DE10047217A1

DE10047217A1 - Verfahren zur Herstellung von Ribonukleinsäure (RNS)

Info

Publication number: DE10047217A1
Application number: DE2000147217
Authority: DE
Inventors: Till T Bachmann; Francois Villatte
Original assignee: VILLATTE F
Current assignee: VILLATTE F
Priority date: 2000-09-23
Filing date: 2000-09-23
Publication date: 2002-04-18
Also published as: AU2001293828A1; WO2002024904A3; WO2002024904A2

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Herstellung von Ribonukleinsäure (RNS) beschrieben, bei dem nukleinsäuresekretierende Mikroorganismen eingesetzt werden. Ferner wird ein Verfahren zur Identifizierung solcher Mikroorganismen sowie deren Verwendung beschrieben.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel lung von Ribonukleinsäure (RNS) gewünschter Sequenz sowie ein Verfahren zur Identifizierung von nukleinsäuresekretierenden Mikroorganismen, Kits zur Durchführung der Verfahren, sowie die Verwendung bestimmter Mikroorganismen in einem Verfahren zur Herstellung von RNS.

Verfahren zur Herstellung von RNS sind im Stand der Technik be kannt. Dabei werden Polynukleotide z. B. in vitro in einer RNS- Synthesereaktion durch "Anpolymerisieren" von 5'-Nukleosiddi phosphaten unter Phosphatabspaltung an vorhandene Oligonukleo tide, die als Starter (Primer) dienen, hergestellt. Diese Reak tion wird durch das Enzym Polynukleotid-Phosphorylase kataly siert. In dem bekannten Verfahren wird die Basenzusammensetzung des zu synthetisierenden Polynukleotids nicht durch eine Matri ze kodiert, sondern von dem unterschiedlichen Angebot an Bau steinen, d. h. Ribonukleotiden, bestimmt. Ein Überblick über das bekannte Verfahren findet sich in dem. Lexikon der Biochemie, 2. Band, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 2000; S. 303.

Des weiteren kann RNS mittels in vitro-Transkription herge stellt werden, bei der für die Synthese der RNS eine Matrize in Form eines DNS-Templates, sowie die Verwendung von DNS abhängigen RNS-Polymerasen, beispielsweise aus den Bakteriopha gen T3, T7 oder SP6, erforderlich ist. Eine detaillierte Be schreibung dieses Verfahrens ist in "Sambrook, Fritsch, Ma niatis in Molecular Cloning - Laboratory Manual", 2. Auflage Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, S. 10.32 ff. dargestellt.

Außerdem besteht nach dem Stand der Technik die Möglichkeit, RNS mittels chemischer Synthese durch Knüpfung von Phosphodie sterbindungen zwischen den Nukleotiden ohne die Beteiligung von Enzymen herzustellen. Ein Beispiel hierfür ist die sogenannte Phosphoamidit-Methode, die im Lexikon der Biochemie, 2. Band, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 2000, S. 163 beschrie ben ist.

Die biologische Bedeutung der RNS für alle lebenden Zellen liegt in der Übertragung der genetischen Information von der DNS zu den Orten der Proteinbiosynthese durch die sogenannte Messenger-RNS (mRNS) und in der Realisierung der Information bei der Proteinbiosynthese unter Beteiligung der sogenannten Transfer-RNS und der ribosomalen RNS (tRNS, rRNS).

Neben diesen physiologischen Aspekten nutzt die moderne Bio technologie die Möglichkeit, RNS z. B. als Therapeutikum einzu setzen. Hier ist zum einen an sogenannte Ribozyme, d. h. an RNS- Moleküle mit katalytischen Eigenschaften, zu denken. Es gibt Bestrebungen, komplexe künstliche Ribozyme herzustellen, die analog zu bestimmten Enzymen therapeutische oder krankheitsvor beugende Eigenschaften haben. Außerdem sind RNS-Moleküle auf grund ihrer Fähigkeit, eine Vielfalt von chemischen Reaktionen zu katalysieren, auch für die chemische Industrie von großem Interesse. Für einen Überblick siehe hierzu auch Jaeger, L. Curr. Opin. Struct. Biol. 7 (1997) 324, und Narkilar G. T. u. Herschlag D., Annu. Rev. Biochem. 66 (1997) 19.

Eine weitere wichtige Rolle spielen RNS-Moleküle als sogenannte Antisense-Medikamente. Darunter versteht man Medikamente, die sich aufgrund ihrer zu einem Gen bzw. zu einer mRNS oder ande ren Nukleinsäure komplementären Struktur an diese Nukleinsäure anlagern und dadurch die Realisierung einer bestimmten geneti schen Information, d. h. Transkription und Translation, blockie ren. Im Tierversuch ist es mit Hilfe solcher Antisense- Medikamente gelungen, pathologische Arterienverengungen zu ver hindern. In anderen Studien konnten maligne Hirntumoren zum Schrumpfen gebracht werden. Des weiteren konnte durch Verwen dung von Antisensekonstrukten in vitro die Proliferation und Differenzierung von Stammzellen gesteuert werden. In den USA wurden Antisense-Medikamente bereits in klinischen Studien auf ihre Wirksamkeit bei Leukämie und eventuellen Nebenwirkungen getestet. Auch die Behandlung von Aids mit Hilfe dieser Medika mente wird angedacht.

Ein großer Bedarf an ausreichenden Mengen von RNS besteht auch im Zusammenhang mit der Entwicklung von neuen Wirkstoffen, die als Wirkort direkt an einer RNS ansetzen sollen. Für das hier mit verbundene notwendige Wirkstoffscreening zum Aufspüren ei ner solchen Substanz sind große Mengen von spezifischer RNS er forderlich.

Des weiteren besteht natürlich auch im Forschungsbereich, z. B. für in vitro-Translationsstudien bis hin zur Entwicklung von Gentherapien, verstärkter Bedarf an großen Mengen von RNS. Aus den vorstehend genannten Gründen ergibt sich eine zunehmende Bedeutung von RNS sowohl in der biotechnologischen als auch in der pharmazeutischen Industrie.

