztettük. Mintegy 15 nap elteltével a meggyökerezett csírákat talajba ültettük. Az így kapott növényeket Co-17 jelzéssel láttuk el.
Továbbra is in vitro, a transzformált dohánypalántákat öt hétig üvegházban akklimatizáltattuk (60%-os relatív páratartalom, éjszaka 20 °C-os, nappal 23 °C-os hőmérséklet mellett), majd 4-[4-CF3-2-(metilszulfonil)-benzoil]-5-ciklopropil-izoxazollal kezeltük.
A nem transzformált, de 50-400 g/hektár 4-[4-CF32-(metil-szulfonil)-benzoil]-5-ciklopropil-izoxazol alkalmazásának megfelelő mennyiségű vegyszerrel kezelt kontrolldohánynövényeknél mintegy 72 óra múlva klorózis (sárgulás) volt megfigyelhető, amely egy hét alatt felerősödött, és igen kifejezett (a terminálisán elhelyezkedő levelek mintegy 80%-át érintő) nekrózissá fejlődött. A transzformációt követően ugyanez a P. fluorescens HPPD-gént nagy mennyiségben expresszáló dohánynövény igen jó védettséget mutat 400 g/hektár 4[4-CF3-2-(metil-szulfonil)-benzoil]-5-ciklopropil-izoxazol alkalmazásának megfelelő mennyiségű vegyszerrel történő kezelés hatásával szemben.
Amennyiben az enzim a kloroplasztokban expresszálódik nagy mennyiségben - azaz, a transzformációt a pRP-V-vektor által hordozott génnel végeztük -, a növény tökéletesen védetté válik, és nem mutatja a kezelésre egyébként jellemző tüneteket.
4. példa
A PBD6 ipari dohánynövény transzformációja
EPSPS-génnel; a 173 jelzésű konstrukció előállítása
Kukorica-EPSPS-gént kódoló cDNS izolálása
Az alábbiakban ismertetjük a kukorica-EPSPScDNS előállításához vezető eljárás különböző állomásait, amely cDNS később a két mutáció létrehozásának szubsztrátjaként szolgált. Valamennyi alább leírt művelet csupán példaként szolgál, és az alkalmazott módszerek csupán néhányat képviselnek a rendelkezésre álló számos, azonos eredményre vezető módszer közül. Az adott módszer nem befolyásolja az eredmény minőségét, következésképp, szakember bármely ismert alkalmas módszer alkalmazásával azonos eredményre juthat. DNS-fragmentumok géntechnológiai módosítására alkalmazott eljárások többségének leírása megtalálható az alábbi szakirodalmi helyen: „Current Protocols in Molecular Biology”, 1. és 2. kötet, szerk.: Ausubel F. M. és munkatársai, „Green Publishing Associates and Wiley - Interscience” (1989) (a leírás további részében a fenti kézikönyvben leírt eljárásokra „CPMB” rövidítéssel utalunk). A DNS7
HU 223 788 Β1 ek vonatkozásában az alább felsorolt műveleteket végeztük fenti kézikönyvben ismertetett eljárások szerint: DNS-fragmentumok ligálása; Klenow DNSpolimerázzal és T4 DNS-polimerázzal történő kezelések; plazmid- és λ-bakteriofág-DNS előállítása minipreparátumként vagy maxipreparátumként; DNS és RNS analízise Southern- vagy Northern-eljárással. Ugyancsak a fenti kézikönyvben ismertetett további eljárások esetében, az alábbiakban csupán az azokat érintő jelentős módosításokat vagy azokhoz képest többletet jelentő változtatásokat ismertetjük.
A) 1. EPSPS-fragmentum előállítása Arabidopsis thalianából
a) Két, 20-20 nukleotidból álló oligonukleotidot szintetizáltunk Arabidopsis thaliana EPSPS-gén szekvenciája alapján [Klee H. J. és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 210, 437 (1987)], amelyek a következő szekvenciájúak voltak.
5’-GCTCTGCTCATGTCTGCTCC-3’;
5’-GCCCGCCCTTGACAAAGAAA-3’.
Ez a két oligonukleotid a szakirodalomban közölt szekvencia 1523-1543. és 1737-1717. nukleotidjainak felelt meg, egymás felé mutató (konvergens) orientációban.
b) Arabidopsis thaliana (Columbia variáns) összDNS-t a Clontech cégtől szereztünk be (katalógusszám: 6970-1).
c) Ötven (50) nanogramm (ng) DNS-t az egyes oligonukleotidok 300 ng mennyiségével elegyítettünk, és 35 ciklus során, „Perkin-Elmer 9600” készülékkel, a gyártó által ajánlott standard körülmények mellett amplifikációt végeztünk. Az amplifikációval kapott 204 bázispárból (bp) álló fragmentum megfelelt az Arabidopsis thaliana EPSPS-fragmentumának.
2. cDNS-génkönyvtár készítése BMS-kukoricasejtvonalból
a) Öt (5) gramm leszűrt sejtet folyékony nitrogénben eldörzsöltünk, és azokból az össznukleinsavat extraháltuk Shure és munkatársai eljárása szerint, a következő módosítások alkalmazása mellett:
a lízispuffer pH-ját 9,0-es értékre állítottuk be; izopropanollal történő extrahálást követően az üledéket vízben szuszpendáltuk, majd oldódást követően az elegyhez LiCI-ot adtunk, úgy, hogy az utóbbi koncentrációja az elegyben 2,5 mol/l legyen. Miután ez elegyet 12 órán át inkubáltuk, majd 15 percig, 30 000 g mellett, 4 °C-on centrifugáltuk, a kapott üledéket ismételten szolubilizáltuk. Ezután a LiCI-precipitációt megismételtük. A szolubilizált üledék az össznukleinsavak RNS-frakcióját képviseli.
b) Az RNS-frakció RNS-poliA+-frakcióját oligo-dTcellulóz oszlopon végzett kormatográfiával kaptuk, a „Current Protocols in Molecular Biology” kézikönyvben ismertetettek szerint.
c) Szintetikus EcoRI-végeket tartalmazó kettős szálú DNS szintézisét a szintézishez szükséges különböző reagenseket reagenskészlet formájában forgalmazó cég - az In Vitrogen - „Copy kit” elnevezésű reagenskészletéhez mellékelt utasítások szerint végeztük.
A tompa végűvé alakított kettős szálú cDNS-sel két egyszálú, részlegesen komplementer, alábbi szekvenciájú oligonukleotidot ligáltunk:
5-AATTCCCGGG-3';
5’-CCCGGG-3’ (az utóbbit foszforilezett formában).
Az adaptorszekvenciák fenti módon történő ligálása a kettős szálú cDNS-hez csatolt Smal-helyek keletkezését és a kettős szálú cDNS végein, kohezív formában, EcoRI-helyek létrehozását eredményezi.
d) Génkönyvtár előállítása
A végükön mesterségesen kialakított kohezív EcoRI-helyeket tartalmazó cDNS-eket Xgt10bakteriofágból EcoRI-enzimmel kihasított és defoszforilezett cDNS-sel ligáltuk, a fág-DNS-t forgalmazó „New England Biolabs” utasításai szerint.
A ligációs reakcióelegy egy részét in vitro, „Gigapack Gold” becsomagoló extraktummal „becsomagoltuk” (fágfejbe csomagoltuk), a gyártó utasításai szerint eljárva; a génkönyvtárat E. coli C6OOri/7-baktériumtörzs alkalmazásával megtitráltuk. Az így kapott génkönyvtárat amplifikáltuk, a fenti forgalmazó utasításai szerint tároltuk, és ezt alkalmaztuk BMS-kukoricasejtszuszpenzió-eredetű cDNS-génkönyvtárként.
3. BMS-kukoricasejtszuszpenzió-eredetű cDNSgénkönyvtár szűrése Arabidopsis thaliana EPSPS-próbával
A „Current Protocols in Molecular Biology” [1. és 2. kötet, szerk.: Ausubel F. M. és munkatársai, „Green Publishing Associates and S” (1989) (CPMB)] kézikönyvben ismertetettek szerint jártunk el. Röviden, mintegy 106 rekombináns fágot oltottunk ki LB-lemezekre, 100 fág/cm2 átlagos sűrűségben. A lízist eredményező plakkokat duplikátumokban „Amersham Hybond N” membránokra vittük át.
a) A DNS-t 1600 kJ energiájú ultraibolya fénnyel történő kezeléssel (Stratalinker; Strategene) fixáltuk a filtereken. A filtereket 0,1% SDS-t és 0,25 fölözött tejet tartalmazó 6*SSC pufferben, 2 órán át, 65 °C-on előhibridizáltattuk. Az Arabidopsis thaliana EPSPS-próbát 32P-dCTP-vel jelöltük, véletlenszerű láncindítással („random priming”), a reagenskészletet gyártó cég utasításai szerint eljárva („Kit Ready to Go”; Pharmacia). A jelölés 1 pg fragmentumra számítva 10® cpm nagyságrendbe eső specifikus aktivitást eredményezett. Miután a DNS-t 5 percig, 100 °C-on denaturáltuk, a próbát hozzáadtuk az előhibridizációs pufferhez, és a hibridizációt 14 órán át, 55 °C-on folytattuk. A filtereket 48 órán át, -80 °C-on „Kodak XAR5 film és .Amersham Hyperscreen RPN” erősítőernyők alkalmazásával röntgenfilmen exponáltuk. A filteren megfigyelhető pozitív foltok összevetése az eredeti lemezekkel lehetővé teszi azt, hogy a lemezekről Arabidopsis thaliana EPSPS-próbával pozitív hibridizációs jelet adó fágoknak megfelelő területeket távolítsunk el. Az átoltást, filterre történő átvitelt, hibridizációt és izolálást addig ismételtük, amíg az ismételt tisztítási lépések eredményeképp, a lemezen található valamennyi fágnak megfelelő folt 100%-ban pozitívnak bizonyult a hibridizációs reakcióval. Az egyes fágoknak megfelelő egy-egy lízisplakkot eltávolítottunk, és azt λ-hígítópufferbe vit8
HU 223 788 Β1 tünk át [Tris-CI (pH=7,5); 10 mmol/l MgSO4; 0,1 mol/l NaCl; 0,1% zselatin]; az oldatban található fágok képviselték a pozitív, BMS-kukoricasejtszuszpenzió-eredetü EPSP-klónokat.
