DE60108102T2

DE60108102T2 - E. coli extrakt zur synthese von proteinen

Info

Publication number: DE60108102T2
Application number: DE60108102T
Authority: DE
Inventors: Yuping Ambuel; R. Thomas VAN OOSBREE; R. Mark McCORMICK; M. Robert MIERENDORF
Original assignee: EMD Biosciences Inc
Current assignee: EMD Chemicals Inc
Priority date: 2000-05-03
Filing date: 2001-05-03
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2021-05-04
Also published as: EP1278883A2; US20020034559A1; US7008651B2; EP1278883B1; CA2400755A1; ATE286140T1; DE60108102D1; AU2001259487A1; WO2001083805A3; WO2001083805A2

Description

Verweis auf verwandte Anmeldungen
Die Anmeldung geht auf die US-Provisional Application No. 60/201,450 vom 3. Mai 2000 zurück.
Hintergrund der Erfindung
Die Techniken der modernen Biotechnologie haben die Identifizierung der genetischen Elemente oder Gene, die die Eigenschaften von lebenden Organismen steuern, ermöglicht. Das Prinzip, nach dem die meisten Gene in Organismen Wirkungen erzeugen, besteht darin, dass sie die Konstruktion von Proteinen kodieren. Somit ist es bei der Untersuchung von Genen häufig erstrebenswert, aus der für das Protein kodierenden DNA des Gens ein Protein zu erzeugen, um zu untersuchen, worum es sich bei dem Protein handelt oder welche Funktionen das Protein ausübt, oder um einige geeignete Reaktionen mit dem Protein durchzuführen. Gelegentlich wird ein Protein exprimiert, indem man das gesamte Gen oder ein künstliches Konstrukt, das die Protein-Kodierungssequenz in einem Expressionsvektor trägt, in eine geeignete Wirtszelle inseriert, so dass die Wirtszellen unter Erzeugung des Proteins gezüchtet werden können. Eine weitere Technik besteht in der in vitro-Erzeugung des Proteins direkt aus einem Gen oder einem künstlichen genetischen Konstrukt in einem zellfreien Protein-Syntheseverfahren. In vitro-Techniken für die Proteinsynthese haben den Vorteil, dass das Protein direkt aus der kodierenden DNA erzeugt werden kann, ohne dass eine zwischengeschaltete Kultur und eine Vermehrung von transformierten Zellen erforderlich ist. Die in vitro-Proteinsynthese bietet den weiteren Vorteil, dass sie die Erzeugung von Proteinen ermöglicht, deren Expression in lebenden Zellen typischerweise schwierig oder unmöglich ist, z. B. von Toxinen oder Proteinen, die Aminosäuren enthalten, die normalerweise in lebenden Zellen nicht auftreten.
Verfahren zur in vitro-Transkription und -Translation von DNA zur Erzeugung von Protein sind seit vielen Jahren bekannt. Die frühesten dokumentierten Beschreibungen einer in vitro-Proteinsynthese wurden in prokaryontischen Systemen entwickelt, die sich bakterieller transkriptionaler und translationaler Komponenten bedienen, um Proteine in einer gekuppelten Reaktion zu erzeugen. Ein übliches prokaryontisches System, das als ein zellfreier E. coli S-30-Extrakt bekannt ist, wurde erstmals in systematischer Weise von Zubay (Annual Review of Genetics, Bd., 7 (1973), S. 267–287) beschrieben. Andere Autoren haben Artikel und Übersichtsartikel darüber verfasst, wie derartige S-30-Extrakte besser herzustellen und anzuwenden sind; vergl. W. Kudlicky et al., Anal. Biochem., Bd. 206(2) (1992), S. 389–393. Ferner wurden Kits zur in vitro-Erzeugung von Proteinen aus DNA gewerblich eingeführt, die auf der Verwendung von S-30-Extrakten beruhen. Derartige Kits werden von mehreren Herstellern vertrieben. Kürzlich wurden Systeme zur Transkription und Translation unter Verwendung von eukaryontischen, zellfreien Extrakten beschrieben, insbesondere von solchen, die auf der Verwendung von Kaninchen-Reticulozytenlysat oder Weizenkeimextrakt beruhen. Die US-Patente 5 324 637 und 5 895 753 beschreiben Systeme zur in vitro-Transkription und -Translation von Protein.
Sowohl prokaryontische als auch eukaryontische, zellfreie Extrakte zur Transkription und Translation werden derzeit gewerblich vertrieben. Im allgemeinen möchte ein Forscher, der sich eines in vitro-Transkriptions- und Translationssystems bedient, das Verfahren so durchführen, dass eine optimale Menge an Zielprotein von voller Länge gebildet wird und die Menge an gebildetem Nicht-Zielprotein und/oder Protein von nicht vollständiger Länge auf ein Minimum beschränkt wird. Während prokaryontische Systeme von Natur aus einfacher anzuwenden sind, gelten eukaryontische Systeme für einige Anwendungsmöglichkeiten als überlegen. Insbesondere sind E. coli S-30-Extrakte bezüglich der Herstellung und Verwendung zweckmäßig, neigen jedoch dazu, dass ein größerer prozentualer Anteil an Protein von nicht vollständiger Länge gebildet wird, verglichen mit eukaryontischen Extrakten. Die Herstellung von unerwünschten Protein- oder Polypeptidprodukten wird im allgemeinen durch das Vorliegen einer Vielzahl von Proteinen beobachtet, die eine vom Zielprotein von voller Länge abweichende Größe aufweisen, wenn die Reaktionsprodukte durch Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden. Es wird angenommen, dass die nicht die volle Länge aufweisenden Proteine aus mehreren Quellen entstehen, die in zwei Hauptkategorien fallen.
Zunächst wird eine bestimmte Menge von Hintergrund-Nichtzielproteinen in S-30-Systemen aufgrund einer Transkription von anderen, im Extrakt vorhandenen E. coli-Promotoren erzeugt, entweder von restlicher genomischer E. coli-DNA, die im Extrakt verblieben ist, oder von anderen Promotoren auf Plasmiden oder anderen Vektoren, die das Zielgen tragen. Beispielsweise tragen die meisten Plasmide ein Gen, das für ein Protein, wie R-Lactamase kodiert, das Resistenz gegenüber einem selektiven Arzneistoff, wie Ampicillin, verleiht, zusätzlich zum Zielgen. Wenn ein derartiges Plasmid als Matrize für die in vitro-Proteinsynthese in einem E. coli S-30-Extrakt verwendet wird, werden sowohl das Zielgen als auch das Gen für die Arzneistoffresistenz durch die RNA-Polymerase transkribiert, so dass aus beiden Genen Protein erzeugt wird. Eine untergeordnete Menge an Nichtziel-Hintergrund kann sich auch von einer nicht-spezifischen Initiation der Transkription von E. coli-RNA-Polymerase an Nichtpromotorstellen an DNA, die im Extrakt vorhanden ist, ableiten. Diese Erscheinung tritt bekanntlich unter bestimmten Bedingungen auf, wobei es aber unwahrscheinlich ist, dass sie unter den typischen Reaktionsbedingungen für die in vitro-Proteinsynthese signifikant ist. Ein Hintergrund kann sich auch von der Translation von restlicher E. coli-mRNA, die im Extrakt vorhanden ist, ableiten. Einige der Strategien, die dazu herangezogen werden, den Beitrag von endogener DNA und mRNA zum Nichtziel-Hintergrund auf ein Minimum zu beschränken, umfassen eine Vorinkubationsstufe, um eine Beseitigung von Ribosomen, die an der Translation von endogener mRNA beteiligt sind, zu ermöglichen und eine Behandlung mit Ca²⁺-abhängiger Nuclease, um bevorzugt endogene DNA und mRNA abzubauen. Es ist jedoch nicht allgemein möglich, mit diesen Stufen die nicht-gezielte Synthese zu beseitigen oder zu entfernen, da etwas DNA und mRNA typischerweise nach der Behandlung zurückbleibt und eine längere Inkubation oder eine Überbehandlung mit Nuclease zu einem inakzeptabel niederen Grad der Aktivität der Proteinsynthese führt, vermutlich aufgrund einer Schädigung von anderen RNA-Spezies, einschließlich rRNA und tRNA, die an der Proteinsynthese teilnehmen. Ein anderer Weg wurde eingeschlagen, um auf eine exklusive Synthese von Zielproteinen abzustellen, indem man T7-RNA-Polymerase für die Transkription in E. coli-Extrakten in Gegenwart von Rifampicin zur Hemmung von E. coli-RNA-Polymerase verwendet (Nevins und Pratt, FEBS Lett., Bd. 291 (1991), S. 259–263).
