CN1639344A - 选择性产生雄性或雌性不育植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产雄性或雌性不育植物的方法，该方法包括步骤：用多核苷酸转化植物材料，该多核苷酸编码至少一种与非毒害植物的物质反应产生毒害植物物质的酶，再生这种转化的材料为植物，其中不超过雄性或雌性配子形成和/或成熟的时期，向所述植物施用所述非毒害植物的物质，由此，非毒害植物的物质提供了毒害植物的物质的产生，该毒害植物的物质选择性阻止了所述配子的形成或使其没有功能，其中酶优先在雄性或雌性生殖结构中表达，其特征在于：(i)非毒害植物的物质选自：对非绿色组织有直接植物毒性的非膦酸酯除草剂的酯衍生物，D－α氨基酸，非蛋白质D－α氨基酸的肽衍生物，芳氧基苯氧丙酸类的S－对映体和芳氧基苯氧丙酸的酯衍生物的S－对映体，和(ii)酶选自：羧酸酯酶、D－氨基酸氧化酶、D－氨基酸脱氢酶、D－氨基酸消旋酶、2－芳基丙酰－CoA差向异构酶、α－甲酰基－CoA消旋酶、硫酯酶和酰基－CoA合成酶。

Description

选择性产生雄性或雌性不育植物的方法

背景技术

农作物植物中的杂种优势对产量提高有显著的影响。一般地，杂种与非杂种品种比较显示了增加的产量。杂种通常给予生长因子诸如水和肥料更多的回报单元(return unit)。杂种常常提供优良的胁迫耐受性、产量和成熟的一致性，也提供了联合以其它方式难以联合的特性或性状的简单育种机会。通常，植物中的杂种优势对于保证商业性开发足够重要。商用杂种广泛地用于许多农作物包括玉米、高梁、甜菜、向日葵和芸苔中。然而，主要是由于缺少经济性杂种种子的生产方法，所以主要还是以近亲交配培育小麦、大麦和水稻。

传统地，杂种种子生产涉及以一定行距种植分开区块的雌性和雄性亲本系，仅收获雌性亲本的种子。为了确保该种子是杂种，必需通过使得该株系雄性不育来最小化雌性亲本系的自花授粉。使得雌性亲本株系雄性不育的方法包括机械、化学和遗传方法。在雌雄同株植物，诸如玉米中，通过去雄雄性花序可以机械地、容易地获得雄性不育。然而，大多数农作物是雌雄异株，并且在相同的花朵中具有雄性和雌性器官，这使得这种物理去雄不实际。因此有时利用遗传方法。

出现的遗传雄性不育性状正常地受核基因控制，核基因中通常相对于相应的能育相关的等位基因，不育表型相关的等位基因隐性地表达。遗传雄性不育出现时正常地与单个隐性基因相关，而为了表达雄性不育，该单个隐性基因必需是纯合的。为了实际利用这种遗传雄性不育性状，育种者通常开发表型一致的雌性株系，该雌性株系分离为雄性不育和雄性能育植物。一旦鉴定雄性能育植物，就需要去劣，这是费力的。因为雄性能育植物是种群维持所必需的，所以不能从种群中排除它们，所以维持亲本株系总是存在问题。除了依赖于天然雄性不育等位基因的存在，也可以利用分子生物学的方法。可以基因工程改造植物，使得植物表达例如反义或核酶基因，该反义或核酶基因减少或消除了能生育的花粉形成必需的关键基因的表达。这种转基因的植物株系是雄性不育的，并且通过利用来源于雄性可育植物的花粉杂交，用于杂种种子的生产。这种株系的主要问题是通过它们与等基因可育株系杂交，它们在随后世代中只能维持杂合状态。这在产量是至关重要的杂种种子生产中可能是个问题。尽管，例如，通过连接除草剂抗性和雄性不育，可以选择性去劣雄性可育植物，但是仍旧必需在最初以超高的密度种植植物。

胞质雄性不育用于商业杂种生产需要稳定的雄性不育胞质和花粉来源。雄性不育的胞质遗传系统需要3种类型用于杂种生产的株系存在，A株系(胞质雄性不育)，B株系(雄性可育维持系)和R株系(具有恢复系基因的雄性可育)。该系统产生的三方面杂交涉及4种株系的维持和产生，一种近交的A和B株系，其它两种株系的雄性可育近亲交配。依靠单一来源的雄性不育胞质可能最小化育种灵活性，并且产生对特定疾病具有大规模敏感性的后代。

也可以通过抑制能生育的花粉形成的化学试剂的应用生产杂种种子。这些化学试剂称为杀配子剂，用于赋予短暂的雄性不育。但是杀配子剂的费用、注册性和可靠性限制了它们的应用。

传统杂种种子生产系统的缺点是需要分开种植成排或成区块的雄性和雌性亲本株系。这里，低效率的授粉是农作物物种，诸如小麦中特别棘手的问题，这种物种释放不能随风漂移很远的小量的花粉。在这种农作物中，多达三分之二的杂种生产田地需要专门用于雄性花粉供体植物，因此杂种种子生产变得不经济。

为了在小麦和其它农作物中获得更经济的种子生产，必需移动雄性和雌性植物使得它们更靠近以进行更有效的花粉转移；通过在同一排中相互间隔几厘米间作雄性和雌性植物，以进行最有效的花粉转移。在这种系统中，仅从(雄性不育)雌性亲本收获种子不实际。通过在种植混合中利用尽可能低百分数的这种雄性亲本植物和/或通过利用雌性不育的雄性植物可以最小化来源于雄性亲本的非杂种种子的污染。

尽管已经描述了构建显性雌性不育株系的方法(EP 412,006 A1(1990)；Goldman等，(1994)EMBO.J.，13，2976-2984)，但是，如同雄性不育株系一样，该株系必需保持为杂合子。

因此，需要杂种种子生产的简单、经济的方法。特别地，为了有效地生产杂种种子，需要提供可以作为纯合株系容易维持并且可用于有效的杂种种子生产的雄性不育雌性亲本株系和雌性不育雄性亲本株系。现有技术中所述用于达到该目的的方法包括这样的方法：其中从雄性和雌性亲本株系生产杂种种子，该雄性和雌性亲本株系的至少一个亲本株系包含优先地在花组织中表达的异源嵌合基因，其根据非毒害植物的物质的外源施用，有条件地使得该株系不育，该非毒害植物的物质可以被异源嵌合基因编码并且优先地在雄性或雌性生殖结构中表达的酶特异地和局部地转化为毒植物素。非毒害植物的物质可以是除草剂前体。具有这种有条件不育亲本株系的优点是它使得它们能够做为关于不育性性状的纯合子维持。只有外源施用非毒害植物的物质时，才破坏了可育性。在一个这种条件性雄性不育性系统的例子中，编码脱乙酰基酶的基因优先地在雄性花组织的花药毡绒层细胞中表达，在该细胞中，它转化外源施用的除草剂前体N-乙酰L膦丝菌素为毒植物素L膦丝菌素，因此，阻止能生育的花粉形成。在另一个相似例子中：(i)细菌细胞色素P450的毡绒层优先表达催化除草剂前体R7402转化为阻止能生育的花粉产生的磺脲毒植物素和(ii)膦酸单酯水解酶的毡绒层优先表达催化甘油草甘磷除草剂前体转化为毒植物素草甘磷，其也阻止能生育的花粉的产生。WO 98/03838描述了有条件雌性不育性系统的例子，其中能将除草剂前体转化为毒植物素的酶优先在雌性生殖结构中表达。

尽管存在生产有条件不育的雄性和雌性亲本系的这些方法，但是在农作物诸如小麦中，杂种种子的生产远远没有常规化。本发明涉及，尤其是现有技术中关于有条件雄性不育的雌性亲本系和有条件雌性不育的雄性亲本系产生的改进。

发明内容

本发明涉及作物杂种种子生产方法的改进。特别地，本发明涉及从雄性和雌性亲本系生产杂种种子的方法，其中该雄性和雌性亲本系的至少一个亲本系是有条件雌性或雄性不育，该有条件雌性或雄性不育取决于对作物是非毒害植物性的物质的外源施用，该物质包括除草剂前体。本发明还涉及在一定时期和以足够的量施用所述非毒害植物的物质的方法，其中该时期和足够的量能够最小化或阻止有条件不育亲本系中的自花受精。本发明也涉及也涉及产生有条件雄性或雌性不育植物的方法，该方法包括：i)用单独或一起编码一种或多种酶的一种或多种嵌合基因转化植物材料，所述酶具有与优选地为除草剂前体形式的非毒害植物的物质反应以产生毒害植物物质的能力。酶在一个或多个启动子可操作控制下表达，其中在有条件雄性不育植物的情况下，所述启动子引起酶优先在雄性生殖结构中表达，或者在有条件雌性不育植物的情况下，所述启动子引起所述酶优先在雌性生殖结构中表达。植物材料再生为有条件雄性或雌性不育的形态学正常的可育植物。本发明也包括有条件雄性不育植物联合有条件雌性不育植物以更有效生产杂种种子的用途，一些除草剂前体做为非毒害植物的物质的用途，和嵌合基因更有效地生产杂种种子的用途，用于本发明的嵌合基因和酶。本发明也提供了有条件雄性不育，有条件雌性不育植物，这些植物的种子和通过该方法生产的杂种种子。在本发明优选的实施方式中，生产杂种种子的方法应用的农作物植物是玉米、稻、高梁、小麦、黍、燕麦、芸苔(canola)和大麦。

根据本发明，提供了生产雄性或雌性不育植物的方法，该方法包括步骤：用编码至少一种酶的多核苷酸转化植物材料，该酶与非毒害植物的物质反应以产生毒害植物的物质，并且将由此转化的材料再生为植物，其中不超过雄或雌配子形成和/或成熟的时间，给植物施用所述非毒害植物的物质，这样非毒害植物的物质提供了毒害植物物质的产生，该毒害植物物质选择性阻止所述配子形成，或者以其它方式使得所述配子没有功能，其中该酶优先在雄性或雌性生殖结构中表达，其特征在于：(i)非毒害植物的物质选自：对非绿色组织是直接毒害植物性的非膦酸酯除草剂(non-phophonate herbicides)的酯衍生物，D-α氨基酸，非蛋白质D-α氨基酸的肽衍生物，芳氧基苯氧丙酸类的S-对映体和芳氧基苯氧丙酸类的酯衍生物的S-对映体，和(ii)酶选自：羧酸酯酶、D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶、D-氨基酸消旋酶、2-芳基丙酰-CoA差向异构酶、α-甲基酰基-CoA消旋酶、硫酯酶和酰基-CoA合成酶。

因为期望的目的是最大化杂种种子产量和因此最小化任何农作物的损害，所以在优选的实施方式中，非毒害植物的物质是除草剂前体，该除草剂前体选自对农作物相对非毒害植物的化合物。为了能够具有抗花组织的作用，也期望除草剂前体是在“非绿色”组织中有效的毒植物素的前体。因此，在本发明优选的实施方式中，除草剂前体选自是毒植物素前体的那些除草剂前体，该毒植物素对非绿色组织具有直接植物毒性，而不是在光合作用或在光合作用色素产生中具有主要作用位点的那些。最小化杂种种子生产的花费也是期望的目的。因此，在优先的实施方式中，除草剂前体选自化学物质，该化学物质用在农作物中已经得到或正在受到适合的管理机关批准。

术语：定义

这里所用“基因”指包含几个可操作地连接的DNA片段的任何DNA序列，所述DNA片段是诸如启动子和5’调节区，编码区和包含聚腺苷酸化位点的非翻译3’区。

“嵌合”当指基因或DNA序列时，用于指在自然界中，编码序列不与基因中DNA的启动子或至少一个其它调节区相关的事实。

这里所用“嵌合基因”指一种基因，其中在自然界中，其编码序列不与基因中DNA的启动子或至少一个其它调节区相关。

这里所用的“表达盒子”指可转移的DNA区，包含侧翼有一个或多个限制或其它位点的嵌合基因，所述位点有利于从一个DNA基因座精确地切除并且插入另一个DNA基因座。

本发明上下文中“非毒害植物的物质”是对本发明方法应用的任何特定农作物的植物、细胞或组织相对非毒害植物的物质。非毒害植物的物质不需要在所有植物的所有植物组织中都是非毒害植物的。非毒害植物的物质包括除草剂前体物质，该除草剂前体是对植物组织没有明显直接毒性作用的物质，但是它是活性毒植物素的前体。在敏感植物物种中，通过植物中将这种除草剂前体转化为毒植物素的内源酶作用，这种除草剂前体间接地做为除草剂。

在本发明上下文中“毒植物素”是本发明方法应用的特定农作物的植物、植物组织和植物细胞具有毒性的物质。这种毒植物素不需要对所有植物物种的所有植物组织都是植物毒性的。

“雌性生殖结构”意指雌配子和那些专门用于雌配子产生、成熟和生育力的植物部分。通常地，该定义包括包含心皮或雌蕊群(“雌蕊”)的植物部分。植物的心皮包括但不限于柱头、花柱、子房和柱头、花柱、子房包含的细胞或组织。

“雄性生殖结构”意指雄配子和专门用于雄配子产生、成熟和生育力的植物部分。该定义包括包含，例如小孢子、雄蕊、绒毡层、花药和花粉的植物部分。

这里所用的“雌性不育植物”是当有功能或能生育的花粉给其授粉时，不能支持能生育的种子形成的植物。这种雌性不育性可以是育种选择或转基因存在的结果。“有条件雌性不育植物”指在正常生长条件下是雌性可育，而在特定条件下可以变成雌性不育的植物。在本发明上下文中，所述条件包括除草剂前体或其它非毒害植物的物质的外源施用。在发明上下文中，这种“雌性不育植物”或“有条件雌性不育植物”保留了雄性可育并且能够产生能生育的花粉。

这里所用“雄性不育植物”是不能支持能生育的花粉形成的植物。这种雄性不育性可以是育种选择或转基因存在的结果。“有条件雄性不育植物”指在正常生长条件下是雄性可育，而在特定条件下可以变成雄性不育的植物。例如所述条件可以包括物理去雄或特定化学杀配子剂的施用。在本发明上下文中，所述条件特别地包括除草剂前体或其它非毒害植物的物质的外源施用。在本发明上下文中，这种“雄性不育植物”或“有条件雄性不育植物”保留了雌性可育并且当有功能或能生育的花粉给其授粉时，其能够产生能生育的种子。

这里所用的“启动子区”是包含至少功能性启动子和可选地一些或所有它的相关上游调节序列和/或相关下游序列的DNA区，该上游调节序列包含增强子序列，该下游序列包含启动子内源性基因的一些或所有5’非翻译区。

这里所用“间作”指在大田中种植植物或种子的方法，该方法确保雄性可育植物对雄性不育或有条件雄性不育植物的充分异花授粉。通过种植前，以不同的混合比例(80/20；90；10；等)随机混合雌性和雄性亲本种子，或者通过以特定的田地模式种植，由此使得不同种子交替可以达到该目的。当需要分开收获不同植物时，优选以交替区块或排种植。

这里所用的“羧酸酯酶”仅仅包含正确分类为EC 3.1.n的酶。

在本发明方法中，所述非毒害植物的物质可以与至少一种其它物质一起以混合物形式施用，所述物质选自氨基酸、安全剂、杀配子剂、谷胱甘肽-S-转移酶诱导物、细胞色素P450诱导物、肥料、除草剂、杀线虫剂、增效剂、杀虫剂、杀真菌剂、激素、植物生长调节剂和细胞色素P450抑制剂。在特定实施方式中，所述非毒害植物的物质可以与胡椒基丁醚或马拉硫磷以混合物形式施用。在特定实施方式中，所述非毒害植物的物质可以与相同的毒害植物物质以混合物形式施用，其中所述非毒害植物的物质是毒害植物物质的前体。

本发明方法中所用的酶可以是羧酸酯酶，非毒害植物的物质可以是咪草酸(imazamethabenz)或氟燕灵(flamprop)的酯。在具体涉及小麦的本发明特别优先的形式中，非毒害植物的物质是除草剂前体，该除草剂前体选自：咪草酸甲酯(imazamethabenz methyl)，氟燕灵甲酯(flamprop methyl)或氟燕灵异丙酯(flamprop isopropyl)。

所述酶可以是D-氨基酸氧化酶，D-氨基酸脱氢酶或D-氨基酸消旋酶，此时非毒害植物的物质可以是D氨基酸，特别地，它可以是膦丝菌素的D对映体，双丙氨酰膦的D对映体，或者选自D-丙氨酸、D丝氨酸、D异亮氨酸、D甲硫氨酸、D亮氨酸或D缬氨酸。这里所用“D-氨基酸氧化酶”意指能氧化D-氨基酸以产生2酮酸的任何酶，并且包括对天冬氨酸特异的酶，称为“D-天冬氨酸氧化酶”。

做为替代技术方案，本发明方法中所用的酶选自：2-芳基丙酰-CoA差向异构酶、α-甲基酰基-CoA消旋酶、硫酯酶和酰基-CoA合成酶，那么非毒害植物的物质可以是芳氧基苯氧丙酸的S-对映体和芳氧基苯氧丙酸酯的S-对映体。

编码酶的嵌合基因可以选自包含DNA编码序列的基因，其中该酶具有单独或与其它物质联合与非毒害植物的物质反应产生毒害植物物质的能力，该DNA编码序列编码一种或多种下面的酶：

(1)能催化水解反应的羧酸酯酶：

(2)能催化水解反应的羧酸酯酶：

  和/或

(3)能催化氧化反应的D-氨基酸氧化酶：

和在一些实施方式中，特别地是反应

(4)能催化氧化反应的D-氨基酸脱氢酶：

D-氨基酸脱氢酶可以是膜相关酶，该膜相关酶通过电子受体将电子与结合膜的电子传递链偶联，通过该电子传递链，最终的电子受体可以是，例如NAD⁺或O₂。

(5)能催化相互转化的氨基酸消旋酶：

D-膦丝菌素<>L-膦丝菌素

(6)能催化下面一种或多种反应的2-芳基丙酰-CoA差向异构酶或α-甲基酰基-CoA消旋酶：

S-吡氟禾草灵-CoA→R-吡氟禾草灵-CoA和/或

S-喹禾灵-CoA→R-喹禾灵-CoA和/或

S-喔草酯-CoA→R-喔草酯-CoA和/或

S-吡氟氯禾灵-CoA→R-吡氟氯禾灵-CoA和/或

S-噁唑禾草灵-CoA→R-噁唑禾草灵-CoA和/或

S-氯甲草-CoA→R-氯甲草-CoA和/或

S-Cyhalofop-CoA→R-Cyhalofop-CoA和/或

S-炔草酯-CoA→R-炔草酯-CoA

(7)能催化水解反应的硫酯酶：

和/或

和/或

和/或

和/或

和/或

和/或

和/或

(8)能催化下列反应的酰基-CoA合成酶：

和/或

和/或

和/或

和/或

和/或

和/或

和/或

和/或

所述羧酸酯酶可以选自羧酸酯酶B(EC 3.1.1.1)类型酶，特别是来源于节杆菌属(Arthrobacter sp)，芽孢杆菌属(Bacillus sp)，猪肝脏，酵母属(Saccharomyces sp)或集胞藻属(Synechocystis sp)的羧酸酯酶。优选的这种酶可以选自具有Swissprot记录号Q01470，P37967，Q29550(来源于60-1703的成熟肽序列)，P40363或SEQID No.2(本申请)的蛋白质，并且编码羧酸酯酶的DNA序列可以选自包含在EMBL记录号M94965，BS06089，SSCE，Z34288和SEQID No.1(本申请)中的DNA序列。适于本发明使用的其它羧酸酯酶和DNA编码序列从植物和微生物中选择，在基本培养基中，所述植物和微生物被发现对咪草酸甲酯的生长抑制显示了和对咪草酸的生长抑制相似的敏感性。利用适合的DNA探针鉴定这种生物体DNA文库的候选酯酶基因，并且通过亚克隆分离该候选酯酶基因。做为可替代的方案，通过筛选咪草酸甲酯敏感表型的转化体，从适合的咪草酸甲酯不敏感宿主生物体中的表达文库鉴定和筛选编码适合的酶的基因。同样地，可根据大肠杆菌(E.coli)中的表达，并且在体内或体外，通过常规的方法检测期望的氟燕灵酯或咪草酸酯(imazamethabenz ester)的酯酶活性，筛选适合和改进的基因和酶，该常规方法包括通过靶酶诸如乙酰醇酸合酶的抑制，通过HPLC/UV和/或通过衍生化和GC MS检测灭草烟或氟燕灵。

