CN1230996A - 含有几个除草剂耐受性基因的嵌合基因、对几种除草剂具耐受性的植物细胞及植物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及:1.具有几种除草剂抗性基因的嵌合基因、对多种除草剂具抗性的植物细胞和植物,2.该植物同时对几种除草剂具抗性,尤其对HPPD抑制剂和EPSPS抑制剂和/或双卤代羟苄腈具抗性,3.其在用几种除草剂去除杂草中的应用。
Description
本发明的目的是含有几个除草剂耐受性基因的嵌合基因、对几种除草剂具耐受性的植物细胞及植物。
在后面的描述中，除草剂将以英国作物保护协会的“杀虫剂手册”第10版的普通名称来命名。
通过编码除降解那些除草剂或对EPSPS-抑制性草剂具耐受性，尤其是对草甘膦、Sulfosate或fosametine具耐受性或对磺酰脲型的乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase(ALS))抑制剂或对dihydropteroate合成酶抑制剂例如黄草灵或对谷氨酰胺合成酶抑制剂例如glufosinate具耐受性的腈酶(nitrilase)的基因，已知转化植物能对特定的除草剂具耐受性，例如对尤其是二卤羟基苄腈，特别是溴苯腈(bromoxynil)和碘苯腈(ioxynil)且有耐受性。
有一些除草剂是已知的，例如，尤其是在法国专利申请9506800和9513570所述的异噁唑，以及特别是精选用于玉米的isoxaflutole，例如欧洲专利申请0496630,0496631中所述的二酮腈(diketonitrile)，尤其是2-氰-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1,3-二酮及2-氰-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮，欧洲申请0625505和0625508中所述的三酮，尤其是美国专利申请5506195所述的sulcotrione，或者Pyrazolinates。而且，对后部分杀草剂具有耐受性的编码HPPD的基因及用含该基因的转基因植株已经得到并具有显著的耐受性，而且是未发表的法国申请号95/06800,95/13570及96/05944的主题。
但是，在农业实践中表明农民喜欢结合多种除草剂来处理植物，尤其是作物，在面对由于除草剂单独使用时除草的范围限制问题时尤其如此。此外，将可选择的标记基因与除草剂耐受性基因结合可能是有好处的。因此有必要使植物尤其作物能对几种除草剂具有耐受性，优选至少两或三种。
现在发现已有可能使植物或植物细胞对多种杀虫剂具耐受性。
本发明的目的首先是一个嵌合基因，该基因包括至少两个基本嵌合基因，这两个嵌合基因中的每一个都在其转录方向上含有在植物中对其转录必需的调控元件，也就是说至少有一个调节启动子序列，至少一个由编码使植物对除草剂具耐受性的酶的编码序列组成的外源编码部分，以及至少一个调节终止子序列或一个多聚腺苷酸序列。
可以使用那些特别已知是使植物对某些抑制剂具耐受性的编码序列，例如：
对草甘膦、Sulfosate或fosametin有抗性，尤其是对突变或未突变的蛋白质有抗性的EPSPS，可能在某些专利中已有提及：
-美国专利4535060，欧洲专利115673，美国专利4796061，美国专利5094945；美国专利4971908，美国专利5145783，欧洲专利293358；欧洲专利378985,WO91/04323；WO92044449；WO9206201。在下述内容中，这种类型的基因将通过序列或基因“EPSPS”命名。可能提及的还有草甘膦氧化还原酶(参见WO92/000377)，一个对草甘膦产生脱毒作用的酶。
-美国专利4810648中所描述的克雷白氏杆菌尤其是衍生自鼻臭克雷白氏杆菌的对二卤苄腈有耐受性的腈酶的基因，在文中将以“OXY”基因或序列命名。
-上面所引用的未公开法国公开号95/06800、95/13570和96/05944中所描述的HPPD。HPPD可以是任何类型的。
尤其是，此序列可以来源于任何细菌，例如特别是假单胞菌属或来源于植物，例如尤其是单子叶或双子叶植物，特别是拟南芥或伞形科植物例如胡萝卜(Daucus Carota)、它可以是天然或野生型序列或可以是突变的，只要它基本上保持了对HPPD抑制剂的除草剂耐受性特点即可，例如异噁唑类或三酮类或吡唑啉酯类(pyrazolinate)的除草剂。
也可使用其它的序列：
-产生对glufosinate耐受性的phosphinotricyine乙酰转移酶或谷氨酰胺合成酶的基因(参见欧洲专利EP0242236)；
-产生对草黄灵耐受性的dihydropteroate合成酶的基因(参见EP0369367)；
-产生对磺酰脲具耐受性的ALS的基因；
-产生对二苯基醚例如氟锁草醚(acifluorfen)或乙氧醚(oxyfluorfen)的耐受性的protoporphyrogen(“protox”)氧化酶的基因，或噁二唑例如oxadiazon或oxadiargyl或环酰亚胺例如chlorophthalim或苯基吡唑(phenylpyrrazole)例如TNP或哌啶及phenopylates及氨基甲酸酯类似物的基因(参见WO95/34659)。
优选地，某一个嵌合基因含有HPPD编码序列。在这种情况下，其它序列可以是任何类型的而且可以是特别是从上述组中选出。优选地，其它的序列从包括对二卤羟基苄腈具耐受性的腈酶基因和EPSPS基因的组中选出。
根据本发明的方法，嵌合基因还含有编码除除草剂耐受性之外的其它特性的基因，例如，抗虫基因，例如赋予对鞘翅目和鳞翅目代表性种类抗性的苏云金杆菌型的基因，或对线虫具抗性的基因，对真菌和微生物疾病有抗性的基因，或者农业特性基因例如脂肪酸生产中的各种脱氢酶。尤其是在国际申请WO93/06712中提到的Δ-6脱氢酶。
对于调控启动子序列、可使用植物中天然表达的基因的任何启动子序列，尤其是细菌性的启动子，例如核酮糖二磷酸羧化/加氢酶(RuBisCo)小亚基的基因或α-微管蛋白(欧洲申请EP No.0652286)基因，或植物病毒的基因，例如来自于花椰菜花叶病毒(CaMY 19S和35S)的基因，但可使用任何已知的启动子。优选地，使用启动编码序列过分表达的调节启动子序列，例如，在欧洲申请EP0507698所述的组蛋白启动子。
根据本发明，与调控启动子序列联合，也可使用其它位于启动子和编码序列之间的调控序列，例如转录活化子、“增强子”，例如申请WO87/07644中所述的烟草斑病毒(TEV)翻译活化子，或转运肽，或者是单链，或者是双链，在此情况下可任选以中间序列隔开，即在转录方向上包括一个编码转运肽的序列，其转运编码质体定位酶的植物基因，编码质体定位酶的植物基因的N端成熟区的部分序列，以及一个编码第二转运肽的序列，其转运编码质体定位酶的植物基因，由编码质体定位酶的植物基因的N端成熟区的部分序列组成，见欧洲申请号0508909所述。
关于调控终止子序列或聚腺苷酸化序列，可使用任何来源于细菌的相应序列，例如根癌土壤杆菌的nos终止子，或来源于植物的相应序列，例如欧洲申请EPNo.633317中所述的组蛋白终止子。
本发明的另一个目标是一种植物细胞，来源于单子叶或双子叶植物，尤其是作物，它对至少两种除草剂有耐受性，其中至少有一个HPPD抑制剂。该细胞可至少含两个嵌合基因，其中每一个都含有编码对一种除草剂具耐受性的序列，其中一个含有编码HPPD的序列。这两个嵌合基因可以用同一个载体携带，也可各以不同载体携带，根据目前的已知方法或可以用物理或物理化学的方法转导，例如通过微注射、电穿孔或轰击法。
本发明的目标还有一种对至少两种除草剂具耐受性的转化植物，其中一个除草剂是HPPD抑制剂。该植物可通过将至少两种分别含有一种对除草剂具耐受性的基因的植物杂交，或通过将上述根据本发明的细胞进行繁殖得到。该植物可以是单子叶的也可以是双子叶的，特别是作物，主要作物例如，但并未意在限制于，双子叶植物，烟草、棉花、油菜、大豆和甜菜，单子味植物玉米和谷物，或商业植物或花卉作物。
本发明的目标还有就是一种通过植物转基因生产具有多种除草剂耐受性的方法，其特征在于：
-在第一阶段，在几个细胞中分别插入一个基本基因，其分别含有对其在植物中转录所必须的调控元件及编码使植物对除草剂具耐受性的酶的编码序列，且其中
-使植物杂交以得到具有多种耐受性的植物。
本发明的另一目的是提供一种通过植物转基因生产对多种除草剂具有耐受性的植物的另一方法，其中在第一阶段包括将含有至少两个对除草剂(其中一个是HPPD抑制剂)具耐受性的基因整合到植物细胞中，第二步是根据本发明，将来自于转化细胞的植物进行再生。
转化可以通过任何已知的适当方法来进行，这些方法可以大量参考专业文献和特别是本申请上文中提到的那些。
以附有DNA的微粒轰击细胞或质体有一系列的方法。根据本发明，这些DNA可以用同一个微粒或以不同子弹轰击。所用的另外一套作物植物转化的方法包括将嵌合基因插入到发根土壤杆菌的Ri质粒或根癌土壤杆菌的Ti质粒中。