4. DNS előállítása és analízise a BMSkukoricasejtszuszpenzió-eredetü EPSPS-klónokból Mintegy 5*108 fágot adtunk 20 ml, olyan C600-hflbaktériumszuszpenzióhoz, amelynek fényelnyelése 600 nm-en mérve, milliliterenként 2 volt, és az elegyet 15 percen át, 37 °C-on inkubáltuk. Ezt a szuszpenziót ezután 200 ml baktériumtenyésztő tápfolyadékban hígítottuk, 1 I össztérfogatú Erlenmeyer lombikban, és 250 fordulat/perc mellett, rotációs keverőben kevertük. A lízist a tápfolyadék feltisztulása jelezte, a zavarosságot (turbiditást) előidéző baktériumok lizálódásának megfelelően, és az mintegy 4 órás rázatást követően volt megfigyelhető. A felülúszót a „Current Protocols in Molecular Biology” kézikönyvben ismertetettek szerint kezeltük. Az így kapott DNS a BMS-kukoricasejtszuszpenzió-eredetű EPSPS-klónokból származik.
Egy-két (1-2) pg fenti módon előállított DNS-t EcoRI-enzimmel hasítottunk, és 0,8% LGTA/TBEagarózgélen szétválasztottunk (lásd CPMB). A kiónok eredetét végül annak alapján igazoltuk, hogy a tisztított DNS valóban hibridizációs jelet ad Arabidopsis thaliana EPSPS-próbával. Elektroforézist követően, a DNSfragmentumokat „Amersham Hybond N” membránokra vittük át, a „Current Protocols in Molecular Biology” kézikönyvben ismertetett Southern-hibridizációs eljárás szerint. A filtereket Arabidopsis thaliana EPSPSpróbával hibridizáltattuk, a 3. pontban már ismertetett körülmények alkalmazása mellett. Az Arabidopsis thaliana EPSPS-próbával hibridizációs jelet adó, leghoszszabb EcoRI-fragmentumot tartalmazó klón mérete gélelektoroforézis szerint mintegy 1,7 kbp volt.
5. A pRPA-ML-711-klón előállítása
Tíz (10) pg, az 1,7 kbp inszertet tartalmazó fágklónból származó DNS-t EcoRI-enzimmel emésztettünk, és 0,8% LGTA/TBE-agarózgélen szétválasztottunk (lásd CPMB). Az 1,7 kbp inszertet tartalmazó gélfragmentumot BET-festés mellett a gélből kivágtuk, és azt βagarázzal kezeltük, a gyártó utasításai szerint eljárva (New England Biolabs). Az 1,7 kbp fragmentumból tisztított DNS-t 12 órán át, 14 °C-on, EcoRI-enzimmel hasított pUC19-plazmid-DNS-sel ligáltuk (New England Biolabs), a „Current Protocols in Molecular Biology” kézikönyvben ismertetett ligációs eljárás szerint. A fenti ligációs elegy 2 pl térfogatú mintájával elektrokompetens E. coli DH10B-sejteket transzformáltunk; a transzformációt elektroporációval végeztük, a következő körülmények alkalmazása mellett: a kompetens baktériumok és ligációs szuszpenzió elegyét előzőleg 0 °C-ra lehűtött, 0,2 cm vastagságú elektroporációs kamrákba mértük (Biorad). Az elektroporációt Biorad típusú elektroporációs készülékkel, az alábbi fizikai paraméterek alkalmazása mellett végeztük: 2500 Volt; 25 pFarad; és 200 Ω. A fenti körülmények mellett, az átlagos kondenzátorkisülési idő 4,2 milliszekundum tartományban van. Ezután, a baktériumokat 1 ml SOC-oldatban szuszpendáltuk (lásd CPMB), és 1 órán át, 200 fordulat/perc mellett, 15 ml Coming-csövekben, rotációs keverőn kevertük. A sejteket 100 pg/ml karbenicillinnel kiegészített LB/agar-táptalajra oltottuk, és az egy éjszaka alatt 37 °C-on kinőtt baktériumklónokból minipreparátumokat állítottunk elő, „Current Protocols in Molecular Biology” kézikönyvben ismertetett eljárás szerint. Miután a DNS-t EcoRI-enzimmel emésztettük, és 0,8% LGTA/TBE-agarózgélen szétválasztottuk (lásd CPMB), az 1,7 kbp inszertet tartalmazó kiónokat megőriztük. Végső bizonyítékként ellenőriztük, hogy a tisztított DNS valóban hibridizációs jelet ad Arabidopsis thaliana EPSPS-próbával. Elektroforézist követően, a DNSfragmentumokat „Amersham Hybond N” membránokra vittük át, a „Current Protocols in Molecular Biology” kézikönyvben ismertetett Southern-hibridizációs eljárás szerint. A filtereket Arabidopsis thaliana EPSPSpróbával hibridizáltattuk, a 3. pontban már ismertetett körülmények alkalmazása mellett. Az 1,7 kbp inszertet tartalmazó, és Arabidopsis thaliana EPSPS-próbával hibridizációs jelet adó plazmidklónt nagyobb mennyiségben állítottunk elő, és a baktériumok lizáltatásával kapott DNS-t CsCI-gradiensen tisztítottuk, a „Current Protocols in Molecular Biology” című kézikönyvben ismertetettek szerint. A tisztított DNS-t a Pharmacia által forgalmazott reagenskészlet alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint eljárva részlegesen szekvenáltuk; a szekvenálásnál láncindító oligonukleotidokként a fenti gyártótól származó M13 „reverz” és „direkt” univerzális láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk. A szekvenálással meghatározott részleges szekvencia mintegy 0,5 kbp régiót fedett át. Az érett protein kódolórégiójának megfelelő (mintegy 50 aminosav hosszúságú) következtetett aminosavszekvencia 100%-ban azonosnak bizonyult az érett kukorica-EPSPS USP 4 971 908 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett szekvenciájának megfelelő régióba eső aminosavszekvenciájával. Ezt a kiónt, amely a BMS-kukoricasejtszuszpenzió-eredetű EPSPDNS-nek megfelelő 1,7 kbp EcoRI-fragmentumot tartalmazta, pRPA-ML-711-kiónnak neveztük. A fenti klón teljes szekvenciáját mindkét szál mentén meghatároztuk, a Pharmacia-reagenskészlethez mellékelt utasítások szerint eljárva, úgy, hogy mintegy 250 bázispáronként komplementer és azzal ellentétes irányú oligonukleotidokat szintetizáltunk. Az így kapott, 1713 bázispárból álló klón teljes szekvenciáját a 2. azonosító számú szekvencián mutatjuk be.
6. A pRPA-ML-715-klón előállítása A pRPA-ML-711-klón szekvenciájának analízise, és közelebbről, a fenti szekvencia alapján következtetett aminosavszekvencia összehasonlítása a kukoricaeredetű szekvenciával azt mutatta, hogy a kukoricaEPSPS-protein érett formájának NH2-terminális alaninját kódoló GCG-kodontól (lásd az USP 4 971 908 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást) 5’-irányban egy 92 bázispárból álló toldalék található. Hasonlóképp, a kukorica-EPSPSprotein érett formájának COOH-terminális aszparaginját kódoló AAT-kodontól (lásd az USP 4 971 908 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást)
HU 223 788 Β1
3’-irányban egy 288 bázispárból álló toldalék figyelhető meg. A fenti két toldalék vonatkozásában, az NH2terminális toldalék megfelelhet egy plasztidlokalizációs tranzitpeptid szekvenciarészletének, a COOHterminális toldalék pedig a cDNS 3’-végi nem transzlá- 5 lódó régiójának.
A kukorica-EPSPS érett formáját (lásd az USP 4 971 908 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást) kódoló cDNS-t a következőkben ismertetettek szerint állítottuk elő: 10
a) A nem transzlálódó 3’-végi régió eltávolítása; a pRPA-ML-712-klón előállítása A pRPA-ML-711-kiónt Asel restrikciós enzimmel hasítottuk, és a hasítással kapott végeket DNSpolimeráz-l Klenow-fragmentumával történő kezelés- 15 sel, a CPMB kézikönyvben ismertetett eljárás szerint tompa végekké alakítottuk. Ezután a DNS-t Sacll restrikciós enzimmel hasítottuk. A fenti módon kapott DNS-t 1%-os LGTA/TBE-agarózgélen végzett elektroforézissel szétválasztottuk (lásd CPMB). 20
A 0,4 kbp méretű, „tompa véggé alakított Asel/Sacll inszertet tartalmazó gélfragmentumot a gélből kivágtuk, és az 5. pontban már ismertetett eljárás szerint tisztítottuk. A pRPA-ML-711-kiónnak megfelelő DNS-t a pUC19 klónozóvektor többszörös klónozórégiójában található helyen, Hindlll restrikciós enzimmel hasítottuk, és a hasítással kapott végeket DNS-polimeráz-l Klenow-fragmentumával történő kezeléssel tompa végekké alakítottuk. Ezután hasítást végeztünk Sacll restrikciós enzimmel. A fenti módon kapott DNS-t 0,7%-os LGTA/TBE-agarózgélen végzett elektroforézissel szétválasztottuk (lásd CPMB).
A 3,7 kbp méretű, „tompa véggé alakított Hindlll/Sacll” inszertet tartalmazó gélfragmentumot a gélből kivágtuk, és az 5. pontban már ismertetett eljárás szerint tisztítottuk.
A két inszertet ligáltuk, és 2 μΙ ligációs eleggyel E. coli DH10B-sejteket transzformáltunk, az 5. pontban már ismertetett eljárás szerint. A különböző kiónokban található plazmid-DNS-eket a pRPA-ML-711-klón esetében ismertetett eljárás szerint analizáltuk. Az egyik izolált plazmidklón mintegy 1,45 kbp méretű EcoRIHindlll-inszertet tartalmazott. A fenti klón terminális szekvenciáinak analízise szerint, az inszert 5’-vége pontosan megfelel a pRPA-ML-711-klón megfelelő végének, a 3’-vég pedig a következő szekvenciájú:
,,5’-AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3’”.
Az aláhúzott szekvencia a COOH-végi terminális aszparaginsavnak, a következő kodon a transzlációs stopkodonnak felel meg. A 3’-irányú nukleotidok a pUC19 többszörös klónozórégiójában található szék- 30 venciaelemekkel egyeznek meg. Ezt a kiónt, amely tartalmazza a pRPA-ML-711-klónban található szekvenciát a kukorica-EPSPS érett formájának transzlációterminációs helyéig, majd ezt követően, a pUC19-vektor többszörös klónozórégiójának megfelelő szekvenciát, 35 az abban található Hindlll hasítási helyig, pRPAML-712-klónnak neveztük.
b) A pRPA-ML-712-klón 5’-végének módosítása; a pRPA-ML-715-klón előállítása A pRPA-ML-712-klónt Pstl és Hindlll restrikciós enzimekkel hasítottuk. A fenti módon kapott DNS-t 0,8%-os LGTA/TBE-agarózgélen végzett elektroforézissel szétválasztottuk (lásd CPMB). Az 1,3 kbp méretű Pstl/EcoRI inszertet tartalmazó gélfragmentumot a gélből kivágtuk, és az 5. pontban már ismertetett eljárás szerint tisztítottuk. Ezt az inszertet azonos mólnyi mennyiségű, következő szekvenciájú részlegesen komplementer oligonukleotidok jelenlétében, BamHIés Hindlll-enzimekkel emésztett pUC19-plazmidDNS-sel ligáltuk:
1. oligonukleotid: 5’-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3’;
2. oligonukleotid: 5’-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3’.
