JP4091901B2 - 無細胞系タンパク質合成におけるミクロソーム膜添加による翻訳後修飾方法 - Google Patents
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Description
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下のとおりである。
(1)
糖鎖修飾活性を保持しない無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる無細胞系でのタンパク質合成において、翻訳反応を、Trichoplusia ni卵細胞由来あるいはSpodoptera frugiperda卵巣細胞由来の昆虫培養細胞から、ショ糖密度勾配による超遠心分離にて調整したミクロソーム膜の存在下で行うことを特徴とする、翻訳後のタンパク質の修飾方法。
(2)
mRNA濃度(μg/ml)と該ミクロソーム膜の濃度(A260)との比が1:0.1〜5で翻訳反応を行う上記(1)記載の方法。
(3)
当該比が1:0.3〜2.3である、上記(2)に記載の方法。
(4)
無細胞系タンパク質合成用抽出液が、節足動物由来の抽出物を含有するものである、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)
節足動物由来の抽出物が昆虫組織から抽出されたものである、上記(4)に記載の方法。
(6)
昆虫組織がカイコ組織である、上記(5)に記載の方法。
(7)
カイコ組織がカイコ幼虫の後部絹糸腺を少なくとも含有する、上記(6)に記載の方法。
(8)
節足動物由来の抽出物が昆虫培養細胞から抽出されたものである、上記(4)に記載の方法。
(9)
昆虫培養細胞がTrichoplusia ni卵細胞由来あるいはSpodoptera frugiperda卵巣細胞由来の培養細胞である、上記(8)に記載の方法。
(10)
無細胞系タンパク質合成用抽出液が、小麦胚芽由来の抽出物を含有するものである、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(11)
無細胞系タンパク質合成用抽出液が、哺乳動物培養細胞由来の抽出物を含有するものである、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(12)
無細胞系タンパク質合成用抽出液が、ウサギ網状赤血球由来の抽出物を含有するものである、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(13)
無細胞系タンパク質合成用抽出液が、大腸菌由来の抽出物を含有するものである、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(14)
無細胞系タンパク質合成用抽出液が、酵母由来の抽出物を含有するものである、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(15)
翻訳後のタンパク質の修飾が、N−グリコシル化および/またはシグナル配列の切除である、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、糖鎖修飾活性を保持しない無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる無細胞系でのタンパク質合成方法であって、翻訳反応を、Trichoplusia ni卵細胞由来あるいはSpodoptera frugiperda卵巣細胞由来の昆虫培養細胞から、ショ糖密度勾配による超遠心分離にて調整したミクロソーム膜の存在下で行うことを特徴とする。
またカイコ組織の「脂肪体」とは、カイコ幼虫において、体内の至るところに分布し、白色の柔らかい扁平な帯状、ひも状あるいは葉状の組織である。脂肪体は、ヒトの肝臓に似て栄養、エネルギー源を貯蔵する役目を果たしているので、細胞内には脂肪球、タンパク質、グリコーゲンその他の新陳代謝に関係する種々の物質を含んでいる。
また「胚」は、カイコの卵の状態の組織を指す。
当該抽出用液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど1価のカリウム塩である場合、10mM〜500mM含有されることが好ましく、50mM〜300mM含有されることがより好ましい。カリウム塩が10mM未満または500mMを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
当該抽出用液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど2価の塩である場合、0.1mM〜10mM含有されることが好ましく、0.5mM〜5mM含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が0.1mM未満または10mMを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
緩衝剤は、得られた抽出液のpHが4〜10に保持されるようなものを使用するのが好ましく、pHが6.5〜8.5に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出液のpHが4未満またはpHが10を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもHEPES−KOH(pH6.5〜8.5)を使用するのが特に好ましい。
当該抽出用液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、5mM〜200mM含有されることが好ましく、10mM〜100mM含有されることがより好ましい。緩衝剤が5mM未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりpHの急激な変動を引き起こし、抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が200mMを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
この場合、塩化カルシウムの含有量は特に制限されないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、0.1mM〜10mMであるのが好ましく、0.5mM〜5mMであるのがより好ましい。また、グリセロールの添加量についても特に制限されるものではないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、5(v/v)%〜80(v/v)%となるように添加されるのが好ましく、10(v/v)%〜50(v/v)%となるように添加されるのがより好ましい。
たとえば、節足動物由来の抽出物として、カイコ組織由来の抽出物または昆虫培養細胞由来の抽出物を使用する場合、上述したような組成の抽出用液を使用して、本発明者らが提案している抽出方法にて抽出液を調製するのが、好適である。
以下、それぞれの場合について詳述する。
まず、常法にしたがって、たとえばハサミ、ピンセット、メスなどの器具を使用して、カイコより所望の組織を摘出する。この摘出によって得る後述の抽出に使用する組織量としては、特に制限はないが、通常、1g〜100gの範囲内である。
次に、摘出した組織を、たとえば液体窒素で凍結した後、−80℃で凍結させた乳鉢中ですり潰し、これに上述した抽出用液を添加して抽出操作を行う。
あるいは、上記抽出用液の添加後、一旦抽出用液も凍結させた後、シャーベット状になるまで(具体的には、ウェットな黄色いシャリシャリ状態の氷になるまで)、薬さじで攪拌しながら溶解する。その後、再度液体窒素で完全に凍結させた後、シャーベット状になるまで(具体的には、ウェットな黄色いシャリシャリ状態の氷になるまで)薬さじで攪拌しながら溶解させる。かかる方法によれば、タンパク質合成に関与する成分が効率的に抽出され且つ安定化されるという利点がある。
このようにして、まず、カイコの組織からの抽出物を含有する液状物を得る。
また、上記上清A1と、上記1回目の遠心分離後の沈殿から上記抽出用液を用いてさらに抽出を行った後に、上記と同様の条件にて遠心分離して得られた上清(上清A3)とを混合して、抽出液として調製するようにしてもよい。このように上清A1と上清A3とを混合して抽出液を調製することで、上清A1、上清A3を単独で抽出液とする場合と比較して、タンパク質合成効率が向上するという利点がある。またさらに、上清A2を、上清A3と混合して抽出液を調製してもよい。これにより上記効果はさらに増強される。勿論、上記上清A1〜上清A3を混合して、抽出液を調製するようにしてもよい。
この場合、調製される混合物(抽出液)における上清A1および/または上清A2(両方混合する場合には、その総量)と上清A3との混合割合に特に制限はないが、タンパク質の合成効率の観点からは、体積比で10:90〜90:10であるのが好ましく、20:80〜80:20であるのがより好ましい。
たとえば脱塩カラム PD−10(アマシャム バイオサイエンス社製)を使用し、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記抽出用液にて溶出する、というような条件にて行う。上記ゲル濾過用緩衝液は、上記抽出用液に、グリセロールをさらに添加したものであることが好ましい。グリセロールは、通常、5(v/v)%〜40(v/v)%(好ましくは、20(v/v)%)となるように添加すればよい。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、0.1mL〜1mLを1画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、0.4mL〜0.6mLを1画分とするのが好ましい。
次に、ゲル濾過後の濾液より280nmにおける吸光度が10以上の画分を分取する。当該処理は、たとえばUltrospec3300pro(アマシャム バイオサイエンス社製)などの機器を用いて、各画分について上記280nmにおける吸光度を測定し、この吸光度が最も高い画分付近を分取し、これを抽出液とする。
昆虫培養細胞から抽出液を調製する場合、本発明者らが提案する、抽出用液中に懸濁した昆虫培養細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有する方法によって調製するのが好ましい。ここで「急激に凍結」とは、凍結処理に付した後10秒以下、好ましくは2秒以下にて、昆虫培養細胞を凍結させることを指す。また昆虫培養細胞を急激に凍結させる温度としては、通常−80℃以下であり、好ましくは−150℃以下である。上記昆虫培養細胞の急激な凍結は、たとえば、液体窒素や液体ヘリウムなどの不活性ガスを使用することなどによって実現できるが、入手が容易であり安価な液体窒素を用いて行うのが好ましい。
かかる方法によって昆虫培養細胞からの抽出を行うことにより、緩和な状態で細胞の破砕を行うことができ、無細胞系タンパク質合成に必須な成分を破壊することなく細胞外に取り出すことができ、従来よりもタンパク質の合成量の高い無細胞系タンパク質合成用抽出液を容易に調製することができる。さらに、使用器具などからのRNaseなどの混入も防ぐことができ、また、界面活性剤などの試薬を用いた細胞破砕法の場合に懸念される翻訳反応を阻害するような物質の持込みもない。
まず、上清B1または上清B2についてゲル濾過を行うが、ゲル濾過は、たとえば脱塩カラム PD−10(アマシャム バイオサイエンス社製)を好適に使用することができ、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記ゲル濾過用緩衝液にて溶出する、というような条件にて行えばよい。上記ゲル濾過用緩衝液としては、従来公知の適宜の組成のものを特に制限なく使用することができ、たとえば、10mM〜100mMのHEPES−KOH(pH6.5〜8.5)、50mM〜300mMの酢酸カリウム、0.5mM〜5mMの酢酸マグネシウム、0.5mM〜5mMのDTT、0.01mM〜5mMのPMSFを含有するゲル濾過用緩衝液を用いることができる。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、0.1mL〜1mLを1画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、0.4mL〜0.6mLを1画分とするのが好ましい。
続いて、たとえばUltrospec3300pro(アマシャム バイオサイエンス社製)などの機器を用いて、280nmにおける吸光度が30以上の画分(吸収の大きな画分)をゲル濾過後の濾液より分取して、これを抽出液とする。
なお上記範囲の量の節足動物由来の抽出物を含有する抽出液は、抽出液のタンパク質濃度測定を利用して、調製できる。当該タンパク質濃度測定は、当分野において通常行われているように、たとえばBCA Protein assay Kit(PIERCE社製)を使用し、反応試薬2mLに対してサンプルを0.1mL加え、37℃で30分間反応させ、562nmにおける吸光度を測定する、といった手順によって行う。分光光度計(Ultrospec3300pro、アマシャム バイオサイエンス社製)を用いて、562nmにおける吸光度を測定する。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン(BSA)を使用する。
以下、節足動物由来の抽出物を含有する抽出液を用いた場合を例にとって(1)翻訳系用反応液、(2)転写/翻訳系用反応液について、それぞれ説明する。節足動物由来の抽出物以外の抽出物を含有する抽出液を用いた場合には、その由来に応じて必要な試薬や反応条件が適宜設定される。
翻訳系用反応液は、上記節足動物由来抽出液を除く成分として、翻訳鋳型、カリウム塩、マグネシウム塩、DTT、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、RNaseインヒビター、tRNA、緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましく、本発明の目的である、タンパク質の翻訳後修飾の為には、ミクロソーム膜、より具体的には後述する節足動物由来のミクロソーム膜を含む。かかる翻訳系用反応液を使用して翻訳系合成反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
mRNA濃度(μg/mL)と節足動物由来のミクロソーム膜の濃度(A260)との比を求める際の節足動物由来のミクロソーム膜の純度は、通常A260/A280=1.3〜2.0で、好ましくは1.4〜1.8のものである。該比が1:0.1〜5(好ましくは0.3〜2.3)とは、反応液1mL中にmRNAが1μg存在する場合にミクロソーム膜の濃度がA260で0.1〜5(好ましくは0.3〜2.3)であることを意味する。
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が1μM〜1000μM含有されることが好ましく、10μM〜200μM含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が1μM未満または1000μMを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
また、上記に加えてさらに0.1mM〜5mMのEGTAを含有するように実現されるのがより好ましい。
転写/翻訳系用反応液は、上記抽出液を除く成分として、転写鋳型、RNAポリメラーゼ、ATP、GTP、シチジン5'−三リン酸、ウリジン5'−三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分およびtRNAを少なくとも含有するのが好ましく、本発明の目的である、タンパク質の翻訳後修飾の為には、ミクロソーム膜、より具体的には節足動物由来のミクロソーム膜を含む。かかる転写/翻訳系用反応液を使用して転写/翻訳系合成反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
また、本発明の鋳型DNAは、構造遺伝子の3’下流側にターミネーター配列を有するのが好ましい。上記ターミネーター配列としては、たとえば、従来公知のT7ターミネーター配列、SP6ターミネーター配列、T3ターミネーター配列などが挙げられる。また、鋳型DNAは、合成されたmRNAの安定性などの観点から、構造遺伝子の3’下流側にポリA配列を有していてもよい。
さらに、鋳型DNAが3つ以上の領域に分かれる場合は、上述のPCRで増幅したDNAとさらにつなぎ合わせたいDNAを用い、ライゲーション、PCRを行い、鋳型DNAを調製する。
RNAポリメラーゼは、mRNA合成の速度およびタンパク質合成の速度の観点から、転写/翻訳系用反応液中に0.01U/μL〜100U/μL含有されることが好ましく、0.1U/μL〜10U/μL含有されることがより好ましい。RNAポリメラーゼが0.01U/μL未満であると、mRNAの合成量が少なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためであり、またRNAポリメラーゼが100U/μLを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
タンパク質合成の速度の観点からは、転写/翻訳系用反応液中において上記のアミノ酸成分が1μM〜1000μM含有されることが好ましく、10μM〜500μM含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が1μM未満または1000μMを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
転写/翻訳系合成反応では、転写、翻訳工程を連続して実施し得るという観点から両工程に好適な20℃〜30℃の範囲で反応を行うことが特に好ましい。反応の時間は、全工程あわせて、通常、1時間〜72時間、好ましくは3時間〜24時間である。
翻訳後修飾の中でも糖鎖修飾(N−グリコシル化)をモデルとしてとらえ、糖鎖修飾が生じることが既に判明しているpro−TNF−GLC(タンパク質の成熟領域内にN−グリコシル化部位を人為的に導入した変異型のヒト抗腫瘍因子)を用い、この糖タンパク質のin vitroの合成を試みた。図1に構築した発現プラスミドの模式図を示した。また、用いるポリヘドリン5’−UTRの塩基配列を配列番号1に、pro−TNF−GLC遺伝子の全塩基配列を配列番号2に示した。
発現プラスミドの構築は、pTNTベクター(プロメガ社製)を鋳型として、配列番号3および4に塩基配列を示した末端にBamHIサイト付加したPCRプライマーを用い、BamHI消化後にセルフライゲーションを行うことによって、マルチクローニングサイトのXhoIサイトの前にBamHIサイトを導入した。更に配列番号5および6に塩基配列を示したPCRプライマーを用いてPCRを行い、HindIII消化後にセルフライゲーションを行うことによって、pTNTベクターにもともと存在しているT7ターミネーター配列直後のBamHIサイトをHindIIIサイトに変更した。次に、PCRによって、BamHIサイトからT7プロモーターまでを増幅し、この間に前述したポリヘドリン5’−UTRのセンス鎖、アンチセンス鎖を合成し、アニーリングさせたものをインサートとしてライゲーションさせることで改変型pTNTベクターを構築した。アニーリングのインサート調製方法は、以下のように行った。合成したセンス鎖、アンチセンス鎖をT4ポリヌクレオチドキナーゼ(TOYOBO社製)によって5’末端リン酸化を行った。反応後、センス鎖とアンチセンス鎖を混合し、95℃、5分間熱処理した。これを室温になるまで静置し、アニーリングを行った。エタノール沈殿により精製した後、水に溶解させた。SigmaSpin Post Reaction Purification Column(シグマ社製)によって、過剰のATPを除いた後、再度エタノール沈殿により精製した。
続いて、この改変型pTNTベクターをBamHI−EcoRIで消化し、pBluescriptベクターのBamHI−EcoRIサイトにpro−TNF GLCcDNAを導入したプラスミドを同じくBamHI−EcoRI消化して得られた約0.7KbのDNA断片(pro−TNF−GLC cDNA)をインサートとしてライゲーションさせることにより、in vitro pro−TNF−GLC遺伝子転写用プラスミド−Iを構築した。
また、転写用プラスミド−I内のpro−TNF GLCの下流にヒスチジン−タグを挿入したin vitro pro−TNF−GLC遺伝子転写用プラスミド−IIも作製した。転写用プラスミド−IIは、改変型pTNTベクターをSmaIで消化した後、この間に、配列番号7記載のヒスチジン−タグのセンス鎖、アンチセンス鎖を合成し、アニーリングさせたものをインサートとしてライゲーションさせることで改変型pTNTベクター(His−Tag)を構築した。このベクターをBamHI−EcoRIで消化し、転写用プラスミド−Iを鋳型に配列番号8および9記載のPCRプライマーを用いて増幅した約0.7KbのDNA断片をインサートとしてライゲーションさせることにより作製した。
上記(1)で調製したプラスミドをHindIIIで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。得られたDNA1μgを鋳型として、RiboMax Large Scale RNA Production System−T7(プロメガ社製)を用いて、20μlスケールで37℃4時間、mRNA合成を行った。反応後、1UのRQ1 RNase Free DNase(プロメガ社製)を添加し、37℃15分インキュベートし、鋳型DNAを消化した。フェノールクロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を100μlの滅菌水に溶解し、Nick column(アマシャム社製)で精製した後、再度エタノール沈殿を行い、最終的にA260/A280=1.8〜2.0、RNA濃度が2mg/mlとなるように滅菌水に溶解した。このようにして調製したmRNAは無細胞系タンパク質合成にそのまま使用した。転写用プラスミド−Iから転写したものをmRNA−I、転写用プラスミド−IIから転写したものをmRNA−IIとした。
(3−1)昆虫培養細胞High FiveおよびSf21の培養
細胞数2.1×107個の昆虫培養細胞High Five(Invitrogen社製)を、L−グルタミンを添加したExpress Five(Invitrogen社製)無血清培地を入れた培養フラスコ(600cm2)内で27℃6日間培養した。結果、細胞数1.0×108個、湿重量1.2gとなった。
昆虫培養細胞Sf21(Invitrogen社製)を、Sf−900IISFM(Invitrogen社製)無血清培地にて27℃で培養した。培地1mlあたり細胞数6.0×105個のSf21を125ml三角フラスコ内の培地50ml中で27℃、130rpm、5日間懸濁培養を行った結果、細胞数1.0×108個、湿重量3gとなった。
(3−2)ミクロソーム膜調製方法
昆虫培養細胞High FiveおよびSf21からのミクロソーム膜の調製は、基本的にWalter,P.and Blobel,G.(1983),Enzymol.96,84−93らの方法を基に、ショ糖密度勾配による超遠心分離にて調製した。すなわち、上記(3−1)で培養した昆虫培養細胞を集め、下記の抽出用液で1回洗浄(700×g、4℃、10分間の遠心条件)した後、培養細胞1gあたり4mlの抽出用液中に懸濁した。
[High Five抽出用液の組成]
30mM HEPES−KOH(pH7.9)、100mM KOAc、2mM Mg(OAc)2、0.25mM EGTA、250mM シュクロース、2mM DTT、0.5mM PMSF
[Sf21抽出用液の組成]
40mM HEPES−KOH(pH7.9)、100mM KOAc、1.5mM Mg(OAc)2、0.1mM EGTA、250mM シュクロース、2mM DTT、0.5mM PMSF
(4−1)節足動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液による無細胞系タンパク質合成
上記(2)で調製したpro−TNF GLCのmRNA−I、および上記(3)で調製したミクロソーム膜を用いて、節足動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液による無細胞系タンパク質合成を行った。
(カイコ抽出液の調製)
5齢期4日目のカイコ幼虫15匹よりハサミ、ピンセット、メス、スパーテルを使用して、後部絹糸腺3.07gを摘出し、これを−80℃で凍結させた乳鉢ですり潰し、下記組成の抽出用液を用いて、抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・20mM HEPES−KOH(pH7.4)
・100mM 酢酸カリウム
・2mM 酢酸マグネシウム
・2mM DTT
・0.5mM PMSF
抽出後、得られた液状物を遠心分離機(himacCR20B3(日立工機社製))にて、30,000×g、30分間、4℃の条件にて遠心分離を行った。
遠心分離後、上清のみを単離し、再び30,000×g、10分間、4℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離した。脱塩カラム PD−10(アマシャム バイオサイエンス社製)に、20%グリセロールを含む抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上清を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。
ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計(Ultrospec3300pro、アマシャム バイオサイエンス社製)を用いて、280nmにおける吸光度が10以上の画分を分取して、5齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。
得られた抽出液について、BCA Protein assay Kit(PIERCE社製)を用い、タンパク質濃度を測定した。まず反応試薬2mLに対してサンプルを0.1mL加え、37℃で30分間反応させ、分光光度計(Ultrospec3300pro、アマシャム バイオサイエンス社製)を用いて、562nmにおける吸光度を測定した。コントロールとして、BSAを用い、検量線を作成した。
抽出液中におけるカイコ幼虫の後部絹糸腺の含有量は、タンパク質濃度で17.5mg/mLであった。
(1)High Five由来抽出液
細胞数2.1×107個の昆虫培養細胞High Five(Invitrogen社製)を、L−グルタミンを添加したExpress Five無血清培地(Invitrogen社製)を入れた培養フラスコ(600cm2)内で27℃で6日間培養した。結果、細胞数1.0×108個、湿重量1.21gとなった。
次いで上記培養した昆虫培養細胞を集め、下記組成の洗浄液で3回洗浄(700×g、4℃、10分間の条件で遠心分離)した。
〔洗浄液の組成〕
・60mM HEPES−KOH(pH7.9)
・200mM 酢酸カリウム
・4mM 酢酸マグネシウム
・4mM DTT
洗浄後の昆虫培養細胞に、下記組成の抽出用液を1mL加え、懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
・40mM HEPES−KOH(pH7.9)
・100mM 酢酸カリウム
・2mM 酢酸マグネシウム
・2mM 塩化カルシウム
・20(v/v)% グリセロール
・1mM DTT
・1mM PMSF
この懸濁液を液体窒素中にて急速に凍結させた。充分に凍結させた後、約4℃の氷水浴中で解凍した。完全に解凍した後、30,000×g、4℃で10分間遠心分離(himacCR20B3、日立工機社製)し、上清を回収した。回収した上清1.5mLを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したPD−10脱塩カラム(アマシャム バイオサイエンス社製)にアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・40mM HEPES−KOH(pH7.9)
・100mM 酢酸カリウム
・2mM 酢酸マグネシウム
・1mM DTT
・1mM PMSF
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液4mLにて溶出し、分光光度計(Ultrospec3300pro、アマシャム バイオサイエンス社製)を用いて、280nmにおける吸光度が30以上の画分を回収し、昆虫培養細胞抽出液とした。
昆虫細胞Sf21(Invitrogen社製)をSf900−II無血清培地(Invitrogen社製)中にて27℃で培養した。培地1mLあたりの細胞数6.0×105個のSf21を125mL三角フラスコ内の培地50mL中で27℃・130rpm・5日間懸濁培養を行った。結果、培地1mLあたりの細胞数1.0×108個、湿重量3gとなった。
次いで、上記培養した昆虫細胞を集め、下記組成の洗浄液にて3回洗浄(700×g、4℃、10分間の条件で遠心分離)した後、3mLの下記組成の抽出用液中に懸濁した。
〔洗浄液の組成〕
・40mM HEPES−KOH(pH7.9)
・100mM 酢酸カリウム
・2mM 酢酸マグネシウム
・2mM 塩化カルシウム
・1mM DTT
〔抽出用液の組成〕
・40mM HEPES−KOH(pH7.9)
・100mM 酢酸カリウム
・2mM 酢酸マグネシウム
・2mM 塩化カルシウム
・20%(v/v) グリセロール
・1mM DTT
・0.5mM PMSF
この細胞懸濁液を液体窒素中にて急速に凍結させた。充分に凍結させた後、約4℃の氷水浴中で解凍した。完全に解凍した後、30000×g、4℃で10分間遠心分離(himacCR20B3、日立工機社製)し、上清1Aを回収した。回収した上清1Aをさらに45000×g、4℃で30分間遠心分離(himacCR20B3、日立工機社製)して上清1Bを回収した。回収した上清1Bを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したPD−10脱塩カラム(アマシャム バイオサイエンス社製)に2.5mLアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・40mM HEPES−KOH(pH7.9)
・100mM 酢酸カリウム
・2mM 酢酸マグネシウム
・1mM DTT
・0.5mM PMSF
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液3mLにて溶出し、分光光度計(Ultrospec3300pro、アマシャム バイオサイエンス社製)を用いて、280nmにおける吸光度が30以上の画分を回収し、これを昆虫細胞抽出液とした。
カイコ後部絹糸腺由来抽出液を用いた合成
・昆虫由来ミクロソーム膜(反応液1μl中A260=0〜50)
・50(v/v)% 節足動物由来(カイコ後部絹糸腺由来)抽出液
・160μg/mL mRNA
・30mM HEPES−KOH(pH7.4)
・100mM 酢酸カリウム
・1.5mM 酢酸マグネシウム
・0.5mM DTT
・10(v/v)% グリセロール
・0.75mM ATP
・0.5mM GTP
・0.25mM EGTA
・25mM クレアチンリン酸
・200μg/mL クレアチンキナーゼ
・100μM アミノ酸(20種)
・2U/μL RNaseインヒビター
・100μg/mL tRNA
ATP(シグマ社製)、GTP(シグマ社製)、アミノ酸(20種)(シグマ社製)、RNaseインヒビター(宝酒造社製)、tRNA(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)をそれぞれ用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽MG−1000(東京理化器械社製)を用いた。翻訳反応は反応温度25℃で6時間行い、反応液量は25μLとした。
(1)High Five由来抽出液を用いた場合
・昆虫由来ミクロソーム膜(反応液1μl中A260=0〜50)
・50(v/v)% 節足動物由来(High Five由来)抽出液
・320μg/mL mRNA
・40mM HEPES−KOH(pH7.9)
・100mM 酢酸カリウム
・2mM 酢酸マグネシウム
・2mM DTT
・10(v/v)% グリセロール
・0.5mM ATP
・0.25mM GTP
・20mM クレアチンリン酸
・200μg/mL クレアチンキナーゼ
・80μM アミノ酸(20種)
・0.25mM EGTA
・1U/μL RNaseインヒビター
・200μg/mL tRNA
ATP(シグマ社製)、GTP(シグマ社製)、アミノ酸(20種)(シグマ社製)、RNaseインヒビター(宝酒造社製)、tRNA(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)をそれぞれ用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽MG−1000(東京理化器械社製)を用いた。翻訳反応は反応温度25℃で8時間行い、反応液量は25μLとした。
・昆虫由来ミクロソーム膜(反応液1μl中A260=0〜50)
・50(v/v)% 節足動物由来(Sf21由来)抽出液
・40mM HEPES−KOH(pH7.9)
・100mM 酢酸カリウム
・1.5mM 酢酸マグネシウム
・2mM DTT
・10(v/v)% グリセロール
・0.25mM ATP
・0.1mM GTP
・20mM クレアチンリン酸
・200μg/mL クレアチンキナーゼ
・80μM アミノ酸(20種)
・0.1mM EGTA
・1U/μL RNaseインヒビター
・200μg/mL tRNA
・320μg/mL 外来mRNA(pro-TNF-GLC遺伝子)
ATP(シグマ社製)、GTP(シグマ社製)、アミノ酸(20種)(シグマ社製)、RNaseインヒビター(宝酒造社製)、tRNA(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)をそれぞれ用いた。反応装置として低温アルミブロック恒温槽MG−1000を用いた。反応液量は25μL、反応温度は25℃、反応時間は6時間で実施した。
上記(2)で調製したpro−TNF GLCのmRNA−II、および上記(3)で調製したミクロソーム膜を用いて、ウサギ網状赤血球抽出液(RRL;プロメガ社製)による無細胞系タンパク質合成を行った。また、この時それぞれの反応開始時に、上記(3)で調製したミクロソーム膜を種々の濃度添加して、共反応させることによりタンパク質のグリコシル化を行った。
・翻訳系反応液中A260=0〜50のミクロソーム膜
・50(v/v)% ウサギ網状赤血球抽出液 17.5μl
・2mg/mL mRNA 2μl
・40U/μL RNaseインヒビター 1μl
・1mM アミノ酸(20種) 1μl
アミノ酸(20種)はシグマ社製のものを、RNaseインヒビターは宝酒造社製のものをそれぞれ用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽MG−1000(東京理化器械社製)を用いた。翻訳反応は反応温度30℃で90分間行い、反応液量は25μLとした。
上記(4)で合成したN−グリコシル化タンパク質(pro−TNF GLC)が糖鎖修飾された糖タンパク質であることを確認するために、N型糖鎖分解酵素で脱糖鎖化を行った。N型糖鎖分解酵素としてグリコペプチダーゼF(TAKARA社製)を用い、これを翻訳反応終了後の反応液10μlあたり1μl添加し、25℃で2時間反応させた。
N−グリコシル化タンパク質の検出は、抗TNF抗体(R&D社製)を用いたウェスタンブロット法とECL−plus(アマシャム社製)による化学発光を用いて行った。すなわち、昆虫抽出液においては、翻訳反応および脱糖鎖反応終了後、SDS化のため当量の×2 Sample Buffer Soln.(Wako社製)を加えて95℃、3分間熱処理を行い、SDS−PAGEに供した。また、ウサギ網状赤血球抽出液においては、SDS化の前処理として、反応液10μlに対し、2μlPMSF(40mM)、200μl RIPAバッファー(50mM Tris−HCl PH7.5、150mM NaCl、1% Nonidet P−40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS)を添加し、ローテーターにて4℃、1時間撹拌して可溶化処理を行った。さらにHis−MicroSpin Purification Module(アマシャム バイオサイエンス社製)にて簡易精製し、これをサンプルとし、等量の×2 Sample Buffer Soln.(Wako社製)を加えて95℃、3分間熱処理を行い、SDS−PAGEに供した。泳動後PVDF膜にタンパク質の転写を行った。転写後の膜は、3%ゼラチンを含むTTBS(20mM Tris、500mM NaCl、0.05% Tween−20、pH7.5)で室温で穏やかに振とうし、ブロッキング処理を行った。ブロッキング後TTBSで10分間振とうして膜を洗浄した。1/2000量の抗TNF抗体および1%ゼラチンを含むTTBSで穏やかに2時間〜12時間反応させた。膜をTCBS(20mM citrate、500mM NaCl、0.05% Tween−20、pH5.5)で5分間×2回、振とうして洗浄した。膜を1%ゼラチンを含むTCBS 100mlあたり33μlのProteinG−Horseradish Peroxidase Conjugate(Bio Rad社製)を加えた液中で2時間穏やかに振とうさせて反応させた。TTBSで10分間振とうして洗浄後、ECL−plusを用いて化学発光を行い、X線フィルムに露光後現像した。
上記方法により検出したウェスタンブロットの結果を図2および図3に示した。
図2において、上段はカイコ後部絹糸腺由来抽出液(BML)、中段は昆虫培養細胞High Five抽出液(HFL)、昆虫培養細胞Sf21細胞抽出液(Sf21L)を用いてミクロソーム膜存在下で翻訳を行った結果を示した。添加したミクロソーム膜は左から犬膵臓ミクロソーム膜(CMM、プロメガ社製)、昆虫培養細胞High Five由来ミクロソーム膜(HFMM),昆虫培養細胞Sf21由来ミクロソーム膜(Sf21MM)をそれぞれ添加し、翻訳と共反応したものである。ミクロソーム膜の添加量は、A260の値で示してある。
これらの結果から、BML、FHL、Sf21Lの全ての抽出液において、HFMMおよびSf21MMをそれぞれ添加した場合に、犬膵臓ミクロソーム膜添加時よりも効率良いN−グリコシル化が生じることが判明した。また、このシフトバンドはグリコペプチダーゼF消化により顕著に減少したことから、N型糖鎖付加タンパク質であることが確認できた。
以上から、昆虫由来抽出液に昆虫由来ミクロソーム膜を添加することで、効率よいタンパク質の糖鎖修飾が可能であることが示された。
以上から、ウサギ網状赤血球抽出液においても、昆虫由来ミクロソーム膜を添加することで、効率よいタンパク質の糖鎖修飾が可能であることが示された。
配列番号2:pro−TNF GLC cDNAの塩基配列
配列番号3:PCRプライマー
配列番号4:PCRプライマー
配列番号5:PCRプライマー
配列番号6:PCRプライマー
配列番号7:His−Tag(ヒスチジンタグ)をコードするDNA
配列番号8:PCRプライマー
配列番号9:PCRプライマー
Claims (15)
- 糖鎖修飾活性を保持しない無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる無細胞系でのタンパク質合成において、翻訳反応を、Trichoplusia ni卵細胞由来あるいはSpodoptera frugiperda卵巣細胞由来の昆虫培養細胞から、ショ糖密度勾配による超遠心分離にて調整したミクロソーム膜の存在下で行うことを特徴とする、翻訳後のタンパク質の修飾方法。
- mRNA濃度(μg/ml)と該ミクロソーム膜の濃度(A260)との比が1:0.1〜5で翻訳反応を行う請求項1に記載の方法。
- 当該比が1:0.3〜2.3である、請求項2に記載の方法。
- 無細胞系タンパク質合成用抽出液が、節足動物由来の抽出物を含有するものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 節足動物由来の抽出物が昆虫組織から抽出されたものである、請求項4に記載の方法。
- 昆虫組織がカイコ組織である、請求項5に記載の方法。
- カイコ組織がカイコ幼虫の後部絹糸腺を少なくとも含有する、請求項6に記載の方法。
- 節足動物由来の抽出物が昆虫培養細胞から抽出されたものである、請求項4に記載の方法。
- 昆虫培養細胞がTrichoplusia ni卵細胞由来あるいはSpodoptera frugiperda卵巣細胞由来の培養細胞である、請求項8に記載の方法。
- 無細胞系タンパク質合成用抽出液が、小麦胚芽由来の抽出物を含有するものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 無細胞系タンパク質合成用抽出液が、哺乳動物培養細胞由来の抽出物を含有するものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 無細胞系タンパク質合成用抽出液が、ウサギ網状赤血球由来の抽出物を含有するものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 無細胞系タンパク質合成用抽出液が、大腸菌由来の抽出物を含有するものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 無細胞系タンパク質合成用抽出液が、酵母由来の抽出物を含有するものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 翻訳後のタンパク質の修飾が、N−グリコシル化および/またはシグナル配列の切除である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
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