JP2004267205A - 無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法、およびカイコ組織用抽出キット - Google Patents
無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法、およびカイコ組織用抽出キット Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 グリセロール等の多価アルコールを含有する抽出用液を用いてカイコ組織からの抽出を行う、無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法、ならびに該抽出用液を有するカイコ組織抽出用キットを提供する。本発明の調製方法により調製されたカイコ組織の抽出液を用いて無細胞系にてタンパク質合成を行うと、多価アルコールを含有しない抽出溶液を用いて調製された抽出液を用いた場合と比較して、格段にタンパク質合成量が向上される。
【選択図】 なし
Description
小麦胚芽の抽出液の調製方法の一例として、たとえば、特許文献1には、以下のような手順が記載されている。小麦種子をミルに添加し、破砕した後、篩で粗胚芽画分を得、四塩化炭素とシクロヘキサン混液(四塩化炭素:シクロヘキサン=2.5:1)を用いた浮選によって、発芽能を有する胚芽を浮上する画分から回収し、室温乾燥によって有機溶媒を除去する。この胚芽画分に混在する種皮などの不純物を静電気帯電体を用いて吸着除去する。次に、この試料から小麦胚乳成分を完全に除去するため、非イオン性界面活性剤であるNP40の0.5%溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄を繰り返す。蒸留水の存在下に再度1回の超音波洗浄を行い、小麦胚芽を純化する。
このように小麦胚芽の抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成では、抽出液の調製が煩雑であり、多大な時間と労力を要するという不具合がある。
また、無細胞系でのタンパク質の合成効率を可及的に向上させ得ることも望まれていることであり、そのような無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法、抽出用液の開発も望まれている。
(1)多価アルコールを含有する抽出用液を用いてカイコ組織からの抽出を行う、無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法。
(2)多価アルコールが、グリセロール、ジグリセロール、エチレングリコール、ポリエリスリトール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、キシロース、マルトースおよびイノシトールのうちから選ばれる少なくともいずれかである、上記(1)に記載の方法。
(3)抽出後に遠心分離して得られた上清と、該遠心分離後の沈殿からさらに上記抽出用液を用いて抽出を行った後に遠心分離して得られた上清とを混合して、抽出液を調製することを特徴とする、上記(1)または(2)に記載の方法。
(4)多価アルコールを含有する抽出用液を有するカイコ組織用抽出キット。
(5)多価アルコールが、グリセロール、ジグリセロール、エチレングリコール、ポリエリスリトール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、キシロース、マルトースおよびイノシトールのうちから選ばれる少なくともいずれかである、上記(4)に記載のキット。
カイコは、卵より孵化した後の幼虫の状態では、桑を食べて発育する期間(齢)と、食べずに脱皮の準備をする期間(眠)を交互に繰り返す。カイコの幼虫において、孵化してから1回目の脱皮までを1齢期、1回目の脱皮から2回目の脱皮までを2齢期といい、通常、4回脱皮して5齢期で成熟する(この成熟した状態のカイコ幼虫は「熟蚕」とも呼ばれる)。カイコの幼虫は、熟蚕になると体が透明になり絹糸を吐いて繭を形成し、蛹化する。蛹の後、羽化して成虫となる。
本発明は、多価アルコールを含有する抽出用液を用いてカイコ組織からの抽出を行うことを特徴とする、無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法である。かかる抽出用液を用いて調製されたカイコ組織由来の抽出物を含有する抽出液を用いて無細胞系タンパク質合成反応を行うことで、多価アルコールを含有しない抽出用液を用いて調製されたカイコ組織由来の抽出物を含有する抽出液を用いて無細胞系タンパク質合成反応を行った場合と比較して、格段にタンパク質合成量が向上される。これは、その詳細は不明ではあるが、タンパク質合成に関与する成分が効率的に抽出され且つ安定化されること、ならびに多価アルコールを含有することで抽出液自体の粘性が低下するためタンパク質合成反応が進行しやすくなるなどの理由によるものと考えられる。
本発明の方法に使用できる多価アルコールとしては、たとえば、グリセロール、ジグリセロール、ポリグリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、エリスリトール、ポリエリスリトール、キシリトール、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、リボース、イノシトール、スクロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、ソルビトール、トレハロース、キシロースなどが挙げられるが、タンパク質合成効率の観点からは、グリセロール、ジグリセロール、エチレングリコール、ポリエリスリトール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、キシロース、マルトースおよびイノシトールのうちから選ばれる少なくともいずれかが好ましい。