Die zweite Hauptkategorie für den Hintergrund in E. coli-Extrakten ergibt sich aus der Erzeugung von kleineren, geschnittenen Formen des Zielproteins. Diese Formen entstehen aufgrund einer oder mehrerer Ursachen, wozu folgende Ursachen gehören: (1) Initiation der Proteinsynthese an internen AUG-Startcodons, die vom authentischen N-terminalen AUG-Codon abweichen, (2) Synthese von unvollständigen Polypeptidketten aufgrund einer vorzeitigen Termination der Translation, (3) Abbau von Matrizen-DNA- und/oder RNA-Transkripten durch im Extrakt vorhandene Nucleasen und (4) Abbau des Zielproteins durch im Extrakt vorhandene Proteasen. Den Abbau von linearen DNA-Matrizen erreicht man durch Verwendung von Extrakten, die aus Stämmen mit einem Mangel an einem oder mehreren Enzymen des RecBCD-Komplexes abgeleitet sind (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77 (1980), S. 7029–7033). Stämme mit einem Mangel an ompT- und Ion-Proteasen wurden auch zur Beschränkung des proteolytischen Abbaus auf ein Minimum verwendet (Kohrer et al., Eur. J. Biochem., Bd. 236 (1996), S. 234–239). Während diese Beispiele offensichtlich eine gewisse Abmilderung der Abbauaktivität erreichen, gibt es zahlreiche weitere Aktivitäten in Zellen, die man nicht beseitigen konnte, da sie für die zelluläre Lebensfähigkeit essentiell waren. Ferner gibt es derzeit kein aus dem Stand der Technik bekanntes Verfahren, das sich allgemein mit der internen Initiation oder vorzeitigen Termination befasst, Vorgänge, von denen man annimmt, dass sie für einen Hintergrund von nicht vollständiger Länge von erheblicher Bedeutung sind. Man kann sich vorstellen, dass die Verwendung bestimmter Stämme, die einen Mangel an einer oder mehreren der hauptsächlichen Ribonuclease-Aktivitäten, die in E. coli vorliegen, aufweisen, Extrakte liefern kann, die in stärkerem Umfang die Synthese von Proteinen voller Länge gewährleisten, wobei es aber keine Berichte über eine erfolgreiche Anwendung dieses Weges gibt. Die verschiedenen RNA-Abbauwege in E. coli und die Wechselwirkungen von Enzymen und anderen Proteinen, die daran beteiligt sind, bedürfen noch der in vivo- und in vitro-Aufklärung.
Einen wichtigen Beitrag zum Abbau von RNA-Transkripten in Zellen liefert offensichtlich das RNA-Degradosom, ein Multiproteinkomplex, der beim RNA-Turnover und -Stoffwechsel beteiligt ist. Das Degradosom ist um das Enzym RNase E organisiert, das Bindungsstellen für andere Schlüsselproteinkomponenten des Komplexes enthält; vergl. z. B. Lopez et al., Mol. Micro., Bd. 33(1) (1999), S. 189–199, und Vanzo et al., Genes & Develop., Bd. 12 (1988), S. 2770–2781. Ob und welche Rolle das RNA-Degradosom oder RNase E in E. coli-Transkriptions- und Translationsextrakten spielt, ist bisher unbekannt.
Das zellfreie S-30-System, das von Zubay konzipiert und von anderen Autoren modifiziert wurde, beinhaltet traditionell die Herstellung eines Extrakts und eines ergänzenden Gemisches. Das Extrakt enthält sämtliche Enzyme und Faktoren aus E. coli, die für die Transkription und Translation erforderlich sind. Das ergänzende Gemisch enthält Nucleotidtriphosphate, tRNA, Aminosäuren und ein Energie-Regenerationssystem und zusätzlich bestimmte Kofaktoren und Salze und Ionen. Die Herstellung und Verwendung derartiger Extrakte und ergänzender Gemische ist seit mehr als 30 Jahren belegt. Seit einiger Zeit werden von gewerblichen Firmen entsprechende Kits vertrieben. Während derartige Extrakte herkömmlicherweise unter Verwendung von E. coli hergestellt werden, gibt es keine technischen Gründe dafür, warum derartige Extrakte nicht aus einer beliebigen Anzahl von möglichen prokaryontischen Wirten herstellbar wären.
Ein typischer S-30-Extrakt wird hergestellt, indem man zunächst die E. coli-Zellen züchtet und erntet. Die E. coli-Zellen werden sodann mit einer French-Druckzelle oder einer anderen Zellaufbrechvorrichtung lysiert oder gebrochen. Das erhaltene Lysat wird sodann zur Entfernung der Zellbruchstücke und anderer fester Bestandteile zentrifugiert. Der Überstand wird für die weitere Verarbeitung gewonnen. Sodann wird der Überstand mit einem Vorinkubationspuffer vereinigt und inkubiert. Gelegentlich wird eine Behandlungsstufe mit einer Mikrokokken-Nuclease vorgenommen, um verunreinigende DNA und mRNA aus den ursprünglichen Wirtszellen zu beseitigen. Der Extrakt wird sodann dialysiert und in eingefrorenem Zustand bis zum Verwendungszeitpunkt gelagert.
Das typische Ergänzungsgemisch, das einer S-30-gekuppelten Transkriptions- und Translationsreaktion zugesetzt wird, enthält Puffer, wie Tris-acetat, Dithiothreit (DTT), die NTPs (ATP, CTP, GTP und UTP), Phosphoenolpyruvat, Pyruvat-kinase, Aminosäuren (typischerweise 10 der 20 natürlich auftretenden Aminosäuren, wobei eine weggelassen wird, um die Zugabe einer radioaktiv markierten Aminosäure oder eines Analogen zu ermöglichen), Polyethyleneglykol (PEG), Folinsäure, cAMP, tRNA, Ammoniumacetat, Kaliumacetat, Calciumacetat und eine optimierte Konzentration an Magnesiumacetat. Diese Typen von Komponenten oder deren Äquivalente werden miteinander in einem Verfahren, das separat von der Herstellung des S-30-Extrakts abläuft, vermischt. Das ergänzende Gemisch wird ebenfalls typischerweise bis zur späteren Verwendung in S-30-gekuppelten Reaktionen in eingefrorenem Zustand gelagert.
Bei einer typischen herkömmlichen Reaktion, die zur in vitro-Erzeugung von Protein aus DNA unter Verwendung eines E. coli S-30-Extrakts durchgeführt wurde, werden die folgenden Komponenten in einem Mikrozentrifugenröhrchen miteinander vermischt, typischerweise in einem Gesamtvolumen von 25 bis 50 μl: 1. S-30-Extrakt; 2. ergänzendes Gemisch; 3. ein oder mehr zusätzliche Aminosäuren (unmarkiert oder markiert); 4. Wasser; und 5. DNA-Matrize. Diese Kombination wird für eine bestimmte Zeitspanne inkubiert, typischerweise 1 Stunde bei 30 bis 37°C. Die Menge und die Qualität der in vitro synthetisierten Proteine wird durch verschiedene Verfahren geprüft.
