JP4442535B2 - 翻訳反応促進ｄｎａ断片を含む発現ベクター及びそれを用いたタンパク質合成方法 - Google Patents
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Description
本発明は、翻訳反応を促進させるＤＮＡ断片を有するタンパク質発現ベクターに関する。
近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単に合成することが必要となってくる。
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって酵母や昆虫細胞（昆虫培養細胞）などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。
一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系または遺伝情報転写／翻訳系を試験管内に取り揃え、反応鋳型として目的タンパク質をコードする構造遺伝子を有するＤＮＡ（転写鋳型）またはｍＲＮＡ（翻訳鋳型）を用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質合成では、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法であると期待されている。このような無細胞系のタンパク質合成に供する抽出液（無細胞系タンパク質合成用抽出液）として、種々の生物由来のものを使用することが検討され、研究が進められている。
ところで真核生物のｍＲＮＡは、ＤＮＡより転写された後、スプライシングやポリＡテールの付加、５'キャップ構造の付加などの様々な修飾が行われていることが知られている。ポリＡテールおよび５'キャップ構造の付加により、真核生物ｍＲＮＡは、リボソームの４０ｓサブユニットへの結合が促進される。したがって従来、真核生物由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる場合、効率的な翻訳反応を行うために、転写反応系に市販のキャップアナログを添加してｍＲＮＡのキャッピングを行ってきた。しかし、キャップアナログは高価であり、転写効率を著しく減少させｍＲＮＡも少量しか得られないという問題があった。さらに、未反応のキャップアナログは翻訳反応も阻害するため、転写反応終了後にはこの未反応のキャップアナログをスピンカラムなどを用いて完全に除去する必要があり、ハイスループットにサンプルを処理していく上で大きな問題となっていた。
このような背景のもと、河原崎らはタバコモザイクウィルス由来の５'非翻訳領域（５' ｕｎ ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ、以下「５'ＵＴＲ」と略す）がキャップ非依存性の（キャップ構造をとることなく）翻訳促進活性を持つことを明らかとした（たとえば、非特許文献１を参照）。非特許文献１では、小麦胚芽抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成において、タバコモザイクウィルス由来の５'ＵＴＲを、所望のタンパク質をコードする構造遺伝子の５'上流側に付加させたＤＮＡより転写して得られたｍＲＮＡを翻訳鋳型として用いたところ、キャップ構造を付加させたｍＲＮＡと同様の翻訳効率が得られたことが報告されている。また、ウサギ網状赤血球由来の抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成において、ラビットβ−グロビンの５'ＵＴＲが同様の作用を持つことも報告されている（たとえば、非特許文献２を参照）。
無細胞系タンパク質合成用抽出液としては、上記小麦胚芽、ウサギ網状赤血球の他、大腸菌、昆虫培養細胞など由来のものが、従来より知られている。我々は、これまでカイコ組織由来の抽出液（カイコ抽出液）や昆虫培養細胞由来の抽出液（昆虫培養細胞抽出液）哺乳動物培養細胞由来の抽出液（以下、哺乳動物培養細胞抽出液）を使用した無細胞系タンパク質合成方法を提案してきている（たとえば、特許文献３、特許文献４、特願２００３−１６５３９０号明細書参照）。我々が提案するカイコ抽出液や昆虫培養細胞抽出液、哺乳動物培養細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法では、従来の方法と比較して、抽出液の調製が格段に容易であり、真核生物由来であるため糖タンパク質の合成も可能であるという利点があり、非常に有用である。したがってこのような抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成においても、より迅速かつ高収量に無細胞系タンパク質合成を行い得るべく、キャップ構造に依存しない翻訳促進配列を見出し、さらに所望の遺伝子を簡便にクローニングできる発現ベクターを構築することは非常に重要な課題であった。
河原崎 et al, 「Biotechnol. Prog」Vol.3, p517-521(2000).
Annweiler et al, 「Nucleic acids Res」Vol.3, p3750(1991).
特開２００３−２３５５９８
特開２００４−２１５６５１
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、所望の遺伝子を簡便にクローニングでき、さらに翻訳効率を向上し得るＤＮＡ断片を含むタンパク質発現ベクターを提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕翻訳反応促進活性を有する配列表の配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片を含む発現ベクター。
〔２〕 上記〔１〕に記載された発現ベクターを用いた、無細胞系タンパク質合成方法。
〔３〕 動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成反応液を用いた、上記〔２〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔４〕 動物由来の抽出物が節足動物から抽出されたものである、上記〔３〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔５〕 節足動物が昆虫組織である、上記〔４〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔６〕 昆虫組織がカイコ組織である、上記〔５〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔７〕 節足動物が昆虫培養細胞である、上記〔４〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔８〕 昆虫培養細胞がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来及び/又はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の細胞である、上記〔７〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔９〕 動物由来の抽出物が哺乳動物細胞から抽出されたものである、上記〔３〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔１０〕 哺乳動物細胞が哺乳動物培養細胞である、上記〔９〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔１１〕 哺乳動物培養細胞が、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ細胞である上記〔１０〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔１２〕 哺乳動物細胞がウサギ網状赤血球である、上記〔９〕に記載の無細胞タンパク質合成方法。
〔１３〕 コムギ胚芽由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成反応液を用いた、上記〔２〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔１４〕 上記〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の発現ベクター含む、無細胞系タンパク質合成用キット。
〔１〕翻訳反応促進活性を有する配列表の配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片を含む発現ベクター。
〔２〕 上記〔１〕に記載された発現ベクターを用いた、無細胞系タンパク質合成方法。
〔３〕 動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成反応液を用いた、上記〔２〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔４〕 動物由来の抽出物が節足動物から抽出されたものである、上記〔３〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔５〕 節足動物が昆虫組織である、上記〔４〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔６〕 昆虫組織がカイコ組織である、上記〔５〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔７〕 節足動物が昆虫培養細胞である、上記〔４〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔８〕 昆虫培養細胞がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来及び/又はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の細胞である、上記〔７〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔９〕 動物由来の抽出物が哺乳動物細胞から抽出されたものである、上記〔３〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔１０〕 哺乳動物細胞が哺乳動物培養細胞である、上記〔９〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔１１〕 哺乳動物培養細胞が、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ細胞である上記〔１０〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔１２〕 哺乳動物細胞がウサギ網状赤血球である、上記〔９〕に記載の無細胞タンパク質合成方法。
〔１３〕 コムギ胚芽由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成反応液を用いた、上記〔２〕に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
〔１４〕 上記〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の発現ベクター含む、無細胞系タンパク質合成用キット。
本発明のタンパク質発現ベクターによれば、所望の遺伝子を簡単にクローニングでき、さらに翻訳効率を向上することが可能である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の発現ベクターは、タンパク質発現系において、翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片を含むものである。ここで「翻訳反応促進活性を有する」とは、本発明の発現ベクターを使用して無細胞系タンパク質合成反応を行うことで、この翻訳反応を促進するＤＮＡ断片を使用しなかった場合と比較して、タンパク質合成量が向上されることを指す。
上記翻訳反応を促進するＤＮＡ断片の効果を簡便に検出する手段として無細胞タンパク質合成系を用いているが、本発明の発現ベクターは無細胞系に限定されることはなく、従来公知の細胞系においても使用できる。
本発明の発現ベクターは、タンパク質発現系において、翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片を含むものである。ここで「翻訳反応促進活性を有する」とは、本発明の発現ベクターを使用して無細胞系タンパク質合成反応を行うことで、この翻訳反応を促進するＤＮＡ断片を使用しなかった場合と比較して、タンパク質合成量が向上されることを指す。
上記翻訳反応を促進するＤＮＡ断片の効果を簡便に検出する手段として無細胞タンパク質合成系を用いているが、本発明の発現ベクターは無細胞系に限定されることはなく、従来公知の細胞系においても使用できる。
本発明の発現ベクターに含まれる翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片としては、具体的には、配列表の配列番号１〜１１のいずれかに示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ断片が挙げられる。これらのDNA断片にはこれらと均等な（上記配列番号１〜１１のいずれかに示される塩基配列より、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された）塩基配列を有し、且つ翻訳反応促進活性を有する二本鎖ＤＮＡ断片も含まれる。
配列表の配列番号１〜１１に示す塩基配列は、それぞれ、カイコまたはバキュロウイルスにおける５'非翻訳領域（５'ＵＴＲ）として公知の塩基配列である。具体的には、配列番号１に示す塩基配列はカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号２に示す塩基配列はカイコのセリシン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号３に示す塩基配列はＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号４に示す塩基配列はＢｍＣＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号５に示す塩基配列はＥｓＣＰＶ（Ｅｕｘｏａ ｓｃａｎｄｅｓ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号６に示す塩基配列はＨｃＮＰＶ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号７に示す塩基配列はＣｒＮＰＶ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｒｏｓａｃｅａｎａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号８に示す塩基配列はＥｏＮＰＶ（Ｅｃｏｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号９に示す塩基配列はＭｎＮＰＶ（Ｍａｌａｃｏｓｍａ ｎｅｕｓｔｒｉａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号１０に示す塩基配列はＳｆＮＰＶ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号１１に示す塩基配列はＷｓＮＰＶ（Ｗｉｓｅａｎａ ｓｉｇｎａｔａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列として、それぞれ公知である。本発明は、これらの塩基配列を有するＤＮＡ断片、あるいは機能を損なわない範囲で均等なＤＮＡ断片が、無細胞系タンパク質合成において、特に有用な翻訳反応促進活性を発揮することを見出したものである。なお、本発明における発現ベクターに含まれるＤＮＡ断片は、カイコまたはバキュロウイルスの５'ＵＴＲに由来するものであれば、上記塩基配列を必ずしも有してなくともよい。
本発明の発現ベクターに含まれるＤＮＡ断片は従来公知のいかなる方法により得られてもよい。たとえば、公知のＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。
本発明の発現ベクターに含まれるＤＮＡ断片は従来公知のいかなる方法により得られてもよい。たとえば、公知のＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。
なお、本発明の発現ベクターに含まれる翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片のうち、顕著な翻訳反応促進活性を発揮し、特に好適なものとして以下のものが例示される。
（１）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（３）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（４）配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に２個組み込まれた発現ベクター；
（５）配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（６）配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に２個組み込まれた発現ベクター；
（７）配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（８）配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（９）配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（１０）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個または２個組み込まれた発現ベクター；
（１１）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（１２）配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（１３）配列番号１１に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター。
（１）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（３）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（４）配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に２個組み込まれた発現ベクター；
（５）配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（６）配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に２個組み込まれた発現ベクター；
（７）配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（８）配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（９）配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（１０）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個または２個組み込まれた発現ベクター；
（１１）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（１２）配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（１３）配列番号１１に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター。
本発明の発現ベクターは上記ＤＮＡ断片の５'上流側に、通常プロモーター配列を少なくとも一つ有する。プロモーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列などが挙げられる。
本発明の発現ベクターは、上記ＤＮＡ断片を一つまたは複数個含む。上記ＤＮＡ断片は、プロモーター配列の３'下流側において、順方向（5'→3'）に組み込まれてもよいし、逆方向に組み込まれてもよい。複数個の上記ＤＮＡ断片を含む場合、上記ＤＮＡ断片は同じものであっても互いに異なるものであってもよい。また、２個以上のＤＮＡ断片が組み込まれた場合、全てのＤＮＡ断片が同じ方向に組み込まれていなくともよい。
また、本発明の発現ベクターは、発現させるタンパク質をコードする構造遺伝子を挿入するための配列を有する。挿入させるための配列としては、従来公知のマルチクローニングサイトや、相同性組み換え反応を起こす配列などが挙げられる。かかるタンパク質をコードする構造遺伝子を挿入させるための配列は、上記翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片の３'下流側に組み込まれる。かかる構造遺伝子を挿入するための配列に、発現させたタンパク質の精製を容易にするという観点から従来公知のヒスチジンタグや、ＧＳＴタグをコードする塩基配列などを付加させてもよい。
また、本発明の発現ベクターは上記タンパク質をコードする構造遺伝子を挿入させるための配列の３'下流側に、合成されたｍＲＮＡの安定性などの観点から３'非翻訳領域（３'ＵＴＲ）およびポリＡ配列を有しているのが好ましい。
また、本発明の発現ベクターは上記ポリＡ配列の３'下流側に転写を終結させる機能を有するターミネーター配列を有していることが好ましい。上記ターミネーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７ターミネーター配列、ＳＰ６ターミネーター配列、Ｔ３ターミネーター配列などが挙げられる。
また、本発明の発現ベクターは、宿主内で安定に保持されるために薬剤耐性マーカーを有する。薬剤耐性マーカーとしては、たとえば従来公知のアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
また、本発明の発現ベクターは、宿主内で自立複製を行うために複製起点を有する。複製起点としては、たとえば従来公知のｐＢＲ３２２ Ｏｒｉ、ｐＵＣ Ｏｒｉ、ＳＶ４０ Ｏｒｉなどが挙げられる。また、シャトルベクターとして使用できるように、異なる宿主間で機能する複製起点を有していてもよい。
上記発現ベクターは、従来公知の遺伝子組み換え技術を用いて作製することができる。
上記発現ベクターは、従来公知の遺伝子組み換え技術を用いて作製することができる。
