JP2005006539A - 無細胞系タンパク質合成方法 - Google Patents

Abstract

【課題】カイコ抽出液または昆虫培養細胞抽出液を使用して無細胞系でタンパク質を製造する方法であって、ハイスループット化可能な新規な無細胞系タンパク質合成方法を提供する。
【解決手段】インビトロで転写反応を行う工程と、転写反応後の転写反応液を、マグネシウムの最終濃度が１０ｍＭ以下となるように節足動物由来の抽出物を含有する翻訳反応用溶液に添加して調製した翻訳反応液を用いて翻訳反応を行う工程とを含む、無細胞系でタンパク質を製造する方法。
【選択図】 なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、無細胞系タンパク質合成方法（無細胞系でタンパク質を製造する方法）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単に合成することが必要となってくる。
【０００３】
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって酵母や昆虫細胞などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。
【０００４】
一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系または遺伝情報転写／翻訳系を試験管内に取り揃え、目的タンパク質をコードするｍＲＮＡまたは鋳型ＤＮＡを用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質合成では、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法であると期待されている。このような無細胞系のタンパク質合成に供する細胞破砕液や抽出液として、種々の生物由来のものを使用することが検討され、研究が進められている。
【０００５】
無細胞系タンパク質合成用抽出液としては、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、大腸菌、昆虫培養細胞など由来のものが、従来より知られている。本発明者らは、これまで、カイコ組織由来の抽出液や昆虫培養細胞由来の抽出液を使用した無細胞系タンパク質合成方法を提案してきている（たとえば、特願２００２−３５５９０６号明細書、特願２００２−３６５１４２号明細書、特願２００２−３８２４１５号明細書）。本発明者らが提案するカイコ組織由来の抽出液（カイコ抽出液）や昆虫培養細胞由来の抽出液（昆虫培養細胞抽出液）を用いた無細胞系タンパク質合成方法では、従来の方法と比較して、抽出液の調製が格段に容易であり、真核生物由来であるため糖タンパク質の合成も可能であるという利点があり、非常に有用である。
【０００６】
上記本発明者らが提案する無細胞系タンパク質合成方法は、ＤＮＡもしくはｍＲＮＡを鋳型として、コードされているタンパク質を合成するものである。すなわち、ＤＮＡよりｍＲＮＡを転写する転写反応と、該転写反応で得られたｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する翻訳反応とを、上記抽出液を用いて連続的に行う方法（転写／翻訳系）、あるいは、ｍＲＮＡを鋳型として翻訳反応のみを、上記抽出液を用いて行う方法（翻訳系）の二通りの方法で、無細胞系のタンパク質合成を行う。しかしながら、ＤＮＡを鋳型とする方法（転写／翻訳系）では、最終的なタンパク質合成量が非常に低くなってしまっていた。また、ｍＲＮＡを鋳型とする方法（翻訳系）では、インビトロ転写反応、転写反応で得られたｍＲＮＡの精製、と抽出液を用いた翻訳反応に至るまでの工程数が多く煩雑な手間を要し、全工程を鑑みると、１ステップ法と同程度のタンパク質合成量を得るまでに長時間を要する。このようにこれまでの方法では、無細胞系タンパク質合成を多検体処理のようなハイスループットな技術とするための大きな障壁があった。
このようにカイコ抽出液または昆虫培養細胞抽出液を使用して、ハイスループットにタンパク質を合成し得るべく、ＤＮＡを鋳型とする場合よりもタンパク質合成量が向上されつつも、ｍＲＮＡを鋳型とする場合よりも簡略化されたステップでタンパク質を合成し得る、新規な無細胞系タンパク質合成方法の開発が望まれる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、カイコ抽出液または昆虫培養細胞抽出液を使用して無細胞系でタンパク質を製造する方法であって、ハイスループット化可能な新規な無細胞系タンパク質合成方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）インビトロで転写反応を行う工程と、
転写反応後の転写反応液を、マグネシウムの最終濃度が１０ｍＭ以下となるように節足動物由来の抽出物を含有する翻訳反応用溶液に添加して調製した翻訳反応液を用いて翻訳反応を行う工程とを含む、無細胞系でタンパク質を製造する方法。
（２）節足動物由来の抽出物がカイコ組織から抽出されたものである、上記（１）に記載の方法。
（３）節足動物由来の抽出物が昆虫培養細胞から抽出されたものである、上記（１）に記載の方法。
（４）昆虫培養細胞がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ卵細胞由来の培養細胞である、上記（３）に記載の方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の無細胞系タンパク質合成方法（無細胞系でタンパク質を製造する方法）は、インビトロで転写反応を行う工程と、インビトロで転写反応を行った後の転写反応液を、マグネシウムが特定の濃度以下となるように、節足動物由来の抽出物を含有する翻訳反応用溶液に添加して調製した翻訳反応液を用いて翻訳反応を行う工程とを含むことを特徴とする。以下、本明細書中において、この本発明の方法を「２ステップ法」と呼ぶことがある（▲１▼ＤＮＡを鋳型として転写反応を行うステップと、▲２▼転写反応後の転写反応液を上記のように翻訳反応用溶液に添加して調製した翻訳反応液を用いて翻訳反応を行うステップ、との２ステップを含有する）。
２ステップ法によれば、反応槽内で転写反応、翻訳反応を連続的に行ってＤＮＡからタンパク質を合成する従来法（以下、この従来法を「１ステップ法」と呼ぶ。）とは異なり、転写反応と翻訳反応とで好適な塩濃度の範囲が異なるために、結果として合成タンパク質の量が少なくなってしまうということがない。さらに、転写反応にてｍＲＮＡを合成し、精製後のｍＲＮＡを鋳型として翻訳反応を行ってタンパク質を合成する従来法（以下、この従来法を「３ステップ法」と呼ぶ；▲１▼転写反応を行うステップと、▲２▼転写反応で得られたｍＲＮＡを精製するステップと、▲３▼精製後のｍＲＮＡを用いて翻訳反応液を用いて翻訳反応を行うステップ、との３ステップを含有する）とは異なり、ｍＲＮＡの精製のステップを要することなく上記の如き合成量にて効率よくタンパク質を合成することができる。このような本発明の２ステップ法は、多検体処理などのようなハイスループットを要する無細胞系タンパク質合成に非常に有用である。
【００１０】
３ステップ法に使用される転写反応液、翻訳反応用溶液は、通常、マグネシウム塩を含有しており、各液中における好適なマグネシウム濃度は異なる（後述するように、転写反応液において好ましくは１ｍＭ〜２００ｍＭ（より好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭ）、翻訳反応用溶液において好ましくは０．１ｍＭ〜１０ｍＭ（より好ましくは０．５ｍＭ〜３ｍＭ））。１ステップ法では、このように転写反応と翻訳反応とでその反応に要する好適なマグネシウム濃度が異なるところ、１液（転写／翻訳反応液）で反応を行うため、良好なタンパク質合成量を達成することができなかったものと考えられる。しかし３ステップ法では、好適な組成に調製された転写反応液を用いてインビトロで転写反応を行った後、得られたｍＲＮＡを精製し、これを好適な組成に調製された翻訳反応用溶液に添加して、翻訳反応を行う。このように３ステップ法の場合、転写反応液および翻訳反応用溶液としては好適な組成に予め調製されたものを用いているため、転写反応から翻訳反応への際の塩の持込み（翻訳反応用溶液の不所望な塩濃度の増加）を防止する観点から、ｍＲＮＡを精製しこれを翻訳反応用溶液に添加するようにしている。
本発明の２ステップ法では、インビトロ転写反応後の転写反応液を、マグネシウムの最終濃度が１０ｍＭ以下（好ましくは５ｍＭ以下）となるように、翻訳反応用溶液に添加する。本明細書中では、マグネシウム濃度が上記となるようにインビトロ転写反応後の転写反応液を翻訳反応用溶液に添加して調製した液を「翻訳反応液」と呼ぶ。上記マグネシウムの最終濃度が１０ｍＭを越える場合には、翻訳反応を行うにはマグネシウムの濃度が高すぎる条件となり、翻訳反応の効率が低下してしまう。
【００１１】
具体的には、インビトロ転写反応後の転写反応液を、好適なマグネシウム濃度に予め調製した翻訳反応用溶液に、添加後のマグネシウム濃度が１０ｍＭ以下となるように、体積量を減少させて添加し、翻訳反応液を調製する。あるいは、上記好適なマグネシウム濃度よりも低い濃度に予め調製した翻訳反応用溶液に、上記よりは多目の体積量となるように減少させて、翻訳反応液を調製するようにしてもよい。
【００１２】
また、上記転写反応液を添加して調製した後の翻訳反応液中におけるマグネシウムの最終濃度は０．１ｍＭ以上であるのが好ましく、１ｍＭ以上であるのがより好ましい。上記マグネシウムの最終濃度が０．１ｍＭ未満であると、翻訳反応の効率が極端に低下してしまう傾向にあるためである。
【００１３】
本発明における転写反応液は、インビトロで転写反応を行い得る従来公知の適宜の組成のものを使用でき、特に制限されるものではない。たとえば、鋳型ＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＮＴＰｓ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）、マグネシウム塩を少なくとも含有する転写反応液が例示される。