Trotz dieses ansteigenden Bedarfs ist die Verfügbarkeit von ausreichenden Mengen an RNS nicht gelöst. Bei den oben zitier ten bekannten Verfahren zur RNS-Herstellung handelt es sich ausschließlich um äußerst kostenintensive und komplexe Herstel lungsverfahren. Häufig werden hierbei auch für den Menschen toxische Lösungsmittel verwendet. Eine Ausweitung der beschrie benen Verfahren auf großmaßstabliche Herstellungsprozesse ist nicht möglich.

Bei der oben beschriebenen enzymunabhängigen chemischen Synthe se von RNS-Oligonukleotiden besteht zusätzlich das Problem, daß der Syntheseprozeß ab einer Länge von circa 80 Nukleotiden ab bricht. D. h. die Herstellung von längerkettigen RNS-Molekülen, die häufig für ihren effizienten Einsatz als Antisense- Medikament eine Voraussetzung sind, ist auf diese Art nicht möglich.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb, ein Verfahren zur Herstellung von Ribonukleinsäure (RNS) gewünschter Sequenz bereitzustellen, bei dem die vorstehend genannten Nachteile vermieden werden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Ver fahren folgende Schritte umfaßt:

a) Bereitstellung von Mikroorganismen, vorzugsweise von Bak terien, in Kultur, die zur Sekretion von RNS in das extra zelluläre Medium fähig sind,
b) Isolierung und/oder Anreicherung der von den Mikroorganis men in das extrazelluläre Medium sekretierten RNS.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Wei se vollkommen gelöst.

Die Erfinder haben nämlich erkannt, daß die hier erstmals bei spielhaft für verschiedene Bakterien beschriebene Fähigkeit von bestimmten Mikroorganismen, RNS in das extrazellulär umgebene Medium zu sekretieren, zur Herstellung großer Mengen von RNS geeignet ist. Hierbei war es besonders überraschend und nicht zu erwarten, daß bspw. bestimmte Bakterienstämme natürliche RNS nach ihrer Synthese aus der Zelle ausschleusen. Diese sekretierte RNS läßt sich besonders einfach und ohne großen Kosten aufwand anreichern bzw. isolieren. Die erfindungsgemäße Her stellung der RNS erfordert keine Lyse der Mikroorganismenzel len, was die Isolierung und/oder Aufreinigung der RNS ganz ent scheidend vereinfacht. Die sekretorischen Mikroorganismen kön nen sehr einfach in großvolumigen Fermentern kultiviert und der RNS-enthaltende Überstand kann mittels einfacher Methoden, z. B. durch Zentrifugation, von den zellulären Bestandteilen abge trennt werden. Durch dieses erfindungsgemäße Verfahren läßt sich RNS in sehr großen Mengen, d. h. in mehreren Milligramm pro Liter, herstellen.

Bei der interessierenden, gewünschten Sequenz kann es sich ins besondere im Zusammenhang mit dem eingangs angesprochenen Wirk stoffscreening zur Entwicklung von neuen Wirkstoffen um eine RNS "natürlichen Ursprungs" handeln, beispielsweise um eine mRNS, die für ein bestimmtes bakterielles Protein kodiert, oder um eine rRNS. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich folg lich besonders für die Entwicklung anitibakterieller bzw. anti biotischer Wirkstoffe.

Des weiteren ist das erfindungsgemäße Verfahren durch seine einfache Durchführbarkeit und durch wenige manuelle Handgriffe charakterisiert, da sowohl die Bereitstellung der Mikroorganis men als auch die Isolierung der sekretierten RNS weitgehend au tomatisiert werden können. Dadurch wird das erfindungsgemäße Verfahren besonders für industrielle biotechnologische oder pharmazeutische Herstellungsprozesse geeignet.

Lediglich der Vollständigkeit halber sei an dieser Stelle er wähnt, daß in einzelnen Säugetierzellen eine Sekretion von RNS in das die Zelle umgebende Medium beobachtet wurde. So konnten z. B. Sitikov, A. S. und Munishkin, A. V., 1991, "Specific sup presser T-cells secrete RNA", Dokl. Akad. Nauk. SSSR, 318 (6), 1486-8, für zwei Suppressor T-Zellinien, die in einem bestimm ten Kulturmedium gehalten wurden, sekretierte RNS in dem Medium nachweisen. Ryazantseva, I. N., 1969, "Dynamic of RNA secretion into a culture medium by Ehrlich carcinoma cells in a short lift culture", Sb. Aspir. Rab., Kazan. Gos. Univ., Estestv. Nauki., 129-32, konnte an isolierten Karzinomzellen eine Sekre tion von RNS in das Kulturmedium beobachten.

In einer weiteren Arbeit konnte an kultivierten Embryofibrobla sten des Huhns eine Freisetzung von RNS in das umgebende Medium gezeigt werden, siehe McIntosh, Alison, A. G. Adams, David H., 1985, "Further studies on the extrusion of cytosol macromole cules by cultured chick embryo fibroblast cells", Int. J. Bio chem., 17 (2), 147-53.

Eine industrielle Nutzung dieser an bestimmten Zellen höherer Eukaryonten beschriebenen RNS-sekretorischen Eigenschaften ist jedoch aufgrund der aufwendigen Kultivierungsbedingungen und der begrenzten Verfügbarkeit dieser Zellen nicht möglich.

In einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Ver fahrens enthalten die Mikroorganismen, vorzugsweise Bakterien, einen Expressionsvektor, der für die gewünschte Sequenz ko diert.

