DE3700313A1 - Verwendung eines resistenzgens gegen phosphinothricin - Google Patents

Verwendung eines resistenzgens gegen phosphinothricin

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DE3700313A1
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Gerhard Dr Woehner
Ruediger Dr Marquardt
Susanne Dr Grabley
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Description

Verwendung eines Resistenzgens gegen Phosphinothricin (Zusatz zur Patentanmeldung P 36 28 747.4 und zur Zusatzanmeldung P 36 42 829.9).
Die Hauptanmeldung P 36 28 747.4 betrifft ein Resistenzgen gegen Phosphinothricin (PTC), erhältlich aus der Gesamt-DNA von auf Phosphinothricyl-alanyl-alanin (PTT)-Resistenz selektiertem Streptomyces viridochromogenes DSM 40 736 durch Schneiden mit BamHI, Klonieren eines 4,0 kb großen Fragments und Selektion auf PTT-Resistenz, sowie die Verwendung dieses Gens zur Herstellung PTC-resistenter Pflanzen, als PTT-Resistenz-Marker in Bakterien und als PTC-Resistenz-Marker in Pflanzenzellen. Das Resistenzgen ist durch eine Restriktionskarte (Fig. 1) charakterisiert, die ein 4 kb großes BamHI-Fragment näher definiert.
Durch Klonieren von Teilbereichen dieses 4 kb-Fragmentes wurde die Lage des Codierbereichs näher eingegrenzt. Hierbei zeigte sich, daß das Resistenzgen auf dem 1,6 kb SstII-SstI-Fragment (Positionen 0,55 bis 2,15 in Fig. 1 der Hauptanmeldung) liegt. Durch Verdauung mit BglII wird das 0,8 kb große Fragment gewonnen, das nach Einbau in ein Plasmid und Transformation von 8. lividans PTT-Resistenz vermittelt. Diese Resistenz ist durch die N-Acetylierung von PCT bedingt (Nachweis wie in der Hauptanmeldung angegeben).
In der Zusatzanmeldung P 36 42 829.9 ist die DNA-Sequenz des vorstehend genannten 0,8 kb-Fragments wiedergegeben. Dieses Fragment umfaßt den größten Teil des Resistenzgens.
Es wurde nun gefunden, daß die N-Acetylierung von PTC auch zur Racemattrennung von synthetischem D,L-PTC genutzt werden kann, da selektiv nur die L-Form acetyliert wird. Die Erfindung betrifft somit die Verwendung des Resistenzgens zur selektiven N-Acetylierung der L-Form von racemischem PTC.
Die von dem erfindungsgemäßen Resistenzgen kodierte PTC- Acetyltransferase kann also dazu benutzt werden, racemisches PTC, wie es beispielsweise nach der deutschen Patentschrift 27 17 440 erhältlich ist, in die optischen Antipoden zu trennen, indem das Racemat der acetylierenden Wirkung dieses Enzyms ausgesetzt wird, wobei selektiv die L-Form angegriffen wird, während die D-Form unverändert bleibt. Das so erhaltene Gemisch kann dann aufgrund seiner unterschiedlichen Eigenschaften in an sich bekannter Weise aufgetrennt werden.
Es ist bekannt, N-Acyl-D,L-Aminosäuren mit gegebenenfalls trägerfixierten Acylasen in Kontakt zu bringen, wobei selektiv die L-Aminosäure freigesetzt wird, die aus dem Gemisch mit der N-Acyl-D-Aminosäure nach Ansäuern mit nicht wassermischbaren Lösemitteln extrahiert werden kann (Britische Patentschrift 13 69 462). Eine entsprechende Auftrennung von N-Acyl-D,L-PTC ist beispielsweise aus der Deutschen Offenlegungsschrift 29 39 269 oder der US-Patentschrift 42 26 941 bekannt.
Das erfindungsgemäß zurückbleibende D-PCT kann in bekannter Weise racemisiert werden (Europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer (EP-A) 01 37 371, Beispiel 8), und dann in den Prozeß zurückgeführt werden.
Die Isolierung des Enzyms, worunter hier und im folgenden auch immer der enzymatisch wirksame Teil verstanden werden soll, ist möglich, aber nicht erforderlich. Falls das Enzym isoliert wird, kann es freier oder trägerfixierter Form eingesetzt werden. Geeignete Träger sind beispielsweise in der EP-A 01 41 223 beschrieben. Zweckmäßig wird jedoch das Enzym nicht isoliert, sondern man setzt beliebige PTC-resistente Zellen ein, die das erfindungsgemäße Enzym exprimieren. So kann zweckmäßig die im Beispiel 1 der Hauptanmeldung beschriebene Selektante von S. viridochromogenes DSM 40 736 eingesetzt werden. Vorteilhaft kann auch eine beliebige, mit dem erfindungsgemäßen Gen transformierte Zelle zum Einsatz gelangen, die in der Lage ist, die PTC-Acetyltransferase zu exprimieren. Das erfindungsgemäße Gen, worunter hier auch der in der Zusatzanmeldung charakterisierte aktive Teil desselben verstanden wird, kann hierbei in plasmidintegrierter Form in die Wirtszelle eingebracht werden, wie es beispielsweise in der Hauptanmeldung beschrieben ist, oder mit anderen üblichen gentechnischen Methoden, beispielsweise durch Transfektion. Zweckmäßig ist beispielsweise der Einbau in ein E. coli-Expressions­ plasmid und Transformation von E. coli mit einem solchen Plasmid, beispielsweise nach den aus EP-A 01 63 249 und 01 71 024 bekannten Verfahren.
Zur erfindungsgemäßen N-Acetylierung von L-PTC im Racemat können die Zellen, die die PTC-Acetyltransferase exprimieren, in freier oder fixierter Form eingesetzt werden, wobei die üblichen Fixierungsmethoden Anwendung finden (z.B. Deutsche Offenlegungsschrift 32 37 341 und darin zitierte Literatur).
Die erfindungsgemäße enzymatische Acetylierung von L-PTC erfolgt in der für enzymatische Umsetzungen üblichen Weise, wobei sich die Verfahrensbedingungen an den Gegebenheiten des eingesetzten Organismus orientieren. Grundsätzlich kommen hierfür dieselben Methoden wie für die vorstehend genannten selektiven Entacylierungsverfahren in Betracht.

Claims (1)

  1. Verwendung des Resistenzgens gegen Phosphinothricin gemäß Patentanmeldung P 36 28 747.4 und Zusatz P 36 42 829.9 zur selektiven N-Acetylierung der L-Form von racemischem Phosphinothricin.
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