上述してきた本発明の発現ベクターに、無細胞系にて合成させる目的タンパク質（ペプチドを含む）をコードする構造遺伝子を挿入する。構造遺伝子がコードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、生細胞で細胞毒となるタンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよいし、糖タンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよいし、融合タンパク質をコードする塩基配列であってもよい。また発現させたタンパク質の精製を容易にするという観点から従来公知のヒスチジンタグや、ＧＳＴタグをコードする塩基配列などを付加させてもよい。これらのタグ配列は通常目的タンパク質のN末端またはC末端に付加される。
なお構造遺伝子は、その塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならば全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各構造遺伝子は、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
なお構造遺伝子は、その塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならば全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各構造遺伝子は、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
上記本発明の発現ベクターに、目的タンパク質（ペプチドを含む）をコードする構造遺伝子を挿入したベクター（以下鋳型ＤＮＡ）は、細胞系および無細胞系において使用することができる。本発明は、上記本発明の発現ベクターを使用したタンパク質合成方法も含まれる。
細胞系において鋳型ＤＮＡを使用する場合、従来公知の方法で、宿主となる生物に鋳型ＤＮＡを導入し形質転換体を得る。この際に使用する宿主はいかなる生物種を用いてもよい。中でも本発現ベクターに含まれる翻訳促進作用を有するＤＮＡ断片は、カイコまたはバキュロウィルス由来であることから、バキュロウィルス発現系やカイコを用いた細胞系において特に好適に使用することができる。
無細胞系タンパク質合成は、一般に、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系のみによるタンパク質合成（翻訳系）、ならびにＤＮＡよりｍＲＮＡを転写する転写工程と、該転写工程で得られたｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する翻訳工程とを含むタンパク質合成（転写／翻訳系）とに大きく分けられるが、上記鋳型ＤＮＡは、いずれの系においても好適に使用することができる。
細胞系において鋳型ＤＮＡを使用する場合、従来公知の方法で、宿主となる生物に鋳型ＤＮＡを導入し形質転換体を得る。この際に使用する宿主はいかなる生物種を用いてもよい。中でも本発現ベクターに含まれる翻訳促進作用を有するＤＮＡ断片は、カイコまたはバキュロウィルス由来であることから、バキュロウィルス発現系やカイコを用いた細胞系において特に好適に使用することができる。
無細胞系タンパク質合成は、一般に、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系のみによるタンパク質合成（翻訳系）、ならびにＤＮＡよりｍＲＮＡを転写する転写工程と、該転写工程で得られたｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する翻訳工程とを含むタンパク質合成（転写／翻訳系）とに大きく分けられるが、上記鋳型ＤＮＡは、いずれの系においても好適に使用することができる。
上記鋳型ＤＮＡを用いた無細胞系タンパク質合成系において、使用される抽出液は、鋳型ＤＮＡにコードされるタンパク質を生成させ得るものであれば如何なるものであってもよく、従来公知の大腸菌、コムギ、オオムギ、イネ、コーン等のイネ科の植物、及びホウレンソウなど植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球などから抽出された抽出物、抽出液を特に制限なく使用することができる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には、大腸菌抽出液の場合、Ｚｕｂａｙ Ｇ「Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ」Ｖｏｌ.７, ｐ２６７−２８７(１９７３)などに記載の方法等に準じて調製することもできる。市販のタンパク質合成用細胞抽出液としては、大腸菌由来では、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｓ３０ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｏｒ ｌｉｎｅａｒ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ（プロメガ社製）などが挙げられ、ウサギ網状赤血球由来ではｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社製）など、コムギ胚芽由来ではｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｅｘｔｒａｃｔ（プロメガ社製）、PROTEIOS（東洋紡績社製）などが挙げられる。
このように上記鋳型ＤＮＡを用いた無細胞系タンパク質合成用反応液には、上述のような公知の抽出物、抽出液が含まれていてもよいが、本発明者らが提案してきている動物由来の抽出物が含まれているものであることが好ましい。動物由来の抽出物としては節足動物由来の抽出物、哺乳動物培養細胞由来の抽出物などが挙げられる。
上記節足動物由来の抽出液として、節足動物の成長段階のいずれを問わずいかなる組織から抽出されたものであってもよく、また、節足動物のいずれの組織由来の培養細胞より抽出されたものであってもよい。中でも、カイコ組織または昆虫培養細胞から抽出されたものであるのが好ましい。カイコ組織を抽出対象とする場合、５齢期の３日〜７日のカイコ幼虫の後部絹糸腺からの抽出物を含有すると、短時間で大量のタンパク質が合成可能な無細胞系タンパク質合成用反応液が得られるという利点もあり、特に好ましい（特開２００３−２３５５９８明細書参照）。また、昆虫培養細胞を抽出対象とする場合、タンパク質合成能が高く、また無血清培地にて培養が可能である、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来の細胞Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の細胞Ｓｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）が好適な昆虫培養細胞として例示される（特開２００４−２１５６５１明細書参照）。
また上記哺乳動物培養細胞由来の抽出液として、特に制限はなく、たとえば、ヒト、ラット、マウス、サルなどの従来公知の適宜の哺乳動物由来の培養細胞を使用することができる。
また、哺乳動物培養細胞としては、いかなる組織由来の細胞であってもよく、たとえば、血球細胞、生殖巣由来細胞、リンパ腫（リンホーマ）由来細胞、その他の腫瘍細胞、幹細胞などを特に制限なく使用することができる。中でも浮遊培養が可能であるため、培養および継代が容易であることから、リンパ腫由来細胞を使用するのが好ましい。また、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ） Ｋ１-ＳＦＭ細胞は、浮遊培養が可能であるだけでなく、無血清培地にて培養が可能であり、より培養および継代が容易である。さらに、細胞系において広く利用され、高いタンパク質合成能を有しており、無細胞系においても同様のことが期待できることから、ＣＨＯ Ｋ１-ＳＦＭ細胞を使用するのが好ましい。
また単一種の哺乳動物における単一の組織由来の哺乳動物培養細胞に限らず、単一種の哺乳動物における複数種の組織由来の哺乳動物培養細胞より抽出を行ってもよく、複数種の哺乳動物における単一の組織由来の哺乳動物培養細胞より抽出を行ってもよく、無論、複数種の哺乳動物における複数種の組織由来の哺乳動物培養細胞より抽出を行ってもよい。
また、哺乳動物培養細胞としては、いかなる組織由来の細胞であってもよく、たとえば、血球細胞、生殖巣由来細胞、リンパ腫（リンホーマ）由来細胞、その他の腫瘍細胞、幹細胞などを特に制限なく使用することができる。中でも浮遊培養が可能であるため、培養および継代が容易であることから、リンパ腫由来細胞を使用するのが好ましい。また、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ） Ｋ１-ＳＦＭ細胞は、浮遊培養が可能であるだけでなく、無血清培地にて培養が可能であり、より培養および継代が容易である。さらに、細胞系において広く利用され、高いタンパク質合成能を有しており、無細胞系においても同様のことが期待できることから、ＣＨＯ Ｋ１-ＳＦＭ細胞を使用するのが好ましい。
また単一種の哺乳動物における単一の組織由来の哺乳動物培養細胞に限らず、単一種の哺乳動物における複数種の組織由来の哺乳動物培養細胞より抽出を行ってもよく、複数種の哺乳動物における単一の組織由来の哺乳動物培養細胞より抽出を行ってもよく、無論、複数種の哺乳動物における複数種の組織由来の哺乳動物培養細胞より抽出を行ってもよい。
上記動物由来の組織または培養細胞からの抽出操作に用いられる抽出用液としては、特には制限されるものではないが、プロテアーゼインヒビターを少なくとも含有するのが好ましい。プロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液を用いると、抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパクの不所望な分解を防止でき、抽出物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すことができるようになるという利点がある。上記プロテアーゼインヒビターとしては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるならば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがある。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エチレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用することができるが、抽出物にはセリンプロテアーゼが含まれることが多いことから、上記中でもセリンプロテアーゼに対して特異性の高いインヒビターとして働くＰＭＳＦを使用するのが好ましい。また、１種類のプロテアーゼインヒビターのみならず、数種類の混合物（プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いてもよい。
当該抽出用液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特に制限はないが、無細胞系タンパク質合成に必須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
当該抽出用液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特に制限はないが、無細胞系タンパク質合成に必須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
また上記動物由来の組織または培養細胞に用いる抽出用液は、上記プロテアーゼインヒビターに加えて、カリウム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトール（以下ＤＴＴ）および緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。
上記カリウム塩としては、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
当該抽出用液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、２０ｍＭ〜３００ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
当該抽出用液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、２０ｍＭ〜３００ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
上記マグネシウム塩としては、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
当該抽出用液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
当該抽出用液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
上記ＤＴＴは、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該抽出用液中において０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
上記緩衝剤は、抽出用液に緩衝能を付与し、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こる抽出液のｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。
緩衝剤は、得られた抽出液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６．０〜８．５に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０〜８．５）を使用するのが特に好ましい。
当該抽出用液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
緩衝剤は、得られた抽出液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６．０〜８．５に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０〜８．５）を使用するのが特に好ましい。
当該抽出用液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
さらに、抽出対象が節足動物や哺乳動物由来の培養細胞である場合、得られる抽出液のタンパク質合成能向上を目的として、カルシウム塩およびグリセロールがさらに添加されたものであるのが好ましい。カルシウム塩としては特に制限はなく、例えば、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウム、クエン酸カルシウム、ヨウ化カルシウム、乳酸カルシウム、硝酸カルシウム、シュウ酸カルシウムなど、一般的な形態で使用することができ、中でも塩化カルシウムを使用するのが好ましい。この場合、塩化カルシウムの含有量は特に制限されないが、タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、0．1ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。また、グリセロールの添加量についても特に制限されるものではないが、タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、５(ｖ／ｖ)％〜８０(ｖ／ｖ)％となるように添加されるのが好ましく、１０(ｖ／ｖ)％〜５０(ｖ／ｖ)％となるように添加されるのがより好ましい。
上記節足動物由来の抽出液は従来公知の適宜の抽出操作を行って得られることができるが、中でも抽出操作が簡便で高いタンパク質合成活性が得られるため、カイコ組織由来の抽出液は特開２００３−２３５５９８明細書記載の方法、培養細胞由来の抽出液は特開２００４−２１５６５１明細書記載の方法によって作製することが好ましい。
また哺乳動物培養細胞由来抽出液を作製する際における細胞破砕方法についても特に制限はなく、従来公知の適宜の方法にて行うことができる。中でも凍結・解凍によって細胞を破砕する方法が好ましい。上記方法は、従来の手法と比較して、より穏和な状態で細胞の破砕を行うことができるため、タンパク質合成に必須な成分を破壊することなく細胞外に取り出すことができるので、従来よりも無細胞系にてタンパク質の合成量の高い哺乳動物培養細胞抽出液を容易に調製することができる。
上記哺乳動物培養細胞の細胞破砕方法では、抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させることを要する。該破砕方法において、「急激に凍結」とは、１０秒以下、好ましくは２秒以下にて、哺乳動物培養細胞を凍結させることを指す。哺乳動物培養細胞の凍結を急激に行わなかった場合には、タンパク質合成に必須な成分が不活化する虞があるため、該抽出方法の上記効果を達成することができない。
上記のように哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる温度としては、通常−８０℃以下であり、好ましくは−１５０℃以下である。−８０℃を越える温度で急激に凍結させると、タンパク質合成に必須な成分が失活してタンパク質合成能が低下してしまう傾向にあるためである。
上記のように哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる温度としては、通常−８０℃以下であり、好ましくは−１５０℃以下である。−８０℃を越える温度で急激に凍結させると、タンパク質合成に必須な成分が失活してタンパク質合成能が低下してしまう傾向にあるためである。
上記哺乳動物培養細胞の急激な凍結は、たとえば、液体窒素や液体ヘリウムなどの不活性ガスを使用することなどによって実現できるが、入手が容易であり安価な液体窒素を用いて行うのが好ましい。
上記急激に凍結した哺乳動物培養細胞を、解凍した後、遠心分離する場合、解凍は、たとえば−１０℃〜２０℃の水浴または氷水浴中での解凍、室温（２５℃）にての放置などによって実現できるが、タンパク質合成に必須な成分の失活を防止し、タンパク質合成能の低下を確実に防ぐことから、０℃〜２０℃（特には、４℃〜１０℃）の水浴または氷水浴中で解凍を行うのが好ましい。
解凍した哺乳動物培養細胞の遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行えばよい。
解凍した哺乳動物培養細胞の遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行えばよい。
哺乳動物培養細胞抽出液の調製方法において、細胞破砕後から、無細胞系タンパク質合成用の哺乳動物培養細胞抽出液を得るまでの手順等については特に制限されるものではない。
たとえば、抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる工程の後に、解凍し、遠心分離する場合には、この遠心分離後の上清（上清１）をそのまま哺乳動物培養細胞抽出液としてもよいし、また、上清１をさらに遠心分離して、得られた上清（上清２）を哺乳動物培養細胞抽出液としてもよい。上記上清１の遠心分離の条件としては、上述したのと同様の条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行えばよい。
なお上述のようにそれぞれ調製した後に、ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取して抽出液として調製するようにしてもよい。
なお、調製方法に供する哺乳動物培養細胞は、培養に用いる培地の翻訳反応液への持込みを避けるため、上記急激な凍結を行う前に、洗浄液にて予め洗浄しておくのが好ましい。洗浄液の組成としては、上述した抽出用液と同様の組成のものであればよい。洗浄液での洗浄は、哺乳動物培養細胞に洗浄液を添加し、これを遠心分離（たとえば、７００×ｇ、１０分間、４℃という条件）することによって行う。
洗浄に用いる洗浄液の量は、培地を完全に洗い流すという理由から、湿重量１ｇの哺乳動物培養細胞に対し５ｍＬ〜１００ｍＬであるのが好ましく、１０ｍＬ〜５０ｍＬであるのがより好ましい。
洗浄回数は、１回〜５回行うのが好ましく、２回〜４回行うのがより好ましい。
たとえば、抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる工程の後に、解凍し、遠心分離する場合には、この遠心分離後の上清（上清１）をそのまま哺乳動物培養細胞抽出液としてもよいし、また、上清１をさらに遠心分離して、得られた上清（上清２）を哺乳動物培養細胞抽出液としてもよい。上記上清１の遠心分離の条件としては、上述したのと同様の条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行えばよい。
なお上述のようにそれぞれ調製した後に、ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取して抽出液として調製するようにしてもよい。
なお、調製方法に供する哺乳動物培養細胞は、培養に用いる培地の翻訳反応液への持込みを避けるため、上記急激な凍結を行う前に、洗浄液にて予め洗浄しておくのが好ましい。洗浄液の組成としては、上述した抽出用液と同様の組成のものであればよい。洗浄液での洗浄は、哺乳動物培養細胞に洗浄液を添加し、これを遠心分離（たとえば、７００×ｇ、１０分間、４℃という条件）することによって行う。
洗浄に用いる洗浄液の量は、培地を完全に洗い流すという理由から、湿重量１ｇの哺乳動物培養細胞に対し５ｍＬ〜１００ｍＬであるのが好ましく、１０ｍＬ〜５０ｍＬであるのがより好ましい。
洗浄回数は、１回〜５回行うのが好ましく、２回〜４回行うのがより好ましい。
哺乳動物培養細胞の量は、特に制限されるものではないが、抽出効率を最適に保つため、抽出用液１ｍＬに対して０．１ｇ〜５ｇであるのが好ましく、０．５ｇ〜２ｇであるのがより好ましい。
哺乳動物培養細胞由来の抽出液中における抽出物の含有量に特に制限はないが、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬであるのが好ましく、中でも１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、無細胞系タンパク質合成に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを越えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しづらい虞があるためである。