A fenti ligációs elegy 2 μΙ térfogatú mintájával E. coli DH10B-sejteket transzformáltunk, az 5. pontban már 45 ismertetett eljárás szerint. Miután a különböző kiónokban található plazmid-DNS-eket az 5. pontban leírtak szerint analizáltuk, egy mintegy 1,3 kbp inszertet tartalmazó kiónt további analízis céljára megtartottunk.
A fenti klón 5’-végének szekvenciaanalízise azt mutat- 50 ta, hogy ebben a régióban a következő DNSszekvenciák következnek egymás után: a pUC19vektor többszörös klónozórégiójának EcoRI-BamHIhelyek közti szekvenciája; a klónozásnál felhasznált oligonukleotidok szekvenciája; a pRPAML-712- 55 kiónban található fennmaradó szekvencia. Ezt a kiónt pRPA-ML-713-klónnak neveztük. A fenti klón egy Ncol-hely részeként, ATG-metioninkodont tartalmaz az érett EPSP-szintetáz N-terminális alaninját kódoló szekvenciától 5’-irányban. Továbbá, az N-terminális 60 végen található alanin- és glicinkodonokat megtartottuk, de azokat a harmadik, variábilis bázis pozíciójában módosítottuk: azaz, az eredeti GCGGGT-szekvenciát GCCGGC-szekvenciára módosítottuk.
A pRPA-ML-713-klónt Hindlll restrikciós enzimmel hasítottuk, és a hasítással kapott végeket DNSpolimeráz-l Klenow-fragmentumával történő kezeléssel tompa végekké alakítottuk. A fenti módon kapott DNS-t 0,8%-os LGTA/TBE-agarózgélen végzett elektroforézissel szétválasztottuk (lásd CPMB). Az 1,3 kbp méretű „tompa véggé alakított Hindlll/Sacl” inszertet tartalmazó gélfragmentumot a gélből kivágtuk, és az 5. pontban már ismertetett eljárás szerint tisztítottuk. Ezt az inszertet Xbal-enzimmel emésztett, majd DNS-polimeráz-l Klenow-fragmentumával történő kezeléssel tompa végűvé alakított, végül Sacl-enzimmel emésztett pUC19plazmid-DNS-sel ligáltuk. A fenti ligációs elegy 2 μΙ tér10
HU 223 788 Β1 fogatú mintájával E. coli DH10B-sejteket transzformáltunk, az 5. pontban már ismertetett eljárás szerint. Miután a különböző kiónok plazmid-DNS-tartalmát az 5. pontban leírtak szerint analizáltuk, egy mintegy 1,3 kbp inszertet tartalmazó kiónt további analízis céljára kivá- 5 lasztottunk. A fenti klón végeinek szekvenciaanalízise azt mutatta, hogy abban a következő DNSszekvenciák következnek egymás után: a pUC19vektor többszörös klónozórégiójának EcoRI-SacIhelyek közti szekvenciája; a klónozásnál felhasznált 10 oligonukleotidok szekvenciája, amelyből azonban az 1. oligonukleotid részét képező 4 bázispárt (GATC) deletáltuk; a pRPAML-712-klónban található fennmaradó szekvencia, a Hindlll-hellyel bezárólag, majd a pUC19-vektor többszörös klónozórégiójának Xbal- 15 Hindlll-helyek közti szekvenciája. A fenti kiónt pRPAML-715-klónnak neveztük.
7. Mutáns kukorica-EPSPS-t kódoló cDNS előállítása
A mutagenezishez vezető valamennyi lépést a 20 Pharmacia által forgalmazott „U.S.E.” mutagenezisreagenskészlettel végeztük, a gyártó utasításai szerint eljárva. A fenti mutagenezisrendszer a következő elven működik: a plazmidDNS-t hővel denaturáljuk, és egyrészt a mutagenezist előidéző oligonukleotid, másrészt 25 a többszörös klónozási helyen található egyedi restrikciós enzim hasítási hely megszüntetését lehetővé tevő oligonukleotid moláris feleslegének jelenlétében hibridízáltatjuk. A hibridizáltatást követően, T4-DNSpolimeráz alkalmazásával a komplementer szálat meg- 30 szintetizáljuk, T4-DNS-ligáz és gén-32-protein jelenlétében, a reagenskészlethez mellékelt megfelelő pufferben. A szintetikus terméket azzal a restrikciós enzimmel inkubáljuk, amelynek megfelelő helyet a mutagenezissel meg kívántuk szüntetni. A fenti DNS-sel mutS- 35 mutációt hordozó E. coli törzshöz tartozó gazdasejteket transzformálunk. Miután a baktériumsejteket folyékony tápfolyadékban tenyésztettük, azokból össz-plazmidDNS-t állítunk elő, és azt az előzőekben már alkalmazott restrikciós enzim jelenlétében inkubáljuk. A fenti kezeléseket követően, gazdasejtekként, E. coli DH10B-törzshöz tartozó sejteket transzformálunk. Az izolált klónokból plazmid-DNS-t állítunk elő, és a létrehozott mutáció jelenlétét szekvenálással igazoljuk.
A) A kukorica-EPSPS, EPSP-szintetáz-aktivitás kompetitív gátlóival szemben mutatott rezisztens jellegét eleve nem befolyásoló szekvencia- vagy restrikcióshely-módosítások; a pRPA-ML-715-klónban található belső Ncol hasítási hely megszüntetése
A pRPA-ML-715-klón szekvenciáját önkényesen számoztuk meg, 1. pozíciónak az N-terminális alaninkodon - GCG - első bázisát tekintettük. Ez a szekvencia Ncol-helyet tartalmaz az 1217. pozícióban. Helymódosító oligonukleotidként a következő szekvenciájú oligonukleotidot alkalmaztuk:
5’-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3’.
Az idézett szakirodalmi hivatkozásokban ismertetettek szerint végzett szekvenálást követően megállapítottuk, hogy a mutagenezissel létrehozott szekvencia megfelel az alkalmazott oligonukleotid szekvenciájának. Az Ncol-helyet valóban megszüntettük, és a fenti régió aminosavakká történő transzlációja nem eredményezi a pRPA-ML-715-klón által kódolt eredeti szekvencia megváltozását.
A kapott kiónt pRPA-ML-716-klónnak neveztük.
A fenti klón 1340 bázispárból álló szekvenciáját a 3. és 4. azonosító számú szekvenciákon mutatjuk be.
B) Szekvenciamódosítások, amelyek az EPSPSenzim rezisztenciájának megnövekedését eredményezik EPSP-szintetáz-aktivitás kompetitív gátlóival szemben
A következő oligonukleotidokat alkalmaztuk:
a) Thr102->lle-mutációt előidéző, következő szekvenciájú oligonukleotidot:
5’-GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3’;
b) Pro106-»Ser-mutációt előidéző, következő szekvenciájú oligonukleotidot:
5’-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3’;
c) Gly101->Ala- és Thr102->lle-mutációkat előidéző, következő szekvenciájú oligonukleotidot: 5’-CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3’;
d) Thr102-»lle- és Pro106->Ser-mutációkat előidéző, következő szekvenciájú oligonukleotidot: 5’-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3’.
Szekvenálást követően megállapítottuk, hogy a három mutagenizált fragmentum szekvenciája megegyezik az eredeti pRPA-ML-716-DNS-szekvenciával, a mutációt tartalmazó régiók kivételével, amelyek a mutáció elő- 50 idézésére alkalmazott oligonukleotid szekvenciájának felelnek meg. A Thr102->lle-mutációt tartalmazó kiónt pRPA-ML-711-kiónnak; a Pro106->Ser-mutációt tartalmazó kiónt pRPA-ML-718-klónnak; a Gly101-»Ala- és Thr102->lle-mutációkat tartalmazó kiónt pRPA-ML-719- 55 kiónnak; és a Thr102—>lle- és Pro106->Ser-mutációkat tartalmazó kiónt pRPA-ML-720-klónnak neveztük.
A pRPA-ML-720-klón 1340 bázispárból álló szekvenciáját az 5. és 6. azonosító számú szekvenciák tartalmazzák. 60
Az 1395 bp Ncol-HindlII-inszert képezte az alapját valamennyi konstrukciónak, amelyet növények transzformálására alkalmaztunk, hogy azokban rezisztenciát hozzunk létre EPSPS-enzim kompetitív gátlóiként viselkedő herbicidekkel, közelebbről glifozáttal szemben. Ezt az inszertet a leírás további részében „kukoricaEPSPS kettős mutáns” inszertnek nevezzük.
B) Különböző mutánsok in vitro glifozáttoleranciája
2a: EPSP-szintetáz extrakciója
A különböző EPSP-szintetáz-géneket Ncol-Hindlllegység formájában Ncol- és Hindlll-enzimekkel hasított pTrc99a-plazmidvektorba építettük (Pharmacia; hivatkozási szám: 27-5007-01). A különböző EPSP-szintetázokat nagy mennyiségben expresszáló rekombináns
HU 223 788 Β1
E. coli DH10B-sejteket 10 g ülepített sejtre számítva 40 ml pufferben [200 mmol/l Tris-HCI (pH=7,8); 50 mmol/l merkaptoetanol; 5 mmol/l EDTA; és 1 mmol/l PMSF] ulrahanggal lizáltattuk, majd 1 g poli(vinilpirrolidon)-nal kiegészített, egyébként a fentivel megegyező összetételű pufferrel mostuk. A szuszpenziót 15 percen át, 4 °C-on kevertük, majd 20 percig, 27 000 g mellett, 4 °C-on centrifugáltuk.
A felülúszóhoz ammónium-szulfátot adtunk, úgy, hogy az oldat 40%-ban telített legyen ammóniumszulfátra nézve. Az elegyet 20 percig, 27 000 g mellett, 4 °C-on centrifugáltuk. Az így kapott felülúszót ammónium-szulfáttal egészítettük ki, amíg az oldat telítettsége el nem érte a 70%-ot. Az elegyet 30 percig, 27 000 g mellett, 4 °C-on centrifugáltuk. Az így kiülepített proteinfrakcióban található EPSP-szintetázt 1 ml pufferben szuszpendáltuk [20 mmol/l Tris-HCI (pH=7,8); 50 mmol/l merkaptoetanol]. Ezt az oldatot egy éjszakán át, 4 °C-on, két liter fenti összetételű pufferrel szemben dializáltuk.