Besonders überraschend ist bei der vorliegenden Erfindung, daß die untersuchten sekretorischen Bakterien nach ihrer Transfor mation mit rekombinanten DNS-Fragmenten, RNS-Moleküle mit der einklonierten Sequenz in das extrazelluläre Medium sekretieren. Durch diese Eigenschaft der sekretorischen Bakterien lassen sich erfindungsgemäß große Mengen an RNS mit beliebiger Nukleo tidsequenz herstellen. Dies ist z. B. im Hinblick auf die Her stellung der eingangs erwähnten Antisense-Medikamente wichtig. Die Synthese eines Proteins kann natürlich nur dann durch ein Antisense-Konstrukt, z. B. in Form einer RNS, blockiert werden, wenn diese Sequenz zu der für das Protein kodierenden Nuklein säure komplementär ist. Hierbei ist es weiterhin ganz entschei dend, daß nur die Synthese des krankheitsassoziierten Proteins, nicht aber von anderen, möglicherweise essentiellen Proteinen gehemmt wird. Bei Kenntnis des zugrunde liegenden krankheitser zeugenden Gens oder der Aminosäuresequenz des entsprechenden Genprodukts, d. h. Proteins, kann die entsprechend komplementäre Sequenz in einen Expressionsvektor kloniert werden, mit dem dann beispielsweise ein sekretorischer Bakterienstamm transfor miert wird. Die von den Bakterien exprimierte rekombinante RNS wird dann erfindungsgemäß in großen Mengen aus dem extrazellu lären Medium aufgereinigt.

In weiter bevorzugter Ausgestaltung der Erfindung erfolgt im Anschluß an den Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens ei ne Isolierung der Fraktion der RNS, die die gewünschte Sequenz aufweist.

Dies hat den besonderen Vorteil, daß aus der Gesamtheit der se kretierten RNS, die z. B. durch RNS "natürlichen Ursprungs", d. h. mit unerwünschter Sequenz, verunreinigt sein kann, nur die Spezies von RNS erhalten wird, die die gewünschte, in den Ex pressionsvektor einklonierte Sequenz aufweist. Eventuell stö rende RNS-Fraktionen werden somit abgetrennt.

Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung ist es, wenn die Isolierung und/oder Anreicherung der sekretierten RNS aus Schritt b) eine Gelfiltration, vorzugsweise mittels Sephacryl, umfaßt.

Diese chromatographische Methode ermöglicht in vorteilhafter Weise die Trennung von Molekülen nach ihrer Größe. Dadurch läßt sich die sekretierte RNS aus Schritt b) auf einfache Art und Weise von Bestandteilen des extrazellulären Mediums, die sich in ihrer Größe von der RNS unterscheiden, z. B. von sekretierten Proteinen, abtrennen. Die Erfinder haben des weiteren erkannt, daß sich für die Gelfiltration als Trennmedium besonders Se phacryl, ein aus Dextran bestehendes poröses Gel, das mit N,N- Methylenbisacrylamid dreidimensional vernetzt ist, eignet.

Weiter bevorzugt ist es, wenn in dem erfindungsgemäßen Verfah ren in Schritt a) Bakterien in Kultur bereitgestellt werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe: Escherichia coli-Top10F', Escherichia coli-XL1, Escherichia coli-JM105, Escherichia coli- JM109, Bacillus subtilis-DSM2277, Bacillus subtilis-DSM618, Agrobacterium tumefaciens-DSM2277, Agrobacterium tumefaciens- DSM30205, Pseudomonas putida-DSM548 sowie Stämme, die mit den vorstehend genannten Stämmen genetisch identisch sind oder ge netische Varianten davon sind.

Den Erfindern ist es gelungen, für die angegebenen Bakteri enstämme eine RNS-sekretierende Eigenschaft nachzuweisen. Sie eignen sich somit ganz besonders gut für den Einsatz in dem er findungsgemäßen Verfahren.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht darin, daß die Kultivierung der Bakterien in einem Medium erfolgt, das folgende Komponenten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Na₂HPO₄, 4-8; KHPO₄, 1-5; NaCl, 3-7; H₉N₂O₄P, 0,5-7; MgSO₄, 0,3- 0,8; CaCl₂, 0,008-0,012; und eine weitere Komponente, die aus der Gruppe ausgewählt ist: Weizenstärke, Endkonzentration in dem Medium 8-12; Glyzerin, Endkonzentration in dem Medium 0,5- 4; Saccharose, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; Mannitol, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; Maisstärke, Endkonzentra tion in dem Medium 0,5-4; und Glukose, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4.

Die Verwendung solch eines Mediums ist nach Erkenntnis der Er finder ganz besonders geeignet und förderlich für eine erhöhte Sekretion von RNS durch Bakterien in das extrazelluläre Medium. Insofern wird durch die Bereitstellung eines solchen Kulturme diums die Voraussetzung für eine besonders gute Realisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens geschaffen.

Vorzugsweise wird in dem Verfahren zur Kultivierung von Bakte rien andererseits ein Medium verwendet, das folgende Komponen ten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Na₂HPO₄, 4-8; KHPO₄, 1-5; NaCl, 0,3-7; MgSO₄, 0,3-0,8; CaCl₂, 0,008-0,012; Glukose, 0,5-4; und eine weitere Komponente, die aus der Gruppe ausge wählt ist: Hefeextrakt, Endkonzentration in dem Medium 3-7; Glutamat, Endkonzentration in dem Medium 3-7; Maissirup, End konzentration in dem Medium 3-7; und H₉N₂O₄P, Endkonzentration in dem Medium 0,5-3.

Auch durch dieses Medium läßt sich das erfindungsgemäße Verfah ren mit besonders hoher Effizienz realisieren.

Weiter bevorzugt wird in diesem Verfahren zur Kultivierung von Bakterien ein Medium verwendet, das folgende Komponenten, ange geben in Gramm pro Liter, enthält: Pepton, 5-15; Hefeextrakt, 1-10; NaCl, 1-10.

Überraschenderweise eignet sich auch dieses Medium besonders gut für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Besonders bevorzugt ist es, wenn das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet wird.