なお上記範囲の量の抽出物を含有する抽出液は、抽出液のタンパク質濃度測定を利用して、調製できる。当該タンパク質濃度測定は、当分野において通常行われているように、たとえばＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する、といった手順によって行う。分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用する。
なお上記範囲の量の抽出物を含有する抽出液は、抽出液のタンパク質濃度測定を利用して、調製できる。当該タンパク質濃度測定は、当分野において通常行われているように、たとえばＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する、といった手順によって行う。分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用する。
哺乳動物培養細胞由来の抽出液は、抽出物をタンパク質濃度で１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ含有するとともに、２０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８．５）を含有するように実現されるのが好ましい。また上記に加えて、さらに０．５ｍＭ〜５ｍＭの塩化カルシウム塩および１０(ｖ／ｖ)％〜５０(ｖ／ｖ)％のグリセロールを含有することが好ましい。
無細胞系タンパク質合成反応液においては、たとえば上述したようにして調製された節足動物由来または哺乳動物培養細胞抽出液を用いて調製する。上記反応液は上記抽出液を１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するように調製されたものであるのが好ましい。すなわち、反応液の全体において、上記節足動物由来または哺乳動物培養細胞由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
尚、当該抽出物の含有量が上記範囲なら、上記節足動物由来または哺乳動物細胞由来の抽出液を単独で用いてもよいし、異なる抽出液を混合してもよい。また異なる抽出液を混合する場合はいかなる割合であってもよい。
尚、当該抽出物の含有量が上記範囲なら、上記節足動物由来または哺乳動物細胞由来の抽出液を単独で用いてもよいし、異なる抽出液を混合してもよい。また異なる抽出液を混合する場合はいかなる割合であってもよい。
上記節足動物由来の抽出物を含有する抽出液を用いた場合における翻訳系用反応液、転写／翻訳系用反応液において、特に制限はなく従来公知の適宜の成分を含有していてもよい。中でも短時間で大量のタンパク質が合成できるという観点から翻訳系用反応液において、カイコ組織由来の翻訳系用反応液の場合、特開２００３−２３５５９８明細書、培養細胞由来抽出液の場合、特開２００４−２１５６５１明細書記載の成分が含有されることが好ましい。また転写／翻訳系用反応液の場合、例えば特開２００３−２４５０９４明細書記載の成分が含有される。
上記哺乳動物培養細胞由来の抽出物を含有する抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成反応液は、上記記載の哺乳動物培養細胞抽出液を除く成分として、外来ｍＲＮＡ、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。かかる反応液を使用して翻訳反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
上記反応液に用いる外来ｍＲＮＡとは、鋳型ＤＮＡ（本発明の発現ベクターに目的タンパク質をコードする構造遺伝子が挿入されたもの）より転写したｍＲＮＡを指し、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、毒性を有するタンパク質をコードするものであってもよいし、糖タンパク質をコードするものであってもよいし、融合タンパク質をコードする塩基配列であってもよいし、また発現させたタンパク質の精製を容易にするという観点から従来公知のヒスチジンタグや、ＧＳＴタグをコードする塩基配列などを付加させてもよい。これらのタグ配列は通常目的タンパク質のN末端またはC末端に付加される。
なお反応液に用いる外来ｍＲＮＡは、その塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならばｍＲＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各ｍＲＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
なお反応液に用いる外来ｍＲＮＡは、その塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならばｍＲＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各ｍＲＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
反応液中において、外来ｍＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点から、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。外来ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
当該反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、２０ｍＭ〜３００ｍＭ含有されることがより好ましい。
当該反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
当該反応液中におけるＤＴＴは、上述した抽出用液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
当該反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
当該反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
当該反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
当該反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
当該反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
反応液に含有される緩衝剤としては、上述した抽出液と同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８．５）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出液における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。
さらに、反応液においては、ＲＮａｓｅインヒビターがさらに添加されたものであるのが好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在する哺乳動物培養細胞由来のＲＮａｓｅによって、無細胞系タンパク質合成の際に外来ｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、０．５Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。
さらに、反応液においては、ｔＲＮＡがさらに添加されたものであるのが好ましい。ｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。
さらに、反応液においては、カルシウム塩がさらに添加されたものであるのが好ましい。カルシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカルシウム塩、好適には、塩化カルシウム、を好ましく使用できる。カルシウム塩は、上述した抽出用液におけるカルシウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
すなわち、哺乳動物培養細胞由来の抽出液を使用した反応液としては、当該抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、２０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８．５）を含有するように実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．５Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、０．１ｍＭ〜５ｍＭの塩化カルシウムを含有するように実現されるのがより好ましい。
上記節足動物由来の抽出液または哺乳動物培養細胞抽出液を含有する反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応は、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。反応の時間は、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
また、哺乳動物培養細胞抽出液を含有する反応液を用いた無細胞系タンパク質合成の場合、合成反応を行う前に、抽出液にｍRNA以外の反応液組成の成分を加えた状態において、一定時間保温を行うのが好ましい。保温は、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。保温時間は、通常、０℃〜５０℃、好ましくは１５℃〜３７℃の範囲である。保温温度が０℃未満であると保温の効果が得られにくく、また保温温度が５０℃を超えると必須な成分が変性する傾向にあるためである。保温の時間は、通常、１分〜１２０分、好ましくは、１０分〜６０分である。
また上記転写／翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応（転写／翻訳系合成反応）についても、上記翻訳系合成反応の場合と同様、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行えばよい。転写工程の反応温度は、通常、１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲内である。転写工程の反応温度が１０℃未満であると、転写の速度が低下する傾向にあり、また転写工程の反応温度が６０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。また翻訳工程の温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。翻訳工程の反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また翻訳工程の反応温度が４０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。
転写／翻訳系合成反応では、転写、翻訳工程を連続して実施し得るという観点から両工程に好適な２０℃〜３０℃の範囲で反応を行うことが特に好ましい。反応の時間は、全工程あわせて、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
転写／翻訳系合成反応では、転写、翻訳工程を連続して実施し得るという観点から両工程に好適な２０℃〜３０℃の範囲で反応を行うことが特に好ましい。反応の時間は、全工程あわせて、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
上記翻訳系用反応液、転写／翻訳系用反応液を使用して合成できるタンパク質に特に制限はない。合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。
また、本発明は、上述した本発明の発現ベクターを含む無細胞系合成用キットをも提供する。当該無細胞系タンパク質合成用キットには、無細胞系タンパク質合成反応液を含む。当該無細胞タンパク質合成用キットにおける好適な発現ベクター、無細胞系タンパク質合成反応液の組成、濃度、その他好適な組成については上述した通りである。かかる無細胞系タンパク質合成用キットは、発現ベクター、無細胞系タンパク質合成反応液を収容した適宜の容器と、その他の適当な要素で構成されていればよく、特に制限されるものではない。また、無細胞系タンパク質合成に用いる抽出物は、保存の点から、無細胞系タンパク質合成用反応液と分けて収容していてもよい。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
参考例１：ベクターｐＴNＴ−Ｌｕｃの構築
ルシフェラーゼをコードする構造遺伝子を有するｐＧＥＭ−Ｌｕｃ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）５ｎｇを鋳型とし、配列表配列番号１２に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ）と、配列表配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行い、構造遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅した。エタノール沈殿によりＰＣＲ産物を精製した後、ＫｐｎＩで消化した。これとは別に、ｐＴNＴ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）をＫｐｎＩで消化した。これらの反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いて精製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて、これらをライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５α（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換した大腸菌からアルカリ−ＳＤＳ法により調製したプラスミドを、配列表配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）およびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてシークエンシング反応（９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分、２５サイクル）を行った。この反応液をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、塩基配列解析を行った。ｐＴNＴ Ｖｅｃｔｏｒ由来の５'−βグロビンリーダー配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンが挿入されたプラスミドをｐＴNＴ−Ｌｕｃと命名した。
ルシフェラーゼをコードする構造遺伝子を有するｐＧＥＭ−Ｌｕｃ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）５ｎｇを鋳型とし、配列表配列番号１２に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ）と、配列表配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行い、構造遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅した。エタノール沈殿によりＰＣＲ産物を精製した後、ＫｐｎＩで消化した。これとは別に、ｐＴNＴ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）をＫｐｎＩで消化した。これらの反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いて精製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて、これらをライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５α（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換した大腸菌からアルカリ−ＳＤＳ法により調製したプラスミドを、配列表配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）およびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてシークエンシング反応（９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分、２５サイクル）を行った。この反応液をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、塩基配列解析を行った。ｐＴNＴ Ｖｅｃｔｏｒ由来の５'−βグロビンリーダー配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンが挿入されたプラスミドをｐＴNＴ−Ｌｕｃと命名した。
参考例２：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＦｉｂ−Ｌｕｃ）の作製
上記参考例１で作成したプラスミドベクターｐＴNＴ−Ｌｕｃを鋳型にして、配列表配列番号１５に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ｐ Ｒｖ）と、配列表配列番号１６に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ−ＡＴＧ）を用い、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃５分、３０サイクルのＰＣＲを行った。反応終了後、電気泳動でＰＣＲ産物を分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いて精製し、これをライゲーション反応に用いた。このようにして、５'ＵＴＲの挿入の効果を確認すべく、プラスミドベクターｐＴNＴ−ＬｕｃからＳＰ６プロモーター配列、５'−βグロビンリーダー配列およびルシフェラーゼをコードする構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失せしめたプラスミドベクターを得た。
配列表配列番号１に示す塩基配列を有するカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲのセンス鎖、アンチセンス鎖をＤＮＡ合成機で合成し、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡績社製）によってその５'末端のリン酸化を行った。反応終了後、センス鎖とアンチセンス鎖とを混合し、９５℃５分間熱処理した。これを室温になるまで静置しセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせた。エタノール沈殿により精製した後、水に溶解させた。ＳｉｇｍａＳｐｉｎ Ｐｏｓｔ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（シグマ社製）によって、過剰のＡＴＰを取り除いた後、再度エタノール沈殿により精製した。得られた二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、カイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクターを選択した。このようにして、Ｔ７プロモーター配列と構造遺伝子との間にカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲが順方向に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を作製した。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＦｉｂ−Ｌｕｃと名付けた。
上記参考例１で作成したプラスミドベクターｐＴNＴ−Ｌｕｃを鋳型にして、配列表配列番号１５に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ｐ Ｒｖ）と、配列表配列番号１６に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ−ＡＴＧ）を用い、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃５分、３０サイクルのＰＣＲを行った。反応終了後、電気泳動でＰＣＲ産物を分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いて精製し、これをライゲーション反応に用いた。このようにして、５'ＵＴＲの挿入の効果を確認すべく、プラスミドベクターｐＴNＴ−ＬｕｃからＳＰ６プロモーター配列、５'−βグロビンリーダー配列およびルシフェラーゼをコードする構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失せしめたプラスミドベクターを得た。
配列表配列番号１に示す塩基配列を有するカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲのセンス鎖、アンチセンス鎖をＤＮＡ合成機で合成し、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡績社製）によってその５'末端のリン酸化を行った。反応終了後、センス鎖とアンチセンス鎖とを混合し、９５℃５分間熱処理した。これを室温になるまで静置しセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせた。エタノール沈殿により精製した後、水に溶解させた。ＳｉｇｍａＳｐｉｎ Ｐｏｓｔ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（シグマ社製）によって、過剰のＡＴＰを取り除いた後、再度エタノール沈殿により精製した。得られた二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、カイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクターを選択した。このようにして、Ｔ７プロモーター配列と構造遺伝子との間にカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲが順方向に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を作製した。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＦｉｂ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例３：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＳｅｒ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号２に示す塩基配列を有するカイコのセリシン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は参考例２と同様にして、Ｔ７プロモーター配列と構造遺伝子との間に、配列表配列番号２に示す塩基配列を有するカイコのセリシン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を作製した。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＳｅｒ−Ｌｕｃと名付けた。