2b: Enzimaktivitás meghatározása
Az egyes enzimek aktivitását és azok rezisztenciáját glifozáttal szemben in vitro mértük, 10 percig, 37 °C-on végzett reakció során, a következő összetételű reakcióelegyben: 100 mmol/l maleinsav (pH=5,6); 1 mmol/l foszfoenolpiruvát; 3 mmol/l sikimát-3-foszfát (Aerobacter aerogenes ATCC 25 597 jelzésű törzsből, Knowes P. F. és Sprinson D. B. eljárása szerint előállítva: Methods in Enzymol. 17A, 351 (1970)]; és 10 mmol/l kálium-fluorid. Az enzimextraktumot az utolsó percben adtuk az elegyhez, a glifozát hozzáadását követően, amelyet 0-20 mmol/l végkoncentrációban alkalmaztunk.
Az enzimaktivitást a foszfát felszabadulása alapján határoztuk meg, Tausky H. A. és Shorr E. eljárása szerint [J. Bioi. Chem. 202, 675 (1953)].
A fenti körülmények alkalmazása mellett, a vad típusú (vt) enzim aktivitása 0,12 mmol/l glifozátkoncentrációtól kezdve 85%-ban gátlódott. Ennél a koncentrációnál a Ser106-mutációt hordozó enzim csak 50%-ban gátlódott, és a három további mutáns enzim - az Ile102, He102/Ser106 és Ala101/lle102 mutációt hordozó enzim - nem gátlódott, vagy csak kismértékben gátlódott.
A glifozát koncentrációját tízszeresére, azaz 1,2 mmol/l-re kellett növelnünk ahhoz, hogy az Ile102mutációt hordozó enzimet 50%-ban gátoljuk; ennél a koncentrációnál az Ile 102/Ser106, Ala/lle és Alamutánsok még mindig nem gátlódtak.
Megjegyzendő, hogy az Ala/lle és Ala-mutánsok nem gátlódtak 10 mmol/l glifozátkoncentrációig, és az Ile102/Ser106 mutáns aktivitása még akkor sem csökkent, ha a glifozátkoncentrációt ennek 2-szeresére, azaz 20 mmol/l-re növeltük.
C) A transzformált dohánynövények rezisztenciájának meghatározása
0-1. Plazmidok előállítása pRPA-RD-124: „nos poliadenilezési helyet klónoztunk a korábbiakban ismertetettek szerint kapott pRPA-ML-720-konstrukcióba, miáltal „kukoricaEPSPS kettős mutáns (Thr102—>lle és Pro106->Ser) gént hordozó klónozóegységet (kazettát) kaptunk.
A pRPA-ML-720-plazmidot Hindlll-enzimmel emésztettük, E. coli DNS-polimeráz Klenow-fragmentumával kezeltük, miáltal tompa végű terméket kaptunk. Egy második emésztést végeztünk Ncol-enzimmel, és az EPSPS-fragmentumot tisztítottuk. Ezt követően, az EPSPS-gént tisztított pRPA-RD-12-plazmiddal (a nopalinszintetáz poliadenilezési szignálját tartalmazó klónozóegységgel) ligáltuk, így kaptuk a pRPA-RD-124konstrukciót. Ahhoz, hogy megfelelően tisztított pRPARD-12-vektort kapjunk, azt először Sall-enzimmel kellett emésztenünk, Klenow DNS-polimerázzal kezelnünk, majd Ncol-enzimmel ismételten emésztenünk.
pRPA-RD-125: ezt a plazmidot úgy kaptuk, hogy optimalizált tranzitpeptidet (OTP) ligáltunk a pRPARD-124-konstrukcióba, ezáltal a plazmidokon a célzott EPSPS-gént tartalmazó klónozóegységet nyertük. A pRPA-RD-7-plazmidot (lásd EP 652 286 számú európai közzétételi irat) Sphl-enzimmel emésztettük, T4DNS-polimerázzal kezeltük, majd Spel-enzimmel emésztettük, és az OTP-fragmentumot tisztítottuk. Ezt az OTP-fragmentumot olyan pRPA-RD-124-plazmidba ligáltuk, amelyet előzőleg Ncol-enzimmel emésztettünk, a túlnyúló 3’-végek eltávolítása céljából Klenow DNS-polimerázzal kezeltünk, majd Spel-enzimmel emésztettünk. Ezután a kiónt az OTP-fragmentum és az EPSPS-gén megfelelő transzlációs fúziójának igazolása céljából szekvenáltuk. Az így kapott kiónt pRPA-RD-125-klónnak neveztük.
pRPA-RD-159: ezt a plazmidot úgy kaptuk, hogy az Arabidopsis thaliana eredetű H4A748 jelzésű kettős hisztonpromotert (lásd EP 507 698 európai közzétételi irat) a pRPA-RD-125-konstrukcióba klónoztuk, ezáltal növényekben történő expresszáltatásra alkalmas egységet (kazettát) kaptunk, az „OTP - kettős mutáns kukorica-EPSPS-gén” kétszikű növényi szövetekben történő expresszáltatására. A pRPA-RD-132-plazmidot [a H4A748 jelzésű kettős hisztonpromotert (lásd EP 507 698 számú európai közzétételi irat) tartalmazó egységet] Ncol- és Sacl-enzimekkel emésztettük. A tisztított promoterfragmentumot előzőleg EcoRI- és Saclenzimekkel emésztett plazmidba klónoztuk.
pRPA-RD-173: A pRPA-RD-159-konstrukcióban található „H4A748-promoter - OTP - kettős mutáns kukorica-EPSPS-gén konstrukciót pRPA-BL-150A-plazmidba (lásd EP 508 909 számú európai közzétételi irat) klónoztuk, miáltal Agrobacterium tumefaciens transzformációs vektort kaptunk. A pRPA-RD-159-plazmidot Notlenzimmel emésztettük, és a Klenow-polimerázzal kezeltük. A kapott fragmentumot ezután Smal-enzimmel emésztett pRPA-BL-150A-plazmidba klónoztuk.
1-1. Transzformáció
A pRPA-RD-173-vektort a pTVK291-plazmidot hordozó [Komari és munkatársai: (1986)] Agrobacterium tumefaciens EHA-101-törzsbe juttattuk [Hood és munkatársai: (1987)]. A transzformációt Horsh és munkatársai által leírt transzformációs eljárás szerint végeztük [Horsh és munkatársai: (1985)].
1-2. Regeneráció
A PBD6 jelzésű dohánynövények (SEITA, Franciaország) levélexplantátumokból történő regenerációját
HU 223 788 Β1 g/l szacharózt és 200 pg/ml kanamycint tartalmazó „Murashige and Skoog” (MS) alaptáptalajon végeztük. A levélexplantátumokat üvegházi növényekről vagy in vitro tenyésztett növényekről távolítottuk el, és azokat a levélkorong-technológiával transzformáltuk [Science 227, 1229 (1985)], három egymás követő lépésben: az első lépésben, 30 g/l szacharózzal kiegészített, 0,05 mg/l naftilecetsavat (ANA) és 2 mg/l benzilaminopurit (BAP) tartalmazó MS-táptalajon, 15 nap alatt csírák kifejlődését váltottuk ki. Az erre az időpontra kialakult csírákat ezután 30 g/l szacharózzal kiegészített, de hormonokat nem tartalmazó MS-táptalajon tenyészve, 10 napig fejlődni hagytuk. A kifejlődött csírákat eltávolítottuk, és azokat az eredeti táptalajhoz képest feleannyi sót, vitamint és cukrot tartalmazó, de hormonokat nem tartalmazó MS gyökereztető táptalajon tenyésztettük. Mintegy 15 nap elteltével a meggyökerezett csírákat talajba ültettük.
1-3. Glifozátrezisztencia
Húsz (20) pRPA-RD-173-konstrukcióval transzformáit növényt regeneráltunk, és azokat üvegházba telepítettük át. A növényeket 5 leveles állapotban, az üvegházban, „RoundUP” vizes szuszpenziójával kezeltük, hektáronként 0,8 kg glifozát elnevezésű aktív hatóanyag alkalmazásának megfelelő mennyiségben.
Az eredményeket a fitotoxicitás jeleinek megfigyelése alapján, a kezelést követően 3 héttel rögzítettük. A fenti körülmények mellett a pRPA-RD-173konstrukcióval transzformált növények igen jó toleranciát mutattak, míg a nem transzformált kontrollnövények teljesen elpusztultak.
Az eredmények alapján nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti kiméragén alkalmazása előrelépést jelent a glifozáttoleranciát kódoló megfelelő génhez képest.
5. példa
A PBD6 jelzésű ipari dohánynövény transzformációja a nitrilázgénnel (a 238-konstrukció előállítása) A fenti dohánynövényt az EP 0 337 899 számú európai közzétételi iratban foglalt, a 238 jelzésű konstrukcióra vonatkozó kitanítás szerint kaptuk (a 238 jelzésű konstrukció ismertetését lásd a fenti közzétételi iratban, a 6. oldal 50. sora után következő oldalakon), amely konstrukció ott pRPA-BL-238-konstrukció néven szerepel.
6. példa
Keresztezés beporzással
A Co-17-, 173- és 238-vonalakat beporzással kereszteztük, üvegházban:
a Co17-vonalat 238-vonallal kereszteztük, és a kapott PBD6-dohánynövényeket izoxaflutollal és bromoxinillel szembeni kettős toleranciára teszteltük („HPPD+OXY” növények), a Co17-vonalat 173-vonallal kereszteztük, és a kapott PBD6-dohánynövényeket izoxaflutollal és glifozáttal szembeni kettős toleranciára teszteltük („HPPD+EPSPS” növények).
A három vonal homozigóta a megfelelő génre, következésképp az utódok a keresztezéssel bejuttatott mindkét génre nézve hemizigóták.
A keresztezett növények hat hét múlva fejlődtek ki.
7. példa
Dohánynövények toleranciájának meghatározása kelést követően végzett izoxaflutolkezeléssel, és kelést követően végzett bromoxinil- vagy glifozátkezeléssel szemben
Ebben a kísérletben mindegyik tesztet 10 növényből álló mintán végeztünk el, és 10 növényt kezeletlenül hagytunk.
Valamennyi kezelést hektáronként 500 I permetezőelegy alkalmazásának megfelelő mennyiségű vegyszer permetezésével végeztük.