Wie bereits in der Einleitung dargelegt, besteht ein erhöhter Bedarf an RNS in Form von therapeutisch wirksamen Substanzen bzw. Arzneimitteln. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich, insbesondere im Hinblick auf die Möglichkeit, beliebige Sequenzen konstruieren zu können, die Herstellung von als Arz neimittel wirksamen RNS-Molekülen besonders einfach und effizi ent realisieren.

Eine besondere Ausgestaltung der Erfindung betrifft ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, das vorzugsweise einen nukleinsäuresekretierenden Mikroorganismus enthält.

Dies hat den besonderen Vorteil, daß durch die Bereitstellung von sämtlichen oder von Teilen der erforderlichen Reagenzien bzw. Mikroorganismen eine einfache Durchführung des erfindungs gemäßen Verfahrens, selbst von angelernten Personen, wie dies z. B. in industriellen Laboratorien häufig der Fall ist, ermög licht wird. Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit einer fehler haften Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens minimiert.

Weiter bevorzugt ist es, wenn ein nukleinsäuresekretierender Mikroorganismus zur Gewinnung von RNS gewünschter Sequenz aus extrazellulärem Medium verwendet wird.

Dies hat den besonderen Vorteil, daß es auf diese Art und Weise es erstmals ermöglicht wird, in großen Mengen z. B. für die ein gangs erwähnten Zwecke RNS beliebiger Sequenzen zu gewinnen. Dies ist mit den bisher bekannten Verfahren nicht möglich.

Aufgrund der durch die Erfinder erstmals erkannten und nicht zu erwartenden sekretorischen Eigenschaften eines Bakterienstamms, der ausgewählt ist aus der Gruppe: Escherichia coli-Top10F', Escherichia coli-XL1, Escherichia coli-JM105, Escherichia coli- JM109, Bacillus subtilis-DSM2277, Bacillus subtilis-DSM618, Agrobacterium tumefaciens-DSM5172, Agrobacterium tumefaciens- DSM30205, Pseudomonas putida-DSM548, sowie Stämme, die mit den vorstehend genannten Stämmen genetisch identisch sind oder ge netische Varianten davon sind, ist auch die Verwendung solch eines Bakterienstamms in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von RNS Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren ein Ver fahren zur Identifizierung von nukleinsäuresekretierenden Mik roorganismen, das folgende Schritte umfaßt:

a) Bereitstellung der zu untersuchenden Mikroorganismen in Kultur,
b) Untersuchung des extrazellulären Mediums der Kultur auf das Vorhandensein von Nukleinsäuren.

Durch diese besondere Ausgestaltung läßt sich mittels einer neuen und erfinderischen Verwendung einfacher Methoden, die als solche im Stand der Technik bekannt sind, ein nukleinsäurese kretierender Mikroorganismus besonders effektiv und kostengün stig identifizieren. In diesem Verfahren können neben Bakterien z. B. auch Hefen analysiert werden. Dies ist darauf zurückzufüh ren, daß man Hefen analog zu Bakterien aufgrund ihrer Einzel ligkeit in flüssigen Medien kultivieren kann. Obwohl von den Erfindern RNS-sekretierende Eigenschaften bisher nur für be stimmte Bakterienstämme gezeigt werden konnten, ist es aufgrund ihrer ähnlichen Stoffwechseleigenschaften und der analogen Kul tivierungsbedingungen zu erwarten, diese auch bei Hefen zu fin den.

Eine bevorzugte Weiterbildung dieses Verfahrens besteht darin, daß der Mikroorganismus mit einem für eine Testsequenz kodie renden Expressionsvektor transformiert und die Testsequenz im extrazellulären Medium nachgewiesen wird.

Dies hat den besonderen Vorteil, daß sich eine Testsequenz re lativ einfach im extrazellulären Medium nachweisen läßt, bei spielsweise wenn eine nicht natürlich vorkommende Sequenz ver wendet wird. Für den Nachweis dieser Testsequenz kommen z. B. spezielle Hybridisierungssonden in Frage, die wahlweise mit Markermolekülen gekoppelt sein können. Diese Ausgestaltung er möglicht somit auf besonders einfache und effiziente Weise die Identifizierung eines nukleinsäuresekretierenden Mikroorganis mus.

Es ist weiterhin besonders bevorzugt, wenn das vorstehend ge nannte Verfahren in einem der drei oben genannten Medien durch geführt wird.

Dies hat den besonderen Vorteil, daß hiermit die Voraussetzun gen für eine besonders hohe Nukleinsäureausbeute geschaffen werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls ein Kit zur Durchführung des vorstehend genannten Verfahrens, das vorzugs weise einen für die Testsequenz kodierenden Expressionsvektor enthält.

Der Vorteil dieser Ausgestaltung betrifft ebenfalls eine Ver einfachung der Durchführung des Verfahrens aufgrund der Zusam menstellung der erforderlichen Reagenzien bzw. Mikroorganismen oder Teilen davon.

Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen erläutert, aus denen sich weitere Merkmale und Vorteile ergeben.

Fünf beigefügte Abbildungen sollen der Beschreibung der Erfin dung dienen. Es zeigen:

Fig. 1 Ethidiumbromidfärbung von sekretierter RNS "natürlichen Ursprungs" nach elektrophoretischer Auftrennung im Agarosegel; beispielhaft für Bacillus subtilis-DSM2277 in LB-Medium;

Fig. 2a Elutionsprofile von sekretierter RNS "natürlichen Ursprungs" und Proteinen bei der zur RNS- Aufreinigung verwendeten Sephacryl 200-Säule;

Fig. 2b Ethidiumbromidfärbung von sekretierter RNS "natürlichen Ursprungs" der Fraktionen 1 bis 8 aus der in Fig. 2a dargestellten Gelfiltration, nach elektrophoretischer Auftrennung im Agarosegel;

Fig. 2c Ethidiumbromidfärbung von sekretierter RNS "natürlichen Ursprungs" und sequenzspezifischer RNS nach Aufreinigung über eine Sephacryl 1000-Säule, nach elektrophoretischer Auftrennung; beispielhaft für transformierte Escherichia coli-Top10F'; und

Fig. 3 Ethidiumbromidfärbung von PCR-Produkten sequenzspe zifischer RNS nach elektrophoretischer Auftrennung im Agarosegel; beispielhaft für PCR-Produkte darge stellt, die die Testsequenzen aus Beispiel 3 aufwei sen.

