JP4389870B2 - 哺乳動物培養細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法 - Google Patents
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Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物培養細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法、ならびに上記抽出液の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単に合成することが必要となってくる。
【０００３】
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって酵母や哺乳動物培養細胞などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。
【０００４】
一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系を試験管内に取り揃え、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質合成では、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法であると期待されている。このような無細胞系のタンパク質合成に供する細胞破砕液や抽出液として、種々の生物由来のものを使用することが検討され、研究が進められている。
【０００５】
無細胞系タンパク質合成用抽出液としては、従来より様々なものが知られているが、翻訳後の糖鎖修飾などを考慮すると、ヒトタンパク質を完全な活性を保持した状態で発現させ得るため、ヒト細胞により近縁な哺乳動物培養細胞由来の抽出液であることが望ましいと考えられる。現在、哺乳動物培養細胞由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液としては、ウサギ網状赤血球の系（たとえば、非特許文献１：Ｐｅｌｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，２４７−２５６（１９７６）参照）、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）の系（たとえば、特許文献１：特開２０００−３２５０７６号公報参照）が報告されている。
【０００６】
しかしながら、ウサギ網状赤血球の系では、ウサギにアセチルフェニルヒドラジン溶液を皮下注射し、投与４〜５日後にウサギの耳から採血し、そこからライセートを調製するという非常に煩雑な操作を伴う。また、ＣＨＯの系では、不活性ガスの雰囲気中、加圧下のＣＨＯを減圧させることによって細胞を破砕して、その抽出液を調製するが、この方法では、抽出液の作製に際し特別な装置や器具が必要である。さらに、抽出液調製時の細胞数やガス圧、加圧時間によって無細胞系でのタンパク質合成能が大きく影響されるため、条件設定に煩雑な操作を要する。また、かかる方法によって得られた抽出液では、合成できるタンパク質の量は極めて少なく、放射能標識を行ったアミノ酸の取り込みによってのみ、そのタンパク質合成活性を測定できるという程度である。
【０００７】
このため、調製が容易であり、かつタンパク質合成量の高い哺乳動物培養細胞由来抽出液およびその調製方法の開発が望まれている。
【発明の開示】
【０００８】
発明の目的
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、調製が容易であり、かつ従来よりもタンパク質合成量の高い無細胞系タンパク質合成用の哺乳動物培養細胞抽出液の調製方法、および該哺乳動物培養細胞抽出液、ならびにこの哺乳動物培養細胞抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供することである。
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有し、さらに、急激に凍結させた哺乳動物培養細胞を、−１０℃〜２０℃で解凍させる工程を含有する方法で調整された哺乳動物培養細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法。
（２）急激な凍結が、液体窒素によって行われるものである、（１）に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（３）前記解凍が、水浴または氷水浴中で解凍されたものである、（１）または（２）に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（４）抽出用液がプロテアーゼインヒビターを含有するものである、（１）〜（３）のうちのいずれかに記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（５）哺乳動物培養細胞が、リンパ腫由来の培養細胞である、（１）〜（４）のうちのいずれかに記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（６）哺乳動物培養細胞が、生殖巣由来の培養細胞である、（１）〜（４）のうちのいずれかに記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（７）哺乳動物培養細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来の培養細胞である、（６）に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（８）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）が、ＣＨＯ Ｋ１−ＳＦＭ由来である、（７）に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図１は、実施例２の実験結果を示すグラフであり、合成量に対する保温工程（合成反応を行う前、無細胞系タンパク質合成反応液に外来ｍＲＮＡ以外の成分を含んだ状態での一定時間の保温）の有無の影響を示す。
図２は、実施例２の実験結果を示すグラフであり、合成量に対する、保温工程の反応液組成及び保持時間の影響を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、哺乳動物培養細胞から抽出を行って哺乳動物培養細胞抽出液を調製する方法であって、抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有することをその大きな特徴とするものである。このような方法によって哺乳動物培養細胞抽出液を調製することで、上記特許文献１に記載の従来の手法と比較して、より緩和な状態で細胞の破砕を行うことができ、無細胞系タンパク質合成に必須な成分を破壊することなく細胞外に取り出すことができるので、従来よりも無細胞系にてタンパク質の合成量の高い哺乳動物培養細胞抽出液を容易に調製することができる。さらに本発明の方法によれば、使用器具などからのＲＮａｓｅなどの混入も防ぐことができ、また、界面活性剤などの試薬を用いた細胞破砕法の場合に懸念される翻訳反応を阻害するような物質の持込みもない。
【００１２】
本発明の調製方法では、抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させることを要する。本発明の調製方法において、「急激に凍結」とは、１０秒以下、好ましくは２秒以下にて、哺乳動物培養細胞を凍結させることを指す。本発明において、哺乳動物培養細胞の凍結を急激に行わなかった場合には、タンパク質合成に必須な成分が不活化する虞があるため、本発明の上記効果を達成することができない。
【００１３】
上記のように哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる温度としては、通常−８０℃以下であり、好ましくは−１５０℃以下である。−８０℃を越える温度で急激に凍結させると、タンパク質合成に必須な成分が失活してタンパク質合成能が低下してしまう傾向にあるためである。
【００１４】
上記哺乳動物培養細胞の急激な凍結は、たとえば、液体窒素や液体ヘリウムなどの不活性ガスを使用することなどによって実現できるが、入手が容易であり安価な液体窒素を用いて行うのが好ましい。
【００１５】
本発明の調製方法においては、哺乳動物培養細胞からの抽出に際して、抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有しているならば、その他の工程について特に制限はない。たとえば、乳鉢中で乳棒を用いてすり潰す方法、ダウンスホモジナイザーを用いる方法、ガラスビーズを用いる方法など、大腸菌や小麦胚芽などから無細胞系タンパク質合成用の抽出液を得る際に従来より行われていた種々の手法にて哺乳動物培養細胞を破砕し、抽出を行ってもよいが、哺乳動物培養細胞は、大腸菌や小麦胚芽などから無細胞系タンパク質合成用の抽出液を得る場合と比較して細胞の破砕が容易であり、さらには、この凍結・解凍によるだけの破砕法により得られた抽出液にはタンパク質合成に必須な成分が活性を保持した状態で含まれているという理由によりタンパク質合成能の高い抽出液を得ることができるという利点もあることから、上記哺乳動物培養細胞を急激に凍結させた後、解凍し、遠心分離することによって哺乳動物培養細胞を破砕するのが好ましい。
【００１６】
上記急激に凍結した哺乳動物培養細胞を、解凍した後、遠心分離する場合、解凍は、たとえば−１０℃〜２０℃の水浴または氷水浴中での解凍、室温（２５℃）にての放置などによって実現できるが、タンパク質合成に必須な成分の失活を防止し、タンパク質合成能の低下を確実に防ぐことから、０℃〜２０℃（特には、４℃〜１０℃）の水浴または氷水浴中で解凍を行うのが好ましい。
【００１７】
解凍した哺乳動物培養細胞の遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行えばよい。
【００１８】
本発明に用いる哺乳動物培養細胞としては、特に制限はなく、たとえば、ヒト、ラット、マウス、サルなどの従来公知の適宜の哺乳動物由来の培養細胞を使用することができる。
【００１９】
また、本発明における哺乳動物培養細胞としては、いかなる組織由来の細胞であってもよく、たとえば、血球細胞、生殖巣由来細胞、リンパ腫（リンホーマ）由来細胞、その他の腫瘍細胞、幹細胞などを特に制限なく使用することができる。中でも浮遊培養が可能であるため、培養および継代が容易であることから、リンパ腫由来細胞を使用するのが好ましい。また、ＣＨＯ細胞は、浮遊培養が可能であるだけでなく、無血清培地にて培養が可能であり、より培養および継代が容易である。さらに、細胞系において広く利用され、高いタンパク質合成能を有しており、無細胞系においても同様のことが期待できることから、ＣＨＯ細胞を使用するのが好ましい。
【００２０】
なお本発明においては、単一種の哺乳動物における単一の組織由来の哺乳動物培養細胞に限らず、単一種の哺乳動物における複数種の組織由来の哺乳動物培養細胞より抽出を行ってもよく、複数種の哺乳動物における単一の組織由来の哺乳動物培養細胞より抽出を行ってもよく、無論、複数種の哺乳動物における複数種の組織由来の哺乳動物培養細胞より抽出を行ってもよい。
【００２１】
本発明の調製方法に用いられる抽出用液は、特に制限されるものではないが、プロテアーゼインヒビターを少なくとも含有するのが好ましい。プロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液を用いると、哺乳動物培養細胞由来の抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパクの不所望な分解を防止でき、結果として哺乳動物培養細胞由来の抽出物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すことができるようになるという利点がある。