緩衝剤は、当該抽出用液のpHが4〜10に保持されるようなものを使用するのが好ましく、pHが6〜8に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出用液のpHが4未満またはpHが10を超えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもHEPES−KOH(pH6〜8)を使用するのが特に好ましい。
なおカイコ組織は、カイコ組織の全体(たとえば、後部絹糸腺全体)である必要はない。
なお、5齢期の脂肪体については、上記アイソザイム解析以外に、抽出液をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)にかけて脂肪体由来のタンパク質であるSP−1、SP−2などを検出することによっても、本発明の方法で調製された抽出液中に含有されているか否かを判別することができる。
なおカイコの胚については、上記アイソザイム解析以外に、抽出液をSDS−PAGEにかけて胚由来のタンパク質である30K、ESP、Vitellin(H)、Vitellin(L)などを検出することによっても、本発明の方法で調製された抽出液中に含有されているか否かを判別することができる。
中でも特に、絹糸の主成分である絹フィブロインを活発につくり、高いタンパク質合成能を有しているという観点から、5齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺、中でも5齢期の3日〜7日のカイコ幼虫の後部絹糸腺から抽出を行うことが好ましい。
まず、常法にしたがって、たとえばハサミ、ピンセット、メスなどの器具を使用して、カイコより所望の組織を摘出する。この摘出によって得る後述の抽出に使用する組織量としては、特に制限はないが、通常、1g〜100gの範囲内である。
次に摘出した組織を、液体窒素で凍結させた後、予め液体窒素で冷却させた乳鉢を用いてすり潰す。これに抽出用液を添加し、一旦抽出用液も凍結させた後、シャーベット状になるまで(具体的には、ウェットな黄色いシャリシャリ状態の氷になるまで)、薬さじで攪拌しながら溶解する。その後、再度液体窒素で完全に凍結させた後、シャーベット状になるまで(具体的には、ウェットな黄色いシャリシャリ状態の氷になるまで)薬さじで攪拌しながら溶解するという操作を行うことで、カイコ組織からの抽出を行う。
かかる抽出操作は、摘出したカイコ組織を、たとえば液体窒素で凍結させた後、−80℃で凍結させた乳鉢中ですり潰し、これに抽出用液を添加して抽出を行うようにしてもよいが、上記のような抽出操作を行うことで、多価アルコールを含有しており粘性の低い抽出用液を用いているためタンパク質合成反応が進行しやすくなる、ならびにタンパク質合成に関与する成分が効率的に抽出され且つ安定化されるという利点がある。
また、上記第一の上清をさらに遠心分離して(上記と同様の条件であればよい)得られた上清(第三の上清)を、上記第二の上清と混合するようにすると、上記効果はさらに増強され、より好ましい。これは、1回の遠心分離では除去しきれなかった第一の上清に含まれる不純物を除去できることによるものと考えられる。なお、上記第一〜第三の上清を混合して、抽出液を調製するようにしてもよい。
たとえば脱塩カラム PD−10(アマシャム バイオサイエンス社製)によりゲル濾過を行い、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記抽出用液にて溶出する、というような条件にて行う。上記ゲル濾過用緩衝液は、上記抽出用液に、グリセロールをさらに添加したものであることが好ましい。グリセロールは、通常、5(v/v)%〜40(v/v)%(好ましくは、20(v/v)%)となるように添加すればよい。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、0.1mL〜1mLを1画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、0.4mL〜0.6mLを1画分とするのが好ましい。
次に、ゲル濾過後の濾液より280nmにおける吸光度が10以上の画分を分取する。当該処理は、たとえばUltrospec3300pro(アマシャムバイオサイエンス社製)などの機器を用いて、各画分について上記280nmにおける吸光度を測定し、この吸光度が最も高い画分付近を分取する。
さらに、このような抽出液は、後述するように従来の小麦胚芽からの抽出液の調製と比較して、無細胞系タンパク質合成に供することのできる抽出液を、格段に容易に調製することができ、効率的な無細胞系タンパク質合成を実現できる。
翻訳系用反応液、転写/翻訳系用反応液のいずれの場合であっても、本発明の方法で得られた抽出液を10(v/v)%〜80(v/v)%、特には30(v/v)%〜60(v/v)%含有するように調製されたものであるのが好ましい。すなわち、反応液の全体において、カイコ組織由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で0.1mg/mL〜160mg/mLとなるように調製されるのが好ましく、3mg/mL〜60mg/mLとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で0.1mg/mL未満または160mg/mLを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