Beispiel 1 Geeignete Bakterienstämme

Der Bakterienstamm E. coli-Top10F' kann bei Clontech (USA) und der Stamm E. coli-XL1 bei Stratagene (USA) bezogen werden. Die Bakterienstämme E. coli-JM105 (DSM3949), E. coli-JM109 (DSM3423), B. subtilis-DSM2277, B. subtilis-DSM618, A. tume faciens-DSM5172, A. tumefaciens-DSM30205 und P. putida-DSM548 können von der DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Braunschweig bezogen werden.

Die Erfinder konnten zeigen, daß sich diese Stämme besonders für die Herstellung von RNS eignen.

Beispiel 2 Geeignete Kulturmedien

Die Bakterien werden in einem der in der Tabelle I nachstehend angezeigten Kulturmedien LB und M0 bis M11 inkubiert.

Tabelle I

Geeignete Kulturmedien

Alle Medien werden bei 120°C, 2 bar für 30 Minuten sterili siert.

Beispiel 3 Expressionsvektoren für die Herstellung von sequenzspezifischer RNS

Zur Herstellung der sequenzspezifischen RNS werden als Expres sionsvektoren pT-Adv-Plasmide (Clontech) mit gemäß Herstel leranweisung einkloniertem Insert verwendet, das z. B. als Ma trize für eine Testsequenz dienen kann. Die sequenzspezifischen Inserts werden hierzu mittels Polymerasekettenreaktionen (PCR) nach Standardmethoden erstellt, mit Ethanol gefällt und in TE- Puffer (20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8) resuspendiert. Beispiel haft sind für drei von den Erfindern verwendete Inserts oder Testsequenzen die Basenabfolgen aufgeführt:

Sequenz 1

Sequenz 2

Sequenz 3

Die Ligation der PCR-Produkte mit dem pT-Adv-Plasmid, erfolgt nach Herstellungsanweisung (Clontech) über Nacht bei 10°C in Ligationspuffer (6 mM Tris-HCl pH 7,5; 6 mM MgCl₂; 5 mM NaCl; 0,1 mg/l BSA; 7 mM β-Mercaptoethanol; 0,1 mM ATP; 2 mM Di thiothreitol; 1 mM Spermidin) mit 1 U DNA-Ligase (MBI Fermentas) in 10 µl Endvolumen.

Beispiel 4 Transformation der sekretorischen Bakterien mit den Expressionsvektoren

Kompetente Zellen der sekretorischen Bakterien werden gemäß folgendem Protokoll transformiert: Die Zellen werden mit dem Plasmid bzw. Ligationsprodukt während 30 Minuten auf Eis inku biert. Anschließend wird β-Mercaptoethanol zu den Zellen gemäß Herstellerprotokoll hinzugefügt, gefolgt von einem Hitzeschock bei 42°C für 30 Sekunden. Der Ansatz wird direkt anschließend auf Eis für 2 Minuten inkubiert. 60 µl des Ansatzes werden dar aufhin 250 µl SOC-Medium (Clontech) hinzugegeben und die Zellen werden bei 200 rpm und 37°C als Schüttelkultur für 1 Stunde inkubiert. Anschließend werden die Zellen auf LB-Agarplatten mit 100 µg/ml Ampicillin ausplattiert und bei 37°C über Nacht kultiviert.

Von den gewachsenen Kolonien werden Bakterienkulturen angelegt und zur Kontrolle werden mittels Qiagen Mini-Prep-Kit die Plas mide mit Inserts nach Herstellerangaben präpariert. Die Inserts werden mit einem PE Applied Biosystems Kit nach Herstelleranga ben (Perkin Elmer) einer Sequenzierungsreaktion unterzogen. Die Analyse der Sequenzen wird auf einem 377 DNA-Sequenzer (Perkin Elmer) durchgeführt. Auf diese Art wird überprüft, ob das einklonierte Insert die gewünschte Sequenz aufweist.

Beispiel 5 Kultivierungsbedingungen

Die Kultivierung der sekretorischen Bakterien wird durch Inoku lation der Stämme in 3 ml Medium in 15 ml-Glasröhrchen, ver schlossen mit Aluminiumdeckeln, vorgenommen. Die Kulturröhrchen werden als Schüttelkulturen bei 37°C und 200 rpm für 120 Stun den inkubiert.

Beispiel 6 Quantifizierung der sekretierten RNS

Nach 120 Stunden der Kultivierung erfolgt die Bestimmung der RNS-Menge im Kulturüberstand. Dazu werden aus der Kultur Proben entnommen und mit 14.000 g für 2 Minuten bei 4°C zentrifu giert. 20 µl des Überstandes werden anschließend auf ein 1%iges Agargel mit Ethidiumbromid geladen und bei 120 Volt für 20 Mi nuten in TAE-Puffer aufgetrennt. Die Gelbanden werden unter UV- Licht visualisiert.

Parallel dazu erfolgt eine RNS-Quantifizierung mittels Ribo green-Farbstoff (Molecular Probes). Hierzu werden 10 µl jeder Probe mit 10 µl 100-fach verdünntem Ribogreen-Farbstoff ver mischt und mit H₂O_bidest auf ein Endvolumen von 200 µl aufge füllt. Die Fluoreszenz wird anschließend mit einem FluoStar Fluorimeter (BMG) unter einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 538 nm bestimmt. Die Kali brierung wird mit einer Standard-RNS aus dem cDNS-Cycle Kit (Invitrogen) durchgeführt.