其它可使用的方法例如微注射或电穿孔。
根据植物的性质，特别它究竟是单子叶还是双子叶的这种特点，本领域技术人员可选择适当的方法。
已发现根据本发明的转化植物具有良好的对羟苯基丙酮酸双加氧酶抑制剂的耐受性，这些抑制剂例如一些最近的除草剂例如法国专利申请9506800和9513570所述的异噁唑类及特别是4-[4-CF3-2-(甲基磺酰基)苯甲酰基]-5-环丙基异噁唑，或“isoxaflutde”，它是选择性用于玉米的除草剂，二酮腈类例如欧洲申请0496630,0496631中所述的，特别是2-氰-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1,3-二酮及2-氰-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮，欧洲申请0625505和0625508中所述的三酮类，特别是Sulcotrione及Pyrazinolate。根据本发明，同样的这些植物对其它除草剂表现出了良好的耐受性，这些除草剂例如是二卤苄腈，特别是溴苯腈和碘苯腈，草甘膦及其类似物，glufosinate。
本发明的目的还有就是从转化细胞再生的植物。再生通过任何适当的方法达到，这取决于该物种的性质，例如在上述申请中所描述的。本发明的植物还可以通过亲本杂交得到，每个亲本都携有一个所说的除草剂耐受性基因。
最后，本发明的目的是一种借助于该种类型除草剂从植物尤其是作物中除去杂草的方法，其特征在于将该除草剂在作物撒种前、发芽前或发芽后施加到本发明的转化植物上。用于本发明的除草剂应理解为是一种具除草活性的物质，它可单独使用或与其它可改善其有效性的添加剂联用，例如是一种增加其活性(协同剂)或限制其活性(安全剂(safener))的试剂。
当然，在实际应用中，上述的除草剂是以已知的方式与农业化学中常用的制剂辅料一起使用的。
根据本发明，植物的除草剂耐受性基因之一可以在体外或体内用作可选择标记。
借助于下面的实验实施例将可以更清楚地了解本发明的各个方面。
实施例1：从荧光假单胞菌A32.(P.fluorescens A 32)中分离HPPD基因。
从来自于假单胞菌SP.P.J.874(Ruetschi U等公开，1992.Eur.J.Biochem.205:459-466)的HPPD氨基酸序列推断出了不同寡核苷酸的序列以用于通过PCR扩增了来自荧光假单胞菌A32(Mckellar,R.C.分离，1982.J.Appl.Bacteriol.53:305-316)的HPPD编码序列的一部分。此HPPD基因的一个扩增片断被用于筛选荧光假单胞菌A32的部分基因库从而分离此酶的编码基因。
A)制备荧光假单胞菌A32基因组DNA。
在28℃将细菌在40毫升M63基本培养基(KH2PO413.6克/升，(NH4)2SO42克/升，MgSO40.2克/升，FeSO40.005克/升pH7，加上10毫摩尔/升L-酪氨酸作为唯一碳源)上培养48小时。
洗涤后，将细胞在1毫升的裂解缓冲液(100毫摩尔/升Tris-HCLpH8.3，1.4摩尔/升NaCl及10毫摩尔升EDTA)中吸收并于65℃温育10分钟。在用苯酚/氯仿(24/1)处理和氯仿处理后，加上1体积的异丙醇沉淀核酸，然后用300微升的无菌水吸收并用终浓度为10微克/毫升的RNAse处理。DNA再以苯酚/氯仿处理，氯仿处理，然后加入1/10体积的3M乙酸钠pH5及2体积的乙醇进行沉淀。DNA以无菌水吸收并进行分析。
B)寡核苷酸及合成酶的选择
从来自于假单胞菌SP.P.J.874的HPPD氨基酸序列中选择了5个寡核苷酸序列，两个是从蛋白质的NH2端到COOH端的方向，而另外三个则是以相反的方向(见图1)。选择的依据是如下的原则：
-3′端稳定寡核苷酸，即至少有两个碱基是没有多义的。
-简并性越低越好。
所选择的寡核苷酸序列如下：
P1:5′TA(C/T)GA(G/A)AA(C/T)CCIATGGG3′
P2:5′GA(G/A)ACIGGICCIATGGA3′
P3:5′AA(C/T)TGCATIA(G/A)(G/A)AA(C/T)TC(C/T)TC3′
P4:5′AAIGCIAC(G/A)TG(C/T)TG(T/G/A)ATICC3′
P5:5′GC(C/T)TT(A/G)AA(A/G)TTICC(C/T)TCICC3′
它们在MILLPORE牌的合成仪“Cyclone plus DNASynthesizer”上合成。
用这五个寡核苷酸，通过PCR根据序列ID No.1理论上应得的扩增片断具下述长度：
用引物P1和P3---→约690bp
用引物P1和P4---→约720bp
用引物P1和P5---→约1000bp
用引物P2和P3---→约390bp
用引物P2和P4---→约420bp
用引物P2和P5---→约700bp
C)来自荧光假单胞菌A32的HPPD编码部分的扩增
扩增在PERKIN ELMER 9600 PCR仪并用PERKIN ELMER Taq聚合酶及其缓冲液，在常规条件下，即在50微升的反应中，dNTPs为200微摩尔/升，引物为20微摩尔/升，Taq聚合酶为2.5单位，来自于荧光假单胞菌A32的DNA为2.5微克。
所用的扩增程序为95℃5分钟，35循环＜95℃45秒，49℃45秒，72℃1分钟＞随后72℃5分钟。
在这些条件下，所有得到的扩增片断都与上述给出的理论大小是相符合的，说明扩增的特异性是比较好的。
在将pBSⅡ SK(-)以EcoRv消化并以末端转移酶如HOLTON T.A.及GRAHAM M.W,1991,N.A.R.第19卷，No.5，第1156页所述的在ddTTP存在的条件下处理后，把用引物对P1/P4,P1/P5和P2/P4所得的片断与该质粒连接起来。
三种类型的每一个的克隆都进行了部分测序，这就使得我们有可能来确定是否在这三种情况下来自荧光假单胞菌A32的HPPD的部分编码区确实被扩增了。为了筛选荧光假单胞菌A32的部分基因组文库并分离完全的HPPD基因，保留了P1/P4片断作为探针。
D)基因的分离
通过Souther印迹表明在以限制酶BamHⅠ消化荧光假单胞菌A32的DNA后，7Kbp的片断可与HPPD P1/P4探针杂交，因此用限制酶BamHⅠ对400微克的荧光假单胞菌A32DNA进行消化，在琼脂糖胶上纯化约7Kbp的片断。
将这些片段连到pBSⅡ SK(-)上，质粒本身用BamHⅠ消化并以碱性磷酸酶处理脱磷酸化。在转化到E.col.DH106中后，用HPPD P1/P4探针对部分基因组文库进行筛选。
分离阳性克隆并命名为pRPA。其简图如图2。HPPD基因的编码部分在图上标出。它由1077个核苷酸组成，编码358个氨基酸(见SEQ IDNo.1)。来自于荧光假单胞菌A32的HPPD与来源于假单胞菌SR菌株P.J.874的HPPD有很好的氨基酸同源性；实际上这两个蛋白质的92％是相同的(见图3)。
实施例2：具有一个HPPD序列的两个嵌合基因的构建
为使植物对抑制HPPD的除草剂产生耐受性，构建了两个嵌合基因：
第一个(嵌合基因)含有将来自于荧光假单胞菌A32HPPD基因编码部分置于两重组蛋白启动子(欧洲专利申请号0507698)的控制之下，后面跟烟草蚀刻病毒转录增强子(TEV)(pRTL-GU5(Carrington及Freed,1990；J.Virol.64:1590-1597))，其带有胭脂氨酸合成酶基因的终止子。HPPD将被定位于胞质中。
第二个(嵌合基因)与第一个是相同的，唯一的区别是TEV转录活化子和HPPD的编码区之间，最适转运肽(OTP)被嵌入(欧洲申请EPNo.0508909)。于是HPPD将被定位于叶绿体中。
A)构建载体pRPA-RD-153：
-pRPA-RD-11：在KpnⅠ和SalⅠ位点之间克隆下含胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸位点(NOS polyA)(欧洲申请No.0652286)的pBS-Ⅱ SK(-)(Stratagene目录号#212206)衍生物。在150微摩尔/升脱氧核糖三磷酸存在下以T4DNA聚合酶Ⅰ处理将KpnⅠ位点转化成NotⅠ位点，随后以NotⅠ接头连接(Stratagene目录号#1029)。于是就得到了NOS PolyA克隆盒。
-pRPA-RD-127：将pRPA-BL-466(欧洲申请EP No.0337899)衍生物克隆到pRPA-RD-11中以产生使OXY基因表达的盒并含有核酮糖双羧化酶(ribulose biscarboxylase)小单位启动子：
“启动子(SSU)-OXY基因-NOS PolyA”
为了得到这个质粒，用XbaⅠ和HindⅢ消化pRPA-BL-488以分离含有SSU启动子和OXY基因的1.9kbp的片段，并将其连到用相容酶(Compatibleenzyme)消化的质粒pRPA-RD-11上。