A kelést követően végzett kezelésekhez a magokat elvetettük, majd a növényeket 9 cmx9 cm cserepekbe ültettük.
A kezelést a kelést követően, jól fejlett (3-4 leveles) állapotban végeztük. A fent leírtak szerint kapott, vad típusú és géntechnológiai eljárással transzformált növényeket a következő csoportokra osztottuk:
a) kezeletlen csoport;
b) további csoportok, amelyeket csupán egyetlen herbiciddel kezeltünk, közelebbről, izoxaflutollal kezelt csoport, amelyet a kelést követően, a vegyszer két különböző dózisának (200 és 400 g/hektár) alkalmazásával kezeltünk;
bromoxinillel kezelt csoport, amelyet a kelést követően, a vegyszer két különböző dózisának (400 és 800 g/hektár) alkalmazásával kezeltünk;
glifozáttal kezelt csoport, amelyet a kelést követően, a vegyszer két különböző dózisának (800 és 1200 g/hektár) alkalmazásával kezeltünk;
c) további csoportok, amelyeket a kelést követően két herbiciddel kezeltünk, a herbicidek frissen készített elegyének alkalmazásával; közelebbről, izoxaflutol és bromoxinil elegyével kezelt csoport, amelyet a herbicidek két különböző dózisának (200 g/hektár izoxaflutol és 400 g/hektár bromoxinil; vagy 400 g/hektár izoxaflutol és 800 g/hektár bromoxinil) alkalmazásával kezeltünk;
izoxaflutol és glifozát elegyével kezelt csoport, amelyet a herbicidek két különböző dózisának (200 g/hektár izoxaflutol és 800 g/hektár glifozát; vagy 400 g/hektár izoxaflutol és 1200 g/hektár glifozát) alkalmazásával kezeltünk.
A kezeléseket a következő készítmények alkalmazásával végeztük: 75% izoxaflutol; bromoxinil (kereskedelemben hozzáférhető, PARDNER elnevezésű termék) oktanoát formában, 225 g/l koncentrációjú emulzifikálható koncentrátumként; és glifozát (RoundUp).
A fenti körülmények alkalmazása mellett, 17 nappal a kezelést követően, az alábbi táblázatban összegzett fitotoxicitást figyeltük meg, a károsodás százalékában kifejezve, a táblázatban jelöltük továbbá az egyes csoportokat alkotó növények számát és a herbicidek alkalmazott dózisát, „gramm aktív hatóanyag/hektár” egységben kifejezve.
HU 223 788 Β1
1. táblázat
Az alábbi táblázatban kelést követően alkalmazott izoxaflutolkezelés, és kelést követően alkalmazott bromoxinilvagy glifozátkezelés kombinációjának hatását szemléltetjük, a károsodás százalékában kifejezve
Herbicid (g/l) Toleranciagénnel transzformált növények
* HPPD+ OXY HPPD+EPSPS nem transzf.=vad típusú
Kontrollok 10 10 10
Csak 200 20 4% 20 2% 10 75%
izoxaflutol 400 20 5% 20 3% 85%
Csak 400 10 3% 10 0%
bromoxinil 800 10 0% 10 0%
Csak 800 20 0% 10 100%
glifozát 1200 20 0% 10 100%
Izoxaflutol + bromoxinil 200 400 20 20% 10 100%
Izoxaflutol + bromoxinil 400 800 20 30% 10 100%
Izoxaflutol + glifozát 200 800 40 5% 10 100%
Izoxaflutol + glifozát 400 1200 40 10% 10 100%
*: növények száma.
8. példa
Annak vizsgálatára, hogy a P. fluorescens HPPDgén alkalmazható-e markergénként valamely növényfaj „transzformációs-regenerációs” ciklusa során, dohánynövényeket a HPPD-gént és glifozátrezisztenciára kétszeresen is mutált EPSPS-gént magában foglaló kiméragénnel transzformáltunk; izoxaflutolra történő szelekcióval mind izoxaflutolra, mind glifozátra rezisztens transzformált növényeket kaptunk.
Kísérieteinkben az alábbi anyagokat és módszereket alkalmaztuk, és a következő eredményeket kaptuk
Az alábbiakban ismertetett, pRP-2012-vektorban található kiméragént PBD6 jelzésű ipari dohánynövénybe juttattuk, az EP 0 508 909 számú európai közzétételi iratban már ismertetett transzformációs és regenerációs eljárás szerint.
A pRP-2012-vektorban található kiméragén az alábbi, A-B-struktúrájú volt:
ahol A:
Kettős hiszton- promoter TEV OTP HPPD- kódoló szekven- cia Nos-ter- minátor
és B:
Kettős hiszton- promoter TEV OTP EPPPS- kódoló szekven- cia Nos-ter- minátor
az utóbbi struktúrája megegyezett a pRPARD-173-vektorban található kiméragén struktúrájával.
A pRP-2012-kiméragént dohánynövénybe juttattuk.
1. Transzformáció
A vektort a pTVK-291-kozmidot hordozó [Komari és munkatársai: (1986)] nem onkogén Agrobacterium EHA-101-törzsbe juttattuk [Hood és munkatársai: (1987)]. A Horsch és munkatársai eljárásán alapuló transzformációs eljárást alkalmaztunk (1985).
2. Regeneráció
A PBD6 jelzésű dohánynövények (SEITA, Franciaország) levélexplantátumokból történő regenerációját 30 g/l szacharózt, 350 mg/l cefotaximot és 1 mg/l izo40 xaflutolt tartalmazó „Murashige and Skoog (MS) alaptáptalajon végeztük. A levélexplantátumokat üvegházi növényekről vagy in vitro tenyésztett növényekről távolítottuk el, és azokat a levélkorong-technológiával transzformáltuk [Science 227, 1229 (1985)], három egymás követő lépésben: az első lépésben, 30 g/l szacharózzal kiegészített, 0,05 mg/l naftilecetsavat (ANA) és 2 mg/l benzil-aminopurit (BAP) tartalmazó MStáptalajon, 15 nap alatt csírák kifejlődését váltottuk ki. Az erre az időpontra kialakult zöld csírákat 30 g/l sza50 charózzal és 1 mg/l izoxaflutollal kiegészített, hormonokat nem tartalmazó MS-táptalajon tenyészve, 10 napig fejlődni hagytuk. A kifejlődött csírákat eltávolítottuk, és azokat az eredeti táptalajhoz képest feleannyi sót, vitamint és cukrot, valamint 1 mg/l izoxaflutolt tartalma55 zó, de hormonokat nem tartalmazó MS gyökereztető táptalajon tenyésztettük. Mintegy 15 nap elteltével a meggyökerezett csírákat talajba ültettük át.
A fenti eljárással kapott valamennyi növényt PCRmódszerrel analizáltuk, P. fluorescens HPPD-génre specifikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával.
HU 223 788 Β1
A PCR-eljárás alkalmazása lehetővé tette annak igazolását, hogy valamennyi fenti módon kapott növény valóban beépülve tartalmazta a HPPD-gént, és azok a 7. példában ismertetett körülmények alkalmazása mellett, toleránsak mind izoxaflutollal, mind glifozáttal szemben.
Következésképp, a fenti kísérlettel igazoltuk, hogy a HPPD-gén alkalmazható markergénként, és - a fenti génnel kombinálva - az izoxaflutol megfelelő szelekciós szer.
9. példa
A HPPD-gént és bar-gént egyaránt tartalmazó növények rezisztensek mind izoxaflutolra, mind foszfinotricinre
1. HPPD-szekvenciát tartalmazó kiméragént a következőképp állítottunk elő:
A 4. ábrán bemutatott pRPA-RD-1004-plazmidot úgy kaptuk, hogy az izoxaflutolrezisztenciát kódoló kiméragént a „New England Biolabs” által forgalmazott, 2686 bázispárból álló pUC19-plazmidba klónoztuk [Yannish-Perron C., Viera J. és Massing J.: Gene 33, 203 (1985)], amely plazmid ampicillinrezisztenciát kódoló szekvenciát tartalmaz.
A kiméragén, a transzláció irányával megegyező irányba haladva a következő elemeket tartalmazta:
a H3C4 jelzésű, 1020 bázispárból álló kukoricahisztonpromotert, amelynek leírását megtaláljuk az EP 0 507 698 számú európai közzétételi iratban;
a kukorica-alkohol-dehidrogenáz 1. gén 536 bázispárból álló intronját, amelyet Sachs M. és munkatársai ismertetnek [Genetics 113, 449 (1986)];
az EP 0 508 909 számú európai közzétételi iratban ismertetett optimalizált tranzitpeptidet (OTP); OTPszekvenciaként, egymást követően a következő elemeket tartalmazó szekvenciát alkalmaztunk: a Helianthus annuus ribulóz 1,5-biszfoszfát karboxiláz/oxigenáz kis alegységének tranzitpeptidje 171 bázispárból álló szekvenciáját [Waksman G. és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 15, 7181 (1987)], a Zea mays ribulóz 1,5biszfoszfát karboxiláz/oxigenáz [Lebrun és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 15, 4360 (1987)] kis alegységének érett formáját kódoló szekvencia 66 bázispárból álló részét; majd a Zea mays ribulóz 1,5-biszfoszfát karboxiláz/oxigenáz [Lebrun és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 15, 4360 (1987)] kis alegységének tranzitpeptidje 150 bázispárból álló szekvenciáját; a teljes szekvencia tehát összesen 387 bázispárt tett ki;
a Pseudomonas fluorescens HPPD-gén fent ismertetett kódolórégióját;
a nopalinszintetáz (nos)-gén terminátorát [a nosgén pTi-37-plazmidból izolált, 250 bázispárból álló poliadenilezési régióját (lásd Bevan és munkatársai: Nucleics Acids Rés. 11, 369)].
2. Foszfinotricintoleranciát kódoló (bar-gént tartalmazó) kiméragént a következőképp állítottunk elő:
A bar-gén által kódolt foszfinotricin-acetiltranszferáz („phosphinotricin acetyl transferase”; PAT) a foszfinotricinherbicid inaktiválására képes enzim. A PPT gátolja a glutamin szintézisét, és ammónia gyors felhalmozódásához vezet a sejtekben, végső soron azok pusztulását okozva [Tachibana és munkatársai: (1986)].
Foszfinotricin szelekciós szerként történő alkalmazásával szembeni tolerancia létrehozására szolgáló plazmidot oly módon állítottunk elő, hogy a pDM-302 jelzésű kiméragént a „Promega Corp.” által forgalmazott, 2462 bázispárból álló pSP72-vektorba inszertáltuk (Genbank/DDBJ adatbázis nyilvántartási szám: X65332), amely utóbbi ampicillinrezisztenciát kódoló gént tartalmaz. A 4700 bázispárból álló pDM-302-plazmidot Cao J. és munkatársai írták le [Plánt Cell Report 11, 586 (1992)].