配列表配列番号２に示す塩基配列を有するカイコのセリシン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は参考例２と同様にして、Ｔ７プロモーター配列と構造遺伝子との間に、配列表配列番号２に示す塩基配列を有するカイコのセリシン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を作製した。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＳｅｒ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例４：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＡｐｈｄ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号３に示す塩基配列を有するＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は参考例２と同様にして、Ｔ７プロモーター配列と構造遺伝子との間に、配列表配列番号３に示す塩基配列を有するＡｃＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を作製した。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＡｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
配列表配列番号３に示す塩基配列を有するＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は参考例２と同様にして、Ｔ７プロモーター配列と構造遺伝子との間に、配列表配列番号３に示す塩基配列を有するＡｃＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を作製した。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＡｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例５：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＦＡｐｈｄ−Ｌｕｃ）の作製
参考例２にてカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲより調製した二本鎖ＤＮＡ断片と、参考例４にてＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲより調製した二本鎖ＤＮＡ断片とを共にインサートとして用い、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、５'側から順にカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲおよびＡｃＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲがそれぞれ順方向（５'→３'）に１個ずつ組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例２と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＦＡｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例２にてカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲより調製した二本鎖ＤＮＡ断片と、参考例４にてＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲより調製した二本鎖ＤＮＡ断片とを共にインサートとして用い、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、５'側から順にカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲおよびＡｃＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲがそれぞれ順方向（５'→３'）に１個ずつ組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例２と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＦＡｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例６：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＢｐｈｄ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号４に示す塩基配列を有するＢｍＣＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は参考例２と同様にして、Ｔ７プロモーター配列とルシフェラーゼ遺伝子との間に、配列表配列番号４に示す塩基配列を有するＢｍＣＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を作製した。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＢｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
配列表配列番号４に示す塩基配列を有するＢｍＣＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は参考例２と同様にして、Ｔ７プロモーター配列とルシフェラーゼ遺伝子との間に、配列表配列番号４に示す塩基配列を有するＢｍＣＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を作製した。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＢｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例７：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＢｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃ）の作製
ＢｍＣＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが逆方向（３'→５'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例６と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＢｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃと名付けた。
ＢｍＣＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが逆方向（３'→５'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例６と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＢｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例８：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＥｐｈｄ−ＦＦ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号５に示す塩基配列を有するＥｓＣＰＶ(Ｅｕｘｏａ ｓｃａｎｄｅｓ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ)のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、参考例２と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、５'側から順にＥｓＣＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲがそれぞれ順方向（５'→３'）に２個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例２と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＥｐｈｄ−ＦＦ−Ｌｕｃと名付けた。
配列表配列番号５に示す塩基配列を有するＥｓＣＰＶ(Ｅｕｘｏａ ｓｃａｎｄｅｓ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ)のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、参考例２と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、５'側から順にＥｓＣＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲがそれぞれ順方向（５'→３'）に２個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例２と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＥｐｈｄ−ＦＦ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例９：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＥｐｈｄ−ＲＲ−Ｌｕｃ）の作製
５'側から順にＥｓＣＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲがそれぞれ逆方向（３'→５'）に２個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例８と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＥｐｈｄ−ＲＲ−Ｌｕｃと名付けた。
５'側から順にＥｓＣＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲがそれぞれ逆方向（３'→５'）に２個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例８と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＥｐｈｄ−ＲＲ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例１０：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＨｐｈｄ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号６に示す塩基配列を有するＨｃＮＰＶ(Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、参考例２と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＨｃＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例２と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＨｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
配列表配列番号６に示す塩基配列を有するＨｃＮＰＶ(Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、参考例２と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＨｃＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例２と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＨｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例１１：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＨｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃ）の作製
ＨｃＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが逆方向（３'→５'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例１０と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＨｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃと名付けた。
ＨｃＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが逆方向（３'→５'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例１０と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＨｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例１２：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＨｐｈｄ−ＲＲ−Ｌｕｃ）の作製
５'側から順にＨｃＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲがそれぞれ逆方向（３'→５'）に２個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例１０と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＨｐｈｄ−ＲＲ−Ｌｕｃと名付けた。
５'側から順にＨｃＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲがそれぞれ逆方向（３'→５'）に２個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例１０と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＨｐｈｄ−ＲＲ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例１３：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＣｐｈｄ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号７に示す塩基配列を有するＣｒＮＰＶ(Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｒｏｓａｃｅａｎａｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ)のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、参考例２と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＣｒＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例２と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＣｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
配列表配列番号７に示す塩基配列を有するＣｒＮＰＶ(Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｒｏｓａｃｅａｎａｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ)のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、参考例２と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＣｒＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例２と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＣｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例１４：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＣｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃ）の作製
ＣｒＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが逆方向（３'→５'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例１３と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＣｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃと名付けた。
ＣｒＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが逆方向（３'→５'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例１３と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＣｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例１５：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＥｏｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号８に示す塩基配列を有するＥｏＮＰＶ(Ｅｃｏｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、参考例２と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＥｏＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが逆方向（３'→５'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例２と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＥｏｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃと名付けた。
配列表配列番号８に示す塩基配列を有するＥｏＮＰＶ(Ｅｃｏｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、参考例２と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＥｏＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが逆方向（３'→５'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例２と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＥｏｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例１６：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＭｐｈｄ−ＦＦ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号９に示す塩基配列を有するＭｎＮＰＶ(Ｍａｌａｃｏｓｍａ ｎｅｕｓｔｒｉａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、参考例２と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＭｎＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に２個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例２と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＭｐｈｄ−ＦＦ−Ｌｕｃと名付けた。
