JP2009207449A - ラミニンコイルドコイル（ｌｃｃ）ドメインヘテロ多量体を含むタンパク質会合体の調製方法 - Google Patents
ラミニンコイルドコイル（ｌｃｃ）ドメインヘテロ多量体を含むタンパク質会合体の調製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009207449A JP2009207449A JP2008055649A JP2008055649A JP2009207449A JP 2009207449 A JP2009207449 A JP 2009207449A JP 2008055649 A JP2008055649 A JP 2008055649A JP 2008055649 A JP2008055649 A JP 2008055649A JP 2009207449 A JP2009207449 A JP 2009207449A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- laminin
- preparation
- domain
- lcc
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】種々のラミニン又はその会合部分を効率よく大量に調製する方法を提供すること
【解決手段】還元剤が存在しない条件下、昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系を用い、目的のタンパク質会合体を構成する各サブユニットを合成することによって、ラミニンコイルドコイル（ＬＣＣ）ドメインヘテロ多量体を含むタンパク質会合体を得る。
【選択図】なし
【解決手段】還元剤が存在しない条件下、昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系を用い、目的のタンパク質会合体を構成する各サブユニットを合成することによって、ラミニンコイルドコイル（ＬＣＣ）ドメインヘテロ多量体を含むタンパク質会合体を得る。
【選択図】なし
Description
本発明は、ラミニンの会合部分であるコイルドコイルドメインヘテロ多量体を少なくとも含むタンパク質会合体を調製する方法に関する。
生体内に大量に存在する細胞外マトリックスは（extracellular matrix: ＥＣＭ）、以前は「細胞と細胞の隙間を埋める単なる詰め物」と見なされることが多かったが、近年、細胞の運命決定に重要な役割を担っていることが次第に明らかとなり、哺乳動物の組織形成の理解には、細胞自体の性質や挙動だけでなく、それらを制御するＥＣＭの時間的・空間的挙動を理解することが必須となっている。特に近年注目を集めている体性幹細胞を用いた再生医学・組織工学においては、幹細胞の維持あるいは分化に必要なＥＣＭの組成が解明されつつあり、医療材料としての幹細胞にとって欠くことのできない存在になることが予想される。目的のＥＣＭを必要なときに必要なだけ調製する技術が開発できれば、再生医療分野に体性幹細胞発見以来の新たな改革をもたらすものと期待される。このように、本格的に始まろうとしている再生医療を見据えて、幹細胞の培養基質としてヒト型ラミニンを大量に調製する方法を確立することが切望されている。
ＥＣＭはその存在様式から間質と基底膜の二つに大別することができる。間質型のＥＣＭは結合組織において細胞を取り囲むように存在しており、フィブロネクチンやコラーゲン繊維などが有名である。一方、基底膜は上皮細胞がその基底面で接する厚さ100 nmほどの薄いシート状の構造をしており、ラミニンやIV型コラーゲンなどから構成される。従って、生体組織から基底膜成分を精製することは、一般的に困難である。
Engelbreth-Holm-Swarm（ＥＨＳ）腫瘍と呼ばれる特殊なマウス移植腫瘍から、ラミニン−１１１（α１β１γ１）を大量に精製することが可能なため、ラミニンの構造や機能、生理活性の解析は、これまでほとんどラミニン−１１１について行われてきた。
さまざまな種類のラミニンを解析に用いるためには、長大なラミニン各鎖の遺伝子の全長を単離して、哺乳動物培養細胞で組換えラミニンを発現・分泌させる手法が取られてきたが、この方法ではせいぜい1 mg/L程度の組み換えラミニンしか得られない。ラミニンの大量調製系構築の試みは、酵母や蚕を用いた系で行われたがいずれも成功していない。おそらくラミニン各鎖の分子量が１０万以上と非常に大きく、複数のジスルフィド結合により複雑なコンフォメーションをとるのに加えて、三量体を形成することも原因のひとつであろう。
林良敬ら（特許文献１）は、EHS腫瘍からラミニンを大量に分泌する細胞株の樹立方法を発明しているが、ヒト型ラミニンを得るためには３本の鎖を同時に導入しなければならず、またヒト−マウス・キメララミニンも生成することから、精製効率も高くない。同じく、林良敬ら（特許文献２）はラミニン−１１１を大量に分泌するマウスの胚性腫瘍細胞株を用い、α１鎖の遺伝子を相同組み替えによって、他のラミニン鎖と入れ替える方法を発明したが、この方法ではヒト型ラミニンは作成できない。
尚、本出願人の一人は、先行する特許出願（特許文献３）において、昆虫培養細胞抽出液由来の新規無細胞タンパク質合成系の開発に成功したことを報告した。また、当該無細胞タンパク質合成系に関連する技術についても出願している（特許文献４、５）。一方、当該無細胞タンパク質合成系の適用例として、還元剤が存在しない条件下で大腸菌アルカリホスファターゼとヒトリソザイムの合成に成功したことが報告されている（非特許文献１）。また、無細胞タンパク合成系において、合成反応液に界面活性剤を添加することで、通常は不溶化してしまい合成が難しい膜蛋白質を大量に調製することが出来たことが報告されている（非特許文献２）。
特開２００４−１３５５１９号公報
特開２００６−３０４６６８号公報
特開２００４−２１５６５１号公報
特開２００６−１８７２７５号公報
特開２００７−１４３４３５号公報
Ezure, T., Suzuki, T., Shikata, M., Ito, M. et al., Expression of proteins containing disulfide bonds in an insect cell-free system and confirmation of their arrangements by MALDI-TOF mass spectrometry. Proteomics 2007, 7, 4424-4434
Related Articles, LinksIshihara G, Goto M, Saeki M, Ito K, Hori T, Kigawa T, Shirouzu M, Yokoyama S. Expression of G protein coupled receptors in a cell-free translational system using detergents and thioredoxin-fusion vectors. Protein Expr Purif. 2005 May;41(1):27-37.
さまざまな種類のラミニンを解析に用いるためには、長大なラミニン各鎖の遺伝子の全長を単離して、哺乳動物培養細胞で組換えラミニンを発現・分泌させる手法が取られてきたが、この方法ではせいぜい1 mg/L程度の組み換えラミニンしか得られない。ラミニンの大量調製系構築の試みは、酵母や蚕を用いた系で行われたがいずれも成功していない。おそらくラミニン各鎖の分子量が１０万以上と非常に大きく、複数のジスルフィド結合により複雑なコンフォメーションをとるのに加えて、三量体を形成することも原因のひとつであろう。
林良敬ら（特許文献１）は、EHS腫瘍からラミニンを大量に分泌する細胞株の樹立方法を発明しているが、ヒト型ラミニンを得るためには３本の鎖を同時に導入しなければならず、またヒト−マウス・キメララミニンも生成することから、精製効率も高くない。同じく、林良敬ら（特許文献２）はラミニン−１１１を大量に分泌するマウスの胚性腫瘍細胞株を用い、α１鎖の遺伝子を相同組み替えによって、他のラミニン鎖と入れ替える方法を発明したが、この方法ではヒト型ラミニンは作成できない。
尚、本出願人の一人は、先行する特許出願（特許文献３）において、昆虫培養細胞抽出液由来の新規無細胞タンパク質合成系の開発に成功したことを報告した。また、当該無細胞タンパク質合成系に関連する技術についても出願している（特許文献４、５）。一方、当該無細胞タンパク質合成系の適用例として、還元剤が存在しない条件下で大腸菌アルカリホスファターゼとヒトリソザイムの合成に成功したことが報告されている（非特許文献１）。また、無細胞タンパク合成系において、合成反応液に界面活性剤を添加することで、通常は不溶化してしまい合成が難しい膜蛋白質を大量に調製することが出来たことが報告されている（非特許文献２）。
以上の背景の下、本発明の目的は、種々のラミニン又はその会合部分を効率よく大量に調製する方法を提供することである。
特許文献３に開示された、昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系では、通常、酸化防止などの目的で還元剤を含む反応液を用いる。本願発明者らは、ラミニンを対象とした研究の経験とそれによって習得した知識を踏まえ、上記無細胞タンパク質合成系をラミニンの合成に適用する場合、反応液中の還元剤がサブユニットの会合に悪影響を及ぼすと予想した。言い換えれば、無細胞タンパク質合成の際に、反応組成液より還元剤を除いた反応系を用いれば、ラミニンサブユニットのジスルフィド結合による多量体の形成（サブユニットの会合）が促され、天然型ラミニンの構造を備える分子が生成すると考えた。この考えに基づく調製法の実効性及び有効性を確認すべく、一例としてヒトラミニンα３Ａ鎖、β３鎖、γ２鎖の各コイルドコイルドメインが会合した分子の調製を試みたところ、ヘテロ二量体及びヘテロ三量体の形成を認めた。一方、ラミニンサブユニットであるラミニンβ鎖の合成実験の結果、合成時に界面活性剤を添加すると、合成されたβ鎖の可溶化が顕著に促進されることが判明した。この結果を考慮しつつ、ヒトラミニンβ３鎖のコイルドコイルドメインとγ２鎖のコイルドコイルドメインが会合したヘテロ二量体の合成実験を施行した。その結果、界面活性剤の存在下でタンパク質の合成（翻訳）と精製を行うと、ジスルフィド結合による架橋によって会合した複合体を効率よく調製できることが示された。本発明は主として以上の成果に基づくものであり、次の通りである。
［１］ラミニンコイルドコイル（ＬＣＣ）ドメインヘテロ多量体を含むタンパク質会合体の調製方法であって、
還元剤が存在しない条件下、昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系を用い、目的のタンパク質会合体を構成する各サブユニットを合成することを特徴とする調製方法。
［２］各サブユニットの合成が、界面活性剤が存在する条件下で実施されることを特徴とする、［１］に記載の調製方法。
［３］以下のステップを含むことを特徴とする、［１］に記載の調製方法：
（１）目的のタンパク質会合体を構成する各サブユニットについて、それをコードするｍＲＮＡを合成するステップ；
（２）還元剤が存在しない条件下、昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系を用い、ステップ（１）で合成した各ｍＲＮＡからタンパク質を同一反応容器内において合成するステップ；
（３）ステップ（２）の結果として形成されたタンパク質会合体を精製するステップ。
［４］ステップ（２）及びステップ（３）が、界面活性剤が存在する条件下で実施されることを特徴とする、［３］に記載の調製方法。
［５］ステップ（１）後の反応液、無細胞タンパク質合成反応用試薬、及びマグネシウムイオンと錯体を形成するキレート剤を混合した後、ステップ（２）を実施することを特徴とする、［３］又は［４］に記載の調製方法。
［６］タンパク質会合体がヒト由来であることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の調製方法。
［７］ＬＣＣドメイン多量体がＬＣＣドメインヘテロ三量体であることを特徴とする、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の調製方法。
［８］ＬＣＣドメインヘテロ三量体が、ラミニン−１１１、２１１、１２１、２２１、３３２、３Ｂ３２、３１１、３２１、４１１、４２１、５１１、５２１、２１３、４２３、５２２及び５２３からなる群より選択されるラミニンのＬＣＣドメインヘテロ三量体であることを特徴とする、［７］に記載の調製方法。
［９］ＬＣＣドメイン多量体が、（１）ラミニン−３３２のコイルドコイルドメインヘテロ三量体、又は（２）ラミニンβ３鎖のコイルドコイルドメインとラミニンγ２鎖のコイルドコイルドメインからなるヘテロ二量体であることを特徴とする、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の調製方法。
［１０］昆虫培養細胞がＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の細胞であることを特徴とする、［１］〜［９］のいずれか一項に記載の調製方法。
［１］ラミニンコイルドコイル（ＬＣＣ）ドメインヘテロ多量体を含むタンパク質会合体の調製方法であって、
還元剤が存在しない条件下、昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系を用い、目的のタンパク質会合体を構成する各サブユニットを合成することを特徴とする調製方法。
［２］各サブユニットの合成が、界面活性剤が存在する条件下で実施されることを特徴とする、［１］に記載の調製方法。
［３］以下のステップを含むことを特徴とする、［１］に記載の調製方法：
（１）目的のタンパク質会合体を構成する各サブユニットについて、それをコードするｍＲＮＡを合成するステップ；
（２）還元剤が存在しない条件下、昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系を用い、ステップ（１）で合成した各ｍＲＮＡからタンパク質を同一反応容器内において合成するステップ；