Beispiel 7 Auf die Sekretion von RNS "natürlichen Ur sprungs" untersuchte Bakterienstämme

Tabelle II

Qualitativer Nachweis der Sekretion von RNS "natürlichen Ursprungs" bei verschiedenen Bak terienstämmen in LB-Medium

Die Erfinder konnten somit für sämtliche der untersuchten Bak terienstämme, mit Ausnahme der beiden E. coli-Varianten JM101 (DSM3948) und DH5α (DSM6897), RNS-sekretorische Eigenschaften, gemessen nach Kultivierung im LB-Medium, nachweisen.

Beispiel 8 RNS-Sekretion in verschiedenen Kulturmedien

Für die verschiedenen Bakterienstämme, für die die Erfinder zeigen konnten, daß sie zur Sekretion von RNS "natürlichen Ur sprungs" in das extrazelluläre Medium fähig sind, wurde die Ab hängigkeit der Sekretion von den verwendeten Kulturmedien un tersucht. Beispielhaft ist die in das extrazelluläre Medium se kretierte Menge von RNS "natürlichen Ursprungs" von Bacillus subtilis-DSM2277 in verschiedenen Kulturmedien (siehe Beispiel 2) dargestellt.

Tabelle III

Sekretion von RNS "natürlichen Ursprungs" von Bacillus subtilis-DSM2277 in Abhängigkeit des verwendeten Kulturmediums

Exemplarisch ist das Ergebnis der Ethidiumbromidanfärbung der RNS "natürlichen Ursprungs" im extrazellulären Medium nach gel elektrophoretischer Auftrennung in 1%iger Agarose in der Fig. 1 dargestellt. In den einzelnen Spuren wurde aufgetragen: Marker (1); 1 µl (2); 2 µl (3); 4 µl (4); 8 µl (5); 16 µl (6); 32 µl Kulturüberstand (7).

Parallel wurde in einem weiteren Ansatz in vier verschiedenen Medien der Einfluß von den Medien zugegebenen Salzen auf die Sekretion von RNS "natürlichen Ursprungs" untersucht.

Tabelle IV

Einfluß von den Medien zugesetzten Salzen auf die Sekretion von RNS "natürlichen Ursprungs" von Bacillus subtilis-DSM2277

Es zeigt sich also eine deutliche Abhängigkeit der RNS- Sekretion von dem verwendeten Medium. Für Bacillus subtilis- DSM2277 läßt sich demnach bei Verwendung des Mediums M6 eine besonders hohe Ausbeute an sekretierter RNS "natürlichen Ur sprungs" erzielen (siehe Tabelle III).

Die Erfinder konnten anhand dieser Daten am Beispiel von Bacil lus subtilis-DSM2277 eine auffällige Abhängigkeit der RNS- Sekretion von den zugesetzten Salzen erkennen. Demnach bewirkt insbesondere die Zugabe von Eisensulfat eine verstärkte Sekre tion von RNS in das extrazelluläre Medium (siehe Tabelle IV).

Beispiel 9 Aufreinigung und Analyse der sekretierten RNS

Im Fall einer sequenzspezifischen Herstellung von RNS aber auch solcher "natürlichen Ursprungs" ist es wichtig, daß nach aus reichender Kultivierung der Bakterien die sekretierte RNS wei tergehend aufgereinigt und analysiert wird. Dies kann über ver schiedene Verfahren erfolgen.

a) RNS-Reinigung

Nach der Kultivierung der natürlichen bzw. transformierten Bakterien für 120 Stunden bei 37°C und 200 rpm wird die extrazelluläre RNS durch Gelfiltration mit einer 10 ml Se phacryl 200-Säule bei natürlichen Bakterien bzw. Sephacryl 1000-Säule (beide Pharmacia) bei transformierten Bakterien gereinigt: Nach Entfernung der Zellen durch Zentrifugation bei 13.000 g für 5 Minuten bei 4°C wird 1 ml des Kultu rüberstandes auf die vorher mit TE-Puffer äquillibrierte Sephacryl-Säule gegeben. Die Säule wird mit einer Flußrate von 1 ml/min gefahren und es werden Fraktionen von 1 ml gesammelt. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe können durch die Gelfiltration sequenzspezifische RNS, RNS "natürlichen Ursprungs", die nach Erkenntnissen der Erfin der üblicherweise aus langkettigen Nukleinsäuremolekülen besteht, als auch extrazelluläres Protein und andere Be standteile voneinander getrennt werden. In den aufgetrenn ten Fraktionen werden RNS-, Protein-(BCA-Test) und Salzge halt (Leitfähigkeitsmessung) bestimmt. Die in den Fraktio nen enthaltene RNS wird dann anhand ihrer unterschiedli chen Größe mittels Agarosegelelektrophorese identifiziert.

In der Fig. 2a ist das Elutionsprofil einer Sephacryl 200- Säule dargestellt, auf die der Kulturüberstand eines RNS- sekretierenden Bakteriums aufgetragen wird. Hierbei wird deutlich, daß die sekretierte RNS "natürlichen Ursprungs" in den Fraktionen 2, 3 und 4 eluiert wird, während das Protein verzögert, bei einem Elutionsmaximum in der Frak tion 6, eluiert wird. Die eluierten Proteinmengen lassen sich anhand der linken y-Achse, die eluierten RNS-Mengen anhand der rechten y-Achse bestimmen. Aufgrund dieser deutlich verschiedenen Elutionsmaxima läßt sich durch die Gelfiltration ein besonders guter Reinigungseffekt erzie len.

In der Fig. 2b ist die Auftrennung der Fraktionen 1 bis 8 der in der Abbildung Fig. 2a dargestellten Fraktionen in einer 1%igen Agarosegelelektrophorese durch anschließende Ethidiumbromidanfärbung dargestellt. Hierbei wurden je weils 20 µl aufgetragen. Die RNS "natürlichen Ursprungs" findet sich nur in den Fraktionen 2, 3 und 4, was auf den konzentrierten Elutionspeak der RNS zurückzuführen ist.