-pRPA-RD-132：它是一个pRPA-BL-488(欧洲申请EP No.0507698)的衍生物，它被克隆到pRPA-RD-127上并具有使OXY基因表达及双重组蛋白启动子的盒：
“双重组蛋白启动子-OXY基因-NOS PolyA”
为了构建该质粒，以HindⅢ消化pRPA-BL-466，以Klenow处理并用NcoⅠ消化。含双组蛋白启动子H3A748的1.35Kbp片段纯化后连接到质粒pRPA-RD-127上，该质粒事先已用XbaⅠ消化，并以Klenow处理以及用NcoⅠ重新消化过。
-pRPA-RD-153：其为含烟草蚀刻病毒(TEV)转录活化子的pRPA-RD-132的衍生物。pRTL-GUS(Carrington及Freed.1990；J.Virol.64：1590-1597)用NCoⅠ和EcoRⅠ消化并将150bp的片段连到用相同的酶消化过的pRPA-RD-132上。从而得到了含有启动子的表达盒：
“双重组蛋白启动子-TEV-OXYμ-NOS PolyA”
B)载体pRPA-RD-185的构建：
PUC19/GECA：含多克隆位点的pUC-19(GIbco目录号#15364-011)的衍生物。pUC19以EcoRⅠ消化并连接到寡核苷酸接头1上：
接头1：AATTGGGCCA GTCAGGCCGT TTAAACCCTA GGGGGCCCG
CCCGGT CAGTCCGGCA AATTTGGGAT CCCCCGGGC TTAA
所选的克隆含有一个EcoRⅠ位点，随后是含下列位点的多接头，这些位点是：EcoRⅠ,ApaⅠ,AvrⅡ,PmeⅠ,SfiⅠ,SacⅠ,KpnⅠ,SmaⅠ,BamHⅠ,XbaⅠ,SalⅠ,PstⅠ,SpHⅠ及HindⅢ。
pRPA-RD-185：其为含修饰的多接头的pUC19/GECA的衍生物。PUC19/GECA用HindⅢ消化并连接到接头寡核苷酸2上：
接头2：AGCTTTTAAT TAAGGCGCGC CCTCGAGCCT GGTTCAGGG
AAATTA ATTCCGCGCG GGAGCTCGGA CCAAGTCCC TCGA
所选克隆含有一个HindⅢ位点，该位点在含有下述位点的多接头的中间，所含的位点为：EcoRⅠ,ApaⅠ,AvrⅡ,PmeⅠ,SfiⅠ,SacⅠ,KpnⅠ,SmaⅠ,BamHⅠ,XbaⅠ,SalⅠ,PstⅠ,SphⅠ,HindⅢ,PacⅠ,AsCⅠ,XhoⅠ及EcoNⅠ。
C)载体pRPT的构建：
-pRPO：含有一个HPPD表达盒，双重组蛋白启动子-TEV-HPPD基因-Nos终止子的pRPA-RD-153的衍生物。为了构建pRPO，用HindⅢ消化pRPA-RD153，并以Klenow处理，然后以NcoⅠ重新消化以除去OXY基因并代之以HPPD基因，该基因是以BstEⅡ消化质粒pRPA，用Klenow处理并用NcoⅠ重新消化衍生来的。
-pRPR：为得到该质粒，以PvuⅡ和SacⅠ消化pRPO，嵌合基因纯化后连接到其本身用PvuⅡ和SacⅠ消化过的pRPA-RD-185上。
-pRPT：将用SacⅠ和HindⅢ消化后的衍生于pRP的嵌合基因连接到用相同的酶消化所得的质粒pRPA-BL150α2而得到(欧洲申请EPNo.0508909)。
因此载体pRPT的嵌合基因具有下述结构：
| 双重组蛋白启动子 | TEV | HPPD的编码区 | NOS终止子 |
D)载体pRPV的构建
-pRPP：其为在HPPD基因后含有最适转运肽的pRPA-RD-7(欧洲申请EP No.0652286)的衍生物。将用BstEⅡ和NcoⅠ消化，以Klenow处理所得的HPPD编码部分与其本身用SphⅠ和AccⅠ消化并用T4DNAse多聚酶处理后的质粒pRPA-RD-7编码部分连接而成。
-pRPQ：含一个HPPD表达盒、双组蛋白启动子-TEV-OTP-HPPD基因-NOS终止子的pRPA-RD-153的衍生物。为构建该载体，质粒pRPA-RD-153用SalⅠ消化，以Klenow处理，并以NcoⅠ重新消化以除去OXY基因并以HPPD基因代替它，HPPD基因是通过用BstEⅡ消化质粒pRPP，并用Klenoro处理和用NcoⅠ重新消化衍生而来的。
-pRPS：为得到此载体，质粒pRPQ以PvuⅡ和SacⅠ消化以除去连接到pRPA-RD-185上的嵌合基因，而pRPA-RD-185本身是用PvuⅡ和SacⅠ消化过的。
-pRPV：它通过将用SacⅠ和HindⅢ消化pRPS后所衍生的嵌合基因连接到质粒pRPA-BL150α2(欧洲申请EP No.0508909)。
因此载体pRPQ的嵌合基因具有下述结构：
| 双重组蛋白启动子 | TEV | OTP | HPPD的编码区 | Nos终止子 |
实施例3：工业用烟草PBD6的转化
为了确定这两个嵌合基因的效率，根据欧洲申请EP No.0508909所述的转化和繁殖技术，将它们转到工业用烟草PBD6中。
1)转化：
将载体导入携带粘粒pTVK291(Komari等，1986)的非致癌土壤杆菌EHA101菌株(Hood等，1987)中。转化技术是基于Horsh等，(1985)Science,227,1229-1231的程序。
2)再生：
来自于叶外植体的PBD6烟草(来源于SEITA法国)的再生在含30克/升蔗糖和100微克/毫升卡那霉素的Murashige和Skoog(MS)基本培养基上进行。叶外植体从温室植株上或在体外取得，根据叶盘技术以三个连续步骤进行转化(Science1985，第227页，第1229-1231页)：首先在补充有30克/升含有0.05毫克/升的萘乙酸(ANA)及2毫克/升的苄氨基嘌呤(benzylaminopurine(BAP))蔗糖的MS培养基上对芽进行诱导15天。在此阶段在补充有30克/升蔗糖但不含激束的MS培养基上进行培养10天使其发育。除去那些已发育的芽并在MS生根培养基上以一半含量的盐，维生素和糖而且不含激束的条件下培养。约15天后，将生根的芽植入土壤中。所得的植株被称为Co17。
在进行体外分离时，将转化的烟草胚在温室(60％相对温度，温度：20℃夜晚，23℃白天)中适应环境5周，然后以4-[4-CF3-2-(甲磺酰)苯甲酰基]-5-环丙基异噁唑进行处理。
对照烟草，未进行转化，并以剂量范围在50到400克/公顷内的4-[4-CF3-2-(甲磺酰)苯甲酰基]-5-环丙基异噁唑处理，在72小时内进行黄化，这使得在一周之内增强并发展成了非常显著的坏死(约占80％的成叶)。
转化之后，该过量表达荧光假单胞菌HPPD的同一烟草被相当好地保护，未受到400克/公顷剂量的4-[4-CF3-2-(甲磺酰)苯甲酰基-5-环丙基异噁唑的处理。
如果酶在叶绿体过量表达，即如果转化是以载体pRPV携带的基因进行的话，那么植物就可被相当好地被保护而且不表现出任何症状。
实施例4：为构建体173用EPSPS基因转化工业用烟草
分离编码玉米EPSPS的cDNA：
导致玉米EPSPS cDNA产生的各个阶段将在下面进行描述，该cDNA作为引入两个变异的底物。下面所述的所有操作都以这种方式给出：实施例以及要达到同样效果时对各种方法的选择。该选择对结果的质粒没有影响，所以，本领域的技术人员可以使用任何适当的方法来达到相同的效果。大多数操作DNA片段的方法在“现代分子生物学技术(Current Protocols inMolecnler Biology)“第一和第二卷；Ausubel F.M.等，Green PublishingAssociates和Wiley-Interscience(1989)中都有描述(下文中，对在此手册中所述方法的参考都将被标注以“参见CPMB”)。根据在此手册中描述的技术进行的有关DNA操作特别见下列的：DNA片段的连接、以Klenow DNA多聚酶和T4DNA多聚酶的处理、来自质粒和λ噬菌体的DNA的制备、微量制备或大量制备，分别根据Southem和Northern技术对DNA和RNA进行分析。在此手册中所描述的其它方法随后仅描述这些技术主要的修改或者增加：
A1．从拟南芥(Arabidopsis thaliana)制备EPSPS片段
a)分别具下述序列的两个20mer的寡核苷酸
5′GCTCTGCTCATGTCTGCTCC-3′
5′GCCCGCCCTTGACAAAGAAA-3′
从一个拟南芥EPSPS基因序列合成(Kee.H.J.等(1987),Mol.Gen.Genet.,210,437-442)。这两个寡核苷酸位于公开序列的1523到1543和1737到1717位置上并且方向是趋同(convergent)的。
b)从Clontech(目录号：6970-1)得到来自于拟南芥(Var.Columbia)的总DNA
c)将50纳克(ng)的DNA分别与300纳克的每种寡核苷酸混合并在产商建议的标准扩增条件下，在Perkin-Elmer9600仪器上进行35个扩增循环。所得的204bp片段组成了拟南芥EPSPS片段。
2．构建BMS玉米细胞系cDNA文库
a)将5克过滤细胞在液氮中进行研磨，总核酸根据Shure等描述的方法进行提取，但对该方法进行如下修改：