以下、(1)翻訳系用反応液、(2)転写/翻訳系用反応液について、それぞれ説明する。
翻訳系用反応液は、本発明の方法で得られた抽出液を除く成分として、外来mRNA、カリウム塩、マグネシウム塩、DTT、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、RNaseインヒビター、tRNA、緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。かかる翻訳系用反応液を使用して翻訳系合成反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が1μM〜1000μM含有されることが好ましく、10μM〜200μM含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が1μM未満または1000μMを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
転写/翻訳系用反応液は、本発明の方法で得られた抽出液を除く成分として、外来鋳型DNA、RNAポリメラーゼ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン5'−三リン酸、ウリジン5'−三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分およびtRNAを少なくとも含有するのが好ましい。かかる転写/翻訳系用反応液を使用して転写/翻訳系合成反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
なお本発明に用いる外来鋳型DNAは、塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならば鋳型DNA全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各外来鋳型DNAは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。なお、抽出液において、含有される鋳型DNAが外来鋳型DNAであるかカイコ組織に由来する鋳型DNAであるかは、抽出液中より、フェノール−クロロホルム抽出を行ってその鋳型DNAを抽出し、その塩基配列を解析することによって判別することができる。
タンパク質合成の速度の観点からは、転写/翻訳系用反応液中において上記のアミノ酸成分が1μM〜1000μM含有されることが好ましく、10μM〜500μM含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が1μM未満または1000μMを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
転写/翻訳系合成反応では、転写、翻訳工程を連続して実施し得るという観点から両工程に好適な20℃〜30℃の範囲で反応を行うことが特に好ましい。反応の時間は、全工程あわせて、通常、1時間〜72時間、好ましくは3時間〜24時間である。
5齢期の6日に達したカイコ幼虫をサンプリングした。サンプリングしたカイコから、ハサミ、ピンセット、メスを使用して、後部絹糸腺を摘出し、以下の手順に従って後部絹糸腺について抽出を行った。
抽出は、まず、5齢期の6日に達したカイコ幼虫より摘出した後部絹糸腺を、液体窒素で凍結させた後、予め液体窒素で冷却された乳鉢を用いてすり潰した。これに下記組成の抽出用液を添加し、一旦抽出液も凍結させた後、シャーベット状になるまで薬さじで攪拌しながら溶解した。その後、液体窒素で完全に凍結させた後、シャーベット状になるまで再度薬さじで攪拌しながら溶解するという操作を行うことで、カイコ組織からの抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・20mM HEPES−KOH(pH7.4)
・100mM 酢酸カリウム
・2mM 酢酸マグネシウム
・19.3(v/v)% グリセロール
・1mM DTT
・0.5mM PMSF
抽出後、得られた液状物を遠心分離機(himacCR20B3(日立工機社製))にて、30000×g、30分間、4℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清(第一の上清)のみを単離し、再び30000×g、30分間、4℃の条件にて遠心分離を行い、上清(第三の上清)を単離した。一方、上記1回目の遠心分離後の沈殿に、上記組成の抽出用液を添加し、上述したのと同様の抽出操作を行った後、30000×g、30分間、4℃の条件にて遠心分離を行い、上清(第二の上清)を単離した。こうして得られた6.25μlの第二の上清と6.25μlの第三の上清とを混合し、抽出液を調製した。
上記実施例1で得られた12.5μlの第三の上清をそのまま抽出液として調製した以外は、実施例1と同様にして行った。
上記実施例1で得られた12.5μlの第二の上清をそのまま抽出液として調製した以外は、実施例1と同様にして行った。
:実施例1〜3の各抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成
上記実施例1〜3で得られた各抽出液を用いて、下記の組成の反応液を調製した。