（３）ステップ（２）の結果として形成されたタンパク質会合体を精製するステップ。
［４］ステップ（２）及びステップ（３）が、界面活性剤が存在する条件下で実施されることを特徴とする、［３］に記載の調製方法。
［５］ステップ（１）後の反応液、無細胞タンパク質合成反応用試薬、及びマグネシウムイオンと錯体を形成するキレート剤を混合した後、ステップ（２）を実施することを特徴とする、［３］又は［４］に記載の調製方法。
［６］タンパク質会合体がヒト由来であることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の調製方法。
［７］ＬＣＣドメイン多量体がＬＣＣドメインヘテロ三量体であることを特徴とする、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の調製方法。
［８］ＬＣＣドメインヘテロ三量体が、ラミニン−１１１、２１１、１２１、２２１、３３２、３Ｂ３２、３１１、３２１、４１１、４２１、５１１、５２１、２１３、４２３、５２２及び５２３からなる群より選択されるラミニンのＬＣＣドメインヘテロ三量体であることを特徴とする、［７］に記載の調製方法。
［９］ＬＣＣドメイン多量体が、（１）ラミニン−３３２のコイルドコイルドメインヘテロ三量体、又は（２）ラミニンβ３鎖のコイルドコイルドメインとラミニンγ２鎖のコイルドコイルドメインからなるヘテロ二量体であることを特徴とする、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の調製方法。
［１０］昆虫培養細胞がＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の細胞であることを特徴とする、［１］〜［９］のいずれか一項に記載の調製方法。
本発明の調製方法によれば、反応組成液より還元剤を除いた反応系を用いることで、各ラミニンサブユニットのＬＣＣドメインが適切に会合した構造を備えるタンパク質会合体が得られる。また、当該タンパク質会合体を簡便且つ迅速に提供することが可能である。さらには、界面活性剤の存在下でタンパク質の合成と精製を行うことにすれば、精製効率が上昇し、量産が可能となる。
本発明はラミニンコイルドコイル（ＬＣＣ：Laminin Coiled Coil）ドメインヘテロ多量体を含むタンパク質会合体の調製方法に関する。本発明の調製方法によって得られるタンパク質会合体は、ＬＣＣドメインヘテロ多量体を少なくとも含む。「ＬＣＣドメインヘテロ多量体」とは、ラミニンを構成する２種類以上のサブユニット（例えばヒトラミニンα鎖、β鎖、γ鎖）のコイルドコイルドメインが会合したものをいう。従って、ラミニンα鎖、β鎖及びγ鎖のコイルドコイルドメインが会合したものに限らず、例えばラミニンβ鎖とγ鎖のコイルドコイルドメインが会合したもの（ヘテロ二量体）も「ＬＣＣドメインヘテロ多量体」に該当する。但し、典型的には、本発明によって調製されるタンパク質会合体（以下、「目的産物」ともいう）はＬＣＣドメインヘテロ三量体を含む。
完全な構造のラミニンを「目的産物」としてもよい。即ち、完全な構造のラミニンの調製にも本発明の調製方法を適用することが可能である。一方、ＬＣＣドメインヘテロ多量体のみからなるタンパク質会合体の調製に本発明の調製方法を適用してもよい。尚、ここでの「完全な構造」とは、天然型ラミニンと同様に会合部分（「長腕」とも呼ばれる）に加え、各サブユニットのＮ末端側領域からなる短腕も備えた構造（十字架構造）をいう。
「目的産物」の由来（換言すれば、目的産物を構成する各サブユニットの生物種）も特に限定されない。ここでの「由来」となる生物種として、哺乳類（ヒト、チンパンジー、サルなどの霊長類、ラット、マウス、モルモットなどの齧歯類、ウシ、ブタ、ウマ、羊、ヤギなどの家畜、イヌ、ネコなどのペット動物を含む）、鳥類（ニワトリ、ウズラなど）、魚類、昆虫を例示することができる。
好ましくは、「目的産物」はヒト由来である。即ち、好ましい一態様では、ヒトラミニン（ラミニン−１１１、２１１、１２１、２２１、３３２、３Ｂ３２、３１１、３２１、４１１、４２１、５１１、５２１、２１３、４２３、５２２及び５２３のいずれか）の会合部分であるコイルドコイルドメインヘテロ三量体、又はそれを含むタンパク質会合体が調製される。各ヒトラミニンにおけるサブユニットの組合せを以下に示す。
ラミニン−１１１（以前の呼称はラミニン−１）：α１β１γ１
ラミニン−２１１（以前の呼称はラミニン−２）：α２β１γ１
ラミニン−１２１（以前の呼称はラミニン−３）：α１β２γ１
ラミニン−２２１（以前の呼称はラミニン−４）：α２β２γ１
ラミニン−３３２（以前の呼称はラミニン−５）：α３Ａβ３γ２
ラミニン−３Ｂ３２（以前の呼称はラミニン−５Ｂ）：α３Ｂβ３γ２
ラミニン−３１１（以前の呼称はラミニン−６）：α３β１γ１
ラミニン−３２１（以前の呼称はラミニン−７）：α３β２γ１
ラミニン−４１１（以前の呼称はラミニン−８）：α４β１γ１
ラミニン−４２１（以前の呼称はラミニン−９）：α４β２γ１
ラミニン−５１１（以前の呼称はラミニン−１０）：α５β１γ１
ラミニン−５２１（以前の呼称はラミニン−１１）：α５β２γ１
ラミニン−２１３（以前の呼称はラミニン−１２）：α２β１γ３
ラミニン−４２３（以前の呼称はラミニン−１４）：α４β２γ３
ラミニン−５２２：α５β２γ２
ラミニン−５２３（以前の呼称はラミニン−１５）：α５β２γ３
好ましくは、「目的産物」はヒト由来である。即ち、好ましい一態様では、ヒトラミニン（ラミニン−１１１、２１１、１２１、２２１、３３２、３Ｂ３２、３１１、３２１、４１１、４２１、５１１、５２１、２１３、４２３、５２２及び５２３のいずれか）の会合部分であるコイルドコイルドメインヘテロ三量体、又はそれを含むタンパク質会合体が調製される。各ヒトラミニンにおけるサブユニットの組合せを以下に示す。
ラミニン−１１１（以前の呼称はラミニン−１）：α１β１γ１
ラミニン−２１１（以前の呼称はラミニン−２）：α２β１γ１
ラミニン−１２１（以前の呼称はラミニン−３）：α１β２γ１
ラミニン−２２１（以前の呼称はラミニン−４）：α２β２γ１
ラミニン−３３２（以前の呼称はラミニン−５）：α３Ａβ３γ２
ラミニン−３Ｂ３２（以前の呼称はラミニン−５Ｂ）：α３Ｂβ３γ２
ラミニン−３１１（以前の呼称はラミニン−６）：α３β１γ１
ラミニン−３２１（以前の呼称はラミニン−７）：α３β２γ１
ラミニン−４１１（以前の呼称はラミニン−８）：α４β１γ１
ラミニン−４２１（以前の呼称はラミニン−９）：α４β２γ１
ラミニン−５１１（以前の呼称はラミニン−１０）：α５β１γ１
ラミニン−５２１（以前の呼称はラミニン−１１）：α５β２γ１
ラミニン−２１３（以前の呼称はラミニン−１２）：α２β１γ３
ラミニン−４２３（以前の呼称はラミニン−１４）：α４β２γ３
ラミニン−５２２：α５β２γ２
ラミニン−５２３（以前の呼称はラミニン−１５）：α５β２γ３
本発明では、還元剤が存在しない条件下、昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系を用い、目的のタンパク質会合体を構成する各サブユニットを合成する。このように本発明では、還元剤が反応容器内に存在しないという特殊な条件の下、昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系を適用する。この特徴により、合成後に各サブユニットが適切に会合し、ＬＣＣドメインヘテロ多量体が形成される。「還元剤が存在しない条件下」とは、ラミニンを構成する各サブユニット間のジスルフィド結合の切断を起こす量の還元剤を含まないという意味であり、各サブユニット間に形成されたジスルフィド結合が保持される量の還元剤を含むことを許容する。具体的には、無細胞系タンパク合成反応液中の還元剤の濃度としては、好ましくは０〜０．５ｍＭ、更に好ましくは０〜０．１ｍＭとする。「還元剤」の例としてジチオスレイトール（ＤＴＴ）や2-メルカプトエタノール、還元型グルタチオン等が挙げられる。尚、本明細書における「無細胞タンパク質合成系」は、無細胞翻訳系と同義であって、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する反応系を指すものとする。従って、ここでの「合成する」とは、ｍＲＮＡからタンパク質を合成すること（即ち翻訳反応）を指すことになる。
ところで、サブユニット間の適切な会合を達成するためには、各サブユニットが可溶化状態を維持することが重要である。本発明者らの検討の結果、合成の際に界面活性剤を添加すると、合成されたサブユニットの可溶化が促されることが示された。この知見に基づけば、サブユニット間の適切な会合を生じさせるためには界面活性剤を使用することが好ましい。そこで本発明の好ましい一態様では、還元剤が存在しないという条件に加え、界面活性剤が存在するという条件の下で各サブユニットの合成を行う。合成されたサブユニットの可溶化という目的が達成される限り、界面活性剤の種類は特に問わない。好ましい界面活性剤として非イオン性界面活性剤を挙げることができる。非イオン性界面活性剤としてはポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテルが挙げられ、具体的にはＮＰ−４０（Nonidet P-40）やTriton X-100、Tween 20、Briji35、Digitoninを例示することができる。界面活性剤の濃度も特に限定されない。例えば、反応液中の界面活性剤の濃度が０．２％（W/V）〜１．４％（W/V）となるようにすればよい。
本発明では、「昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系」が利用される。以下、昆虫培養細胞抽出液の調製方法（以下、「抽出液調製方法」という）を説明する。尚、詳細は特開２００４−２１５６５１号公報を参照されたい。
ここで説明する抽出液調製方法では、抽出用液中に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させることを要する。当該抽出液調製方法において、「急激に凍結」とは、凍結処理に付した後、１０秒以下、好ましくは２秒以下で昆虫細胞を凍結させることを指す。昆虫細胞の凍結を急激に行わなかった場合には、タンパク質合成に必須な成分が不活化する虞があり好ましくない。
上記のように昆虫細胞を急激に凍結させる温度としては、通常−８０℃以下であり、好ましくは−１５０℃以下である。−８０℃を越える温度で急激に凍結させると、タンパク質合成に必須な成分が失活してタンパク質合成能が低下してしまう傾向にあるためである。
ここで説明する抽出液調製方法では、抽出用液中に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させることを要する。当該抽出液調製方法において、「急激に凍結」とは、凍結処理に付した後、１０秒以下、好ましくは２秒以下で昆虫細胞を凍結させることを指す。昆虫細胞の凍結を急激に行わなかった場合には、タンパク質合成に必須な成分が不活化する虞があり好ましくない。
上記のように昆虫細胞を急激に凍結させる温度としては、通常−８０℃以下であり、好ましくは−１５０℃以下である。−８０℃を越える温度で急激に凍結させると、タンパク質合成に必須な成分が失活してタンパク質合成能が低下してしまう傾向にあるためである。
上記昆虫細胞の急激な凍結は、たとえば、液体窒素や液体ヘリウムなどの不活性ガスを使用することなどによって実現できるが、入手が容易であり安価な液体窒素を用いて行うのが好ましい。
当該抽出液調製方法においては、昆虫細胞からの抽出に際して、抽出用液中に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有しているならば、その他の工程について特に制限はない。たとえば、乳鉢中で乳棒を用いてすり潰す方法、ダウンスホモジナイザーを用いる方法、ガラスビーズを用いる方法など、大腸菌や小麦胚芽などから無細胞系タンパク質合成用の抽出液を得る際に従来より行われていた種々の手法にて昆虫細胞を破砕し、抽出を行えばよいが、昆虫細胞は、大腸菌や小麦胚芽などから無細胞系タンパク質合成用の抽出液を得る場合と比較して細胞の破砕が容易であり、さらには、この凍結・解凍によるだけの破砕法により得られた抽出液にはタンパク質合成に必須な成分が活性を保持した状態で含まれているという理由によりタンパク質合成能の高い抽出液を得ることができるという利点もあることから、上記昆虫細胞を急激に凍結させた後、解凍し、遠心分離することによって昆虫細胞を破砕するのが好ましい。
上記急激に凍結した昆虫細胞を、解凍した後、遠心分離する場合、解凍は、たとえば−１０℃〜２０℃の水浴または氷水浴中での解凍、室温（２５℃）にての放置などによって実現できるが、タンパク質合成に必須な成分の失活を防止し、タンパク質合成能の低下を確実に防ぐことから、０℃〜２０℃（特には、４℃〜１０℃）の水浴または氷水浴中で解凍を行うのが好ましい。解凍した昆虫細胞の遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行えばよい。かかる遠心分離後の上清には、目的とする昆虫細胞の抽出物が含有される。
抽出液調製方法に用いる昆虫細胞としては、特に制限はなく、たとえば、鱗翅目、直翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目、甲虫目、脈翅目、半翅目などの昆虫由来の細胞を使用することができる。中でも、培養細胞株が多く樹立されていることから鱗翅目、半翅目などの昆虫由来の細胞が好ましい。また、昆虫細胞としては、いかなる組織由来の細胞であってもよく、たとえば、血球細胞、生殖巣由来細胞、脂肪体由来細胞、胚由来細胞、孵化幼虫由来細胞などを特に制限なく使用することができる。中でも、タンパク質生産能が高いと考えられる生殖巣由来細胞を使用するのが好ましい。特に、細胞系においてタンパク質合成能が高く、また無血清培地にて培養が可能であることから、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来の細胞であるＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）やＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の細胞であるＳｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を昆虫細胞として用いるのが好ましい。
尚、単一種の昆虫における単一の組織由来の昆虫細胞に限らず、単一種の昆虫における複数種の組織由来であってよく、複数種の昆虫における単一の組織由来であってもよく、無論、複数種の昆虫における複数種の組織由来であってもよい。
尚、単一種の昆虫における単一の組織由来の昆虫細胞に限らず、単一種の昆虫における複数種の組織由来であってよく、複数種の昆虫における単一の組織由来であってもよく、無論、複数種の昆虫における複数種の組織由来であってもよい。
抽出液調製方法に用いられる抽出用液は、特に制限されるものではないが、プロテアーゼインヒビターを少なくとも含有するのが好ましい。プロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液を用いると、昆虫細胞由来の抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパクの不所望な分解を防止でき、結果として昆虫細胞由来の抽出物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すことができるようになるという利点がある。
上記プロテアーゼインヒビターとしては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるならば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがある。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エチレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用することができるが、昆虫細胞由来の抽出液にはセリンプロテアーゼが含まれることから、上記中でもセリンプロテアーゼに対して特異性の高いインヒビターとして働くＰＭＳＦを使用するのが好ましい。また、１種類のプロテアーゼインヒビターのみならず、数種類の混合物（プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いてもよい。
当該抽出用液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特に制限はないが、酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
また、抽出用液は、上記プロテアーゼインヒビターに加えて、カリウム塩、マグネシウム塩、および緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。
上記カリウム塩としては、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
上記カリウム塩としては、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
当該抽出用液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜３００ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
上記マグネシウム塩としては、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
当該抽出液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
上記緩衝剤は、抽出液に緩衝能を付与し、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こる抽出液のｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては、特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。
緩衝剤は、当該抽出液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６．５〜８．５に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を使用するのが特に好ましい。
緩衝剤は、当該抽出液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６．５〜８．５に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を使用するのが特に好ましい。
当該抽出液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
また、上記組成に加えて、塩化カルシウムおよびグリセロールをさらに含有してなる抽出用液を用いると、タンパク質合成能がより向上された昆虫細胞抽出液を得ることができるため好ましい。
この場合、塩化カルシウムの含有量は特に制限されないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであるのが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭであるのがより好ましい。また、グリセロールの添加量についても特に制限されるものではないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、５（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのが好ましく、１０（ｖ／ｖ）％〜５０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのがより好ましい。
この場合、塩化カルシウムの含有量は特に制限されないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであるのが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭであるのがより好ましい。また、グリセロールの添加量についても特に制限されるものではないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、５（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのが好ましく、１０（ｖ／ｖ）％〜５０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのがより好ましい。
抽出液調製方法において、細胞破砕後から、無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液を得るまでの手順等については特に制限されるものではない。図１は、好ましい調製方法１〜３を簡略化して示すフローチャートである。図１に示す各調製方法１〜３においては、上述したように急激な凍結後、解凍して遠心分離を行う方法によって細胞破砕を行う例を示している。
図１に示すように、抽出液調製方法においては、細胞破砕後、上記遠心分離後の上清（上清１Ａ）をそのまま抽出液としてもよいし、また上清１Ａをさらに遠心分離（１０，０００×ｇ〜１００，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜１２０分間）にかけて、得られた上清（上清１Ｂ）を抽出液（上清１）としてもよい（以下「調製方法１」と呼ぶ）。さらに、上記上清１（上清１Ａまたは１Ｂ）をゲル濾過し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分（吸収の大きな画分）を分取して、これを抽出液としてもよい（以下「調製方法２」と呼ぶ）。この場合、具体的には以下の手順にて行う。
図１に示すように、抽出液調製方法においては、細胞破砕後、上記遠心分離後の上清（上清１Ａ）をそのまま抽出液としてもよいし、また上清１Ａをさらに遠心分離（１０，０００×ｇ〜１００，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜１２０分間）にかけて、得られた上清（上清１Ｂ）を抽出液（上清１）としてもよい（以下「調製方法１」と呼ぶ）。さらに、上記上清１（上清１Ａまたは１Ｂ）をゲル濾過し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分（吸収の大きな画分）を分取して、これを抽出液としてもよい（以下「調製方法２」と呼ぶ）。この場合、具体的には以下の手順にて行う。
まず、上清１Ａまたは上清１Ｂについてゲル濾過を行うが、ゲル濾過は、たとえば脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）を好適に使用することができ、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記ゲル濾過用緩衝液にて溶出する、というような条件にて行えばよい。上記ゲル濾過用緩衝液としては、従来公知の適宜の組成のものを特に制限なく使用することができ、たとえば、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）、５０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦを含有するゲル濾過用緩衝液を用いることができる。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
続いて、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャム バイオサイエンス社製）などの機器を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分（吸収の大きな画分）をゲル濾過後の濾液より分取して、これを抽出液とする。
続いて、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャム バイオサイエンス社製）などの機器を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分（吸収の大きな画分）をゲル濾過後の濾液より分取して、これを抽出液とする。
また上記調製方法２で得られた吸収の大きな画分を、さらに遠心分離にかけて、得られた上清（上清２）を抽出液とするようにしてもよい（以下、「調製方法３」と呼ぶ）。このゲル濾過後の遠心分離は、翻訳反応を阻害する不溶性の成分を除去するという理由から、３０，０００×ｇ〜１００，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間の条件で行うのが、好ましい。
なお、抽出液調製方法に供する昆虫細胞は、培養に用いる培地の翻訳反応液への持込みを避けるため、上記急激な凍結を行う前に、プロテアーゼインヒビターおよびグリセロールを含有しない以外は、上述した昆虫細胞用の好適な抽出用液と同じ組成の洗浄液にて予め洗浄しておくのが好ましい。洗浄液での洗浄は、昆虫細胞に洗浄液を添加し、これを遠心分離（たとえば、７００×ｇ、１０分間、４℃という条件）することによって行う。洗浄に用いる洗浄液の量は、培地を完全に洗い流すという理由から、湿重量１ｇの昆虫細胞に対し５ｍＬ〜１００ｍＬであるのが好ましく、１０ｍＬ〜５０ｍＬであるのがより好ましい。洗浄回数は、１回〜５回行うのが好ましく、２回〜４回行うのがより好ましい。
また本発明の調製方法に供する昆虫細胞の量は、特に制限されるものではないが、抽出効率を最適に保つため、抽出液１ｍＬに対して０．１ｇ〜５ｇであるのが好ましく、０．５ｇ〜２ｇであるのがより好ましい。
上記方法にて調製された無細胞タンパク質合成系用の昆虫細胞抽出液は、昆虫細胞由来の抽出物をタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ含有することが好ましく、１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ含有することがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、昆虫細胞抽出液の作用に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを越えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しづらい虞があるためである。
該抽出液中の昆虫細胞由来の抽出物の含有量は、タンパク質濃度を測定することで決定され、たとえば、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、タンパク質濃度を測定することによって決定される。具体的には、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用し、検量線を作成する。このような手法により測定することができる。
該抽出液中の昆虫細胞由来の抽出物の含有量は、タンパク質濃度を測定することで決定され、たとえば、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、タンパク質濃度を測定することによって決定される。具体的には、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用し、検量線を作成する。このような手法により測定することができる。
また抽出液中に含有される抽出物が昆虫細胞由来のものであるか否かは、たとえば、抽出液中のリボソームＲＮＡの塩基配列解析を行うことによって判別することができる。
昆虫細胞抽出液は、昆虫細胞由来の抽出物をタンパク質濃度で１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ含有するとともに、５０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を含有するように実現されるのが好ましい。
昆虫細胞抽出液は、無細胞系タンパク質合成に供する前に、ヌクレアーゼ処理を施されたものであることが好ましい。ヌクレアーゼ処理の施された昆虫細胞抽出液を無細胞系タンパク質合成に供することで、ヌクレアーゼ処理を施さなかった昆虫細胞抽出液を用いた場合と比較して、より多くの量の目的タンパク質を合成することができる。これは、以下のような理由による。
無細胞系において目的タンパク質を合成する際、細胞抽出液由来の内在性ｍＲＮＡが含まれると、この内在性ｍＲＮＡがコードするタンパク質も合成されてしまう。たとえば、無細胞系において目的タンパク質を標識したいときに、この内在性ｍＲＮＡより合成されたタンパク質についても同時に標識されてしまい、その後の目的タンパク質の解析に支障をきたすことがある。また内在性ｍＲＮＡ存在下では目的のタンパク質の合成量も低下してしまう可能性が高い。よって、無細胞系タンパク質合成に用いられる細胞抽出液中には内在性ｍＲＮＡは含まれないことが望ましい。
無細胞系において目的タンパク質を合成する際、細胞抽出液由来の内在性ｍＲＮＡが含まれると、この内在性ｍＲＮＡがコードするタンパク質も合成されてしまう。たとえば、無細胞系において目的タンパク質を標識したいときに、この内在性ｍＲＮＡより合成されたタンパク質についても同時に標識されてしまい、その後の目的タンパク質の解析に支障をきたすことがある。また内在性ｍＲＮＡ存在下では目的のタンパク質の合成量も低下してしまう可能性が高い。よって、無細胞系タンパク質合成に用いられる細胞抽出液中には内在性ｍＲＮＡは含まれないことが望ましい。
ヌクレアーゼ処理は、従来公知の適宜の手法を特に制限なく用いることができるが、内在性のＲＮＡの中で、ｍＲＮＡのみに対し選択的に消化を行うことから、ｍＲＮＡをカルシウム存在下で選択的に分解するミクロコッカルヌクレアーゼを用いて昆虫細胞抽出液を処理することが好ましい。
具体的には、昆虫細胞抽出液に、ミクロコッカルヌクレアーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）及び塩化カルシウムを添加し、１５℃〜２５℃で５分間〜６０分間反応させる。ミクロコッカルヌクレアーゼは、翻訳反応開始後に外来ｍＲＮＡを分解または抽出液中のタンパク質合成に必須な成分を分解する虞があるため、終濃度が１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬとなるように添加するのが好ましく、３０μｇ／ｍＬ〜６０μｇ／ｍＬとなるように添加するのがより好ましい。また塩化カルシウムはカルシウムがミクロコッカルヌクレアーゼの活性化に必須であるが、翻訳反応を阻害する虞があるため、終濃度が０．０５ｍＭ〜５０ｍＭとなるように添加するのが好ましく、０．１ｍＭ〜１ｍＭとなるように添加するのがより好ましい。上記反応後、ミクロコッカルヌクレアーゼがカルシウム依存性であるため、カルシウムイオンをキレートし、ミクロコッカルヌクレアーゼを失活させることを目的として、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（以下、「ＥＧＴＡ」ということがある。）を添加する。ＥＧＴＡは、カルシウムイオンを充分にキレートできるように、終濃度が０．１ｍＭ〜１００ｍＭとなるように添加するのが好ましく、１ｍＭ〜２０ｍＭとなるように添加するのがより好ましい。
具体的には、昆虫細胞抽出液に、ミクロコッカルヌクレアーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）及び塩化カルシウムを添加し、１５℃〜２５℃で５分間〜６０分間反応させる。ミクロコッカルヌクレアーゼは、翻訳反応開始後に外来ｍＲＮＡを分解または抽出液中のタンパク質合成に必須な成分を分解する虞があるため、終濃度が１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬとなるように添加するのが好ましく、３０μｇ／ｍＬ〜６０μｇ／ｍＬとなるように添加するのがより好ましい。また塩化カルシウムはカルシウムがミクロコッカルヌクレアーゼの活性化に必須であるが、翻訳反応を阻害する虞があるため、終濃度が０．０５ｍＭ〜５０ｍＭとなるように添加するのが好ましく、０．１ｍＭ〜１ｍＭとなるように添加するのがより好ましい。上記反応後、ミクロコッカルヌクレアーゼがカルシウム依存性であるため、カルシウムイオンをキレートし、ミクロコッカルヌクレアーゼを失活させることを目的として、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（以下、「ＥＧＴＡ」ということがある。）を添加する。ＥＧＴＡは、カルシウムイオンを充分にキレートできるように、終濃度が０．１ｍＭ〜１００ｍＭとなるように添加するのが好ましく、１ｍＭ〜２０ｍＭとなるように添加するのがより好ましい。
次に、上記抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系による合成反応について説明する。合成反応においては、通常、上記抽出液に無細胞系でのタンパク質合成に要する添加物を添加した反応液として調製する。上記添加物に特に制限はなく、無細胞系のタンパク質合成の分野において従来より一般に使用されているものであれば特に制限はない。
尚、上記反応液は、本発明の抽出液が１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有されるように調製されるのが好ましい。すなわち、上記反応液の全体において、昆虫細胞由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、目的のタンパク質の合成速度が低下する虞があるためである。
尚、上記反応液は、本発明の抽出液が１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有されるように調製されるのが好ましい。すなわち、上記反応液の全体において、昆虫細胞由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、目的のタンパク質の合成速度が低下する虞があるためである。
通常、上記反応液としては、上記抽出液を除く成分として、カリウム塩、マグネシウム塩、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、外来ｍＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含有するものを用いる。これにより、短時間で大量のタンパク質の合成が可能であるというような利点をさらに有する無細胞系タンパク質合成用の反応液を実現できる。尚、上記成分以外の添加成分の例として、EGTAを挙げることができる。
当該反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
当該反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。
当該反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
当該反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
当該反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
当該反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
当該反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
当該反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在する昆虫細胞由来のＲＮａｓｅによって、無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
当該反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
反応液に含有される緩衝剤としては、上述した本発明の抽出液と同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出液における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
また上記反応液は、ＥＧＴＡを含有するのが好ましい。ＥＧＴＡを含有すると、ＥＧＴＡが抽出液中の金属イオンとキレートを形成することでリボヌクレアーゼ、プロテアーゼ等が不活化することにより、タンパク質合成に必須な成分の分解を阻害することができるためである。また上記のように抽出液にヌクレアーゼ処理を施した場合であっても、反応液がＥＧＴＡを含有することにより、ヌクレアーゼが無細胞系タンパク質合成に悪影響を及ぼすことを確実に防止することができる。該ＥＧＴＡは、上記反応液中において、上記分解阻害能を好適に発揮し得る観点から０．０１ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることがより好ましい。ＥＧＴＡが０．０１ｍＭ未満であると必須な成分の分解活性を充分に抑えることができない傾向にあるためであり、また、５０ｍＭを越えるとタンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
すなわち、本発明の無細胞系タンパク質合成方法に用いる反応液は、上記抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、２０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を含有するように実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．１ｍＭ〜１０ｍＭのＥＧＴＡを含有するように実現されるのがより好ましい。
本発明では、外来ｍＲＮＡとして、目的のタンパク質会合体を構成するサブユニットをコードするｍＲＮＡが使用される。例えば、ラミニン−３３２の会合部分を含むタンパク質会合体を調製する場合、α３Ａの少なくともＬＣＣドメイン部分をコードするｍＲＮＡ、β３の少なくともＬＣＣドメイン部分をコードするｍＲＮＡ、及びγ２の少なくともＬＣＣドメイン部分をコードするｍＲＮＡを用いる。尚、目的のタンパク質会合体の構造に応じて２種類又は３種類のｍＲＮＡが使用されることになる。以下、サブユニットをコードするｍＲＮＡの例を示す。
ラミニンα１：配列番号２３（GenBank Acc. no. NM_005559）：当該配列の4760番塩基〜6469番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンα２：配列番号２４（GenBank Acc. no. NM_000426）：当該配列の4825番塩基〜6564番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンα３Ａ：配列番号２５（GenBank Acc. no. NM_000227）：当該配列の640番塩基〜2415番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンα３Ｂ配列番号２６（GenBank Acc. no. NM_198129）：当該配列の5550番塩基〜7335番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンα４：配列番号２７（GenBank Acc. no. NM_001105206）：当該配列の1126番塩基〜2832番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンα５：配列番号２８（GenBank Acc. no. NM_005560）：当該配列の6566番塩基〜8293番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンβ１：配列番号２９（GenBank Acc. no. NM_002291）：当該配列の3870番塩基〜5693番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンβ２：配列番号３０（GenBank Acc. no. NM_002292）：当該配列の3867番塩基〜5693番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンβ３：配列番号３１（GenBank Acc. no. NM_000228）：当該配列の1885番塩基〜3660番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンγ１：配列番号３２（GenBank Acc. no. NM_002293）：当該配列の3348番塩基〜5084番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンγ２：配列番号３３（GenBank Acc. no. NM_005562）：当該配列の2139番塩基〜3893番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンγ３：配列番号３４（GenBank Acc. no. NM_006059）：当該配列の3135番塩基〜4823番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンα１：配列番号２３（GenBank Acc. no. NM_005559）：当該配列の4760番塩基〜6469番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンα２：配列番号２４（GenBank Acc. no. NM_000426）：当該配列の4825番塩基〜6564番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンα３Ａ：配列番号２５（GenBank Acc. no. NM_000227）：当該配列の640番塩基〜2415番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンα３Ｂ配列番号２６（GenBank Acc. no. NM_198129）：当該配列の5550番塩基〜7335番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンα４：配列番号２７（GenBank Acc. no. NM_001105206）：当該配列の1126番塩基〜2832番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンα５：配列番号２８（GenBank Acc. no. NM_005560）：当該配列の6566番塩基〜8293番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンβ１：配列番号２９（GenBank Acc. no. NM_002291）：当該配列の3870番塩基〜5693番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンβ２：配列番号３０（GenBank Acc. no. NM_002292）：当該配列の3867番塩基〜5693番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンβ３：配列番号３１（GenBank Acc. no. NM_000228）：当該配列の1885番塩基〜3660番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンγ１：配列番号３２（GenBank Acc. no. NM_002293）：当該配列の3348番塩基〜5084番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンγ２：配列番号３３（GenBank Acc. no. NM_005562）：当該配列の2139番塩基〜3893番塩基がＬＣＣドメインに対応する
ラミニンγ３：配列番号３４（GenBank Acc. no. NM_006059）：当該配列の3135番塩基〜4823番塩基がＬＣＣドメインに対応する
本発明に用いる外来ｍＲＮＡは、常法で用意すればよい（例えば、Molecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)、Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）が参考になる）。例えば、合成目的のサブユニットのＯＲＦ（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を市販のベクター、たとえば、ｐＴＮＴ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）の５’−βグロビンリーダー配列の下流に挿入し、これを用いて転写反応で得られたｍＲＮＡを用いることができる。また、転写反応の際にメチル化されたリボヌクレオチドなどを加えることにより付加されたキャップ構造を有する外来ｍＲＮＡを用いてもよい。
好ましくは、ｍＲＮＡからタンパク質を翻訳する際（ステップ（２）のとき）に、翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片を含む発現ベクターを用いる。ここで「翻訳反応促進活性を有する」とは、当該発現ベクターを使用して無細胞系タンパク質合成反応を行うことで、この翻訳反応を促進するＤＮＡ断片を使用しなかった場合と比較して、合成量が向上されることを指す。
当該発現ベクターに含まれる翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片としては、具体的には、配列表の配列番号１〜１１いずれかに示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ断片が挙げられる。これらのDNA断片にはこれらと均等な（配列番号１〜１１いずれかに示される塩基配列より、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された）塩基配列を有し、且つ翻訳反応促進活性を有する二本鎖ＤＮＡ断片も含まれる。
配列表の配列番号１〜１１に示す塩基配列は、それぞれ、カイコまたはバキュロウイルスにおける５'非翻訳領域（５'ＵＴＲ）として公知の塩基配列である。具体的には、配列番号１に示す塩基配列はカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号２に示す塩基配列はカイコのセリシン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号３に示す塩基配列はＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号４に示す塩基配列はＢｍＣＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号５に示す塩基配列はＥｓＣＰＶ（Ｅｕｘｏａ ｓｃａｎｄｅｓ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号６に示す塩基配列はＨｃＮＰＶ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号７に示す塩基配列はＣｒＮＰＶ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｒｏｓａｃｅａｎａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号８に示す塩基配列はＥｏＮＰＶ（Ｅｃｏｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号９に示す塩基配列はＭｎＮＰＶ（Ｍａｌａｃｏｓｍａ ｎｅｕｓｔｒｉａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号１０に示す塩基配列はＳｆＮＰＶ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号１１に示す塩基配列はＷｓＮＰＶ（Ｗｉｓｅａｎａ ｓｉｇｎａｔａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列として、それぞれ公知である。なお、本発明における発現ベクターに含まれるＤＮＡ断片は、カイコまたはバキュロウイルスの５'ＵＴＲに由来するものであれば、上記塩基配列を必ずしも有してなくともよい。
発現ベクターに含まれる上記ＤＮＡ断片は従来公知のいかなる方法により得られてもよい。たとえば、公知のＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。
発現ベクターに含まれる上記ＤＮＡ断片は従来公知のいかなる方法により得られてもよい。たとえば、公知のＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。
なお、発現ベクターに含まれる翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片のうち、顕著な翻訳反応促進活性を発揮し、特に好適なものとして以下のものが例示される。
（１）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（３）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（４）配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に２個組み込まれた発現ベクター；
（５）配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（６）配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に２個組み込まれた発現ベクター；
（７）配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（８）配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（９）配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（１０）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個または２個組み込まれた発現ベクター；
（１１）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（１２）配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（１３）配列番号１１に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター。
（１）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（３）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（４）配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に２個組み込まれた発現ベクター；
（５）配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（６）配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に２個組み込まれた発現ベクター；
（７）配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（８）配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（９）配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（１０）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個または２個組み込まれた発現ベクター；
（１１）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に逆方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（１２）配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター；
（１３）配列番号１１に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、プロモーター配列の３’下流側に順方向に１個組み込まれた発現ベクター。
発現ベクターは上記ＤＮＡ断片の５'上流側に、通常プロモーター配列を少なくとも一つ有する。プロモーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列などが挙げられる。
発現ベクターは、上記ＤＮＡ断片を一つまたは複数個含む。上記ＤＮＡ断片は、プロモーター配列の３'下流側において、順方向（5'→3'）に組み込まれてもよいし、逆方向に組み込まれてもよい。複数個の上記ＤＮＡ断片を含む場合、上記ＤＮＡ断片は同じものであっても互いに異なるものであってもよい。また、２個以上のＤＮＡ断片が組み込まれた場合、全てのＤＮＡ断片が同じ方向に組み込まれていなくともよい。
また、発現ベクターは、発現させるタンパク質をコードする構造遺伝子を挿入するための配列を有する。挿入させるための配列としては、従来公知のマルチクローニングサイトや、相同性組み換え反応を起こす配列などが挙げられる。かかるタンパク質をコードする構造遺伝子を挿入させるための配列は、上記翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片の３'下流側に組み込まれる。かかる構造遺伝子を挿入するための配列に、発現させたタンパク質の精製を容易にするという観点から従来公知のヒスチジンタグや、ＧＳＴタグをコードする塩基配列などを付加させてもよい。
また、発現ベクターは上記タンパク質をコードする構造遺伝子を挿入させるための配列の３'下流側に、合成されたｍＲＮＡの安定性などの観点から３'非翻訳領域（３'ＵＴＲ）およびポリＡ配列を有しているのが好ましい。
また、発現ベクターは上記ポリＡ配列の３'下流側に転写を終結させる機能を有するターミネーター配列を有していることが好ましい。上記ターミネーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７ターミネーター配列、ＳＰ６ターミネーター配列、Ｔ３ターミネーター配列などが挙げられる。
また、発現ベクターは、宿主内で安定に保持されるために薬剤耐性マーカーを有することが好ましい。薬剤耐性マーカーとしては、たとえば従来公知のアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
また、発現ベクターは、宿主内で自立複製を行うために複製起点を有する。複製起点としては、たとえば従来公知のｐＢＲ３２２ Ｏｒｉ、ｐＵＣ Ｏｒｉ、ＳＶ４０ Ｏｒｉなどが挙げられる。また、シャトルベクターとして使用できるように、異なる宿主間で機能する複製起点を有していてもよい。
上記発現ベクターは、従来公知の遺伝子組み換え技術を用いて作製することができる。
上記発現ベクターは、従来公知の遺伝子組み換え技術を用いて作製することができる。
無細胞系タンパク質合成用の反応液中において、外来ｍＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点から、５μｇ／ｍＬ〜２０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、２０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。外来ｍＲＮＡが５μｇ／ｍＬ未満または２０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
無細胞系タンパク質合成は、上記の通り用意した反応液を用いて、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは１５℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。
反応の時間は、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
反応の時間は、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
本発明の調製方法では、典型的には、以下に示すステップ（１）〜（３）を順番に実施する。
（１）目的のタンパク質会合体を構成する各サブユニットについて、それをコードするｍＲＮＡを合成するステップ；
（２）還元剤が存在しない条件下、昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系を用い、ステップ（１）で合成した各ｍＲＮＡからタンパク質を同一反応容器内において合成するステップ；
（３）ステップ（２）の結果として形成されたタンパク質会合体を精製するステップ。
以下、ステップ毎に説明する。尚、これまでの説明と重複する事項（例えば、目的産物であるタンパク質会合体や無細胞タンパク質合成系など）については特に言及しない。
（１）目的のタンパク質会合体を構成する各サブユニットについて、それをコードするｍＲＮＡを合成するステップ；
（２）還元剤が存在しない条件下、昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系を用い、ステップ（１）で合成した各ｍＲＮＡからタンパク質を同一反応容器内において合成するステップ；
（３）ステップ（２）の結果として形成されたタンパク質会合体を精製するステップ。
以下、ステップ毎に説明する。尚、これまでの説明と重複する事項（例えば、目的産物であるタンパク質会合体や無細胞タンパク質合成系など）については特に言及しない。
ステップ（１）では転写反応を実施し、目的のタンパク質会合体（目的産物）を構成する各サブユニットについて、それをコードするｍＲＮＡを得る。転写反応は常法に従って行えばよい。但し、好ましくは以下に示す方法を採用する。
まず、転写反応液は、インビトロで転写反応を行い得る従来公知の適宜の組成のものを使用でき、特に制限されるものではない。たとえば、鋳型ＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＮＴＰｓ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）、マグネシウム塩を少なくとも含有する転写反応液が例示される。
転写反応液に含有される鋳型ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡなどの環状ＤＮＡであってもよいし、ＰＣＲ産物などの直鎖状ＤＮＡであってもよい。上記鋳型ＤＮＡは、目的タンパク質（目的産物を構成するサブユニット）をコードする塩基配列と、その５’上流側に位置するプロモーター配列とを少なくとも有する。また、鋳型ＤＮＡにおけるプロモーター配列としては、特に制限されるものではないが、たとえば、従来公知のＴ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列などが挙げられる。また、本発明に用いる鋳型ＤＮＡは、上記目的タンパク質をコードする塩基配列の３’下流側に転写を終結させる機能を有するターミネーター配列、および／または、合成されたｍＲＮＡの安定性などの観点からポリＡ配列を有しているのが好ましい。上記ターミネーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７ターミネーター配列、ＳＰ６ターミネーター配列、Ｔ３ターミネーター配列などが挙げられる。
鋳型ＤＮＡは、転写反応液中において、１μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。鋳型ＤＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または２００μｇ／ｍＬを越えると、充分な量のタンパク質を合成し得る量のｍＲＮＡをインビトロ転写反応により得られない傾向にあるためである。
転写反応液中におけるＲＮＡポリメラーゼは、鋳型ＤＮＡが有するプロモーター配列に応じて適宜選択することができる。たとえば、鋳型ＤＮＡがＴ７プロモーター配列を有している場合は、その配列を認識するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。また、外来鋳型ＤＮＡが、ＳＰ６またはＴ３プロモーター配列を有している場合は、それぞれ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。
ＲＮＡポリメラーゼは、ｍＲＮＡ合成の速度の観点から、転写反応液中に０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、０．５Ｕ／μＬ〜５Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮＡポリメラーゼが０．１Ｕ／μＬ未満または１０Ｕ／μＬを越えると、充分な量のタンパク質を合成し得る量のｍＲＮＡをインビトロ転写反応により得られにくい傾向にあるためである。
ＲＮＡポリメラーゼは、ｍＲＮＡ合成の速度の観点から、転写反応液中に０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、０．５Ｕ／μＬ〜５Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮＡポリメラーゼが０．１Ｕ／μＬ未満または１０Ｕ／μＬを越えると、充分な量のタンパク質を合成し得る量のｍＲＮＡをインビトロ転写反応により得られにくい傾向にあるためである。
転写反応液中におけるＮＴＰｓ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）の含有量に特に制限はないが、１ｍＭ〜２０ｍＭ含有されるのが好ましく、２ｍＭ〜１０ｍＭ含有されるのがより好ましい。ＮＴＰｓの含有量が１ｍＭ未満または２０ｍＭを越えると、充分な量のタンパク質を合成し得る量のｍＲＮＡがインビトロ転写反応により得られにくくなる傾向にあるためである。当該ＮＴＰｓは、通常、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰを概ね等量ずつ含有してなる。
転写反応液中におけるマグネシウム塩としては、インビトロ転写反応および翻訳反応を阻害するものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。転写反応液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が１ｍＭ未満または２００ｍＭを越えると、充分な量のタンパク質を合成し得る量のｍＲＮＡがインビトロ転写反応により得られにくくなる傾向にあるためである。
転写反応液は、さらに、ＲＮａｓｅインヒビターおよびスペルミジンを含有するのが好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターは、インビトロ転写反応にて合成したｍＲＮＡがＲＮａｓｅによって不所望に消化されるのを防止する目的で添加されるものであり、転写反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜２０Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、０．２Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。またスペルミジンは、転写における伸長反応を促進する目的で添加されるものであり、０．１ｍＭ〜２０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることがより好ましい。
また転写反応液は、通常、緩衝剤を含有する。緩衝剤としては、特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。緩衝剤は、転写反応液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６〜８に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが特に好ましい。
当該転写反応液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、１０ｍＭ〜４００ｍＭ含有されることが好ましく、２０ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が１０ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こす傾向にあるためであり、また緩衝剤が４００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎる傾向にあるためである。
当該転写反応液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、１０ｍＭ〜４００ｍＭ含有されることが好ましく、２０ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が１０ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こす傾向にあるためであり、また緩衝剤が４００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎる傾向にあるためである。
すなわち、本発明に用いる転写反応液は、１μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬの鋳型ＤＮＡ、０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮＡポリメラーゼ、１ｍＭ〜２０ｍＭのＮＴＰｓ、１ｍＭ〜２００ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭ〜２００ｍＭのＤＴＴ、０．１Ｕ／μＬ〜２０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、０．１ｍＭ〜２０ｍＭのスペルミジン、１０ｍＭ〜４００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ましい。
本発明において、上述したような転写反応液を用いたインビトロ転写反応は、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行えばよい。転写工程の反応温度は、通常、１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲内である。転写工程の反応温度が１０℃未満であると、転写の速度が低下する傾向にあり、また転写工程の反応温度が６０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。反応の時間は、全工程あわせて、通常、１時間〜８時間、好ましくは３時間〜５時間である。
本発明の一態様では、以上のようにして転写反応を行った後、各ｍＲＮＡを精製する。そして、還元剤が存在しない条件下、昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系を用い、精製した各ｍＲＮＡからタンパク質を同一容器内において合成する（ステップ（２））。
一方、本発明の他の態様では、以上のようにして転写反応を行った後、転写反応液、翻訳反応用試薬、及びマグネシウムイオンと錯体を形成するキレート剤を混合して翻訳反応溶液とし、これを用いて次のステップ（２）を行う。ｍＲＮＡの精製を経ることなく無細胞系タンパク合成を行う当該方法のことを「リンク法」と呼ぶことがある。リンク法によれば、反応槽内で転写反応、翻訳反応を連続的に行ってＤＮＡからタンパク質を合成する従来法（以下、この従来法を「１ステップ法」と呼ぶ）とは異なり、転写反応と翻訳反応とで好適な塩濃度の範囲が異なるために、結果として合成量が少なくなってしまうということがない。さらに、転写反応にてｍＲＮＡを合成し、精製後のｍＲＮＡを鋳型として翻訳反応を行ってタンパク質を合成する従来法（以下、この従来法を「３ステップ法」と呼ぶ）とは異なり、ｍＲＮＡの精製のステップを要することなく、効率よくタンパク質を合成することができる。加えて、マグネシウムイオン濃度のコントロールをキレート剤によって行うため、十分な量のｍＲＮＡを含む転写反応液を添加する事ができ、合成量を向上させることができる。
なお、転写反応液中にDTTが含まれる場合、翻訳反応溶液中の還元剤の濃度は、ラミニンを構成する各サブユニット間のジスルフィド結合の切断を起こす量以下、例えば、０．５ｍM以下、更に好ましくは、０.１ｍM以下となるように転写反応液中のDTTの濃度もしくは転写反応液と翻訳反応試薬の混合比を調整する。
一方、本発明の他の態様では、以上のようにして転写反応を行った後、転写反応液、翻訳反応用試薬、及びマグネシウムイオンと錯体を形成するキレート剤を混合して翻訳反応溶液とし、これを用いて次のステップ（２）を行う。ｍＲＮＡの精製を経ることなく無細胞系タンパク合成を行う当該方法のことを「リンク法」と呼ぶことがある。リンク法によれば、反応槽内で転写反応、翻訳反応を連続的に行ってＤＮＡからタンパク質を合成する従来法（以下、この従来法を「１ステップ法」と呼ぶ）とは異なり、転写反応と翻訳反応とで好適な塩濃度の範囲が異なるために、結果として合成量が少なくなってしまうということがない。さらに、転写反応にてｍＲＮＡを合成し、精製後のｍＲＮＡを鋳型として翻訳反応を行ってタンパク質を合成する従来法（以下、この従来法を「３ステップ法」と呼ぶ）とは異なり、ｍＲＮＡの精製のステップを要することなく、効率よくタンパク質を合成することができる。加えて、マグネシウムイオン濃度のコントロールをキレート剤によって行うため、十分な量のｍＲＮＡを含む転写反応液を添加する事ができ、合成量を向上させることができる。
なお、転写反応液中にDTTが含まれる場合、翻訳反応溶液中の還元剤の濃度は、ラミニンを構成する各サブユニット間のジスルフィド結合の切断を起こす量以下、例えば、０．５ｍM以下、更に好ましくは、０.１ｍM以下となるように転写反応液中のDTTの濃度もしくは転写反応液と翻訳反応試薬の混合比を調整する。
ステップ（２）に続くステップ（３）では、ステップ（２）の結果として形成されたタンパク質会合体を精製する。例えば、遠心分離、塩析（硫安分画）、各種クロマトグラフィー（例えばゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー）を適宜組み合わせて精製すればよい。タグ（例えばＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｈｉｓタグ）が付加されたタンパク質を合成することにすれば、タグとの親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーによって簡便かつ効率的に目的産物を精製・回収することができる。
好ましくは、タンパク質の合成（ステップ（２））に加えて精製（ステップ（３））も、界面活性剤が存在する条件下で実施する。サブユニットが会合した状態を維持するとともに、凝集を防止するためである。界面活性剤としては、合成時と同様、非イオン性界面活性剤（例えばＮＰ−４０（Nonidet P-40）、Triton X-100）を用いることが好ましい。界面活性剤の濃度は所望の上記効果が奏される限り特に限定されない。精製時に目的産物が存在することになる溶液中の界面活性剤の濃度を例えば０．２％（W/V）〜１．４％（W/V）とする。
好ましくは、タンパク質の合成（ステップ（２））に加えて精製（ステップ（３））も、界面活性剤が存在する条件下で実施する。サブユニットが会合した状態を維持するとともに、凝集を防止するためである。界面活性剤としては、合成時と同様、非イオン性界面活性剤（例えばＮＰ−４０（Nonidet P-40）、Triton X-100）を用いることが好ましい。界面活性剤の濃度は所望の上記効果が奏される限り特に限定されない。精製時に目的産物が存在することになる溶液中の界面活性剤の濃度を例えば０．２％（W/V）〜１．４％（W/V）とする。
ヒト・ラミニンα３Ａ鎖・β３鎖・γ２鎖ヘテロ三量体（ラミニン−３３２のコイルドコイルドメインヘテロ三量体）の合成
ヒト・ラミニン−３３２（α３Ａβ３γ２）を構成するα３Ａ鎖(GenBank accession number NM_000227)、β３鎖(NM_000228)およびγ２鎖(NM_005562)の会合ドメイン（ＬＣＣドメイン）のcDNAをヒト表皮角化細胞から抽出した全RNAよりRT-PCR法にて増幅した。用いたプライマーの配列は以下の通りである。
ヒト・ラミニン−３３２（α３Ａβ３γ２）を構成するα３Ａ鎖(GenBank accession number NM_000227)、β３鎖(NM_000228)およびγ２鎖(NM_005562)の会合ドメイン（ＬＣＣドメイン）のcDNAをヒト表皮角化細胞から抽出した全RNAよりRT-PCR法にて増幅した。用いたプライマーの配列は以下の通りである。
ラミニンα３Ａ：5’-ATGGATGATTGCGACAGCTGTGTGATG-3’（配列番号１２）及び5’-GGGATCCATATCCTTTCAAATCTTCCAG-3’（配列番号１３、アミノ酸残基200-793（配列番号１４）に対応する）。
ラミニンβ３：5’-ATGGTGGCCTGCCACCCTTGCTTCCAG-3’（配列番号１５）及び5’-GGTCTAGACTACTTGCAGGTGGCATAGTAGAGCAC-3’（配列番号１６、アミノ酸残基560-1153（配列番号１７）に対応する）。
ラミニンγ２：5’-ATGGAGCATGGAGCATTCAGCTGTCCAG-3’（配列番号１８）及び5’-GGTCTAGATCACTGTTGCTCAAGAGCCTGGGTATT-3’（配列番号１９、アミノ酸残基603-1193（配列番号２０）に対応する）。
ラミニンβ３：5’-ATGGTGGCCTGCCACCCTTGCTTCCAG-3’（配列番号１５）及び5’-GGTCTAGACTACTTGCAGGTGGCATAGTAGAGCAC-3’（配列番号１６、アミノ酸残基560-1153（配列番号１７）に対応する）。
ラミニンγ２：5’-ATGGAGCATGGAGCATTCAGCTGTCCAG-3’（配列番号１８）及び5’-GGTCTAGATCACTGTTGCTCAAGAGCCTGGGTATT-3’（配列番号１９、アミノ酸残基603-1193（配列番号２０）に対応する）。
増幅したcDNAをin vitro転写用ベクターpTD1に組み込み、1μgの線状化したプラスミドDNAを用い、ScriptMax Thermo T7 Transcription Kit（東洋紡）によりmRNAを合成した。合成したmRNAを終濃度2μg/μlになるようにヌクレアーゼフリーの脱イオン水で希釈し、さらに終濃度1.5 mMになるようにEDTAを添加した。
6μgの各鎖mRNA（全体で18μg）を50μlの昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系用試薬を混合し、反応溶液（40 mM HEPES-KOH (pH 7.9), 100 mM KOAc, 1.5 mM Mg(OAc)2, 0.25mM ATP, 0.1 mM GTP, 20 mM クレアチンリン酸, 200 μg/mlクレアチンキナーゼ, 80μM 各アミノ酸（２０種）, 0.1 mM EGTA, 0.25mM PMSF, 200μg/ml tRNA、360μg/ml mRNA, 50%(v/v) Sf21抽出液）とした（参考文献：Ezure, T., Suzuki, T., Shikata, M., Ito, M. et al., Expression of proteins containing disulfide bonds in an insect cell-free system and confirmation of their arrangements by MALDI-TOF mass spectrometry. Proteomics 2007, 7, 4424-4434）。この反応溶液を25℃で30分から12時間インキュベートしてタンパク質を合成した。
6μgの各鎖mRNA（全体で18μg）を50μlの昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系用試薬を混合し、反応溶液（40 mM HEPES-KOH (pH 7.9), 100 mM KOAc, 1.5 mM Mg(OAc)2, 0.25mM ATP, 0.1 mM GTP, 20 mM クレアチンリン酸, 200 μg/mlクレアチンキナーゼ, 80μM 各アミノ酸（２０種）, 0.1 mM EGTA, 0.25mM PMSF, 200μg/ml tRNA、360μg/ml mRNA, 50%(v/v) Sf21抽出液）とした（参考文献：Ezure, T., Suzuki, T., Shikata, M., Ito, M. et al., Expression of proteins containing disulfide bonds in an insect cell-free system and confirmation of their arrangements by MALDI-TOF mass spectrometry. Proteomics 2007, 7, 4424-4434）。この反応溶液を25℃で30分から12時間インキュベートしてタンパク質を合成した。
経時的にサンプリングした反応混合液を非還元条件の8%アクリルアミドを含むSDS電気泳動で分離し、ニトロセルロース膜（GE Healthcare）に転写した。ニトロセルロース膜を5%スキムミルクでブロッキングを行った後、ラミニンγ２鎖（B-2; Santa Cruz Biotechnology）の抗体と反応させた。ニトロセルロース膜を洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された二次抗体と反応させ、ECL検出試薬（GE Healthcare）を用いて増幅したシグナルをX線フィルム（GE Healthcare）に露光して、ヘテロ二量体およびヘテロ三量体の形成を解析した。解析結果を図２に示す。合成時間が１時間と２時間では単量体と二量体のバンドが認められる。合成時間が４時間では三量体のバンドも認められる。合成時間が１２時間になると、単量体を示すバンド及び二量体を示すバンドも認められるものの、三量体を示すバンドが優位である。このように、三量体の形成が確認されるとともに、合成時間が長くなるほど三量体の形成量が増大することが示された。
ラミニンβ鎖の可溶性発現に及ぼす界面活性剤の影響
ラミニンβ鎖のコイルドコイルドメインを実施例１と同様の方法で合成したところ、不溶化することが確認された。そのため、タンパク質合成時に界面活性剤を添加し、その影響について検討した。タンパク質合成は、実施例１と同様の方法で合成した。反応溶液には、蛍光検出するために、反応液50uLあたりに1μLのフルオロテクト（蛍光標識試薬）を添加した。界面活性剤としては、Triton X-100とNP-40を用い、最終濃度で0-1.4%(w/v)の濃度範囲にて検討を行った。
50μLスケールでタンパク質合成（25℃、4時間）を行い、10μLを全画分(Total)として回収した。残りの反応液は15000rpm、15分間遠心した後、その上清10μLを静かに回収し、これを可溶性画分(Sup)とした。各画分6μL分を12.5%プレキャストゲルにてSDS-PAGE後、蛍光イメージアナライザーにて検出した結果を図３に示す。いずれの界面活性剤においても、その添加により、β鎖が顕著に可溶化していることが明らかとなった。そのため、これ以降の実験においては反応系に界面活性剤を添加することにした。
ラミニンβ鎖のコイルドコイルドメインを実施例１と同様の方法で合成したところ、不溶化することが確認された。そのため、タンパク質合成時に界面活性剤を添加し、その影響について検討した。タンパク質合成は、実施例１と同様の方法で合成した。反応溶液には、蛍光検出するために、反応液50uLあたりに1μLのフルオロテクト（蛍光標識試薬）を添加した。界面活性剤としては、Triton X-100とNP-40を用い、最終濃度で0-1.4%(w/v)の濃度範囲にて検討を行った。
50μLスケールでタンパク質合成（25℃、4時間）を行い、10μLを全画分(Total)として回収した。残りの反応液は15000rpm、15分間遠心した後、その上清10μLを静かに回収し、これを可溶性画分(Sup)とした。各画分6μL分を12.5%プレキャストゲルにてSDS-PAGE後、蛍光イメージアナライザーにて検出した結果を図３に示す。いずれの界面活性剤においても、その添加により、β鎖が顕著に可溶化していることが明らかとなった。そのため、これ以降の実験においては反応系に界面活性剤を添加することにした。
ヒト・ラミニンβ３鎖・γ２鎖二量体（ラミニンβ３鎖コイルドコイルドメインとラミニンγ２鎖コイルドコイルドメインからなるヘテロ二量体）の合成と精製
（１）mRNAの調製
ラミニンβ３鎖を含むpTD1-lamB3とラミニンγ２鎖を含み、そのC末端にグリシン8個からなるスペーサー配列を介してStrepタグ配列を有するpTD1-strep-lamG2を鋳型として、フォワードプライマーpTD1161-179：GCAGATTGTACTGAGAGTG（配列番号２１）とリバースプライマーpTD1845-827：GGAAACAGCTATGACCATG（配列番号２２）を用いて、PCR反応(変性：96℃、15秒、アニール：50℃、30秒、伸長：68℃、2分30秒)を30サイクル行った。反応終了後、反応液をフェノール・クロロホルムにて抽出し、エタノール沈殿を行った。これをmRNA合成用のDNAテンプレートとした。
mRNAの合成は、プロメガ社T7RiboMAX Express Large Scale RNA Production System (P1320)を用いて行い、ゲル濾過カラムとエタノール沈殿によって精製した。
（１）mRNAの調製
ラミニンβ３鎖を含むpTD1-lamB3とラミニンγ２鎖を含み、そのC末端にグリシン8個からなるスペーサー配列を介してStrepタグ配列を有するpTD1-strep-lamG2を鋳型として、フォワードプライマーpTD1161-179：GCAGATTGTACTGAGAGTG（配列番号２１）とリバースプライマーpTD1845-827：GGAAACAGCTATGACCATG（配列番号２２）を用いて、PCR反応(変性：96℃、15秒、アニール：50℃、30秒、伸長：68℃、2分30秒)を30サイクル行った。反応終了後、反応液をフェノール・クロロホルムにて抽出し、エタノール沈殿を行った。これをmRNA合成用のDNAテンプレートとした。
mRNAの合成は、プロメガ社T7RiboMAX Express Large Scale RNA Production System (P1320)を用いて行い、ゲル濾過カラムとエタノール沈殿によって精製した。
（２）タンパク質合成
上記で調製したmRNAを用い、実施例１の場合に準じて反応溶液を調製した。mRNAの添加量は各160μgとし、追加の成分として界面活性剤NP-40を最終濃度で0.4%(w/v)添加することにした。この反応溶液を用い、1mLのスケールでタンパク質合成（共発現）を実施した（25℃、4時間）。
上記で調製したmRNAを用い、実施例１の場合に準じて反応溶液を調製した。mRNAの添加量は各160μgとし、追加の成分として界面活性剤NP-40を最終濃度で0.4%(w/v)添加することにした。この反応溶液を用い、1mLのスケールでタンパク質合成（共発現）を実施した（25℃、4時間）。
（３）合成タンパク質の精製
Strep-Tactin Superflow（QIAGEN社30001または30003）を用いて、bed volume 0.5 mLのオープンカラムを作製し、精製を行った。まず、50 mM Tris-HCl, pH8.0, 300 mM NaCl, 0.4%(w/v)NP-40（Buffer A）でカラムを平衡化した（5 mL）。このカラムに上記タンパク質合成反応液の遠心上清（15000rpm,15min）をアプライした。0.5 mLのBuffer Aでのカラム洗浄を5回行い、次に2 mM desthiobiotin（SIGMA社D1411-1G）を含むBuffer Aを1.5 mL添加し溶出し、溶出液をスピンタイプの限外ろ過で約30μLまで濃縮した。
Strep-Tactin Superflow（QIAGEN社30001または30003）を用いて、bed volume 0.5 mLのオープンカラムを作製し、精製を行った。まず、50 mM Tris-HCl, pH8.0, 300 mM NaCl, 0.4%(w/v)NP-40（Buffer A）でカラムを平衡化した（5 mL）。このカラムに上記タンパク質合成反応液の遠心上清（15000rpm,15min）をアプライした。0.5 mLのBuffer Aでのカラム洗浄を5回行い、次に2 mM desthiobiotin（SIGMA社D1411-1G）を含むBuffer Aを1.5 mL添加し溶出し、溶出液をスピンタイプの限外ろ過で約30μLまで濃縮した。
（４）精製タンパク質のSDS-PAGE
精製したタンパク質を還元（＋2メルカプトエタノール）及び非還元（−2メルカプトエタノール）の各条件にてSDS-PAGE（10%）を行った。結果を図４に示す。非還元条件では、ジスルフィド結合により架橋されたと考えられる複合体が確認された。
精製したタンパク質を還元（＋2メルカプトエタノール）及び非還元（−2メルカプトエタノール）の各条件にてSDS-PAGE（10%）を行った。結果を図４に示す。非還元条件では、ジスルフィド結合により架橋されたと考えられる複合体が確認された。
本発明の調製方法では、還元剤の存在しない条件下、昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系を用いた合成を行う。これによって、各ラミニンサブユニットのＬＣＣドメインが適切に会合した構造を備えるタンパク質会合体が得られる。本発明の調製方法によれば、様々なラミニン種に対応したタンパク質会合体を調製することが可能である。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (10)
- ラミニンコイルドコイル（ＬＣＣ）ドメインヘテロ多量体を含むタンパク質会合体の調製方法であって、
還元剤が存在しない条件下、昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系を用い、目的のタンパク質会合体を構成する各サブユニットを合成することを特徴とする調製方法。 - 各サブユニットの合成が、界面活性剤が存在する条件下で実施されることを特徴とする、請求項１に記載の調製方法。
- 以下のステップを含むことを特徴とする、請求項１に記載の調製方法：
（１）目的のタンパク質会合体を構成する各サブユニットについて、それをコードするｍＲＮＡを合成するステップ；
（２）還元剤が存在しない条件下、昆虫培養細胞抽出液由来の無細胞タンパク質合成系を用い、ステップ（１）で合成した各ｍＲＮＡからタンパク質を同一反応容器内において合成するステップ；
（３）ステップ（２）の結果として形成されたタンパク質会合体を精製するステップ。 - ステップ（２）及びステップ（３）が、界面活性剤が存在する条件下で実施されることを特徴とする、請求項３に記載の調製方法。
- ステップ（１）後の反応液、無細胞タンパク質合成反応用試薬、及びマグネシウムイオンと錯体を形成するキレート剤を混合した後、ステップ（２）を実施することを特徴とする、請求項３又は４に記載の調製方法。
- タンパク質会合体がヒト由来であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製方法。
- ＬＣＣドメイン多量体がＬＣＣドメインヘテロ三量体であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の調製方法。
- ＬＣＣドメインヘテロ三量体が、ラミニン−１１１、２１１、１２１、２２１、３３２、３Ｂ３２、３１１、３２１、４１１、４２１、５１１、５２１、２１３、４２３、５２２及び５２３からなる群より選択されるラミニンのＬＣＣドメインヘテロ三量体であることを特徴とする、請求項７に記載の調製方法。
- ＬＣＣドメイン多量体が、（１）ラミニン−３３２のコイルドコイルドメインヘテロ三量体、又は（２）ラミニンβ３鎖のコイルドコイルドメインとラミニンγ２鎖のコイルドコイルドメインからなるヘテロ二量体であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の調製方法。
- 昆虫培養細胞がＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の細胞であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の調製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008055649A JP2009207449A (ja) | 2008-03-06 | 2008-03-06 | ラミニンコイルドコイル（ｌｃｃ）ドメインヘテロ多量体を含むタンパク質会合体の調製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008055649A JP2009207449A (ja) | 2008-03-06 | 2008-03-06 | ラミニンコイルドコイル（ｌｃｃ）ドメインヘテロ多量体を含むタンパク質会合体の調製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009207449A true JP2009207449A (ja) | 2009-09-17 |
Family
ID=41181222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008055649A Pending JP2009207449A (ja) | 2008-03-06 | 2008-03-06 | ラミニンコイルドコイル（ｌｃｃ）ドメインヘテロ多量体を含むタンパク質会合体の調製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2009207449A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013518922A (ja) * | 2010-02-11 | 2013-05-23 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | Ｉｇｆ−ｉポリ（エチレングリコール）コンジュゲート |
| JP2013226138A (ja) * | 2012-04-26 | 2013-11-07 | Genefrontier Corp | タンパク質多量体の効率的な提示法 |
-
2008
- 2008-03-06 JP JP2008055649A patent/JP2009207449A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013518922A (ja) * | 2010-02-11 | 2013-05-23 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | Ｉｇｆ−ｉポリ（エチレングリコール）コンジュゲート |
| JP2015145402A (ja) * | 2010-02-11 | 2015-08-13 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | Ｉｇｆ−ｉポリ（エチレングリコール）コンジュゲート |
| US9587006B2 (en) | 2010-02-11 | 2017-03-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | IGF-I poly (ethylene glycol) conjugates |
| JP2013226138A (ja) * | 2012-04-26 | 2013-11-07 | Genefrontier Corp | タンパク質多量体の効率的な提示法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2012289916B2 (en) | Collagen 7 and related methods | |
| JP2012005493A (ja) | 血管形成に関連する障害を診断及び治療するための組成物と方法 | |
| JP2009207449A (ja) | ラミニンコイルドコイル（ｌｃｃ）ドメインヘテロ多量体を含むタンパク質会合体の調製方法 | |
| US20060154331A1 (en) | Erythrocyte differentiation factor, gene encoding same, and methods of use thereof | |
| JP4324730B2 (ja) | 無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液の調製方法および昆虫細胞抽出液、ならびに昆虫細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法 | |
| JP5888522B2 (ja) | カイコ幼虫中部絹糸腺抽出液を用いた無細胞タンパク質合成方法 | |
| JP4243762B2 (ja) | 無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法、およびカイコ組織用抽出キット | |
| JP6574760B2 (ja) | カスパーゼ阻害剤の存在下で真核細胞溶解物を用いた無細胞のタンパク質の合成方法及び装置、並びに該方法において合成されたタンパク質の収量及び／又は安定性を増加させるためのカスパーゼ阻害剤の使用 | |
| JP4091901B2 (ja) | 無細胞系タンパク質合成におけるミクロソーム膜添加による翻訳後修飾方法 | |
| JP4400687B2 (ja) | 翻訳反応促進ＤＮＡ断片およびそれを用いた鋳型ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ならびに無細胞系タンパク質合成用反応液 | |
| Funkenstein et al. | α2-Macroglobulin in the marine fish Sparus aurata | |
| JP2007202491A (ja) | タンパク質への修飾基の導入を制御する無細胞タンパク質合成方法 | |
| Vilotte et al. | Genetics and biosynthesis of milk proteins | |
| JP4389870B2 (ja) | 哺乳動物培養細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法 | |
| US20100087005A1 (en) | Auxiliary reagent for gene transfer | |
| JP2007143435A (ja) | 無細胞系タンパク質合成方法 | |
| WO2005047517A1 (ja) | 無細胞系タンパク質合成におけるミクロソーム膜添加による翻訳後修飾方法 | |
| JP4442535B2 (ja) | 翻訳反応促進ｄｎａ断片を含む発現ベクター及びそれを用いたタンパク質合成方法 | |
| JP2003245094A (ja) | 無細胞系タンパク質合成方法およびそのための抽出液 | |
| JP4385652B2 (ja) | 翻訳反応促進ＤＮＡ断片およびそれを用いた鋳型ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ならびに無細胞系タンパク質合成用反応液 | |
| US20180002401A1 (en) | Collagen 7 and related methods | |
| JP5776144B2 (ja) | チューブリン除去された無細胞系タンパク質合成用細胞抽出液の調製方法、無細胞系タンパク質合成用試薬キット及び無細胞系タンパク質合成方法 | |
| JP7140362B2 (ja) | 活性型組換えアクロシン | |
| Lobanova et al. | Biologicals Technology Optimization of Culturing of CHO Cells Expressing Recombinant Interferon-β | |
| JP2005073609A (ja) | 鋳型ｄｎａの増幅方法、ならびに増幅された鋳型ｄｎａを用いた無細胞系タンパク質合成方法 |