-调裂解缓冲液的pH调到pH=9.0；
-在以异丙醇进行沉淀后，以水吸收，溶解后，调到2.5M LiHCl。在[lacuna]℃温育12小时后，以30000g离心15分钟，所得沉淀于4℃下重新溶解。然后重复使用LiCl的沉淀步骤。再溶解的沉淀就是总核酸中的RNA部分。
b)如“现代分子生物学技术”所述在寡聚-dT纤维素柱上得到RNA成分中的RNA-polyA+部分。
c)具合成EcoRⅠ末端的双链cDNA的合成：根据此合成中以试剂盒形式使用的各种试剂的产商建议方法进行，该试剂盒为来自于In Vitrogen公司的“拷贝试剂盒(copy kit)”。
将两个单链的并部分互补的寡核苷酸序列：
5′-AATTCCCGGG-3′
5′-CCCGGG-3′(后者已被磷酸化)
与平端的双链cDNA相连。
该接头的连接导致形成了附到双键cDNA上的SmaⅠ位点以及每个cDNA双链末端的粘端形式的EcoRⅠ位点。
d)文库构建
将在其末端具有人工EcoRⅠ粘端的cDNA与根据产商New EnglandBiolabs的方法以EcoRⅠ切割及去磷酸化的噬菌体λgt10相连。
以衣壳提取物：Gigapock Gold在体外将一个等分试样的连接反应物衣壳化：根据产商建议，用大肠杆菌C600hfl滴定该文库。根据该相同的产商的建议将所得的文库进行扩增和保存并构成了BMS玉米细胞悬浮物cDNA文库。
3．以拟南芥EPSPS探针筛选BMS玉米细胞悬浮物cDNA文库：
后面的技术即Ausubel F.M.等，Green Publishing Associates和S(1989)出版的“现代分子生物学技术”(CPMB)第1卷和第2卷的技术。简而言之，以平均密度为100个噬菌体/平方厘米将约106重组噬菌体涂于LB盘上。分培裂解斑并复制到Amersham Hybond N膜上。
h)用1600KJ的UV处理(来自Stratagene的Stratalinker)将DNA固定在膜上。在6×SSC/0.1％SDS/0.25脱脂乳中将膜在65℃进行预杂交2小时。根据产商(来自Pharmacia的Kit Ready to Go)建议以“随机引物法”用32p-dCTP将拟南芥EPSPS探针进行标记。所得比活性的数量级约为108居里每分(cpm)每微克片段。100℃变性5分钟后，将探针加到预杂交膜上并在55℃继续杂交14小时。用柯达XAR5胶卷及AmershamHyperscreenRPN增感屏在-80℃将膜进行荧光照相，时间为14小时。膜上阳性点与其相应的盘可使得从盘上除去表现出与拟南芥EPSPS探针具阳性杂交的噬菌体区域。这种涂平板、转移、杂交及回收步骤一直进行垂直到盘上所有噬菌体的点都成功纯化并证明在杂交中是100％的阳性时才结束。以1个裂解斑/单个噬菌体从稀释λ培养基(Tris-Cl pH=7.5；10微摩尔/升MgSO4；0.1摩尔/升NaCl,0.1％明胶)中除去，这些噬菌体在溶液中组成了阳性的BMS玉米细胞悬浮液EPSP克隆。
4．来自BMS玉米细胞悬浮物EPSPS克隆的DNA的制备和分析
将5×108个噬菌体地加到2OD毫升20D600纳米/毫升的C600hfl细菌中并在37℃温育15分钟。在一个1升的Erlenmeyer烧瓶中的200毫升细菌生长培养基中稀释该悬浮液，并在旋转烧瓶中以250rpm振荡。裂解根据培养基的澄清来鉴定，培养基澄清相当于混浊细菌的裂解，并在振荡约4小时后发生。上清液以“现代”分子生物学技术”中所述的方法进行处理。所得DNA相当于BMS玉米细胞上清清EPSP克隆。
一到两微克的该ENA以EcoRⅠ进行切割，在0.8％LGTA/TBE琼脂糖胶(参见CPMB)上分离。最后的确证包括保证纯化的DNA确实产生了与拟南芥EPSPS探针的杂交信号。电泳后，将DNA片段根据“现代分子生物学技术”中所述的Southern技术转移到Amersham Hybond N膜上。根据上面第三节的条件将膜与拟南芥EPSPS探针杂交。与拟南芥EPSPS探针有杂交信号并含有最长EcoRⅠ片段的克隆其在胶上的估计长度大约为1.7kbp。
5．pRPA-ML-711克隆的产生
将含有1.7kbp插入片段的来自噬菌体克隆的10微克DNA以EcoRⅠ消化并在0.8％LGTA/TBE琼脂糖胶上分离(参见CPMB)。通过BET染色将含有1.7kbp插入片段的凝胶片段从胶上切割下来并根据产商New EnglandBiolabs[原文为New a Biolabs]建议的方法用β-琼脂糖酶处理。从1.7kbp片段中纯化到的DNA在12℃下用“现代分子生物学技术”所述连接方法与用EcoRⅠ切割质粒pUC19(New England Biolabs)所得DNA连接14小时。将上述的两微升连接混合物用于一个等分试样的电感受态大肠杆菌DH10B的转化；转化以下述条件通过电穿孔法进行：将感受态细菌与连接培养基的混合物置于在0℃预冷过0.2厘米厚的电穿孔池(Biorad)中。使用Biorad牌的电穿仪的电穿孔物理条件为：2500伏特，25微法拉第以及200欧姆。在这些条件下，平均的聚光器放电时间为4.2毫秒级。细菌以1毫升的SOC培养基(参见CPMB)吸收并以200rpm在旋转振荡器上于15毫升Corming试管中振荡1小时。在补充有100微克/毫升羧苄青霉素的LB/琼脂糖培养基上涂平板后，根据“现代分子生物学技术”所述的方法制备在37℃过夜生长过的微量制备的细菌克隆。将DNA以EcoRⅠ消化并在0.8％LGTA/TBE琼脂糖胶上分离(参见CPMB)后，保留了具有1.7kbp插入片段的克隆。最终的确证即纯化的DNA确实产生了与拟南芥EPSPS探针的杂交信号。电泳后，根据“现代分子生物学技术”所述的Southem技术将DNA片段转移到Amersham Hybond N膜上。根据上述第3节的条件将滤膜与拟南芥EPSPS探针杂交。根据“现代分子生物学技术”所述的方法大量制备具有1.7kbp插入片段并与拟南芥EPSPS探针杂交的质粒克隆，并以CsCl梯度纯化来自于细菌裂解所得的DNA。根据产商建议用Pharmacia试剂盒将纯化的DNA进行部分测序，引物使用来自于相同产商的正向和反向M13通用引物。部分测序(结果)确定了约0.5kbp的范围。所得的在成熟区(约50个氨基酸残基)的氨基酸序列与美国专利USP4971908中所述的成熟玉米EPSPS的相应氨基酸序列是100％相同的。这个相当于BMS玉米细胞悬浮液EPSP DNA的1.7kbp的EcoRⅠ片段的克隆被称之为pRPA-ML-711。用pharmacia kit方法并通过合成互补和约每约250bp的反向的寡核苷酸在两条链上确定该克隆的全序列此所得的1713bp克隆的全序列列于SEQ ID No.2中。
6．pRPA-ML-715克隆的制备
pRPA-ML-711的序列分析尤其是所得氨基酸序列与玉米序列的比较表明在编码玉米EPSPS(美国专利USP4971908)成熟部分的NH2末端丙氨酸的GCG密码子上游有92bp的序列延伸。同样地，在编码玉米EPSPS(美国专利USP4971908)的成熟部分的COOH-末端天冬氨酸的ATT密码子下游观察到288bp的延伸。这两个部分对NH2末端而言，它可能相应于质体定位的转运肽序列的某一部分，对COOH端而言，它可能相应于cDNA3′非翻译区。
为了得到编码如USP4971908所述的玉米EPSPS cDNA成熟部分的cDNA，进行了如下操作：
a)3′非翻译区的除去：pRPA-ML-712的构建：
用限制性酶AseⅠ切割pRPA-ML-711克隆，所切得的末端根据CPMB所述的技术用Klenow片段进行处理使其平端化。然后用限制酶SacⅡ进行切割。经过这些步骤后所得DNA在1％LGTA/TBE琼脂糖胶上电泳进行分离(参见CPMB)。
根据上述第5节中所说方法从胶中切下含有0.4kbp“AseⅠ平端/SacⅡ”插入片段的凝胶片段并进行纯化。用位于载体pUC19多接头处的限制酶对克隆pRPA-ML711的DNA进行切割，由此切割所得的平末端用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段进行平端化处理。然后以限制酶SacⅡ进行切割。由这些步骤所得的DNA在0.7％LGTA/TBE琼脂糖胶上电泳进行分离(参见CPMB)。
根据上述第5节所述的方法从胶中切下含有约3.7kbp的HindⅡ-平端/SacⅡ插入片段的凝胶片段并进行纯化。
连接两个插入片段，根据上述第5节所述的方法将2微升的连接混合物用于转化大肠杆菌DH10B。
根据所述的对pRPA-ML-711的方法分析各克隆的质粒DNA含量。保留的一个质粒克隆含有约1.45kbp的EcoRⅠ-HindⅢ插入片段。该克隆的末端序列表明其插入片段的5′端与相应的pRPA-ML-711的末端是正确对应的，并且其3′末端具有下述序列：
"5′-AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3′".