【００２２】
上記プロテアーゼインヒビターとしては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるならば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがある。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エチレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用することができるが、哺乳動物培養細胞由来の抽出液にはセリンプロテアーゼが含まれることから、上記中でもセリンプロテアーゼに対して特異性の高いインヒビターとして働くＰＭＳＦを使用するのが好ましい。また、１種類のプロテアーゼインヒビターのみならず、数種類の混合物（プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いてもよい。
【００２３】
当該抽出用液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特に制限はないが、本発明の作用に必須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００２４】
また本発明に用いる抽出用液は、上記プロテアーゼインヒビターに加えて、カリウム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトールおよび緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。
【００２５】
上記カリウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００２６】
当該抽出用液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、２０ｍＭ〜３００ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２７】
上記マグネシウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００２８】
当該抽出用液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２９】
上記ジチオトレイトール（以下、「ＤＴＴ」ということがある。）は、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該抽出用液中において０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３０】
上記緩衝剤は、緩衝能を付与し、抽出用液による抽出により調製された抽出液（＝抽出用液＋抽出物）において、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こるｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては、特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。
【００３１】
緩衝剤は、得られた抽出液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６〜８．５に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８．５）を使用するのが特に好ましい。
【００３２】
当該抽出用液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、これを用いて調製した抽出液において抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３３】
さらに、抽出用液においては、得られる抽出液のタンパク質合成能向上を目的として、カルシウム塩およびグリセロールがさらに添加されたものであるのが好ましい。カルシウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、例えば、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウム、クエン酸カルシウム、ヨウ化カルシウム、乳酸カルシウム、硝酸カルシウム、シュウ酸カルシウムなど、一般的な形態で使用することができ、中でも塩化カルシウムを使用するのが好ましい。この場合、塩化カルシウムの含有量は特に制限されないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。また、グリセロールの添加量についても特に制限されるものではないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、５（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのが好ましく、１０（ｖ／ｖ）％〜５０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのがより好ましい。
【００３４】
本発明の哺乳動物培養細胞抽出液の調製方法において、細胞破砕後から、無細胞系タンパク質合成用の哺乳動物培養細胞抽出液を得るまでの手順等については特に制限されるものではない。
たとえば、抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる工程の後に、解凍し、遠心分離する場合には、この遠心分離後の上清（上清１）をそのまま哺乳動物培養細胞抽出液としてもよいし、また、上清１をさらに遠心分離して、得られた上清（上清２）を哺乳動物培養細胞抽出液としてもよい。上記上清１の遠心分離の条件としては、上述したのと同様の条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行えばよい。
【００３５】
なお上述のようにそれぞれ調製した後に、ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分付近を分取して抽出液として調製するようにしてもよい。しかしながらタンパク質の合成効率の観点からは、当該ゲル濾過および画分の分取を経ずに抽出液として調製するのが好ましい。
【００３６】
なお、上記ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分付近を分取する場合には、具体的には以下の手順にて行えばよい。
【００３７】
たとえば脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記抽出用液にて溶出する、というような条件にて行う。上記ゲル濾過用緩衝液としては、従来公知の適宜の組成のものを特に制限なく使用することができ、たとえば、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８．５）、２０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦを含有するゲル濾過用緩衝液を用いることができる。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
【００３８】
次に、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する。当該処理は、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャム バイオサイエンス社製）などの機器を用いて、各画分について上記２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、この吸光度が最も高い画分付近を分取し、これを抽出液とする。
【００３９】
なお、本発明の調製方法に供する哺乳動物培養細胞は、培養に用いる培地の翻訳反応液への持込みを避けるため、上記急激な凍結を行う前に、洗浄液にて予め洗浄しておくのが好ましい。洗浄液の組成としては、上述した抽出用液と同様の組成のものであればよい。洗浄液での洗浄は、哺乳動物培養細胞に洗浄液を添加し、これを遠心分離（たとえば、７００×ｇ、１０分間、４℃という条件）することによって行う。
【００４０】
洗浄に用いる洗浄液の量は、培地を完全に洗い流すという理由から、湿重量１ｇの哺乳動物培養細胞に対し５ｍＬ〜１００ｍＬであるのが好ましく、１０ｍＬ〜５０ｍＬであるのがより好ましい。
洗浄回数は、１回〜５回行うのが好ましく、２回〜４回行うのがより好ましい。
【００４１】
また本発明の調製方法に供する哺乳動物培養細胞の量は、特に制限されるものではないが、抽出効率を最適に保つため、抽出用液１ｍＬに対して０．１ｇ〜５ｇであるのが好ましく、０．５ｇ〜２ｇであるのがより好ましい。
【００４２】
本発明の方法にて調製された哺乳動物培養細胞抽出液は、無細胞系タンパク質合成用として好適に使用することができる。哺乳動物培養細胞抽出液は、哺乳動物培養細胞由来の抽出物をタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ含有することが好ましく、１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ含有することがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、本発明の作用に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを越えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しづらい虞があるためである。
【００４３】
該抽出液中の哺乳動物培養細胞由来の抽出物の含有量は、タンパク質濃度を測定することで決定され、たとえば、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、タンパク質濃度を測定することによって決定される。具体的には、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用し、検量線を作成する。このような手法により測定することができる。
【００４４】
また抽出液中に含有される抽出物が哺乳動物培養細胞由来のものであるか否かは、たとえば、抽出液中のリボソームＲＮＡの塩基配列解析を行うことによって判別することができる。
【００４５】
本発明の抽出液は、哺乳動物培養細胞由来の抽出物をタンパク質濃度で１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ含有するとともに、２０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８．５）を含有するように実現されるのが好ましい。また上記に加えて、さらに０．５ｍＭ〜５ｍＭの塩化カルシウム塩および１０（ｖ／ｖ）％〜５０（ｖ／ｖ）％のグリセロールを含有することが好ましい。
【００４６】
本発明はまた、上記抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供するものである。本発明の方法にて得られた抽出液を用いてタンパク質合成反応を行うことによって、如何なるタンパク質、例えば生細胞で細胞毒となるタンパク質であっても、短時間にて合成することが可能となる。また、真核生物である哺乳動物培養細胞由来の抽出物を用いているため、糖タンパク質を無細胞系で合成することも可能であり、特に制限されることなく多くの種類のタンパク質を合成することができる。なお本発明における無細胞系タンパク質合成反応は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系のみによるタンパク質合成反応を指す。
【００４７】
本発明の方法で得られる抽出液を用いて調製される無細胞系タンパク質合成反応液の組成に特に制限はなく、従来公知の組成を適宜選択すればよいが、上記抽出液が１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有されるように調製されるのが好ましい。すなわち、上記反応液の全体において、哺乳動物培養細胞由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、目的のタンパク質の合成速度が低下する虞があるためである。
【００４８】
無細胞系タンパク質合成反応液は、本発明の方法で得られた抽出液を除く成分として、外来ｍＲＮＡ、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。かかる反応液を使用して翻訳反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
【００４９】
上記反応液に用いる外来ｍＲＮＡとは、抽出液を調製するのに用いた哺乳動物培養細胞に由来しないｍＲＮＡを指し、かかる哺乳動物培養細胞に由来しないｍＲＮＡであるならば、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、毒性を有するタンパク質をコードするものであってもよいし、また糖タンパク質をコードするものであってもよい。なお、反応液に含有されるｍＲＮＡが外来ｍＲＮＡであるか抽出液を調製するのに用いた哺乳動物培養細胞に由来するｍＲＮＡであるかは、まず、反応液中より、ｍＲＮＡを単離精製後、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、既知の外来ｍＲＮＡの塩基配列と比較することで判別することができる。
【００５０】
なお反応液に用いる外来ｍＲＮＡは、その塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならばｍＲＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各ｍＲＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
【００５１】
本発明に用いる外来ｍＲＮＡは、市販のものでもよいし、目的とするタンパク質のＯＲＦ（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を市販のベクター、たとえば、ｐＴＮＴ、Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）の５'−βグロビンリーダー配列の下流に挿入し、これを用いて転写反応で得られたｍＲＮＡを用いても構わない。また、転写反応の際にメチル化されたリボヌクレオチドなどを加えることにより付加されたキャップ構造を有する外来ｍＲＮＡを用いてもよい。
【００５２】
反応液中において、外来ｍＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点から、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。外来ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５３】
当該反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、２０ｍＭ〜３００ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５４】
当該反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５５】
当該反応液中におけるＤＴＴは、上述した抽出用液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
当該反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５６】
当該反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５７】
当該反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５８】
当該反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５９】
当該反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
【００６０】
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６１】
当該反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在する哺乳動物培養細胞由来のＲＮａｓｅによって、本発明の無細胞系タンパク質合成の際に外来ｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、０．５Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６２】
当該反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００６３】
反応液に含有される緩衝剤としては、上述した本発明の抽出液と同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８．５）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出液における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６４】
さらに、反応液においては、翻訳反応速度を向上させる目的で、スペルミジンがさらに添加されたものであるのが好ましい。スペルミジンは、反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。スペルミジンが０．０１ｍＭ未満であると、十分な翻訳促進能が認められない傾向にあるためであり、また、スペルミジンが１０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６５】
さらに、反応液においては、カルシウム塩がさらに添加されたものであるのが好ましい。カルシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカルシウム塩、好適には、塩化カルシウム、を好ましく使用できる。カルシウム塩は、上述した抽出用液におけるカルシウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６６】
すなわち、本発明の方法で得られた抽出液を使用した反応液としては、当該抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、２０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、０．５Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８．５）を含有するように実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．０５ｍＭ〜５ｍＭのスペルミジン、０．１ｍＭ〜５ｍＭの塩化カルシウムを含有するように実現されるのがより好ましい。
【００６７】
上記反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応は、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。反応の時間は、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００６８】
また、反応を行う前に、抽出液にｍＲＮＡ以外の反応液組成の成分を加えた状態において、一定時間保温を行うのが好ましい。保温は、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。保温時間は、通常、０℃〜５０℃、好ましくは１５℃〜３７℃の範囲である。保温温度が０℃未満であると保温の効果が得られにくく、また保温温度が５０℃を超えると必須な成分が変性する傾向にあるためである。保温の時間は、通常、１分〜１２０分、好ましくは、１０分〜６０分である。
【００６９】
上記反応液を使用して合成できるタンパク質に特に制限はない。合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。
本発明の無細胞系のタンパク質合成方法にて合成できるタンパク質に特に制限はない。
【実施例】
【００７０】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
参考例１：哺乳動物培養細胞（リンパ腫由来）の培養
細胞数２．１×１０６個の哺乳動物培養細胞Ｌ５１７８Ｙ−Ｓ（東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより分譲）を、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）が入った培養フラスコ（２１００ｃｍ２）内で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で７０時間培養した。その結果、細胞数４．２×１０８個、湿重量０．５７ｇとなった。
【００７１】
実施例１：哺乳動物培養細胞（リンパ腫由来）抽出液の調製
まず、上記参考例１で培養した動物培養細胞を遠心分離（７００×ｇ、１０分間）により収集し、下記組成の洗浄液で３回洗浄（７００×ｇ、１０分間の条件で遠心分離）した。
〔洗浄液の組成〕
・５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
その後、上記組成の洗浄液に０．５７ｍＬの０．５ｍＭ ＰＭＳＦおよび２０％グリセロールを添加して調製した抽出用液（４℃に冷却）に、懸濁した。
この懸濁液を液体窒素中にて急激に（２秒）凍結させた。充分に凍結させた後、約１０℃の水浴中で解凍した。完全に解凍した後、４℃、３０，０００×ｇで１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）して残渣を取除き、上清を回収した。得られた上清をさらに遠心分離（４℃、３０，０００×ｇ、３０分間）した後に回収した上清を、哺乳動物培養細胞抽出液とした。
【００７２】
参考例２：外来ｍＲＮＡの作製
（１）ベクターＤＮＡの構築
ｐＧＥＭ−ｌｕｃ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）５ｎｇを鋳型とし、配列表配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ）と、配列表配列番号２に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９７℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行った。エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を精製した後、ＫｐｎＩで消化した。これとは別に、ｐＴＮＴ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）をＫｐｎＩで消化した。これらの反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いてＤＮＡ断片を精製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて、これらのＤＮＡ断片をライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５α（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換した大腸菌からアルカリ−ＳＤＳ法により調製したプラスミドＤＮＡを、配列表配列番号３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）およびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてシークエンシング反応（９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分、３０サイクル）を行った。この反応液をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、塩基配列解析を行った。ｐＴＮＴ Ｖｅｃｔｏｒ由来の５'−βグロビンリーダー配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンが挿入されたプラスミドをｐＴＮＴ−Ｌｕｃと命名した。
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応
上記（１）で作製したｐＴＮＴ−ＬｕｃをＢａｍＨＩで消化した後、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。得られたＤＮＡ断片１μｇを鋳型として、ＲｉｂｏＭａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）を用い２０μｌスケールで３７℃４時間ｍＲＮＡを合成した。
（３）外来ｍＲＮＡの精製
上記転写反応後の反応液２０μＬに、１ＵのＲＱ１ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を添加し、３７℃、１５分間インキュベートし、鋳型ＤＮＡを消化した。フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１００μＬの滅菌水に溶解し、Ｎｉｃｋ Ｃｏｌｕｍｎ（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした。滅菌水４００μＬで溶出を行った。溶出画分を回収し、酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。合成されたｍＲＮＡの定量は、２６０ｎｍの吸光度を測定して行った。
【００７３】
実験例１：哺乳動物培養細胞（リンパ腫由来）抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成
実施例１で調製した哺乳動物培養細胞抽出液、および参考例２で合成した外来ｍＲＮＡを用いて、下記組成の反応液を調製し、無細胞系でのタンパク質合成を行った。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 哺乳動物培養細胞抽出液
・２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１５０ｍＭ 酢酸カリウム
・１ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．１ｍＭ ＧＴＰ
・２０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・０．２５ｍＭ スペルミジン
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ（酵母由来）
・２４０μｇ／ｍＬ 外来ｍＲＮＡ
・１０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００を用いた。反応液量は２５μＬ、反応温度は２０℃とし、反応時間ごとにサンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ量を測定した。合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
結果、反応開始１時間で約０．５μｇ／ｍＬの無細胞系タンパク質合成に成功した。
【００７４】
比較例１
参考例１と同様にして培養した哺乳動物培養細胞Ｌ５１７８Ｙ−Ｓを、実施例１と同様の洗浄液で洗浄した後、実施例１と同様の４℃に冷却した抽出用液に懸濁した。その後、５分間激しく攪拌して抽出を行った以外は、実施例１と同様の操作で行った。無細胞系タンパク質合成反応は、参考例２で作製したｍＲＮＡを用いて、実験例１と同様の反応液組成で行った。
結果、ルシフェラーゼは１０ｎｇ／ｍＬと、実験例１の約５０分の１程度であった。
【００７５】
参考例３：哺乳動物培養細胞（ＣＨＯ）の培養
細胞濃度４．９×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬのチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ Ｋ１−ＳＦＭ（東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センターより分譲）をＣＨＯ ＳＥＲＵＭ−ＦＲＥＥ ＭＥＤＩＵＭ（ＳＩＧＭＡ社製）２００ｍＬが入った三角フラスコ（５００ｍＬ）内で１３０ｒｐｍ・３７℃・５％ＣＯ２雰囲気下で１２０時間培養した。その結果、細胞濃度８．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、湿重量３．２ｇとなった。
【００７６】
実施例２：哺乳動物培養細胞（ＣＨＯ）抽出液の調製
まず、上記参考例３で培養した動物培養細胞を遠心分離（７００×ｇ、１０分間）により収集し、下記組成の洗浄用緩衝液で３回洗浄（７００×ｇ、１０分間の条件で遠心分離）した。
〔洗浄用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
その後、重量を測定し、細胞１ｇあたり０．８ｍＬの下記組成の抽出用緩衝液を添加し、細胞を懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・２０％（ｖ／ｖ） グリセロール
・１ｍＭ ＤＴＴ
この細胞懸濁液を液体窒素中にて急激に凍結させた。十分に凍結させた後、約４℃の氷浴中で解凍した。完全に解凍した後、４℃、３００００×ｇで１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃ ＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）して細胞残渣を取り除き、上清Ｓ１を回収した。得られた上清Ｓ１をさらに遠心分離（４℃、３００００×ｇ、３０分間）した後に上清Ｓ２を回収した。この上清Ｓ２を下記組成の脱塩用緩衝液にて平衡化したＰＤ−１０（アマシャム社製）にアプライした。アプライした後、脱塩用バッファーにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分を回収し、哺乳動物培養細胞（ＣＨＯ）抽出液とした。
〔脱塩用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
【００７７】
実験例２：哺乳動物培養細胞（ＣＨＯ）抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成
実施例２で調製した哺乳動物培養細胞（ＣＨＯ）抽出液は、まず下記組成のうち反応液組成における外来ｍＲＮＡ以外の成分と混合し、２５℃で３０分間保温した。その後、参考例２で合成した外来ｍＲＮＡを添加し、無細胞系でのタンパク質合成を行った。
〔反応液の組成〕
・５０％〔Ｖ／Ｖ〕 哺乳動物培養細胞抽出液
・５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１７５ｍＭ 酢酸カリウム
・１ｍＭ 酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ 塩化カルシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．２５ｍＭ ＧＴＰ
・３０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・８０μＭ アミノ酸（２０種）
・１６０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ（ルシフェラーゼ遺伝子をコード）
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）をそれぞれ用いた。反応装置としては低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００を用いた。反応液量は２５μＬ、反応温度は２５℃とし、反応時間ごとにサンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ量を測定した。合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。その結果、反応開始２時間後のタンパク質合成量は約２７μｇ／ｍＬ（図１■）と、タンパク質合成を行う前の保温（２５℃、３０分間）を行わない場合（図１□）より著しく向上した。
【００７８】
以上の説明で明らかなように、本発明によれば、調製が容易であり、かつ従来よりもタンパク質合成量の高い無細胞系タンパク質合成用哺乳動物培養細胞抽出液の調製方法、および該哺乳動物培養細胞抽出液、ならびにこの哺乳動物培養細胞を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供することができる。
【００７９】
なお、配列表フリーテキスト（人工配列の記載（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ））において、配列番号１はプライマーＬｕｃ Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎであり、配列番号２はプライマーＬｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎであり、配列番号３はプライマーＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒである。
【０００１】
本発明は、哺乳動物培養細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法、ならびに上記抽出液の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単に合成することが必要となってくる。
【０００３】
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって酵母や哺乳動物培養細胞などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。
【０００４】
一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系を試験管内に取り揃え、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質合成では、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法であると期待されている。このような無細胞系のタンパク質合成に供する細胞破砕液や抽出液として、種々の生物由来のものを使用することが検討され、研究が進められている。
【０００５】
無細胞系タンパク質合成用抽出液としては、従来より様々なものが知られているが、翻訳後の糖鎖修飾などを考慮すると、ヒトタンパク質を完全な活性を保持した状態で発現させ得るため、ヒト細胞により近縁な哺乳動物培養細胞由来の抽出液であることが望ましいと考えられる。現在、哺乳動物培養細胞由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液としては、ウサギ網状赤血球の系（たとえば、非特許文献１：Ｐｅｌｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，２４７−２５６（１９７６）参照）、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）の系（たとえば、特許文献１：特開２０００−３２５０７６号公報参照）が報告されている。
【０００６】
しかしながら、ウサギ網状赤血球の系では、ウサギにアセチルフェニルヒドラジン溶液を皮下注射し、投与４〜５日後にウサギの耳から採血し、そこからライセートを調製するという非常に煩雑な操作を伴う。また、ＣＨＯの系では、不活性ガスの雰囲気中、加圧下のＣＨＯを減圧させることによって細胞を破砕して、その抽出液を調製するが、この方法では、抽出液の作製に際し特別な装置や器具が必要である。さらに、抽出液調製時の細胞数やガス圧、加圧時間によって無細胞系でのタンパク質合成能が大きく影響されるため、条件設定に煩雑な操作を要する。また、かかる方法によって得られた抽出液では、合成できるタンパク質の量は極めて少なく、放射能標識を行ったアミノ酸の取り込みによってのみ、そのタンパク質合成活性を測定できるという程度である。
【０００７】
このため、調製が容易であり、かつタンパク質合成量の高い哺乳動物培養細胞由来抽出液およびその調製方法の開発が望まれている。
【発明の開示】
【０００８】
発明の目的
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、調製が容易であり、かつ従来よりもタンパク質合成量の高い無細胞系タンパク質合成用の哺乳動物培養細胞抽出液の調製方法、および該哺乳動物培養細胞抽出液、ならびにこの哺乳動物培養細胞抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供することである。
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有し、さらに、急激に凍結させた哺乳動物培養細胞を、−１０℃〜２０℃で解凍させる工程を含有する方法で調整された哺乳動物培養細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法。
（２）急激な凍結が、液体窒素によって行われるものである、（１）に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（３）前記解凍が、水浴または氷水浴中で解凍されたものである、（１）または（２）に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（４）抽出用液がプロテアーゼインヒビターを含有するものである、（１）〜（３）のうちのいずれかに記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（５）哺乳動物培養細胞が、リンパ腫由来の培養細胞である、（１）〜（４）のうちのいずれかに記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（６）哺乳動物培養細胞が、生殖巣由来の培養細胞である、（１）〜（４）のうちのいずれかに記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（７）哺乳動物培養細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来の培養細胞である、（６）に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（８）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）が、ＣＨＯ Ｋ１−ＳＦＭ由来である、（７）に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図１は、実施例２の実験結果を示すグラフであり、合成量に対する保温工程（合成反応を行う前、無細胞系タンパク質合成反応液に外来ｍＲＮＡ以外の成分を含んだ状態での一定時間の保温）の有無の影響を示す。
図２は、実施例２の実験結果を示すグラフであり、合成量に対する、保温工程の反応液組成及び保持時間の影響を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、哺乳動物培養細胞から抽出を行って哺乳動物培養細胞抽出液を調製する方法であって、抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有することをその大きな特徴とするものである。このような方法によって哺乳動物培養細胞抽出液を調製することで、上記特許文献１に記載の従来の手法と比較して、より緩和な状態で細胞の破砕を行うことができ、無細胞系タンパク質合成に必須な成分を破壊することなく細胞外に取り出すことができるので、従来よりも無細胞系にてタンパク質の合成量の高い哺乳動物培養細胞抽出液を容易に調製することができる。さらに本発明の方法によれば、使用器具などからのＲＮａｓｅなどの混入も防ぐことができ、また、界面活性剤などの試薬を用いた細胞破砕法の場合に懸念される翻訳反応を阻害するような物質の持込みもない。
【００１２】
本発明の調製方法では、抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させることを要する。本発明の調製方法において、「急激に凍結」とは、１０秒以下、好ましくは２秒以下にて、哺乳動物培養細胞を凍結させることを指す。本発明において、哺乳動物培養細胞の凍結を急激に行わなかった場合には、タンパク質合成に必須な成分が不活化する虞があるため、本発明の上記効果を達成することができない。
【００１３】
上記のように哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる温度としては、通常−８０℃以下であり、好ましくは−１５０℃以下である。−８０℃を越える温度で急激に凍結させると、タンパク質合成に必須な成分が失活してタンパク質合成能が低下してしまう傾向にあるためである。
【００１４】
上記哺乳動物培養細胞の急激な凍結は、たとえば、液体窒素や液体ヘリウムなどの不活性ガスを使用することなどによって実現できるが、入手が容易であり安価な液体窒素を用いて行うのが好ましい。
【００１５】
本発明の調製方法においては、哺乳動物培養細胞からの抽出に際して、抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有しているならば、その他の工程について特に制限はない。たとえば、乳鉢中で乳棒を用いてすり潰す方法、ダウンスホモジナイザーを用いる方法、ガラスビーズを用いる方法など、大腸菌や小麦胚芽などから無細胞系タンパク質合成用の抽出液を得る際に従来より行われていた種々の手法にて哺乳動物培養細胞を破砕し、抽出を行ってもよいが、哺乳動物培養細胞は、大腸菌や小麦胚芽などから無細胞系タンパク質合成用の抽出液を得る場合と比較して細胞の破砕が容易であり、さらには、この凍結・解凍によるだけの破砕法により得られた抽出液にはタンパク質合成に必須な成分が活性を保持した状態で含まれているという理由によりタンパク質合成能の高い抽出液を得ることができるという利点もあることから、上記哺乳動物培養細胞を急激に凍結させた後、解凍し、遠心分離することによって哺乳動物培養細胞を破砕するのが好ましい。
【００１６】
上記急激に凍結した哺乳動物培養細胞を、解凍した後、遠心分離する場合、解凍は、たとえば−１０℃〜２０℃の水浴または氷水浴中での解凍、室温（２５℃）にての放置などによって実現できるが、タンパク質合成に必須な成分の失活を防止し、タンパク質合成能の低下を確実に防ぐことから、０℃〜２０℃（特には、４℃〜１０℃）の水浴または氷水浴中で解凍を行うのが好ましい。
【００１７】
解凍した哺乳動物培養細胞の遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行えばよい。
【００１８】
本発明に用いる哺乳動物培養細胞としては、特に制限はなく、たとえば、ヒト、ラット、マウス、サルなどの従来公知の適宜の哺乳動物由来の培養細胞を使用することができる。
【００１９】
また、本発明における哺乳動物培養細胞としては、いかなる組織由来の細胞であってもよく、たとえば、血球細胞、生殖巣由来細胞、リンパ腫（リンホーマ）由来細胞、その他の腫瘍細胞、幹細胞などを特に制限なく使用することができる。中でも浮遊培養が可能であるため、培養および継代が容易であることから、リンパ腫由来細胞を使用するのが好ましい。また、ＣＨＯ細胞は、浮遊培養が可能であるだけでなく、無血清培地にて培養が可能であり、より培養および継代が容易である。さらに、細胞系において広く利用され、高いタンパク質合成能を有しており、無細胞系においても同様のことが期待できることから、ＣＨＯ細胞を使用するのが好ましい。
【００２０】
なお本発明においては、単一種の哺乳動物における単一の組織由来の哺乳動物培養細胞に限らず、単一種の哺乳動物における複数種の組織由来の哺乳動物培養細胞より抽出を行ってもよく、複数種の哺乳動物における単一の組織由来の哺乳動物培養細胞より抽出を行ってもよく、無論、複数種の哺乳動物における複数種の組織由来の哺乳動物培養細胞より抽出を行ってもよい。
【００２１】
本発明の調製方法に用いられる抽出用液は、特に制限されるものではないが、プロテアーゼインヒビターを少なくとも含有するのが好ましい。プロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液を用いると、哺乳動物培養細胞由来の抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパクの不所望な分解を防止でき、結果として哺乳動物培養細胞由来の抽出物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すことができるようになるという利点がある。
【００２２】
上記プロテアーゼインヒビターとしては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるならば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがある。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エチレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用することができるが、哺乳動物培養細胞由来の抽出液にはセリンプロテアーゼが含まれることから、上記中でもセリンプロテアーゼに対して特異性の高いインヒビターとして働くＰＭＳＦを使用するのが好ましい。また、１種類のプロテアーゼインヒビターのみならず、数種類の混合物（プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いてもよい。
【００２３】
当該抽出用液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特に制限はないが、本発明の作用に必須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００２４】
また本発明に用いる抽出用液は、上記プロテアーゼインヒビターに加えて、カリウム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトールおよび緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。
【００２５】
上記カリウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００２６】
当該抽出用液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、２０ｍＭ〜３００ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２７】
上記マグネシウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００２８】
当該抽出用液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２９】
上記ジチオトレイトール（以下、「ＤＴＴ」ということがある。）は、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該抽出用液中において０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３０】
上記緩衝剤は、緩衝能を付与し、抽出用液による抽出により調製された抽出液（＝抽出用液＋抽出物）において、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こるｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては、特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。
【００３１】
緩衝剤は、得られた抽出液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６〜８．５に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８．５）を使用するのが特に好ましい。
【００３２】
当該抽出用液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、これを用いて調製した抽出液において抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３３】
さらに、抽出用液においては、得られる抽出液のタンパク質合成能向上を目的として、カルシウム塩およびグリセロールがさらに添加されたものであるのが好ましい。カルシウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、例えば、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウム、クエン酸カルシウム、ヨウ化カルシウム、乳酸カルシウム、硝酸カルシウム、シュウ酸カルシウムなど、一般的な形態で使用することができ、中でも塩化カルシウムを使用するのが好ましい。この場合、塩化カルシウムの含有量は特に制限されないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。また、グリセロールの添加量についても特に制限されるものではないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、５（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのが好ましく、１０（ｖ／ｖ）％〜５０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのがより好ましい。
【００３４】
本発明の哺乳動物培養細胞抽出液の調製方法において、細胞破砕後から、無細胞系タンパク質合成用の哺乳動物培養細胞抽出液を得るまでの手順等については特に制限されるものではない。
たとえば、抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる工程の後に、解凍し、遠心分離する場合には、この遠心分離後の上清（上清１）をそのまま哺乳動物培養細胞抽出液としてもよいし、また、上清１をさらに遠心分離して、得られた上清（上清２）を哺乳動物培養細胞抽出液としてもよい。上記上清１の遠心分離の条件としては、上述したのと同様の条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行えばよい。
【００３５】
なお上述のようにそれぞれ調製した後に、ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分付近を分取して抽出液として調製するようにしてもよい。しかしながらタンパク質の合成効率の観点からは、当該ゲル濾過および画分の分取を経ずに抽出液として調製するのが好ましい。
【００３６】
なお、上記ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分付近を分取する場合には、具体的には以下の手順にて行えばよい。
【００３７】
たとえば脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記抽出用液にて溶出する、というような条件にて行う。上記ゲル濾過用緩衝液としては、従来公知の適宜の組成のものを特に制限なく使用することができ、たとえば、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８．５）、２０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦを含有するゲル濾過用緩衝液を用いることができる。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
【００３８】
次に、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する。当該処理は、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャム バイオサイエンス社製）などの機器を用いて、各画分について上記２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、この吸光度が最も高い画分付近を分取し、これを抽出液とする。
【００３９】
なお、本発明の調製方法に供する哺乳動物培養細胞は、培養に用いる培地の翻訳反応液への持込みを避けるため、上記急激な凍結を行う前に、洗浄液にて予め洗浄しておくのが好ましい。洗浄液の組成としては、上述した抽出用液と同様の組成のものであればよい。洗浄液での洗浄は、哺乳動物培養細胞に洗浄液を添加し、これを遠心分離（たとえば、７００×ｇ、１０分間、４℃という条件）することによって行う。
【００４０】
洗浄に用いる洗浄液の量は、培地を完全に洗い流すという理由から、湿重量１ｇの哺乳動物培養細胞に対し５ｍＬ〜１００ｍＬであるのが好ましく、１０ｍＬ〜５０ｍＬであるのがより好ましい。
洗浄回数は、１回〜５回行うのが好ましく、２回〜４回行うのがより好ましい。
【００４１】
また本発明の調製方法に供する哺乳動物培養細胞の量は、特に制限されるものではないが、抽出効率を最適に保つため、抽出用液１ｍＬに対して０．１ｇ〜５ｇであるのが好ましく、０．５ｇ〜２ｇであるのがより好ましい。
【００４２】
本発明の方法にて調製された哺乳動物培養細胞抽出液は、無細胞系タンパク質合成用として好適に使用することができる。哺乳動物培養細胞抽出液は、哺乳動物培養細胞由来の抽出物をタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ含有することが好ましく、１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ含有することがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、本発明の作用に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを越えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しづらい虞があるためである。
【００４３】
該抽出液中の哺乳動物培養細胞由来の抽出物の含有量は、タンパク質濃度を測定することで決定され、たとえば、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、タンパク質濃度を測定することによって決定される。具体的には、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用し、検量線を作成する。このような手法により測定することができる。
【００４４】
また抽出液中に含有される抽出物が哺乳動物培養細胞由来のものであるか否かは、たとえば、抽出液中のリボソームＲＮＡの塩基配列解析を行うことによって判別することができる。
【００４５】
本発明の抽出液は、哺乳動物培養細胞由来の抽出物をタンパク質濃度で１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ含有するとともに、２０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８．５）を含有するように実現されるのが好ましい。また上記に加えて、さらに０．５ｍＭ〜５ｍＭの塩化カルシウム塩および１０（ｖ／ｖ）％〜５０（ｖ／ｖ）％のグリセロールを含有することが好ましい。
【００４６】
本発明はまた、上記抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供するものである。本発明の方法にて得られた抽出液を用いてタンパク質合成反応を行うことによって、如何なるタンパク質、例えば生細胞で細胞毒となるタンパク質であっても、短時間にて合成することが可能となる。また、真核生物である哺乳動物培養細胞由来の抽出物を用いているため、糖タンパク質を無細胞系で合成することも可能であり、特に制限されることなく多くの種類のタンパク質を合成することができる。なお本発明における無細胞系タンパク質合成反応は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系のみによるタンパク質合成反応を指す。
【００４７】
本発明の方法で得られる抽出液を用いて調製される無細胞系タンパク質合成反応液の組成に特に制限はなく、従来公知の組成を適宜選択すればよいが、上記抽出液が１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有されるように調製されるのが好ましい。すなわち、上記反応液の全体において、哺乳動物培養細胞由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、目的のタンパク質の合成速度が低下する虞があるためである。
【００４８】
無細胞系タンパク質合成反応液は、本発明の方法で得られた抽出液を除く成分として、外来ｍＲＮＡ、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。かかる反応液を使用して翻訳反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
【００４９】
上記反応液に用いる外来ｍＲＮＡとは、抽出液を調製するのに用いた哺乳動物培養細胞に由来しないｍＲＮＡを指し、かかる哺乳動物培養細胞に由来しないｍＲＮＡであるならば、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、毒性を有するタンパク質をコードするものであってもよいし、また糖タンパク質をコードするものであってもよい。なお、反応液に含有されるｍＲＮＡが外来ｍＲＮＡであるか抽出液を調製するのに用いた哺乳動物培養細胞に由来するｍＲＮＡであるかは、まず、反応液中より、ｍＲＮＡを単離精製後、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、既知の外来ｍＲＮＡの塩基配列と比較することで判別することができる。
【００５０】
なお反応液に用いる外来ｍＲＮＡは、その塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならばｍＲＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各ｍＲＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
【００５１】
本発明に用いる外来ｍＲＮＡは、市販のものでもよいし、目的とするタンパク質のＯＲＦ（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を市販のベクター、たとえば、ｐＴＮＴ、Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）の５'−βグロビンリーダー配列の下流に挿入し、これを用いて転写反応で得られたｍＲＮＡを用いても構わない。また、転写反応の際にメチル化されたリボヌクレオチドなどを加えることにより付加されたキャップ構造を有する外来ｍＲＮＡを用いてもよい。
【００５２】
反応液中において、外来ｍＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点から、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。外来ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５３】
当該反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、２０ｍＭ〜３００ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５４】
当該反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５５】
当該反応液中におけるＤＴＴは、上述した抽出用液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
当該反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５６】
当該反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５７】
当該反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５８】
当該反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５９】
当該反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
【００６０】
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６１】
当該反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在する哺乳動物培養細胞由来のＲＮａｓｅによって、本発明の無細胞系タンパク質合成の際に外来ｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、０．５Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６２】
当該反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００６３】
反応液に含有される緩衝剤としては、上述した本発明の抽出液と同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８．５）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出液における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６４】
さらに、反応液においては、翻訳反応速度を向上させる目的で、スペルミジンがさらに添加されたものであるのが好ましい。スペルミジンは、反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。スペルミジンが０．０１ｍＭ未満であると、十分な翻訳促進能が認められない傾向にあるためであり、また、スペルミジンが１０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６５】
さらに、反応液においては、カルシウム塩がさらに添加されたものであるのが好ましい。カルシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカルシウム塩、好適には、塩化カルシウム、を好ましく使用できる。カルシウム塩は、上述した抽出用液におけるカルシウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６６】
すなわち、本発明の方法で得られた抽出液を使用した反応液としては、当該抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、２０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、０．５Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８．５）を含有するように実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．０５ｍＭ〜５ｍＭのスペルミジン、０．１ｍＭ〜５ｍＭの塩化カルシウムを含有するように実現されるのがより好ましい。
【００６７】
上記反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応は、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。反応の時間は、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００６８】
また、反応を行う前に、抽出液にｍＲＮＡ以外の反応液組成の成分を加えた状態において、一定時間保温を行うのが好ましい。保温は、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。保温時間は、通常、０℃〜５０℃、好ましくは１５℃〜３７℃の範囲である。保温温度が０℃未満であると保温の効果が得られにくく、また保温温度が５０℃を超えると必須な成分が変性する傾向にあるためである。保温の時間は、通常、１分〜１２０分、好ましくは、１０分〜６０分である。
【００６９】
上記反応液を使用して合成できるタンパク質に特に制限はない。合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。
本発明の無細胞系のタンパク質合成方法にて合成できるタンパク質に特に制限はない。
【実施例】
【００７０】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
参考例１：哺乳動物培養細胞（リンパ腫由来）の培養
細胞数２．１×１０６個の哺乳動物培養細胞Ｌ５１７８Ｙ−Ｓ（東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより分譲）を、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）が入った培養フラスコ（２１００ｃｍ２）内で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で７０時間培養した。その結果、細胞数４．２×１０８個、湿重量０．５７ｇとなった。
【００７１】
実施例１：哺乳動物培養細胞（リンパ腫由来）抽出液の調製
まず、上記参考例１で培養した動物培養細胞を遠心分離（７００×ｇ、１０分間）により収集し、下記組成の洗浄液で３回洗浄（７００×ｇ、１０分間の条件で遠心分離）した。
〔洗浄液の組成〕
・５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
その後、上記組成の洗浄液に０．５７ｍＬの０．５ｍＭ ＰＭＳＦおよび２０％グリセロールを添加して調製した抽出用液（４℃に冷却）に、懸濁した。
この懸濁液を液体窒素中にて急激に（２秒）凍結させた。充分に凍結させた後、約１０℃の水浴中で解凍した。完全に解凍した後、４℃、３０，０００×ｇで１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）して残渣を取除き、上清を回収した。得られた上清をさらに遠心分離（４℃、３０，０００×ｇ、３０分間）した後に回収した上清を、哺乳動物培養細胞抽出液とした。
【００７２】
参考例２：外来ｍＲＮＡの作製
（１）ベクターＤＮＡの構築
ｐＧＥＭ−ｌｕｃ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）５ｎｇを鋳型とし、配列表配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ）と、配列表配列番号２に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９７℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行った。エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を精製した後、ＫｐｎＩで消化した。これとは別に、ｐＴＮＴ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）をＫｐｎＩで消化した。これらの反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いてＤＮＡ断片を精製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて、これらのＤＮＡ断片をライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５α（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換した大腸菌からアルカリ−ＳＤＳ法により調製したプラスミドＤＮＡを、配列表配列番号３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）およびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてシークエンシング反応（９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分、３０サイクル）を行った。この反応液をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、塩基配列解析を行った。ｐＴＮＴ Ｖｅｃｔｏｒ由来の５'−βグロビンリーダー配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンが挿入されたプラスミドをｐＴＮＴ−Ｌｕｃと命名した。
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応
上記（１）で作製したｐＴＮＴ−ＬｕｃをＢａｍＨＩで消化した後、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。得られたＤＮＡ断片１μｇを鋳型として、ＲｉｂｏＭａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）を用い２０μｌスケールで３７℃４時間ｍＲＮＡを合成した。
（３）外来ｍＲＮＡの精製
上記転写反応後の反応液２０μＬに、１ＵのＲＱ１ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を添加し、３７℃、１５分間インキュベートし、鋳型ＤＮＡを消化した。フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１００μＬの滅菌水に溶解し、Ｎｉｃｋ Ｃｏｌｕｍｎ（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした。滅菌水４００μＬで溶出を行った。溶出画分を回収し、酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。合成されたｍＲＮＡの定量は、２６０ｎｍの吸光度を測定して行った。
【００７３】
実験例１：哺乳動物培養細胞（リンパ腫由来）抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成
実施例１で調製した哺乳動物培養細胞抽出液、および参考例２で合成した外来ｍＲＮＡを用いて、下記組成の反応液を調製し、無細胞系でのタンパク質合成を行った。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 哺乳動物培養細胞抽出液
・２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１５０ｍＭ 酢酸カリウム
・１ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．１ｍＭ ＧＴＰ
・２０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・０．２５ｍＭ スペルミジン
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ（酵母由来）
・２４０μｇ／ｍＬ 外来ｍＲＮＡ
・１０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００を用いた。反応液量は２５μＬ、反応温度は２０℃とし、反応時間ごとにサンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ量を測定した。合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
結果、反応開始１時間で約０．５μｇ／ｍＬの無細胞系タンパク質合成に成功した。
【００７４】
比較例１
参考例１と同様にして培養した哺乳動物培養細胞Ｌ５１７８Ｙ−Ｓを、実施例１と同様の洗浄液で洗浄した後、実施例１と同様の４℃に冷却した抽出用液に懸濁した。その後、５分間激しく攪拌して抽出を行った以外は、実施例１と同様の操作で行った。無細胞系タンパク質合成反応は、参考例２で作製したｍＲＮＡを用いて、実験例１と同様の反応液組成で行った。
結果、ルシフェラーゼは１０ｎｇ／ｍＬと、実験例１の約５０分の１程度であった。
【００７５】
参考例３：哺乳動物培養細胞（ＣＨＯ）の培養
細胞濃度４．９×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬのチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ Ｋ１−ＳＦＭ（東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センターより分譲）をＣＨＯ ＳＥＲＵＭ−ＦＲＥＥ ＭＥＤＩＵＭ（ＳＩＧＭＡ社製）２００ｍＬが入った三角フラスコ（５００ｍＬ）内で１３０ｒｐｍ・３７℃・５％ＣＯ２雰囲気下で１２０時間培養した。その結果、細胞濃度８．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、湿重量３．２ｇとなった。
【００７６】
実施例２：哺乳動物培養細胞（ＣＨＯ）抽出液の調製
まず、上記参考例３で培養した動物培養細胞を遠心分離（７００×ｇ、１０分間）により収集し、下記組成の洗浄用緩衝液で３回洗浄（７００×ｇ、１０分間の条件で遠心分離）した。
〔洗浄用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
その後、重量を測定し、細胞１ｇあたり０．８ｍＬの下記組成の抽出用緩衝液を添加し、細胞を懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・２０％（ｖ／ｖ） グリセロール
・１ｍＭ ＤＴＴ
この細胞懸濁液を液体窒素中にて急激に凍結させた。十分に凍結させた後、約４℃の氷浴中で解凍した。完全に解凍した後、４℃、３００００×ｇで１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃ ＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）して細胞残渣を取り除き、上清Ｓ１を回収した。得られた上清Ｓ１をさらに遠心分離（４℃、３００００×ｇ、３０分間）した後に上清Ｓ２を回収した。この上清Ｓ２を下記組成の脱塩用緩衝液にて平衡化したＰＤ−１０（アマシャム社製）にアプライした。アプライした後、脱塩用バッファーにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分を回収し、哺乳動物培養細胞（ＣＨＯ）抽出液とした。
〔脱塩用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
【００７７】
実験例２：哺乳動物培養細胞（ＣＨＯ）抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成
実施例２で調製した哺乳動物培養細胞（ＣＨＯ）抽出液は、まず下記組成のうち反応液組成における外来ｍＲＮＡ以外の成分と混合し、２５℃で３０分間保温した。その後、参考例２で合成した外来ｍＲＮＡを添加し、無細胞系でのタンパク質合成を行った。
〔反応液の組成〕
・５０％〔Ｖ／Ｖ〕 哺乳動物培養細胞抽出液
・５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１７５ｍＭ 酢酸カリウム
・１ｍＭ 酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ 塩化カルシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．２５ｍＭ ＧＴＰ
・３０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・８０μＭ アミノ酸（２０種）
・１６０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ（ルシフェラーゼ遺伝子をコード）
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）をそれぞれ用いた。反応装置としては低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００を用いた。反応液量は２５μＬ、反応温度は２５℃とし、反応時間ごとにサンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ量を測定した。合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。その結果、反応開始２時間後のタンパク質合成量は約２７μｇ／ｍＬ（図１■）と、タンパク質合成を行う前の保温（２５℃、３０分間）を行わない場合（図１□）より著しく向上した。
【００７８】
以上の説明で明らかなように、本発明によれば、調製が容易であり、かつ従来よりもタンパク質合成量の高い無細胞系タンパク質合成用哺乳動物培養細胞抽出液の調製方法、および該哺乳動物培養細胞抽出液、ならびにこの哺乳動物培養細胞を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供することができる。
【００７９】
なお、配列表フリーテキスト（人工配列の記載（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ））において、配列番号１はプライマーＬｕｃ Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎであり、配列番号２はプライマーＬｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎであり、配列番号３はプライマーＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒである。
Claims (8)
- 抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有し、さらに、急激に凍結させた哺乳動物培養細胞を、−１０℃〜２０℃で解凍させる工程を含有する方法で調整された哺乳動物培養細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法。
- 急激な凍結が、液体窒素によって行われるものである、請求項１に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
- 前記解凍が、水浴または氷水浴中で解凍されたものである、請求項１または２に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
- 抽出用液がプロテアーゼインヒビターを含有するものである、請求項１〜３のうちのいずれかに記載の無細胞系タンパク質合成方法。
- 哺乳動物培養細胞が、リンパ腫由来の培養細胞である、請求項１〜４のうちのいずれかに記載の無細胞系タンパク質合成方法。
- 哺乳動物培養細胞が、生殖巣由来の培養細胞である、請求項１〜４のうちのいずれかに記載の無細胞系タンパク質合成方法。
- 哺乳動物培養細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来の培養細胞である、請求項６に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
- チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）が、ＣＨＯ Ｋ１−ＳＦＭ由来である、請求項７に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
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