D-氨基酸氧化酶(DAMOX)可以选自红冬孢属(Rhodosporidiumsp)(红酵母属(Rhodotorula sp))，三角酵母属(Trigonopsis Sp)，猪，镰刀菌属(Fusarium Sp)，假丝酵母属(Candida Sp)，裂殖糖酵母属(Schizosasaccharomyces Sp)，和轮枝孢属(Verticillium Sp)，并且可以选自具有对应于Swissprot记录号P80324，Q99042，P00371，P24552或SPTREMBL号Q9HGY3和Q9Y7N4的序列的蛋白质。编码D氨基酸氧化酶的DNA序列可以选自包含在EMBL记录号A56901，RGU60066，Z50019，SSDA04，D00809，AB042032，RCDAAOX，A81420和SPCC1450中的序列。D-氨基酸氧化酶是遍在黄素酶。

在非毒害植物的物质是D-膦丝菌素或D-双丙氨酰膦或D-天冬氨酸或D-ghitamate情况下，特别优选的D-氨基酸氧化酶获自纤细红酶母(Rhodotorula gracilis)突变体或是D-天冬氨酸氧化酶。无论非毒害植物的物质是什么，当这种突变体与野生型序列比较时，其都可以在213和238位置含有单或双氨基酸置换。优选地，在位置213，用Arg，Lys，Ser，Cys，Asn或Ala置换野生型甲硫氨酸，而在位置238，用His，Ser，Gys，Asn或Ala置换野生型Tyr。

然而，所述酶可以在前段提到的位置以外还包含其它置换，或者在不同于前段提到的位置包含置换。特别地，可以用选自His，Ser，Lys，Ala，Arg和Asp，优选是His，Ser或Ala的残基置换在野生型序列位置58的Phe。此外，或做为可替代方案，可以用选自His，Ser，Lys，Ala，Arg和Asp，优选是Ser或Ala的残基置换在野生型序列位置213的Met。此外，或做为可替代的方案，可以用选自His，Ser，Ala，Arg和Asp的残基置换在野生型序列位置223的Tyr。此外，或做为可替代的方案，可以用选自His，Ser，Lys，Ala，Arg和Asp的残基置换在野生型序列位置238的Tyr。

该酶特别优选的突变体形式包含至少2种上述突变。这种双突变体的第一实施方式在位置58有His(而不是野生型序列中的Phe)，在位置213有Ser(而不是Met)。这种双突变体的第二实施方式在位置58有Ser(而不是野生型序列中的Phe)，在位置213有Arg(而不是野生型Met)。

在非毒害植物的物质是D-氨基酸，但不是D膦丝菌素或D-双丙氨酰膦的情况下，那么酶是D-氨基酸氧化酶。优选地，D-氨基酸不是内源植物代谢物，并且选择韧皮部可移动、在植物中代谢稳定(优选地，在植物中具有约1周以上的t1/2)和是所述氧化酶有效底物的D-氨基酸。酶的D-氨基酸氧化作用伴随着氧还原为毒害植物的过氧化物和/或超氧阴离子的还原作用。

在优选的实施方式中，氧化酶靶向过氧化物酶体外的亚细胞位置。例如，通过修饰基因以缺失或修饰3个C-末端氨基酸(例如，在纤细红酶母(Rhodotorula gracilis)D氨基酸氧化酶的情况下是SKL)，和/或通过向N-末端添加叶绿体或线粒体转运肽的序列可以达到该目的。

通过本领域技术人员已知和本发明公开扩充的突变和筛选方法，优选地可以从真菌来源获得其它适合的D氨基酸氧化酶。

适于本发明使用的其它D氨基酸氧化酶(或同样地，膦丝菌素消旋酶)和DNA编码序列选自生物体，可选地经过诱变的生物体，其中发现在D-膦丝菌素存在的情况下，在诱导D-氨基酸氧化酶(或膦丝菌素消旋酶)的条件下，N限制性培养基上的生长选择性地受到抑制。因此，例如，通过用适合的简并DNA探针(例如，根据确定的D-氨基酸氧化酶共有序列诸如PROSITE，PS00677)探测杂交这种生物体的基因文库，和亚克隆，可以获得适于本发明的D-氨基酸氧化酶基因。做为可替代的方案，通过筛选基本培养基上转化为对D-膦丝菌素的生长抑制具有增加敏感性表型的适合宿主细胞诸如大肠杆菌(E.coli)或酵母(适合的宿主株系缺少对D-膦丝菌素的内源氧化酶或脱氢酶活性)中基因表达文库，获得编码适合的酶的基因。该方法取决于转化的大肠杆菌(E.coli)克隆通过它们内源L转氨酶活性和异源氧化酶的联合作用，从D-PPT产生L-PPT的能力。做为可替代的方案，根据所表达酶氧化D-膦丝菌素期望能力的体外测定筛选适合和改进的基因。存在许多直接测定D-氨基酸氧化酶活性的方法，诸如基于过氧化物(Enzyme Microb.Technol.，(2000)，27(8)，605-611)的测定，利用氧电极的氧消耗的测定法或基于氨的直接测定法。

在本发明实施方式中，将优选真菌来源的DAMOX基因克隆到启动子(例如，GAL启动子)可操作控制的穿梭载体中，该启动子能够在将要进行筛选的宿主生物体(优选酵母)中表达。然后，例如通过Mn2+-有毒PCR，在DNA修复/编辑过程缺陷的株系诸如大肠杆菌(E.coli)株系XL1 red中进行质粒DNA复制，或者通过在利用，例如X射线、UV光线、化学诱变剂添加经过诱变的宿主株系中进行质粒DNA复制对该基因进行诱变，并且将其转化到宿主生物体(优选酵母)中。通过例如以下方式筛选具有增强的氧化D-PPT能力的期望特性的编码DAMOX的期望DNA(这在基于穿梭载体中存在的选择性标记的可选的，最初的转化体筛选步骤之后进行，所述筛选步骤允许，例如通过在潮霉素存在情况下的生长或原养型的恢复进行筛选)：

(a)筛选有能力利用作为唯一氮源的氨基酸的转化细胞，该氨基酸与D-膦丝菌素化学上相似。例如，筛选在作为唯一氮源的D-PPT(和其酯)的类似物上能生长的转化酵母菌落，在D-PPT(和其酯)类似物中，用羧酸(即，D-谷氨酸)、磺酸、膦酸、砜或亚砜部分(或它们的酯)置换次膦酸(phosphinic acid)部分。例如

(b)筛选能利用D-PPT本身做为唯一N源的转化细胞。为了进行该筛选，还必需使用能使L-膦丝菌素对谷氨酰胺合成酶抑制作用无效的基因转化宿主细胞。例如穿梭载体也可以包含编码酶诸如失活L-PPT的PAT的基因。

可以重复突变和筛选的循环。可以进行克隆、表达、部分纯化和动力学表征D-氨基酸氧化酶以鉴定具有最适特性(例如，酶稳定性、D-PPT氧化作用的高kcat/Km值、任何内源植物底物的最小氧化作用、最适宜pH等)的基因和DAMOXs。

在非毒害植物的物质是D-膦丝菌素(PPT)的情况下，可以从D和L-PPT混合物获得它。可以向大肠杆菌(E.coli)细胞(可选地，最小化N-乙酰PPT脱乙酰基酶活性背景水平的arg E突变体)的(优选基本)培养基添加DL PPT，所述大肠杆菌被转化并且以高水平诱导表达PAT基因(编码从乙酰CoA转移乙酰基到L-PPT的酶)。在(例如，通过利用31-P NMR监测转化判断)使得L成分基本所有都是N-乙酰化的适合时间后，利用连续步骤，例如，在高和低pH的溶剂萃取，阴离子和阳离子交换层析，用手性阳离子诸如chinchocine的选择性结晶作用，或本领域已知的其它方法诸如具有两个非混溶含水相做为相系统的液体/液体萃取(参见，USP 5,153,355中的方法)，从无细胞培养基回收和纯化D-PPT。

做为可替代方案，可以通过酶促方法获得D-PPT，在该方法中通过(I)L-氨基转移酶(例如，来源于大肠杆菌(E.coli))和(II)谷氨酸脱羧酶的联合作用，将DL PPT+2酮戊二酸转化为主要是DPPT，2-氧代PPT(和其脱羧基产物)和GABA的混合物。利用本领域已知和上文概述的方法，从反应混合物解析期望的纯D PPT。

D-PPT也可以用酶促方法获得，在该方法中，通过(I)L-氨基转移酶和(II)谷氨酸脱氢酶的联合作用将DL PPT+2酮戊二酸+NAD转化为主要是D-PPT、2-氧代PPT(和其脱羧化产物)NADH和氨的混合物。目的D-PPT从反应混合物中纯化。

在产生D-PPT的另一个方法中，用L-氨基酸氧化酶处理DL PPT，这样仅仅保留了期望的D形式氨基酸。然后，从反应混合物纯化该D-PPT。

另一个方法包括(I)转化DL PPT为N-乙酰DL PPT(利用本领域熟知的醋酸酐或其它乙酰化试剂和方法)和(II)用D-氨酰化酶处理N-乙酰DL PPT，这样仅N-乙酰D PPT脱乙酰化。从反应混合物纯化由此得到的D-PPT。例如，通过结合至Dowex阴离子交换树脂和用40mM甲酸洗脱，从N-乙酰-L-PPT解析D-PPT。在适合的加样条件下，该酸洗脱D-PPT，而留下与结合柱子的N-乙酰-L-PPT。

另一个方法包括在非水溶剂中，用L-氨基酰化酶和酰化试剂处理DL PPT，这样仅留下非乙酰化形式的期望D-PPT。

制备纯D-PPT的另一个方法包括利用手性碱(chiral base)诸如chinchocine和纯D-PPT和手性碱的晶种的添加，从DL PPT的对映体选择性结晶作用。

从DL-PPT制备纯D-PPT的另一种方法利用手性碱柱子，通过直接手性层析。

在下面的一个实施例中给出了纯D-PPT产生的详细方法。

2-芳基丙酰-CoA差向异构酶或α-甲基酰基-CoA消旋酶(EC 5.1.99.4)可以选自：通过大鼠肝脏、支顶孢属(Acremomium sp)或粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)产生的这种酶。2-芳基丙酰-CoA差向异构酶或α-甲基酰基-CoA消旋酶(EC 5.1.99.4)可以选自：具有对应于GENESEQP Derwent数据库中AAR49827，Swisspro中P70473或SEQ ID No.4(本申请)的序列的蛋白质，2-芳基丙酰-CoA差向异构酶或α-甲基酰基-CoA消旋酶(EC 5.1.99.4)可以由下列DNA编码序列编码，所述DNA序列选自：包含在GENESEQNDerwent数据库记录号AAQ44447，EMBL记录号RN2ARYLCO和RNU89905和SEQ ID No.3(本申请)中的序列。

本发明所用的酰基CoA合成酶可以是“长链”酰基CoA合成酶(EC 6.2.1.3)，其选自：欧洲油菜(Brassica napus)，大鼠肝脏，酵母属(Saccharomyces sp)或拟南介属(Arabidopsis)产生的那些酶。所述合成酶可以选自：具有对应于SPTREMBL序列Q96338，Swissprot P18163，Swissprot P39518，SPTREMBL Q9C5U7或SPTREMBL Q9TOAO的序列的蛋白质，而编码酰基CoA合成酶的DNA序列可以选自：包含在EMBL记录号BNAMPBP2，J05439，X77783和AB030317中的序列。

可以根据来源生物体转化S-芳氧基苯氧丙酸类为R-芳氧基苯氧丙酸类和/或转化S-ibuprofen为R-ibuprofen的能力，选择适于本发明所用的酰基CoA合成酶，2-芳基丙酰-CoA差向异构酶和硫酯酶和/或编码它们的DNA序列。例如，可以从土壤样品获得这种生物体，并且本领域熟知细胞培养物和微生物肉汤中测定和检测这种手性转换的方法(参见，Menzel-Soglowek等，(1990)J.Chromatogr.，532,295-303；Bewick(1986)Pestic.Sci.，17，349-356)。因此，酰基CoA合成酶，2-芳基丙酰-CoA差向异构酶和/或硫酯酶，和可选地编码它们的DNA序列可以来源于：简单节杆菌(4rthrobacter simplex)NCIB 8929；玫瑰色石蜡节杆菌(Arthrobacter roseoparaffineus)ATCC15584；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 15841；灰葡萄孢(Botrytis cinerea)CM1 124882；Brevibacterium butanicum ATCC15841；希氏短杆菌属(Brevibacterium healii)ATCC 15527；酮戊二酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum)ATCC 21004；Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195；束棒杆菌(Corynebacterium fascians)；Corynebacterium fijikoense ATCC 21496；Methanomonas methanolica NRRL B-5758；玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)；金色分枝杆菌(Mycobacterium aurum)NCTC 1043；嗜石油分枝杆菌(Mycobacterium petroteophilum)ATCC21497；草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)NCTC 10266；耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)ATCC 19420；不透明诺卡菌(Nocardia opaca)NCIB 9409；Nocardiopsis asteroids ATCC 21943；缺陷假单孢菌(Psuedomonas dimimuta)NCIB 9393；勒氏假单孢菌(Psuedomonas lemoignei)NCIB 9947；紫红红球菌(Rhodococcusrhodocrous)ATCC 13808；紫红红球菌(Rhodococcus rhodocrous)ATCC 21197；红球菌属(Rhodococcus sp)ATCC 21499；和红球菌属(Rhodococcus sp)ATCC 31337。利用本领域熟知的方法，利用基于其它酰基CoA合成酶，2-芳基丙酰-CoA差向异构酶和硫酯酶已知序列的适合简并的探针，容易从这些生物体的适合基因文库克隆和筛选包含DNA编码序列的候选和改进基因。通过在适合宿主中制备表达文库，和利用体外或整个生物体培养测定法，筛选文库克隆进行全部手性转换的能力，或可替代地催化单个酰基CoA合成酶(利用微粒体部分)，2-芳基丙酰-CoA差向异构酶或硫酯酶部分反应中每一个的能力，选择替代的和额外的适当基因。这些活性体外测定的适合方法与文献中所述用于ibuprofen的方法相似或相同(例如，Shieh和Chen(1993)JBC，268，3487-3493)。

本发明方法中所用的酶可以是膦丝菌素消旋酶，通过谷氨酸消旋酶基因的诱变和/或重组改组，接着进行重复循环的筛选和向增加膦丝菌素消旋酶活性水平的方向进化产生它的DNA编码序列。谷氨酸消旋酶普遍存在细菌中，并且具有两种类型，一种类型依赖于吡哆醛磷酸做为辅因子，另一种类型是辅因子依赖型，并且包含2个活性位点半胱氨酸残基。在本发明一个实施方式中，选择编码戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，溶血葡萄球菌(Staphylococcushemolyticus)和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)谷氨酸消旋酶的序列用于突变和/或重组家族改组。在特定实施方式中，选定用于改组的基因编码具有对应于(Swissprot)序列O82826，P94556和031332的序列的蛋白质。通过从适合的宿主细胞诸如大肠杆菌(E.coli)或酵母中的表达文库筛选那些菌落，选择适于本发明使用的基因，其中在基本培养基中该菌落对D-膦丝菌素生长抑制显示了增加的敏感性。L-PPT抑制谷氨酰胺合成酶，而D-PPT不抑制。除非补加谷氨酰胺，否则转化D-为L-PPT的谷氨酸消旋酶突变体克隆将不在基本培养基上生长。在适合的宿主株系中，不表达内源D-氨基酸氧化酶或D-氨基酸脱氢酶活性，或者该活性不包含D-膦丝菌素做为底物。做为可替代的方案，可以根据所编码酶互换D和L膦丝菌素能力的体外或体内测定，选择适合的基因。适合的这种测定法可以根据α-质子交换，检测从D-膦丝菌素到L-膦丝菌素形成的生物测定法的应用，或者，例如，利用与适合的D-氨基酸氧化酶偶联，L-膦丝菌素到D-膦丝菌素转换的检测。

可选地，可以进一步突变和选择本发明所用编码酶的DNA序列，以产生具有改进效用的其它有用的酶。因此，改进酶的许多特性，包括对期望底物的催化活性(kcat/Km)，温度稳定性和最适宜pH。产生、筛选和选择这种改进的变异体的方法是公知的。例如，通过诱变方法(例如，通过UV，化学或靶向寡核苷酸PCR诱变，通过具有易错DNA复制的细菌或酵母株系，诸如大肠杆菌(E.coli)XL1 red传代DNA)产生适合的变异体DNA序列。特别地，通过在例如WO0061740，28-41页中概述的大量DNA改组或“有性PCR”替代方法中的任何一种方法产生这种基因，这里本发明参考文献包含这篇文献的所有内容。许多方法适于选择这种改进的基因。可以适合地在适合的宿主细胞诸如大肠杆菌(E.coli)或酵母中表达该基因，并且利用如，例如这里所述适合的这种测定法选择改进的该基因。

能单独或与其它酶联合，转化非毒害植物的物质为毒害植物物质的本发明所用酶的编码嵌合基因每个都可以包含编码一种所述酶的DNA序列，该DNA序列可操作地连接5’启动子区，该启动子区优先地将表达定向到雄性或雌性生殖结构。该表达特异性确保仅在能生育的种子或能生育的花粉形成所必需的组织和细胞位点中发挥所表达酶的作用，并且在适合的非毒害植物的物质(可以是除草剂前体)存在的情况下，除了该表达酶对生育力的作用外，它不会对植物有害。除了启动子区外，本发明嵌合基因还可以包含3’转录终止子序列。它负责转录终止和正确的mRNA聚腺苷酸化。本领域已知许多这种3’转录终止子序列，并且其适于用在本发明嵌合基因中。在特定的实施方式中，3’转录终止子序列选自：CMV 35S终止子，tml终止子，胭脂氨酸合酶(nos)终止子和豌豆rbcS E0终止子。

适于用在所述嵌合基因一些实施方式中的5’启动子区包含优先在雌性花组织中表达的基因5’区。在一些实施方式中，5’启动子区选自：烟草stig 1启动子(Goldman等，(1994)EMBO J.，13，2976-2984)，修饰的S13启动子(Dzelkalns等，(1993)Plant Cell，5，8555)，AGL5启动子(Savidge等，(1995)Plant Cell，7，721-733)和玉米-心皮特异性ZAG2基因的5’启动子区(Thiessen等，(1995)Gene，156，155-166)。可选地，从对应于本领域已知优先在雌性生殖结构中表达的cDNA序列的基因组DNA编码序列上游区获得其它适合的启动子区。在一些实施方式中，这种探针cDNAs选自：拟南介属(Arabidopsis)Fbp7和Fbp11基因(Angenent等，(1995)Plant Cell，7，1569-1582)和兰花特异性cDNAs O40，O108，O39，O126和O141(Nadeau等，(1996)Plant Cell，8，213-239)。在特定的实施方式中，含有与雌性生殖结构优先表达相关的基因组DNA的5’启动子区选自包含在如下克隆中的DNA区域：具有记录号NRRL B-21920的基因组DNA克隆pSH64，与cDNA P26-A4杂交的具有记录号NRRL B-21655的基因组克隆pCIB 10302，和与cDNA克隆P19-QA杂交的具有记录号NRRLB-21919的基因组DNA克隆X2-1。在另一个特定实施方式中，这些启动子区包含WO 98/39462中SEQ ID No.11的核苷酸1到1390，SEQID No.2和SEQ ID No.4的核苷酸1到1093。在另一个实施方式中，通过本领域技术人员熟悉的方法分离和克隆适于本发明嵌合基因中使用的其它5’启动子区。例如，通过从组织诸如玉米须或小麦雌蕊分离RNA，接着利用技术诸如差异显示、PCR选择cDNA扣除和扣除cDNA文库的构建进行差异筛选，鉴定在雌性生殖结构中表达的新的转录物。分离优选在雌性组织表达，不在植物其它部分诸如叶片、根和穗中表达的cDNA克隆。可选地，通过Northern印迹进一步证实表达的组织特异性。cDNA克隆用作基因组文库筛选的探针。从基因组DNA克隆获得与组织优先表达相关的5’启动子区和可选地，3’非翻译DNA区，并且用于在雌性生殖结构中优先表达的嵌合基因构建中。