有下划线的序列对应于COOH端氨基酸天冬酰胺的密码子，下一个密码子相当于翻译终止密码子。下游核苷酸相当于pUC19多接头的序列元素。此克隆含有直到成熟玉米EPSPS翻译终止位点的pRPA-ML-711序列，其后为直到HindⅢ位点的pUC19多接头序列，称为pRPA-ML-712。
b)pRPA-ML-712的5′端修饰：pRPA-ML-715构建
以限制酶PstⅠ和HindⅢ切割pRPA-ML-712。所得DNA在0.8％LGTA/TBE琼脂糖凝胶上电泳进行分离(参见CPMB)。根据上述第5节所述方法从胶中切下含有1.3kbp PStⅠ/EcoRⅠ插入片段的凝胶片段并进行纯化。在有下列两个等摩尔量的部分互补的寡核苷酸序列：
寡核苷酸1:5′-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3′
寡核苷酸2:5′-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3′存在并且有用BamHⅠ和HindⅢ限制酶消化的质粒pUC19的DNA存在的条件下将该片段进行连接。
按照上述第5节的方法将2微升的连接混合物用于转化大肠杆菌DH10B。根据上述第5节所述的方法对各克隆的质粒DNA含量进行分析之后，保存具有约1.3kbp插入片段的克隆用于后面的分析。所保留的5′端序列表明该区域的DNA序列是下述的：从EcoRⅠ直到BamHⅠ位点的pUC19多接头序列，其后为克隆中所用的寡核苷酸序列，其后为pRPAML-712中出现的剩余序列。该克隆被称之为pRPA-ML-713克隆。该克隆含有一个在成熟EPSP合成酶N末端丙氨酸密码子上游的NcoⅠ位点的甲硫氨酸密码子ATG。而且，N末端的丙氨酸和甘氨酸密码子是保守的，但在第三个可变碱基上有修饰：原来的GCGGGT修饰后成了GCCGGC。
用限制酶HindⅢ切割克隆pRPA-ML-713，并用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段处理使所切得的末端平端化。然后以限制酶SacⅠ进行切割，经过这些步骤所得的DNA在0.8％LGTA/TBE琼脂糖胶上电泳进行分离(参见CPMB)。根据第5节所述的方法从胶上切下含有1.3kbp“HindⅢ平端/SacⅠ”插入片段的凝胶并进行纯化。在有用限制酶αbaⅠ消化的质粒pUC19的DNA存在以及用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段使所切末端切平的条件下连接该插入片段。以限制酶SacⅠ切割。以第5节所述将2微升的连接混合物用于转化大肠杆菌DH10B。根据上述第5节所述的程度将各克隆的质粒DNA含量进行分析之后，将具有约1.3kbp插入片段的一个克隆保留用于随后的分析。所保留的克隆的末端序列表明其DNA序列是下述的：从EcoRⅠ到SacⅠ位点的pUC19多接头序列，其后为在克隆中所用的寡核苷酸序列，但其缺失了前述寡核苷酸序列1中的4bp的GATCC，随后为直到HindⅢ位点的pRPA-ML-712中的剩余序列以及从XbaⅠ到HindⅢ的pUC19多接头序列。该克隆被称之为pRPA-ML-715。
7)编码突变玉米EPSPS的cDNA的制备
所有的诱变步骤都是根据产商的建议用购自pharmacia的U.S.E.诱变试剂盒进行的。诱变系统的原理如下：使质粒DNA热变性，一方面在过量摩尔量诱变寡核苷酸存在情况下退火，另一方面退火时还存在一种过量摩尔量的寡核苷酸，它使得可以在多接头中出现的独特限制酶位点被除去。在退火阶段，在T4 DNA连接酶和提供有适当缓冲液的来自基因32的蛋白质存在下通过T4DNA聚合酶的作用进行互补链的合成。合成产物在限制酶存在的条件下温育，该酶的位点即在诱变中要去除的位点。特别是，具有MutS突变的E.cali株可被用作该DNA的转化的宿主。在液体培养基中生长后，制备总质粒DNA，在上述用过的限制酶存在条件下进行温育。在这些处理之后，将E.coli DH1OB株用作转化宿主。制备所分离的克隆的质粒DNA，并通过测序验证所导入的诱变的存在。
A)在玉米EPSPS对EPSP合成酶的竞争性抑制剂的产物的抗性特征上没有任何既定的效应的序列或位点修饰：从pRPA-ML-715上缺失了一个内部的NcoⅠ位点。
把pRPA-ML-715的序列通过将N端丙氨酸密码子GCC置于第一位进行任意编号。该序列在位置1217处有一个NcoⅠ位点。位点修饰寡核苷酸具有序列：
5′-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3′。
根据前述方法进行测序之后，变异后所读的序列相应于所用的寡核苷酸序列。该NcoⅠ位点确实已被缺失，并且在该区域其翻译后的氨基酸保留了pRPA-ML-715中出现的起始序列。
该克隆被称之为pRPA-ML-716。
该克隆的1340bp的序列见SEQID NO:3和SEQ ID NO:4中。
B)使得玉米EPSPS对EPSP合成酶活性竞争性抑制剂产物的抗性增加的序列修饰
下述寡核苷酸是所用的：
a)苏氨酸102→异亮氨酸变异
5′-GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3′
b)脯氨酸106→丝氨酸变异
5′-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3′
c)甘氨酸101→丙氨酸及苏氨酸102→异亮氨酸变异
5′-CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3′
d)苏氨酸102→异亮氨酸及脯氨酸106→丝氨酸变异
5′-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3′
测序之后，除了在相应于所用的诱变寡核苷酸的诱变区之外，在三个片段中诱变后的序列与亲本DNA序列pRPA-ML-716是相同的。这些克隆的命名为：将苏氨酸102→异亮氨酸变异称之为pRPA-ML-717，将脯氨酸106→丝氨酸变异称之为pRPA-ML-718，将甘氨酸101→丙氨酸及苏氨酸102→异亮氨酸变异称之为pRPA-ML-719，以及将苏氨酸102→异亮氨酸及脯氨酸106→丝氨酸变异称之为pRPA-ML-720。
pRPA-ML-720的1340bp的序列参见SEQ ID NO:5和SEQ ID NO.6。
在用于对EPSPS的竞争性抑制剂的除草剂尤其是对草甘膦的抗性导入的植物转化中，形成所有构建体的基础的是1395bp的NcoⅠ-HindⅢ插入片段。在后面的描述中，该插入片段被称之为“双玉米EPSPS突变”。
B．各种体外突变的草甘膦耐受性。
2．a.EPSP合成酶提取
将各种EPSP合成酶基因以NcoⅠ-HindⅡ盒的形式导入到以NcoⅠ和HindⅢ切割的质粒载体pTrc99a(Pharmacia，参见：27-5007-01)中。每10克的Culotted细胞在40毫升缓冲液中把过量表达各种EPSP合成酶的重组体E.Coli DH10B进行超声破碎并以加有1克聚乙烯吡咯烷酮的相同缓冲液(200毫摩尔/升Tris-HCl pH7.8,50毫摩尔/升巯基乙醇，5毫摩尔/升EDTA及1毫摩尔/升PMSF)进行洗涤。悬浮液在4℃搅拌15分钟，然后于4℃27000g离心20分钟。
在上清液中补充硫酸铵以使溶液含有40％饱和度的硫酸铵。将混合物在4℃以27000g离心20分钟。新的上清补充以硫酸铵以使溶液含有70％饱和度的硫酸铵。混合物于4℃以27000g离心30分钟。在该蛋白质沉淀中的EPSP合成酶以1毫升的缓冲液(20毫摩尔/升Tris-HCl pH7.8及50毫摩尔/升巯基乙醇)。该溶液在4℃于2升的相同缓冲液中渗析过夜。
2．b：酶活性
以37℃10分钟的下述反应混合物在体外测试了每种酶的活性及其对草甘磷的抗性：100毫摩尔/升马来酸pH5.6,1毫摩尔/升磷酸烯醇丙酮酸，3毫摩尔/升莽草酸磷酸-3-磷酸盐(根据Knowles P.F.及Sprinson D.B.,1970,Methodsin Enzymol.,17A,351-352的方法从产气气杆菌(AerobacterDerogenesis)菌株ATCC25597中制备)以及10毫摩尔/升的氟化钾。在加入了终浓度为0到20毫摩尔/升的草甘膦后才在最后时刻加入酶提取物。
根据Tausky H.A.及Shorr E.,1953,J.Biol.Chem.202,675-685的技术通过测定释放的磷酸盐来确定其活性。
在这些条件下，野生型(WT)酶从0.12毫摩尔/升草甘膦开始其活性即被抑制了85％。在此浓度下，所说的丝氨酸106变异酶仅被抑制了50％。而其它3种突变体异亮氨酸102，异亮氨酸102/丝氨酸106，丙氨酸101/异亮氨酸102却未被抑制或未被明显抑制。
为了使突变酶异亮氨酸102被抑制50％，草甘磷的浓度应乘以10，即1.2毫摩尔/升，而突变体异亮氨酸102/丝氨酸106，丙氨酸/异亮氨酸及丙氨酸仍然未受抑制。
应当注意到丙氨酸/异亮氨酸及丙氨酸突变体的活性直到10毫摩尔/升草甘磷浓度时仍未受抑制，并且异亮氨酸102/丝氨酸106突变体的活性甚至在草甘磷浓度再乘以2，即20毫摩尔/升的情况下也仍然未受抑制。
C．转化的烟草植株的抗性。
0-1质粒构建
pRPA-RD-124：将一个“Nos”聚腺苷酸化信号加到先前所得的pRPA-ML-720上，同时产生含有玉米双突变EPSPS基因(苏氨酸102→异亮氨酸及脯氨酸106→丝氨酸)的克隆盒。pRPA-ML-720用HindⅢ酶切，而且为了得到平端还以来自大肠杆菌的Klenow片段进行处理。用NcoⅠ进行第二轮消化并纯化EPSPS片段。为了得到pRPA-RD-124，将该EPSPS基因连接到纯化好的lpRPA-RD-12(一个含有胭脂碱合成酶聚腺苷酸化信号的克隆盒)上。为了得到有用的纯化载体pRPA-RD-12，有必要将后者先以SalⅠ消化，以Klenow DNA聚合酶处理，然后用NcoⅠ进行第二次处理。
pRPA-RD-125：将优化转运肽(OTP)加到pRPA-RD-124上并产生在质粒上含有靶EPSPS基因的克隆盒。将pRPA-RD-7(欧洲专利申请EP652286)用SphⅠ消化，以T4DNA聚合酶处理，然后以SpeⅠ消化并纯化OTP片段。该OTP片段被克隆到pRPA-RD-124中，该pRPA-RD-124预先以NcoⅠ消化，为除去伸出的3′部分用Klenow DNA聚合酶处理，然后以SpeⅠ消化。为了确证OTP和EPSPS基因之间正确的翻译融合对该克隆进行了测序。于是得到了pRPA-RD-125。
pRPA-RD-159：将Arabidopsis H4A748双组蛋白启动子(专利申请EP507698)加到pRPA-RD-125上，产生了用于在双子叶组织中“OTP-双突变EPSPS基因”表达的植物表达盒。用NcoⅠ和SacⅠ对pRPA-RD-132(含H4A748双启动子(专利申请EP507698)的盒)进行消化。该启动子纯化片段然后被克隆到以ECoRⅠ和SacⅠ消化的载体上。
pRPA-RD-173：将pRPA-RD-159的“H4A 748-OTP双突变EPSPS基因启动子”基因加到质粒pRPA-RD-150A(欧洲专利申请508909)上并产生了根瘤土壤杆菌转化载体。将pRPA-RD-159以NotⅠ消化并以Klenow多聚酶处理并以SmaⅠ将该片段克隆到pRPA-BL-150A中。
1-1-转化
将载体pRPA-RD-173导入到携带粘粒pTVK291(Komari等，1986)的根瘤土壤杆菌EHA101菌株(Hood等，1987)中。该转化的技术是根据Horsh等的方法(1985)。
1-2-再生
在含30克/升的蔗糖和200微克/毫升卡那霉素的Murashige和Skoog(MS)基础培养基上进行PBD6烟草(来源于SEITA法国)从叶外植体的再生。叶外植体从温室植株或体外取得并根据叶圆盘技术(科学，1985，第227卷，第1229-1231页)分三个步骤进行转化：首先以补充以30克/升的含0.05毫克/升的萘乙酸(ANA)和2毫克/升的苄胺基嘌呤(BAP)的蔗糖在MS培养基上对幼苗进行诱导15天。将在此阶段形成的幼苗在补充以30克/升的蔗糖但不含激素的MS培养基上培养10天进行发育。除去已发育的幼苗并在含半量的盐、维生素和糖且不含激素的MS生根培养基上培养。约15天后将生根幼苗植入土中。
1-3-草甘膦抗性
将20株转化植株进行再生并置于温室中用于构建pRPA-RD-173。这些植株在5叶期时在温室中用相当于每公顷0.8千克草甘膦活性物质的Round UP含水悬浮液进行处理。
结果为在处理三周后所记录到的植物毒性指标。在这些条件下我们观察到以构建体pRPA-RD-173转化的植株有很好的耐受性而未转化的对照植株则完全被毁。
这些结果清楚地表明了使用根据本发明的编码草甘膦耐受性的同一基因的嵌合基因所带来的改良。
实施例5：以腈酶(nitrilase)基因(用于构建体238)对工业烟草PBD6进行转化：
此烟草根据欧洲申请号0337899第6页第50行及其后所述的技术由构建体238而得到，该构建体被称之为pRPA-BL238。
实施例6：授粉杂交
在温室中通过授粉分别使Co17,173和238系进行杂交：
-为了得到用于测试对isoxaflutole和溴苯腈具双效耐受性的PBD6烟草植株(“植物HPPD+OXY”)，将Co17和238进行杂交，并且
-为了得到用于测试对isoxaflutole和草甘膦具双效耐受性的PBD6烟草植株(“植物HPPD+EPSPS”)，将Co17与173进行杂交。
对相关的基因而言，这三系都是纯合的，因此对这两个由杂交引入的基因中的每一个来说，其后代是半合子的。
六周后得到杂交的植物。
实施例7：以isoxaflutole萌后处理及用溴苯腈或草甘膦萌芽后处理的烟草耐受性测定
在此实验中，每个测试都在10株样本上进行，10株不作处理。
所有的处理都是以500升喷洒混合物/公顷的比率进行喷洒。
对于萌后处理，播种然后将植株移植到4厘米×9厘米的盆中。
在达到充分发育阶段(3-4叶)时进行萌后处理。上述得到的各批野生型及经遗传转化的植物被分成几个部分，即：
a)未处理批，
b)其它分别以单独一种除草剂处理的批次，
-isoxaflutole萌后处理，双剂量(分别为200和400克/公顷)，
-溴苯腈萌后双剂量(分别为400和800克/公顷)处理，
-草甘膦萌后双剂量(分别为800克和1200克/公顷)处理，
c)其它分别以新鲜制备的两种除草剂混合物进行萌后处理的批次：
-isoxaflutole和溴苯腈双剂量(分别为200/400和400/800克/公顷)
-isoxaflutole和草甘膦双剂量(分别为200/800和400/1200克/公顷)。
处理以下述配方进行：75％isoxaflutole，以225克/升的可乳化浓度的碘苯腈的辛酸酯形式的溴苯腈(商用产品PARDER)和草甘膦(Round UP)。
在这些条件下，在处理17天后观察随后的植物毒性，将其表示为下述表中所示的毁坏百分数，以及每批中的植株数，以及以每公顷中的活性物质克数表示的除草剂剂量：
以isoxaflutole进行萌后处理和用溴苯腈或草甘胺进行萌后处理
| 除草剂(克/升) | 具耐受基因的植株 | |||||
| * | HPPD+OXY | * | HPPD+EPSPS | * | 没有野生型 | |
| 对照 | 10 | 10 | 10 | |||
| 单独为isoxaflutole 200400 | 2020 | 4％5％ | 2020 | 2％3％ | 10 | 75％85％ |
| 单独为溴苯腈 400800 | 1010 | 3％0％ | 1010 | 0％0％ | ||
| 单独为草甘膦 8001200 | 2020 | 0％0％ | 1010 | 100％100％ | ||
| isoxaflutole 200+溴苯腈 400 | 20 | 20％ | 10 | 100％ | ||
| isoxaflutole 400+溴苯腈 800 | 20 | 30％ | 10 | 100％ | ||
| isoxaflutole 200+草甘膦 800 | 40 | 5％ | 10 | 100％ | ||
| isoxaflutole 400+草甘膦 1200 | 40 | 10％ | 10 | 100％ | ||
*植株数目
实施例8
为了研究荧光假单胞菌HPPD基因能否在植物“转化-再生循环”中用作标记基因，将由HPPD基因和具双突变草甘膦抗性的EPSPS基因组成的嵌合基因用于转化烟草，在isoxaflutole上选择后得到了对isoxaflutole和草甘膦都具有抗性的转化植株。
材料、方法及结果
根据欧洲申请EP No.0508909中已描述的转化和再生方法将下述的嵌合基因pRP2012转入PBD6工业烟草中。