【００１４】
転写反応液に含有される鋳型ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡなどの環状ＤＮＡであってもよいし、ＰＣＲ産物などの直鎖状ＤＮＡであってもよい。上記鋳型ＤＮＡは、目的タンパク質をコードする塩基配列と、その５’上流側に位置するプロモーター配列とを少なくとも有する。本発明に用いる鋳型ＤＮＡは、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、生細胞で細胞毒となるタンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよいし、また糖タンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよい。また鋳型ＤＮＡにおけるプロモーター配列としては、特に制限されるものではないが、たとえば、従来公知のＴ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列などが挙げられる。また、本発明に用いる鋳型ＤＮＡは、上記目的タンパク質をコードする塩基配列の３’下流側に転写を終結させる機能を有するターミネーター配列、および／または、合成されたｍＲＮＡの安定性などの観点からポリＡ配列を有しているのが好ましい。上記ターミネーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７ターミネーター配列、ＳＰ６ターミネーター配列、Ｔ３ターミネーター配列などが挙げられる。
なお本発明に用いる鋳型ＤＮＡは、塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならば全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各鋳型ＤＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
【００１５】
鋳型ＤＮＡは、転写反応液中において、１μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。鋳型ＤＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または２００μｇ／ｍＬを越えると、本発明の２ステップ法にて充分な量のタンパク質を合成し得る量のｍＲＮＡをインビトロ転写反応により得られない傾向にあるためである。
【００１６】
転写反応液中におけるＲＮＡポリメラーゼは、鋳型ＤＮＡが有するプロモーター配列に応じて適宜選択することができる。たとえば、鋳型ＤＮＡがＴ７プロモーター配列を有している場合は、その配列を認識するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。また、外来鋳型ＤＮＡが、ＳＰ６またはＴ３プロモーター配列を有している場合は、それぞれ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。
ＲＮＡポリメラーゼは、ｍＲＮＡ合成の速度の観点から、転写反応液中に０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、０．５Ｕ／μＬ〜５Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮＡポリメラーゼが０．１Ｕ／μＬ未満または１０Ｕ／μＬを越えると、本発明の２ステップ法にて充分な量のタンパク質を合成し得る量のｍＲＮＡをインビトロ転写反応により得られにくい傾向にあるためである。
【００１７】
転写反応液中におけるＮＴＰｓ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）の含有量に特に制限はないが、１ｍＭ〜２０ｍＭ含有されるのが好ましく、２ｍＭ〜１０ｍＭ含有されるのがより好ましい。ＮＴＰｓの含有量が１ｍＭ未満または２０ｍＭを越えると、本発明の２ステップ法にて充分な量のタンパク質を合成し得る量のｍＲＮＡがインビトロ転写反応により得られにくくなる傾向にあるためである。当該ＮＴＰｓは、通常、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰを概ね等量ずつ含有してなる。
【００１８】
転写反応液中におけるマグネシウム塩としては、インビトロ転写反応および翻訳反応を阻害するものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。転写反応液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が１ｍＭ未満または２００ｍＭを越えると、本発明の２ステップ法にて充分な量のタンパク質を合成し得る量のｍＲＮＡがインビトロ転写反応により得られにくくなる傾向にあるためである。
【００１９】
転写反応液は、さらに、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ＲＮａｓｅインヒビターおよびスペルミジンを含有するのが好ましい。ＤＴＴは、酸化防止の目的で配合されるものであり、転写反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターは、インビトロ転写反応にて合成したｍＲＮＡがＲＮａｓｅによって不所望に消化されるのを防止する目的で添加されるものであり、転写反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜２０Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、０．２Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。またスペルミジンは、転写における伸長反応を促進する目的で添加されるものであり、０．１ｍＭ〜２０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００２０】
また転写反応液は、通常、緩衝剤を含有する。緩衝剤としては、特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。緩衝剤は、転写反応液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６〜８に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが特に好ましい。
当該転写反応液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、１０ｍＭ〜４００ｍＭ含有されることが好ましく、２０ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が１０ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こす傾向にあるためであり、また緩衝剤が４００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎる傾向にあるためである。
【００２１】
すなわち、本発明に用いる転写反応液は、１μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬの鋳型ＤＮＡ、０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮＡポリメラーゼ、１ｍＭ〜２０ｍＭのＮＴＰｓ、１ｍＭ〜２００ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭ〜２００ｍＭのＤＴＴ、０．１Ｕ／μＬ〜２０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、０．１ｍＭ〜２０ｍＭのスペルミジン、１０ｍＭ〜４００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ましい。
【００２２】
本発明において、上述したような転写反応液を用いたインビトロ転写反応は、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行えばよい。転写工程の反応温度は、通常、１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲内である。転写工程の反応温度が１０℃未満であると、転写の速度が低下する傾向にあり、また転写工程の反応温度が６０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。反応の時間は、全工程あわせて、通常、１時間〜８時間、好ましくは３時間〜５時間である。
【００２３】
本発明の２ステップ法における翻訳反応用溶液としては、節足動物由来の抽出物を含有しており、無細胞系で翻訳反応を行い得るものであれば特に制限されるものではない。
ここで「節足動物」とは、後生動物の一門であって、左右相称、裂体腔を有する旧口動物を指し、鋏角亜門、大顎亜門のいずれに属するものであってもよく、たとえば、昆虫綱、クモ綱などに属する動物を包含する。中でも、昆虫綱またはクモ綱（特に、クモ亜綱）に属する節足動物が好ましく、昆虫綱に属する節足動物が特に好ましい。昆虫綱に属する節足動物としては、たとえば、鱗翅目（チョウ目）、直翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目、甲虫目、脈翅目、半翅目などに属するものが挙げられ、特に制限されるものではないが、中でも、カイコガ科、ヤガ科などの鱗翅目に属するものが好適に使用される。
本発明における翻訳反応用溶液中に含有される上記抽出物は、上記節足動物由来であるならば、成長段階のいずれを問わずいかなる組織から抽出されたものであってもよく、また、節足動物のいずれの組織由来の培養細胞より抽出されたものであってもよい。中でも、カイコ組織または昆虫培養細胞から抽出されたものであるのが特に好ましい。