A fenti plazmid a következő elemeket tartalmazza: a rizsaktingén promoterét, amely 840 bázispárból áll, és amelyet McElroy D. és munkatársai írtak le [Plánt Molecular Biology 15, 257 (1990)];
a rizsaktingén első exonját, amely 80 bázispárt tartalmazza;
a rizsaktingén első intronját, amely 450 bázispárból áll;
a bar-gén 600 bázispárból álló kódolórégióját, amelyet a plJ41404-plazmid hasításával nyertünk [White J. és munkatársai: Nuc. Acids Rés. 18, 1862 (1990)];
a nopalinszintetáz (nosj-gén terminátorát [a nosgén pTi-37-plazmidból izolált, 250 bázispárból álló poliadenilezési régióját (lásd Bevan és munkatársai: Nucleics Acids Rés. 11, 369)].
3. Transzformáció
A genetikai konstrukciót bombázásos technológiával juttattuk a sejtekbe.
A plazmidokat Qiagen-oszlopon tisztítottuk, és volfrám-M10-részecskékre precipitáltuk, Klein eljárása szerint [Natúré 327, 70 (1987)].
Fémrészecskék és a fenti két plazmid elegyével embriogén kukoricasejteket bombáztunk.
4. Regeneráció és a bar-gén alkalmazása szelekciós génként
A bombázott kalluszokat glufozináttartalmú táptalajon szelektáltuk, amíg zöld szektorok jelentek meg. A pozitív kalluszokat szomatikus embriókká hagytuk fejlődni, és csíraképződést elősegítő körülmények közé helyeztük. A fiatal növényeket üvegházba vittük át, hogy azok ott magokat teremjenek.
A fenti növényeken végzett molekuláris analízisek szerint:
legalább 4, foszfinotricintartalmú táptalajon szelektált kalluszból olyan növény keletkezett, amely PCReljárás szerint tartalmazta a HPPD-gént;
legalább 5, foszfinotricintartalmú táptalajon szelektált kalluszból olyan növény keletkezett, amely Southern-blot szerint tartalmazta a HPPD-gént;
legalább 5, foszfinotricintartalmú táptalajon szelektált kalluszból olyan növény keletkezett, amelyben Western-blot-eljárással kimutattuk a rekombináns protein jelenlétét.
A HPPD-kiméragén és a heterológ protein a nem transzformált kalluszokban nem volt kimutatható.
Eredményeink szerint a őar-kiméragén hatékonyan alkalmazható egyéb mezőgazdasági jelentőséggel bíró gént tartalmazó transzformált kalluszok szelekciójára.
HU 223 788 Β1
5. A transzformált növények utódainak analízise A fenti módon kapott transzformált növények virágport (pollent) termeltek, amelyről feltételeztük, hogy részben transzgenikus, és azzal nem transzgenikus vad típusú kukorica-magkezdeményeket termékenyí- 5 tettünk. A kapott magokat izoxaflutollal történő kezelést követően homokon szelektáltuk.
A következő szelekciós eljárást alkalmaztuk:
800 ml Fontainebleau-homokot töltöttünk 15*20 cm oldalhosszúságú ládákba. Ezeket a ládákat vízzel per- 10 meteztük, és hidratált állapotban tartottuk, úgy, hogy azokat 1 liter vízre számítva 5 ml Quinoligót (Quinolone) tartalmazó tápoldattal láttuk el. Húsz-húsz kukoricamagot helyeztünk az egyes ládákba, amelyeket ezután izoxaflutollal kezeltünk, oly módon, hogy azokat hektáronként 100-200 g aktív hatóanyag alkalmazásának megfelelő mennyiségű herbiciddel permeteztük (azaz ládánként 300 vagy 600 pg aktív hatóanyagot alkalmaztunk). Ezt követően a ládákat üvegházba telepítettük át.
Eredményeinket az alábbi, 2. táblázatban összegeztük.
2. táblázat
A HPPD-gén alkalmazása rezisztens kukoricanövények szelekciójára
Genotípus Izoxaflutol (g/hektár) Elvetett magok száma Kicsírázott magok száma Elhalt növények száma Túlélő növények száma
Nem transzgenikus 0 20 20 0 20
100 20 20 20 o
261 2B 459 100 10 10 5 5
200 10 9 4 5
261 2D2 100 10 9 6 3
200 10 10 7 3
261 2A2 100 10 5 3 2
200 10 7 7 0
A fenti eredmények szerint, a HPPD-gén hatékonyan alkalmazható rezisztens kukoricanövények szelekciójára. Az adatokból kitűnik továbbá, hogy a Pseudomonas HPPD-gén nagy mennyiségben történő expressziója kukoricaszövetekben toleranciát hoz létre izoxaflutollal szemben.
Leírásunkhoz az alábbi szekvenciákat csatoltuk:
1. azonosító számú szekvencia:
P. fluorescens Α-32-törzs HPPD-génjének szekvenciája
2. azonosító számú szekvencia:
Az Arabidopsis thaliana EPSPS-cDNS-szekvenciája.
3. és 4. azonosító számú szekvenciák:
A mutáns kukorica EPSPS-gén- és EPSPS-protein-szekvenciája, a pRPA-ML-716-klón 1340 bp részlete.
5. és 6. azonosító számú szekvenciák:
A mutáns kukorica EPSPS-gén- és EPSPS-proteinszekvenciája, a pRPA-ML-720-klón 1340 bp részlete.
A találmány szerinti megoldást a pontosabb értelmezhetőség kedvéért az alábbi ábrákon keresztül kívánjuk szemléltetni:
Az 1. ábrán a Pseudomonas sp. P. J. 874-törzs HPPD-protein-szekvenciáját és a megfelelő kódolórész következtetett nukleotidszekvenciáját mutatjuk be; csillaggal jelöltük a fenti kódolórégió fragmentumainak amplifikálására felhasznált öt oligonukleotid pozícióját.
A 2. ábrán a P. fluorescens Α-32-törzs HPPD-génjét tartalmazó 7 kb nagyságú genomi eredetű DNSfragmentumot hordozó plazmid térképét mutatjuk be.
A 3. ábrán a P. fluorescens Α-32-törzsből és a Pseudomonas sp. P. J. 874-törzsből származó HPPD aminosavszekvenciáját hasonlítottuk össze (csak a két szekvenciában eltérő aminosavakat jelöltük), megadtuk továbbá a konszenzusszekvenciát.

Claims (35)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Kimérakonstrukció, amely legalább kétalapkiméragént tartalmaz, amelyek mindegyike a gén nővé- 55 nyékben végbemenő transzkripciójához szükséges szabályozóelemeket, valamint növényekben herbiciddel szembeni toleranciát létrehozó enzimet kódolószekvenciát tartalmaz, és a kódolószekvenciák egyike hidroxi-fenil-piruvát-dioxigenázt (HPPD-t) kódol. 60
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti kimérakonstrukció, amely egy harmadik kiméragént is tartalmaz, amely növényekben herbicidtoleranciát létrehozó enzimet kódoló szekvenciát tartalmaz.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti kimérakonstrukció, amely második kódolószekvenciaként Klebsiella faj nitrilázgénből származó szekvenciát
    HU 223 788 Β1 tartalmaz, amely a dihalo-hidroxi-benzonitril herbicidcsaláddal szembeni toleranciát hoz létre.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti kimérakonstrukció, amely bromoxinilherbiciddel szembeni toleranciát kódol.
  5. 5. A 3. igénypont szerinti kimérakonstrukció, amely ioxinilherbiciddel szembeni toleranciát kódol.
  6. 6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti kimérakonstrukció, amely második kódolószekvenciaként glifozáttoleranciát kódoló szekvenciát tartalmaz.
  7. 7. A 1. vagy 2. igénypont szerinti kimérakonstrukció, amely második kódolószekvenciaként 5-enolpiruvilsikimát-3-foszfát-szintázt (EPSPS-enzimet) kódoló szekvenciát tartalmaz, amely EPSPS-gátló herbiciddel szembeni toleranciát hoz létre.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti kimérakonstrukció, amely második kódolószekvenciaként EPSPS-enzimet kódoló szekvenciát tartalmaz, amely glifozáttoleranciát hoz létre.
  9. 9. A 6. igénypont szerinti kimérakonstrukció, amely második kódolószekvenciaként glifozát-oxidoreduktázt kódoló szekvenciát tartalmaz, amely a glifozát detoxifikálását végző enzim.
  10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti kimérakonstrukció, amely HPPD-kódoló szekvenciaként Pseudomonas fajból származó szekvenciát tartalmaz.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti kimérakonstrukció, amely HPPD-kódoló szekvenciaként Pseudomonas fluorescensbő\ származó szekvenciát tartalmaz.
  12. 12. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti kimérakonstrukció, amely HPPD-kódoló szekvenciaként növényi eredetű szekvenciát tartalmaz.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti kimérakonstrukció, amely HPPD-kódoló szekvenciaként Arabidopsis thaliana eredetű szekvenciát tartalmaz.
  14. 14. A 12. igénypont szerinti kimérakonstrukció, amely HPPD-kódoló szekvenciaként Daucus carotaeredetű szekvenciát tartalmaz.
  15. 15. Vektor, amely az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti kimérakonstrukciót tartalmaz.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti vektor, amely plazmid.
  17. 17. Növényi sejt, amely legalább két alapkiméragént tartalmaz, amelyek mindegyike növényekben herbiciddel szembeni toleranciát létrehozó enzimet kódoló szekvenciát foglal magában, és a kódolószekvenciák egyike hidroxi-fenil-piruvát-dioxigenáz (HPPD)inhibitorral szembeni toleranciát kódol.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti növényi sejt, amely három alapkiméragént tartalmaz, amelyek mindegyike szabályozóelemeket, valamint növényekben herbiciddel szembeni toleranciát létrehozó enzimet kódoló szekvenciát tartalmaz.
  19. 19. A 17. vagy 18. igénypontok bármelyike szerinti növényi sejt, amely legalább egy, 1-14. igénypontok bármelyike szerinti kimérakonstrukciót tartalmaz.
  20. 20. Növény, amely a 17-19. igénypontok bármelyike szerinti növényi sejtet tartalmaz.
  21. 21. Eljárás növény transzformálására, a növényben legalább két herbiciddel szembeni tolerancia létrehozása céljából, azzal jellemezve, hogy növényi sejtbe az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti kimérakonstrukciót inszertálunk, és a transzformált sejteket regeneráljuk.