配列表配列番号９に示す塩基配列を有するＭｎＮＰＶ(Ｍａｌａｃｏｓｍａ ｎｅｕｓｔｒｉａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、参考例２と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＭｎＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に２個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例２と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＭｐｈｄ−ＦＦ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例１７：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＭｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃ）の作製
ＭｎＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが逆方向（３'→５'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例１６と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＭｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃと名付けた。
ＭｎＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが逆方向（３'→５'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例１６と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＭｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例１８：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＳｐｈｄ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号１０に示す塩基配列を有するＳｆＮＰＶ(Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ)のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、参考例２と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＳｆＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例２と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＳｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
配列表配列番号１０に示す塩基配列を有するＳｆＮＰＶ(Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ)のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、参考例２と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＳｆＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例２と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＳｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例１９：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＷｐｈｄ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号１１に示す塩基配列を有するＷｓＮＰＶ(Ｗｉｓｅａｎａ ｓｉｇｎａｔａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、参考例２と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＷｓＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例２と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＷｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
配列表配列番号１１に示す塩基配列を有するＷｓＮＰＶ(Ｗｉｓｅａｎａ ｓｉｇｎａｔａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、参考例２と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴNＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＷｓＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、参考例２と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＷｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
参考例２０：昆虫培養細胞（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）抽出液の調製
（１）昆虫培養細胞の培養
細胞数２．１×１０７個の昆虫培養細胞Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、Ｌ−グルタミンを添加したＥｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を入れた培養フラスコ（６００ｃｍ2）内で２７℃で６日間培養した。結果、細胞数１．０×１０８個、湿重量１．２１ｇとなった。
（２）昆虫培養細胞抽出液の調製
まず、上記（１）で培養した昆虫培養細胞を収集し、下記組成の洗浄液で３回洗浄（７００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離）した。
〔洗浄液の組成〕
・６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・２００ｍＭ 酢酸カリウム
・４ｍＭ 酢酸マグネシウム
・４ｍＭ ＤＴＴ
洗浄後の昆虫培養細胞に、下記組成の抽出用液を１ｍＬ加え、懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・２０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・１ｍＭ ＤＴＴ
・１ｍＭ ＰＭＳＦ
この懸濁液を液体窒素中にて急速に凍結させた。充分に凍結させた後、約４℃の氷水浴中で解凍した。完全に解凍した後、３０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）し、上清を回収した。回収した上清１．５ｍＬを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
・１ｍＭ ＰＭＳＦ
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液４ｍＬにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分を回収し、昆虫培養細胞抽出液とした。
（１）昆虫培養細胞の培養
細胞数２．１×１０７個の昆虫培養細胞Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、Ｌ−グルタミンを添加したＥｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を入れた培養フラスコ（６００ｃｍ2）内で２７℃で６日間培養した。結果、細胞数１．０×１０８個、湿重量１．２１ｇとなった。
（２）昆虫培養細胞抽出液の調製
まず、上記（１）で培養した昆虫培養細胞を収集し、下記組成の洗浄液で３回洗浄（７００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離）した。
〔洗浄液の組成〕
・６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・２００ｍＭ 酢酸カリウム
・４ｍＭ 酢酸マグネシウム
・４ｍＭ ＤＴＴ
洗浄後の昆虫培養細胞に、下記組成の抽出用液を１ｍＬ加え、懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・２０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・１ｍＭ ＤＴＴ
・１ｍＭ ＰＭＳＦ
この懸濁液を液体窒素中にて急速に凍結させた。充分に凍結させた後、約４℃の氷水浴中で解凍した。完全に解凍した後、３０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）し、上清を回収した。回収した上清１．５ｍＬを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
・１ｍＭ ＰＭＳＦ
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液４ｍＬにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分を回収し、昆虫培養細胞抽出液とした。
参考例２１：昆虫培養細胞（Ｓｆ２１）抽出液の調製
（１）昆虫培養細胞の培養
昆虫細胞Ｓｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、Ｓｆ９００−II無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中にて２７℃で培養した。培地1mLあたりの細胞数６．０×１０５個のＳｆ２１を１２５ｍＬ三角フラスコ内の培地５０ｍＬ中で２７℃・１３０ｒｐｍ・５日間懸濁培養を行った。結果、培地１ｍＬあたりの細胞数１．０×１０８個、湿重量３gとなった。この細胞を用いて細胞抽出液を調製した。
（2）昆虫培養細胞抽出液の調製
まず、上記（1）で培養した昆虫培養細胞を収集し、下記組成の洗浄液で3回洗浄（７００×g、４℃、１０分間の条件で遠心分離）した。
〔洗浄液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
洗浄後の昆虫培養細胞に、下記組成の抽出用液を３ｍＬ加え、懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・２０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・１ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
この懸濁液を液体窒素中にて急速に凍結させた。充分に凍結させた後、約４℃の氷水浴中で解凍した。完全に解凍した後、３０，０００×g、４℃で１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）し、上清を回収した。回収した上清をさらに４５，０００×g、４℃で３０分間遠心分離して上清を回収した。回収した上清２．５ｍＬを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したPD−１０脱塩カラム（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液３ｍＬにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００pro、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０nmにおける吸光度が３０以上の画分を回収し、昆虫培養細胞抽出液とした。
（１）昆虫培養細胞の培養
昆虫細胞Ｓｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、Ｓｆ９００−II無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中にて２７℃で培養した。培地1mLあたりの細胞数６．０×１０５個のＳｆ２１を１２５ｍＬ三角フラスコ内の培地５０ｍＬ中で２７℃・１３０ｒｐｍ・５日間懸濁培養を行った。結果、培地１ｍＬあたりの細胞数１．０×１０８個、湿重量３gとなった。この細胞を用いて細胞抽出液を調製した。
（2）昆虫培養細胞抽出液の調製
まず、上記（1）で培養した昆虫培養細胞を収集し、下記組成の洗浄液で3回洗浄（７００×g、４℃、１０分間の条件で遠心分離）した。
〔洗浄液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
洗浄後の昆虫培養細胞に、下記組成の抽出用液を３ｍＬ加え、懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・２０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・１ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
この懸濁液を液体窒素中にて急速に凍結させた。充分に凍結させた後、約４℃の氷水浴中で解凍した。完全に解凍した後、３０，０００×g、４℃で１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）し、上清を回収した。回収した上清をさらに４５，０００×g、４℃で３０分間遠心分離して上清を回収した。回収した上清２．５ｍＬを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したPD−１０脱塩カラム（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液３ｍＬにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００pro、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０nmにおける吸光度が３０以上の画分を回収し、昆虫培養細胞抽出液とした。
参考例２２：カイコ抽出液の調製
５齢期４日目のカイコ幼虫１５匹よりハサミ、ピンセット、メス、スパーテルを使用して、後部絹糸腺３．０７ｇを摘出し、これを−８０℃で凍結させた乳鉢ですり潰し、下記組成の抽出用液を用いて、抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３０，０００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。
遠心分離後、上清のみを単離し、再び３０，０００×ｇ、１０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離した。脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）に、２０％グリセロールを含む抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上清を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。
ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取して、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。
５齢期４日目のカイコ幼虫１５匹よりハサミ、ピンセット、メス、スパーテルを使用して、後部絹糸腺３．０７ｇを摘出し、これを−８０℃で凍結させた乳鉢ですり潰し、下記組成の抽出用液を用いて、抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３０，０００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。
遠心分離後、上清のみを単離し、再び３０，０００×ｇ、１０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離した。脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）に、２０％グリセロールを含む抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上清を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。
ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取して、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。
参考例２３：哺乳動物培養細胞（ＣＨＯ）抽出液の調製
（１）哺乳動物培養細胞の培養
細胞濃度４．９×１０５ｃｅｌｌｓ/ｍＬのチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO K1-SFM（東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センターより分譲）をCHO SERUM-FREE MEDIUM（SIGMA社製）２００ｍＬが入った三角フラスコ(５００ｍＬ)内で１３０rpm・３７℃・５%CO２雰囲気下で１２０時間培養した。その結果、細胞濃度８．８×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬ、湿重量３．２gとなった。
（2）哺乳動物培養細胞（ＣＨＯ）抽出液の調製
まず、上記（１）で培養した動物培養細胞を遠心分離（７００×g、１０分間）により収集し、下記組成の洗浄用緩衝液で３回洗浄（７００×g、１０分間の条件で遠心分離）した。
〔洗浄用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
洗浄後の哺乳動物培養細胞に、細胞湿重量１gあたり０．８ｍＬの下記組成の抽出用液を添加し、細胞を懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・２０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・１ｍＭ ＤＴＴ
この懸濁液を液体窒素中にて急速に凍結させた。充分に凍結させた後、約4℃の氷水浴中で解凍した。完全に解凍した後、３０，０００×g、４℃で１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）し、上清を回収した。回収した上清をさらに３０，０００×g、４℃で３０分間遠心分離して上清を回収した。回収した上清２．０ｍＬを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したPD−１０脱塩カラム（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液３ｍＬにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００pro、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０nmにおける吸光度が３０以上の画分を回収し、哺乳動物培養細胞抽出液とした。
（１）哺乳動物培養細胞の培養
細胞濃度４．９×１０５ｃｅｌｌｓ/ｍＬのチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO K1-SFM（東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センターより分譲）をCHO SERUM-FREE MEDIUM（SIGMA社製）２００ｍＬが入った三角フラスコ(５００ｍＬ)内で１３０rpm・３７℃・５%CO２雰囲気下で１２０時間培養した。その結果、細胞濃度８．８×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬ、湿重量３．２gとなった。
（2）哺乳動物培養細胞（ＣＨＯ）抽出液の調製
まず、上記（１）で培養した動物培養細胞を遠心分離（７００×g、１０分間）により収集し、下記組成の洗浄用緩衝液で３回洗浄（７００×g、１０分間の条件で遠心分離）した。
〔洗浄用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
洗浄後の哺乳動物培養細胞に、細胞湿重量１gあたり０．８ｍＬの下記組成の抽出用液を添加し、細胞を懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・２０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・１ｍＭ ＤＴＴ
この懸濁液を液体窒素中にて急速に凍結させた。充分に凍結させた後、約4℃の氷水浴中で解凍した。完全に解凍した後、３０，０００×g、４℃で１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）し、上清を回収した。回収した上清をさらに３０，０００×g、４℃で３０分間遠心分離して上清を回収した。回収した上清２．０ｍＬを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したPD−１０脱塩カラム（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液３ｍＬにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００pro、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０nmにおける吸光度が３０以上の画分を回収し、哺乳動物培養細胞抽出液とした。
実験例１：インビトロ転写反応およびｍＲＮＡの精製
上記参考例１−１９で作製した各ベクター（鋳型DNA）を、ＢａｍＨＩまたはＢｇｌIIで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。得られたベクター１μｇを鋳型として、ＲｉｂｏＭａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）を用い２０μｌスケールで３７℃４時間のインビトロ転写反応を行い、ｍＲＮＡを合成した。