载体pRP 2012的嵌合基因具有下述结构A-B，其中：
A是：
| 双组蛋白启动子 | TEV | OTP | HPPD的编码区 | Nos终止子 |
而且B是：
| 双组蛋白启动子 | TEV | OTP | EPSPS的编码区 | Nos终止子 |
这都与载体pRPA-RD-173中所用的一样。
将嵌合基因pRP2012导入烟草中。1)转化：
将载体导入携带粘粒pTVK291(Komari等，1986的)非致癌的土壤杆菌EHA101株系(Hood等，1987)中。转化技术根据Horsh等(1985)的方法。2)再生
在含30克/升蔗糖和350毫克/升Cefotaxime及1毫克/升isoxaflutole的Murashige和Skoog(MS)基础培养基上进行PBD6烟草(来源于法国SEITA)从叶外植体的再生。叶外植体从温室植株或体外取得并根据外圆盘技术(科学，1985，第227卷，第1229-1231页)分三个步骤进行转化：首先以补充以30克/升的含0.05毫克/升萘乙酸(ANA)和2毫克/升的苄胺基嘌呤(BAP)的蔗糖及1毫克/升isoxaflutole在MS培养基上对幼苗进行诱导15天。在此时期形成的幼苗在补充以30克/升的蔗糖和1毫克/升的isoxaflutole但不含激素的MS培养基上培养10天进行发育。除去已发育的幼苗并在含半量的盐，维生素和糖及1毫克/升isoxaflutole及不含激素的MS生根培养基上培养，约15天后，将生根的幼苗植入土中。
根据这种方法所得的全部植株都用荧光假单胞菌HPPD特异性的引物以PCR进行分析。这种PCR分析使得有可能确证所有如此所得的植物中确实整合了HPPD基因而且在实施例7所述条件下它们对isoxaflutole和草甘膦都具有抗性。
总而言之，该实验证实HPPD基因可以用作标记基因，而且与该基因一道，isoxaflutole可作为一个良好的选择试剂。
实施例9：具HPPD基因及一个对isoxaflutole和phoshinothricin都具抗性的bar基因的植物
1．构建具HPPD序列的嵌合基因；
将具异噁唑抗性的嵌合基因插入到2686bp的质粒pUC19中得到图4中所示的质粒pRPA-RD-1004，质粒pUC19购自New EnglandBiolabs(Yannish-Perron,C.Viera,J.及Massing,J.(1985)Gene33,103-119，而且含有氨苄青霉素抗性。
在翻译方向上嵌合基因的各种元素是：
-申请EP0507698中所述的1020bp玉米H3C4组蛋白启动子；
-由536bp组成的Sachs M.等Genetics113:449-467(1986)中所述的玉米乙醇脱氢酶1基因的内含子
-专利申请EP0508909中所述的最优转运肽(OTP)；该OTP包含来自于向日葵的核酮糖1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Waksman G.等，1987,Nucleicsacids Res.15:7181)小亚基的171bp的转运肽，其后有来自于玉米的核酮糖1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Lebrun等，1987,Nucleic acids Res.15:4360)小亚基的成熟部分的66bp，这两个部分本身后面还含有来自于玉米核酮糖1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Lebrun等，1987,Nucleic acids Res.15:4360)小亚基150bp的转运肽；总共是387bp；
-上述荧光假单胞菌HPPD的编码区；
-胭脂氨酸合成酶(nos)基因(从pTi37中分离的nos基因的多聚腺苷酸化区，250bp(Bevan M.等，Nncleic acids Res 11:369-385)的终止子；
2．构建对phosphinothricin具耐受性的嵌合基因(bar基因)：
由bar基因编码的phosphinothricin乙酰转移酶(PAT)是使一种除草剂phosphinothricin(PPT)失活的酶。PPT抑制了谷氨酸的合成并引起了细胞中氨的快速积累，从而导致其死亡(Tachibana等，1986)
将嵌合基因pDM302插入到2462bp的载体pSP72中得到用于导入对选择试剂phosphinothricin具耐受性的质粒，载体pSP72购自PromegaCorp.(Genbank/DDBJ数据库索引号×65332)并含有氨苄青霉素抗性。
Cao,J.等Plant Cell Report11:586-591(1992)已描述了4700bp的质粒pDM302。
该质粒的各种元件是：
-由840bp组成的NcElroy D.等，Plant Molecular Biology15:257-268(1990)所述的水稻肌动蛋白基因启动子；
-由80bp组成的水稻肌动蛋白基因的第一个外显子；
-由450bp组成的水稻肌动蛋白基因的第一个内含子；从White J.等Nuc.Acids res.18:1862(1990)所述的质粒pJ41404中切下的600bp的bar基因的编码区；
-胭脂氨酸合成酶(nos)基因(从pTi37,250bp(Bevan M.等，NucleicAcids Res.11:369-385)分离的nos基因聚腺苷酸化区)的终止子。
3．转化：
用轰击法来进行遗传构建体的导入。质粒在Qiagen柱上纯化并根据Klein法(Nature327:70-73,1987)在钨M10粒上沉淀。
根据(？？？)方法将金属粒及上述两种质粒的混合物(？)轰击到玉米成胚细胞上。
4．再生及将bar基因用作选择试剂：
将轰击后的愈伤组织在glufosinate进行选择直到出现绿色区域。将阳性愈伤组织(？)转换成体细胞胚(现有技术条件或参考？)并置于刺激胚生成的条件(现有技术条件或参考？)。幼株被移到温室中用于生产种子(现有技术条件或参考？)。
在这些植株上进行的分子分析(现有技术单件或参考？PCR？)表明：
-在phoshinothricin上选择的至少4个愈伤组织产生了通过PCR显示有HPPD基因存在的植株；
-在phosphinothricin上选择的至少5个愈伤组织产生了通过Southem印迹显示有HPPD基因存在的植株；
-在phosphinothricin上选择的至少5个愈伤组织产生了通过Western印迹显示有重组蛋白存在的植株；
-HPPD嵌合基因及杂合蛋白质不存在于未转化的愈伤组织中。
这些结果表明用于选择转化愈伤组织(含有其它具农业价值的基因)的bar嵌合基因的效率。
5．转化植株的后代分析
上述所得的转化植株产生了花粉，部分暗示其为转基因的，它使得来自于非转化的野生型玉米胚株受精。所得种子在以isoxaflutole处理后于沙上选择。
选择方法如下：
将800毫升的Fontaineblean沙置于边长为15×20厘米的盆中。然后以水喷洒于这些沙上，并补充以由每升水中含5毫升Quinohigo(Quinoline)形成的营养液以保湿。将20粒玉米种籽置于盆中，然后将盆通过每公顷100到200克活性物质的流量用isoxaflutole进行喷洒(每盆300或600微克活性物质)。该盆然后被置于温室中进行培养。
所得结果列于下表：
| 基因型 | Isoxaflutole(克/公顷) | 所播的种籽数 | 发芽的植株数 | 死亡植株数 | 存活植株数 |
| 非转基因的 | 0 | 20 | 20 | 0 | 20 |
| 100 | 20 | 20 | 20 | 0 | |
| 261 2B 459 | 100 | 10 | 10 | 5 | 5 |
| 200 | 10 | 9 | 4 | 5 | |
| 261 2D 2 | 100 | 10 | 9 | 6 | 3 |
| 200 | 10 | 10 | 7 | 3 | |
| 261 2A2 | 100 | 10 | 5 | 3 | 2 |
| 200 | 10 | 7 | 7 | 0 |
结果表明了以HPPD基因来选择抗性玉米植株的有效性。还表明了玉米组织中假单胞菌HPPD的过量表达赋了以这些组织以isoxaflutole抗性。
所述的序列如下：SEQ ID No.1来自于荧光假单胞菌A32的HPPD基因的序列。SEQ ID NO.2拟南芥EPSPS cDNA序列SEQ ID NO.3和4分别为突变玉米EPSPS，克隆pRPA-ML-7161340bp部分的基因和蛋白质的序列SEQ ID No.5和SEQ ID No.6分别为突变玉米EPSPS，克隆pRPA-ML-720的1340bp部分的基因和蛋白质序列。
下图用以帮助说明本发明。
图1表示来自假单胞菌菌株PJ.874的HPPD的蛋白质序列及相应编码部分的理论上的核苷酸序列；选出的用于扩增该编码区的5个寡核苷酸以5个箭头示意。
图2代表具有含荧光假单胞菌A32的HPPD基因的7kb基因组DNA片段的质粒的图谱。
图3给出了荧光假单胞菌A32和假单胞菌菌株P.J.874的氨基酸序列的比较(只指出在两个序列之间互不相同的氨基酸)以及共有序列。
序列表SEQ ID No.1:ATGGCACATC TATACGAAAA CCCAATGCGC CTGATGGGCT TTGAATTCAT CGAATTAGCG 60TCGCCGACGC CGGGTACCCT GGAGCCGATC TTCGAGATCA TGGGCTTCAC CAAAGTCGCG 120ACTCACCGTT CCAAGAACGT GCACCTGTAC CGCCAGGGCG AGATCAACCT GATCCTCAAC 180AACGAGCCCA ACAGCATCGC CTCCTACTTT GCGGCCGAAC ACGGCCCGTC GGTGTGCGGC 240ATGGCGTTCC GCGTGAAGGA CTCGCAAAAG GCCTACAACC GCGCCCTGGA ACTCGGCGCC 300CAGCCGATCC ATATTGACAC CGGGCCGATG GAATTGAACC TGCCGGCGAT CAAGGGCATC 360GGCGGCGCGC CGTTGTACCT GATCGACCGT TTCGGCGAAG GCAGCTCGAT CTACGACATC 420GACTTCGTGT ACCTCGAAGG TGTGGAGCGC AATCCGGTCG GTGCAGGTCT CAAAGTCATC 480GACCACCTGA CCCACAACGT CTATCGCGGC CGCATGGTCT ACTGGGCCAA CTTCTACGAG 540AAATTGTTCA ACTTCCGTGA AGCGCGTTAC TTCGATATCA AGGGCGAGTA CACCGGCCTG 600ACTTCCAAGG CCATGAGTGC GCCGGACGGC ATGATCCGCA TCCCGCTGAA CGAAGAGTCG 660TCCAAGGGCG CGGGGCAGAT CGAAGAGTTC CTGATGCAGT TCAACGGCGA AGGCATCCAG 720CACGTGGCGT TCCTCACCGA CGACCTGGTC AAGACCTGGG ACGCGTTGAA GAAAATCGGC 780AEGCGCTTCA TGACCGCGCC GCCAGACACT TATTACGAAA TGCTCGAAGG CCGCCTGCCT 840GACCACGGCG AGCCGGTGGA TCAACTGCAG GCACGCGGTA TCCTGCTGGA CGGATCTTCC 900GTGGAAGGCG ACAAACGCCT GCTGCTGCAG ATCTTCTCGG AAACCCTGAT GGGCCCGGTG 960TTCTTCGAAT TCATCCAGCG CAAGGGCGAC GATGGGTTTG GCGAGGGCAA CTTCAAGGCG 1020CTGTTCGAGT CCATCGAACG TGACCAGGTG CGTCGTGGTG TATTGACCGC CGATTAA 1077SEQ ID No.2:AATCAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG AATTCGGGCC CGGGCGCGTG 60ATCCGGCGGC GGCAGCGGCG GCGGCGGTGC AGGCGGGTGC CGAGGAGATC GTGCTGCAGC 120CCATCAAGGA GATCTCCGGC ACCGTCAAGC TGCCGGGGTC CAAGTCGCTT TCCAACCGGA 180TCCTCCTACT CGCCGCCCTG TCCGAGGGGA CAACAGTGGT TGATAACCTG CTGAACAGTG 240AGGATGTCCA CTACATGCTC GGGGCCTTGA GGACTCTTGG TCTCTCTGTC GAAGCGGACA 300AAGCTGCCAA AAGAGCTGTA GTTGTTGGCT GTGGTGGAAA GTTCCCAGTT GAGGATGCTA 360AAGAGGAAGT GCAGCTCTTC TTGGGGAATG CTGGAACTGC AATGCGGCCA TTGACAGCAG 420CTGTTACTGC TGCTGGTGGA AATGCAACTT ACGTGCTTGA TGGAGTACCA AGAATGAGGG 480AGAGACCCAT TGGCGACTTG GTTGTCGGAT TGAAGCAGCT TGGTGCAGAT GTTGATTGTT 540TCCTTGGCAC TGACTGCCCA CCTGTTCGTG TCAATGGAAT CGGAGGGCTA CCTGGTGGCA 600AGGTCAAGCT GTCTGGCTCC ATCAGCAGTC AGTACTTGAG TGCCTTGCTG ATGGCTGCTC 660CTTTGGCTCT TGGGGATGTG GAGATTGAAA TCATTGATAA ATTAATCTCC ATTCCGTACG 720TCGAAATGAC ATTGAGATTG ATGGAGCGTT TTGGTGTGAA AGCAGAGCAT TCTGATAGCT 780GGGACAGATT CTACATTAAG GGAGGTCAAA AATACAAGTC CCCTAAAAAT GCCTATGTTG 840AAGGTGATGC CTCAAGCGCA AGCTATTTCT TGGCTGGTGC TGCAATTACT GGAGGGACTG 900TGACTGTGGA AGGTTGTGGC ACCACCAGTT TGCAGGGTGA TGTGAAGTTT GCTGAGGTAC 960TGGAGATGAT GGGAGCGAAG GTTACATGGA CCGAGACTAG CGTAACTGTT ACTGGCCCAC 1020CGCGGGAGCC ATTTGGGAGG AAACACCTCA AGGCGATTGA TGTCAACATG AACAAGATGC 1080CTGATGTCGC CATGACTCTT GCTGTGGTTG CCCTCTTTGC CGATGGCCCG ACAGCCATCA 1140GAGACGTGGC TTCCTGGAGA GTAAAGGAGA CCGAGAGGAT GGTTGCGATC CGGACGGAGC 1200TAACCAAGCT GGGAGCATCT GTTGAGGAAG GGCCGGACTA CTGCATCATC ACGCCGCCGG 1260AGAAGCTGAA CGTGACGGCG ATCGACACGT ACGACGACCA CAGGATGGCC ATGGCCTTCT 1320CCCTTGCCGC CTGTGCCGAG GTCCCCGTCA CCATCCGGGA CCCTGGGTGC ACCCGGAAGA 1380CCTTCCCCGA CTACTTCGAT GTGCTGAGCA CTTTCGTCAA GAATTAATAA AGCGTGCGAT 1440ACTACCACGC AGCTTGATTG AAGTGATAGG CTTGTGCTGA GGAAATACAT TTCTTTTGTT 1500CTGTTTTTCT CTTTCACGGG ATTAAGTTTT GAGTCTGTAA CGTTAGTTGT TTGTAGCAAG 1560TTTCTATTTC GGATCTTAAG TTTGTGCACT GTAAGCCAAA TTTCATTTCA AGAGTGGTTC 1620GTTGGAATAA TAAGAATAAT AAATTACGTT TCAGTGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1680AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AACCCGGGAA TTC 1713SEQ ID No.3:
CCATG GCC CGC GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC 47
Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile
1 5 10
TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ATC 95
Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile
15 20 25 30
CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG 143
Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu
35 40 45
CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191
Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu
50 55 60
GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239
Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala AlA Lys Arg Ala Val Val Val
65 70 75
GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA GTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287
Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln
80 85 90
CTC TTC TTG GGG AAT GCT GGA ACT GCA ATG CGG CCA TTG ACA GCA GCT 335
Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala
95 100 105 110
GTT ACT GCT GCT GGT GGA AAT GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 383
Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro
115 120 125
AGA ATG AGG GAG AGA CCC ATT GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431
Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln
130 135 140
CTT GGT GCA GAT GTT GAT TGT TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 479
Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val
145 150 155
CGT GTC AAT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT 527
Arg Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser
160 165 170
GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG AGT GCC TTG CTG ATG CGT GCT CCT 575
Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro
175 180 185 190
TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC 623
Leu AlA Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile AsP Lys Leu Ile Ser
195 200 205
ATT CCG TAC GTC GAA ATG ACA TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG 671
Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val
210 215 220
AAA GCA GAG CAT TCT GAT AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 719
Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly
225 230 235SEQ ID No.3(续)
CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA 767
Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser
240 245 250
AGC GCA AGC TAT TTC TTG GCT GGT GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815
Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val
255 260 265 270
ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 863
Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe
275 280 285
GCT GAG GTA CTG GAG ATG ATG GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 911
Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr
290 295 300
AGC GTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959
Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His
305 310 315
CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG 1007
Leu Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met
320 325 330
ACT CTT GCT GTG GTT GCC CTC TTT GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA 1055
Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg
335 340 345 350
GAC GTG GCT TCC TGG AGA ATA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 1103
Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lye Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile
355 360 365
CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 1151
Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp
370 375 380
TAC TGC ATC ATC ACG CCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199
Tyr Cy Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp
385 390 395
ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCC ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 1247
Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys
400 405 410
GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 1295
Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr
415 420 425 430
TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 1337
Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
435 440TAA 1340SEQ ID No. 4:
SEQ ID NO: 4:
Ala Gly Ala Glu Glu Ila Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly
1 5 10 15
Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lya Ser Leu Sar Asn Arg Ile Leu Leu
20 25 30
Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn
35 40 45
Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu
50 55 60
Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys
65 70 75 80
Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lyg Glu Glu Val Gln Leu Phe
85 90 95
Leu Gly Asn Ala Gly Thr Als Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr
100 105 110
Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met
115 120 125
Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly
130 135 140
Ala Asp Val Asp Cys Phs Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val
145 150 155 160
Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser
165 170 175
Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala
180 185 190
Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lye Leu Ile Ser Ile Pro
195 200 205
Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala
210 215 220
Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys
225 230 235 240
Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala
245 250 255
Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val
360 265 270
Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu
275 280 285
Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val
290 295 300
Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lye His Leu Lys
305 310 315 320
Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Lau
325 330 335
Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val
340 345 350SEQ ID No.4(续)
SEQ ID NO:4(suite)
Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr
355 360 365
Glu Lau Thr Lya Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys
370 375 380
Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lya Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr
385 390 395 400
Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu
405 -- 410 4l5
Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Pha Pro
420 425 430
Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
435 440SEQ ID No.5:CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC 47
Ala Gly Ala Glu Glu lle Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile
1 5 10TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ATC 95Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile15 20 25 30CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT AGT AAC CTG 143Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu
35 40 45CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu
50 55 60GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val
65 70 75GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA GTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln
80 85 90CTC TTC TTG GGG AAT GCT GGA ACT GCA ATG CGG CCA TTG ACA GCA GCT 335Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala95 100 105 110GTT ACT GCT GCT GGT GGA AAT GCA ACT TAC GTG CTT AGT GGA GTA CCA 383Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro
115 120 125AGA ATG AGG GAG AGA CCC ATT GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln
130 135 140CTT GGT GCA GAT GTT GAT TGT TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 479Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val
145 150 155CGT GTC AAT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT 527Arg Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser
160 165 170GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG ATG GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT 575Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro175 180 185 190TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC 623Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser
195 200 205ATT CCG TAC GTC GAA ATG ACA TTG AGA TTG ATG AGA CGT TTT GGT GTG 671Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Pha Gly Val
210 215 220AAA GCA GAG CAT TCT GAT AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 719Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly
225 230 235SEQ ID No.5(续)
CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA 767
Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Sar
240 245 250
AGC GCA AGC TAT TTC TTG GCT GGT GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815
Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val
255 260 265 270
ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 863
Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe
275 280 285
GCT GAG GTA CTG GAG ATG ATG GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 911
Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr
-- 290 295 300
AGC GTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959
Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His
305 110 315
CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT AGT GTC GCC ATG 1007
Leu Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met
320 325 330
ACT CTT GCT GTG GTT GCC CTC TTT GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA 1055
Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg
335 340 345 350
GAC GTG GCT TCC TGG AGA GTA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 1103
Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile
355 360 365
CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 1151
Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp
370 375 380
TAC TGC ATC ATC GCG CCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199
Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp
385 390 395
ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCC ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 1247
Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys
400 405 410
GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 1295
Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr
415 420 425 430
TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 1337
Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
435 440
TAA 1340SEQ ID NO:6:Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly1 5 10 15Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu
20 25 30Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Aep Asn Leu Leu Asn
35 40 45Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Lau Arg Thr Leu Gly Leu
50 55 60Ger Val Glu Ala AsP Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys65 70 75 80Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe
85 90 95Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala Val Thr
100 105 110Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met
115 120 125Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly
130 135 140Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val145 150 155 160Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser
165 170 175Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala
180 185 190Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro
195 200 205Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala
210 215 220Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys225 230 235 240Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala
245 250 255Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val
260 265 270Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu
275 280 285Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr SeT Val
290 295 300Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg GLu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lya305 310 315 320Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lya Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu
325 330 335Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val
340 345 350SEQ ID No.6(续)SEQ ID NO:6(suite)Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr
355 360 365Glu Leu Thr Lya Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys
3T0 375 380Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr385 390 395 400Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Qlu
405 410 -- 415Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Pha Pro
420 425 430Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
435 440
Claims (34)
1．至少包括两个基本嵌合基因的嵌合基因，这两个基本嵌合基因中的每一个都包括都其在植物中进行转录所必需的调控元件及编码赋予植物除草剂耐受性的酶的编码序列，其特征在于其中的一个编码序列编码羟苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)。
2．根据权利要求1的嵌合基因，其特征在于它还额外含有第三个含编码赋予植物除草剂耐受性的酶的嵌合基因。
3．根据权利要求1或2的嵌合基因，其特征在于第二个编码序列衍生自一个赋予对双卤代羟基苄腈族的除草剂的耐受性的克雷伯氏菌属的腈酶基因。
4．根据权利要求3的嵌合基因，其特征在于除草剂是溴苯腈。
5．根据权利要求3的嵌合基因，其特征在于除草剂是碘苯腈。
6．根据权利要求2到5中任一项的嵌合基因，其特征在于第二个编码序列编码对草甘膦的抗性。
7．根据权利要求2到6中任一项的嵌合基因，其特征在于第二个编码序列编码赋予对抑制EPSPS的除草剂具耐受性的EPSPS。
8．根据权利要求7的嵌合基因，其特征在于第二个编码序列编码一个赋予对草甘膦耐受性的EPSPS。
9．根据权利要求6的嵌合基因，其特征在于第二个编码序列编码草甘膦氧化/还原酶，该酶对草甘膦具脱毒作用。
10．根据权利要求1到9中任一项的嵌合基因，其特征在于编码HPPD的序列衍生自假单胞菌属。
11．根据权利要求10的嵌合基因，其特征在于编码HPPD的序列衍生于荧光假单胞菌。
12．根据权利要求1到9中任一项的嵌合基因，其特征在于编码HPPD的序列来源于植物。
13．根据权利要求12的嵌合基因，其特征在于编码HPPD的序列来源于拟南芥。
14．根据权利要求11的嵌合基因，其特征在于编码HPPD的序列来源于野胡萝卜。
15．载体，其特征为它包含根据权利要求1到14中任一项的嵌合基因。
16．根据权利要求15的载体，其特征在于它由质粒组成。
17．植物细胞，其特征在于它至少含有两个基因，这两个基因中的每一个都含有编码赋予植物以除草剂耐受性的酶的编码序列，其中之一是羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂。
18．根据权利要求17的植物细胞，其特征在于它包含3个基本嵌合基因，这些基因中的每一个都含有调控元件以及编码赋予植物以除草剂耐受性的酶的编码序列。
19．根据权利要求17和18的植物细胞，其特征在于它含有至少一个根据权利要求1到14中任一项的嵌合基因。
20．植物，其特征在于它含有根据权利要求17到19中任一项的植物细胞。
21．使得植物至少对两种除草剂具耐受性的转化植物方法，其特征在于将根据权利要求1到14的一个基因插入到植物细胞中并且其特征还在于将转化细胞进行再生。
22．通过植物的转基因产生具多种除草剂抗性的方法，其特征在于：
-第一阶段，分别在几个细胞中插入每个都包含对其在植物中转录所必需的调控元件及编码赋予植物以除草剂抗性的酶的编码序列的一个基本基因，而且其特征还在于：
-然后将植株进行杂交以得到具多重抗性的植株。
23．用于根据权利要求20植物的除草处理的方法，其特征在于至少使用了两种除草剂。
24．根据权利要求23的方法，其特征在于使用了三种除草剂。
25．根据权利要求21到24中任一项的方法，其特征在于除草剂的其中之一是一种HPPD抑制剂。
26．根据权利要求21到25中任一项的方法，其特征在于将两种除草剂同时使用。
27．根据权利要求26的方法，其特征在于将两种除草剂以待用的单一组分的形式使用。
28．根据权利要求25的方法，其特征在于将两种除草剂要以新鲜制备的混合物的形式施用。
29．根据权利要求22到24中任一项的方法，其特征在于将两种除草剂连续施用。
30．根据权利要求22到29中任一项的方法，其特征在于抑制HPPD的除草剂是isoxaflutole。
31．根据权利要求22到29中任一项的方法，其特征在于抑制HPPD的除草剂是Sulcotrion。
32．根据权利要求22到31中任一项的方法，其特征在于除草剂是属于dihydroohydroxybenzonitrile族的。
33．根据权利要求32的方法，其特征在于除草剂选自溴苯腈和碘苯腈。
34．根据权利要求22到33中任一项的方法，其特征在于抑制EPSPS的除草剂是草甘膦或Sulfosate。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103361316A (zh) * | 2005-10-28 | 2013-10-23 | 美国陶氏益农公司 | 新除草剂抗性基因 |
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