〔反応液の組成〕
・50(v/v)% 抽出液
・40μg/mL 外来mRNA
・30mM HEPES−KOH(pH7.4)
・100mM 酢酸カリウム
・1.0mM 酢酸マグネシウム
・0.5mM DTT
・10(v/v)% グリセロール
・0.5mM ATP
・0.5mM GTP
・0.25mM EGTA
・25mM クレアチンリン酸
・200μg/mL クレアチンキナーゼ
・40μM アミノ酸(20種)
・2U/μL RNaseインヒビター
・200μg/mL tRNA
ATP(シグマ社製)、GTP(シグマ社製)、アミノ酸(20種)(シグマ社製)、RNaseインヒビター(宝酒造社製)、tRNA(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)をそれぞれ用いた。外来mRNAとしては、ルシフェラーゼをコードするmRNA(ルシフェラーゼコントロールRNA、プロメガ社製)を用いた。
各々調製した反応液を用いて、反応装置として低温アルミブロック恒温槽MG−1000(東京理化器械社製)を用い、無細胞系のタンパク質(ルシフェラーゼ)の合成反応を行った。反応液量は25μLとした。反応温度は25℃とし、反応時間ごとにサンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ量を測定した。
合成されたルシフェラーゼは、ルシフェラーゼアッセイキット(E−1500、プロメガ社製)を用いて各々定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬50μLに反応液2.5μLを添加し、ルミノメーター(Luminescencer−JNR AB−2100、アトー社製)を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
図1は、実験例1の結果を示すグラフである。図1において、縦軸はルシフェラーゼ発光積算量を示し、横軸は反応時間(時間)を示す。
実施例1で調製した第二の上清と第三の上清との混合物を、さらにSephadex G−25 Fine(アマシャム バイオサイエンス社製)に、抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上記混合物を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計(Ultrospec3300pro、アマシャム バイオサイエンス社製)を用いて、280nmにおける吸光度が最も高い画分を分取し、これを抽出液とした以外は、実施例1と同様にした。
実施例2で得られた第三の上清を、さらにSephadex G−25 Fine(アマシャム バイオサイエンス社製)に、抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上記混合物を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計(Ultrospec3300pro、アマシャム バイオサイエンス社製)を用いて、280nmにおける吸光度が最も高い画分を分取し、これを抽出液とした以外は、実施例2と同様にした。
実施例3で得られた第二の上清を、さらにSephadex G−25 Fine(アマシャム バイオサイエンス社製)に、抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上記混合物を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計(Ultrospec3300pro、アマシャム バイオサイエンス社製)を用いて、280nmにおける吸光度が10以上の画分を分取し、これを抽出液とした以外は、実施例3と同様にした。
:実施例4〜6の各抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成
上記実施例4〜6で得られた各抽出液を用いて、実験例1と同様にして、無細胞系タンパク質合成反応を行った。
図2は、実施例4〜6についての実験例2の結果を示すグラフである。図2において、縦軸はルシフェラーゼ発光積算量を示し、横軸は反応時間(時間)を示す。
5齢期の6日に達したカイコ幼虫をサンプリングした。サンプリングしたカイコから、ハサミ、ピンセット、メスを使用して、後部絹糸腺を摘出し、以下の手順に従って後部絹糸腺について抽出を行った。
抽出は、まず、5齢期の6日に達したカイコ幼虫より摘出した後部絹糸腺3.0gを液体窒素で凍結した後、予め液体窒素で冷却させた乳鉢を用いてすり潰し、下記の組成の抽出用液を用いて抽出用液を添加した。
〔抽出用液の組成〕
・20mM HEPES−KOH(pH7.4)
・100mM 酢酸カリウム
・2mM 酢酸マグネシウム
・10(v/v)% グリセロール
・1mM DTT
・0.5mM PMSF
抽出用液の添加後、液体窒素にて凍結、解凍した後、得られた液状物を遠心分離機(himacCR20B3(日立工機社製))にて、30000×g、30分間、4℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離し、再び30000×g、30分間、4℃の条件にて遠心分離を行った。この遠心分離後、上清のみを単離し、抽出液とした。
グリセロールを20(v/v)%含有すること以外は実施例7と同様の抽出用液を用いて、実施例7と同様にして抽出液を調製した。
グリセロールに換えて、20(v/v)%のジグリセロールを含有すること以外は実施例7と同様の抽出用液を用いて、実施例7と同様にして抽出液を調製した。