【００２４】
「カイコ」は、カイコガ科に属する鱗翅目昆虫（絹糸昆虫）と同義であり、その一生において「卵（胚）」（産卵直後より孵化直前までの間）、「幼虫」（孵化直後から繭の形成終了直前（１齢期〜５齢期に分けられる））、「蛹」（繭の形成終了直前から羽化する直前までの間）、ならびに「成虫（蛾）」（羽化直後より死亡までの間）の各状態を経るものであり、その一生にわたる形態のいずれをも含むものとする。カイコは、卵より孵化した後の幼虫の状態では、桑を食べて発育する期間（齢）と、食べずに脱皮の準備をする期間（眠）を交互に繰り返す。カイコの幼虫において、孵化してから１回目の脱皮までを１齢期、１回目の脱皮から２回目の脱皮までを２齢期といい、通常、４回脱皮して５齢期で成熟する（この成熟した状態のカイコ幼虫は「熟蚕」とも呼ばれる）。カイコの幼虫は、熟蚕になると体が透明になり絹糸を吐いて繭を形成し、蛹化する。蛹の後、羽化して成虫となる。
【００２５】
翻訳反応用溶液がカイコ組織由来の抽出物を含有する場合、組織としてはカイコの一生のうちのどの状態（卵、幼虫（１齢期〜５齢期）、蛹、成虫）のいずれの組織であってよい。またカイコ組織は、単一の状態における単一の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺のみ）に限らず、単一の状態における複数の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺および脂肪体）であってもよく、複数の状態における単一の組織（たとえば、３齢期、４齢期、５齢期の各カイコ幼虫における後部絹糸腺）であってもよいものとする。無論、複数の状態における複数の組織であってもよい。なおカイコ組織は、カイコ組織の全体（たとえば、後部絹糸腺全体）である必要はない。
【００２６】
ここで、カイコ組織の「絹糸腺」とは、カイコ幼虫の両体側において、頭部の下唇先端に位置する吐出口から盲管にまで連なる一対の管状の外分泌腺であり、前部絹糸腺、中部絹糸腺および後部絹糸腺に大きく分けられる。後部絹糸腺は、絹糸の中心部を為すフィブロインを分泌する。また中部絹糸腺は、セリシンを分泌する。フィブロインは中部絹糸腺に蓄積されるとともに、セリシンによってその外周を覆われて、ゲル状の絹物質となる。この絹物質は、前部絹糸腺を通って吐出口から排出され、固体化して絹糸となる。
またカイコ組織の「脂肪体」とは、カイコ幼虫において、体内の至るところに分布し、白色の柔らかい扁平な帯状、ひも状あるいは葉状の組織である。脂肪体は、ヒトの肝臓に似て栄養、エネルギー源を貯蔵する役目を果たしているので、細胞内には脂肪球、タンパク質、グリコーゲンその他の新陳代謝に関係する種々の物質を含んでいる。
また「胚」は、カイコの卵の状態の組織を指す。
【００２７】
またカイコ組織に由来する抽出物を含有する場合、カイコ幼虫の絹糸腺、脂肪体およびカイコの胚から選ばれる少なくともいずれか由来の抽出物であるのが好ましい。カイコ幼虫の絹糸腺（特に、後部絹糸腺）より調製を行うと、短時間で大量のタンパク質が合成可能であるという特に優れた利点がある。またカイコ幼虫の脂肪体から抽出液を調製すると、脂肪体が柔らかい組織であるために、すり潰す作業が短時間で済み、結果として容易に抽出液を調製できる利点がある。さらに、カイコの胚から調製を行うと、胚が１つの個体であるために他の組織とは異なり摘出する作業を要さず、結果として容易に抽出液を調製できるという利点がある。
【００２８】
カイコを抽出対象とする場合、カイコは１齢期〜５齢期の幼虫であればよいが、５齢期のカイコ幼虫が好ましい。これは、カイコ幼虫は繭の形成期に近づくにつれて組織が成熟し、特に５齢期のカイコ幼虫においては組織が１齢期〜５齢期のうちで最も成熟しているため、同量の抽出物を得るために要する数は少なくて済むためである。中でも、５齢期のカイコ幼虫の絹糸腺または脂肪体（好ましくは５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺、より好ましくは５齢期の３日〜７日のカイコ幼虫の後部絹糸腺）からの抽出物を含有すると、他の齢期のものと比べて短時間で大量のタンパク質が合成可能な無細胞系タンパク質合成用抽出液が得られるという利点もあり、特に好ましい。
【００２９】
また、上述したように翻訳反応用溶液に含有される節足動物由来の抽出物は、従来公知の節足動物を由来とする培養細胞から得られたものであってもよい。かかる培養細胞としては、培養細胞株が多く樹立されており、また、多くの哺乳類系の培養細胞と異なり二酸化炭素雰囲気下での培養を必要とせず、無血清培地においても培養が可能であることから、鱗翅目、半翅目などの昆虫由来の培養細胞（昆虫培養細胞）を使用するのが好ましい。昆虫培養細胞も、いかなる組織由来の細胞であってもよく、たとえば、血球細胞、生殖巣由来細胞、脂肪体由来細胞、胚由来細胞、孵化幼虫由来細胞などを特に制限なく使用することができるが、中でも、タンパク質生産能が高いと考えられる生殖巣由来の昆虫培養細胞を使用するのが好ましい。特には、細胞系においてタンパク質合成能が高く、また無血清培地にて培養が可能である、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来の細胞Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）が好適な昆虫培養細胞として例示される。
【００３０】
上記節足動物由来の抽出物を含有する翻訳反応用溶液は、従来公知の適宜の組成の抽出用液を用いて、節足動物の組織または培養細胞より抽出操作を行って得られた抽出液（抽出液＝抽出用液＋抽出物）を調製し、これに後述するような翻訳反応に要する成分（カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、緩衝剤など）を適宜添加することで、調製することができる。
【００３１】
節足動物からの抽出操作に用いられる抽出用液としては、特には制限されるものではないが、プロテアーゼインヒビターを少なくとも含有するのが好ましい。
プロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液を用いると、節足動物由来の抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパクの不所望な分解を防止でき、結果として節足動物由来の抽出物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すことができるようになるという利点がある。上記プロテアーゼインヒビターとしては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるならば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがある。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エチレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用することができるが、節足動物由来の抽出物にはセリンプロテアーゼが含まれることが多いことから、上記中でもセリンプロテアーゼに対して特異性の高いインヒビターとして働くＰＭＳＦを使用するのが好ましい。
また、１種類のプロテアーゼインヒビターのみならず、数種類の混合物（プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いてもよい。
当該抽出用液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特に制限はないが、無細胞系タンパク質合成に必須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００３２】
また本発明に用いる抽出用液は、上記プロテアーゼインヒビターに加えて、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴおよび緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。
【００３３】
上記カリウム塩としては、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。
カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
当該抽出用液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜３００ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３４】
上記マグネシウム塩としては、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
当該抽出用液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３５】
上記ＤＴＴは、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該抽出用液中において０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３６】
上記緩衝剤は、抽出用液に緩衝能を付与し、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こる抽出液のｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。
緩衝剤は、得られた抽出液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６．５〜８．５に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を使用するのが特に好ましい。
当該抽出用液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３７】