  22. 22. Eljárás a 20. igénypont szerinti, több herbiciddel szemben toleráns növény előállítására, azzal jellemezve, hogy:
    első lépésben, az alapgéneket külön-külön sejtekbe juttatjuk, amely gének azok növényekben történő transzkripciójához szükséges szabályozóelemeket, valamint növényekben herbicidtoleranciát létrehozó enzimet kódoló szekvenciát tartalmaznak; majd a növényeket keresztezzük, és így több herbiciddel szemben toleráns növényt kapunk.
  23. 23. Eljárás a 20. igénypont szerinti növény herbicidkezelésére, azzal jellemezve, hogy a kezelést legalább két herbicid alkalmazásával végezzük.
  24. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelést három herbicid alkalmazásával végezzük.
  25. 25. A 23-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyik herbicidként HPPDinhibitort alkalmazunk.
  26. 26. A 23-25. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mindkét herbicidet egyszerre alkalmazzuk.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mindkét herbicidet egyetlen, azonnal felhasználható készítmény formájában alkalmazzuk.
  28. 28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mindkét herbicidet frissen készített elegy formájában alkalmazzuk.
  29. 29. A 23-25. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a két herbicidet egymást követően alkalmazzuk.
  30. 30. A 23-29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HPPD-gátló herbicidként izoxaflutolt alkalmazunk.
  31. 31. A 23-29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HPPD-gátló herbicidként szulkotriont alkalmazunk.
  32. 32. A 23-31. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dihalo-hidroxi-benzonitrilcsaládba tartozó herbicidet alkalmazunk.
  33. 33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy bromoxinilt és ionixinilt tartalmazó csoportba tartozó herbicidet alkalmazunk.
  34. 34. A 23-31. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második herbicidként EPSPS-inhibitort alkalmazunk.
  35. 35. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy EPSPS-inhibitorként glifozátot vagy szulfozátot alkalmazunk.
HU9903774A 1996-07-16 1997-07-10 Több herbicidtolerancia-gént tartalmazó kiméragének, több herbiciddel szemben toleráns növényi sejtek és növények HU223788B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9609137A FR2751347B1 (fr) 1996-07-16 1996-07-16 Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides
PCT/FR1997/001256 WO1998002562A2 (fr) 1996-07-16 1997-07-10 Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9903774A2 HUP9903774A2 (hu) 2000-03-28
HUP9903774A3 HUP9903774A3 (en) 2000-04-28
HU223788B1 true HU223788B1 (hu) 2005-01-28

Family

ID=9494283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9903774A HU223788B1 (hu) 1996-07-16 1997-07-10 Több herbicidtolerancia-gént tartalmazó kiméragének, több herbiciddel szemben toleráns növényi sejtek és növények

Country Status (20)

Country Link
US (5) US7250561B1 (hu)
EP (1) EP0937154A2 (hu)
JP (1) JP2000517166A (hu)
KR (1) KR20000023830A (hu)
CN (1) CN1154741C (hu)
AR (1) AR007884A1 (hu)
AU (1) AU734878B2 (hu)
BR (2) BR9710340B1 (hu)
CA (1) CA2261094C (hu)
CO (1) CO4770898A1 (hu)
CU (1) CU22809A3 (hu)
CZ (1) CZ11399A3 (hu)
EA (2) EA002980B1 (hu)
FR (1) FR2751347B1 (hu)
HU (1) HU223788B1 (hu)
NZ (1) NZ334188A (hu)
PL (1) PL190393B1 (hu)
TR (1) TR199900117T2 (hu)
WO (1) WO1998002562A2 (hu)
ZA (1) ZA976296B (hu)

Families Citing this family (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2736926B1 (fr) * 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
WO1998020144A2 (en) * 1996-11-07 1998-05-14 Zeneca Limited Herbicide resistant plants
US7235716B2 (en) 1997-06-03 2007-06-26 Chromatin, Inc. Plant centromere compositions
US7193128B2 (en) 1997-06-03 2007-03-20 Chromatin, Inc. Methods for generating or increasing revenues from crops
US7227057B2 (en) 1997-06-03 2007-06-05 Chromatin, Inc. Plant centromere compositions
US6900012B1 (en) 1997-06-03 2005-05-31 The University Of Chicago Plant artificial chromosome compositions and methods
US7119250B2 (en) 1997-06-03 2006-10-10 The University Of Chicago Plant centromere compositions
WO1999005265A2 (en) * 1997-07-23 1999-02-04 Sanford Scientific, Inc. Improved plastid transformation of higher plants and production of transgenic plants with herbicide resistance
US7161064B2 (en) 1997-08-12 2007-01-09 North Carolina State University Method for producing stably transformed duckweed using microprojectile bombardment
US6069115A (en) * 1997-11-12 2000-05-30 Rhone-Poulenc Agrochimie Method of controlling weeds in transgenic crops
FR2771104B1 (fr) * 1997-11-17 2000-12-08 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere ayant un promoteur lumiere dependant conferant la tolerance aux inhibiteurs del'hppd
JP4788011B2 (ja) * 1998-04-30 2011-10-05 住友化学株式会社 雑草防除剤耐性の付与方法
BR9912745A (pt) 1998-08-04 2001-11-06 Cargill Inc Promotores da desnaturase de ácido graxo de plantas
DE19836673A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Zuckerrübenkulturen
FR2785148B1 (fr) * 1998-11-02 2000-12-15 Rhone Poulenc Agrochimie Nouvelles compositions herbicide a base de glyphosate et d'isoxazoles
JP4570706B2 (ja) * 1999-03-09 2010-10-27 バイエルクロップサイエンス株式会社 水田雑草の防除方法
US7989202B1 (en) 1999-03-18 2011-08-02 The University Of Chicago Plant centromere compositions
JP4821038B2 (ja) * 1999-10-29 2011-11-24 住友化学株式会社 除草剤耐性植物
AU2000274256A1 (en) * 2000-09-08 2002-03-22 Bayer Cropscience S.A. Hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase fused with a signal peptide, DNA sequence and use for obtaining plants containing herbicide-tolerant plants
CA2434059C (en) 2001-02-22 2011-05-24 Rhobio Constitutive promoter from arabidopsis
RU2004106631A (ru) 2001-08-09 2005-05-10 Нортвест Плант Бридинг Компани (Us) Растения пшеницы с повышенной устойчивостью к имидозалиновым гербицидам
MXPA06009225A (es) 2004-02-23 2007-03-08 Chromatin Inc Plantas modificadas con mini-cromosomas.
UY28769A1 (es) 2004-03-30 2005-09-30 Monsanto Technology Llc Métodos para controlar agentes patógenos en plantas usando n-fosfonometilglicina
MXPA06012634A (es) * 2004-04-30 2007-02-08 Dow Agrosciences Llc Nuevos genes con resistencia a los herbicidas.
EP1929019A2 (en) 2005-09-08 2008-06-11 Chromatin, Inc. Plants modified with mini-chromosomes
NZ567807A (en) 2005-10-28 2011-09-30 Dow Agrosciences Llc Novel herbicide (2,4-D and pyridyloxyacetate) resistance genes with aryloxyalkanoage dioxygenase activity
NZ704098A (en) * 2006-01-12 2015-02-27 Incima Ipco B V Epsps mutants
US20100257621A1 (en) * 2006-10-03 2010-10-07 Monsanto Technology Llc Methods for Hybrid Corn Seed Production and Compositions Produced Therefrom
HUE031454T2 (hu) * 2006-12-07 2017-07-28 Dow Agrosciences Llc Új szelektálható markergének
US8614089B2 (en) 2007-03-15 2013-12-24 Chromatin, Inc. Centromere sequences and minichromosomes
EP2164320A4 (en) * 2007-05-30 2010-08-11 Syngenta Participations Ag CYCTOCHROM P450 GENES TRANSFERRING HERBICIDE RESISTANCE
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
WO2009134966A1 (en) * 2008-05-02 2009-11-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Chemical selection of resistant gametes of plants in the field
CN102118966A (zh) * 2008-06-11 2011-07-06 陶氏益农公司 表达除草剂耐受基因的构建体、相关植物和相关的性状组合
GB0816880D0 (en) * 2008-09-15 2008-10-22 Syngenta Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US10555527B2 (en) * 2009-05-18 2020-02-11 Monsanto Technology Llc Use of glyphosate for disease suppression and yield enhancement in soybean
US9096909B2 (en) 2009-07-23 2015-08-04 Chromatin, Inc. Sorghum centromere sequences and minichromosomes
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
UY33050A (es) 2009-11-23 2011-06-30 Bayer Bioscience Nv Evento elite ee-gm3 y métodos y conjuntos de elementos para identificar dicho evento en muestras biológicas
JP2013511294A (ja) 2009-11-23 2013-04-04 バイエル・クロップサイエンス・エヌ・ヴェー 除草剤耐性植物及びそれを識別するための方法
TW201142029A (en) 2009-11-24 2011-12-01 Univ Leuven Kath Banana promoters
WO2011076889A1 (en) * 2009-12-23 2011-06-30 Bayer Cropscience Ag Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides
EP2516630B1 (en) * 2009-12-23 2017-11-15 Bayer Intellectual Property GmbH Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides
BR112012015706A2 (pt) * 2009-12-23 2015-09-01 Bayer Ip Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inibidores de hppd
WO2011076885A1 (en) * 2009-12-23 2011-06-30 Bayer Cropscience Ag Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides
ES2668198T3 (es) * 2009-12-23 2018-05-17 Bayer Intellectual Property Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de HPPD
JP2010070578A (ja) * 2010-01-05 2010-04-02 Rhone Poulenc Yuka Agro Kk 水田雑草の防除方法
SG183407A1 (en) 2010-03-08 2012-09-27 Monsanto Technology Llc Polynucleotide molecules for gene regulation in plants
US9187762B2 (en) 2010-08-13 2015-11-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods comprising sequences having hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) activity
WO2012048221A1 (en) * 2010-10-08 2012-04-12 Fraunhofer Usa Inc. Closterovirus-based nucleic acid molecules and uses thereof
CN103562392B (zh) * 2010-12-03 2016-07-20 Ms技术有限责任公司 植物细胞中草甘膦抗性编码核酸分子的优化表达
BR122019027736B1 (pt) * 2010-12-28 2021-04-27 Incorporated Administrative Agency, National Agriculture And Food Research Organization Vetor e processo para a produção de uma planta
WO2013040116A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
MX350774B (es) 2011-09-13 2017-09-15 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para el control de malezas.