転写反応終了後、１ＵのＲＱ１ ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を添加し、３７℃１５分インキュベートし、鋳型を消化した。フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１００μｌの滅菌水に溶解し、Ｎｉｃｋ ｃｏｌｕｍｎ（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした後、滅菌水で溶出した。溶出画分に酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。合成されたｍＲＮＡの定量は２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定して行った。
上記参考例１−１９で作製した各ベクター（鋳型DNA）を、ＢａｍＨＩまたはＢｇｌIIで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。得られたベクター１μｇを鋳型として、ＲｉｂｏＭａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）を用い２０μｌスケールで３７℃４時間のインビトロ転写反応を行い、ｍＲＮＡを合成した。
転写反応終了後、１ＵのＲＱ１ ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を添加し、３７℃１５分インキュベートし、鋳型を消化した。フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１００μｌの滅菌水に溶解し、Ｎｉｃｋ ｃｏｌｕｍｎ（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした後、滅菌水で溶出した。溶出画分に酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。合成されたｍＲＮＡの定量は２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定して行った。
実験例２：昆虫培養細胞（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）由来の抽出物を含有する翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成
参考例２０で調製した昆虫細胞抽出液を用い、上記参考例２〜７、９、１１〜１９で作製した鋳型ＤＮＡより上記実験例１に記載の方法で作製した各ｍＲＮＡそれぞれについて、下記組成の翻訳系用反応液を調製し、翻訳反応を行った。
〔翻訳系用反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 昆虫培養細胞抽出液
・３２０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ
・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．２５ｍＭ ＧＴＰ
・２０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター(宝酒造社製)、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。翻訳反応は反応温度２５℃で５時間行い、反応液量は２５μＬとした。
合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
参考例２０で調製した昆虫細胞抽出液を用い、上記参考例２〜７、９、１１〜１９で作製した鋳型ＤＮＡより上記実験例１に記載の方法で作製した各ｍＲＮＡそれぞれについて、下記組成の翻訳系用反応液を調製し、翻訳反応を行った。
〔翻訳系用反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 昆虫培養細胞抽出液
・３２０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ
・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．２５ｍＭ ＧＴＰ
・２０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター(宝酒造社製)、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。翻訳反応は反応温度２５℃で５時間行い、反応液量は２５μＬとした。
合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
図１は、実験例２の結果を示すグラフであり、ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ（プロメガ社製）を１００％とした場合の相対合成量を縦軸に示している。
実験例３：昆虫培養細胞（Ｓｆ２１）由来の抽出物を含有する翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成
参考例２１で調製した昆虫細胞抽出液を用い、上記参考例２〜４、６〜１６、１８、１９で作製した鋳型ＤＮＡより上記実験例１に記載の方法で作製した各ｍＲＮＡそれぞれについて、下記組成の翻訳系用反応液を調製し、翻訳反応を行った。
〔翻訳系用反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 昆虫培養細胞抽出液
・３２０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１．５ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．２５ｍＭ ＡＴＰ
・０．１ｍＭ ＧＴＰ
・２０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・８０μＭ アミノ酸（２０種）
・０．１ｍＭ ＥＧＴＡ
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、GTP（シグマ社製）、アミノ酸（20種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター(宝酒造社製)、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。翻訳反応は反応温度２５℃で５時間行い、反応液量は２５μＬとした。
合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬50μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
図２は、実験例３の結果を示すグラフであり、ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ（プロメガ社製）を１００％とした場合の相対合成量を縦軸に示している。
参考例２１で調製した昆虫細胞抽出液を用い、上記参考例２〜４、６〜１６、１８、１９で作製した鋳型ＤＮＡより上記実験例１に記載の方法で作製した各ｍＲＮＡそれぞれについて、下記組成の翻訳系用反応液を調製し、翻訳反応を行った。
〔翻訳系用反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 昆虫培養細胞抽出液
・３２０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１．５ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．２５ｍＭ ＡＴＰ
・０．１ｍＭ ＧＴＰ
・２０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・８０μＭ アミノ酸（２０種）
・０．１ｍＭ ＥＧＴＡ
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、GTP（シグマ社製）、アミノ酸（20種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター(宝酒造社製)、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。翻訳反応は反応温度２５℃で５時間行い、反応液量は２５μＬとした。
合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬50μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
図２は、実験例３の結果を示すグラフであり、ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ（プロメガ社製）を１００％とした場合の相対合成量を縦軸に示している。
実験例４：カイコ組織由来の抽出物を含有する翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成
参考例２２で調製したカイコ抽出液を用い、上記参考例２−１９で作製した鋳型ＤＮＡより上記実験例１に記載の方法で作製した各ｍＲＮＡそれぞれについて、下記組成の翻訳系用反応液を調製し、翻訳反応を行った。
〔翻訳系用反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ カイコ抽出液
・１６０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ
・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１．０ｍＭ 酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．５ｍＭ ＧＴＰ
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
・２５ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。外来ｍＲＮＡとしては、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ、プロメガ社製）を用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。翻訳反応は反応温度２５℃で５時間行い、反応液量は２５μＬとした。合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
参考例２２で調製したカイコ抽出液を用い、上記参考例２−１９で作製した鋳型ＤＮＡより上記実験例１に記載の方法で作製した各ｍＲＮＡそれぞれについて、下記組成の翻訳系用反応液を調製し、翻訳反応を行った。
〔翻訳系用反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ カイコ抽出液
・１６０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ
・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１．０ｍＭ 酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．５ｍＭ ＧＴＰ
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
・２５ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。外来ｍＲＮＡとしては、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ、プロメガ社製）を用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。翻訳反応は反応温度２５℃で５時間行い、反応液量は２５μＬとした。合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
図３は、実験例４の結果を示すグラフであり、ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ（プロメガ社製）を１００％とした場合の相対合成量を縦軸に示している。
実験例５：哺乳動物培養細胞（ＣＨＯ）由来の抽出物を含有する翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成
参考例２３で調製した哺乳動物培養細胞抽出液を用い、上記参考例１、５、６、８、１１、１２、１４、１５、１６、１８、１９で作製した鋳型ＤＮＡより上記実験例１に記載の方法で作製した各ｍＲＮＡそれぞれについて、下記組成の翻訳系用反応液を調製し、翻訳反応を行った。
〔翻訳系用反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 哺乳動物培養細胞抽出液
・１６０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ
・５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１７５ｍＭ 酢酸カリウム
・１ｍＭ 酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ 塩化カルシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．２５ｍＭ ＧＴＰ
・３０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・８０μＭ アミノ酸（２０種）
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
ATP（シグマ社製）、GTP（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）をそれぞれ用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。翻訳反応を開始するにあたり上記翻訳反応液中ｍＲＮＡを含まない翻訳反応液をまず作製し、２５℃で３０分間インキュベートを行った。その後、ｍＲＮＡを添加し翻訳反応を開始（２５℃で４時間）した。反応液量は２５μＬとした。
合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
図４は、実験例５の結果を示すグラフであり、上記参考例１で作製したベクターｐＴＮＴ−Ｌｕｃより転写したｍＲＡＮを１００％とした場合の相対合成量を縦軸に示している。また、上記参考例１で作製したベクターｐＴNＴ−Ｌｕｃは、哺乳類由来の抽出液において好適に翻訳反応を促進するＤＮＡ断片（５’β−グロビンリーダー配列）を有しているため、ここでは、参考例１に対して８０％以上の合成量を示す上記ＤＮＡ断片を翻訳反応を促進するＤＮＡ断片とした。
参考例２３で調製した哺乳動物培養細胞抽出液を用い、上記参考例１、５、６、８、１１、１２、１４、１５、１６、１８、１９で作製した鋳型ＤＮＡより上記実験例１に記載の方法で作製した各ｍＲＮＡそれぞれについて、下記組成の翻訳系用反応液を調製し、翻訳反応を行った。
〔翻訳系用反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 哺乳動物培養細胞抽出液
・１６０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ
・５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１７５ｍＭ 酢酸カリウム
・１ｍＭ 酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ 塩化カルシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．２５ｍＭ ＧＴＰ
・３０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・８０μＭ アミノ酸（２０種）
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
ATP（シグマ社製）、GTP（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）をそれぞれ用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。翻訳反応を開始するにあたり上記翻訳反応液中ｍＲＮＡを含まない翻訳反応液をまず作製し、２５℃で３０分間インキュベートを行った。その後、ｍＲＮＡを添加し翻訳反応を開始（２５℃で４時間）した。反応液量は２５μＬとした。
合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
図４は、実験例５の結果を示すグラフであり、上記参考例１で作製したベクターｐＴＮＴ−Ｌｕｃより転写したｍＲＡＮを１００％とした場合の相対合成量を縦軸に示している。また、上記参考例１で作製したベクターｐＴNＴ−Ｌｕｃは、哺乳類由来の抽出液において好適に翻訳反応を促進するＤＮＡ断片（５’β−グロビンリーダー配列）を有しているため、ここでは、参考例１に対して８０％以上の合成量を示す上記ＤＮＡ断片を翻訳反応を促進するＤＮＡ断片とした。
参考例２４：発現ベクター（pTD1 Vector）の作製
配列表配列番号１７に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ｐＭｎ−Ｅｃｏ）およびそのアンチセンス鎖をＤＮＡ合成機で合成し、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅによってその５'末端のリン酸化を行った。反応終了後、センス鎖とアンチセンス鎖とを混合し、９５℃５分間熱処理した。これを室温になるまで静置しセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせた。エタノール沈殿により精製した後、水に溶解させた。ＳｉｇｍａＳｐｉｎ Post Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓによって、過剰のＡＴＰを取り除いた後、再度エタノール沈殿により精製した。得られた二本鎖ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ（東洋紡績社製）で消化し、これをインサートとした。これとは別にｐＵＣ１９をＥｈｅＩ（東洋紡績社製）およびＥｃｏＲＩで消化し、電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＵＣ１９由来のベクターとインサートをライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、配列表配列番号１８に示すＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて塩基配列解析を行った。得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＵＭと名付けた。
配列表配列番号１７に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ｐＭｎ−Ｅｃｏ）およびそのアンチセンス鎖をＤＮＡ合成機で合成し、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅによってその５'末端のリン酸化を行った。反応終了後、センス鎖とアンチセンス鎖とを混合し、９５℃５分間熱処理した。これを室温になるまで静置しセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせた。エタノール沈殿により精製した後、水に溶解させた。ＳｉｇｍａＳｐｉｎ Post Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓによって、過剰のＡＴＰを取り除いた後、再度エタノール沈殿により精製した。得られた二本鎖ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ（東洋紡績社製）で消化し、これをインサートとした。これとは別にｐＵＣ１９をＥｈｅＩ（東洋紡績社製）およびＥｃｏＲＩで消化し、電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＵＣ１９由来のベクターとインサートをライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、配列表配列番号１８に示すＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて塩基配列解析を行った。得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＵＭと名付けた。
ＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ Ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）０．５μｇを鋳型として、配列表配列番号１９に示す塩基配列を有するプライマー（Ｐｈｄ３ Ｆｗ）と、配列表配列番号２０に示す塩基配列を有するプライマー（Ｐｈｄ３ Ｒｖ−Ｈｉｎｄ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃３０秒、３０サイクルのＰＣＲを行い、ＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の３'ＵＴＲを増幅した。Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＫｉｎａｓｅによってＤＮＡ断片の５'末端のリン酸化を行った。反応液をエタノール沈殿により精製した後、ＨｉｎｄＩＩＩ（東洋紡績社製）で消化し、これをインサートとした。これとは別にｐＵＭをＨｉｎｃII（東洋紡績社製）およびＨｉｎｄIIIで消化した。電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＵＭ由来のベクターとインサートをライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、配列表配列番号１８に示すＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて塩基配列解析を行った。得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＴＭと名付けた。
配列表配列番号２１に示す塩基配列を有するプライマー（Ａ２５Ｔ７ｔ）のセンス鎖、アンチセンス鎖をＤＮＡ合成機で合成し、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅによってその５'末端のリン酸化を行った。反応終了後、センス鎖とアンチセンス鎖とを混合し、９５℃５分間熱処理した。これを室温になるまで静置しセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせた。エタノール沈殿により精製した後、水に溶解させた。ＳｉｇｍａＳｐｉｎ Ｐｏｓｔ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓによって、過剰のＡＴＰを取り除いた後、再度エタノール沈殿により精製し、これをインサートとした。これとは別にｐＴＭ ５ｎｇを鋳型として、配列表配列番号２２に示す塩基配列を有するプライマー（Ｎｏｔ Ｆｗ）と、配列表配列番号２３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｐｈｄ３ Ｒｖ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃３分、３０サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。精製したＰＣＲ産物とインサートをライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、配列表配列番号１８に示すＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて塩基配列解析を行った。ＡｃＮＰＶポリヘドリン３'ＵＴＲ配列の下流にポリＡ尾部が順方向に挿入されたプラスミドＤＮＡを、ｐＴＭＡ名付けた。
ｐＴＭＡ ５ｎｇを鋳型として、配列表配列番号２２に示す塩基配列を有するプライマー（Ｎｏｔ Ｆｗ）と、配列表配列番号２４に示す塩基配列を有するプライマー（Ｎｏｔ Ｒｖ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃３分、３０サイクルのＰＣＲを行った。Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＫｉｎａｓｅによってＰＣＲ産物の５'末端のリン酸化を行った。反応液を電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。精製したＰＣＲ産物をライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、配列表配列番号１８に示すＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて塩基配列解析を行った。得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＴＤ１ Ｖｅｃｔｏｒと名付けた。作製したｐＴＤ１Ｖｅｃｔｏｒは、配列表配列番号29に示す塩基配列を有する。 図７に、作成したｐＴＤ１Ｖｅｃｔｏｒのマップを示す。図中T７はＴ７プロモーター、ＥｎｈａｎｃｅｒはＭｎＮＰＶ由来のポリヘドリン遺伝子５’ＵＴＲ（順方向）、ＭＣＳはマルチクローニングサイト、３’ＵＴＲはＡｃＮＰＶ由来のポリヘドリン遺伝子３’ＵＴＲ、ｐｏｌｙＡはポリA尾部、ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒはＴ7ターミネーター配列である。
参考例２５：発現ベクター（ｐＴＤ２ Vector）の作製
配列表配列番号２５に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ｐＥｏ−Ｅｃｏ）およびそのアンチセンス鎖をＤＮＡ合成機で合成し、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅによってその５'末端のリン酸化を行った。反応終了後、センス鎖とアンチセンス鎖とを混合し、９５℃５分間熱処理した。これを室温になるまで静置しセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせた。エタノール沈殿により精製した後、水に溶解させた。ＳｉｇｍａＳｐｉｎ Post Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓによって、過剰のＡＴＰを取り除いた後、再度エタノール沈殿により精製した。得られた二本鎖ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ（東洋紡績社製）で消化し、これをインサートとした。これとは別にｐＵＣ１９をＥｈｅＩ（東洋紡績社製）およびＥｃｏＲＩで消化し、電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＵＣ１９由来のベクターとインサートをライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、配列表配列番号１８に示すＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて塩基配列解析を行った。得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＵＥと名付けた。
配列表配列番号２５に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ｐＥｏ−Ｅｃｏ）およびそのアンチセンス鎖をＤＮＡ合成機で合成し、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅによってその５'末端のリン酸化を行った。反応終了後、センス鎖とアンチセンス鎖とを混合し、９５℃５分間熱処理した。これを室温になるまで静置しセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせた。エタノール沈殿により精製した後、水に溶解させた。ＳｉｇｍａＳｐｉｎ Post Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓによって、過剰のＡＴＰを取り除いた後、再度エタノール沈殿により精製した。得られた二本鎖ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ（東洋紡績社製）で消化し、これをインサートとした。これとは別にｐＵＣ１９をＥｈｅＩ（東洋紡績社製）およびＥｃｏＲＩで消化し、電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＵＣ１９由来のベクターとインサートをライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、配列表配列番号１８に示すＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて塩基配列解析を行った。得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＵＥと名付けた。
ＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ Ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）０．５μｇを鋳型として、配列表配列番号１９に示す塩基配列を有するプライマー（Ｐｈｄ３ Ｆｗ）と、配列表配列番号２０に示す塩基配列を有するプライマー（Ｐｈｄ３ Ｒｖ−Ｈｉｎｄ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃３０秒、３０サイクルのＰＣＲを行い、ＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の３'ＵＴＲを増幅した。Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＫｉｎａｓｅによってＤＮＡ断片の５'末端のリン酸化を行った。反応液をエタノール沈殿により精製した後、ＨｉｎｄIII（東洋紡績社製）で消化し、これをインサートとした。これとは別にｐＵＥをＨｉｎｃII（東洋紡績社製）およびＨｉｎｄIIIで消化した。電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＵＥ由来のベクターとインサートをライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、配列表配列番号１８に示すＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて塩基配列解析を行った。得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＴＥと名付けた。
配列表配列番号２１に示す塩基配列を有するプライマー（Ａ２５Ｔ７ｔ）のセンス鎖、アンチセンス鎖をＤＮＡ合成機で合成し、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅによってその５'末端のリン酸化を行った。反応終了後、センス鎖とアンチセンス鎖とを混合し、９５℃５分間熱処理した。これを室温になるまで静置しセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせた。エタノール沈殿により精製した後、水に溶解させた。ＳｉｇｍａＳｐｉｎ Ｐｏｓｔ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓによって、過剰のＡＴＰを取り除いた後、再度エタノール沈殿により精製し、これをインサートとした。これとは別にｐＴＥ ５ｎｇを鋳型として、配列表配列番号２２に示す塩基配列を有するプライマー（Ｎｏｔ Ｆｗ）と、配列表配列番号２３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｐｈｄ３ Ｒｖ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃３分、３０サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。精製したＰＣＲ産物とインサートをライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、配列表配列番号１８に示すＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて塩基配列解析を行った。ＡｃＮＰＶポリヘドリン３'ＵＴＲ配列の下流にポリＡ尾部が順方向に挿入されたプラスミドＤＮＡを、ｐＴＥＡ名付けた。
ｐＴＥＡ ５ｎｇを鋳型として、配列表配列番号２２に示す塩基配列を有するプライマー（Ｎｏｔ Ｆｗ）と、配列表配列番号２４に示す塩基配列を有するプライマー（Ｎｏｔ Ｒｖ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃３分、３０サイクルのＰＣＲを行った。Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＫｉｎａｓｅによってＰＣＲ産物の５'末端のリン酸化を行った。反応液を電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。精製したＰＣＲ産物をライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、配列表配列番号１８に示すＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて塩基配列解析を行った。得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＴＤ２ Ｖｅｃｔｏｒと名付けた。
作製したｐＴＤ２Ｖｅｃｔｏｒは、配列表配列番号30に示す塩基配列を有する。 図8に、作成したpTD1Vectorのマップを示す。図中T７はT7プロモーター、ＥｎｈａｎｃｅｒはＥｏＮＰＶ由来のポリヘドリン遺伝子５’ＵＴＲ（逆方向）、ＭＣＳはマルチクローニングサイト、３’ＵＴＲはＡｃＮＰＶ由来のポリヘドリン遺伝子３’ＵＴＲ、ｐｏｌｙＡはポリA尾部、ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒはT７ターミネーター配列である。
作製したｐＴＤ２Ｖｅｃｔｏｒは、配列表配列番号30に示す塩基配列を有する。 図8に、作成したpTD1Vectorのマップを示す。図中T７はT7プロモーター、ＥｎｈａｎｃｅｒはＥｏＮＰＶ由来のポリヘドリン遺伝子５’ＵＴＲ（逆方向）、ＭＣＳはマルチクローニングサイト、３’ＵＴＲはＡｃＮＰＶ由来のポリヘドリン遺伝子３’ＵＴＲ、ｐｏｌｙＡはポリA尾部、ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒはT７ターミネーター配列である。
実施例１：ｐＴＤ１ Ｖｅｃｔｏｒを用いた遺伝子のクローニングとそれを用いた無細胞タンパク質合成
（1）鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＴＤ１−Ｌｕｃ）の作製
ルシフェラーゼをコードする構造遺伝子を有するｐＧＥＭ−Ｌｕｃ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）５ｎｇを鋳型とし、配列表配列番号１６に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ−ＡＴＧ）と、配列表配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行い、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅した。Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＫｉｎａｓｅによってＰＣＲ産物の５'末端のリン酸化を行った後、エタノール沈殿によりＰＣＲ産物を精製した。このＤＮＡ断片をＫｐｎＩで消化した後、電気泳動に供し、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、これをインサートとした。これとは別にｐＴＤ１ Ｖｅｃｔｏｒ ５ｎｇを鋳型として、配列表配列番号２６に示す塩基配列を有するプライマー（Ｅｃｏ−Ｋｐｎ）と、配列表配列番号２７に示す塩基配列を有するプライマー（Ｍｎ２９ Ｒｖ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃３分、３０サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をエタノール沈殿により精製した後、ＫｐｎＩで消化した。電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＴＤ１ Ｖｅｃｔｏｒ由来のＤＮＡ断片とインサートをライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、配列表配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）および配列表配列番号１８に示すＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて塩基配列解析を行った。得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＴＤ１−Ｌｕｃと名付けた。
（2）インビトロ転写反応およびｍＲＮＡの精製
インビトロ転写反応およびｍＲＮＡの精製は、上記実験例１に記載の方法と同様にして行った。
（3）翻訳反応
翻訳反応は、上記参考例２１で作製した昆虫培養細胞（Ｓｆ２１）抽出液を用いて、上記実験例３に記載の方法に従って翻訳反応を行った。合成されたルシフェラーゼは上記実験例３に記載の方法に従って定量した。
（1）鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＴＤ１−Ｌｕｃ）の作製
ルシフェラーゼをコードする構造遺伝子を有するｐＧＥＭ−Ｌｕｃ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）５ｎｇを鋳型とし、配列表配列番号１６に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ−ＡＴＧ）と、配列表配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行い、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅した。Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＫｉｎａｓｅによってＰＣＲ産物の５'末端のリン酸化を行った後、エタノール沈殿によりＰＣＲ産物を精製した。このＤＮＡ断片をＫｐｎＩで消化した後、電気泳動に供し、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、これをインサートとした。これとは別にｐＴＤ１ Ｖｅｃｔｏｒ ５ｎｇを鋳型として、配列表配列番号２６に示す塩基配列を有するプライマー（Ｅｃｏ−Ｋｐｎ）と、配列表配列番号２７に示す塩基配列を有するプライマー（Ｍｎ２９ Ｒｖ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃３分、３０サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をエタノール沈殿により精製した後、ＫｐｎＩで消化した。電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＴＤ１ Ｖｅｃｔｏｒ由来のＤＮＡ断片とインサートをライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、配列表配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）および配列表配列番号１８に示すＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて塩基配列解析を行った。得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＴＤ１−Ｌｕｃと名付けた。
（2）インビトロ転写反応およびｍＲＮＡの精製
インビトロ転写反応およびｍＲＮＡの精製は、上記実験例１に記載の方法と同様にして行った。
（3）翻訳反応
翻訳反応は、上記参考例２１で作製した昆虫培養細胞（Ｓｆ２１）抽出液を用いて、上記実験例３に記載の方法に従って翻訳反応を行った。合成されたルシフェラーゼは上記実験例３に記載の方法に従って定量した。
図５は、実施例１の結果を示すグラフであり、横軸が合成時間（時間）、縦軸がルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示す。また、比較例として参考例１６で作製したｐＭｐｈｄ−ＦＦ−Ｌｕｃより転写したｍＲＮＡを用いた合成結果を示す。図５に示すとおり、参考例２４において作製した、翻訳反応を促進するDNA断片として、配列表配列番号９に示す塩基配列を示すDNA断片を使用して作製したタンパク質発現ベクターは、鋳型DNAとして参考例１６で作製したｐＭｐｈｄ−ＦＦ−Ｌｕｃを使用した場合と同程度の合成量を示すことがわかった。
実施例２：ｐＴＤ２ Ｖｅｃｔｏｒを用いた遺伝子のクローニングとそれを用いた無細胞タンパク質合成
（1）鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＴＤ２−Ｌｕｃ）の作製
ルシフェラーゼをコードする構造遺伝子を有するｐＧＥＭ−Ｌｕｃ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）５ｎｇを鋳型とし、配列表配列番号１６に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ−ＡＴＧ）と、配列表配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行い、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅した。Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＫｉｎａｓｅによってＰＣＲ産物の５'末端のリン酸化を行った後、エタノール沈殿によりＰＣＲ産物を精製した。このＤＮＡ断片をＫｐｎIで消化した後、電気泳動に供し、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、これをインサートとした。これとは別にｐＴＤ２ Ｖｅｃｔｏｒ ５ｎｇを鋳型として、配列表配列番号２６に示す塩基配列を有するプライマー（Ｅｃｏ−Ｋｐｎ）と、配列表配列番号２８に示す塩基配列を有するプライマー（Ｅｏ２１ Ｆｗ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃３分、３０サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をエタノール沈殿により精製した後、ＫｐｎＩで消化した。電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＴＤ２ Ｖｅｃｔｏｒ由来のＤＮＡ断片とインサートをライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、配列表配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）および配列表配列番号１８に示すＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて塩基配列解析を行った。得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＴＤ２−Ｌｕｃと名付けた。
（2）インビトロ転写反応およびｍＲＮＡの精製
インビトロ転写反応およびｍＲＮＡの精製は、上記実験例１に記載の方法と同様にして行った。
（3）翻訳反応
翻訳反応は、上記参考例２０で作製した昆虫培養細胞（ＨｉｇｈＦｉｖｅ）抽出液を用いて、上記実験例２に記載の方法に従って翻訳反応を行った。合成されたルシフェラーゼは上記実験例２に記載の方法に従って定量した。
図６は、実施例２の結果を示すグラフであり、横軸が合成時間（時間）、縦軸がルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示す。また、比較例として参考例１５で作製したｐＥｏｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃより転写したｍＲＮＡを用いた合成結果を示す。図６に示すとおり、参考例２５において作製した、翻訳反応を促進するDNA断片として、配列表配列番号８に示す塩基配列を示すDNA断片を使用して作製したタンパク質発現ベクターは、鋳型DNAとして参考例１５で作製したｐＥｏｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃを使用した場合と同程度の合成量を示すことがわかった。
実施例２：ｐＴＤ２ Ｖｅｃｔｏｒを用いた遺伝子のクローニングとそれを用いた無細胞タンパク質合成
（1）鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＴＤ２−Ｌｕｃ）の作製
ルシフェラーゼをコードする構造遺伝子を有するｐＧＥＭ−Ｌｕｃ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）５ｎｇを鋳型とし、配列表配列番号１６に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ−ＡＴＧ）と、配列表配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行い、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅した。Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＫｉｎａｓｅによってＰＣＲ産物の５'末端のリン酸化を行った後、エタノール沈殿によりＰＣＲ産物を精製した。このＤＮＡ断片をＫｐｎIで消化した後、電気泳動に供し、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、これをインサートとした。これとは別にｐＴＤ２ Ｖｅｃｔｏｒ ５ｎｇを鋳型として、配列表配列番号２６に示す塩基配列を有するプライマー（Ｅｃｏ−Ｋｐｎ）と、配列表配列番号２８に示す塩基配列を有するプライマー（Ｅｏ２１ Ｆｗ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃３分、３０サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をエタノール沈殿により精製した後、ＫｐｎＩで消化した。電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＴＤ２ Ｖｅｃｔｏｒ由来のＤＮＡ断片とインサートをライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、配列表配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）および配列表配列番号１８に示すＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて塩基配列解析を行った。得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＴＤ２−Ｌｕｃと名付けた。
（2）インビトロ転写反応およびｍＲＮＡの精製
インビトロ転写反応およびｍＲＮＡの精製は、上記実験例１に記載の方法と同様にして行った。
（3）翻訳反応
翻訳反応は、上記参考例２０で作製した昆虫培養細胞（ＨｉｇｈＦｉｖｅ）抽出液を用いて、上記実験例２に記載の方法に従って翻訳反応を行った。合成されたルシフェラーゼは上記実験例２に記載の方法に従って定量した。
図６は、実施例２の結果を示すグラフであり、横軸が合成時間（時間）、縦軸がルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示す。また、比較例として参考例１５で作製したｐＥｏｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃより転写したｍＲＮＡを用いた合成結果を示す。図６に示すとおり、参考例２５において作製した、翻訳反応を促進するDNA断片として、配列表配列番号８に示す塩基配列を示すDNA断片を使用して作製したタンパク質発現ベクターは、鋳型DNAとして参考例１５で作製したｐＥｏｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃを使用した場合と同程度の合成量を示すことがわかった。
参考例２６：鋳型DNA（ベクターpEU3-N２-Luc）の作製
ルシフェラーゼをコードする構造遺伝子を有するpGEM−Luc Vector（プロメガ社製）5ngを鋳型とし、配列表配列番号16に示す塩基配列を有するプライマー（Luc−ATG）と、配列表配列番号13に示す塩基配列を有するプライマー（Luc T7−R4−Kpn）と、KOD plus（東洋紡績社製）を用い、96℃2分で鋳型を変性させた後、96℃15秒、50℃30秒、68℃120秒、30サイクルのPCRを行い、オープンリーディングフレーム（ORF）を増幅した。T4 Polynucleotide KinaseによってPCR産物の5'末端のリン酸化を行った後、エタノール沈殿によりPCR産物を精製した。このDNA断片をKpnIで消化した後、電気泳動に供し、Gen Elute Gel Purification Kitを用いて約1.6 kbのDNA断片を精製し、これをインサートとした。これとは別にpEU3-N２ Vector（翻訳促進配列としてタバコモザイクウィルス由来のΩ配列を有するコムギ胚芽抽出液用の発現ベクター、東洋紡績社製）をEcoRVおよびKpnIで消化し、これに上記で作製したインサートをライゲーションした後、大腸菌DH5αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、配列表配列番号14に示す塩基配列を有するプライマー（T7 promoter）およびM13 Reverseプライマーを用いて塩基配列解析を行った。得られたプラスミドDNAを、pEU3-N２-Lucと名付けた。本タンパク質発現用のプラスミドは、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成において、好適に発現されることが予想される。
ルシフェラーゼをコードする構造遺伝子を有するpGEM−Luc Vector（プロメガ社製）5ngを鋳型とし、配列表配列番号16に示す塩基配列を有するプライマー（Luc−ATG）と、配列表配列番号13に示す塩基配列を有するプライマー（Luc T7−R4−Kpn）と、KOD plus（東洋紡績社製）を用い、96℃2分で鋳型を変性させた後、96℃15秒、50℃30秒、68℃120秒、30サイクルのPCRを行い、オープンリーディングフレーム（ORF）を増幅した。T4 Polynucleotide KinaseによってPCR産物の5'末端のリン酸化を行った後、エタノール沈殿によりPCR産物を精製した。このDNA断片をKpnIで消化した後、電気泳動に供し、Gen Elute Gel Purification Kitを用いて約1.6 kbのDNA断片を精製し、これをインサートとした。これとは別にpEU3-N２ Vector（翻訳促進配列としてタバコモザイクウィルス由来のΩ配列を有するコムギ胚芽抽出液用の発現ベクター、東洋紡績社製）をEcoRVおよびKpnIで消化し、これに上記で作製したインサートをライゲーションした後、大腸菌DH5αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、配列表配列番号14に示す塩基配列を有するプライマー（T7 promoter）およびM13 Reverseプライマーを用いて塩基配列解析を行った。得られたプラスミドDNAを、pEU3-N２-Lucと名付けた。本タンパク質発現用のプラスミドは、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成において、好適に発現されることが予想される。
実施例３：pTD1 Vectorを用いたコムギ胚芽抽出液での無細胞系タンパク質合成
（1）鋳型DNA
鋳型DNAとして、実施例１で作製したpTD1-Lucを用いた。
（2）インビトロ転写反応およびmRNAの精製
インビトロ転写反応およびmRNAの精製は、上記実験例1に記載の方法と同様にして行った。
（3）翻訳反応
翻訳反応は、上記（２）で作製したｍRNAを鋳型として、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成を行った。コムギ胚芽抽出液としては、PROTEIOSTM ver.2（東洋紡績社製）を用いた。mRNAを終濃度240μg/mLとなるよう添加し、取り扱い説明書に従って50μLの反応スケール（バッチ反応）でタンパク質合成反応を行った。合成されたルシフェラーゼは上記実験例2に記載の方法に従って定量した。
図９が結果であり、縦軸にルシフェラーゼの相対合成量（%）を示す。参考として、鋳型DNAとして参考例２６で作製したpEU3-N２-Lucを用い、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成を行った結果を示す（参考例２６）。図９に示すとおり、実施例1で作製したpTD1-LucはpEU3-N２-Lucと比較して約170%の合成量を示すことがわかり、pTD1 Vectorがコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成においても、翻訳反応を促進しうる発現ベクターとして好適に使用できることが明らかとなった。
（1）鋳型DNA
鋳型DNAとして、実施例１で作製したpTD1-Lucを用いた。
（2）インビトロ転写反応およびmRNAの精製
インビトロ転写反応およびmRNAの精製は、上記実験例1に記載の方法と同様にして行った。
（3）翻訳反応
翻訳反応は、上記（２）で作製したｍRNAを鋳型として、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成を行った。コムギ胚芽抽出液としては、PROTEIOSTM ver.2（東洋紡績社製）を用いた。mRNAを終濃度240μg/mLとなるよう添加し、取り扱い説明書に従って50μLの反応スケール（バッチ反応）でタンパク質合成反応を行った。合成されたルシフェラーゼは上記実験例2に記載の方法に従って定量した。
図９が結果であり、縦軸にルシフェラーゼの相対合成量（%）を示す。参考として、鋳型DNAとして参考例２６で作製したpEU3-N２-Lucを用い、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成を行った結果を示す（参考例２６）。図９に示すとおり、実施例1で作製したpTD1-LucはpEU3-N２-Lucと比較して約170%の合成量を示すことがわかり、pTD1 Vectorがコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成においても、翻訳反応を促進しうる発現ベクターとして好適に使用できることが明らかとなった。
実施例４：pTD1 Vectorを用いたウサギ網状赤血球抽出液での無細胞系タンパク質合成
（1）鋳型DNA
鋳型DNAとして、実施例１で作製したpTD1-Lucを用いた。
（1）鋳型DNA
鋳型DNAとして、実施例１で作製したpTD1-Lucを用いた。
（2）インビトロ転写反応およびmRNAの精製
インビトロ転写反応およびmRNAの精製は、上記実験例1に記載の方法と同様にして行った。
インビトロ転写反応およびmRNAの精製は、上記実験例1に記載の方法と同様にして行った。
（3）翻訳反応
翻訳反応は、上記（2）で作製したmRNAを鋳型として、ウサギ網状赤血球抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成を行った。ウサギ網状赤血球抽出液としてRabbit Reticulocyte Lysate, Nuclease Treated（プロメガ社製）を用いた。mRNAを終濃度40μg/mLとなるよう添加し、取り扱い説明書に従って50μLの反応スケールでタンパク質合成反応を行った。合成されたルシフェラーゼは上記実験例2に記載の方法に従って定量した。
図１０に結果を示す。縦軸にルシフェラーゼの相対合成量（%）を示す。参考として、鋳型DNAとして参考例1で作製したpTNT-Lucを用い、ウサギ網状赤血球抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成を行った結果を示す（参考例１）。図１０に示すとおり、ウサギ網状赤血球抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成において、pTD1-LucはpTNT-Lucと同程度の合成量を示すことがわかり、pTD1 Vectorがウサギ網状赤血球抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成においても、翻訳反応を促進しうる発現ベクターとして好適に使用できることが明らかとなった。
翻訳反応は、上記（2）で作製したmRNAを鋳型として、ウサギ網状赤血球抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成を行った。ウサギ網状赤血球抽出液としてRabbit Reticulocyte Lysate, Nuclease Treated（プロメガ社製）を用いた。mRNAを終濃度40μg/mLとなるよう添加し、取り扱い説明書に従って50μLの反応スケールでタンパク質合成反応を行った。合成されたルシフェラーゼは上記実験例2に記載の方法に従って定量した。
図１０に結果を示す。縦軸にルシフェラーゼの相対合成量（%）を示す。参考として、鋳型DNAとして参考例1で作製したpTNT-Lucを用い、ウサギ網状赤血球抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成を行った結果を示す（参考例１）。図１０に示すとおり、ウサギ網状赤血球抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成において、pTD1-LucはpTNT-Lucと同程度の合成量を示すことがわかり、pTD1 Vectorがウサギ網状赤血球抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成においても、翻訳反応を促進しうる発現ベクターとして好適に使用できることが明らかとなった。
参考例２４及び２５では、翻訳反応活性を有するＤＮＡ断片として、各々配列表配列番号９及び８に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片を使用してタンパク質発現ベクター作製したが、そのほかの配列番号に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片を使用してタンパク質発現ベクターについても容易に作製し得る。
さらに、これらの発現ベクターを用いることによって無細胞系タンパク質合成において、タンパク質の合成量が向上することは実験例２から５及び実施例１から４、から明らかである。
さらに、これらの発現ベクターを用いることによって無細胞系タンパク質合成において、タンパク質の合成量が向上することは実験例２から５及び実施例１から４、から明らかである。
配列番号１：
カイコフィブロインＬ鎖遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号２：
カイコセリシン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号３：
ＡｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号４：
ＢｍＣＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号５：
ＥｓＣＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号６：
ＨｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号７：
ＣｒＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号８：
ＥｏＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号９：
ＭｎＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号１０：
ＳｆＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号１１：
ＷｓＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号１２：
プライマー Ｌｕｃ Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ
配列番号１３：
プライマー Ｌｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ
配列番号１４：
プライマー Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ
配列番号１５：
プライマー Ｔ７ｐ Ｒｖ
配列番号１６：
プライマー Ｌuc−ＡＴＧ
配列番号１７：
プライマー Ｔ７ｐＭｎ−Ｅｃｏ
配列番号１８：
プライマー Ｍ１３Ｒｅｖｅｒｓｅ
配列番号１９：
プライマー Ｐｈｄ３ Ｆｗ
配列番号２０：
プライマー Ｐｈｄ３ Ｒｖ−Ｈｉｎｄ
配列番号２１：
プライマー Ａ２５Ｔ７ｔ
配列番号２２：
プライマー Ｎｏｔ−Ｆｗ
配列番号２３：
プライマー Ｐｈｄ３ Ｒｖ
配列番号２４：
プライマー Ｎｏｔ−Ｒｖ
配列番号２５：
プライマー Ｔ７ｐＥｏ−Ｅｃｏ
配列番号２６：
プライマー Ｅｃｏ−Ｋｐｎ
配列番号２７：
プライマー Ｍｎ２９ Ｒｖ
配列番号２８：
プライマー Ｅｏ２１ Ｆｗ
配列番号２９：
ｐTD1 Vector
配列番号３０：
ｐTD2 Vector
カイコフィブロインＬ鎖遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号２：
カイコセリシン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号３：
ＡｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号４：
ＢｍＣＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号５：
ＥｓＣＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号６：
ＨｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号７：
ＣｒＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号８：
ＥｏＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号９：
ＭｎＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号１０：
ＳｆＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号１１：
ＷｓＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号１２：
プライマー Ｌｕｃ Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ
配列番号１３：
プライマー Ｌｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ
配列番号１４：
プライマー Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ
配列番号１５：
プライマー Ｔ７ｐ Ｒｖ
配列番号１６：
プライマー Ｌuc−ＡＴＧ
配列番号１７：
プライマー Ｔ７ｐＭｎ−Ｅｃｏ
配列番号１８：
プライマー Ｍ１３Ｒｅｖｅｒｓｅ
配列番号１９：
プライマー Ｐｈｄ３ Ｆｗ
配列番号２０：
プライマー Ｐｈｄ３ Ｒｖ−Ｈｉｎｄ
配列番号２１：
プライマー Ａ２５Ｔ７ｔ
配列番号２２：
プライマー Ｎｏｔ−Ｆｗ
配列番号２３：
プライマー Ｐｈｄ３ Ｒｖ
配列番号２４：
プライマー Ｎｏｔ−Ｒｖ
配列番号２５：
プライマー Ｔ７ｐＥｏ−Ｅｃｏ
配列番号２６：
プライマー Ｅｃｏ−Ｋｐｎ
配列番号２７：
プライマー Ｍｎ２９ Ｒｖ
配列番号２８：
プライマー Ｅｏ２１ Ｆｗ
配列番号２９：
ｐTD1 Vector
配列番号３０：
ｐTD2 Vector
Claims (14)
- 翻訳反応促進活性を有する配列表の配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片を含む発現ベクター。
- 請求項１に記載された発現ベクターを用いた、無細胞系タンパク質合成方法。
- 動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成反応液を用いた、請求項２に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
- 動物由来の抽出物が節足動物から抽出されたものである、請求項３に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
- 節足動物が昆虫組織である、請求項４に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
- 昆虫組織がカイコ組織である、請求項５に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
- 節足動物が昆虫培養細胞である、請求項４に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
- 昆虫培養細胞がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来及び/又はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の細胞である、請求項７に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
- 動物由来の抽出物が哺乳動物細胞から抽出されたものである、請求項３に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
- 哺乳動物細胞が哺乳動物培養細胞である、請求項９に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
- 哺乳動物培養細胞が、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ細胞である請求項１０に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
- 哺乳動物細胞がウサギ網状赤血球である、請求項９に記載の無細胞タンパク質合成方法。
- コムギ胚芽由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成反応液を用いた、請求項２に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
- 請求項１から１３のいずれかに記載の発現ベクター含む、無細胞系タンパク質合成用キット。
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| JP2005262518A JP4442535B2 (ja) | 2004-12-07 | 2005-09-09 | 翻訳反応促進ｄｎａ断片を含む発現ベクター及びそれを用いたタンパク質合成方法 |
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