また抽出対象である節足動物が昆虫培養細胞である場合、上記組成に加えて、塩化カルシウムおよびグリセロールをさらに含有してなる抽出用液を用いると、タンパク質合成能がより向上された昆虫培養細胞抽出液を得ることができるため好ましい。
この場合、塩化カルシウムの含有量は特に制限されないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであるのが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭであるのがより好ましい。また、グリセロールの添加量についても特に制限されるものではないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、５（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのが好ましく、１０（ｖ／ｖ）％〜５０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのがより好ましい。
【００３８】
抽出液を抽出する方法についても特に制限はなく、従来公知の適宜の方法にて行うことができる。
たとえば、節足動物由来の抽出物として、カイコ組織由来の抽出物または昆虫培養細胞由来の抽出物を使用する場合、上述したような組成の抽出用液を使用して、本発明者らが提案している抽出方法にて抽出液を調製するのが、好適である。
以下、それぞれの場合について詳述する。
【００３９】
〔Ａ〕カイコ組織由来の抽出物を含有する抽出液の調製方法
まず、常法にしたがって、たとえばハサミ、ピンセット、メスなどの器具を使用して、カイコより所望の組織を摘出する。この摘出によって得る後述の抽出に使用する組織量としては、特に制限はないが、通常、１ｇ〜１００ｇの範囲内である。
次に、摘出した組織を、たとえば液体窒素で凍結した後、−８０℃で凍結させた乳鉢中ですり潰し、これに上述した抽出用液を添加して抽出操作を行う。
あるいは、上記抽出用液の添加後、一旦抽出用液も凍結させた後、シャーベット状になるまで（具体的には、ウェットな黄色いシャリシャリ状態の氷になるまで）、薬さじで攪拌しながら溶解する。その後、再度液体窒素で完全に凍結させた後、シャーベット状になるまで（具体的には、ウェットな黄色いシャリシャリ状態の氷になるまで）薬さじで攪拌しながら溶解させる。かかる方法によれば、タンパク質合成に関与する成分が効率的に抽出され且つ安定化されるという利点がある。
このようにして、まず、カイコの組織からの抽出物を含有する液状物を得る。
【００４０】
次に、上記抽出処理で得られた液状物を遠心分離にかける。該遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行う。該遠心分離を１回行った後の上清（上清Ａ１）をそのまま用いて抽出液とするようにしてもよいし、また、該上清Ａ１に上記と同様の条件にて再度の遠心分離を行い、得られた上清（上清Ａ２）を抽出液としてもよい。
また、上記上清Ａ１と、上記１回目の遠心分離後の沈殿から上記抽出用液を用いてさらに抽出を行った後に、上記と同様の条件にて遠心分離して得られた上清（上清Ａ３）とを混合して、抽出液として調製するようにしてもよい。このように上清Ａ１と上清Ａ３とを混合して抽出液を調製することで、上清Ａ１、上清Ａ３を単独で抽出液とする場合と比較して、タンパク質合成効率が向上するという利点がある。またさらに、上清Ａ２を、上清Ａ３と混合して抽出液を調製してもよい。これにより上記効果はさらに増強される。勿論、上記上清Ａ１〜上清Ａ３を混合して、抽出液を調製するようにしてもよい。
この場合、調製される混合物（抽出液）における上清Ａ１および／または上清Ａ２（両方混合する場合には、その総量）と上清Ａ３との混合割合に特に制限はないが、タンパク質の合成効率の観点からは、体積比で１０：９０〜９０：１０であるのが好ましく、２０：８０〜８０：２０であるのがより好ましい。
【００４１】
なお上述のようにそれぞれ調製した後に、ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分付近を分取して抽出液として調製するようにしてもよい。しかしながらタンパク質の合成効率の観点からは、当該ゲル濾過および画分の分取を経ずに抽出液として調製するのが好ましい。
【００４２】
なお、上記ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分付近を分取する場合には、具体的には以下の手順にて行えばよい。
たとえば脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）を使用し、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記抽出用液にて溶出する、というような条件にて行う。上記ゲル濾過用緩衝液は、上記抽出用液に、グリセロールをさらに添加したものであることが好ましい。グリセロールは、通常、５（ｖ／ｖ）％〜４０（ｖ／ｖ）％（好ましくは、２０（ｖ／ｖ）％）となるように添加すればよい。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
次に、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する。当該処理は、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャムバイオサイエンス社製）などの機器を用いて、各画分について上記２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、この吸光度が最も高い画分付近を分取し、これを抽出液とする。
【００４３】
〔Ｂ〕昆虫培養細胞由来の抽出物を含有する抽出液の調製方法
昆虫培養細胞から抽出液を調製する場合、本発明者らが提案する、抽出用液中に懸濁した昆虫培養細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有する方法によって調製するのが好ましい。ここで「急激に凍結」とは、１０秒以下、好ましくは２秒以下にて、昆虫培養細胞を凍結させることを指す。また昆虫培養細胞を急激に凍結させる温度としては、通常−８０℃以下であり、好ましくは−１５０℃以下である。上記昆虫培養細胞の急激な凍結は、たとえば、液体窒素や液体ヘリウムなどの不活性ガスを使用することなどによって実現できるが、入手が容易であり安価な液体窒素を用いて行うのが好ましい。
かかる方法によって昆虫培養細胞からの抽出を行うことにより、緩和な状態で細胞の破砕を行うことができ、無細胞系タンパク質合成に必須な成分を破壊することなく細胞外に取り出すことができ、従来よりもタンパク質の合成量の高い無細胞系タンパク質合成用抽出液を容易に調製することができる。さらに、使用器具などからのＲＮａｓｅなどの混入も防ぐことができ、また、界面活性剤などの試薬を用いた細胞破砕法の場合に懸念される翻訳反応を阻害するような物質の持込みもない。
【００４４】
上記本発明者らが提案する抽出液の調製方法では、上述した急激に凍結させる工程を少なくとも含有しているならば、その他の工程について特に制限はない。
たとえば、乳鉢中で乳棒を用いてすり潰す方法、ダウンスホモジナイザーを用いる方法、ガラスビーズを用いる方法など、大腸菌や小麦胚芽などから無細胞系タンパク質合成用抽出液を得る際に従来より行われていた種々の手法にて昆虫培養細胞を破砕し、抽出を行えばよい。中でも、上記昆虫培養細胞を急激に凍結させた後、解凍し、遠心分離することによって昆虫培養細胞を破砕するのが好ましい。
【００４５】
上記急激に凍結した昆虫培養細胞を、解凍した後、遠心分離する場合、解凍は、たとえば−１０℃〜２０℃の水浴または氷水浴中での解凍、室温（２５℃）にての放置などによって実現できるが、タンパク質合成に必須な成分の失活を防止し、タンパク質合成能の低下を確実に防ぐことから、０℃〜２０℃（特には、４℃〜１０℃）の水浴または氷水浴中で解凍を行うのが好ましい。解凍した昆虫培養細胞の遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行えばよい。かかる遠心分離後の上清には、目的とする昆虫培養細胞の抽出物が含有される。
【００４６】
細胞破砕後、上記遠心分離後の上清（上清Ｂ１）をそのまま抽出液としてもよいし、上清Ｂ１をさらに遠心分離（１０，０００×ｇ〜１００，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜１２０分間）にかけて、得られた上清（上清Ｂ２）を抽出液としてもよい。さらに、上記上清Ｂ１または上清Ｂ２をゲル濾過し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分（吸収の大きな画分）を分取して、これを抽出液としてもよい。この場合、具体的には以下の手順にて行う。
まず、上清Ｂ１または上清Ｂ２についてゲル濾過を行うが、ゲル濾過は、たとえば脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）を好適に使用することができ、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記ゲル濾過用緩衝液にて溶出する、というような条件にて行えばよい。上記ゲル濾過用緩衝液としては、従来公知の適宜の組成のものを特に制限なく使用することができ、たとえば、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）、５０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦを含有するゲル濾過用緩衝液を用いることができる。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
続いて、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャム バイオサイエンス社製）などの機器を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分（吸収の大きな画分）をゲル濾過後の濾液より分取して、これを抽出液とする。
【００４７】
また上記ゲル濾過で得られた吸収の大きな画分を、さらに遠心分離にかけて、得られた上清（上清Ｂ３）を抽出液とするようにしてもよい。このゲル濾過後の遠心分離は、翻訳反応を阻害する不溶性の成分を除去するという理由から、３０，０００×ｇ〜１００，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間の条件で行うのが、好ましい。
【００４８】
なお、本発明の調製方法に供する昆虫培養細胞は、培養に用いる培地の翻訳反応液への持込みを避けるため、上記急激な凍結を行う前に、プロテアーゼインヒビターおよびグリセロールを含有しない以外は、上述した昆虫培養細胞用の好適な抽出用液と同じ組成の洗浄液にて予め洗浄しておくのが好ましい。洗浄液での洗浄は、昆虫培養細胞に洗浄液を添加し、これを遠心分離（たとえば、７００×ｇ、１０分間、４℃という条件）することによって行う。洗浄に用いる洗浄液の量は、培地を完全に洗い流すという理由から、湿重量１ｇの昆虫培養細胞に対し５ｍＬ〜１００ｍＬであるのが好ましく、１０ｍＬ〜５０ｍＬであるのがより好ましい。洗浄回数は、１回〜５回行うのが好ましく、２回〜４回行うのがより好ましい。
【００４９】
本発明の抽出液中における節足動物由来の抽出物の含有量に特に制限はないが、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬであるのが好ましく、中でも１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、無細胞系タンパク質合成に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを越えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しづらい虞があるためである。
なお上記範囲の量の節足動物由来の抽出物を含有する抽出液は、抽出液のタンパク質濃度測定を利用して、調製できる。当該タンパク質濃度測定は、当分野において通常行われているように、たとえばＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙＫｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する、といった手順によって行う。分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用する。
【００５０】
本発明における翻訳反応用溶液は、上記抽出液を１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するように調製されたものであるのが好ましい。すなわち、翻訳反応用溶液の全体において、節足動物由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
翻訳反応用溶液は、上記抽出液を除く成分として、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。かかる翻訳反応用溶液を使用して翻訳反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
【００５１】
翻訳反応用溶液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該翻訳反応用溶液中において１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５２】
翻訳反応用溶液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出用液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該翻訳反応用溶液中において０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５３】
翻訳反応用溶液中におけるＤＴＴは、上述した抽出用液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５４】
翻訳反応用溶液中におけるＡＴＰは、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５５】
翻訳反応用溶液中におけるＧＴＰは、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５６】
翻訳反応用溶液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５７】
翻訳反応用溶液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５８】
翻訳反応用溶液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５９】
翻訳反応用溶液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在する節足動物由来のＲＮａｓｅによって、無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。
ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６０】
翻訳反応用溶液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００６１】
翻訳反応用溶液に含有される緩衝剤としては、上述した抽出用液に用いたものと同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出用液における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６２】
また翻訳反応用溶液は、さらにグリセロールを添加されたものであるのがより好ましい。グリセロールを添加すると、翻訳系合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるという利点があるためである。グリセロールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。
【００６３】
さらに、翻訳反応用溶液は、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（以下、「ＥＧＴＡ」ということがある。）を含有するのが好ましい。ＥＧＴＡを含有すると、ＥＧＴＡが抽出液中の金属イオンとキレートを形成することでリボヌクレアーゼ、プロテアーゼなどを不活化させることにより、無細胞系タンパク質合成に必須な成分の分解を阻害することができるためである。
該ＥＧＴＡは、上記反応液中において、上記分解阻害能を好適に発揮し得る観点から０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＥＧＴＡが０．０１ｍＭ未満であると必須な成分の分解活性を充分に抑えることができない傾向にあるためであり、また、１０ｍＭを越えるとタンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６４】
すなわち、翻訳反応用溶液としては、節足動物由来抽出物を含有する抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロール、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．１ｍＭ〜５ｍＭのＥＧＴＡを含有するように実現されるのがより好ましい。
【００６５】
上述してきたように、本発明の２ステップ法に用いる翻訳反応液は、インビトロ転写反応を行った後の転写反応液を、マグネシウムが特定の濃度以下となるように上記翻訳反応用溶液に添加して得られるものである。かかる翻訳反応液を用いた翻訳反応（無細胞系タンパク質合成反応）は、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。反応の時間は、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００６６】
本発明の２ステップ法にて合成できるタンパク質に特に制限はない。合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。
【００６７】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
参考例１
：発現ベクターの構築
ｐＧＥＭ−ｌｕｃ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）５ｎｇを鋳型とし、配列表配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ）と、配列表配列番号２に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９７℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行った。エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を精製した後、ＫｐｎＩで消化した。これとは別に、ｐＴ_ＮＴＶｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）をＫｐｎＩで消化した。これらの反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いてＤＮＡ断片を精製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて、これらのＤＮＡ断片をライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５α（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換した大腸菌からアルカリ−ＳＤＳ法により調製したプラスミドを、配列表配列番号３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）およびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてシークエンシング反応（９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分、３０サイクル）を行った。この反応液をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、塩基配列解析を行った。ｐＴ_ＮＴ Ｖｅｃｔｏｒ由来の５’−βグロビンリーダー配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンが挿入されたプラスミドをｐＴ_ＮＴ−Ｌｕｃと命名した。
【００６８】
参考例２
：カイコ由来の抽出物を含有する翻訳反応用溶液の調製
（１）カイコ組織由来の抽出物を含有する抽出液（カイコ抽出液）の調製
５齢期４日目のカイコ幼虫１５匹よりハサミ、ピンセット、メス、スパーテルを使用して、後部絹糸腺３．０７ｇを摘出し、これを−８０℃で凍結させた乳鉢ですり潰し、下記組成の抽出用液を用いて、抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３０，０００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。
遠心分離後、上清のみを単離し、再び３０，０００×ｇ、１０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離した。脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）に、２０％グリセロールを含む抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上清を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。
ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取して、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。
得られた抽出液について、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用い、タンパク質濃度を測定した。まず反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとして、ＢＳＡを用い、検量線を作成した。
抽出液中におけるカイコ幼虫の後部絹糸腺の含有量は、タンパク質濃度で１７．５ｍｇ／ｍＬであった。
【００６９】
（２）翻訳反応用溶液の調製
上記（１）で調製したカイコ抽出液を用いて、以下の組成の翻訳反応用溶液を調製した。
〔翻訳反応用溶液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ カイコ抽出液
・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１．５ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．７５ｍＭ ＡＴＰ
・０．５ｍＭ ＧＴＰ
・２５ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
・２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・１００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。
【００７０】
実施例１
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（カイコ）
（１）インビトロ転写反応
参考例１で作製したｐＴ_ＮＴ−ＬｕｃをＢａｍＨＩで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。これを鋳型とし、インビトロ転写反応を行った。転写反応液としては、以下の組成のものを用いた。
〔転写反応液の組成〕
・８０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・２４ｍＭ 酢酸マグネシウム
・４０ｍＭ ＤＴＴ
・７．５ｍＭ ＮＴＰｓ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ）
・２ｍＭ スペルミジン
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・１Ｕ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
・５０μｇ／ｍＬ ｐＴ_ＮＴ−Ｌｕｃ／ＢａｍＨＩ
ＮＴＰｓ（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ（プロメガ社製）をそれぞれ用いた。反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。転写反応は３７℃、４時間で行い、反応液量は２０μＬとした。
【００７１】
（２）翻訳反応
上記（１）の転写反応後の転写反応液を、参考例２で調製した翻訳反応用溶液に１／１０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で３．９ｍＭ（＝２４／１０ｍＭ＋１．５ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った。反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。翻訳反応は反応温度２５℃で６時間行い、反応液量は２５μＬとした。合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
【００７２】
実施例２
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（カイコ）
転写反応後の転写反応液を、参考例２で調製した翻訳反応用溶液に１／２０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で２．７ｍＭ（＝２４／２０ｍＭ＋１．５ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った以外は、実施例１と同様にして行った。
【００７３】
実施例３
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（カイコ）
転写反応後の転写反応液を、参考例２で調製した翻訳反応用溶液に１／３０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で２．３ｍＭ（＝２４／３０ｍＭ＋１．５ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った以外は、実施例１と同様にして行った。
【００７４】
実施例４
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（カイコ）
転写反応後の転写反応液を、参考例２で調製した翻訳反応用溶液に１／４０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で２．１ｍＭ（＝２４／４０ｍＭ＋１．５ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った以外は、実施例１と同様にして行った。
【００７５】
実施例５
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（カイコ）
転写反応後の転写反応液を、参考例２で調製した翻訳反応用溶液に１／５０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で１．９８ｍＭ（＝２４／５０ｍＭ＋１．５ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った以外は、実施例１と同様にして行った。
【００７６】
比較例１
：１ステップ法による無細胞系タンパク質合成（カイコ）
参考例１で作成したｐＴ_ＮＴ−Ｌｕｃを鋳型ＤＮＡとして、参考例２（１）で調製したカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出液を用いた下記組成の転写／翻訳反応液を使用して行った。
〔転写／翻訳反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ カイコ抽出液
・５０μｇ／ｍｌ 鋳型ＤＮＡ（ルシフェラーゼをコード）
・１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
・０．２ｍＭ ＡＴＰ
・０．２ｍＭ ＧＴＰ
・０．２ｍＭ ＵＴＰ
・０．２ｍＭ ＣＴＰ
・２５ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・０．１ｍＭ スペルミジン
・２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
・１Ｕ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、ＣＴＰ（シグマ社製）、ＵＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（プロメガ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。各々調製した反応液を用いて、反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用い、無細胞系のタンパク質（ルシフェラーゼ）の合成反応を行った。反応液量は２５μＬとした。反応温度２０℃で、８時間反応を行った。
【００７７】
図１は、実施例１〜５、比較例１の実験結果を示すグラフである。図１のグラフにおいて縦軸は、比較例１で得られたタンパク質合成量に対する実施例１〜５の結果それぞれ得られたタンパク質合成量の割合（相対合成量：％）を表している。
【００７８】
実施例６
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（カイコ）
酢酸マグネシウムの濃度を１ｍＭとした以外は参考例２と同様にして調製した翻訳反応用溶液に、転写反応後の転写反応液を、１／４０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で１．６ｍＭ（＝２４／４０ｍＭ＋１ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った以外は、実施例１と同様にして行った。
【００７９】
実施例７
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（カイコ）
酢酸マグネシウムの濃度を１．２５ｍＭとした以外は参考例２と同様にして調製した翻訳反応用溶液に、転写反応後の転写反応液を、１／４０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で１．８５ｍＭ（＝２４／４０ｍＭ＋１．２５ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った以外は、実施例１と同様にして行った。
【００８０】
実施例８
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（カイコ）
酢酸マグネシウムの濃度を１．５ｍＭとした以外は参考例２と同様にして調製した翻訳反応用溶液に、転写反応後の転写反応液を、１／２０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で２．１ｍＭ（＝２４／４０ｍＭ＋１．５ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った以外は、実施例１と同様にして行った。
【００８１】
図２は、実施例６〜８の実験結果を示すグラフである。図２のグラフにおいて縦軸は、比較例１で得られたタンパク質合成量に対する実施例６〜８の結果それぞれ得られたタンパク質合成量の割合（相対合成量：％）を表している。結果、翻訳反応用溶液中の酢酸マグネシウムの濃度を１ｍＭとした場合（実施例６）においてタンパク質合成量が最も高く、比較例１と比較して約５．６倍のタンパク質合成量となった。この結果は、本来翻訳反応液の最適濃度は１．５ｍＭであるところ、実施例６においては転写反応液からの持込みが０．６ｍＭであり、実際の反応液中のマグネシウム濃度は１．６ｍＭとなっていることに大きく起因するものと考えられる。
【００８２】
参考例３
：昆虫培養細胞由来の抽出物を含有する翻訳反応用溶液の調製
（１）昆虫培養細胞の培養
細胞数２．１×１０^７個の昆虫培養細胞Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、Ｌ−グルタミンを添加したＥｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を入れた培養フラスコ（６００ｃｍ^２）内で２７℃で６日間培養した。結果、細胞数１．０×１０^８個、湿重量１．２１ｇとなった。
【００８３】
（２）昆虫培養細胞抽出液の調製
まず、上記（１）で培養した昆虫培養細胞を集菌し、下記組成の洗浄液で３回洗浄（７００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離）した。
〔洗浄液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
洗浄後の昆虫培養細胞に、下記組成の抽出用液を１ｍＬ加え、懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・２０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・１ｍＭ ＤＴＴ
・１ｍＭ ＰＭＳＦ
この懸濁液を液体窒素中にて急速に凍結させた。充分に凍結させた後、約４℃の氷水浴中で解凍した。完全に解凍した後、３０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）し、上清を回収した。この上清をさらに４５，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、その上清を回収した。回収した上清１．５ｍＬを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
・１ｍＭ ＰＭＳＦ
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液４ｍＬにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分を回収し、昆虫培養細胞抽出液とした。
【００８４】
（３）翻訳反応用溶液の調製
上記（２）で調製した昆虫培養細胞抽出液を用いて、以下の組成の翻訳反応用溶液を調製した。
〔翻訳反応用溶液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 昆虫培養細胞抽出液
・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．２５ｍＭ ＧＴＰ
・２０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。
【００８５】
実施例９
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（昆虫培養細胞）
（１）インビトロ転写反応
参考例１で作製したｐＴ_ＮＴ−ＬｕｃをＢａｍＨＩで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。これを鋳型とし、インビトロ転写反応を行った。転写反応液としては、以下の組成のものを用いた。
〔転写反応液の組成〕
・８０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・２４ｍＭ 酢酸マグネシウム
・４０ｍＭ ＤＴＴ
・７．５ｍＭ ＮＴＰｓ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ）
・２ｍＭ スペルミジン
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・１Ｕ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
・５０μｇ／ｍＬ ｐＴ_ＮＴ−Ｌｕｃ／ＢａｍＨＩ
ＮＴＰｓ（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ（プロメガ社製）をそれぞれ用いた。反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。転写反応は３７℃、４時間で行い、反応液量は２０μＬとした。
【００８６】
（２）翻訳反応
上記（１）の転写反応後の転写反応液を、参考例３で調製した翻訳反応用溶液に１／１０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で４．４ｍＭ（＝２４／１０ｍＭ＋２ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った。反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。翻訳反応は反応温度２５℃で６時間行い、反応液量は２５μＬとした。合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
【００８７】
実施例１０
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（昆虫培養細胞）
転写反応後の転写反応液を、参考例３で調製した翻訳反応用溶液に１／２０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で３．２ｍＭ（＝２４／２０ｍＭ＋２ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った以外は、実施例１と同様にして行った。
【００８８】
実施例１１
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（昆虫培養細胞）
転写反応後の転写反応液を、参考例３で調製した翻訳反応用溶液に１／３０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で２．８ｍＭ（＝２４／３０ｍＭ＋２ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った以外は、実施例１と同様にして行った。
【００８９】
実施例１２
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（昆虫培養細胞）
転写反応後の転写反応液を、参考例３で調製した翻訳反応用溶液に１／４０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で２．６ｍＭ（＝２４／４０ｍＭ＋２ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った以外は、実施例１と同様にして行った。
【００９０】
実施例１３
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（昆虫培養細胞）
転写反応後の転写反応液を、参考例３で調製した翻訳反応用溶液に１／５０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で２．４８ｍＭ（＝２４／５０ｍＭ＋２ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った以外は、実施例１と同様にして行った。
【００９１】
比較例２
：１ステップ法による無細胞系タンパク質合成（昆虫培養細胞）
参考例１で作成したｐＴ_ＮＴ−Ｌｕｃを鋳型ＤＮＡとして、参考例３（２）で調製した昆虫培養細胞由来の抽出液を用いた下記組成の転写／翻訳反応液を使用して行った。
〔転写／翻訳反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 昆虫培養細胞抽出液
・５０μｇ／ｍｌ 鋳型ＤＮＡ（ルシフェラーゼをコード）
・２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１．５ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．３ｍＭ ＡＴＰ
・０．３ｍＭ ＧＴＰ
・０．３ｍＭ ＵＴＰ
・０．３ｍＭ ＣＴＰ
・２０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・０．０２５ｍＭ スペルミジン
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
・０．８Ｕ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、ＣＴＰ（シグマ社製）、ＵＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（プロメガ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。各々調製した反応液を用いて、反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用い、無細胞系のタンパク質（ルシフェラーゼ）の合成反応を行った。反応液量は２５μＬとした。反応温度２０℃で、８時間反応を行った。
【００９２】
図３は、実施例９〜１３、比較例２の実験結果を示すグラフである。図３のグラフにおいて縦軸は、比較例２で得られたタンパク質合成量に対する実施例９〜１３の結果それぞれ得られたタンパク質合成量の割合（相対合成量：％）を表している。
【００９３】
実施例１４
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（昆虫培養細胞）
酢酸マグネシウムの濃度を１ｍＭとした以外は参考例３と同様にして調製した翻訳反応用溶液に、転写反応後の転写反応液を、１／２０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で２．２ｍＭ（＝２４／２０ｍＭ＋１ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った以外は、実施例１と同様にして行った。
【００９４】
実施例１５
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（昆虫培養細胞）
酢酸マグネシウムの濃度を１．２５ｍＭとした以外は参考例３と同様にして調製した翻訳反応用溶液に、転写反応後の転写反応液を、１／２０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で２．４５ｍＭ（＝２４／２０ｍＭ＋１．２５ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った以外は、実施例１と同様にして行った。
【００９５】
実施例１６
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（昆虫培養細胞）
酢酸マグネシウムの濃度を１．５ｍＭとした以外は参考例３と同様にして調製した翻訳反応用溶液に、転写反応後の転写反応液を、１／２０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で２．７ｍＭ（＝２４／２０ｍＭ＋１．５ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った以外は、実施例１と同様にして行った。
【００９６】
実施例１７
：２ステップ法による無細胞系タンパク質合成（昆虫培養細胞）
酢酸マグネシウムの濃度を２ｍＭとした以外は参考例３と同様にして調製した翻訳反応用溶液に、転写反応後の転写反応液を、１／２０体積量添加し、マグネシウムを最終濃度で３．２ｍＭ（＝２４／２０ｍＭ＋２ｍＭ）含有する翻訳反応液を調製し、翻訳反応を行った以外は、実施例１と同様にして行った。
【００９７】
図４は、実施例１４〜１７の実験結果を示すグラフである。図４のグラフにおいて縦軸は、比較例２で得られたタンパク質合成量に対する実施例１４〜１７の結果それぞれ得られたタンパク質合成量の割合（相対合成量：％）を表している。結果、翻訳反応用溶液中の酢酸マグネシウムの濃度を１ｍＭとした場合（実施例１４）においてタンパク質合成量が最も高く、比較例２と比較して約２３倍のタンパク質合成量となった。この結果は、本来翻訳反応液の最適濃度は２ｍＭであるところ、実施例１４においては転写反応液からの持込みが１．２ｍＭであり、実際の反応液中のマグネシウム濃度は２．２ｍＭとなっていることに大きく起因するものと考えられる。
【００９８】
参考例４
：外来ｍＲＮＡの精製
上記実施例１（１）と同様にしてインビトロ転写反応を行った後の転写反応液２０μＬに、１ＵのＲＱ１ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を添加し、３７℃、１５分間インキュベートし、鋳型ＤＮＡを消化した。フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１００μＬの滅菌水に溶解し、Ｎｉｃｋ Ｃｏｌｕｍｎ（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした。滅菌水４００μＬで溶出を行った。溶出画分を回収し、酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。合成された外来ｍＲＮＡの定量は、２６０ｎｍの吸光度を測定して行った。
その結果、２０μＬスケールの反応で約６０μｇの外来ｍＲＮＡが合成された。
【００９９】
比較実験例１
：１ステップ法と３ステップ法とのタンパク質合成量の比較（カイコ）
従来法である１ステップ法と３ステップ法とでのタンパク質合成量の違いを比較実験した。
１ステップ法は、比較例１と同様にして行った。
３ステップ法は、上述したとおり、上記参考例４で精製したｍＲＮＡを、参考例２で調製した翻訳反応用溶液に最終濃度１６０μｇ／ｍＬとなるように添加して調製した翻訳反応液を用いて翻訳反応を行った以外は、実施例１と同様にして行った。
図５は、上記比較実験例１の結果を示すグラフである。結果、１ステップ法でのタンパク質合成量は、３ステップ法でのタンパク質合成量の約２．４５％と非常に低い値となった。
【０１００】
比較実験例２
：１ステップ法と３ステップ法とのタンパク質合成量の比較（昆虫培養細胞）
従来法である１ステップ法と３ステップ法とでのタンパク質合成量の違いを比較実験した。
１ステップ法は、比較例２と同様にして行った。
３ステップ法は、上述したとおり、上記参考例４で精製したｍＲＮＡを、参考例３で調製した翻訳反応用溶液に最終濃度３２０μｇ／ｍＬとなるように添加して調製した翻訳反応液を用いて翻訳反応を行った以外は、実施例９と同様にして行った。
図６は、上記比較実験例２の結果を示すグラフである。結果、１ステップ法でのタンパク質合成量は、３ステップ法でのタンパク質合成量の約１．６％と非常に低い値となった。
【０１０１】
【発明の効果】
以上の説明で明らかなように、本発明によれば、カイコ抽出液または昆虫培養細胞抽出液を使用した無細胞系タンパク質合成方法であって、ハイスループット化可能な新規な無細胞系タンパク質合成方法を提供することができる。
【０１０２】
【配列表のフリーテキスト】
配列番号１：
プライマー Ｌｕｃ Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ
配列番号２：
プライマー Ｌｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ
配列番号３：
プライマー Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ
【０１０３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１〜５、比較例１の実験結果を示すグラフである。
【図２】実施例６〜８、比較例１の実験結果を示すグラフである。
【図３】実施例９〜１３、比較例２の実験結果を示すグラフである。
【図４】実施例１４〜１７、比較例２の実験結果を示すグラフである。
【図５】比較実験例１の結果を示すグラフである。
【図６】比較実験例２の結果を示すグラフである。

Claims (4)

1. インビトロで転写反応を行う工程と、
   転写反応後の転写反応液を、マグネシウムの最終濃度が１０ｍＭ以下となるように節足動物由来の抽出物を含有する翻訳反応用溶液に添加して調製した翻訳反応液を用いて翻訳反応を行う工程とを含む、無細胞系でタンパク質を製造する方法。
2. 節足動物由来の抽出物がカイコ組織から抽出されたものである、請求項１に記載の方法。
3. 節足動物由来の抽出物が昆虫培養細胞から抽出されたものである、請求項１に記載の方法。
4. 昆虫培養細胞がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ卵細胞由来の培養細胞である、請求項３に記載の方法。

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