AU2012308818B2 (en) 2011-09-13 2018-06-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
CN103957696B (zh) 2011-09-13 2019-01-18 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CA2848576A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control comprising topical application of 4-hydroxyphenyl-pyruvate-dioxygenase (hppd)-inhibiting polynucleotides
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
EP2756086B1 (en) 2011-09-13 2018-02-21 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
EP2755987B1 (en) 2011-09-13 2018-06-06 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
WO2013040049A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
US9499831B2 (en) 2012-01-17 2016-11-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transcription factors, promoters and uses thereof
AR090418A1 (es) * 2012-02-01 2014-11-12 Dow Agrosciences Llc Peptido de transito al cloroplasto
CN104703998B (zh) 2012-03-13 2020-08-21 先锋国际良种公司 植物中雄性育性的遗传减少
WO2013138309A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
CA2873828A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 A.B. Seeds Ltd. Naked dsrna for silencing target molecules in plant seeds
BR112014031260A2 (pt) 2012-06-15 2019-08-20 Du Pont métodos e composições que envolvem variantes de als com preferência de substrato nativo
US10041087B2 (en) * 2012-06-19 2018-08-07 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
AR091489A1 (es) 2012-06-19 2015-02-11 Basf Se Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo)
KR20150070148A (ko) * 2012-09-14 2015-06-24 바이엘 크롭사이언스 엘피 Hppd 변이체들 및 사용 방법들
CN104870647A (zh) 2012-10-18 2015-08-26 孟山都技术公司 用于植物害虫控制的方法和组合物
EA032406B1 (ru) 2013-01-01 2019-05-31 Эй.Би. СИДЗ ЛТД. СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ дсРНК В СЕМЕНА РАСТЕНИЙ ДЛЯ МОДУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
US9789511B2 (en) * 2013-03-12 2017-10-17 Nordson Corporation Jetting devices
CA2905104A1 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Monsanto Technology Llc Control of lolium species by topical application of herbicidal composition comprising dsrna
WO2014164761A1 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
CA2903693A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize stress related transcription factor 18 and uses thereof
US20140283216A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Pioneer Hi Bred International Inc Compositions and methods of use of acc oxidase polynucleotides and polypeptides
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CA2918387C (en) 2013-07-19 2021-11-02 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling leptinotarsa
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
MX2016005778A (es) 2013-11-04 2016-12-20 Monsanto Technology Llc Composiciones y metodos para controlar infestaciones de plagas y parasitos de los artropodos.
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
AU2015206585A1 (en) 2014-01-15 2016-07-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control using EPSPS polynucleotides
CA2937514C (en) 2014-01-31 2021-09-21 AgBiome, Inc. Compositions and methods of use comprising the biocontrol agent deposited as nrrl n0. b-50897
CN110506752B (zh) 2014-04-01 2022-02-18 孟山都技术公司 用于控制虫害的组合物和方法
CN106795515B (zh) 2014-06-23 2021-06-08 孟山都技术公司 用于经由rna干扰调控基因表达的组合物和方法
US11807857B2 (en) 2014-06-25 2023-11-07 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
AU2015296700B2 (en) 2014-07-29 2021-10-21 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
UA124255C2 (uk) 2015-01-22 2021-08-18 Монсанто Текнолоджі Елелсі Інсектицидна композиція та спосіб боротьби з leptinotarsa
AU2016270870A1 (en) 2015-06-02 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
WO2016196782A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
EP4268594A3 (en) 2016-06-24 2024-02-07 Agbiome, Inc. Methods and compositions for spray drying gram-negative bacteria
WO2019023226A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 AgBiome, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING PLANT HEALTH AND CONTROL OF PLANT DISEASES AND PLANT PESTS
WO2019074813A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 AgBiome, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING PLANT HEALTH AND CONTROL OF PLANT DISEASES AND PLANT PESTS
CA3026528A1 (en) * 2017-12-15 2019-06-15 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for ppo herbicide tolerance
WO2019241370A1 (en) 2018-06-12 2019-12-19 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
WO2020006555A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 AgBiome, Inc. Compositions comprising bacteria and methods for controlling plant pests and improving plant health
CN113163771B (zh) 2018-10-10 2023-01-31 农业生物群落股份有限公司 用于防治植物有害生物和改善植物健康的组合物和方法
BR112021008376A2 (pt) 2018-10-30 2021-08-03 AgBiome, Inc. composições e métodos para controlar pragas de plantas e melhorar a saúde das plantas
WO2020232103A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 AgBiome, Inc. Dried biological control agents and their uses
US20220312774A1 (en) 2019-06-07 2022-10-06 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
WO2022225925A1 (en) 2021-04-19 2022-10-27 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
WO2022245786A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
WO2023211979A2 (en) 2022-04-26 2023-11-02 AgBiome, Inc. Use of bacterial strains to solubilize phosphorus for agriculture
WO2024026305A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 AgBiome, Inc. Compositions and methods based on pseudomonas chlororaphis for improving plant health and controlling plant disease

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
DK175922B1 (da) 1985-08-07 2005-07-04 Monsanto Technology Llc Glyphosat-resistente planter
FR2591069B1 (fr) * 1985-12-09 1988-03-18 Produits Ind Cie Fse Produits herbicides a base d'esters de bromoxynil et/ou d'ioxynil
US7705215B1 (en) * 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
HU214927B (hu) * 1989-08-10 1998-07-28 Plant Genetic Systems N.V. Eljárás módosított virággal rendelkező növények előállítására
EP0536330B1 (en) * 1990-06-25 2002-02-27 Monsanto Technology LLC Glyphosate tolerant plants
CA2088661C (en) * 1990-08-31 2001-12-18 Gerard F. Barry Glyphosate tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
FR2673643B1 (fr) 1991-03-05 1993-05-21 Rhone Poulenc Agrochimie Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide.
FR2673642B1 (fr) 1991-03-05 1994-08-12 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere comprenant un promoteur capable de conferer a une plante une tolerance accrue au glyphosate.
DE59209747D1 (de) * 1991-03-12 1999-10-21 Hoechst Ag Gegen herbizide vom aryloxy-phenoxy-alkancarbonsäuretyp resistenter maiszellen und verfahren zur herstellung herbizidresistenter maiszelllinien
GB9218664D0 (en) * 1992-09-03 1992-10-21 Rhone Poulenc Agrochimie Herbicidal compositions
CA2146113A1 (en) * 1992-10-15 1994-10-15 Adrianus Johannes Van Tunen Genetic moderation of restoration or plant phenotypes
DE4305696A1 (de) 1993-02-25 1994-09-01 Hoechst Ag Nachweisverfahren zur Identifizierung von Inhibitoren
US5530187A (en) 1993-07-16 1996-06-25 The Salk Institute For Biological Studies Transgenic plants containing multiple disease resistance genes
US5491076A (en) * 1993-11-01 1996-02-13 The Texas A&M University System Expression of foreign genes using a replicating polyprotein producing virus vector
FR2712302B1 (fr) 1993-11-10 1996-01-05 Rhone Poulenc Agrochimie Eléments promoteurs de gènes chimères de tubuline alpha.
GB9515941D0 (en) * 1995-08-03 1995-10-04 Zeneca Ltd DNA constructs
FR2734842B1 (fr) 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
CA2262002A1 (en) * 1996-07-25 1998-02-05 American Cyanamid Company Hppd gene and inhibitors
US6245968B1 (en) 1997-11-07 2001-06-12 Aventis Cropscience S.A. Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, DNA sequence and isolation of plants which contain such a gene and which are tolerant to herbicides
US6069115A (en) * 1997-11-12 2000-05-30 Rhone-Poulenc Agrochimie Method of controlling weeds in transgenic crops

Also Published As

Publication number Publication date
US20080028481A1 (en) 2008-01-31
WO1998002562A3 (fr) 1998-04-30
WO1998002562A2 (fr) 1998-01-22
EP0937154A2 (fr) 1999-08-25
US7250561B1 (en) 2007-07-31
CZ11399A3 (cs) 1999-05-12
AU734878B2 (en) 2001-06-21
PL331165A1 (en) 1999-06-21
CA2261094A1 (fr) 1998-01-22
BR9710340A (pt) 1999-08-17
NZ334188A (en) 2000-09-29
EA003140B1 (ru) 2003-02-27
TR199900117T2 (xx) 1999-03-22
CA2261094C (fr) 2005-06-28
ZA976296B (en) 1998-08-19
US20100029481A1 (en) 2010-02-04
BRPI9710340B8 (pt) 2018-02-27
JP2000517166A (ja) 2000-12-26
CU22809A3 (es) 2002-12-19
CO4770898A1 (es) 1999-04-30
EA002980B1 (ru) 2002-12-26
CN1230996A (zh) 1999-10-06
BR9710340B1 (pt) 2009-12-01
HUP9903774A2 (hu) 2000-03-28
US7935869B2 (en) 2011-05-03
AU3625997A (en) 1998-02-09
US20120005769A1 (en) 2012-01-05
FR2751347B1 (fr) 2001-12-07
FR2751347A1 (fr) 1998-01-23
PL190393B1 (pl) 2005-12-30
AR007884A1 (es) 1999-11-24
HUP9903774A3 (en) 2000-04-28
US20130157854A1 (en) 2013-06-20
EA199900116A1 (ru) 1999-08-26
CN1154741C (zh) 2004-06-23
EA200001219A1 (ru) 2001-06-25
KR20000023830A (ko) 2000-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU223788B1 (hu) Több herbicidtolerancia-gént tartalmazó kiméragének, több herbiciddel szemben toleráns növényi sejtek és növények
JP3961566B2 (ja) 植物の形質転換に用い得るキメラ遺伝子中で調節成分として作用し得る単離されたｄｎａ配列
EP0828837B1 (fr) Gene chimere comprenant une sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
KR100388121B1 (ko) 식물의형질전환에사용될수있는키메라유전자내의터미네이터부위로서작용할수있는분리된dna서열
JP4691733B2 (ja) 変異５−エノールピリビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ、この蛋白質をコードする遺伝子及びこの遺伝子を有する形質転換植物
US7112665B1 (en) Genetically engineered plant cells and plants exhibiting resistance to glutamine synthetase inhibitors, DNA fragments and recombinants for use in the production of said cells and plants
US5188642A (en) Glyphosate-resistant plants
KR100233191B1 (ko) 식물의 형질 전환용 키메라 유전자
WO2004055191A1 (en) Expression of hydroxyphenylpyruvate dioxygenase in plastids of plants for herbicide tolerance
SK88599A3 (en) Glyphosate resistant transgenic plants
JP4365025B2 (ja) コメアクチンの第１のイントロンに結合したトウモロコシｈ３ｃ４プロモーター、前記プロモーターを含むキメラ遺伝子及び形質転換植物
MXPA99000639A (en) Chemical gene for various genes of herbicide tolerance, cell vegetable plants tolerantesa various herbici
AU760662B2 (en) DNA sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20041213

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees