JP2003245094A - 無細胞系タンパク質合成方法およびそのための抽出液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 反応液の調製が容易であり、糖タンパク質の
合成も可能である無細胞系タンパク質合成方法を提供す
る。 【解決手段】 カイコ組織由来の抽出物と、外来鋳型Ｄ
ＮＡとを少なくとも含有する抽出液を用い、転写および
翻訳を経て外来鋳型ＤＮＡからタンパク質を合成する無
細胞系タンパク質合成方法、およびそのための無細胞系
タンパク質抽出液。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、転写および翻訳を
経て外来鋳型ＤＮＡからタンパク質を合成する、新規な
無細胞系のタンパク質合成方法およびそのための抽出液
に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺
伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲ
ノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク
質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これら
の遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、
利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単
に合成することが必要となってくる。

【０００３】現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子
組換え技術によって酵母や昆虫細胞などの生細胞を用い
る発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く
利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持する
ために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細
胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないな
ど発現が困難なタンパク質も多い。

【０００４】一方、細胞系を使用しないタンパク質の生
産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを
加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系を試験管内に取り
揃え、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを用い
て、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させるこ
とのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質
合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合
成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受
けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を
行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操
作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質
の合成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質
合成では、生命体が利用していないアミノ酸配列からな
るタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な
発現方法であると期待されている。このような無細胞系
のタンパク質合成としては、たとえば、小麦胚芽の抽出
液や大腸菌の抽出液を用いる方法が知られている。

【０００５】しかし、小麦胚芽の抽出液を用いた無細胞
系のタンパク質合成では、抽出液の抽出操作が一般に極
めて煩雑であるという欠点がある。小麦胚芽の抽出液の
調製方法の一例として、たとえば、特許文献１には、以
下のような手順が記載されている。小麦種子をミルに添
加し、破砕した後、篩で粗胚芽画分を得、四塩化炭素と
シクロヘキサン混液（四塩化炭素：シクロヘキサン＝
２．５：１）を用いた浮選によって、発芽能を有する胚
芽を浮上する画分から回収し、室温乾燥によって有機溶
媒を除去する。この胚芽画分に混在する種皮などの不純
物を静電気帯電体を用いて吸着除去する。次に、この試
料から小麦胚乳成分を完全に除去するため、非イオン性
界面活性剤であるＮＰ４０の０．５％溶液に懸濁し、超
音波洗浄器を用いて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄
を繰り返す。蒸留水の存在下に再度１回の超音波洗浄を
行い、小麦胚芽を純化する。このように小麦胚芽の抽出
液を用いた無細胞系タンパク質合成では、抽出液の調製
が煩雑であり、多大な時間と労力を要するという不具合
がある。

【０００６】また大腸菌の抽出液を用いた無細胞系タン
パク質合成では、大腸菌が原核生物であるため、タンパ
ク質への糖鎖修飾を行うことができず、糖タンパク質を
合成することができないという欠点がある。上記糖鎖修
飾によりタンパク質に付加される糖鎖は、物質間や細胞
間の認識や接着に関与するシグナルやリガンドとして、
タンパク質自身の機能調節因子として、またはタンパク
質の保護や安定化因子として機能しているものと考えら
れる。そのため、糖鎖修飾を受けるタンパク質について
生体内の機能を解析するためには、糖鎖修飾を受けたタ
ンパク質（糖タンパク質）を取得することが必要であ
り、タンパク質への翻訳の後に糖鎖修飾も行えるような
無細胞系のタンパク質合成が望まれている。

【０００７】

【特許文献１】特開２０００−２３６８９６号公報

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記課題を
解決するためになされたものであって、その目的とする
ところは、反応液の調製が容易であり、糖タンパク質の
合成も可能である無細胞系タンパク質合成方法を提供す
ることである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成す
るに至った。即ち、本発明は以下のとおりである。 （１）カイコ組織由来の抽出物と、外来鋳型ＤＮＡとを
少なくとも含有する抽出液を用い、転写および翻訳を経
て外来鋳型ＤＮＡからタンパク質を合成する無細胞系タ
ンパク質合成方法。 （２）上記抽出液が、プロテアーゼインヒビターをさら
に含有するものである、上記（１）に記載の無細胞系タ
ンパク質合成方法。 （３）上記抽出液に、ＲＮＡポリメラーゼ、アデノシン
三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン５'−三リン
酸、ウリジン５'−三リン酸、クレアチンリン酸、クレ
アチンキナーゼ、アミノ酸成分およびｔＲＮＡを少なく
とも添加してなる反応液を用いるものである、上記
（１）または（２）に記載の無細胞系タンパク質合成方
法。 （４）カイコ組織由来の抽出物と、プロテアーゼインヒ
ビターとを少なくとも含有する液状組成物を用い、転写
および翻訳を経て外来鋳型ＤＮＡからタンパク質を合成
する無細胞系タンパク質合成方法。 （５）上記液状組成物に、外来鋳型ＤＮＡ、ＲＮＡポリ
メラーゼ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、
シチジン５'−三リン酸、ウリジン５'−三リン酸、クレ
アチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分およ
びｔＲＮＡを少なくとも添加してなる反応液を用いるも
のである、上記（４）に記載の無細胞系タンパク質合成
方法。 （６）カイコ組織が、カイコ幼虫の絹糸腺を少なくとも
含有する上記（１）〜（５）のいずれかに記載の無細胞
系タンパク質合成方法。 （７）カイコ組織が、カイコ幼虫の脂肪体を少なくとも
含有する上記（１）〜（５）のいずれかに記載の無細胞
系タンパク質合成方法。 （８）カイコ組織が、カイコの胚を少なくとも含有する
上記（１）〜（５）のいずれかに記載の無細胞系タンパ
ク質合成方法。 （９）カイコ組織が、カイコ幼虫の後部絹糸腺を少なく
とも含有する上記（６）に記載の無細胞系タンパク質合
成方法。 （１０）カイコ組織由来の抽出物と、外来鋳型ＤＮＡと
を少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用抽出
液。 （１１）さらにプロテアーゼインヒビターを含有するも
のである、上記（１０）に記載の抽出液。

【００１０】なお本明細書において「カイコ」は、カイ
コガ科に属する鱗翅目昆虫（絹糸昆虫）と同義であり、
その一生において「卵（胚）」（産卵直後より孵化直前
までの間）、「幼虫」（孵化直後から繭の形成終了直前
（１齢期〜５齢期に分けられる））、「蛹」（繭の形成
終了直前から羽化する直前までの間）、ならびに「成虫
（蛾）」（羽化直後より死亡までの間）の各状態を経る
ものであり、その一生にわたる形態のいずれをも含むも
のとする。カイコは、卵より孵化した後の幼虫の状態で
は、桑を食べて発育する期間（齢）と、食べずに脱皮の
準備をする期間（眠）を交互に繰り返す。カイコの幼虫
において、孵化してから１回目の脱皮までを１齢期、１
回目の脱皮から２回目の脱皮までを２齢期といい、通
常、４回脱皮して５齢期で成熟する（この成熟した状態
のカイコ幼虫は「熟蚕」とも呼ばれる）。カイコの幼虫
は、熟蚕になると体が透明になり絹糸を吐いて繭を形成
し、蛹化する。蛹の後、羽化して成虫となる。

【００１１】本明細書における「絹糸腺」は、カイコ幼
虫の両体側において、頭部の下唇先端に位置する吐出口
から盲管にまで連なる一対の管状の外分泌腺であり、前
部絹糸腺、中部絹糸腺および後部絹糸腺に大きく分けら
れる。後部絹糸腺は、絹糸の中心部を為すフィブロイン
を分泌する。また中部絹糸腺は、セリシンを分泌する。
フィブロインは中部絹糸腺に蓄積されるとともに、セリ
シンによってその外周を覆われて、ゲル状の絹物質とな
る。この絹物質は、前部絹糸腺を通って吐出口から排出
され、固体化して絹糸となる。

【００１２】本明細書における「脂肪体」は、カイコ幼
虫において、体内の至るところに分布し、白色の柔らか
い扁平な帯状、ひも状あるいは葉状の組織である。脂肪
体は、ヒトの肝臓に似て栄養、エネルギー源を貯蔵する
役目を果たしているので、細胞内には脂肪球、タンパク
質、グリコーゲンその他の新陳代謝に関係する種々の物
質を含んでいる。

【００１３】本明細書における「胚」は、カイコの卵の
状態の組織を指すものとする。

【００１４】本明細書における「無細胞系タンパク質合
成」は、外来鋳型ＤＮＡよりｍＲＮＡを転写する転写工
程と、該転写工程で得られたｍＲＮＡの情報を読み取っ
てタンパク質を合成する翻訳工程とを含む、無細胞転写
翻訳系によるタンパク質合成を指すものとする。ここ
で、本発明の合成方法によって無細胞系で合成される
「タンパク質」は、複数のアミノ酸残基から構成される
任意の分子量のペプチド、すなわち低分子量のペプチド
から高分子量のいずれをも包含するものとする。また本
明細書でいう「タンパク質」は、糖鎖修飾されてなる糖
タンパク質も含む。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明の無細胞系タンパク質合成
方法に用いる抽出液に含有される「カイコ組織由来の抽
出物」は、カイコの一生のうちのどの状態（卵、幼虫
（１齢期〜５齢期）、蛹、成虫）のいずれの組織由来で
あってもよい。またカイコ組織は、単一の状態における
単一の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後
部絹糸腺のみ）由来に限らず、単一の状態における複数
の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹
糸腺および脂肪体）由来であってもよく、複数の状態に
おける単一の組織（たとえば、３齢期、４齢期、５齢期
の各カイコ幼虫における後部絹糸腺）由来であってもよ
いものとする。無論、複数の状態における複数の組織由
来であってもよい。なお上記「カイコ組織由来の抽出
物」は、カイコの組織の全体（たとえば、後部絹糸腺全
体）からの抽出物である必要はない。

【００１６】本発明における抽出液中のカイコ組織由来
の抽出物の含有量に特に制限はないが、タンパク質濃度
で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ含有するものである
のが好ましく、中でも１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍ
Ｌ含有するものであるのがより好ましい。当該抽出物の
含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、
本発明の作用に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合
成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽
出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを越
えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しずらい虞
があるためである。

【００１７】なお上記範囲の量のカイコ組織由来の抽出
物を含有する抽出液は、抽出液のタンパク質濃度測定を
利用して、調製できる。当該タンパク質濃度測定は、当
分野において通常行われているように、たとえばＢＣＡ
Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ
製）を使用し、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．
１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎｍに
おける吸光度を測定する、といった手順によって行う。
コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）を使用する。

【００１８】上記カイコ組織としては、カイコ幼虫の絹
糸腺、脂肪体およびカイコの胚から選ばれる少なくとも
いずれかを含有していることが望ましい。抽出液中にカ
イコ幼虫由来の絹糸腺、脂肪体およびカイコの胚から選
ばれる少なくともいずれかが含有されているか否かは、
たとえばアルドラーゼについてのアイソザイム解析を行
うことによって判別することができる（Nagaokaら(199
5)、Insect Biochem Mol Biol. 25, 819-825）。

【００１９】カイコ幼虫の絹糸腺由来の抽出物、特には
後部絹糸腺由来の抽出物を少なくとも含有すると、短時
間で大量のタンパク質が合成可能であるというような特
に優れた利点を有する無細胞系タンパク質合成用抽出液
を実現できる上で好ましい。

【００２０】カイコ幼虫の脂肪体由来の抽出物は、脂肪
体が柔らかい組織であるために、すり潰す作業が短時間
で済み、結果として容易に抽出液を調製できる、という
ような特に優れた利点を有する無細胞系タンパク質合成
用抽出液を実現できる上で好ましい。なお脂肪体につい
ては、上記アイソザイム解析以外に、抽出液をドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて脂肪体由来のタンパク質であ
るＳＰ−１、ＳＰ−２などを検出することによっても、
抽出液中に含有されているか否かを判別することができ
る。

【００２１】カイコの胚由来の抽出物は、胚が１つの個
体であるために、他の組織とは異なり摘出する作業を要
さず、結果として容易に抽出液を調製できる、というよ
うな特に優れた利点を有する無細胞系タンパク質合成用
抽出液を実現できる上で好ましい。なおカイコの胚につ
いては、上記アイソザイム解析以外に、抽出液をＳＤＳ
−ＰＡＧＥにかけて胚由来のタンパク質である３０Ｋ、
ＥＳＰ、Ｖｉｔｅｌｌｉｎ（Ｈ）、Ｖｉｔｅｌｌｉｎ
（Ｌ）などを検出することによっても、抽出液中に含有
されているか否かを判別することができる。

【００２２】抽出物がカイコ幼虫の後部絹糸腺または脂
肪体由来である場合、カイコ幼虫の１齢期〜５齢期のも
のであれば、特に制限なく本発明に使用できるが、当該
後部絹糸腺または脂肪体は、５齢期のカイコ幼虫由来で
あるのが好ましい。これは、５齢期のカイコ幼虫におい
ては、後部絹糸腺および脂肪体が１齢期〜５齢期のうち
で最も成熟しており、これを用いることで他の齢期のも
のと比べて短時間で大量のタンパク質合成可能である、
というような利点を有する。中でも特に、絹糸の主成分
である絹フィブロインを活発につくり、高いタンパク質
合成能を有しているという観点から、本発明における抽
出液は、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺、中でも５齢
期の３日目〜７日目のカイコ幼虫の後部絹糸腺からの抽
出物を必須成分として含有していることが好ましい。

【００２３】また本発明に使用する抽出液においては、
外来鋳型ＤＮＡが、上記のカイコ組織由来の抽出物とと
もに必須成分として含有される。外来鋳型ＤＮＡは、プ
ラスミドＤＮＡなどの環状ＤＮＡであってもよいし、Ｐ
ＣＲ産物などの直鎖状ＤＮＡであってもよい。上記外来
鋳型ＤＮＡは、カイコ組織に由来しない鋳型ＤＮＡを指
し、目的タンパク質をコードする塩基配列と、その５’
上流側に位置するプロモーター配列とを少なくとも有す
る。本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡは、カイコ組織に由
来しない鋳型ＤＮＡであるならば、コードするタンパク
質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、生細胞で細胞
毒となるタンパク質をコードする塩基配列を有するもの
であってもよいし、また糖タンパク質をコードする塩基
配列を有するものであってもよい。また本発明に用いる
外来鋳型ＤＮＡにおけるプロモーター配列としては、特
に制限されるものではないが、たとえば、従来公知のＴ
７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プ
ロモーター配列などが挙げられる。なお本発明に用いる
外来鋳型ＤＮＡは、塩基数に特に制限はなく、目的とす
るタンパク質を合成し得るならば鋳型ＤＮＡ全てが同じ
塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を
合成し得る程度に相同な配列であれば、各外来鋳型ＤＮ
Ａは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加され
たものであってよい。なお、抽出液において、含有され
る鋳型ＤＮＡが外来鋳型ＤＮＡであるかカイコ組織に由
来する鋳型ＤＮＡであるかは、抽出液中より、フェノー
ル−クロロホルム抽出を行ってその鋳型ＤＮＡを抽出
し、その塩基配列を解析することによって判別すること
ができる。

【００２４】また、本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡは、
上記目的タンパク質をコードする塩基配列の３’下流側
に転写を終結させる機能を有するターミネーター配列、
および／または、合成されたｍＲＮＡの安定性などの観
点からポリＡ配列を有しているのが好ましい。上記ター
ミネーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７タ
ーミネーター配列、ＳＰ６ターミネーター配列、Ｔ３タ
ーミネーター配列などが挙げられる。

【００２５】また上記抽出液中において、外来鋳型ＤＮ
Ａは、タンパク質合成の速度の観点から、１μｇ／ｍＬ
〜１０ｍｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ
／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ま
しい。外来鋳型ＤＮＡが１μｇ／ｍＬ未満の場合、該外
来鋳型ＤＮＡが抽出液中で不安定となり、また１０ｍｇ
／ｍＬを越える場合には、粘性があがり操作性が悪くな
る。また、外来鋳型ＤＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１
０ｍｇ／ｍＬを越えると、これを用いたタンパク質合成
の際にタンパク質合成の速度が低下する傾向にある。

【００２６】このようなカイコ組織由来の抽出物と外来
鋳型ＤＮＡとを含有する抽出液を用いて、転写および翻
訳を経て外来鋳型ＤＮＡからタンパク質を合成すること
によって、如何なるタンパク質、例えば生細胞で細胞毒
となるタンパク質であっても、短時間にて合成すること
が可能となる。また、真核生物であるカイコ由来の抽出
物を用いているため、糖タンパク質を無細胞系で合成す
ることも可能であり、特に制限されることなく多くの種
類のタンパク質を合成することができる。さらに、本発
明に用いる抽出液は、後述するように従来の小麦胚芽か
らの抽出液の調製と比較して格段に容易に調製すること
ができ、効率的な無細胞系タンパク質合成を実現でき
る。また本発明の無細胞系タンパク質合成方法は、ＤＮ
Ａをそのまま鋳型としてタンパク質合成反応に使用し転
写工程をも無細胞系で行うものである。これにより本発
明においては、従来一般的であった無細胞系での翻訳工
程のみによってｍＲＮＡからタンパク質を合成する方法
とは異なり、使用するｍＲＮＡの調製のための作業（た
とえば、外来鋳型ＤＮＡを生細胞に導入しｍＲＮＡを合
成させる、または、インビトロ転写系によりｍＲＮＡを
合成した後、得られたｍＲＮＡを精製するなどの作業）
が不要であり、容易に反応液の調製を行うことができ
る。またｍＲＮＡはＤＮＡと比較して分解され易く、こ
れを用いた無細胞系タンパク質合成用の反応液は保存安
定性に劣るが、本発明においては分解されにくく安定な
ＤＮＡを使用するので、安定な反応液を調製することが
できるという利点もある。

【００２７】また本発明に使用する抽出液は、上記のカ
イコ組織由来の抽出物および外来鋳型ＤＮＡに加えて、
プロテアーゼインヒビターをさらに含有することが好ま
しい。プロテアーゼインヒビターをさらに含有すること
によって、調製が容易であり、タンパク質（糖タンパク
質も含む）の合成を効率的に行うことができる。これ
は、プロテアーゼインヒビターによりカイコ組織由来の
抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当
該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパク質の不所
望な分解を防止でき、結果としてカイコ組織由来の抽出
物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すことがで
きるようになるためであると考えられる。

【００２８】このようなプロテアーゼインヒビターとし
ては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるなら
ば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニ
ルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがあ
る。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペ
プスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシス
クシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エ
チレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用する
ことができるが、カイコ組織由来の抽出物を含有する抽
出液にはセリンプロテアーゼが含まれることから、上記
中でも、セリンプロテアーゼに対して特異性の高いイン
ヒビターとして働くＰＭＳＦを使用するのが好ましい。
また、１種類のプロテアーゼインヒビターのみならず、
数種類のプロテアーゼインヒビターの混合物（プロテア
ーゼインヒビターカクテル）を用いてもよい。

【００２９】プロテアーゼインヒビターは、上記抽出液
中において、本発明の作用に必須な酵素類の分解阻害能
を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有さ
れることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有される
ことがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μ
Ｍ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑える
ことができない傾向にあるためであり、またプロテアー
ゼインヒビターが５０ｍＭを越えると、タンパク質合成
反応を阻害する傾向にあるためである。

【００３０】本発明の無細胞系でのタンパク質合成にお
いては、上記カイコ組織由来の抽出物と外来鋳型ＤＮＡ
とを少なくとも含有し、好ましくはプロテアーゼインヒ
ビターをさらに含有する抽出液に、ＲＮＡポリメラー
ゼ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジ
ン５'−三リン酸、ウリジン５'−三リン酸、クレアチン
リン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分およびｔＲ
ＮＡを少なくとも添加してなる反応液を用いて行うのが
好ましい。

【００３１】上記反応液は、上述した抽出液が１０（ｖ
／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％
〜６０（ｖ／ｖ）％含有されるように調製されるのが好
ましい。すなわち、上記反応液の全体において、カイコ
組織由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１
ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製される
のが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるよ
うに調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量
がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０
ｍｇ／ｍＬを越えると、反応速度が低下する傾向にある
ためである。また、反応液の全体において、外来鋳型Ｄ
ＮＡは、０．１μｇ／ｍＬ〜８０００μｇ／ｍＬ含有さ
れることが好ましく、３μｇ／ｍＬ〜６００μｇ／ｍＬ
含有されることがより好ましい。外来鋳型ＤＮＡが０．
１μｇ／ｍＬ未満または８０００μｇ／ｍＬを越える
と、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためで
ある。

【００３２】本発明に使用するＲＮＡポリメラーゼは、
外来鋳型ＤＮＡが有するプロモーター配列に応じて適宜
選択することができる。たとえば、外来鋳型ＤＮＡがＴ
７プロモーター配列を有している場合は、その配列を認
識するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ま
しい。また、外来鋳型ＤＮＡが、ＳＰ６またはＴ３プロ
モーター配列を有している場合は、それぞれ、ＳＰ６
ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを
使用することが好ましい。

【００３３】ＲＮＡポリメラーゼは、当該反応液中にお
いて、ｍＲＮＡ合成の速度およびタンパク質合成の速度
の観点から、０．０１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有さ
れることが好ましく、０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含
有されることがより好ましい。ＲＮＡポリメラーゼが
０．０１Ｕ／μＬ未満であると、ｍＲＮＡの合成量が少
なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下する
傾向にあるためであり、またＲＮＡポリメラーゼが１０
０Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する
傾向にあるためである。

【００３４】当該反応液中におけるアデノシン三リン酸
（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク
質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０
１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍ
Ｍ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが
０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク
質の合成速度が低下する傾向にあるためである。

【００３５】当該反応液中におけるグアノシン三リン酸
（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク
質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０
１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍ
Ｍ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが
０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク
質合成の速度が低下する傾向にあるためである。

【００３６】当該反応液中におけるシチジン５'−三リ
ン酸（以下、「ＣＴＰ」ということがある。）は、タン
パク質合成の速度の観点から、当該反応液中において
０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、
０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。Ｃ
ＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タ
ンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。

【００３７】当該反応液中におけるウリジン５'−三リ
ン酸（以下、「ＵＴＰ」ということがある。）は、タン
パク質合成の速度の観点から、当該反応液中において
０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、
０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。Ｕ
ＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タ
ンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。

【００３８】当該反応液中におけるクレアチンリン酸
は、タンパク質を継続的に合成するための成分であっ
て、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレ
アチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当
該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されること
が好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがよ
り好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、
充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果とし
てタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであ
り、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻
害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾
向にあるためである。

【００３９】当該反応液中におけるクレアチンキナーゼ
は、タンパク質を継続的に合成するための成分であっ
て、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する
目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質
合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／
ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、
１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがよ
り好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満で
あると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、
結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にある
ためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／
ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合
成速度が低下する傾向にあるためである。

【００４０】当該反応液中におけるアミノ酸成分は、２
０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グ
ルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、
グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、
アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アス
パラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチ
ン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含
有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識さ
れたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾
アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、
通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、
当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１
０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜５０
０μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が
１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質
の合成速度が低下する傾向にあるためである。

【００４１】当該反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２
０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量
ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成
の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ
〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０
μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好
ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μ
ｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する
傾向にあるためである。

【００４２】本発明における反応液は、さらに、カリウ
ム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトール、ＲＮａｓ
ｅインヒビター、スペルミジンおよび緩衝剤を含有する
のが好ましい。

【００４３】上記カリウム塩としては、本発明の作用を
阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえ
ば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩
化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カ
リウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化
カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用す
ることができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ま
しい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助
因子として作用する。

【００４４】カリウム塩は、当該反応液中において、保
存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価の
カリウム塩である場合、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有され
ることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されるこ
とがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５
００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不
安定になる傾向にあるためである。

【００４５】上記マグネシウム塩としては、本発明の作
用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、た
とえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグ
ネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシ
ウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マ
グネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で
使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用す
るのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反
応における補助因子として作用する。

【００４６】マグネシウム塩は、当該反応液中におい
て、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウム
など２価の塩である場合、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有さ
れることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されるこ
とがより好ましい。マグネシウム塩０．１ｍＭ未満また
は１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分
が不安定になる傾向にあるためである。

【００４７】上記ジチオトレイトール（以下、「ＤＴ
Ｔ」ということがある。）は、酸化防止の目的で配合さ
れるものであり、当該反応液中において０．１ｍＭ〜１
００ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜２０
ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍ
Ｍ未満または１００ｍＭを越えると、タンパク質の合成
に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。

【００４８】当該反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビ
ターは、抽出液に混在するカイコ由来のＲＮａｓｅによ
って、本発明の無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡ
やｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を
妨げるのを防ぐ目的で添加されるものであり、当該反応
液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有され
ることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有され
ることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．
１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分
抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮ
ａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを越えると、タン
パク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。

【００４９】上記スペルミジンは、転写における伸張反
応を促進する目的で添加されるものであり、当該反応液
中において０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることが
好ましく、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることがよ
り好ましい。スペルミジンが０．０１ｍＭ未満である
と、ｍＲＮＡの合成速度が低下し生成するｍＲＮＡの量
が少なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下
するというような傾向にあるためであり、またスペルミ
ジンが１００ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻
害する傾向にあるためである。

【００５０】上記緩衝剤は、抽出液に緩衝能を付与し、
たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こ
る抽出液のｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止
する目的で配合される。このような緩衝剤としては、特
に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン
酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳな
どを使用することができる。緩衝剤は、当該抽出液のｐ
Ｈが好ましくは４〜１０、より好ましくは６〜８に保持
されるようなものを使用するのが好ましい。抽出液のｐ
Ｈが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応
に必須な成分が変性する虞があるためである。このよう
な観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．
４）を使用するのが好ましい。

【００５１】緩衝剤は、当該抽出液中において好適な緩
衝能を保持するという観点から、１ｍＭ〜２００ｍＭ含
有されることが好ましく、５ｍＭ〜５０ｍＭ含有される
ことがより好ましい。緩衝剤が１ｍＭ未満であると、酸
性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引
き起こし、抽出物が変性する傾向にあるためであり、ま
た緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過
ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向に
あるためである。

【００５２】本発明に使用される反応液は、グリセロー
ルを含有するのがより好ましい。グリセロールを添加す
ると、タンパク質合成反応においてタンパク質合成に必
須な成分を安定化できるというような利点があるためで
ある。グリセロールを添加する場合、通常、５（ｖ／
ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。

【００５３】すなわち、本発明の無細胞系タンパク質合
成方法に用いる反応液は、上述したプロテアーゼインヒ
ビターを含む抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／
ｖ）％含有するとともに、さらに０．１Ｕ／μＬ〜１０
Ｕ／μＬのＲＮＡポリメラーゼ、０．１ｍＭ〜５ｍＭの
ＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、０．１ｍＭ〜５
ｍＭのＣＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＵＴＰ、１０ｍＭ
〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５
００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜５０
０μＭのアミノ酸成分、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／
ｍＬのｔＲＮＡを含有するのが好ましい。さらには、５
０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍ
Ｍの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜２０ｍＭのＤＴ
Ｔ、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビタ
ー、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭのスペルミジン、５ｍＭ〜
５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、５（ｖ
／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロールを含有する
ように実現されるのが好ましい。

【００５４】本発明の無細胞系タンパク質合成方法は、
上記のような本発明における抽出液を含有する反応液を
用いて、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。

【００５５】転写工程の反応温度は、通常、１０℃〜６
０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲内である。転写
工程の反応温度が１０℃未満であると、転写の速度が低
下する傾向にあり、また転写工程の反応温度が６０℃を
越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるため
である。また翻訳工程の温度は、通常、１０℃〜４０
℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。翻訳工
程の反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成
速度が低下する傾向にあり、また翻訳工程の反応温度が
４０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向に
あるためである。本発明では、転写、翻訳工程を連続し
て実施し得るという観点から両工程に好適な２０℃〜３
０℃の範囲で反応を行うことが特に好ましい。反応の時
間は、全工程あわせて、通常、１時間〜７２時間、好ま
しくは３時間〜２４時間である。

【００５６】本発明の無細胞系タンパク質合成方法にて
合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。本
発明の無細胞系のタンパク質合成方法にて合成できるタ
ンパク質に特に制限はない。

【００５７】本発明の無細胞系タンパク質合成方法に使
用する抽出液は、上述したようにカイコ組織由来の抽出
物と、外来鋳型ＤＮＡとを少なくとも含有するものであ
るが、本発明は、この無細胞系タンパク質合成用の抽出
液も提供するものである。本発明の抽出液は、上述した
理由によりプロテアーゼインヒビターをさらに含有する
ものであるのが好ましい。さらには、カリウム塩、マグ
ネシウム塩、ＤＴＴおよび緩衝剤を含有すると、本発明
の作用に必須な成分を安定に保つことができる、という
ような利点があるため好ましい。

【００５８】当該抽出液中におけるカリウム塩として
は、反応液の成分として上述した各種のカリウム塩、好
適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム
塩は、上述した反応液におけるカリウム塩の場合と同様
の観点から、当該抽出液中に１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有
されることが好ましく、５０ｍＭ〜２００ｍＭ含有され
ることがより好ましい。

【００５９】当該抽出液中におけるマグネシウム塩とし
ては、反応液の成分として上述した各種のマグネシウム
塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用でき
る。マグネシウム塩は、上述した反応液におけるマグネ
シウム塩の場合と同様の観点から、当該抽出液中に０．
１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍ
Ｍ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。

【００６０】当該抽出液中におけるＤＴＴは、上述した
反応液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、当該抽
出液中に０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好まし
く、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好まし
い。

【００６１】抽出液に含有される緩衝剤としては、上述
した反応液と同様のものが好適に使用でき、同様の理由
から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）を使用するの
が好ましい。また、緩衝剤は、上述した反応液における
緩衝剤の場合と同様の観点から、当該抽出液中に５ｍＭ
〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５
０ｍＭ含有されることがより好ましい。

【００６２】本発明の抽出液は、カイコ組織から抽出用
液を用いて抽出したカイコ組織由来の抽出物に、外来鋳
型ＤＮＡを添加して抽出液とする方法によって調製され
る。かかる調製方法においては、カイコ組織からの抽出
を行う処理を少なくとも含有し、好ましくは、カイコ組
織からの抽出後、精製を行う。具体的には、このカイ
コ組織からの抽出を行う処理、の処理で抽出して得
られた液状物の上清をゲル濾過する処理、ゲル濾過後
の抽出液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画
分を分取する処理、を少なくとも含有する調製方法によ
って、好適に調製できる。

【００６３】上記の処理では、まず、常法にしたがっ
て、たとえばハサミ、ピンセット、メスなどの器具を使
用して、カイコより所望の組織を摘出する。この摘出に
よって得る後述の抽出に使用する組織量としては、特に
制限はないが、通常、１ｇ〜１００ｇの範囲内である。

【００６４】次に、摘出した組織を、たとえば液体窒素
で凍結した後、−８０℃で凍結させた乳鉢を用いてすり
潰し、抽出用液で抽出する。ここで使用する抽出用液
は、従来公知の抽出に用いる緩衝液を特に制限なく使用
することができるが、好ましくは、プロテアーゼインヒ
ビター、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴおよび緩
衝剤を含有するものを使用する。特に好ましくは、０．
１ｍＭ〜１ｍＭのＰＭＳＦ、５０ｍＭ〜２００ｍＭの酢
酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、
０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥ
ＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）を含有する抽出用液を使
用する。

【００６５】の処理では、まず、上記の処理で得た
液状物を遠心分離にかける。当該遠心分離は、当分野に
おいて通常行われている条件（１００００×ｇ〜５００
００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行い
上清を回収し、再度、上記の条件で行えばよい。遠心分
離後、上清をゲル濾過する。ゲル濾過は、たとえば脱塩
カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社
製）を好適に使用することができ、常法にしたがって、
ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供
給し、上記ゲル濾過用緩衝液にて溶出する、というよう
な条件にて行えばよい。上記ゲル濾過用緩衝液は、上記
抽出用液にグリセロールを添加したものであることが好
ましい。これにより、タンパク質合成に必須な成分を安
定化できるというような利点がある。グリセロールは、
通常、５（ｖ／ｖ）％〜４０（ｖ／ｖ）％（好ましく
は、２０（ｖ／ｖ）％）となるように添加すればよい。

【００６６】ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル
濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画
分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を
効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６
ｍＬを１画分とするのが好ましい。

【００６７】の処理では、ゲル濾過後の濾液より２８
０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する。当
該処理は、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ
（アマシャム バイオサイエンス社製）などの機器を用
いて、各画分について上記２８０ｎｍにおける吸光度を
測定し、この吸光度が１０以上の画分を分取する。この
ようにして得られる画分に外来鋳型ＤＮＡを添加して、
抽出液を得る。外来鋳型ＤＮＡの添加は、外来鋳型ＤＮ
Ａの含有量が上記した本発明の抽出液として好適な範囲
内になるように実現される。すなわち、該抽出液中、外
来鋳型ＤＮＡが好ましくは１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍ
Ｌ、より好ましくは１０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍ
Ｌ含有されるように添加される。なお本発明における抽
出液は、上記２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の複
数の画分を混合したものに外来鋳型ＤＮＡを添加したも
のであっても当然よい。

【００６８】所望の量の上記抽出物を含有する抽出液を
得るためには、通常、複数体のカイコより抽出する必要
がある。抽出に供するカイコの数は、使用するカイコの
状態や個体差によっても異なるが、カイコ幼虫について
は、繭の形成期に近づくにつれて組織の成熟に伴って、
同量の抽出物を得るために要する数は少なくて済む。特
に絹糸腺は、５齢期のカイコ幼虫において日を追うごと
に著しく成熟するため、たとえば、５齢期の１日目で３
０匹程度のカイコ幼虫からと同程度の量を５齢期の７日
目では６匹〜７匹程度のカイコ幼虫から得ることができ
る。

【００６９】なお本発明の抽出液は、上記の調製方法で
得られると、上述したような利点を有する上で好ましい
が、必ずしも上記調製方法で得られたものでなくともよ
い。

【００７０】また本発明は、カイコ組織由来の抽出物
と、プロテアーゼインヒビターとを少なくとも含有する
液状組成物を用い、転写および翻訳を経て外来鋳型ＤＮ
Ａからタンパク質を合成する無細胞系タンパク質合成方
法も提供する。この液状組成物に含有されるカイコ組織
由来の抽出物およびプロテアーゼインヒビターは、本発
明における抽出液について上述したのと同様である。ま
た、本発明の液状組成物も、外来鋳型ＤＮＡを含有しな
い以外は上述したのと同様の含有量にて、カリウム塩、
マグネシウム塩、ＤＴＴおよび緩衝剤をさらに含有する
のが好ましい。かかる液状組成物を用いた無細胞系タン
パク質合成反応に際しては、反応液に外来鋳型ＤＮＡを
さらに添加する以外は、上述した抽出液からの反応液の
調製と同様にして行えばよい。

【００７１】

〔抽出用液の組成〕

・２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４） ・１００ｍＭ 酢酸カリウム ・２ｍＭ 酢酸マグネシウム ・２ｍＭ ＤＴＴ ・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ 抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ
２０Ｂ３（日立工機社製）にて、３００００×ｇ、３０
分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、
上清のみを単離し、再び３００００×ｇ、１０分間、４
℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみ
を単離した。脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バ
イオサイエンス社製）に、２０％グリセロールを含む抽
出用液を加えカラムを平衡化した後、上清を供給し、上
記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。
ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓ
ｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス
社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上
の画分を分取して、これに４０μｇ／ｍＬの外来鋳型Ｄ
ＮＡを添加し、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の
無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。外来鋳型ＤＮ
Ａとしては、下記（２）の手順にて調製したものを用い
た。得られた抽出液について、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ
ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用い、タ
ンパク質濃度を測定した。まず反応試薬２ｍＬに対して
サンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応さ
せ、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、
アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、５６２
ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとして、
ＢＳＡを用い、検量線を作成した。抽出液中におけるカ
イコ幼虫の後部絹糸腺の含有量は、タンパク質濃度で１
７．５ｍｇ／ｍＬであった。

【００７２】（２）外来鋳型ＤＮＡの調製 以下の手順にしたがって、外来鋳型ＤＮＡを調製した。
まず、ＴＮＴ Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌ
ｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社
製）に付属のルシフェラーゼＴ７コントロールＤＮＡを
用いて、大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡績社製）を、常法に
従い形質転換した。形質転換後の大腸菌をＬＢ培地８０
ｍｌで３７℃、１２時間培養し、得られた菌体から、Ｐ
ｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）
を用いて、プロトコルに従いプラスミドＤＮＡを調製し
た。

【００７３】（３）無細胞系タンパク質合成 上記（１）で調製した抽出液を用いて、下記の組成の反
応液を調製した。 〔反応液の組成〕 ・５０（ｖ／ｖ）％ 抽出液（反応液中における外来鋳
型ＤＮＡ：２０μｇ／ｍＬ） ・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．
４） ・１００ｍＭ 酢酸カリウム ・１ｍＭ 酢酸マグネシウム ・１０ｍＭ ＤＴＴ ・１０（ｖ／ｖ）％ グリセロール ・０．２ｍＭ ＡＴＰ ・０．２ｍＭ ＧＴＰ ・０．２ｍＭ ＵＴＰ ・０．２ｍＭ ＣＴＰ ・２５ｍＭ クレアチンリン酸 ・４００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ ・２００μＭ アミノ酸（２０種） ・０．１ｍＭ スペルミジン ・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター ・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ ・１Ｕ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、ＣＴＰ
（シグマ社製）、ＵＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２
０種）（シグマ社製）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（プ
ロメガ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社
製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社
製）をそれぞれ用いた。各々調製した反応液を用いて、
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１００
０（東京理化器械社製）を用い、無細胞系のタンパク質
（ルシフェラーゼ）の合成反応を行った。反応液量は２
５μＬとした。反応温度は２０℃とし、反応時間ごとに
サンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ量を測
定した。合成されたルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ
アッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ製）を用いて
各々定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに
反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｒｎ
ｅｒ ＤｅｓｉｇｎｓＴＤ−２０／２０、プロメガ社
製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。

【００７４】図１は、実施例１についての、反応時間に
対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフである。図
１において、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍ
Ｌ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。図１に示す
ように、５齢期４日目のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の
抽出物を含有する抽出液を用いた、転写および翻訳を経
て外来鋳型ＤＮＡからタンパク質を合成する無細胞系タ
ンパク質合成反応では、反応時間３００分間で約２１ｎ
ｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成されていた。

【００７５】実施例２ 外来鋳型ＤＮＡを８０μｇ／ｍＬ添加した以外は上記実
施例１の（１）と同様にして調製した抽出液を用いて、
下記の最適化した組成の反応液を調製した。 〔反応液の組成〕 ・５０（ｖ／ｖ）％ 抽出液（反応液中における外来鋳
型ＤＮＡ：４０μｇ／ｍＬ） ・１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．
４） ・１００ｍＭ 酢酸カリウム ・１ｍＭ 酢酸マグネシウム ・１ｍＭ ＤＴＴ ・１０（ｖ／ｖ）％ グリセロール ・０．２ｍＭ ＡＴＰ ・０．２ｍＭ ＧＴＰ ・０．２ｍＭ ＵＴＰ ・０．２ｍＭ ＣＴＰ ・２５ｍＭ クレアチンリン酸 ・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ ・４０μＭ アミノ酸（２０種） ・０．１ｍＭ スペルミジン ・２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター ・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ ・１Ｕ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、ＣＴＰ
（シグマ社製）、ＵＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２
０種）（シグマ社製）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（プ
ロメガ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社
製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社
製）をそれぞれ用いた。各々調製した反応液を用いて、
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１００
０（東京理化器械社製）を用い、無細胞系のタンパク質
（ルシフェラーゼ）の合成反応を行った。反応液量は２
５μＬとした。反応温度は２０℃とし、反応時間ごとに
サンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ量を測
定した。合成されたルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ
アッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ製）を用いて
各々定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに
反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｒｎ
ｅｒ ＤｅｓｉｇｎｓＴＤ−２０／２０、プロメガ社
製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。

【００７６】図２は、実施例２についての、反応時間に
対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフである。図
２において、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍ
Ｌ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。図２に示す
ように、５齢期４日目のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の
抽出物を含有し、最適化した組成の反応液を用いた無細
胞系タンパク質合成反応では、反応時間４２０分間で約
１４６ｎｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成されていた。

【００７７】

【発明の効果】以上の説明で明らかなように、本発明に
よれば、反応液の調製が容易であり、糖タンパク質の合
成も可能である、転写工程を含む無細胞系タンパク質合
成方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１についての、反応時間に対するルシフ
ェラーゼの合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェ
ラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間
（分）を示す。

【図２】実施例２についての、反応時間に対するルシフ
ェラーゼの合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェ
ラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間
（分）を示す。

フロントページの続き (72)発明者 伊東 昌章 大阪府大阪市福島区大開４−１−186 レ ンゴー株式会社中央研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA08 CA04 EA04 4B050 CC03 LL03 4B064 AG01 CC24 CD30 DA20

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カイコ組織由来の抽出物と、外来鋳型Ｄ
   ＮＡとを少なくとも含有する抽出液を用い、転写および
   翻訳を経て外来鋳型ＤＮＡからタンパク質を合成する無
   細胞系タンパク質合成方法。
2. 【請求項２】 上記抽出液が、プロテアーゼインヒビタ
   ーをさらに含有するものである、請求項１に記載の無細
   胞系タンパク質合成方法。
3. 【請求項３】 上記抽出液に、ＲＮＡポリメラーゼ、ア
   デノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン５'
   −三リン酸、ウリジン５'−三リン酸、クレアチンリン
   酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分およびｔＲＮＡ
   を少なくとも添加してなる反応液を用いるものである、
   請求項１または２に記載の無細胞系タンパク質合成方
   法。
4. 【請求項４】 カイコ組織由来の抽出物と、プロテアー
   ゼインヒビターとを少なくとも含有する液状組成物を用
   い、転写および翻訳を経て外来鋳型ＤＮＡからタンパク
   質を合成する無細胞系タンパク質合成方法。
5. 【請求項５】 上記液状組成物に、外来鋳型ＤＮＡ、Ｒ
   ＮＡポリメラーゼ、アデノシン三リン酸、グアノシン三
   リン酸、シチジン５'−三リン酸、ウリジン５'−三リン
   酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸
   成分およびｔＲＮＡを少なくとも添加してなる反応液を
   用いるものである、請求項４に記載の無細胞系タンパク
   質合成方法。
6. 【請求項６】 カイコ組織が、カイコ幼虫の絹糸腺を少
   なくとも含有する請求項１〜５のいずれかに記載の無細
   胞系タンパク質合成方法。
7. 【請求項７】 カイコ組織が、カイコ幼虫の脂肪体を少
   なくとも含有する請求項１〜５のいずれかに記載の無細
   胞系タンパク質合成方法。
8. 【請求項８】 カイコ組織が、カイコの胚を少なくとも
   含有する請求項１〜５のいずれかに記載の無細胞系タン
   パク質合成方法。
9. 【請求項９】 カイコ組織が、カイコ幼虫の後部絹糸腺
   を少なくとも含有する請求項６に記載の無細胞系タンパ
   ク質合成方法。
10. 【請求項１０】 カイコ組織由来の抽出物と、外来鋳型
    ＤＮＡとを少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成
    用抽出液。
11. 【請求項１１】 さらにプロテアーゼインヒビターを含
    有するものである、請求項１０に記載の抽出液。