适于用在所述嵌合基因一些实施方式中的5’启动子区包含在雄性花组织中优先表达的基因5’区。这些包括在花粉、绒毡层或花药中其它结构中表达的启动子区。在一些实施方式中，这些5’启动子区选自：LAT52启动子(Twell等，(1989)Dev.，109，705-713)，番茄A127启动子(Dotson等，(1996)Plant J.，10，383＝392)，玉米Zmg启动子(Hamilton等，(1989)Sex.Plant Reprod.2，208-212)，玉米CDPK启动子(Guerro等，(1990)Mol.Gen.Genet.，224，161-168)和USP5477002(全部引入本文作为参考)中公开的花药特异性ant32和ant43D启动子。在一些其它实施方式中，5’启动子区选自：玉米的绒毡层特异性启动子CA55(WO 92/13956中所述“Pca55”)，水稻绒毡层特异性启动子E1(USP 5639948中所述)，水稻绒毡层特异性启动子T72(USP 5639948中所述)，水稻RA8花药特异性启动子(EMBL/Genbank记录号AF042275；Jean Js等，(1999)PMB，39，35-44)，花药特异性Tap1启动子(Spena等，(1992)Theor ApplGenet 84，520-527)和玉米ZmC5-花粉特异性启动子(EMBL/Genbank记录号Y13285；Wakeley等，(1998)PMB，37，187-192)。可选地，从对应于本领域已知优先在雄性生殖结构中表达的cDNA序列的基因组DNA编码序列上游区获得其它适合的启动子区。在一些实施方式中，这种探针cDNAs选自：兰花花粉管特异性细胞色素P450基因(Nadeau等，(1996)Plant Cell，8，213-239)，拟南介(Arabidopsis)的Bcp1基因(Xu等，(1995)P.N.A.S.，92，2106-2110)和玉米雄花特异性MFS14基因(Wright S Y等，(1993)Plant J 3，41-49)。在另一个实施方式中，通过本领域技术人员熟悉的方法分离和克隆适于本发明嵌合基因中使用的其它5’启动子区。例如，通过从组织诸如穗、花粉管、花药或绒毡层分离RNA，接着利用技术诸如差异显示、PCR选择cDNA扣除和扣除cDNA文库的构建进行差异筛选，鉴定在雄性生殖结构中表达的新的转录物。分离优选在雄性组织表达，不在植物其它部分诸如叶片、根和柱头中表达的cDNA克隆。可选地，通过Northern印迹进一步证实表达的组织特异性。cDNA克隆用作基因组文库筛选的探针。从基因组DNA克隆获得与组织优先表达相关的5’启动子区和3’非翻译DNA区，并且用于在雄性生殖结构中优先表达的嵌合基因构建中。

用在本发明嵌合基因中的其它启动子区包含水稻Osmads 13基因上游区，水稻花药的OSG基因，和水稻YY2基因。一般地，选择在雄性或雌性生殖结构中产生高效、早期、持续和优先表达的启动子区做为最适合的启动子区。启动子区还可以包含互相的嵌合联合和与增强子区的嵌合联合。

可选地，嵌合基因在紧邻编码参与非毒害植物的物质到毒植物素转换的酶的DNA序列之前包含区域，其编码能将所述酶靶向亚细胞细胞器诸如叶绿体、过氧化物酶体(除了当毒植物素是过氧化物或超氧阴离子时外)或线粒体的肽序列，并且所述靶向蛋白质可以具有(i)叶绿体转运肽序列或(ii)叶绿体转移肽-叶绿体蛋白质N-末端部分-叶绿体转运肽的序列。例如，在所述DNA序列编码D-氨基酸脱氢酶的情况下，其中预期所述D-氨基酸脱氢酶在包含膜电子传递链的区室诸如线粒体或叶绿体中最好地起作用，或者，例如，在DNA序列编码仅仅催化整个期望转化中部分步骤的酶且全部反应需要与区室化代谢物和内源活性联合的情况下，这特别有利。特别地，为了靶向线粒体，紧邻编码酶的DNA序列之前的所述DNA区编码线粒体转运肽序列。在一些实施方式中，转运肽序列可以选自：Nicotiniaplumbaginifolia线粒体ATP合酶β-亚基，线粒体特异性依赖于NADP的异柠檬酸脱氢酶，呼吸链复合物I的NADPH结合亚基和酵母线粒体色氨酰-tRNA-合成酶的内源转运肽序列(WO 6121513)。

本发明方法中所用的多核苷酸可以包含一种或多种编码酶的嵌合基因，该酶催化参与从非毒害植物的物质产生毒植物素的反应。可选地，多核苷酸还包含基因和嵌合基因，诸如嵌合标记基因。这里所用的嵌合标记基因包含植物细胞中有活性的启动子表达控制下的标记DNA。该标记DNA编码RNA，蛋白质或多肽，当在植物、植物组织或植物细胞中表达时，其能够使得这种植物材料区别于没有表达标记DNA的植物材料。标记基因的例子是给细胞提供特定颜色的基因，如A1基因(Meyer等，(1987)Nature 330，667)或赋予植物细胞对用抗生素(例如，编码对庆大霉素抗性的aac(6’)基因，WO 94/01560或提供对潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因)，或者除草剂诸如草甘膦(例如，诸如在USP 5510471或WO 00/66748者的EPSPS基因)，苯敌草(例如，pmph基因，USP 5347047；USP 5543306)，bromoxynyl(例如，USP 4810648中所述基因)，磺酰脲类(例如，EP 0360750中所述基因)，茅草枯(WO 99/48023中所述基因)，氰氨钙(WO98/48023；WO 98/56238中所述基因)进行的本来致死的选择有抗性的基因和编码对谷氨酰胺合成酶抑制剂诸如L-膦丝菌素抗性的基因(例如，EP 0242246，EP 0242246和EP 0257542中所述，N-乙酰-转移酶基因)。在包含除草剂抗性基因做为标记基因的本发明多核苷酸优选的实施方式中，所述除草剂是用于农作物中杂草控制的除草剂，和此外，除草剂抗性基因被充足地表达以提供对所述除草剂田地频率(fieldrates)的加强耐受性。在进一步优选的实施方式中，除草剂是草甘膦，除草剂抗性基因是EPSP合酶。然而，标记基因可以是提供正选择的基因，其中标记基因编码给特定培养基环境中转化的植物细胞提供阳性代谢优点的酶。USP 5767378描述了大量适合的正选择系统和基因。

在本发明多核苷酸包含除草剂抗性基因的情况下，给农作物植物外源施用除草剂，该农作物植物以足够的密度间作，以排除来源于非转基因自体受精亲本植物的非杂种种子的产生。在优选的实施方式中，除草剂是草甘膦或其农艺学有用的盐，并且所述除草剂抗性标记基因选自：WO 00/66748中所述草甘膦抗性赋予基因。

当存在标记基因的情况下，也可以提供除去所述标记基因的工具。例如，在决定联合性状的情况下，期望这样做。此外，也期望除去这样的除草剂抗性标记基因，其可能干扰本发明的依赖于除草剂前体的有条件可育机制的运作。例如，可能期望从多核苷酸除去膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT)除草剂抗性标记基因，该多核苷酸也包含嵌合基因，其根据D-膦丝菌素除草剂前体的外源施用，用于提供有条件雄性或雌性不育。PAT基因的存在可以通过失活L-膦丝菌素毒植物素，潜在地干扰成功的有条件不育。因此，包含标记基因的多核苷酸在位于标记基因侧翼并且使得该序列将被“剔除”的位置，可选地可以包含特异性重组酶的特异识别位点。带有含这种侧翼的标记基因的植物和带有编码相应的特异性重组酶的基因的植物杂交产生特异性切除标记的子代植物。适合的这种位点特异性同源重组系统的例子是flp/frt系统(Lyznik等，(1996)，Nucleic Acids Res.24，3784-3789)和Cre/Lox系统(Bayley，C.C.等，(1992)PMB，18，353-361)。

本发明方法中所用多核苷酸可选地可以包含一种或多种翻译增强子，其位于蛋白质编码序列的5’非翻译区中。本领域技术人员知道这种适合的翻译增强子，诸如来源于TMV的Ω和Ω原初序列和来源于烟草蚀刻病毒的增强子，和如何可以将这种翻译增强子引入多核苷酸中以提供增加的蛋白质表达的期望结果。其它例子包括来源于玉米褪绿斑驳病毒和苜蓿花叶病毒的翻译增强子(Gallie等，(1987)Nucl.Acids Res.，15，8693-8711；Skuzeski等，(1990)PMB.，15，65-79)。为了进一步优化从嵌合基因和嵌合标记基因的蛋白质表达，所述多核苷酸还可以包含诸如增强子、支架连接区(SARS或MARS)和内含子的元件。已经证明当将各种内含子序列诸如玉米adh1内含子1包含在基因5’非翻译区时，其增强表达，并且，可选地，其用在本发明嵌合基因中。

也可以用包含蛋白质编码区的多核苷酸转化本发明已经转化以显示期望雄性/雌性不育特性的植物，该蛋白质赋予包含它的植物材料至少一种下面的农艺学期望性状：对昆虫、真菌、病毒、细菌、线虫、胁迫、干旱和除草剂的抗性。

例如，赋予除草剂抗性的基因可以选自编码下列蛋白质的基因：草甘膦氧化酶(GOX)，EPSP合酶，膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)，羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)，谷胱甘肽S转移酶(GST)，细胞色素P450，乙酰-CoA羧化酶(ACCase)，乙酰乳酸合酶(ALS)，原卟啉原氧化酶(PPO)，dihydropteroate合酶，聚胺转运蛋白质，超氧化物歧化酶(SOD)，溴苯腈腈水解酶，八氢番茄红素去饱和酶(PDS)，从真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)可获得的tfdA基因产物，和所述蛋白质的已知诱变或其它修饰的变体。仔细地考虑到本领域技术人员使用来转化非毒害植物的物质的酶的特性，他将认识到关闭这种基因和驱动它们表达的启动子的需要。在多核苷酸提供多种除草剂抗性的情况下，这种除草剂可以选自：二硝基苯胺类除草剂、三唑并嘧啶类、尿嘧啶类、苯基脲类、三酮类、异噁唑类、乙酰苯胺类、噁二唑类、三嗪酮类、sulfonanilide、酰胺类、酰替苯胺类、异噁氟草、flurochloridone、达草灭和triazolinone类型除草剂，苗后除草剂，选自：草甘膦和其盐、草铵膦、黄草灵、噻草平、双丙胺膦、除草定、稀禾定，或其它环己二酮类、麦草畏、膦铵素、胺草唑、苯氧基丙酸酯类、喹禾灵，或其它芳氧-苯氧基丙酸酯类、毒莠定、fluormetron、butafenacil、莠去津、或其它三嗪类、赛克津、chlorimuron、绿黄隆、氟唑啶草、吡氯磺隆、sulfometron、灭草喹、咪草烟、异噁草胺、咪草啶酸、唑草磺胺、pyrithrobac、玉嘧磺隆、苄嘧磺隆、烟嘧磺隆、氟黄胺草醚、fluroglycofen、KIH9201、ET751、carfentrazone、mesotrione、磺草酮、对草快、敌草快、溴苯腈、噁唑禾草灵。

在多核苷酸包含编码杀虫蛋白质的序列的情况下，这些蛋白质可以选自：来源于Bt的晶体毒素，包括分泌的Bt毒素诸如称为“VIP”的毒素；蛋白酶抑制剂，凝集素和Xenhorabdus/Photorhabdus毒素。赋予真菌抗性的基因可以选自：编码已知AFPs，防卫素、壳多糖酶、葡聚糖酶和Avr-Cf9的基因。特别优选的杀虫蛋白质是cryIAc，cryIAb，cry3A，Vip 1A，Vip 1B，Vip3A，Vip3B，半胱氨酸蛋白酶抑制剂和雪花莲凝集素。在多核苷酸包含赋予细菌抗性的基因的情况下，这些基因可以选自：编码杀菌肽和techyplesin和其类似物的基因。赋予病毒抗性的基因可以选自：已知提供对病毒抗性的编码病毒外被蛋白、移动蛋白、病毒复制酶，和反义和核酶序列的基因。而赋予胁迫、盐和干旱抗性的基因可以选自：编码谷胱甘肽-S-转移酶和过氧化物酶的基因、组成已知CBF1调节序列的序列和已知提供海藻糖积累的基因。

也可以修饰本发明所用的多核苷酸以增强它们所包含的蛋白质编码序列的表达，因为可以除去mRNA不稳定基序和/或偶然剪接区，或者可以使用农作物优选的密码子，以使得植物中由此修饰的多核苷酸的表达产生与生物体中未修饰的核苷酸蛋白质编码区表达获得的蛋白质具有基本相似活性/功能的基本相似的蛋白质，在所述生物体中，这种未修饰的多核苷酸区是内源的。修饰的多核苷酸和内源地包含在所述植物中和编码基本相同蛋白质的多核苷酸之间的同一性程度可以是防止修饰和内源序列之间的共抑制的程度。在这种情况下，序列间同一性的程度应该优选小于约70％。此外，可以修饰翻译起始位置周围的序列，使得它是“Kozack优选的”。其含义是本领域技术人员已知的。

本发明还包括植物杂交产生的形态学正常的有条件可育的整个植物，其中所述的植物从用本发明核酸已经转化和因此提供这种性状的材料再生。本发明也包括由此得到的植物的子代，它们的种子和部分。

本发明的植物可以选自：大田作物、水果和蔬菜诸如canola、向日葵、烟草、甜菜、棉花、玉米、小麦、大麦、稻、高梁、mangel worzels、番茄、芒果、桃、苹果、梨、草莓、香蕉、瓜、马铃薯、胡萝卜、莴苣、甘蓝、洋葱、大豆属、甘蔗、豌豆、蚕豆、白杨、葡萄、柑桔、紫花苜蓿、黑麦、燕麦、草皮草和牧草、亚麻和油籽油菜和还没有特别提到的坚果生产植物，它们的后代，种子和部分。

特别地，优选的这种植物包括小麦、大麦、燕麦、稻、玉米、黍和高梁。

本发明还提供了生产杂种小麦种子的优选方法，该方法包括步骤：

(i)用多核苷酸或载体转化植物材料，该多核苷酸或载体包含在外源施用除草剂前体或其它非毒害植物的物质时赋予有条件雄性不育的基因；

(ii)选择由此转化的材料；和

(iii)将由此选择的材料再生为形态学正常的有条件雄性不育的整株植物；

(iv)培育纯合有条件雄性不育雌性亲本系；

(v)用多核苷酸或载体转化植物材料，该多核苷酸或载体包含在外源施用如(i)中相同的除草剂前体或非毒害植物的物质时赋予有条件雌性不育的基因；

(vi)选择由此转化的材料；和

(vii)将由此选择的材料再生为形态学正常的有条件雌性不育的整株植物；

(viii)培育纯合有条件雌性不育雄性亲本系；

(ix)以确保有效授粉的这种比率，间作所述有条件不育的雄性和雌性亲本系；

(x)在最小化自体受精的剂量和发育阶段，给间作亲本系施用所述的除草剂前体或其它非毒植物素物质；

(xi)从间作的亲本植物收获杂种小麦种子。

本发明也提供了上述方法的变化形式，其中雄性亲本是通过任何方法雌性不育的，雌性亲本是通过任何方法雄性不育的，雄性和雌性亲本系依赖于其所施用的不同除草剂前体的施用有条件不育，以及农作物不是小麦。

本发明也包括诊断试剂盒，该诊断试剂盒包含检测本发明方法产生的植物中存在的蛋白质或编码它们的DNA序列的工具，因此适于鉴定包含蛋白质或编码它们的DNA序列的组织或样品。可以通过本领域技术人员已知的PCR扩增检测DNA序列，该PCR扩增是基于本领域技术人员从本申请中公开或提到的酶编码序列容易获得的引物。通过，例如，抗体的应用可以检测酶本身，其中抗体是针对它们产生的，用于诊断性地区别它们包含的抗原区。

本发明也提供了产生对映体纯的D-膦丝菌素(D-PPT)的方法，该方法包括步骤：

(a)提供包含酶的细胞，该酶具有选择性N-酰化PPT的能力；

(b)在含有D-L PTT的培养基中生长所述细胞以产生条件培养基；

(c)从(b)的条件培养基分离细胞；

(d)可选地，在各种pH用非水、非混溶的溶剂萃取条件培养基，使得从含有水溶性比PPT大的分子的级份分离含有PPT的级份；

(e)可选地，以足以从培养基吸附相当比例的除了PTT外的阳离子的量和pH，混合质子化形式的阳离子交换树脂和条件培养基或步骤(d)的含有PPT的萃取培养基，

(f)以足以结合培养基中大部分PPT的量和pH，混合质子化形式阳离子交换树脂和条件培养基、萃取培养基或得自步骤(e)的培养基，

(g)收集步骤(f)的与PPT结合的阳离子离子交换树脂，并且利用有足够pH和离子强度的洗脱介质从该树脂选择性洗脱PPT，条件是所述洗脱介质的pH不至于低到引起由此洗脱的PPT外消旋。

在植物材料转化方面，本领域技术人员将会明白尽管在下面的实施例中具体说明了特定靶材料类型(例如，胚生成性的细胞悬浮培养物或去分化的未成熟胚)和特定的转化方法(例如，利用农杆菌属(Agrobacterium)或颗粒轰击)，但是本发明不限于这些特定的实施方式，可以互换地使用这些靶材料和方法。而且，本发明整个说明书所用术语“植物细胞”可以指分离的细胞，包括悬浮培养物，也指完整的或部分完整的组织诸如胚、盾片、小孢子、小孢子来源的胚中的细胞或来源于植物器官的体细胞。相似地，尽管具体的实施例限于玉米和小麦，但是，本发明同样可应用于广泛范围的、可以利用适合的植物细胞转化方法转化的农作物。

联合序列表和附图一起，从下列非限制性实施例将会更清楚理解本发明。

SEQ ID NO：1表示从集胞藻属(Synechocystis sp.)分离的DNA序列，其编码具有酯酶B活性的酶(SEQ ID NO：2所示)。

SEQ ID NO：3表示从粗糙链孢霉(Neurospora crassa)分离的DNA序列，其编码具有酰基-甲基酰基-CoA消旋酶序列的活性的酶(SEQ ID NO：4所示)。

SEQ ID NO：5和6描述了用于获得TA29启动子区的PCR引物。

SEQ ID NO：7描述了从纤细红酶母(Rhodotorula gracilis)分离的DNA序列，其编码具有D-氨基酸氧化酶活性的酶。

SEQ ID NO：8和9描述了用于提供变异体D-氨基氧化酶的简并寡聚物。

SEQ ID NO：10和11描述了一些基序，其中可以用可替代的氨基酸进行置换以提供变异体D-氨基酸氧化酶。

图1是用于烟草转化的构建体示意图，该构建体包含stig1启动子区可操作地控制下的红酵母属(Rhodotorula)D-氨基酸氧化酶。标明的组件是LB(左边界序列)，AOPR1(AoPR1启动子)，PSTIG1(EMBL记录号X77823)，RGDAO  (OPT)(SEQ ID NO：7)，PC启动子(EMBL记录号X16082)，PAT(EMBL记录号A02774)，NOS(从EMBL记录号ATU237588获得的nos终止子)和RB(右边界序列)。

图2是用于烟草转化的构建体示意图，其中红酵母属(Rhodotorula)D-氨基酸氧化酶编码区在3’末端被截短3个密码子，并且在5’末端(RGDAO(OPT)-SKL)融合编码优化的转运肽(FR2673643)的区域。

图3a是质粒Ubi-CoA合成酶的图谱，其中PUB 11-01-01具有EMBL记录号SM29159，CoA合成酶具有记录号J05439。

图3b是质粒Ubi-差向异构酶的图谱，其中差向异构酶具有EMBL记录号Y0817Z。

根据非常成熟的方法进行一般的生物学方法。

对于下面大部分实施例，每个实施例都包含本发明的多个示例。其中采用所用术语“基因的启动子区”意指包含启动子、启动子上游序列和可选地，编码mRNA 5’非翻译前导区的所有或部分DNA序列的DNA序列。

实施例1.

依赖于D-膦丝菌素或D-丙氨酸或D-亮氨酸或D-甲硫氨酸或D-天冬酰胺D-天冬氨酸或或D-谷氨酸的外源施用有条件雌性不育的烟草植物

通过RT-PCR从变异三角酶母(Trigonopsis variabilis)mRNA获得或合成获得编码EMBL序列Z50019中D-氨基酸氧化酶蛋白质序列Q99042(Swissprot)的DNA序列。做为可替代方案，通过RT-PCR从类酵母红冬孢(Rhodosporidium tolruloides)(纤细红酶母(Rhodotorula gracilis))mRNA获得或通过合成获得(这更容易控制存在的内部限制酶位点和产生有利于克隆的侧翼位点)编码EMBL序列A56901中D-氨基酸氧化酶蛋白质序列P80324(Swissprot)的DNA序列，该DNA可以合成为例如，SEQ ID #7，设计该序列用于符合植物(在这里是小麦)密码子使用和用于最小化对表达潜在不利的DNA特征。做为可替代方案，(例如，来源于EMBL记录号X95310的)该DNA序列编码“D-天冬氨酸氧化酶”诸如P31228(Swiss Prot)，并且，再一次合成该DNA序列以解释植物密码子使用和最小化对表达不利的特征。做为可替代方案，获得和实施例2中所述相同的D-氨基酸氧化酶编码序列。设计侧翼PCR-引物和合成的DNA序列以放置用于克隆的有用单一限制位点。优选地，和在氧化酶编码序列不含有混淆的内部位点的情况下，在5’末端置放Nco1和Nde1位点以方便与添加到ORF 5’的序列，诸如叶绿体转运肽编码序列的符合读框融合物的克隆。在该实施例的一些变化形式中，克隆D-氨基酸氧化酶(在一些变异形式中称为“D-天冬氨酸氧化酶”)基因使得截短末端的3个氨基酸，因此所编码的酶不再向过氧化物酶体靶向。在其它一系列变化形式的方法中，通过PCR改造基因，以编码在位置213和238具有可替代氨基酸的纤细红酶母(Rhodotorula gracilis)D氨基酸氧化酶，特别地，用精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬酰胺或丙氨酸置换在位置213的甲硫氨酸和/或用组氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或丙氨酸置换在位置238的酪氨酸。在天然蛋白质序列基序RCTMDSS中在“213”位置的甲硫氨酸鉴定为M。在天然蛋白质序列基序GGTYGVG中在位置238中的甲硫氨酸鉴定为“Y”。当雌性不育将被制成施用D-天冬氨酸，D-谷氨酸或D-膦丝菌素的情况下有条件的雌性不育时，使用这些变异形式的来源于红酵母属(Rhodotorula)的D氨基酸氧化酶或“D-天冬氨酸氧化酶”。

可以将限制位点放置于ATG翻译起始位点间插序列的上游以符合植物翻译的共有序列诸如根据Kozak的那些。

“δ-S13启动子”是用于在雌性花部分中获得优先表达的启动子区。其包含与CMV 35S核心启动子-46到+8融合的SLG13启动子区-399到-79的区域(Dzelkalns等，(1993)Plant Cell，5,833-863)。将该S13启动子克隆到bluescript sk中，然后，进一步限制消化该质粒，并且连接限制性片段，该限制性片段包含nos 3’转录终止子区和氨基酸氧化酶编码序列，以在bluescript sk质粒中产生“δ-S13-D-氨基酸氧化酶-Nos终止子”表达盒。然后，限制性消化做为例如EcoR1片段，就这样连接回到载体诸如pBIN19(Bevan(1984)Nucleic Acids Res.)或PCIB200或PCIB2001(WO 98/39462)的适合位点，用于利用农杆菌属(Agrobacterium)的转化。如WO 98/39462中所述，PCIB200包含下面的单一多接头限制位点：EcoR1，Sstl，Kpnl，BglII，Xbal和SaII。PCIB2001在多接头中含有插入，该多接头进一步添加了单一限制位点，包含：MluI，BclI，AvrII，ApaI，HpaI和StuI。PCIB200和pCIB2001还提供了用于卡那霉素上植物和细菌筛选的选择性标记基因，左和右T-DNA边界、用于在大肠杆菌(E.coli)和其它宿主之间移动的RK2来源的trfA功能和来源于RK2的oriT和oriV功能。做为可替代方案，利用引入来源于广谱宿主范围质粒pRK252序列的双元载体PCIB10(Rothstein等，(1987)Gene 53，153-161)或利用引入卡那霉素抗性基因和潮霉素磷酸转移酶基因的其衍生物之一如pCIB715(Gritz等，(1983)Gene 25，179-188)。

做为可替代方案，利用约1.6kb Stig启动子区(来源于EMBL记录号X77823)。例如，利用适合的限制酶，用编码P80324或Q99042编码序列的DNA序列置换Goldman等，(1994)在EMBO J.，13，2976-2984中所述stig1-GUS构建体中的GUS基因编码区，在邻接适合标记基因的3’终止子序列上游位置和T-DNA边界序列之间，将由此得到的stig1-D-氨基酸氧化酶表达构建体克隆到适合的载体诸如pCIB200中。

在另一个特定的实例中，根据图1构建双元载体中的T-DNA插入。将包含stig1启动子区可操作控制下的编码纤细红酶母(Rhodotorulagracilis)D-氨基酸氧化酶的合成DNA序列(SEQ ID #7)和豌豆质体蓝素启动子区可操作控制下的编码L-膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT)的DNA序列(A02774)的构建体克隆到双元载体T-DNA的LB/npt II基因和RB之间的位点中。简而言之，将序列ID#7做为NcoI/PstI片段克隆到质粒pFse4-Stiglnos(WO9942598中所述)的Stig1启动子后和nos终止子区(包含在EMBL：ATU237588中)之前。通过PCR，从豌豆基因组DNA获得豌豆质体蓝素启动子区(来源于EMBL记录号X16082)，克隆到PAT基因/nos终止子前。将由此得到的PC-PAT-nos盒子做为NotI片段克隆到Stigl-RGDAMOX-nos之后，这整个两基因构建体做为FseI片段转移到双元载体(pVB6，Binl9衍生物)。

在本方法的进一步变化形式中，所用的构建体是根据图2中的示图。红酵母属(Rhodotorula)D-氨基酸氧化酶编码序列SEQ ID# 7在3’末端截短3个密码子，可选地，定向突变它以编码M213R形式，并且在5’末端，将其克隆置于紧邻着编码叶绿体转运肽的区域下游，因此编码叶绿体转运肽D-氨基酸氧化酶融合蛋白质。叶绿体转运肽编码序列来源于编码EPSP合酶小亚基的拟南芥(Arabidopsis)基因(Klee等，1987 in Mol.Gen.Genet.，210，437)。可选地，进行修饰以在CTP加工位点包含Sph1位点，由此在该位置用Cry-Met置换Glu-Lys(WO92044490的图9中SEQ)。相应地，可以在D-氨基酸氧化酶编码序列的N-末端工程改造SPh1位点(转化甲硫氨酸后面的氨基酸为亮氨酸)。做为可替代的方案，叶绿体转运肽编码序列来源于编码EPSP合酶的矮牵牛基因(WO 92044490的图11)。做为可替代的方案，叶绿体编码序列是大量的可能编码序列中的任何一种编码序列，包括来源于编码核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基的基因的叶绿体转运肽编码序列，并且包括称为“最佳化”嵌合转运肽序列(FR 2673643)。在所有这些情况下，除了依赖于亚克隆以外，可以简单地通过合成获得编码叶绿体转运肽/红酵母属(Rhodotorula)D-氨基酸氧化酶融合多肽的整个DNA序列。将该序列克隆到适合载体中的stig1启动子区下游和(例如，nos)终止子序列下游的位点(例如在含有stig1→GUS构建体的载体中置换GUS编码序列，Goldman等，(1994)in EMBO J.，13，2976-2984所述)。然后将整个基因表达构建体克隆到PVB6载体T-DNA右和左边界之间适合的位点中。

利用与Horsch等，(1985)Science，227，1229-1231中所述相似的方法，用重组双元载体转化烟草叶片圆盘。可以利用该方法的许多变化形式。利用冷冻融溶的转化方法，双元载体可以转化到，例如根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系LBA4404中。根据Draper等(Plant Genetic Transformation，Blackwell Sci.Pub.1989)所述的方法，利用Nicotiana tabacum var.Samsun进行烟草转化和整株植物再生。在含有卡那霉素或其它适合抗生素的MS培养基上筛选转化事件。通过PCR证实整合的转基因的存在。再生植物，并且使得植物达到成熟和自花受精以产生种子。利用Northern和/或Western分析证实D-氨基酸氧化酶基因的组织特异性表达。植物是自花能育的，但是具有有条件雌性不育的条件。以一定行距种植T1代的种子。一旦小植株生长到足够的大小，就通过PCR检测它们的转基因的存在。将PCR阳性植物转移到温室。在没有外源施用的除草剂前体存在的情况下，这些植物是完全可育的。在各种生长阶段，用各种量的D-膦丝菌素或D-丙氨酸或D-亮氨酸或D-天冬酰胺或D-甲硫氨酸或D-天冬氨酸或D-谷氨酸处理一小批这些(推测地)有条件不育的植物。对PCR证实为D-氨基酸氧化酶基因阳性的T1植物进行这种处理，或者，同样地，直接对To代植物进行这种处理(营养克隆To代植物，这样可以留出每个事件未处理的克隆用于种子生产)。然后，观察到的可育性做为选择适合的植物株系的基础，该适合的植物株系显示了最明显的有条件不育性表型。例如，这些氨基酸是纯D对映体，或者可替代地是DL外消旋物。例如，在花形成早期阶段之前或期间，以通常0.25和20kg/ha之间的比率，做为叶面喷雾施用它们。通过进一步施用做为喷雾薄雾的水重新溶解和重新调动叶面施用后可能从溶液结晶出来的氨基酸而用于叶片吸收。例如，还可以做为灌根施用氨基酸，并且可选地，还可以做为约50μl的10-200mM的溶液施用该氨基酸，该溶液直接灌浸入新出现小花的芽中。收集来源于处理植物的花粉，检测生育力。获得用D-膦丝菌素或D-丙氨酸或D-亮氨酸或D-天冬酰胺或D-甲硫氨酸或D-天冬氨酸或D-谷氨酸处理后相对几乎没有产生种子或没有产生种子，但是，在相同处理条件下确实产生接近正常水平能生育的花粉的植物。对照植物是转基因和非转基因两种植物，并且除了处理溶液是水或等同浓度的纯L-氨基酸外，在相同条件和相同的物理处理方案下生长该对照植物。

在该方法的一个变化形式中，施用的氨基酸是外消旋DL膦丝菌素。在这种情况下，用于转化的DNA构建体除了包含组织特异性雌性花启动子区诸如“stig1”可操作表达控制下的编码D-氨基酸氧化酶的DNA序列外，还包含启动子区可操作控制下的‘PAT’基因的DNA序列(EMBL：A02774)，所述启动子区是诸如豌豆(Pisum sativum)质体蓝素基因的质体蓝素基因翻译起始的5’区(EMBL记录号：X16082)。例如，除了位点特异性突变编码D-氨基酸氧化酶的DNA序列，使得编码M213R形式的酶外，构建体与图1中所述相同。质体蓝素启动子区提供了在植物绿色组织中的优先表达。意外地发现这种不同于例如35S启动子区的启动子基本上仅在植物的一些组织中表达，最明显地是绿色组织中表达，但是，当其与PAT基因联合使用时，其提供了对甚至超过2kg/ha比率的除草剂DL PPT的基本上完全生殖耐受性。而且，在花组织中缺少共表达的任何适合异源D-氨基酸氧化酶或相似的D到L转换活性的情况下，尽管当在该启动子区控制下表达时，在许多重要花组织中PAT表达水平低或者不存在，但是质体蓝素/PAT基因联合提供了基本完全的生殖耐受性，而没有明显的产量损失。因此，在该实例的变化形式中，非毒害植物的物质D膦丝菌素以其最少的花费和最容易获得的形式，做为商用除草剂DL膦丝菌素外消旋物施用。在适合的喷雾次数，和250g/ha至5kg/ha的DL膦丝菌素比率，没有观察到处理植物明显的损害，但是使得该处理植物有条件雌性不育，又保留了正常或接近正常的雄性可育。

实施例2.

依赖于D-膦丝菌素或D-丙氨酸或D-亮氨酸或D-甲硫氨酸或D-天冬酰胺或D-天冬氨酸或D-谷氨酸的外源施用有条件雌性不育的烟草植物

通过RT-PCR从博伊丁氏假丝酵母(Candida boidini)mRNA获得或通过合成获得编码EMBL序列AB042032中D-氨基酸氧化酶蛋白质序列Q9HGY3(Sptrembl)的DNA序列。做为可替代方案，通过RT-PCR从茄病镰胞(Fusarium solani)mRNA获得或通过合成获得编码EMBL序列D00809中D-氨基酸氧化酶蛋白质序列P24552(Swissprot)的DNA序列。设计侧翼PCR引物或合成DNA序列以放置有用的单一限制性位点。优选地和在氧化酶编码序列不含有混淆的内部位点的情况下，在5’末端置放Nco1和Nde1位点以方便与添加到ORF 5’序列的符合读框融合物的克隆。或者，在将限制位点放置于ATG翻译起始位点上游时，设计间插序列以符合植物翻译的共有序列诸如根据Kozak的那些。做为可替代的方案，获得的D-氨基酸氧化酶编码序列与实施例1中相同。而且，和在前述实施例中一样，在根据D-天冬氨酸、D-谷氨酸或D-膦丝菌素的施用产生不育性的情况下，优选地，D-氨基酸氧化酶是在氨基酸位置213和/或238的变异体。

利用引物：

5′-AACTGCAGCTTTTTGGTTAGCGAATGC-3′(SEQ ID #5)和，

5′-CAGACTAGTTTTAGCTAATTTCTTTAAGTAAAAAC-3′(SEQ ID #6)

通过PCR，从烟草基因组DNA克隆TA29启动子区(Kriete等，(1996)Plant J.，9，808-818)。通过一系列限制和亚克隆步骤，将由此获得的PCR片段置于D-氨基酸氧化酶编码序列的上游，并将nos转录终止子添加到编码区3’。如实施例1中所述，然后，克隆由此获得的T29-D-氨基酸氧化酶-nos终止子表达盒子，获得适合的限制片段，克隆到双元载体中。如实施例1中所述，在通过施用D-天冬氨酸、D-谷氨酸或D-膦丝菌素产生有条件不育性的情况下，优选地，使用在位置213和/或238有突变的纤细红酶母(Rhodotorula gracilis)D-氨基酸氧化酶变异体。

做为可替代技术方案，将任何上述D-氨基酸氧化酶编码序列区克隆为适合的限制片段(例如，BamHI，Bg1/II，其中设计合成的编码序列变异体以除去内部限制位点)，并通过以有义构型插入到(例如)双元载体pROK1(Baulcombe等，(1986)Nature，321，446-449)的BamH1位点，融合到CaMV 35S启动子和胭脂氨酸合酶终止子区。然后切除和用带有TA29s启动子区片段(-810到+54)，来源于pAP30(Kriete等，(1996)The Plant Journal 9，809-818)的EcoR1-BamH1片段置换带有35S启动子区的EcoR1-BamH1片段。根据所编码的蛋白质序列，命名由此得到的载体为：pGKTA29_Q99042，pGKTA29_P80324，pGKTA29_Q9HGY3和pGKTA29_P24552等。

用载体通过农杆菌属(Agrobacterium)转化烟草植物材料，用前述实施例中所述相似的方法再生转基因植物。产生的植物是自花能育的，但是其是有条件雄性不育的。以一定行距将T1代种子种植到土壤中。一旦小植株生长到足够的大小，就通过PCR检测它们的转基因的存在。将PCR阳性植物转移到温室。在外源施用的除草剂前体不存在的情况下，这些植物是完全可育的。在各种生长阶段，用各种量的D-膦丝菌素或D-丙氨酸或D-亮氨酸或D-甲硫氨酸或D-天冬酰胺或D-天冬氨酸或D-谷氨酸处理一小批这些推测地有条件不育的T1植物或者可替代的T0“事件”的小植株(转化的直接再生体)。在处理T0代植物时，将它们营养克隆，这样可以留出事件的未处理的同胞用于种子生产。然后，观察到的可育性做为选择适合的植物株系的基础，该适合的植物株系显示了最明显的有条件不育性表型。例如，这些氨基酸是纯D对映体，或者可替代地是DL外消旋物。例如，在花形成早期阶段之前或期间，以通常0.25和20kg/ha之间的比率，做为叶面喷雾施用它们。通过进一步施用做为喷雾薄雾的水可以重新溶解和重新调动叶面施用后可能从叶片上溶液结晶出来的氨基酸，而用于叶片吸收。例如，还可以做为灌根施用氨基酸，并且可选地，还可以做为约50μl的10-200mM的溶液施用该氨基酸直接到新出现小花的芽中。

收集来源于处理植物的花粉，检测生育力。获得没有散发花粉或者相对几乎没有花粉和/或花粉没有活力的植物。检测从一些处理的植物收集的花粉，发现其是畸形或不能生育的。然而，这种雄性不育植物保留了雌性可育，并且用从其它未处理的非转基因或有条件雌性不育的烟草植物收集的花粉给其授粉时，其产生了(杂种)种子。对照植物是转基因和非转基因两种植物，并且除了处理溶液是水或等同浓度的纯L-氨基酸外，在相同条件和相同的物理处理方案下生长该对照植物。

与实施例1类似，在该实施例的一个变化形式中，施用的氨基酸是外消旋DL膦丝菌素。在这种情况下，用于转化的DNA构建体除了包含组织特异性雄性花启动子区诸如“TA29”可操作表达控制下的编码D-氨基酸氧化酶的DNA序列外，还包含启动子区诸如来源于质体蓝素基因的启动子区(在这里，该启动子区来源于豌豆(Pisumsativum)质体蓝素基因)可操作控制下的编码膦丝菌素N-乙酰转移酶基因诸如‘PAT’基因的DNA序列。在适合的喷雾次数，和250g/ha至5kg/ha的DL膦丝菌素比率，没有观察到处理植物明显的损害，但是使得该处理植物有条件雄性不育，又保留了正常或接近正常的雌性可育。

实施例3.

在雄性生殖结构中优先表达和编码具有水解咪草酸甲酯或氟燕灵甲酯M(flamprop M methyl)或氟燕灵异丙酯M(flamprop M isopropyl)为它们各自羧酸能力的酶的嵌合基因

通过PCR从氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)基因组DNA获得或通过合成获得编码EMBL序列M94965中羧酸酯酶蛋白质序列Q01470(Swissprot)的DNA序列。做为可替代的方案，通过PCR从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因组DNA获得或合成获得编码EMBL序列BS06089中羧酸酯酶蛋白质序列P37967(Swissprot)的DNA序列。或者，通过RT-PCR从酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)mRNA获得或合成获得编码EMBL序列Z34288中羧酸酯酶蛋白质序列P40363(Swissprot)的DNA序列。设计侧翼PCR引物或合成DNA序列以置放用于克隆的有用的单一限制位点。优选地和在羧酸酯酶编码序列不含有混淆的内部位点的情况下，在5’末端置放Nc01或者Nde1位点以方便与添加到ORF 5’的序列的符合读框融合物的克隆。做为可替代的方案，当限制位点放置于ATG翻译起始位点上游时，设计间插序列以符合植物翻译的共有序列诸如根据Kozak的共有序列。

质粒pGK73带有从-810到+54的TA29s启动子区EcoR1-BamH1片段(Kriete等，(1996)，9，809-818)。在编码羧酸酯酶Q01470或P37967的DNA序列上游位置，将该限制片段或相似的适合PCR产生的片段优选做为符合读框的融合物克隆到bluescript sk中。利用适合的一系列限制、连接和亚克隆步骤，根据编码序列，将nos转录终止子添加到编码区的3’以在Bluescript sk质粒pBLTA_Q01470、pBLTA_P37967和pBLTA_P40363中产生TA29-羧酸酯酶-nos类型可替代的表达盒。

在进一步实例中，使用USP 5470359的Seq ID No.1的花药特异性SGB6启动子区。例如，进一步亚克隆包含来源于pSGB6g1的3kb基因组EcoR1-Nhe1亚克隆片段的pSGBNE1(USP 5470359)，以放置在SmaI位点克隆到Bluescript sk中的1558bp ApaII/Xba1片段平端。如先前一样，通过进一步限制和克隆步骤，该片段以符合读框方式融合在P37967，Q01470或P40363 DNA编码序列上游。而且，向编码区3’添加nos终止子以产生可替代的Bluescript sk质粒pBLB6_Q01470，pBLB6_P37967和pBLB6_P40363，其含有可替代的SGB6-羧酸酯酶-nos表达盒。

在相似的一组实例中，相似地，在符合读框的和编码羧酸酯酶的DNA序列和nos3’终止子上游的位点融合来源于水稻的RA8花药特异性启动子区(EMBL/genbank记录号：AF042275；Jean Js等，(1999)PMB，39，35-44)，以在一系列Bluescript sk载体，pBLRA8_Q01470，pBLRA8_P37967和pBLRA8_P40363中包含可替代的RA8-羧酸酯酶-nos表达盒。

实施例4.

在雌性生殖结构中优先表达和编码具有氧化D-膦丝菌素和/或D-丙氨酸和/或D-亮氨酸和/或D-甲硫氨酸和/或D-天冬酰胺和/或D-天冬氨酸和/或D-谷氨酸能力的酶的嵌合基因

如实施例1和2中所述获得编码D-氨基酸氧化酶蛋白质序列的DNA序列。

根据布达佩斯条约，在1998年2月27日，将基因组克隆pSH64保藏在NRRL，分配给其的保藏号是：NRRL B-21920。检测它为与穗丝特异性cDNA克隆B200i4-2(WO 98/39462)杂交的基因组克隆。如下所述，构建优先在雌性生殖结构中表达的嵌合基因。如WO 98/39462中所述，构建与pSH70相似的具有“空”表达盒子的bluescript ks来源的质粒，-该“空”表达盒子包含，从5’到3’，由WO 98/39462的SEQ IDNo 11核苷酸1-3790组成的B200i 5’启动子区，BamH1位点和含有WO 98/39462的SEQ ID No 11核苷酸4427-6397的B200i3’非翻译终止子区。利用部分BamH1消化，或者可替代地的方案，通过进一步亚克隆，PCR和连接步骤，将可替代的D-氨基酸氧化酶编码序列连接到BamH1位置或邻接BamH1的位置，使得它们紧邻B200i启动子区3’和B200i终止子区5’。因此，产生一系列编码可替代的B200i-D-氨基酸氧化酶-B200i表达盒子的bluescript载体pBLB200_Q99042，pBLB200_P80324，pBLB200_Q9HGY3和pBLB200_P24552。

做为可替代的方案，如WO 98/39462中所述，从基因组克隆X2-1切除P19基因5’启动子区的Pst I/NcoI片段，该基因组克隆根据布达佩斯条约，在1998年2月27日保藏在NRRL，分配给其的保藏号是B-21919。在WO 98/39462的SEQ ID No 14核苷酸1088的Nco I位点对应于P19基因的ATG翻译起始。利用适合的亚克隆、限制、连接和PCR步骤，连接该片段以形成与编码D-氨基酸氧化酶的DNA序列的符合读框的融合，并且向编码序列的3’添加nos终止子序列。因此，产生一系列编码可替代的P19-D-氨基酸氧化酶-nos表达盒子的bluescript载体pBLP19_Q99042，pBLP19_P80324，pBLP19_Q9HGY3和pBLP19_P24552等。做为可替代的方案，利用相似的方法，获得相似的质粒，该质粒具有代替P19启动子区的P26基因5’启动子区(包含WO 98/39462的SEQ ID No 2核苷酸1-3987的所有或部分核苷酸)。如WO 98/39462中所述，亚克隆基因组P26-4克隆，pCIB10302，其根据布达佩斯条约，1997年1月21日保藏在农业研究机构保藏中心(NRRL)，保藏号是NRRL B-21655。因此，产生了一系列编码可替代的P19-D-氨基酸氧化酶-nos表达盒子的bluescript载体pBLP26_Q99042，pBLP26_P80324，pBLP26_Q9HGY3和pBLP26_P24552。

实施例5.

在雄性生殖结构中优先表达和编码具有氧化D-膦丝菌素和/或D-丙氨酸和/或D-亮氨酸和/或D-甲硫氨酸和/或D-天冬酰胺和/或D-天冬氨酸和/或D-谷氨酸能力的酶的嵌合基因

如实施例1和2中所述获得编码D-氨基酸氧化酶蛋白质序列的DNA序列。

质粒pGK73带有从-810到+54的TA29s启动子区EcoR1-BamH1片段(Kriete等，(1996)，9，809-818)。在编码D氨基酸氧化酶的DNA序列上游位置，将该限制片段或相似的适合PCR产生的片段优选做为符合读框的融合物克隆到bluescript sk中。利用适合的一系列限制、连接和亚克隆步骤，根据编码序列，将nos转录终止子添加到编码区的3’以在Bluescript sk质粒中产生TA29-D-氨基酸氧化酶-nos类型可替代的表达盒。

在进一步实例中，使用USP 5470359的Seq ID No.1的花药特异性SGB6启动子区。例如，进一步亚克隆包含来源于pSGB6g1的3kb基因组EcoR1-Nhe1亚克隆片段的pSGBNE1(USP 5470359)，以放置在SmaI位点克隆到Bluescript sk中的1558bp ApaII/Xba1片段平端。如先前一样，通过进一步限制和克隆步骤，该片段以符合读框方式融合在D-氨基酸氧化酶编码序列上游。而且，向编码区3’添加nos终止子以产生可替代的Bluescript sk质粒，其含有可替代的SGB6-D-氨基酸氧化酶-nos表达盒。

在相似的一组实例中，相似地，在符合读框的和编码D-氨基酸氧化酶的DNA序列和nos3’终止子上游的位点融合来源于水稻的RA8花药特异性启动子区(EMBL/genbank记录号：AF042275；Jean Js等，(1999)PMB，39，35-44)，以在一系列Bluescript sk载体中包含可替代的RA8-D-氨基酸氧化酶-nos表达盒。

实施例6.

用在本发明方法中的一对互补构建体，提供了(a)依赖于DL膦丝菌素施用，有条件雄性不育的雌性自交亲本系，和(b)依赖于DL膦丝菌素的施用，有条件雌性不育的互补雄性自交亲本系

适于提供依赖于DL膦丝菌素外源施用，有条件雄性不育的雌性自交亲本谷类或水稻的第一个DNA构建体包含三种基因A)，B)和C)。A)由来源于大麦质体蓝素基因(EMBL：Z28347)的约1kb启动子区和适合的终止子区诸如来源于nos或35S基因的终止子区可操作控制下的编码能N-乙酰化L-膦丝菌素的PAT酶的DNA序列组成，B)由与第一基因相似的PAT编码序列组成但是这次该编码序列受组织特异性雌性花启动子区(诸如实施例4中所述的P19或P26)和适合的终止子可操作控制，和C)由如实施例1，2，12和13中所述适合的DAMOX编码序列组成，该编码序列处在组织特异性雄性花启动子区(如实施例5中所述SGB6或RA8)和适合的终止子区可操作控制下，编码例如在位置213有置换甲硫氨酸的精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬酰胺或丙氨酸和/或在位置238有置换酪氨酸的组氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或丙氨酸的突变体形式的纤细红酶母(Rhodotorula gracilis)D氨基酸氧化酶。利用本领域的标准方法和先前实施例中所教导的方法装配该构建体。

适于提供依赖于DL膦丝菌素外源施用，有条件雌性不育的雄性自交亲本谷类或水稻的第二个DNA构建体包含三种基因A)，D)和F)。A)由来源于大麦质体蓝素基因的启动子区和适合的终止子区诸如来源于nos或35S基因的终止子可操作控制下的编码能N-乙酰化L-膦丝菌素的PAT酶的DNA序列组成，D)由与第一基因相似的PAT编码序列组成，但是这次该编码序列受与构建体1中所用相同的组织特异性雄性花启动子区(如实施例5中所述的SGB6或RA8)和适合的终止子可操作控制，和F)由如实施例1，2，12和13中所述适合的DAMOX基因组成，该基因处在与构建体1中所用相同的组织特异性雌性花启动子区(如实施例4中所述的P19或P26)和适合的终止子区可操作控制下，例如编码在位置213有置换甲硫氨酸的精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬酰胺或丙氨酸和/或在位置238有置换酪氨酸的组氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或丙氨酸的突变体形式的纤细红酶母(Rhodotorula gracilis)D氨基酸氧化酶。利用本领域的标准方法和先前实施例中所教导的方法装配该构建体。

该实施例的一对DNA构建体包含，例如下面的元件：

构建体1

A＝大麦质体蓝素启动子区→PAT编码区，Nos终止子；

B＝P19启动子区→PAT编码区，35S终止子；

C＝RA8启动子区→红酵母属(Rhodotorula)D-氨基酸氧化酶(M213R突变体)编码序列，Nos终止子。

构建体2

A＝大麦质体蓝素启动子区→PAT编码区，Nos终止子；

D＝RA8启动子区→PAT编码区，35S终止子；

C＝P19启动子区→红酵母属(Rhodotorula)D-氨基酸氧化酶(M213R突变体)编码序列，Nos终止子。

实施例7.用于小麦转化的多核苷酸载体

实施3、4、5和6描述了通常克隆到bluescript sk(例如，pBLRA8_Q01470，pBLRA8_P37967，pBLRA8_P40363，pBLB200_Q99042，pBLB200_P80324，pBLB200_Q9HGY3和pBLB200_P24552等)中的表达盒子中各种嵌合基因的构建。可选地，如WO 98/39462中所述，大量制备用于直接DNA转化的这些载体，以与共轰击选择性标记诸如pSOG35(DHFR/氨甲喋呤)或pUbi-Hyg(潮霉素磷酸转移酶/潮霉素)一起使用。优选地，大量制备后，利用适合的限制酶线性化该载体以除去bluescript的氨苄青霉素抗性基因。

可选地，除了使用共轰击外，通过标准方法进一步基因工程改造所述bluescript载体，这样它们还包含植物选择性标记基因诸如卡那霉素抗性、潮霉素抗性、氨甲喋呤抗性或草甘膦抗性基因，并且直接使用它们。在一些前述实施例中，PAT基因是载体设计必需的，在这些情况下，可选地，在转化后的一些阶段，DL膦丝菌素可以用于筛选。

做为可替代的技术方案，切除适合的限制片段内的表达盒，并且克隆到pIGPD9来源的载体中(WO 00/66748的图12中所述)。该载体用于转化的用途避免了抗生素标记基因转移到植物，这是因为它在细菌中的维持依赖于营养缺陷型his B大肠杆菌(E.coli)突变体的互补。该载体含有表达IGPD(his B产物)的基因，并且进一步基因工程改造该载体以包含植物选择性标记基因诸如，克隆到例如WO00/66748的pZEN16i和pZEN18i中XmaI位点的EPSPS基因。做为可替代技术方案，使用对甘露糖或木糖提供正选择的标记基因(USP5767378)。

在利用pIGPD9载体的特定实例中，构建用于小麦转化的质粒。示例性例子是pZEN18_BLB200_Q99042和pZEN18_BLRA8_Q01470。这些是pIGPD9-来源的载体，其分别包含pZEN18 EPSPS基因(WO 00/66748)和，在这种情况下，B200i-(Q99042)D-氨基酸氧化酶-B200i或RA8-(Q01470)羧酸酯酶-nos表达盒。

利用Maxi-prep方法(Qiagen)，利用制造商提供的程序获得用在植物转化中的大规模DNA制备物。

实施例8.

用多核苷酸转化/再生小麦，该多核苷酸包含在雄性或雌性生殖结构中优先表达和编码酶的嵌合基因，该酶具有氧化D-膦丝菌素和/或D-丙氨酸和/或D-亮氨酸和/或D-甲硫氨酸和/或D-天冬酰胺和/或D-天冬氨酸和/或D-谷氨酸的能力

在一个实例中，将基因型UC703的未成熟胚(0.75-1.0mm长)放置在含有3mg/l 2，4-D和3％蔗糖的MS培养基上。约4h后，将胚放置到用滤纸支持的琼脂糖片覆盖的，含有15％麦芽糖，3％蔗糖和3mg/l 2，4-D的MS培养基上，琼脂糖含有相同成分。在轰击前，使胚质壁分离2-3h。

利用标准方法，在微米大小的金颗粒上沉淀如实施例7中和前述实施例中所述制备的DNA。用DuPont生物弹击氨装置，利用1100psi的爆破压力射击每个靶有16个胚的4个靶平板2次。用载料台和靶之间适当位置的80目网筛，射击平板。轰击后，在25℃，将靶放置在黑暗中24小时，然后将具有胚的片平铺到含有3％蔗糖和3mg/l 2，4-D的MS培养基平板上。48h后，从片上移除每个胚，并且将其直接放置在相同组成的新鲜培养基上。基因递送后约6周，将组织放置在具有3mg/l 2，4-D，3％蔗糖和0.2mg/l氨甲喋呤的MS培养基上3周。然后将组织放置在包含MS培养基的再生培养基上，该MS培养基包含1mg/l玉米素核苷和1mg/l氨甲喋呤。2周后，将再生的小植株放在具有一半浓度MS培养基的无菌容器中，该MS培养基含有2％蔗糖、1mg/l napthylacetic acid和4mg/l氨甲喋呤。

在该实施例特定的变化形式中，共轰击包含在雄性生殖结构中优先表达的嵌合基因的载体和可替代的选择性标记基因。因此，例如，制备RA8启动子区可操作控制下的质粒DNA如pBLRA8_P24552，其与实施例3类似地制得(但是其表达D-氨基酸氧化酶而不是羧酸酯酶序列)，并且与pUbiHyg(编码玉米聚泛素启动子可操作控制下潮霉素磷酸转移酶的质粒)一起包覆在金颗粒上。在这种情况下，除了轰击后，再生培养基含有2和20mg/l之间增加浓度的潮霉素外，如上所述进行转化和再生。

在进一步实施例中，用pZEN18 BLB200 Q99042转化小麦，利用草甘膦筛选，如WO 00/66748的实施例15中所述进行再生。

从来源于转化的植物叶片组织提取DNA，进行PCR检测选择性标记基因和编码D氨基酸氧化酶的基因的存在。繁殖PCR阳性植物。在开花期间，收集雌蕊和花药，并且制备RNA。通过Northern分析证实DNA表达。此外，用pET载体在大肠杆菌(E.coli)中表达D-氨基酸氧化酶基因，并且部分纯化。从SDS凝胶切下表达蛋白质的蛋白质条带以产生多克隆抗体。通过Western分析，用这些抗体检测花组织和其它组织中的表达。

实施例9.

有效地产生杂种谷类农作物的方法，其中施用DL膦丝菌素用于杂草控制，同时用作化学杂交试剂，和其中由这样产生的杂种种子获得的植物F1杂种后代对DL膦丝菌素的施用基本上具有营养和生殖耐受性

化学杂交试剂是昂贵的。期望利用相对便宜的物质如商品除草剂做为化学杂交试剂。因为杂草控制将和化学杂交联合，所以这将获得更进一步的效率。然而，需要克服大量的问题，以实现这个建议。首先，需要建定对所述除草剂具有耐受性的雄性和雌性亲本系。而且，为了获得对除草剂施用应答的期望的“有条件”可育性，需要改造两个株系这样对除草剂的耐受性不会延伸到所有组织，而是以组织特异性的方式表达，使得每个所需的花组织保留了选择性敏感性。因此，在一个系(雌性亲本系)中，必须使得植物的大部分加上雌性组织具有耐受性，而雄性花组织的一些重要部分必须保留对施用的敏感性，而在另一个(雄性亲本系)中，所需要的正相反，仅形成雌性配子的组织一些重要部分保留了敏感性。假设可以达到上述目的，在杂种种子和F1代方面还要克服另外的问题。假设农作物的这代将必需包含至少两个赋予对除草剂抗性的基因，期望这种同样的除草剂也可以用于农作物的杂草控制。然而，设想允许F1代该同样除草剂的这种应用的除草剂、组织特异性启动子区和耐受性基因的联合是非常困难的。很可能在将除草剂施用给F1代后，杂种植物将显示营养耐受性，但是很少有或没有谷粒产量。例如，对于除草剂草甘膦，通常的抗性机理是EPSP合酶抗性形式的表达。很难鉴定允许在所有组织中和除了在雄蕊或柱头发育的重要阶段外的所有时期R-EPSPS足够表达的启动子区或启动子区联合。关于这个的最直接方法是利用反义或类似的方法，其中通过组织非特异性/组成型启动子驱动R-EPSPS的表达，并且由于反义EPSPS基因的表达，例如在雄蕊中仅局部和暂时地抑制该R-EPSPS的表达(参见，例如WO 9946396)。然而，在那种情况下，雄蕊(柱头)中表达抑制将由显性基因驱动。对于任何这种机理，由于显性雄性和雌性条件不育性基因的加和作用，给F1代施用除草剂将引起不育的没有产量的农作物，这点是清楚的。

本发明提供了克服该问题的方法，该方法可以使用便宜的商品除草剂DL膦丝菌素既用作杂草控制，还用作杂种谷类产生中的杂交试剂，该方法还提供了由此得到的杂种谷类或水稻，其中DL膦丝菌素(或L膦丝菌素)可以安全地用于杂草控制而不会有明显的产量损失。做为另一个益处，更容易管理在随后农作物中后来可能因自生自长出现的F1代自交种子，因为如果用控制量的DL膦丝菌素喷雾，一般地它们本身将是不育的。对于从F1植物到杂草(例如红米)或其它谷类的异型杂交的花粉后代也具有相同的益处。本发明提供了转化商品除草剂形式DL膦丝菌素的非毒害植物的成分，D-膦丝菌素为活性L形式的基因和酶。已经知道了转化L-膦丝菌素为N-乙酰L膦丝菌素的PAT基因，并且商业上利用它提供农作物中对DL膦丝菌素的耐受性。与本发明密切相关的另一个重要的观察结果是，意外地，发现含有处于大麦质体蓝素启动子区可操作控制下的PAT基因的小麦基本上对以至少2kg/ha以上比率施用的DL膦丝菌素具有生殖耐受性。因此，用于提供给本实施例植物的实施例6中所述构建体的重要特征是提供抗性性状的PAT基因在启动子区可操作控制下表达，该启动子区提供了基本上仅在绿色组织中的表达。这种有用的启动子区特征是它应该这样表达PAT基因，以使得它充分地保护所有的非绿色花组织不受叶面施用DL膦丝菌素的影响，而同时，在花组织本身仅仅提供最低水平的PAT表达，并且在有条件不育性靶向的那些部分中具有特别低的PAT表达。用大麦质体蓝素启动子区可操作控制下表达的PAT，看起来满足了这种条件，因为基本上截断了所有喷雾的通过叶片进入的L-膦丝菌素，并且在它转运到发育中的花组织前，将其转化为非毒害植物的N-乙酰-L-膦丝菌素。因此，在本发明中，通过D氨基酸氧化酶，仅从韧皮部可移动的非毒害植物的D-膦丝菌素暂时和局部地产生L膦丝菌素，该L膦丝菌素在亲本系中引起了组织选择性不育性作用。通过在互补对构建体(实施例6)中，精确匹配驱动PAT表达的花控制元件和驱动D-氨基酸氧化酶表达的元件，确保在F1杂种中，靶花组织中L-膦丝菌素的短暂出现很快地被同时和相同局部组织中相应的PAT表达出现所中和。因此，除草剂的施用在杂种中没有诱导不育性。然而，在以后的世代中，杂种的花相应的PAT和D-氨基酸氧化酶将分离，因此，一旦施用控制量的DL膦丝菌素，由此得到的植物将再一次是雄性或雌性不育的。

利用实施例7和8中所述的方法，将实施例6中所述的构建体转化到小麦中或(利用标准超级双元载体(superbinary vector)方法)，将其转化到水稻中，筛选和再生为小植株。筛选T0转化事件(利用分蘖的无性繁殖维持未处理的株系)，并且做为可替代方案，利用基本如实施例1和2中所述的方法筛选适合的转化事件用于培育做为依赖于DL膦丝菌素的施用，有条件雌性不育的雄性近交亲本系或依赖于DL膦丝菌素的施用，有条件雄性不育的雌性近交系。最好的株系显示了最好的除草剂耐受性、最小的产量损失，最纯的有条件不育性表型等。选择可替代的雄性和雌性亲本系，并且可选地，回交至适合的原种系用于产生大量的后代。充分地表征这些最终选定事件中的基因插入，以及有条件可育，除草剂抗性性状和所表达的基因产物特性遗传的遗传学。

然后，在田地中，以适合的比率，一起间作选定的雌性和雄性亲本系，并且用DL膦丝菌素，以选定用于优化杂种种子产量的0.05到5kg/ha之间的适合比率和不超过早期开花期的时间安排，进行喷雾。由此产生的种子具有这样的优点，即它们将产生不仅从杂种优势获益，同时还具有对包含DL膦丝菌素的除草剂制剂具有耐受性的植物，因此该除草剂制剂可以用于杂草控制。杂种种子也有这样的优点，即它们表达的除草剂耐受性性状仅不完整地传递给将来的自交代和运交至相关的杂草。因此，例如，可以利用DL膦丝菌素做为杂草控制试剂生长本发明产生的杂种水稻，而没有明显的产量损失。然而，做为来源于杂种水稻花粉与红米雌性亲本远交的后代出现的红米植物将来的世代将具有对用DL膦丝菌素处理的营养耐受性，但是具有减少的自稔性(由于花组织中D-氨基酸氧化酶的表达)和因此几乎不产生谷粒。因此，利用本发明的杂种水稻，DL膦丝菌素可以用于杂草控制，同时大大降低将来做为除草剂抗性性状远交至亲密相关红米结果的红米谷粒污染风险。相似地，来源于杂种农作物的第二代水稻或小麦自生作物在用DL膦丝菌素喷雾后，大部分将不产生谷粒。

实施例10.

用包含嵌合基因的多核苷酸进行的玉米的转化/再生，该嵌合基因在雄性生殖组织中优先表达并且编码具有水解咪草酸甲酯或氟燕灵甲酯(famprop methyl)或氟燕灵异丙酯(flamprop methyl)为它们各自的酸能力的酶

如上所述，将RA8-羧酸酯酶-nos表达盒子克隆到一系列bluescript sk载体，pBLRA8_Q01470，pBLRA8_P37967和pBLRA8_P40363中。可选地，与包含选择性标记如pUbiHyg或pSOG35的DNA一起共轰击它们，按例如在WO 98/39462的实施例11中所述，用潮霉素或氨甲喋呤筛选和再生。

做为可替代的方案，在碳化硅须晶上，将pZEN18_BLRA8_Q01470直接轰击或转移到玉米细胞中，例如，如WO 00/66748的实施例12和13中所述，在草甘膦上筛选和再生玉米植物。

做为可替代的方案，利用含有超级双元载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行玉米的转化。例如，从pZEN18BLRA8_Q01470切除pZEN18表达盒子和BLRA8_Q01470嵌合基因，通过与WO 00/66748中所述相似的一系列步骤中一系列的亚克隆和同源重组，将它们克隆到pSB 1-来源的超级双元载体的右和左T-DNA边界之间的位置。用含有超级载体的农杆菌属(Agrobacterium)感染来源于未成熟胚的植物材料，该超级双元载体含有草甘膦标记基因和本发明嵌合基因。如WO 00/66748中所述，利用草甘膦筛选和再生植物。

从来源于转化的植物叶片组织提取DNA，进行PCR检测选择性标记基因和编码羧酸酯酶的基因的存在。繁殖PCR阳性植物。在开花期间，收集雌蕊和花药，并且制备RNA。通过Northern分析证实DNA表达。此外，用pET载体在大肠杆菌(E.coli)中表达羧酸酯酶基因，并且部分纯化。从SDS凝胶切下表达蛋白质的蛋白质条带以产生多克隆抗体。通过Western分析，用这些抗体检测花组织和其它组织中的表达。

实施例11.

将玉米细胞转化为对S-吡氟禾草灵酸(S-fluazifop acid)的生长抑制显示了增加的敏感性的表型

通过RT-PCR或合成获得编码GENESEQP Derwent数据库中2-芳基丙酰-CoA差向异构酶蛋白质序列AAR49827的DNA序列，或者分别包含在GENESEQN Derwent数据库记录号AAQ44447或EMBL记录号RN2ARYLCO的DNA序列中的P70473(Swissprot)，以优化植物组织中的表达。

设计侧翼PCR引物或合成DNA序列以放置用于克隆的有用的单一限制位点。优选地和在差向异构酶编码序列不含有混淆的内部位点的情况下，在5’末端置放Nco1和Nde1位点以方便与添加到ORF 5’的序列的符合读框融合物的克隆。做为可替代的方案，当将限制位点放置于ATG翻译起始位点的上游时，设计间插序列以符合植物翻译的共有序列诸如根据Kozak的共有序列。

通过RT-PCR或合成获得EMBL记录号J05439或X77783 DNA序列中的编码“长链”酰基CoA合成酶蛋白质序列P18163或P39518(Swissprot)的DNA序列。设计侧翼PCR引物或合成DNA序列以置放用于克隆的有用的单一限制位点。优选地和在差向异构酶编码序列不含有混淆的内部位点的情况下，在5’末端置放Nco1和Nde1位点以方便与添加到ORF 5’的序列的符合读框融合物的克隆。做为可替代的方案，如果限制位点放置于ATG翻译起始位点的上游，可设计间插序列以符合植物翻译的共有序列诸如根据Kozak的那些。

与实施例1和2类似，最初将上述编码序列克隆到pUC19或bluescript sk。然后，用适合的限制酶，优选地利用编码序列5’末端的Nco 1位点，切除编码序列，克隆到pMJB1中以产生可替代的符合读框融合的表达盒子，在5’到3’方向包含CaMV35S启动子，TMV翻译增强子，酰基CoA合成酶或差向异构酶编码序列-nos终止子。pMJB1是pUC19-来源的质粒，其包含可操作的双增强的CaMV35S启动子；TMVΩ增强子和nos终止子序列。在WO 98/20144的图2中描述了pMJB1的示意图。

用这种方法产生了一系列pMJB1衍生物，pMJ35S_AAR49827等和pMJ35S_P18163等，其分别含有可替代的差向异构酶和酰基CoA合成酶表达盒子。利用标准技术，可选地，可以进一步将它们克隆至包含植物选择性标记基因的载体如pUbiHyg。

做为可替代的方案，根据图3A和图3B的示意设计，构建两个构建体，其中一个用于“长链”酰基CoA合成酶的表达，另一个用于2-芳基丙酰-CoA差向异构酶的表达。在3A中，DNA构建体在5’到3’方向含有玉米多泛素启动子区(EMBL：ZM29159)，编码酰基-CoA合成酶的DNA序列(EMBL：J05439)，nos终止子序列，CAM 35S启动子区，编码含有玉米ADH内含子的5’非翻译前导序列的区域，编码膦丝菌素乙酰转移酶的DNA序列和nos终止子。照例，将该整个DNA构建体克隆到载体(例如，pUC衍生物)的适合位点，该载体含有大肠杆菌(E.coli)复制起点和氨苄青霉素抗性基因。构建体3B除了编码酰基-CoA合成酶的DNA序列被编码2-芳基丙酰-CoA差向异构酶(EMBL：Y08172)的DNA序列置换外，与构建体3A相同。

利用晶须，将这些载体单独或联合地转化到玉米植物细胞培养物中。例如，通过利用基本如Frame等，(1994)，Plant J.，6，941-948所述的方法，通过将细胞与DNA包覆的碳化硅晶须接触转化BMS细胞的细胞悬浮液。根据在含有一系列浓度的筛选试剂的培养基中差异生长筛选这样产生的转化愈伤组织，所述筛选试剂根据用于转化的DNA可以是，例如草甘膦、潮霉素、L-膦丝菌素或卡那霉素。在图3A和3B中所描述的构建体的情况下，在DL膦丝菌素或其衍生物上进行筛选。选定稳定转化的株系做为愈伤组织，在筛选试剂中繁殖和继续生长。

例如，利用碳化硅晶须转化后，在补加1mg/L双丙氨酰膦的MS培养基上生长BMS细胞。2周后，将细胞转移到补加5mg/L双丙氨酰膦的MS培养基上，它们在该培养基上生长6-8周。形成的抗性愈伤组织转移到补加2mg/L双丙氨酰膦的MS培养基上。稳定转化的愈伤组织转移到液体MS培养基中，生长2周。这个时期以后，沉淀细胞和以1∶10的培养基稀释物重悬浮细胞。然后，将它们平均分配到6孔测定板中，暴露于2.5ppm和10ppm的R或S吡氟禾草灵。在R或S吡氟禾草灵存在的情况下4天后，从孔中除去0.1ml固定体积的细胞，用新鲜的液体MS培养基冲洗，铺平板到固体MS培养基上。7天后，评价细胞活力生长和分化的能力。

比较转化株系和非转化株系对S-吡氟禾草灵，S-吡氟禾草灵丁酯(fluazifop butyl)或类似的S-芳氧基苯氧丙酸类和衍生物的敏感性。筛选优选用在本发明方法中的编码酶的DNA编码序列为这样的序列，即当在BMS细胞中表达这些序列时，它们编码酶或酶的联合，将转化玉米细胞的表型从仅对相对高浓度S吡氟禾草灵或S-吡氟禾草灵丁酯的生长抑制具有敏感性转化为对低得多(至少2-3倍)浓度的S吡氟禾草灵或S-吡氟禾草灵丁酯的生长抑制具有敏感性。

然后如其它实施例中所述利用这种选定的DNA编码序列以产生依赖于外源S-吡氟禾草灵或S-吡氟禾草灵酯的施用，雄性或雌性不育的小麦植物株系。

实施例12

定点诱变以产生编码氧化D-膦丝菌素的D-氨基酸氧化酶的基因

本实施例涉及产生编码纤细红酵母(R.gracilis)D-氨基酸氧化酶变异体的基因，该D-氨基酸氧化酶变异体具有改进的氧化D-膦丝菌素的能力。这些基因用在本发明优选的实施方式中，在其它实施例中描述这些实施方式，其中一旦施用D-膦丝菌素就产生有条件的不育性。在本实施例中，这些基因编码在位置“213”和/或在位置“238”具有单个氨基酸改变的酶。在天然蛋白质序列基序RCTMDSS中，将“213”位置的甲硫氨酸标识为M。在天然蛋白质序列基序GGTYGVG中位置238的酪氨酸被标识为“Y”。本领域已知许多方法可以提供编码一系列D-氨基酸氧化酶变异体的一系列基因，这些D-氨基酸氧化酶变异体在这些位置的一个或两个位置具有氨基酸改变。根据用途选择用于诱变的DNA模板。因此，例如，如果突变基因的期望用途是用于植物中的表达，那么编码纤细红酵母(R.gracilis)D-氨基酸氧化酶的合成DNA诸如SEQ ID#7是适合的起始点。另一方面，当突变基因期望的直接用途是用作酵母筛选系统中进一步诱变和改进循环的起始点时(如实施例13中所述)，那么天然DNA序列(可选地，被改进用于在酿酒酵母(S.cerevisiae)中的表达)更适合。

提供纤细红酵母(R.gracilis)D-氨基酸氧化酶的适合突变体的优选方法是利用Strategenes Quickchange诱变试剂盒和简并寡核苷酸。所用的方法按照制造商的说明书进行。

例如，(在编码D-氨基酸氧化酶的天然纤细红酵母(R.gracilis)DNA序列是诱变的DNA模板的情况下)，适合地，成对的“上部”(RGMUTTOP)和“下部”(RGMUTBOT)简并寡核苷酸具有50-250个核苷酸的长度，经设计它们包含如下的序列区：

RGMUTTOP中包含的序列(SEQ ID #8)

tccccatgcaagcgatgcacgNNNgactcgtccgaccccgcttctcccgcctacatcattccccgaccaggtggcgaagtcatctgcggcgggacgNNNggcgtgggagactgggacttg

RGMUTBOT中包含的序列(SEQ ID#9)

caagtcccagtctcccacgccNNNcgtcccgccgcagatgacttcgccacctggtcggggaatgatgtaggcgggagaagcggggtcggacgagtcNNNcgtgcatcgcttgcatgggga

此外，这两个寡核苷酸，RGMUTTOP和RGMUTBOT的每个末端包含有这样一种序列，即一旦两个寡核苷酸相互退火，所述序列将组成5’和3’末端，该末端将精确地匹配当在一对适宜的单一限制位点切割模板DNA时产生的末端(即，这样设计使得退火的寡核苷酸可以置换从D-氨基酸氧化酶编码模板DNA切下的单一限制片段)。

将0.5到1.0μg每种寡核苷酸转移到0.5ml Eppendorf离心管中，在适合的温度下加热(例如，94℃，根据计算的熔点)5分钟，通过冷却到室温慢慢地退火。然后用两个限制酶(根据模板DNA中两个单一限制位点，这两个单一限制位点横跨包含两个将要被置换的密码子的区，并且以退火DNA的末端为特征)切割模板DNA(例如，pYES6/CT酵母穿梭载体)，凝胶纯化，与退火的寡核苷酸连接，按例如实施例13中所述，转化到酵母中，由此，在酵母中表达通过诱变产生的替代D-氨基酸氧化酶。然后，如所述，选择在作为唯一氮源的D膦丝菌素类似物(如，D-高半胱磺酸(D-homo-cysteic acid))上或D-膦丝菌素上(当共表达PAT基因时)产生最好生长的酵母克隆做为包含具有期望特性的变异体D-氨基酸氧化酶编码序列的酵母克隆。做为可替代方案，在一些非酵母的微生物中，例如，在大肠杆菌(E.coli)溶原菌中，pET载体t7启动子表达控制下进行D-氨基酸氧化酶表达。在这种情况，转化后，利用本领域已知的方法(例如，用于过氧化物产生的荧光测定筛选法或用于氨产生的比色测定法)，可以挑选单菌落，涂平板复制，培养，诱导，裂解和筛选相对于D膦丝菌素的期望底物活性。然后，培育这样选定的酵母或其它微生物克隆，制备DNA，通过校正PCR克隆全长D-氨基酸氧化酶DNA序列，利用InvitrogensZero Blunt TOPO试剂盒克隆到pCRBlunt II中。检测表征选定克隆的D-氨基酸氧化酶编码序列。进一步亚克隆这些D-氨基酸氧化酶编码序列用于在pET载体(例如，Novagen pET 24a)中表达，并且转化到大肠杆菌(E.coli)BL21 DE3中。在发酵罐中，在含有100μg/ml卡那霉素的LCM50培养基上生长细胞，之后IPTG诱导，收获细胞、破碎并部分纯化提取物和测定D-氨基酸氧化酶活性(如下文所述)。选择编码D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因，在pH7.0，该酶的每mg纯蛋白质对D-膦丝菌素产生可接受的稳定性和最高活性(Kcat/Km)。

此外，产生一系列编码特定靶向的D-氨基酸氧化酶的特定DNA序列。具体地，编码纤细红酶母(Rhodotorula gracilis)D氨基酸氧化酶的基因，在位置213具有置换甲硫氨酸的精氨酸、丝氨酸，半胱氨酸、赖氨酸、天冬酰胺或丙氨酸，和/或在位置238具有置换酪氨酸的组氨酸、丝氨酸、半胱氨酸，天冬酰胺或丙氨酸。所用方法与上述方法相同，只是不使用寡核苷酸混合物，而是设计单独的寡核苷酸对，并且用于实现每一单或双氨基酸的改变。克隆每个由此得到的D-氨基酸氧化酶编码序列用于在Novagen pET 24A中T7启动子后(未加标签的)表达，并且转化到大肠杆菌(E.coli)BL21 DE3中。在1.0L发酵罐中，在含有100μg/ml卡那霉素的LCM50培养基中生长细胞，用1mM IPTG诱导表达，通过低速离心收获细胞。

LCM50培养基含有(1L中)：

KH₂PO₄(3g)，Na₂HPO₄(6g)，NaCl(0.5g)，酪蛋白水解产物(Oxoid)(2g)，(NH₄)₂SO₄(10g)，酵母提取物(Difco)(10g)，甘油(35g)(将这些组分配制成溶液并高压灭菌)。下面的另外组分做为溶液无菌过滤，并且添加到培养基中：MgSO₄(246.5mg/ml溶液2.5ml)，硫胺素。HCl(8mg/ml溶液lml)，CaCl₂·2H₂O(147g/l的溶液，0.2ml)，^*FeSO₄·7H₂O/柠檬酸母液(2ml)，^**痕量元素溶液(5ml)，配制成1L。

^*每100ml FeSO₄·7H₂O/柠檬酸母液由FeSO₄·7H₂O(0.415mg)，柠檬酸(0.202mg)组成。

^**每1ml痕量元素溶液组合物是AlCl₃·6H₂O(20mg)，CoCl₂·6H₂O(8mg)，KCo(SO₄)₂·12H₂O(2mg)，CuCl₂·H₂O(2mg)，H₃BO₃(1mg)，KI(20mg)，MnSO₄·H₂O(0.8mg)，Na₂MoO₄·2H₂O(4mg)，ZnSO₄·7H20(4mg)。

在水中洗约7g湿重的细胞。在pH7.0，在等体积含有2mM EDTA，2mM DTT和0.01mM FAD的50mM/Mops/KOH缓冲液中重悬浮细胞。利用玻璃匀浆器均匀地悬浮细胞，然后在13500psi，利用ConstantSystems(BudBrooke Rd，Warwick U.K.)Basic Z细胞破裂器中以一个射击头破裂细胞。在30,000重力，保持冷却(～4℃)离心粗提取物1h，并且弃去沉淀。一些提取蛋白质进行SDS PAGE凝胶电泳，用考马斯蓝染色，通过与相似制备的仅含有“空”pET载体的细胞提取物并排比较，估计提取物中2-50％的总的可溶蛋白质是D-氨基酸氧化酶。将一些提取蛋白质转换到pH7.0含有0.01mM FAD的50mM/Mops/KOH缓冲液中。在标准氧电极室中(在25℃，在0和饱和浓度的氧之间校正)，用相同的缓冲液进行稀释。可选地，利用离子交换、苯基琼脂糖凝胶、分级硫酸胺沉淀和凝胶过滤进一步纯化D-氨基酸氧化酶。在25℃，通过向稀释的酶添加200mM DL膦丝菌素铵盐溶液开始测定。氧电极室中最终反应体积是2ml。(扣除基线中的任何偏差后)测定氧消耗率。M213R(精氨酸置换甲硫氨酸)突变体形式的纤细红酵母(R.gracilis)D氨基酸氧化酶以约14nmol/min/mg蛋白质粗提取物的速率氧化DL膦丝菌素(提取物中估算的D-氨基酸氧化酶纯度是总蛋白质的35％+/-15％)。M213S(丝氨酸置换甲硫氨酸)突变体形式的纤细红酵母(R.gracilis)D氨基酸氧化酶以约4nmol/min/mg蛋白质粗提取物的速率氧化DL膦丝菌素(提取物中估算的D-氨基酸氧化酶纯度是总蛋白质的35％+/-15％)。在对照试验中，根本没有氧化纯的L形式，并且根据浓度，以达到DL氧化速率2倍的速率氧化纯的D形式。在相似的条件下，天然(未突变的)纤细红酵母(R.gracilis)D氨基酸氧化酶没有显示氧化DL或D-膦丝菌素的显著能力(＜0.4nmol/min/mg)。

实施例13.

突变和筛选以产生编码对D-膦丝菌素氧化具有改进的特异性(Kcat/Km)的酶的D-氨基酸氧化酶基因

将天然的纤细红酵母(Rhodotorula gracillis)D-氨基酸氧化酶编码序列克隆到Invitrogen的pYES6/CT穿梭载体中，做为GAL1启动子下游的HindIII/PmeI片段。相似地，将天然的红酵母属(Rhodotorula)D-氨基酸氧化酶编码序列克隆到pAUR123蛋白质表达穿梭载体(Panvera)中做为ADHI组成型启动子下游的XbaI片段。在大肠杆菌(E.coli)中进行这些载体的构建，接着转化到S288C酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中。当适合的时候，用PAT基因分别置换pYES6/CT/pAUR123载体上的杀稻瘟素或aureobasidin抗生素抗性基因，用DL膦丝菌素而不是抗生素维持筛选。此外，克隆编码M213R或M213S基因或M213S，Y238S突变体形式的红酵母属(Rhodotorula)D-氨基酸氧化酶的序列置换野生型编码序列。

利用各种诱变方法产生其它D-氨基酸氧化酶的突变体形式。例如，通过Mn2+-毒害的PCR产生D-氨基酸氧化酶编码序列的多种变异体，在两个穿梭载体的GAL1或ADH1启动子前克隆此混合群体，转化到酵母中，并根据新序列赋予酵母在D-高半胱磺酸(做为唯一氮源)上生长的能力进行筛选。作为替代方案，对转化的酵母直接进行突变和筛选。例如，在含有10-50mM D-高半胱磺酸或(在表达PAT基因的情况下)20-100mM DL膦丝菌素的氮限制培养基中，在化学诱变剂如EMS存在的情况下，在发酵罐中生长用上述质粒转化的酵母，并诱导D-氨基酸氧化酶表达(如培养在作为碳源的半乳糖上)。连续传代培养后，鉴定生长在D-高半胱磺酸或膦丝菌素(做为唯一氮源)上的传代培养物，涂平板并亚克隆D-氨基酸氧化酶序列，测序，在大肠杆菌(E.coli)中表达用于进一步鉴定。

在另一优选的方法中，通过扩增和传代大肠杆菌(E.coli)株系XL1-红，对两个穿梭载体进行诱变。该株系缺陷3个主要的DNA修复途径，mut S，mut D和mut T。这在DNA复制期间导致约5000倍突变率的增加。所用方法根据Stratagene实施。例如，将10ng的穿梭载体转化到大肠杆菌(E.coli)株系XL1-红中，生长细胞，然后在含有氨苄青霉素的L-Broth琼脂上涂平板24小时。从每个平板，通过从平板刮擦菌落到L肉汤中合并大于200个转化体的菌落，然后在37℃，在L-肉汤/氨苄青霉素中以1比100和1比1000的稀释度生长和连续传代1-2周，以确保大量的细胞分裂。从大量的平板开始实施相似的方法。从过夜生长的细胞制备小量制备的穿梭载体DNA，转化回到酵母中。如上所述，生长转化的酵母和筛选含有改进的D-氨基酸氧化酶的菌落。

做为可替代方案，在一些微生物但不是酵母中，例如，在大肠杆菌(E.coli)溶原菌中，pET载体t7启动子表达控制下进行D-氨基酸氧化酶的表达筛选。在这种情况下，将D-氨基酸氧化酶编码序列(可选地，通过Mn2+-有毒PCR诱变)克隆到pET载体中，转化到大肠杆菌(E.coli)株系XL1-红中，并且在传代数个世代后，转化回大肠杆菌(E.coli)溶原菌如BL212 DE3中。然后可以利用本领域已知的方法(例如，用于过氧化物产生的荧光测定筛选法或用于氨产生的比色测定法)，挑选每个菌落，涂平板复制、生长、用IPTG诱导，裂解和筛选对D膦丝菌素期望的底物活性。

做为可替代的方案，直接在纤细红酶母(Rhodotorula gracilis)中进行改进的D-氨基酸氧化酶编码序列的诱变和筛选。在用D-丙氨酸或D-谷氨酸做为唯一氮源的基本培养基中生长纤细红酵母(R.gracilis)，用EMS进行连续循环的诱变，通过传代培养到渐增严格性的培养基中实施筛选，其中，唯一氮源从D-谷氨酸向D-高半胱磺酸转移。在该实施例的变化形式中，利用上述一个酵母载体转化纤细红酶母(Rhodotorula gracilis)，使它表达PAT(当在半乳糖上生长时或组成型地)，并且针对DL膦丝菌素或D膦丝菌素做为唯一氮源进行最后阶段的严格筛选。

可选地，用于酵母筛选的培养基包含低浓度的溶剂(例如，0.1％DMSO)。

实施例14.

对映体纯形式的D-膦丝菌素的产生

用Novagen pET 24A转化大肠杆菌(E.coli)BL21 DE3 codon plusRIL，该Novagen pET 24A具有克隆在T7启动子后用于(未加标签)表达的PAT编码序列(A02774)。在含有卡那霉素的LCM50培养基的10L发酵罐中生长这些细胞达到约40OD_600nm的密度，用0.2mM IPTG诱导，通过低速离心收集，快速转移到含有9.91g D/L膦丝菌素(PPT)铵盐的基本培养基中。

基本培养基(1L中)是：

在水中溶解Na₂HPO₄(6g)，KH₂PO₄(3g)，NaCl(1g)，NH₄Cl(1g)，高压灭菌，加入无菌过滤后的下面的溶液：CaCl₂(14.7g/l，1ml)，MgSO₄(246.5g/l，1ml)，硫胺素.HCl(1mg/ml，5ml)，葡萄糖(30ml 20％溶液，单独高压灭菌)，DMSO 0.5ml。

发酵细节如下。用含有PAT基因的大肠杆菌(E.coli)BL21 DE3密码子加RIL的LB肉汤生长接种物(200ml)接种LCM50培养基的10L发酵罐，在30℃，200rpm，pH6.5，50％空气饱和的氧浓度下维持。约12h后，培养物生长到约30 OD_600nm。然后，通过0.2mM IPTG的添加诱导培养物的PAT表达。1.5h后，通常培养物进一步生长到约40 OD₆₀₀之后通过离心收集细胞和在8L基本培养基中洗细胞。再一次离心细胞，在发酵罐中，在含有9.91g商购D/L膦丝菌素铵盐和0.2mMIPTG的基本培养基中重悬浮到10L的最终体积。升高温度到37℃，通过质子和磷NMR监测发酵罐培养基的样品以检测a)什么时候葡萄糖水平已经实质上下降并且需要补充，和b)膦丝菌素转化为正乙酰膦丝菌素的程度。经约12h的过程，向发酵罐添加约500g葡萄糖。几小时后，开始观察到正乙酰膦丝菌素的形成，并且到约20h时，达到＞93％的L-PPT(46.5％v的D/L)到N-乙酰-L-PP的转化。之后迅速收集发酵培养基，通过低速离心除去细胞。

利用离子交换层析，从发酵培养基纯化D-PPT。在4℃贮藏发酵培养基(～9.51)。它与H⁺形式的900ml Dowex 50W-X8 200-400筛目阳离子交换树脂(用HCl预制备)混合，由此，树脂上方上清液pH值降低到约pH3.0。在重力下沉淀Dowex树脂，并且一起倾析上清液和2L Dowex树脂漂洗水，然后离心澄清化。弃掉洗过的Dowex(最终被回收)。然后，通过分液漏斗用醋酸乙酯(1/4上清液体积)萃取澄清的上清液，保留水性级分(～12L)。然后，添加另一2.3升的H⁺形式Dowex 50W-X8树脂，与此约12L搅拌。然后允许树脂沉淀。在这个阶段，树脂上上清液的pH是～pH1.6。倾析和弃掉上清液，用约12L的水洗树脂，再一次进行沉淀。再一次弃掉上清液。将树脂倾倒在烧结的Buchner漏斗滤器上，用另外约4.5L的水漂洗(除去大多数残留的N-乙酰-膦丝菌素)。用15L 0.4M氢氧化铵，接着用1.4L水漂洗树脂，从树脂洗脱含有D-膦丝菌素的主要级分。该含有D-膦丝菌素的级分的pH是约11.4。可选地，通过，例如0.13mol醋酸和约600ml H⁺形式的阳离子交换树脂的添加，将该pH减少到约pH10。如果进行上述添加，那么要沉淀树脂。然后，将D-膦丝菌素(上清液)级分加样到OH-形式的Dowex 1X8-400筛目阴离子交换树脂的565ml(5×28cm)柱子上(用NaOH预平衡和用水冲洗)。给柱子施用0-0.32M醋酸铵梯度，超过17柱床体积。整个收集55ml的级分。在215nm通过UV和通过质子和31P NMR监测级分。该分析表明在级分39和78之间洗脱高纯度的膦丝菌素。N-乙酰膦丝菌素做为未结合的物质洗脱，并且在梯度中较早洗脱，稍后级分79-90中洗脱一些谷氨酸。

级分63到78(对应于6-7.6柱床体积)组成了大量高纯度的膦丝菌素。冷冻干燥膦丝菌素级分，通过质子和磷NMR检测发现其是纯的(除了醋酸盐外，没有观察到其它的峰，＞95％的有机物质是膦丝菌素)，尽管，根据计算和观察到的干重偏差，发现在膦丝菌素样品中通常仍有一些无机盐(例如，氯化铵)残留。对于实际的目的，当使用D-膦丝菌素时(例如，喷雾到植物上)，可以将这些无机物视为惰性的，并且仅当D-膦丝菌素溶液由称重的干样品配制时，才需要考虑调整计算的浓度。

预期根据上述方法分离的膦丝菌素应该基本上是对映体纯的D-膦丝菌素。这可以根据Hori等，(2002)J.Chrom.B 776，191-198的荧光HPLC分析方法证实。例如，在pH8.5的0.1M硼酸盐缓冲液中溶解50μl商品DL膦丝菌素(0.01-10μg/ml)或50μl样品，与200μl同样硼酸盐缓冲液混合。然后添加50μl的18mM FLEC((+)-1-(9-芴基)乙基氯甲酸酯，并且在40℃，进一步温育该混合物30分钟。通过用500μl醋酸乙酯振荡3分钟除去多余的FLEC。移出100μl底部水层用于HPLC分析。

用77％10mM含水醋酸铵(pH5.0)：23％乙腈以0.8ml/min的速率平衡Inertsil ODS2(15×4.6)5uM的partical HPLC柱子。将2μl样品注射到柱子上，并且进行恒溶剂过柱60分钟，利用荧光检测进行监测，该荧光检测具有在260nm的激发和在305nm的发射波长。观察到清楚地分离了D&L膦丝菌素异构体，并且它们分别在12.4和13.4分钟被洗脱。检测根据本发明方法分离的D膦丝菌素样品，估算其为超过99％的对映体过量。这种估算的基础是用已知量的商品DL膦丝菌素形成峰，并且观察右侧13.2分钟的峰如何小量的增加在该样品产生的12.4分钟的明显单峰背景下是可检测的。

此外，根据峰积分和与标准曲线比较，利用HPLC方法估算膦丝菌素的量。另外通过NMR信号积分估算膦丝菌素的总量。

估算从开始的约9.91gDL外消旋物，总计产生了＞99％对映体过量的约1.9g(38％产率)纯D膦丝菌素铵盐。50-70％干重的样品包含其一直带有的无机盐。可选地，通过进一步的离子交换，并且(交换为挥发性的盐后)冷冻干燥来移除它们。

实施例15.

对映体纯S-吡氟禾草灵和S-吡氟禾草丁酯的产生

利用熟知用于R-吡氟禾草灵的类似方法和如文献中所述(例如，D.Cartwright，Proceedings of the Brighton  Crop ProtectionConference-Weeds(1989)2，707-716和其中的参考文献)，产生S-吡氟禾草灵酸和它们的酯。相似地，熟知产生RS外消旋物的方法。可选地，通过从RS外消旋物制备性层析拆分产生纯的S-吡氟禾草灵(例如，如Bewick(1986)，Pesticide Sci.，17，349-356)。从吡氟禾草灵丁酯的RS混合物，利用Bewick所述的HPLC方法，以超过97％的对映体过量分离S对映体。做为可替代的方案，通过沿着适合环糊精柱子的层析(Journal of Chromatography(1993)，634(2)，197-204)，或者通过利用其它柱层析方法(Biomedical Chromatography(1998)，12(6)，309-316；Journal of Chromatography，A(2001)，937(1-2)，135-138)，从酸的RS混合物直接拆分S-吡氟禾草灵。在Chimiques Des Pays-Bas(1991)110(05)，185-188中描述了分离对映体纯的S芳氧基苯氧基丙酸和它们的酯的另一种一般制备应用方法。在这种情况下，产生羧酸酯酶NP酶，并且用于芳氧基苯氧基丙酸类的外消旋酯的对映选择性水解(可以容易地从剩余的酯分离出由此得到的酸)。

在优选的方法中，通过直接合成方法产生对映体纯的S-吡氟禾草灵。在第一步骤中，合成中间体4-(5-三氟甲基-oyridin-2-基氧基)-苯酚。

4-(5-三氟甲基-oyridin-2-基氧基)-苯酚的制备

在室温，向干燥DMF(200mls)中的碳酸钾悬浮液(13.81g，99mmol)添加氢醌(10.0g，91mmol)，并且搅拌混合物30分钟。添加2-氯-5-三氟甲基吡啶(16.49g，91mmol)，并且温热混合物到90℃，16小时。将反应混合物倾倒到水中，用稀释的HCl酸化，用醋酸乙酯萃取。用水洗合并的有机层，硫酸镁干燥，过滤并且在减压条件下除去溶剂。利用10-20％醋酸乙酯/己烷做为洗脱液，在硅胶上进行柱层析以例如约44％产率产生约10.22g 4-(5-三氟甲基-oyridin-2-基氧基)-苯酚。

δH(400MHz；CDC1₃)8.45，s，1H；7.9，dd，1H；7.0，m，1H；7.0，d，2H；6.8，d，2H；5.75，s，1H.

在下一步中，合成中间体(R)-2-羟基丙酸苄基酯。

(R)-2-羟基丙酸苄基酯的制备

在0℃，在氮气下，向DMF中的D-乳酸钠悬浮液逐滴地添加苄基溴。在0℃，搅拌混合物16小时。在减压条件下除去溶剂，在乙醚和水之间分配残留物。分离各层，用饱和碳酸氢钠、盐水洗有机相，硫酸镁干燥，过滤并在减压条件下除去溶剂产生作为无色油的(R)-2-羟基丙酸苄基酯。例如以88％产率制备2.81g。

δH(400MHz；CDC1₃)7.4，m，5H；5.23，s，2H；4.35，q，1H；2.85，d，1H；1.45，d，3H.

在下一步中，合成中间体(S)-2-[4-(5-三氟甲基-吡啶-2-基氧基)-苯氧基]-丙酸苄基酯

(S)-2-[4-(5-三氟甲基-吡啶-2-基氧基)-苯氧基]-丙酸苄基酯的 制备

在0℃，在氮气下，向4-(5-三氟甲基)-oyridin-2-基氧基)-苯酚(2.90g，11.4mmol)和(R)-2-羟基丙酸苄酯(2.25g，12.5mol)在干燥THF(100ml)中的溶液添加三苯膦，接着逐滴地添加偶氮二羧酸二异丙基酯(3.36ml，17mmol)。搅拌由此得到的黄色混合物1小时，然后保持静止16小时。反应混合物在水和醋酸乙酯之间分配，分离各层。用醋酸乙酯进一步提取含水相，硫酸镁干燥合并的有机层，过滤并在减压条件下除去溶剂。利用10％醋酸乙酯/己烷做为洗脱液在硅胶上进行柱层析产生了无色油状物(S)-2-[4-(5-三氟甲基-吡啶-2-基氧基)-苯氧基]-丙酸苄酯。在一个实施例中，制备了3.25g，69％的产率，并且＞99％ee(通过nmr所测定)。

δH(400MHz；CDCl₃)8.42，s，1H；7.89，dd，1H；7.35，m，5H；7.25，d，2H；6.95，d，1H；6.9，d，2H；5.22，s，2H；4.78，q，1H；1.65，d，3H.

在最后步骤中，制备S酸。

(S)-2-[4-[5-三氟甲基-吡啶-s-基氧基]-苯氧基]-丙酸的制备

在2.5巴氢气氛下，在醋酸乙酯中搅拌(S)-2-[4-(5-三氟甲基-吡啶-2-基氧基)-苯氧基]-丙酸苄酯(3.12g)和Pd/C(5％，0.1g)的混合物2.5小时。通过硅藻土过滤反应混合物，在减压条件下除去溶剂。利用25％醋酸乙酯/己烷1％醋酸做为洗脱液在硅胶上进行柱层析产生无色油状物(S)-2-[4-[5-三氟甲基-吡啶-s-基氧基]-苯氧基]-丙酸。例如，以99％ee+/-0.5％，以99％产率制备2.41g(通过nmr所测定)。

DH(400MHz；CDCl₃)8.42，s，1H；7.9，dd，1H；7.1，m，2H；6.9，m，3H；4.8，q，1H；1.7，d，3H.

利用与上述方法类似的方法产生其它芳氧基苯氧基丙酸除草剂(例如，噁唑禾草灵、吡氟氯禾灵、fluozifop、喹禾灵和它们的酯)的S-对映体。

本领域技术人员将理解，尽管示例了本发明，但是上述实施例没有限制它的范围。

                      序列表

<110>Syngenta Limited

<120>选择性产生雄性或雌性不育植物的方法

<130>PPD50695

<160>11

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>831

<212>DNA

<213>集胞藻属

<400>1

atggaacgat tagaacacca cgccagcttt gggggttggc aaagcgttta tagccatcac    60

agcgctgtgc ttaattgcac catgaacgtt ggcgtttacc tgcctcccca ggctactaac    120

caacattgcc cagttttgta ctggctgtct ggcctcacct gtactgaaca aaatgccatc    180

actaaatcgg gtctacagca gcacgcagca aagcatggac taattatggt gacgccagac    240

actagccccc ggggtgaagg cgtaactgat tctgaagatt atgacctcgg tatgggagcc    300

ggtttctatc tcaacgccac ccaacctccc tgggcagccc actatcaaat gcatgattac    360

attgtgcaag agctgcctac gtggattgag gctaattttg ccgccaccga tgcccggagt    420

atttttggcc attccatggg gggccatggg gccctagtca ttgccctgcg taatcccggt    480

cgttatcgca gtgtttccac cttctctccc attgttgccc ccactcaagt tccctgggga    540

caaaaggcct tccaagctta tttaggggat aaccagttaa gctggcaagc ttgggatacc    600

tgtgctctga ttaaatcggc tccagagcgg ctaccatttt tcgtggacta tggcgacgct    660

gatccattcc tccctaccca attgcggcca gagttactcc aagcggcctg cacggcggct    720

aaccatcccc tcaccctccg tatgcaaccg ggctatgacc atagctatta ctttattgct    780

agtttcatcg gtgatcacat ggattggcat ggagcggcgc tgctaaacta g             831

<210>2

<211>276

<212>PRT

<213>集胞藻属

<400>2

Met Glu Arg Leu Glu His His Ala Ser Phe Gly Gly Trp Gln Ser Val

1               5                   10                  15

Tyr Ser His His Ser Ala Val Leu Asn Cys Thr Met Asn Val Gly Val

            20                  25                  30

Tyr Leu Pro Pro Gln Ala Thr Asn Gln His Cys Pro Val Leu Tyr Trp

        35                  40                  45

Leu Ser Gly Leu Thr Cys Thr Glu Gln Asn Ala Ile Thr Lys Ser Gly

    50                  55                  60

Leu Gln Gln His Ala Ala Lys His Gly Leu Ile Met Val Thr Pro Asp

65                  70                  75                  80

Thr Ser Pro Arg Gly Glu Gly Val Thr Asp Ser Glu Asp Tyr Asp Leu

                85                  90                  95

Gly Met Gly Ala Gly Phe Tyr Leu Asn Ala Thr Gln Pro Pro Trp Ala

            100                 105                 110

Ala His Tyr Gln Met His Asp Tyr Ile Val Gln Glu Leu Pro Thr Trp

        115                 120                 125

Ile Glu Ala Asn Phe Ala Ala Thr Asp Ala Arg Ser Ile Phe Gly His

    130                 135                 140

Ser Met Gly Gly His Gly Ala Leu Val Ile Ala Leu Arg Asn Pro Gly

145                 150                 155                 160

Arg Tyr Arg Ser Val Ser Thr Phe Ser Pro Ile Val Ala Pro Thr Gln

                165                 170                 175

Val Pro Trp Gly Gln Lys Ala Phe Gln Ala Tyr Leu Gly Asp Asn Gln

            180                 185                 190

Leu Ser Trp Gln Ala Trp Asp Thr Cys Ala Leu Ile Lys Ser Ala Pro

        195                 200                 205

Glu Arg Leu Pro Phe Phe val Asp Tyr Gly Asp Ala Asp Pro Phe Leu

    210                 215                 220

Pro Thr Gln Leu Arg Pro Glu Leu Leu Gln Ala Ala Cys Thr Ala Ala

225                 230                 235                 240

Asn His Pro Leu Thr Leu Arg Met Gln Pro Gly Tyr Asp His Ser Tyr

                245                 250                 255

Tyr Phe Ile Ala Ser Phe Ile Gly Asp Hig Met Asp Trp His Gly Ala

            260                 265                 270

Ala Leu Leu Asn

        275

<210>3

<211>1374

<212>DNA

<213>粗糙链孢霉

<400>3

ggaaggaatc agtatggttg gccaaccgcc tcttaccggc ctcaaggtcc tggagtttgc    60

cggtctagct ccaggtcagc cctccatctc tcacttttcc tccgacttac acacacagag    120

gctttcggcc gaaacccggc cgatcttgag gtctcactta tacacttcac ttacacttca    180

ctctcacttg gaaaaaaaca aaatgtcaca aaactaattc cccgcttggg aacaggtccc    240

ttcgccgggc tcctcctcgc cgacgctggc gcctccgtcc tgcgcatcga ccgcgccgtc    300

tccggccccg tcgcccgcca agttcccgac caactaaccc gccacaaatc ctccttggtg    360

gtcgacctca agtccccctc cggaatcgcc ctcatcaaat ccctcgccgc cgtatcggac    420

gttctcatcg acccttaccg ccccggcgtc ctggagaagc tcgggctggg cccctctgtc    480

ctgtgcagcg acgaatgcaa cccccgcctc atctacgccc gcctgacggg cttccggcga    540

gacggccggt tcgccaccat ggccgggcac gatatcaact acctggctgt gagcggggtg    600

ttgagtctgc tggggaggaa gggcgagaag ccgacgccgc ccatcaacat tctgggagac    660

tttgccggcg gcggagcggt tttgttccag ggcatcctgc ttgcgctggc cgcgagggag    720

aggacgggca agggacaggt ggtggaggcg aatatcgtcg acggagcgag ttacttggct    780

acttttaacc ggtttgcgct caaaacggcc gtggggaacg caccgagggg ggagaacctg    840

ctggatacgg gctgccctta ctatgatacg tacgagaccg cggatgggaa gtacatagct    900

gtcggggcgt tggagccgca gtttttcaag gagttggtta aagggttggg gttagaggga    960

caagggtggg aggagaggag aggggacaag gagaattggc ccgagctgag gagggtgttg    1020

gagcacaagt tcaagaccaa aacgaggagg gagtgggagg atatctttga cgggactgat    1080

gcgtgctgca cggcggtgtt tgagtacggc gagatggaaa gggagaggga gcggttggag    1140

ggcgatcaga gacccgtggt tacgcttagg gagacgccct gcttggcgct gaggagcgat    1200

gcgaaggatg ctagccatgg gcaagggccg ggcgtcaagg gggaagcgta tgtaggcatt    1260

cccttgaaac ctggaaaggg aggcgaatct gtcgtggaga agtggcttgg ttggaagaag    1320

ggcaaggagt ttgatgtgtt gaatgggagc gctgtcgcta tcaagtccag actg          1374

<210>4

<211>460

<212>PRT

<213>粗糙链孢霉

<400>4

Gly Arg Asn Gln Tyr Gly Trp Pro Thr Ala Ser Tyr Arg Pro Gln Gly

1               5                   10                  15

Pro Gly Val Cys Arg Ser Ser Ser Arg Ser Ala Leu His Leu Ser Leu

            20                  25                  30

Phe Leu Arg Leu Thr His Thr Glu Ala Phe Gly Arg Asn Pro Ala Asp

        35                  40                  45

Leu Glu Val Ser Leu Ile His Phe Thr Tyr Thr Ser Leu Ser Leu Gly

    50                  55                  60

Lys Lys Gln Asn Val Thr Lys Leu Ile Pro Arg Leu Gly Thr Gly Pro

65                  70                  75                  80

Phe Ala Gly Leu Leu Leu Ala Asp Ala Gly Ala Ser Val Leu Arg Ile

                85                  90                  95

Asp Arg Ala Val Ser Gly Pro Val Ala Arg Gln Val Pro Asp Gln Leu

            100                 105                 110

Thr Arg His LYs Ser Ser Leu Val Val Asp Leu Lys Ser Pro Ser Gly

        115                 120                 125

Ile Ala Leu Ile Lys Ser Leu Ala Ala Val Ser Asp Val Leu Ile Asp

    130                 135                 140

Pro Tyr Arg Pro Gly Val Leu Glu Lys Leu Gly Leu Gly Pro Ser Val

145                 150                 155                 160

Leu Cys Ser Agp Glu Cys Asn Pro Arg Leu Ile Tyr Ala Arg Leu Thr

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Arg Asp Gly Arg Phe Ala Thr Met Ala Gly His Asp Ile

            180                 185                 190

Agn Tyr Leu Ala Val Ser Gly Val Leu Ser Leu Leu Gly Arg Lys Gly

        195                 200                 205

Glu Lys Pro Thr Pro Pro Ile Asn Ile Leu Gly Asp Phe Ala Gly Gly

    210                 215                 220

Gly Ala Val Leu Phe Gln Gly Ile Leu Leu Ala Leu Ala Ala Arg Glu

225                 230                 235                 240

Arg Thr Gly Lys Gly Gln Val Val Glu Ala Asn Ile Val Asp Gly Ala

                245                 250                 255

Ser Tyr Leu Ala Thr Phe Asn Arg Phe Ala Leu Lys Thr Ala Val Gly

            260                 265                 270

Asn Ala Pro Arg Gly Glu Asn Leu Leu Asp Thr Gly Cys Pro Tyr Tyr

        275                 280                 285

Asp Thr Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Lys Tyr Ile Ala Val Gly Ala Leu

    290                 295                 300

Glu Pro Gln Phe Phe Lys Glu Leu Val Lys Gly Leu Gly Leu Glu Gly

305                 310                 315                 320

Gln Gly Trp Glu Glu Arg Arg Gly Asp Lys Glu Asn Trp Pro Glu Leu

                325                 330                 335

Arg Arg Val Leu Glu His Lys Phe Lys Thr Lys Thr Arg Arg Glu Trp

            340                 345                 350

Glu Asp Ile Phe Asp Gly Thr Asp Ala Cys Cys Thr Ala Val Phe Glu

        355                 360                 365

Tyr Gly Glu Met Glu Arg Glu Arg Glu Arg Leu Glu Gly Asp Gln Arg

    370                 375                 380

Pro Val Val Thr Leu Arg Glu Thr Pro Cys Leu Ala Leu Arg Ser Asp

385                 390                 395                 400

Ala Lys Asp Ala Ser His Gly Gln Gly Pro Gly Val Lys Gly Glu Ala

                405                 410                 415

Tyr Val Gly Ile Pro Leu Lys Pro Gly Lys Gly Gly Glu Ser Val Val

            420                 425                 430

Glu Lys Trp Leu Gly Trp Lys Lys Gly Lys Glu Phe Asp Val Leu Asn

        435                 440                 445

Gly Ser Ala Val Ala Ile Lys Ser Arg Leu Ser Gln

    450                 455                 460

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

aactgcagct ttttggttag cgaatgc                                        27

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

cagactagtt ttagctaatt tctttaagta aaaac                               35

<210>7

<211>1107

<212>DNA

<213>纤细红酵母

<400>7

atgggatccc aaaagagggt tgtggtgctg ggttccggcg tgataggact cagctccgcg    60

cttatacttg cccggaaggg gtactccgtc cacatcctgg cccgggacct cccagaggat    120

gttagctcac agaccttcgc gtccccttgg gctggagcca actggacccc ttttatgacc    180

ctcactgacg gcccgaggca ggcaaagtgg gaggagtcta cattcaagaa gtgggtggaa    240

cttgtgccaa cggggcatgc catgtggttg aagggaacca ggcgtttcgc ccaaaatgag    300

gacggactgc tcggtcactg gtacaaagat atcaccccca attatagacc cttgccctct    360

tccgaatgtc caccaggcgc tattggcgtg acttatgaca cattgtcagt gcacgctcca    420

aagtactgcc aatacctcgc aagggagctc cagaagctgg gggcgacatt cgagcgccgc    480

accgttactt ccctcgagca agcttttgat ggggctgacc tcgtcgttaa cgcgacgggg    540

ctgggtgcca agtccatcgc tggcatcgat gaccaggcgg ccgagcctat tcgcggtcaa    600

acggtgctcg tcaagtcgcc ctgcaaaagg tgtactatgg acagctcgga cccggcatca    660

ccggcgtaca tcatcccgcg gccaggaggc gaagtgattt gcggcggtac gtacggggtc    720

ggagactggg atctctcggt caacccagag accgtccagc gcatcctcaa acactgcctg    780

cgcctggatc cgactatttc ttcggacggc acaatcgaag gcatcgaggt gctgcggcat    840

aacgtcggac tcagaccggc gaggagggga ggccctcgcg ttgaagccga gaggattgtt    900

cttccacttg acagaacgaa gagccccctc tcactgggcc gtgggagcgc tcgtgcggcc    960

aaggagaagg aggtgacttt ggtgcatgcc tacggtttct ccagcgctgg ctatcaacag    1020

tcttggggcg cagccgaaga cgtcgcacaa ttggtcgatg aggcgtttca gaggtatcat    1080

ggggccgccc gcgagtctaa gctctga                                        1107

<210>8

<211>120

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(22)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(97)..(97)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(98)..(98)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(99)..(99)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<400>8

tccccatgca agcgatgcac gnnngactcg tccgaccccg cttctcccgc ctacatcatt    60

ccccgaccag gtggcgaagt catctgcggc gggacgnnng gcgtgggaga ctgggacttg    120

<210>9

<211>120

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(22)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(97)..(97)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(98)..(98)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(99)..(99)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<400>9

caagtcccag tctcccacgc cnnncgtccc gccgcagatg acttcgccac ctggtcgggg    60

aatgatgtag gcgggagaag cggggtcgga cgagtcnnnc gtgcatcgct tgcatgggga    120

<210>10

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基序

<400>10

Arg cys Thr Met Asp Ser Ser

1               5

<210>11

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基序

<400>11

Gly Gly Thr Tyr Gly Val Gly

1               5

Claims (20)

1、一种生产雄性或雌性不育植物的方法，该方法包括步骤：用多核苷酸转化植物材料，该多核苷酸编码至少一种与非毒害植物的物质反应产生毒害植物的物质的酶，和将由此转化的材料再生为植物，其中不超过雄性或雌性配子形成和/或成熟的时期，向所述植物施用所述非毒害植物的物质，使得非毒害植物的物质提供毒害植物的物质的产生，该毒害植物的物质选择性地阻止所述配子的形成或使其没有功能，其中所述酶优先在雄性或雌性生殖结构中表达，其特征在于：(i)非毒害植物的物质选自：对非绿色组织有直接植物毒性的非膦酸酯类除草剂的酯衍生物，D-α氨基酸，非蛋白质D-α氨基酸的肽衍生物，芳氧基苯氧丙酸类的S-对映体和芳氧基苯氧丙酸类的酯衍生物的S-对映体，和(ii)所述酶选自：羧酸酯酶、D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶、D-氨基酸消旋酶、2-芳基丙酰-CoA差向异构酶、α-甲基酰基-CoA消旋酶、硫酯酶和酰基-CoA合成酶。

2、如权利要求1所述的方法，其中所述非毒害植物的物质与至少一种另外的物质一起混合施用，所述另外的物质选自：安全剂、杀配子剂、谷胱甘肽-S-转移酶诱导物、细胞色素P450诱导物、除草剂、肥料、杀线虫剂、增效剂、杀虫剂、杀真菌剂、激素、植物生长调节剂和细胞色素P450抑制剂。

3、如权利要求1或2所述的方法，其中叶面施用非毒害植物的物质，且该非毒害植物的物质是所述酶的韧皮部可移动的和代谢稳定的可氧化底物，其中该酶提供了做为来源于非毒害植物物质的直接或间接产物的毒害植物的产物。

4、如前述权利要求所述的方法，其中毒害植物的产物是以过氧化物和/或超氧阴离子形式产生的间接产物。

5、如权利要求3或4任一权利要求所述的方法，其中非毒害植物的物质是D-α氨基酸，其选自：D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-甲硫氨酸、D-丝氨酸、D-亮氨酸和D-异亮氨酸，所述的酶是D-氨基酸氧化酶或氧化还原酶，其氧化所述氨基酸为2-酮酸，同时伴随着氧原子还原为过氧化物阴离子。

6、如权利要求3或4任一权利要求所述的方法，其中非毒害植物的物质是D-天冬氨酸或D-谷氨酸，所述酶是D-氨基酸氧化酶或氧化还原酶，其氧化所述的氨基酸为2-酮酸，同时伴随氧还原为过氧化物阴离子。

7、如前述权利要求所述的方法，其中酶是从纤细红酶母(Rhodotorula gracilis)获得的突变D-氨基酸氧化酶，该氧化酶与野生型序列相比，在位置213和/或238包含置换，或者是D-天冬氨酸氧化酶。

8、如前述权利要求所述的方法，其中从红酵母属(Rhodotorula)获得的氧化酶在位置213具有选自Arg，Lys，Ser，Cys，Asn和Ala的氨基酸，和/或在位置238具有选自His，Ser，Cys，Asn和Ala的氨基酸。

9、如权利要求3-8任一权利要求所述的方法，其中所述酶不靶向过氧化物酶体。

10、如权利要求1或2所述的方法，其中所述酶是羧酸酯酶，非毒害植物的物质是咪草酸的酯或氟燕灵的酯。

11、如前述权利要求所述的方法，其中非毒害植物的物质是咪草酸甲酯，氟燕灵甲酯或氟燕灵异丙酯，植物是小麦或本身同样对咪草酸甲酯，氟燕灵甲酯或氟燕灵异丙酯基本上不敏感的植物。

12、如权利要求1或2所述的方法，其中所述酶是D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶或D-氨基酸消旋酶，非毒害植物的物质是膦丝菌素的D对映体或双丙氨酰膦的D对映体。

13、如权利要求1或2所述的方法，其中非毒害植物的物质包含在混合物中，该混合物含有毒害植物的物质，其中酶是D-氨基酸氧化酶或氧化还原酶，所述酶能将氨基酸氧化为2-酮酸，同时伴随氧还原为过氧化物阴离子。

14、如前述权利要求所述的方法，其中酶是从纤细红酶母(Rhodotorula gracilis)获得的突变D-氨基酸氧化酶，该氧化酶与野生型序列相比在位置213和/或238包含置换，或者是D-天冬氨酸氧化酶。

15、如前述权利要求所述的方法，其中从红酵母属(Rhodotorula)获得的氧化酶在位置213具有选自Arg，Lys，Ser，Cys，Asn和Ala的氨基酸，和/或在位置238具有选自His，Ser，Cys，Asn和Ala的氨基酸。

16、如权利要求13-15任一权利要求所述的方法，其中混合物包含D和L膦丝菌素，并且植物材料基本上仅在绿色组织中和产生配子的花组织中表达PAT基因，该配子不是那些使得其没有功能的配子。

17、如权利要求1或2所述的方法，其中酶选自：2-芳基丙酰-CoA差向异构酶、α-甲基酰基-CoA消旋酶、硫酯酶和酰基-CoA合成酶，其中非毒害植物的物质是芳氧基苯氧丙酸类的S-对映体和芳氧基苯氧丙酸酯类的S-对映体。

18、如前述权利要求所述的方法，其中所述的芳氧基苯氧丙酸的S-对映体选自：S-吡氟禾草灵、S-喹禾灵、S-喔草酯、S-吡氟氯禾灵、S-噁唑禾草灵、S-氟甲草、S-Cyhalofop和S-炔草酯。

19、一种产生对映体纯的D-膦丝菌素(D-PPT)的方法，包括步骤：

(a)提供包含酶的细胞，该酶具有选择性N-酰化PPT的能力；

(b)在含有D-L PTT的培养基中生长所述细胞以产生条件培养基；

(c)从(b)的条件培养基分离细胞；

(d)可选地，在各种pH，用非水性、非混溶的溶剂萃取条件培养基，使得含有PPT的级份与含有水溶性比PPT大的分子的级份分离；

(e)可选地，以足以从培养基吸附相当比例除PTT外的阳离子的量和pH，混合质子化形式的阳离子交换树脂和条件培养基或步骤(d)的含有PPT的萃取培养基；

(f)以足以结合培养基中大部分PPT的量和pH，混合质子化形式阳离子交换树脂和条件培养基、萃取培养基或来源于步骤(e)的培养基，

(g)收集步骤(f)的PPT结合的阳离子离子交换树脂，并且利用有足够pH和离子强度的洗脱介质从该树脂选择性洗脱PPT，条件是所述洗脱介质的pH不至于低到引起由此洗脱的PPT外消旋化。

20、具有至少98.5％对映体过量的D-PPT。

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