In der Fig. 2c ist exemplarisch das Ergebnis einer Ethidi umbromidfärbung der gelelektrophoretischen Auftrennung von Fraktionen in 1%iger Agarose gezeigt, die aus dem extra zellulären Kultivierungsmedium transformierter E. coli- Top10F'-Bakterien durch eine Sephacryl 1000-Gelfiltration aufgereinigt wurden. Hierbei wurden jeweils 20 µl der ent sprechenden Fraktionen 7 (Spur 1), 10 (Spur 2), 12 (Spur 3), 13 (Spur 4) aufgetragen. Es zeigt sich, daß RNS "natürlichen Ursprungs" (A) gegenüber sequenzspezifischer RNS mit einer der Testsequenzen aus Beispiel 3 (B) deutlich verzögert durch das Agarosegel wandert, wodurch die einfache Trennung der beiden RNS-Spezies möglich wird.

Das quantitative Ergebnis einer Gelfiltration auf Se phacryl 200 ist nachstehend exemplarisch an einem Beispiel dargestellt:

Es zeigt sich, daß durch Gelfiltration des extrazellulären Mediums 94% der Proteine sowie 92% des Salzes entfernt werden können. Dabei gehen lediglich geringfügige Mengen der RNS verloren. D. h. die sekretierte RNS kann mit rela tiv einfachen konventionellen Methoden gereinigt bzw. prä pariert werden, was die Ausweitung des Verfahrens auf großmaßstabliche Verhältnisse möglich macht.

b) Identifizierung der sekretierten sequenzspezifischen RNS durch RT-PCR und Agarosegelelektrophorese

Die Sequenz der sekretierten sequenzspezifischen RNS wird nach der Gelfiltration und/oder Ethanolfällung bzw. Phe nol/Chlorophorm-Extraktion durch RT-PCR identifiziert. Hierzu wird die RNS zunächst auf 65°C für 10 Minuten erhitzt, mit Random-Primern nach Herstellervorschrift (cDNA Cycle™ Kit, Invitrogen) und bei 25°C für 15 min inku biert. Nach Zugabe der Retrotranskriptase, den Nukleotiden und des Puffers wird die cDNS-Synthese bei 42°C für eine Stunde durchgeführt. Nachfolgend wird eine PCR mit dem Standard-Primer M13-Primer und M13-reverse Primer und der neusynthetisierten cDNS durchgeführt (PCR-Bedingungen: 94 C für 20 sec, (94°C für 20 sec, 50°C für 1 min. 72°C für 1 min 30 sec) × 35 Zyklen, 72°C für 10 min). Die PCR- Produkte werden parallel anhand ihrer Größe über eine 1%ige Agarosegelektrophorese überprüft.

Durch die RT-PCR und die Größenabschätzung der sekretier ten RNS über die Agarosegelektrophorese lassen sich die sequenzzpezifischen RNS-Moleküle eindeutig charakterisie ren und identifizieren.

In der Fig. 3 ist die Auftrennung von drei PCR-Produkten in einer 1%igen Agarosegelektrophorese dargestellt, die die Testsequenzen aus dem Beispiel 3 (1: Sequenz 1, 2: Se quenz 2, 3: Sequenz 3, M: Marker) aufweisen. Die seitlich angebrachten Pfeile markieren die Laufhöhe von 1,6 und 1 Kilobasen großen Nukleinsäuremolekülen.

c) Identifizierung der sekretierten RNS "natürlichen Ur sprungs" durch Sequenzierung

Die sekretierte RNS "natürlichen Ursprungs" wird nach der Gelfiltration und/oder Ethanolfällung bzw. Phe nol/Chlorophorm-Extraktion durch Sequenzierung identifi ziert. Hierzu wird die RNS zunächst auf 65°C für 10 Minuten erhitzt, mit Random-Primern nach Herstellervorschrift (cDNA Cycle™ Kit, Invitrogen) und bei 25°C für 15 Minu ten inkubiert. Nach Zugabe der Retrotanskriptase, der Nu kleotide und des Puffers wird die cDNS-Synthese bei 42°C für ein Stunde durchgeführt. Nachfolgend wird eine Rapid- Amplifikation von cDNS-Enden durchgeführt: Nach Ligation über Nacht eines 5'-phosphorylierten Ankers an die cDNS mit RNS-Ligase wird eine Verlängerung unter Verwendung des zum Anker komplementären Primers vorgenommen. An diese Re aktion schließt sich eine zweite Ligation mit einem 5'- phosphorylierten Anker an. Diese cDNS wird als Template für eine PCR benutzt, mit dem komplementären Anker als Primer [PCR-Bedingungen: 94°C für 20 sec, (94°C für 20 sec, 50°C für 1 min. 72°C für 1 min 30 sec) × 35 Zyklen, 72°C für 10 min]. Diese PCR-Produkte werden in einen pAdvantage™-Plasmid mit dem Advantage™ PCR Cloning Kit kloniert. Nach Ethanolfällung bzw. Phenol/Chlorophorm- Extraktion werden die PCR-Produkte über Nacht mit dem Plasmid nach Herstellervorschrift ligiert. Top10F'- Bakterien werden mit dem Ligationsprodukt nach Hersteller vorschrift transformiert. Plasmide mit Inserts werden aus transformierten Übernacht-Bakterien-Kulturen mit einem Qiagen®-Miniprep Kit präpariert. 200-500 ng Plasmid werden in die anschliessende Sequenzierungsreaktion mit Standardprimern unter Verwendung eines PE Applied Biosy stems Kit nach Herstellervorschrift eingesetzt. Die Se quenzen werden mit einem ABI PE 377 DNA Sequenzer gelesen.