Kurze zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die Erfindung ist auf Reaktionsgemische zur Durchführung einer Proteinsynthese abgestellt. Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Reaktionsgemisch zur Durchführung einer Protein-Synthesereaktion bereitgestellt, wobei das Gemisch einen prokaryontischen S-30-Extrakt in Kombination mit einem ergänzenden Gemisch mit einem Gehalt an Puffer, Salzen, Nucleotidtriphosphaten, einem Energieerzeugungssystem und Aminosäuren umfasst, wobei das Reaktionsgemisch in Bezug auf RNase E erheblich verarmt ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Reaktionsgemisch zur Durchführung von Protein-Synthesereaktionen bereitgestellt, wobei das Gemisch einen prokaryontischen S-30-Extrakt in Kombination mit einem ergänzenden Gemisch mit einem Gehalt an Puffer, Salzen, Nucleotidtriphosphaten und einem Energieerzeugungssystem umfasst, wobei aus dem Reaktionsgemisch die Degradosomen in erheblichem Umfang entfernt worden sind.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Reaktionsgemisch zur Durchführung von Protein-Synthesereaktionen bereitgestellt, wobei das Gemisch einen prokaryontischen S-30-Extrakt in Kombination mit einem ergänzenden Gemisch mit einem Gehalt an Puffer, Salzen, Nucleotidtriphosphaten und einer Energiequelle umfasst, wobei das Gemisch durch Einfrieren, Auftauen und Zentrifugieren fraktioniert worden ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Protein-Synthesereaktionsgemisch bereitgestellt, das eine Kombination eines S-30-Extrakts und eines ergänzenden Gemisches, das durch das Einfrieren, Auftauen und Zentrifugieren fraktioniert worden ist, umfasst. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Fertigungsgegenstände bereitgestellt, die folgendes umfassen:
ein fraktioniertes E. coli-Reaktionsgemisch und einen zur Lagerung und zum Transport geeigneten Behälter, der das fraktionierte Reaktionsgemisch enthält. Speziell wird erfindungsgemäß folgendes bereitgestellt:

a) ein Fertigungsgegenstand, umfassend: ein fraktioniertes E. coli-S-30-Reaktionsgemisch, bestehend aus den vereinigten Bestandteilen eines S-30-Extrakts und eines ergänzenden Gemisches, das vereinigt und fraktioniert worden ist, wobei durch die Fraktionierung RNase E aus dem Gemisch entfernt worden ist, umfasst; und einen zur Lagerung und zum Transport geeigneten Behälter, der das S-30-Reaktionsgemisch enthält;
b) Fertigungsgegenstand, umfassend: ein fraktioniertes E. coli-Reaktionsgemisch, das durch Vereinigen eines S-30-Extrakts und eines ergänzenden Gemisches und durch anschließendes Fraktionieren der Kombination erhalten worden ist, wobei durch die Fraktionierung der Großteil der DNA aus dem Gemisch entfernt wird; und einen zur Lagerung und zum Transport geeigneten Behälter, der das Reaktionsgemisch enthält; und
c) Fertigungsgegenstand, umfassend: ein fraktioniertes E, coli-Reaktionsgemisch, das durch Vereinigen eines S-30-Extrakts und eines ergänzenden Gemisches und durch anschließendes Fraktionieren der Kombination hergestellt worden ist, wobei durch die Fraktionierung die RNA-Degradosomen aus E. coli in erheblichem Umfang entfernt worden sind; und einen zur Lagerung und zum Transport geeigneten Behälter, der das fraktionierte Reaktionsgemisch enthält.

Die vorliegende Erfindung ist auch auf das Verfahren zur Herstellung dieses Gemisches abgestellt. Eine Ausführungsform der Erfindung ist auf ein Verfahren zur Herstellung eines Reaktionsgemisches zur Durchführung einer Protein-Synthesereaktion in einem prokaryontischen, zellfreien Extrakt abgestellt, wobei das Verfahren folgende Stufen umfasst:

(a) Herstellen eines E, coli-S-30-Extrakts durch Lysis von E. coli-Zellen und durch Zentrifugieren des Lysats;
(b) vor oder nach Stufe (a) getrenntes Herstellen eines ergänzenden Gemisches mit einem Gehalt an Puffer, Salzen und Nucleotidtriphosphaten, einem Energieerzeugungssystem und einem Fällungsmittel, das vorzugsweise Moleküle mit hohem Molekulargewicht fällt;
(c) Vereinigen der Lösungen von Stufe (a) und (b); und
(d) Zentrifugieren der vereinigten Lösungen und Abtrennen des Überstands zur Bildung des Reaktionsgemisches.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist auf ein Verfahren zur Durchführung einer in vitro-Protein-Synthesereaktion abgestellt, wobei das Verfahren folgende Stufen umfasst:

(a) Herstellen eines E. coli S-30-Extrakts durch Lysis von E. coli-Zellen und durch Zentrifugieren des Lysats;
(b) vor oder nach Stufe (a) getrenntes Herstellen eines ergänzenden Gemisches mit einem Gehalt an Puffer, Salzen, Nucleotidtriphosphaten, einem Energieerzeugungssystem und einem Fällungsmittel, das vorzugsweise Moleküle mit hohem Molekulargewicht fällt;
(c) Vereinigen der Lösungen von Stufe (a) und (b);
(d) Zentrifugieren der vereinigten Lösungen und Abtrennen des Überstands zur Bildung des Reaktionsgemisches;
(e) Zusetzen einer DNA-Matrize zum Reaktionsgemisch, wobei die DNA-Matrize für die Expression eines Proteins kodiert und einen Promotor umfasst, der durch eine RNA-Polymerase bei der Reaktion erkannt wird; und
(f) Inkubieren des Gemisches unter solchen Bedingungen, dass ein Protein erzeugt wird.

Das fraktionierte S-30-Reaktionsgemisch kann zur in vitro-Durchführung von gekuppelten Transkriptions- und Translationsreaktionen verwendet werden, bei denen weniger Pipettierungsstufen erforderlich sind und bessere Ergebnisse erzielt werden als mit üblichen S-30-Extrakten und Reaktionsverfahren.
Ein Ziel der Erfindung ist es ferner, ein E. coli-S-30-Protein-Synthesesystem bereitzustellen, das einen größeren prozentualen Anteil an Zielprotein von voller Länger und weniger Zielprotein von nicht vollständiger Länge sowie von Nichtzielprotein liefert, als es unter Verwendung herkömmlicher Systeme möglich war.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Beschreibung eines Verfahrens zur Herstellung eines E. coli-S-30-Transkriptions- und Translationsreaktionsgemisches, das sich gegenüber aus dem Stand der Technik bekannten Gemischen in Bezug auf die einfache Anwendung und in Bezug auf das Leistungsvermögen als überlegen erweist.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das hier beschriebene fraktionierte S-30-Reaktionsgemisch zu einer höheren Proteinausbeute und einer höheren Genauigkeit des erzeugten Proteins von voller Länge führt, verglichen mit Proteinen, die unter Verwendung von bekannten S-30-Extrakten und ergänzenden Bestandteilen erzeugt worden sind.
Weitere Ziele, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen.
Kurze Beschreibung der verschiedenen Ansichten der Zeichnungen
1 ist ein Autoradiogramm von Forschungsergebnissen eines in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Experiments.
2 ist ein weiteres Autoradiogramm zur Erläuterung von Ergebnissen von in den Beispielen beschriebenen Experimenten.
3 ist ein Histogramm zur Erläuterung von Ergebnissen aus den Beispielen.
4 ist ein weiteres Histogramm von experimentellen Ergebnissen.
5 ist ein weiteres Histogramm von experimentellen Ergebnissen.
6 und 7 sind weitere Autoradiogramme von experimentellen Ergebnissen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Es wurde festgestellt, dass bei Kombination eines E. coli S-30-Extrakts mit einem ergänzenden Gemisch vor der Verwendung und durch anschließende Fraktionierung das vereinigte und fraktionierte Reaktionsgemisch für in vitro-Protein-Syntheseverfahren verwendet werden kann, wobei man Ergebnisse erzielt, die gegenüber herkömmlichen S-30-Zubereitungen überlegen sind. Die Verwendung des verbesserten, partiell gereinigten, fraktionierten S-30-Reaktionsgemisches führt zu wesentlich weniger Nichtzielprotein und zu einer geringeren Synthese von Protein von partieller Länge, relativ zum Produkt von voller Länge, als bei herkömmlichen S-30-Systemen. Ferner kann das fraktionierte Reaktionsgemisch im Verfahren zur Proteinsynthese unter Durchführung von weniger Stufen, mit einem höheren Wirkungsgrad und einer geringeren Fehleranfälligkeit eingesetzt werden.
Es ist schwierig, sämtliche Komponenten zu identifizieren, die bei der vorstehend beschriebenen Fraktionierungsstufe aus dem S-30-Extrakt entfernt werden. Jedoch hat eine Analyse ergeben, dass die RNA-Degradosomen weitgehend aus dem Extrakt entfernt werden. Es wird angenommen, dass die Entfernung der RNA-Degradosomen und der RNase E, die den organisierenden Bestandteil der Degradosomen darstellt, einen wesentlichen Beitrag zu den verbesserten Ergebnissen, die durch Verwendung eines Reaktionsgemisches auf der Basis eines fraktionierten Extrakts erhalten werden, liefert. Erhebliche Mengen an Nucleinsäuren, sowohl DNA als auch RNA, werden ferner aus dem Extrakt durch diese Fraktionierung entfernt. Es wird angenommen, dass auch die Entfernung dieser Komponenten zu den verbesserten Ergebnissen beiträgt.
Wie vorstehend ausgeführt, stellt es im Stand der Technik eine übliche Praxis dar, einen S-30-Extrakt und ein ergänzendes Gemisch separat bereitzustellen. Die beiden Lösungen werden sodann erst zum Zeitpunkt der Durchführung des Protein-Syntheseverfahrens zu einem Reaktionsgemisch vereinigt. Bei dem Verfahren und bei dem Produkt gemäß den vorliegenden Angaben kommt es in Betracht, dass die beiden Lösungen miteinander vermischt und fraktioniert werden, bevor sie verpackt, vertrieben und an den Verbraucher ausgeliefert werden. Eine Mischung eines üblichen S-30-Extrakts und eines ergänzenden Gemisches führt zu einer trüben Lösung, in der ausgefälltes Material vorliegt. Hier wird offenbart, dass dann, wenn diese vereinigte Lösung fraktioniert wird, wie es durch Einfrieren und Auftauen dieses Gemisches im Anschluss an eine Zentrifugation vorgenommen werden kann, das ausgefällte Material entfernt werden kann, ohne dass der Wirkungsgrad der im Überstand verbleibenden Elemente beeinträchtigt wird. Tatsächlich erweist sich das Material im Überstand gegenüber einem nicht-fraktionierten Gemisch als überlegen. Ferner kann das fraktionierte S-30-Reaktionsgemisch bei –70°C gelagert werden, bis es für die Verwendung bei einer Protein-Synthesereaktion benötigt wird.
Bei einer Protein-Synthesereaktion möchte man als Reaktionsprodukt das Zielprotein von voller Länge in möglichst großer Ausbeute und mit möglichst großer Reinheit, wie es in der Praxis möglich ist, erhalten. Bei den meisten Protein-Synthesereaktionen unter Verwendung von E. coli S-30-Extrakten werden unerwünschte Mengen an geschnittenen oder Nichtzielproteinen erzeugt, und zwar aufgrund einer Reihe von Faktoren, wie endogener, proteinkodierender DNA und mRNA im Reaktionsgemisch und aufgrund eines Abbaus der transkribierten mRNA durch Nucleasen im Reaktionsgemisch, die aus dem Extrakt stammen. Wissenschaftler haben sich der Behandlung eines S-30-Extrakts mit calciumabhängiger Nuclease bedient, um endogene DNA oder mRNA zu entfernen. Ferner haben sie eine Vorinkubation des Extrakts vorgenommen, um ein "Ablaufen" von endogener mRNA von den Ribosomen zu ermöglichen.
Mit den herkömmlichen Techniken war es jedoch nicht möglich, die DNA oder mRNA vollständig zu entfernen, ohne die Protein-Syntheseaktivität des Extrakts auf inakzeptabel niedrige Werte zu verringern. Es wurde nunmehr in überraschender Weise festgestellt, dass dann, wenn man sich bei einer derartigen Reaktion des hier beschriebenen, partiell gereinigten, fraktionierten S-30-Reaktionsgemisches bedient, das Zielprotein von voller Länge in wesentlich größerer Reinheit erzeugt wird oder, anders ausgedrückt, geschnittenes oder Nichtzielprotein im Vergleich zum Protein von voller Länge in wesentlich geringerer Menge gebildet wird. Durch Western-Blotting- oder Elektrophorese-Abbildungstechniken lassen sich diese verbesserten Ergebnisse leicht sichtbar machen. Da bei der hier beschriebenen Reaktion ein Ausgangsgemisch verwendet wird, das aus einer Kombination eines S-30-Extrakts und eines ergänzenden Gemisches gebildet wird, beinhaltet das Protein-Herstellungsverfahren unter Einschluss dieser Verbesserung tatsächlich weniger Stufen als das gleiche Verfahren bei Durchführung gemäß dem Stand der Technik. Kurz ausgedrückt, das hier beschriebene Verfahren und das entsprechende Produkt zeichnen sich dadurch aus, dass ein besseres und ein einfacheres Verfahren eingesetzt wird und bessere Ergebnisse erzielt werden.
Verschiedene Hersteller haben gemäß herkömmlichen Verfahren E. coli S-30-Systeme hergestellt und vertrieben, die zwei getrennte Bestandteile, nämlich den S-30-Extrakt und das ergänzende Gemisch enthalten, die erst zum Zeitpunkt der Durchführung der Protein-Synthesereaktion vereinigt werden. Hier kommt es in Betracht, dass ein vereinigtes, fraktioniertes S-30-Reaktionsgemisch als Handelsprodukt vertrieben wird. Das Reaktionsgemisch kann hergestellt werden, indem man einen S-30-E. coli-Extrakt und ein ergänzendes Gemisch vereinigt, die Kombination einfriert und auftaut und zentrifugiert, wodurch teilchenförmige Bestandteile entfernt werden. Beim erhaltenen fraktionierten Reaktionsgemisch handelt es sich um eine klare, nicht trübe Lösung, die vorher zubereitet und bis zur Verwendung gelagert werden kann. Dieses als Produkt erhaltene Reaktionsgemisch kann somit in gebrauchsfertiger Form als Gesamtmenge oder in Aliquotanteilen für einzelne Reaktionen oder Gruppen von Reaktionen auf Behälter verteilt werden. Dieses Produkt kann gelagert und in gefrorenem Zustand transportiert werden oder es kann getrocknet oder lyophilisiert und vor der Verwendung rehydratisiert werden. Bei diesem Produkt handelt es sich um ein neuartiges Handelsprodukt, das dazu geeignet ist, die Durchführung von Protein-Synthesereaktionen mit prokaryontischen, zellfreien Extrakten im Vergleich zu herkömmlichen Systemen effizienter und zweckmäßiger zu gestalten. Das fraktionierte S-30-Reaktionsgemisch kann in Behältern gelagert werden, die sich für eine Lagerung in gefrorenem oder getrocknetem Zustand und für einen Transport zu den Anwendern eignen. Das Gemisch kann mit einer Gebrauchsanweisung und mit begleitenden Bestandteilen, z. B. mit vorgetestetem Wasser und einer positiven Kontroll-DNA, zu Testpackungen zusammengestellt werden, was der üblichen Praxis in der Industrie entspricht.
Somit wird insgesamt erfindungsgemäß ein E. coli-Protein-Synthesereaktionsgemisch hergestellt, indem man zunächst Zellen züchtet, die Zellen durch Zentrifugation erntet und die erhaltenen Pellets wäscht. Die Zellen werden sodann in einem Puffer resuspendiert und zur Lysis der Zellen durch eine French-Presse gedrückt. Die lysierten Zellen werden sodann 2-mal zentrifugiert, um feste Bruchstücke zu entfernen, wonach der Vorinkubationspuffer zum Extrakt gegeben wird. Das erhaltene Produkt wird inkubiert. Anschließend wird ein Calciumsalz zugesetzt, wonach sich die Zugabe von Mikrokokken-Nuclease und eine Inkubation zum Abbau von endogenen Nucleinsäuren anschließen. Sodann wird EGTA zugegeben, um die Nuclease zu inaktivieren, wonach sich eine Dialyse gegen einen Dialysepuffer anschließt. Der S-30-Extrakt, dessen Herstellung bis zu diesem Punkt gemäß herkömmlichen Verfahren erfolgt, kann gegebenenfalls für Lagerungszwecke in Aliquotanteilen eingefroren werden. Ab hier weicht das erfindungsgemäße Verfahren von herkömmlichen Verfahrensweisen ab. Der S-30-Extrakt wird sodann mit einem ergänzenden Gemisch und einer optimierten Konzentration an Magnesium vereinigt. Das S-30-Reaktionsgemisch, das sowohl den S-30-Extrakt als auch das ergänzende Gemisch enthält, wird sodann in flüssigem Stickstoff eingefroren. Wenn das Reaktionsgemisch aufgetaut wird, entsteht eine trübe Lösung. Durch 5-minütige Zentrifugation mit 16 000 × g wird die Trübung im Gemisch beseitigt. Beim erhaltenen fraktionierten S-30-Reaktionsgemisch handelt es sich um den Überstand, der bei dieser Fraktionierungsstufe gewonnen wird. Dieses Produkt kann in Aliquotanteile aufgeteilt und bis zur Verwendung eingefroren oder getrocknet werden.
Die Hauptunterschiede zwischen dem hier beschriebenen S-30-Protein-Synthesereaktionsgemisch und herkömmlichen Produkten bestehen in den Bestandteilen, die durch das Fraktionierungsverfahren aus dem Gemisch entfernt worden sind. Tests haben gezeigt, dass RNA-Degradosomen und endogene DNA mit einer Größe von mehr als etwa 2 kbp bevorzugt aus dem erfindungsgemäßen S-30-Protein-Synthesereaktionsgemisch entfernt werden. Ein Test auf die RNase E- und DNA-Konzentrationen im Gemisch bestätigt dies. In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Gemisch sind die Konzentrationen an nativer, unmutierter RNase E drastisch verringert, und zwar auf Mengen, die in Western-Blots unter Verwendung von anti-RNase E-Antikörper nur schwer sichtbar zu machen sind. Die Menge an endogener DNA im Gemisch wird auf eine Größenordnung von etwa 90% und bestimmt mehr als 80% verringert, während die Menge an RNA im Gemisch um etwa 80% verringert wird, wobei aber immer noch ein mehr als angemessenes Protein-Synthesevermögen erhalten bleibt.
Beim Studium der Natur der aus dem S-30-Extrakt durch die vorstehend beschriebene Fraktionierung entfernten Bestandteile wurde festgestellt, dass die Anwesenheit eines Fällungsmittels, das bevorzugt die Fällung einer hochmolekularen Spezies bewirkt, besonders hilfreich ist. Im typischen S-30-Protein-Synthesereaktionsgemisch wird Polyethylenglykol (PEG) als ein Bestandteil des ergänzendes Gemisches unmittelbar vor der Verwendung des Extrakts für die Proteinsynthese zugesetzt. PEG wird gelegentlich getrennt zusammen mit Salzen verwendet, um Nucleinsäuren zu fällen. Es wird gemäß dem Stand der Technik zur Fällung sämtlicher makromolekularer Komponenten von S-30-Extrakten als ein Mittel zum Einengen eingesetzt. Zu den Eigenschaften von Polyethylenglykol gehört, dass es mit höherer Wahrscheinlichkeit eine Ausfällung von hochmolekularen Bestandteilen in einem heterogenen Gemisch bewirkt. Unter den hier angewandten Bedingungen, die geringere PEG- und Salzkonzentrationen, als sie gemäß dem Stand der Technik typischerweise zum Einengen herangezogen wurden, umfassen, wird der Extrakt einer Fraktionierung anstelle einer bloßen Einengung unterzogen. Durch die Fraktionierung werden selektiv Komponenten entfernt, die die Synthese von Protein von voller Länge hemmen und die eine Synthese von Nichtzielproteinen hervorrufen, wobei aber die aktive Protein-Syntheseaktivität erhalten bleibt. Es wurde festgestellt, dass die Anwesenheit von Polyethylenglykol oder von einem anderen Fällungsmittel für hochmolekulare Spezies für die Erzielung der Vorteile des hier beschriebenen Fraktionierungsverfahrens bevorzugt ist. Ohne Zusatz von Polyethylenglykol oder einem hierzu äquivalenten Mittel lässt sich der volle Nutzen der Verbesserung des S-30-Protein-Expressionskits nur schwer erreichen. Zu andern Fällungsmitteln, die ähnliche Fällungseigenschaften wie PEG aufweisen, gehören Polyethylenimin (PEI), Chitosan und kolloidale Teilchen, z. B. der Biocryl BPA-Reihe.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die Stufen des Einfrierens und Auftauens für das hier beschriebene Fraktionierungsverfahren als zweckmäßig gelten, jedoch nicht als notwendig anzusehen sind. Das dem Extrakt durch das ergänzende Gemisch zugesetzte Fällungsmittel PEG bewirkt, dass höhermolekulare Komponenten, wie große DNA-Moleküle und RNA-Degradosomenkomplexe weniger löslich sind. Der Einfrier- und Auftauzyklus bewirkt offensichtlich eine weitere Verringerung der Löslichkeit derartiger Komponenten. Es kommt jedoch in Betracht, dass ein Fraktionierungsverfahren auf der Grundlage von einer oder mehreren Zentrifugationsstufen oder ähnlicher Trennverfahren, ähnliche Ergebnisse liefert.
Der hier verwendete Ausdruck "Protein" dient zur Bezeichnung sowohl von biologisch aktiven Proteinen von voller Länge als auch von inaktiven oder geschnittenen Proteinen, für die gelegentlich der Ausdruck "Polypeptide" bevorzugt wird, ein Ausdruck, der auch hier gelegentlich verwendet wird.
Zur beispielhaften Erläuterung dieses verbesserten Verfahrens wird nachstehend ein beispielhaftes Verfahren zur Herstellung und zur Verwendung der Lösungen, die bei diesem Verfahren verwendet werden, beschrieben. Sämtliche Varianten dieser beispielhaften Vorgehensweise, die vom Umfang der beigefügten Ansprüche umfasst werden, fallen unter den Umfang der Erfindung.
Beispiele
Herstellung von Vorratslösungen

1. Wachstumsmedium: 5,6 g KH₂PO₄, 28,9 g K₂HPO₄, 10 g Hefeextrakt, 15 mg Thiamin, Wasser auf 1 Liter; Autoklavisierung zur Sterilisation; Zugabe von 40 ml 25% (Gew./Vol.) Glucose/Liter Medium; Zugabe weiterer Vitamine gemäß den Erfordernissen der Stämme.
2. Waschpuffer: 10 mM Tris-acetat, pH-Wert 8,0, 14 mM Mg(OAc)₂, 60 mM KCl, 1 mM DTT, 50 μg/ml PMSF; Zugabe von PMSF unmittelbar vor der Verwendung; Lagerung bei 4°C.
3. Lysispuffer: 10 mM Tris-acetat, pH-Wert 8,0, 14 mM Mg(OAc)₂, 60 mM KCl, 50 μg/ml PMSF; Zugabe von PMSF unmittelbar vor der Verwendung; Aufbewahrung bei 4°C.
4. Vorinkubationspuffer: Unmittelbar vor der Verwendung wird eine Lösung mit folgenden Bestandteilen hergestellt: 3,75 ml 2 M Tris-acetat, pH-Wert 8,0, 236,7 μl 1,0 M Mg(OAc)₂, 75 μl 1 M DTT, 75 μl 10 mM Aminosäurengemisch, 600 μl 0,1 M ATP, 0,2 g Phosphoenolpyruvat (Trinatriumsalz), 50 Einheiten (25 μl) Pyruvat-kinase, 4,99 ml Wasser.
5. 0,1 M CaCl₂, filtriert mit einem 0,2 μm-Filter und aufbewahrt bei 4°C.
6. 0,2 M EDTA, filtriert mit einem 0,2 μm-Filter und aufbewahrt bei 4°C.
7. 178,6 Einheiten/μl Mikrokokken-Nuclease, aufbewahrt bei –20°C.
8. Dialysepuffer: 10 mM Tris-acetat, pH-Wert 8,0, 14 mM Mg(OAc)₂, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, 50 μg/ml PMSF. Zugabe des PMSF unmittelbar vor der Verwendung, Aufbewahrung bei 4°C.

Ergänzendes Gemisch
Das ergänzende Gemisch wurde durch Zugabe der nachstehend aufgeführten Bestandteile in den angegebenen Mengenverhältnissen hergestellt.
Züchtung von Zellen
Die bevorzugten Stämme von E. coli sind SL 119 und SL 119(DE3)LacZ. Ein Ausstrich wird aus einem Glycerin-Vorrat auf eine LB-Platte mit einem Gehalt an 12,5 μg/ml Tetracyclin vorgenommen. Die Platte wird über Nacht bei 37°C inkubiert.
Eine einzelne Kolonie wird aus der über Nacht gezüchteten Platte herausgenommen und auf 50 ml LB-Medium mit 12,5 μg/ml Tetracyclin überimpft. Die Kultur wird über Nacht bei 37°C unter Schütteln mit 250 U/min inkubiert.
Am nächsten Tag werden 50 ml der über Nacht gezüchteten Kultur auf 900 ml Wachstumsmedium plus 12,5 μg/ml Tetracyclin überimpft und bei 37°C unter Schütteln mit 250 U/min inkubiert. Das Wachstum wird in Abständen von 30 Minuten durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm überwacht. Wenn die optische Dichte den Wert von 2,0 bis 3,0 erreicht, werden 6 Aliquotanteile einer 150 ml-Kultur auf 2,8 Liter fassende Fernbach-Kolben mit einem Gehalt an 850 ml Wachstumsmedium übertragen. Die Kolben werden sodann bei 37°C unter heftigem Schütteln inkubiert, wobei das Wachstum aufgrund der optischen Dichte überwacht wird. Wenn die Dichtewerte in diesen Kulturen bei Messung bei 600 nm 0,8 bis 1,0 bei einer 1/5-Verdünnung der Kultur erreicht haben, werden die Kulturen sofort auf Eiswasser übertragen und rasch unter Aufrühren gekühlt.
Für die SL119(DE3)-Kulturen darf die optische Dichte bei 600 nm ohne Verdünnung 1,5 bis 2,0 erreichen. IPTG wird bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM jedem der Kolben zugegeben. Anschließend wird eine weitere 2- bis 3-stündige Inkubation bei 37°C durchgeführt, bevor eine Übertragung auf Eiswasser vorgenommen wird.
Die Zellen werden durch 10-minütige Zentrifugation mit 3 500 g bei 4°C geerntet. Die Zellpellets werden gewonnen und in insgesamt 2 Liter Waschpulver resuspendiert, wonach sich eine 10-minütige Zentrifugation mit 3 500 g bei 4°C anschließt. Die Zellpellets werden erneut gewonnen, in 2 Liter Waschpuffer resuspendiert und 20 Minuten mit 16 000 g bei 4°C zentrifugiert. Die gewonnenen Zellpellets werden vereinigt und können unmittelbar verarbeitet oder bei –70°C aufbewahrt werden.
Extraktherstellung
Die Zellpellets werden gründlich in kaltem Lysispuffer in einem Verhältnis von 2 ml Puffer pro Gramm Zellen resuspendiert. Sodann werden die Zellen zur vollständigen Resuspension durch eine Nadel Nr. 22 gegeben. Anschließend werden die Zellen durch Passage durch eine gekühlte French-Presse mit 8 000–10 000 psi lysiert. DTT wird sofort zum Lysat unter Erreichen einer Endkonzentration von 1 mM gegeben.
Die lysierten Zellen werden sodann 10 Minuten mit 30 000 g bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird gewonnen und in ein sauberes Zentrifugenröhrchen übertragen. Anschließend wird der Überstand 20 Minuten mit 46 000 g bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und auf einen sauberen Kolben auf Eis übertragen. Sein Volumen wird bestimmt.
1 ml Vorinkubationspuffer wird zu jeweils 6,5 ml S-30-Extrakt gegeben, wonach 60 Minuten mäßig bei 30–32°C geschüttelt wird. Sodann werden CaCl₂ bis zu einer Endkonzentration von 1 mM und Mikrokokken-Nuclease bis zu einer Endkonzentration von 1,32 Einheiten pro ml zugegeben, wonach sich eine 30-minütige Inkubation bei 26°C anschließt. Anschließend wird EGTA bis zu einer Endkonzentration von 2 mM zugegeben. Nach Mischen wird das Gemisch auf Eis gestellt.
Der S-30-Extrakt wird sodann in einen Dialyseschlauch gebracht (Molekulargewicht-Ausschlussgrenze 6 000–8 000) und gegen 4 Liter kalten Dialysepuffer bei 4°C dialysiert. Der Puffer wird in 1-stündigen Abständen 3-mal ausgetauscht. Der erhaltene S-30-Extrakt wird in Aliquotanteile aufgeteilt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –70°C aufbewahrt.
Optimierung
Wie bei jedem Protein-Synthesesystem ist es zweckmäßig, die Konzentration an Magnesiumsalz für die Umsetzung zu optimieren. Dies wird vorgenommen, indem man die Konzentration der Magnesiumionen in kleinen Testreaktionen variiert, bis ein Optimum erreicht wird. Kleine Aliquotanteile von S-30-Extrakt werden aufgetaut und ebenso kleine Aliquotanteile des ergänzenden Gemisches. 0,3 ml des S-30-Extrakts werden mit 0,4 ml ergänzendem Gemisch vereinigt, vermischt (zur Herstellung des Reaktionsgemisches) und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das vereinigte Material wird auf Eis aufgetaut und in eine Mikrozentrifuge gegeben, wo es 5 Minuten mit 14 000 U/min bei 4°C zentrifugiert wird. Sodann wird der Überstand entfernt und auf Eis gestellt. Bei diesem Überstand handelt es sich um das fraktionierte S-30-Reaktionsgemisch, das anschließend bei Proteinsynthese-Testreaktionen verwendet wird. Parallele Reaktionen werden unter Verwendung variierender Mengen an Magnesiumsalzen in den Testreaktionen im Bereich von 5 bis 15 mM zugesetztem Magnesium durchgeführt, bis der optimale Magnesiumwert für diesen Ansatz des Reaktionsgemisches bestimmt ist. Eine typische optimale Magnesiumkonzentration beträgt 10,6 mM Magnesiumacetat.
Herstellung des Großteils des fraktionierten S-30-Reaktionsgemisches
Der Großteil des S-30-Extrakts und der Großteil des ergänzenden Gemisches werden aufgetaut. Die beiden Lösungen werden in einem Verhältnis von 0,75 ml S-30-Extrakt pro 1 ml ergänzendem Gemisch (oder das Verhältnis beruht auf dem optimierten Verhältnis) vereinigt und bei 4°C vermischt. Magnesiumacetat wird in einer ausreichenden Menge zugegeben, um die Magnesiumkonzentration auf den durch die Optimierungsstufe bestimmten Wert zu bringen. Anschließend wird weiter bei 4°C vermischt. Das vereinigte Gemisch wird sodann in flüssigem Stickstoff eingefroren. Nach dem Einfrieren wird das Material aufgetaut und zur Fraktionierung 5 Minuten bei 4°C mit 16 000 g zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und je nach Bedarf für bestimmte Reaktionsgrößen in Aliquotanteile aufgetrennt, eingefroren und bis zur Verwendung aufbewahrt. Hierbei handelt es sich um das fraktionierte S-30-Reaktionsgemisch.
Gekuppelte Protein-Synthesereaktionen
Die eingefrorenen Aliquotanteile werden aufgetaut und in einer gekuppelten Transkriptions- und Translations-Protein-Synthesereaktion verwendet. Bei einer typischen Reaktion werden 35 μl fraktioniertes S-30-Reaktionsgemisch mit markiertem oder unmarkiertem Methionin plus eine DNA-Matrize plus Wasser verwendet, um das Gesamtvolumen auf 50 μl zu bringen. Das Reaktionsgemisch wird 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Herstellung von Reaktionsprodukten kann nach einem der verschiedenen Techniken getestet werden, einschließlich Trennung durch Gelelektrophorese und Nachweis durch radioaktive, immunologische oder enzymatische Techniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind.
Beispielhafte Ergebnisse
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Reagenzien und Vorgehensweisen wurden Protein-Synthesereaktionen wiederholt durchgeführt. Ein Satz von Reaktionen wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen verbesserten, fraktionierten S-30-Reaktionsgemisches parallel zu gleichartigen Reaktionen unter Verwendung der gleichen Reagenzien, mit der Ausnahme, dass der S-30-Extrakt und das ergänzende Gemisch vor der Verwendung nicht vereinigt und fraktioniert worden waren, durchgeführt. Mit anderen Worten, bei diesem Experiment wurde das erfindungsgemäße, partiell gereinigte Reaktionsgemisch mit herkömmlichen Verfahren für S-30-Reaktionen verglichen. Um den Stand der Technik angemessen wiederzugeben, wurden drei verschiedene, handelsübliche S-30-Extrakte von zwei verschiedenen Herstellern (Ambion PROTEINscript-PRO, Promega E. coli-S30-Extraktsystem für lineare Matrizen, Promega E. coli-S30-Extraktsystem für zirkuläre DNA) verwendet.
Bei der verwendeten Matrizen-DNA handelte es sich um ein Konstrukt, das für die Expression des Proteins β-Glucuronidase unter der Kontrolle eines E. coli-tac-Promotors kodiert. Die DNA wurde sowohl in zirkulärer Form als auch als amplifiziertes, lineares PCR-Produkt mit den Promotor-flankierenden Primern und Kodierungsregionen verwendet. Die Reaktionsgemische enthielten ³⁵S-Methionin als radioaktive Markierung. Die erhaltenen Proteine wurden einer Größenfraktionierung an einem Elektrophoresegel unterzogen. Eine Reproduktion des Autoradiogramms dieses Gels ist als 1 dargestellt. In 1 zeigen die ersten drei Spalten die Ergebnisse der Verwendung eines erfindungsgemäßen Extrakts (EcoPro) mit zirkulärer (C), linearer PCR (P) und ohne Matrize (–). Bei den nächsten beiden Sätzen von drei Bahnen handelt es sich um das zirkuläre Promega S30-System (Xcirc) und das lineare Promega S30-DNA-System (Xlin) mit den gleichen Matrizen. Die letzten drei Spalten geben das Ambion S30-System (Y) wieder, und zwar erneut mit den gleichen drei Matrizen.
Die Ergebnisse zeigen eine größere Menge des exprimierten Zielproteins von voller Länge und eine höhere Zuverlässigkeit der Expression als bei den herkömmlichen Systemen. Unter Verwendung verschiedener Proteinprodukte und DNA-Matrizen gelang unter Verwendung dieses verbesserten, fraktionierten S-30-Reaktionsgemisches die Herstellung von mehr Zielprotein und von weniger Nichtzielprotein, als es bei Anwendung herkömmlicher Verfahren gelang. Die Ergebnisse standen tendenziell in Kontrast zu herkömmlichen S-30-Systemen, bei denen es typischerweise nicht nur zu einer geringeren Bildung an Zielprotein, sondern auch zu einer reichlichen Bildung an Nichtzielprotein kommt.
Charakterisierung des fraktionierten S-30-Reaktionsgemisches
Um die Natur der aus einem E. coli-Protein-Synthesesystem durch das hier beschriebene Fraktionierungsverfahren entfernten Komponenten besser zu verstehen, wurde eine Reihe von Tests durchgeführt. Zunächst wurde ein Test durchgeführt, um zu bestätigen, dass die nach dem Einfrieren erfolgende Abtrennung durch Zentrifugation für die verbesserten Ergebnisse verantwortlich ist. Zur Durchführung dieses Tests wurden Experimente mit zwei Sätzen von S-30-Reaktionsgemischen vorgenommen. Ein Satz wurde auf die vorstehend beschriebene Weise vorbereitet, einschließlich der Fraktionierungsstufe mit Einfrieren, Auftauen und Zentrifugieren des vereinigten S-30-Extrakts und des ergänzenden Gemisches. Beim zweiten Satz von Reaktionsgemischen handelte es sich um den vereinigten S-30-Extrakt und das ergänzende Gemisch, die keiner Fraktionierung nach dem Vermischen unterworfen wurden. Die gleichen Matrizen wurden sodann als Matrizen bei Protein-Synthesereaktionen eingesetzt, wobei man beide Reaktionsgemische in Gegenwart von ³⁵S-Methionin zur Markierung der synthetisierten Proteine verwendete. Die Ergebnisse sind im Autoradiogramm von 2 dargestellt. Bei den Proben im Gel auf der linken Seite von 2 handelte es sich um das fraktionierte S-30-Reaktionsgemisch, während die Proben des Gels auf der rechten Seite von 2 mit dem Reaktionsgemisch ohne die Fraktionierungsstufe behandelt wurden. Bei den verwendeten Matrizen handelte es sich um β-Glucuronidase (Gus), β-Galactosidase (Bga1) und Glühwürmchen-Luciferase (fLuc). Bei Betrachtung der in 2 dargestellten Gele ist zu erkennen, dass die mit den fraktionierten S-30-Reaktionsgemischen durchgeführten Reaktionen ein wesentlich saubereres Muster aufwiesen, was die im Vergleich zu den Reaktionen mit dem herkömmlichen Reaktionsgemisch geringere Bildung an Nichtzielprotein zeigt. Ferner sind die Banden für das Zielprotein bei den mit den fraktionierten S-30-Reaktionsgemischen durchgeführten Reaktionen offensichtlich dichter und stärker. Mit anderen Worten, mit dem fraktionierten S-30-Reaktionsgemisch werden wesentlich bessere Ergebnisse erzielt.
Eine Reihe von Messungen von gesamter DNA, gesamter RNA und Gesamtprotein, die sich im Gemisch durch die Fraktionierungsstufe veränderten, wurde sodann durchgeführt. Der Nucleinsäuregehalt wurde nach einer Extraktion der entsprechenden Proben mit Phenol zur Entfernung von Protein, das die Tests stören kann, gemessen. Die gesamte DNA wurde nach RNase-Behandlung unter Verwendung des handelsüblichen Kits PicoGreen (Molecular Probes) gemessen. Die gesamte RNA wurde unter Verwendung des gewerblichen Kits PicoGreen (Molecular Probes) gemessen. Das Gesamtprotein wurde unter Verwendung des gewerblichen Kits BCA (Pierce Chemical Co.) gemessen. Die Ergebnisse sind in den Histogrammen von 3 bis 5 zusammengestellt. In den einzelnen Figuren bedeutet "W" das gesamte S-30-Extrakt-Reaktionsgemisch ohne Fraktionierung, "P" den Gehalt des Niederschlags oder Pellets, das nach Zentrifugation des eingefrorenen/aufgetauten Gemisches aus dem S-30-Extrakt und dem ergänzenden Gemisch in Wasser resuspendiert worden ist. Ferner bedeutet in diesen Figuren "S" den Gehalt des Überstands, bei dem es sich um das fraktionierte S-30-Reaktionsgemisch handelt. Wie aus 3 ersichtlich ist, ist die DNA-Menge im Pellet tatsächlich größer als im gesamten Extrakt (vermutlich aufgrund einer verbesserten Ausbeute nach Phenolextraktion der Probe im Pellet). Sehr wenig DNA verblieb im Überstand, d. h. im fraktionierten S-30-Reaktionsgemisch. In 4 zeigen die Ergebnisse, dass mehr als 80% der gesamten RNA sich im Pellet oder im Niederschlag befinden und aus dem Gemisch durch die Fraktionierungsstufe entfernt werden. Dieses Ergebnis ist etwas überraschend, da offensichtlich die verschiedenen rRNA-Spezies alle für die Proteinsynthese benötigt werden, jedoch die Synthese von Zielprotein unter Verwendung des Überstands tatsächlich im Vergleich zum gesamten Extrakt erhöht ist. In 5 scheinen die Ergebnisse zu zeigen, dass nur etwa ein Viertel des Proteins im gesamten Extrakt durch die Fraktionierungsstufe entfernt wird. Eine Analyse der Proteine in den verschiedenen Proben durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ergibt, dass eine Anzahl von Proteinen durch das Fraktionierungsverfahren selektiv aus dem Extrakt entfernt wird.
Eine Analyse wurde durchgeführt, um die Annahme zu bestätigen, dass die RNA-Degradosomen durch den Fraktionierungsvorgang entfernt worden sind und dass die Anwesenheit des Fällungsmittels bei dieser Entfernung wichtig ist. In 6 ist ein Western-Blot unter Verwendung eines anti-RNase E-Antikörpers zur Sondenbehandlung eines nicht-fraktionierten Reaktionsgemisches ("W"), resuspendierten Niederschlags aus der Fraktionierungsstufe ("P") und des Überstands der Fraktionierungsstufe ("S"), die allein ähnlicher Weise, wie es unmittelbar vorher beschrieben worden ist, hergestellt worden sind, dargestellt. Für diese Analyse wurde keine Proteinsynthese durchgeführt; die Gemische selbst wurden analysiert. Ferner wurden parallele Präparate hergestellt, wobei das PEG weggelassen wurde (PEG – in 6) und das normale PEG zugesetzt wurde (PEG + in 6). Im Gel erscheinen die Größenmarker in den Bahnen auf jeder Seite. Durch Vergleich der Sätze von 3 Bahnen ist leicht ersichtlich, dass kein oder zumindest nur sehr wenig Material, das an den anti-RNase E-Antikörper im Überstand bindet, vorliegt, jedoch nur im Präparat mit zugesetztem PEG. Wenn das PEG aus dem Präparat weggelassen wird, werden durch die Fraktionierung die Moleküle, die den Antikörper binden, nicht aus dem Überstand entfernt. Somit belegen diese Daten, dass die Fraktionierungsstufe in Gegenwart des Fällungsmittels bezüglich der Entfernung von RNA-Degradosomen aus dem Reaktionsgemisch wirksam ist, da RNase E die organisierende Komponente dieser Komplexe darstellt. Dies kann für die verbesserte Bildung von Zielprotein im erfindungsgemäßen fraktionierten Reaktionsgemisch verantwortlich sein.
In 7 ist eine Analyse des DNA-Gehalts der gleichen Lösungen dargestellt, wobei erneut die Nomenklatur W für das nicht-fraktionierte Gemisch, P für den resuspendierten Niederschlag aus dem Fraktionierungsverfahren und S für den Überstand der Fraktionierung verwendet wird. In 7 ist die einer Größentrennung unterworfene DNA dargestellt. Auf der rechten Abbildungsseite sind drei Reihenmarkierungen vorhanden, nämlich "PEG", "RNase" und "μl". Die mit "PEG" bezeichnete Reihe gibt die Anwesenheit oder Abwesenheit von PEG im Präparat an. Die mit "RNase" bezeichnete Reihe gibt an, ob das Gemisch vor dem Aufsetzen auf das Gel mit RNase behandelt worden ist oder nicht. Die mit "μl" bezeichnete Reihe bezieht sich auf die Anzahl an Mikrolitern der entsprechenden Lösung, die auf das Gel aufgesetzt worden ist. Es wurde wieder keine Proteinsynthese durchgeführt und keine DNA-Matrize wurde zugesetzt. Die signifikantesten Ergebnisse werden in den mittleren sechs Bahnen festgestellt, bei denen durchweg eine RNase-Behandlung vorgenommen worden ist. Bei den linken drei Bahnen handelt es sich um Experimente mit PEG-Behandlung, während bei den rechten drei Bahnen keine PEG-Behandlung vorgenommen worden ist. Es ist darauf hinzuweisen, dass in Gegenwart von PEG fast sämtliche längeren DNA-Spezies in den Niederschlag und nur sehr wenig in den Überstand wanderten. Ferner ist bei einem Vergleich festzustellen, dass in den drei Bahnen für die Präparate, bei denen kein PEG zugesetzt wurde, keine derartige DNA-Entfernung aus dem Überstand erkennbar ist. Die Kombination der Verwendung des Fällungsmittels und des Einfrier- und Zentrifugiervorgangs scheint offensichtlich eine Entfernung einer signifikanten und potentiell wichtigen Menge der endogenen DNA aus dem Reaktionsgemisch zu bewirken, verglichen mit herkömmlichen Gemischen.

Claims

Reaktionsgemisch zur Durchführung einer Protein-Synthesereaktion, wobei das Gemisch einen prokaryotischen S-30-Extrakt, der mit einem Ergänzungsgemisch mit einem Gehalt an Puffer, Salzen, Nucleotidtriphosphaten, einem Energieerzeugungssystem und Aminosäuren vereinigt ist, umfasst, wobei das Reaktionsgemisch in Bezug auf RNase E erheblich verarmt ist.
Reaktionsgemisch nach Anspruch 1, wobei der Extrakt von E. coli stammt.
Reaktionsgemisch nach Anspruch 1, wobei das Gemisch ferner eine Menge an Aminosäuren umfasst.
Reaktionsgemisch zur Durchführung von Protein-Synthesereaktionen, wobei das Gemisch einen prokaryotischen S-30-Extrakt, der mit einem Ergänzungsgemisch mit einem Gehalt an Puffer, Salzen, Nucleotidtriphosphaten und einem Energieerzeugungssystem vereinigt ist, umfasst, wobei aus dem Reaktionsgemisch die Degradosomen in erheblichem Umfang entfernt worden sind.
Reaktionsgemisch nach Anspruch 4, wobei der Extrakt von E. coli stammt.
Reaktionsgemisch nach Anspruch 4, ferner umfassend eine Menge an Aminosäuren.
Reaktionsgemisch zur Durchführung von Protein-Synthesereaktionen, wobei das Gemisch einen prokaryotischen S-30-Extrakt, der mit einem Ergänzungsgemisch mit einem Gehalt an Puffer, Salzen, Nucleotidtriphosphaten und einer Energiequelle vereinigt ist, umfasst, wobei das Reaktionsgemisch durch Einfrieren, Auftauen und Zentrifugieren fraktioniert worden ist.
Reaktionsgemisch nach Anspruch 7, wobei der Extrakt von E. coli stammt.
Reaktionsgemisch nach Anspruch 7, wobei das Gemisch ferner eine Menge an Aminosäuren umfasst.
Proteinsynthesereaktion-Reaktionsgemisch, umfassend eine Vereinigung von einem S-30-Extrakt und einem Ergänzungsgemisch, das durch Einfrieren, Auftauen und Zentrifugieren fraktioniert worden ist.
Fertigungsgegenstand, umfassend eine fraktioniertes E. coli S-30-Reaktionsgemisch, bestehend aus den vereinigten Bestandteilen eines S-30-Extrakts und eines Ergänzungsgemisches, das vereinigt und fraktioniert worden ist, wobei durch die Fraktionierung RNase E aus dem Gemisch entfernt worden ist; und einen zur Lagerung und zum Transport geeigneten Behälter, der das fraktionierte S-30-Reaktionsgemisch enthält.
Fertigungsgegenstand nach Anspruch 11, wobei das Reaktionsgemisch gefroren ist.
Fertigungsgegenstand nach Anspruch 11, wobei das Reaktionsgemisch getrocknet ist.
Fertigungsgegenstand nach Anspruch 11, wobei das S-30-Reaktionsgemisch durch das Verfahren der Vereinigung eines S-30-Extrakts und eines Ergänzungsgemisches zur Herstellung einer trüben Lösung mit anschließender Zentrifugation der Lösung und Gewinnen des Überstands hergestellt worden ist.
Fertigungsgegenstand, umfassend ein fraktioniertes E. coli-Reaktionsgemisch, das durch Vereinigen eines S-30-Extrakts und eines Ergänzungsgemisches und anschließende Fraktionierung des vereinigten Produkts hergestellt worden ist, wobei durch die Fraktionierung der Großteil der DNA aus dem Gemisch entfernt ist; und einen zur Lagerung und zum Transport geeigneten Behälter, der das Reaktionsgemisch enthält.
Fertigungsgegenstand nach Anspruch 15, wobei das Reaktionsgemisch gefroren ist.
Fertigungsgegenstand nach Anspruch 15, wobei das Reaktionsgemisch getrocknet ist.
Fertigungsgegenstand nach Anspruch 15, wobei das S-30-Reaktionsgemisch durch das Verfahren der Vereinigung eines S-30-Extrakts und eines Ergänzungsgemisches zur Herstellung einer trüben Lösung mit anschließender Zentrifugation der Lösung und Gewinnen des Überstands hergestellt worden ist.
Fertigungsgegenstand, umfassend ein fraktioniertes E. coli-Reaktionsgemisch, das durch Vereinigen eines S-30-Extrakts und eines Ergänzungsgemisches und anschließende Fraktionierung der Vereinigung hergestellt worden ist, wobei durch die Fraktionierung die RNA-Degradosomen aus E. coli in erheblichem Umfang entfernt worden sind; und einen zur Lagerung und zum Transport geeigneten Behälter, der das Reaktionsgemisch enthält.
Fertigungsgegenstand nach Anspruch 19, wobei das Reaktionsgemisch gefroren ist.
Fertigungsgegenstand nach Anspruch 19, wobei das Reaktionsgemisch getrocknet ist.
Fertigungsgegenstand nach Anspruch 19, wobei das S-30-Reaktionsgemisch durch das Verfahren der Vereinigung eines S-30-Extrakts und eines Ergänzungsgemisches zur Herstellung einer trüben Lösung mit anschließender Zentrifugation der Lösung und Gewinnen des Überstands hergestellt worden ist.
Verfahren zur Herstellung eines Reaktionsgemisches zur Durchführung einer Protein-Synthesereaktion in einem prokaryotischen, zellfreien Extrakt, wobei das Verfahren folgende Stufen umfasst: (a) Herstellen eines E. coli S-30-Extrakts durch Lysis von E. coli-Zellen und durch Zentrifugieren des Lysats; (b) vor oder nach Stufe (a) getrenntes Herstellen eines Ergänzungsgemisches mit einem Gehalt an Puffer, Salzen, Nucleotidtriphosphaten, einem Energieerzeugungssystem und einem Fällungsmittel, das vorzugsweise Moleküle mit hohem Molekulargewicht fällt; (c) Vereinigen der Lösungen von Stufe (a) und (b); und (d) Zentrifugieren der vereinigten Lösungen und Abtrennen des Überstands zur Bildung des Reaktionsgemisches.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei es sich beim Fällungsmittel um Polyethylenglycol handelt.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei nach Stufe (c) die vereinigten Lösungen vor der Zentrifugierungsstufe (d) eingefroren und aufgetaut werden.
Verfahren nach Anspruch 23, ferner umfassend Stufen, bei denen der Überstand in Behälter für den gewerblichen Vertrieb gebracht wird.
Verfahren zur Durchführung einer in vitro-Protein-Synthesereaktion, wobei das Verfahren folgende Stufen umfasst (a) Herstellen eines E. coli S-30-Extrakts durch Lysis von E. coli-Zellen und durch Zentrifugieren des Lysats; (b) vor oder nach Stufe (a) getrenntes Herstellen eines Ergänzungsgemisches mit einem Gehalt an Puffer, Salzen, Nucleotidtriphosphaten, einem Energieerzeugungssystem und einem Fällungsmittel, das vorzugsweise Bestandteile mit hohem Molekulargewicht fällt; (c) Vereinigen der Lösungen von Stufe (a) und (b); (d) Zentrifugieren der vereinigten Lösungen und Abtrennen des Überstands zur Bildung des Reaktionsgemisches; (e) Zusetzen einer DNA-Matrize zum Reaktionsgemisch, wobei die DNA-Matrize für die Expression eines Proteins kodiert und einen Promotor umfasst, der durch eine RNA-Polymerase bei der Reaktion erkannt wird; und (f) Inkubieren des Gemisches unter solchen Bedingungen, dass ein Protein erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei es sich bei dem Fällungsmittel um Polyethylenglycol handelt.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei nach Stufe (c) die vereinigten Lösungen vor der Zentrifugierungsstufe (d) eingefroren und aufgetaut werden.
Verfahren nach Anspruch 28, ferner umfassend Stufen, bei denen der Überstand in Behälter für den gewerblichen Vertrieb gebracht wird.