Die Erfinder konnten für RNS "natürlichen Ursprungs", die von B. subtilis sekretiert wird, in einem 112 bp langen Abschnitt Sequenzhomologien zur Gensequenz des ribosomalen Proteins L24 von B. subtilis feststellen. Die Gesamtlänge dieser untersuchten sekretierten RNS "natürlichen Ur sprungs" beträgt 12-15 kb. Erste Hinweise liegen vor, wo nach es sich bei dem sequenzierten Abschnitt um einen Teil einer polycistronischen mRNA handeln könnte, die von dem bakteriellen Operon S10-spc-α transkribiert wird.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Ribonukleinsäure (RNS) ge wünschter Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:

a) Bereitstellung von Mikroorganismen, vorzugsweise von Bakterien, in Kultur, die zur Sekretion von RNS in das extrazelluläre Medium fähig sind,
b) Isolierung und/oder Anreicherung der von den Mikro organismen in das extrazelluläre Medium sekretierten RNS.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen, vorzugsweise Bakterien, einen Expressi onsvektor enthalten, der für die gewünschte Sequenz ko diert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an den Schritt b) aus der RNS die Fraktion isoliert wird, die die gewünschte Sequenz aufweist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge kennzeichnet, daß Schritt b) eine Gelfiltration, vorzugs weise mittels Sephacryl, umfaßt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß in dem Schritt a) Bakterien in Kultur bereitgestellt werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe: Escherichia coli-Top10F', Escherichia coli-XL1, Escheri chia coli-JM105, Escherichia coli-JM109, Bacil lus subtilis-DSM2277, Bacillus subtilis-DSM618, Agrobacte rium tumefaciens-DSM5172, Agrobacterium tumefaciens- DSM30205, Pseudomonas putida-DSM548, sowie Stämme, die mit den vorstehend genannten Stämmen genetisch identisch sind oder genetische Varianten davon sind.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge kennzeichnet, daß die Kultivierung von Bakterien in einem Medium erfolgt, das folgende Komponenten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Na₂HPO₄, 4-8; KHPO₄, 1-5; NaCl, 3-7; H₉N₂O₄P, 0,5-7; MgSO₄, 0,3-0,8; CaCl₂, 0,008-0,012; und eine weitere Komponente, die aus der Gruppe ausgewählt ist: Weizenstärke, Endkonzentration in dem Medium 8-12; Glyzerin, Endkonzentration in dem. Medium 0,5-4; Saccharo se, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; Mannitol, End konzentration in dem Medium 0,5-4; Maisstärke, Endkonzen tration in dem Medium 0,5-4; und Glukose, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge kennzeichnet, daß die Kultivierung von Bakterien in einem Medium erfolgt, das folgende Komponenten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Na₂HPO₄, 4-8; KHPO₄, 1-5; NaCl, 0,3-7; MgSO₄, 0,3-0,8; CaCl₂, 0,008-0,012; Glukose, 0,5-4; und eine weitere Komponente, die aus der Gruppe ausgewählt ist: Hefeextrakt, Endkonzentration in dem Medium 3-7; Glutamat, Endkonzentration in dem Medium 3-7; Maissirup, Endkonzentration in dem Medium 3-7; und H₉N₂O₄P, Endkonzen tration in dem Medium 0,5-3.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge kennzeichnet, daß die Kultivierung von Bakterien in einem Medium erfolgt, das folgende Komponeten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Pepton, 5-15; Hefeextrakt, 1-10; NaCl 1-10.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Arzneimittels.

10. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprü che 1 bis 9.

11. Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es einen nukleinsäuresekretierenden Mikroorganismus enthält.

12. Verwendung eines nukleinsäuresekretierenden Mikroorganis mus zur Gewinnung von RNS gewünschter Sequenz aus extra zellulärem Medium.

13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Bakterienstamm ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe: Escherichia coli-Top10F', Escheri chia coli-XL1, Escherichia coli-JM105, Escherichia coli- JM109, Bacillus subtilis-DSM2277, Bacillus subtilis- DSM618, Agrobacterium tumefaciens-DSM5172, Agrobacteri um tumefaciens-DSM30205, Pseudomonas putida-DSM548, sowie Stämme, die mit den vorstehend genannten Stämmen genetisch identisch sind oder genetische Varianten davon sind.

14. Verfahren zur Identifizierung von nukleinsäuresekretieren den Mikroorganismen, das folgende Schritte umfaßt:

a) Bereitstellung der zu untersuchenden Mikroorganismen in Kultur,
b) Untersuchung des extrazelluären Mediums der Kultur auf das Vorhandensein von Nukleinsäuren.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus mit einem für eine Testsequenz kodie renden Expressionsvektor transformiert und die Testsequenz im extrazellulären Medium nachgewiesen wird.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeich net, daß die Kultivierung von Bakterien in einem Medium erfolgt, das folgende Komponenten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Na₂HPO₄, 4-8; KHPO₄, 1-5; NaCl, 3-7; H₉N₂O₄P, 0,5-7; MgSO₄, 0,3-0,8; CaCl₂, 0,008-0,012; und eine weitere Komponente, die aus der Gruppe ausgewählt ist: Weizenstärke, Endkonzentration in dem Medium 8-12; Glyze rin, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; Saccharose, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; Mannitol, Endkonzen tration in dem Medium 0,5-4; Maisstärke, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; und Glukose, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4.

17. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeich net, daß die Kultivierung von Bakterien in einem Medium erfolgt, das folgende Komponenten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Na₂HPO₄, 4-8; KHPO₄, 1-5; NaCl, 0,3-7; MgSO₄, 0,3-0,8; CaCl₂, 0,008-0,012; Glukose, 0,5-4; und eine weitere Komponente, die aus der Gruppe ausgewählt ist: Hefeextrakt, Endkonzentration in dem Medium 3-7; Glutamat, Endkonzentration in dem Medium 3-7; Maissirup, Endkonzentration in dem Medium 3-7; und H₉N₂O₄P, Endkonzen tration in dem Medium 0,5-3.

18. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeich net, daß die Kultivierung von Bakterien in einem Medium erfolgt, das folgende Komponenten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Pepton, 5-15; Hefeextrakt, 1-10; NaCl, 1-10.

19. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprü che 14 bis 18, mit einem für die Testsequenz kodierenden Expressionsvektor.