グリセロールに換えて、10(v/v)%のエチレングリコールを含有すること以外は実施例7と同様の抽出用液を用いて、実施例7と同様にして抽出液を調製した。
:ポリエリスリトール(4量体)の製造
メソ−エリスリトール100.0gと水酸化ナトリウム1.0gとを二酸化炭素雰囲気下、240℃、30mmHg〜40mmHgで2時間反応させた。得られた褐色液体に水150mlを加え、希塩酸で中和し、活性炭で脱色し、カチオン交換樹脂(三菱化学(株)製、ダイアイオンSK−112)およびアニオン交換樹脂(三菱化学(社)製、ダイアイオンWA30)にて処理し、水を留去して無色粘性の液体69.3g(含水率:5%)を得た。
得られたものをTOF−MS分析(マイクロマス社製 LCT質量分析計、イオン化方式:ESI、測定イオン:正イオン)したところ、メソ−エリスリトールに由来する104Daの繰り返し単位が観測できた。また、主なピークとして、m/z226(重合度2)から1474(重合度14)までの鎖状ポリエリスリトールのピークに加えて、それらのm/zより18Daおよび36Daの小さい脱水物のピークも観察された。同装置のLC(カラム:TSK−gel Amide−80(東ソー(株)社製)、溶離液:(アセトニトリル/水=80/20)、60℃、流速1ml/min)にて成分を分離し分子量を測定したところ、同一分子量でも直鎖状と分岐状のポリエリスリトールが観察された。なお、TOF−MSのイオン強度より算出すると、平均重合度は4であった。
グリセロールに換えて、上記製造例1で得られたポリエリスリトールを10(v/v)%含有すること以外は実施例7と同様の抽出用液を用いて、実施例7と同様にして抽出液を調製した。
グリセロールを含有しないこと以外は実施例7で用いたのと同様の抽出用液を用いて抽出を行った以外は、実施例7と同様にして抽出液を調製した。
:実施例7〜11、比較例1の各抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成
上記実施例7〜11、比較例1で得られた各抽出液を用いて、下記の組成の反応液を調製した。
〔反応液の組成〕
・50(v/v)% 抽出液
・160μg/mL 外来mRNA
・30mM HEPES−KOH(pH7.4)
・100mM 酢酸カリウム
・1.75mM 酢酸マグネシウム
・2mM DTT
・0.75mM ATP
・0.5mM GTP
・0.25mM EGTA
・25mM クレアチンリン酸
・50μg/mL クレアチンキナーゼ
・100μM アミノ酸(20種)
・2U/μL RNaseインヒビター
・100μg/mL tRNA
ATP(シグマ社製)、GTP(シグマ社製)、アミノ酸(20種)(シグマ社製)、RNaseインヒビター(宝酒造社製)、tRNA(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)をそれぞれ用いた。外来mRNAとしては、ルシフェラーゼをコードするmRNA(ルシフェラーゼコントロールRNA、プロメガ社製)を用いた。
各々調製した反応液を用いて、反応装置として低温アルミブロック恒温槽MG−1000(東京理化器械社製)を用い、無細胞系のタンパク質(ルシフェラーゼ)の合成反応を行った。反応液量は25μLとした。反応温度は25℃とし、反応時間ごとにサンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ量を測定した。
合成されたルシフェラーゼは、ルシフェラーゼアッセイキット(E−1500、プロメガ社製)を用いて各々定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬50μLに反応液2.5μLを添加し、ルミノメーター(Turner Designs TD−20/20、プロメガ社製)を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
図3は、実験例3の反応開始より4時間後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフである。図3において、縦軸は、比較例1で得られた抽出液を用いた場合の無細胞系タンパク質合成量に対する、実施例7〜11で得られた各抽出液を用いた場合の無細胞系タンパク質合成量の割合(相対合成量:%)を表している。図3に示すように、多価アルコールを含有する抽出用液を用いて調製した抽出液を使用した反応液は、多価アルコールを含有しない抽出用液を用いて調製した抽出液を使用した反応液と比較して、タンパク質合成量が約200%〜350%となる。
グリセロールに換えて、10(v/v)%のエリスリトールを含有すること以外は実施例7と同様の抽出用液を用いて、実施例7と同様にして抽出液を調製した。
グリセロールに換えて、10(v/v)%のキシリトールを含有すること以外は実施例7と同様の抽出用液を用いて、実施例7と同様にして抽出液を調製した。
グリセロールに換えて、10(v/v)%のソルビトールを含有すること以外は実施例7と同様の抽出用液を用いて、実施例7と同様にして抽出液を調製した。
グリセロールに換えて、10(v/v)%のトレハロースを含有すること以外は実施例7と同様の抽出用液を用いて、実施例7と同様にして抽出液を調製した。
グリセロールに換えて、10(v/v)%のスクロースを含有すること以外は実施例7と同様の抽出用液を用いて、実施例7と同様にして抽出液を調製した。
グリセロールに換えて、10(v/v)%のラクトースを含有すること以外は実施例7と同様の抽出用液を用いて、実施例7と同様にして抽出液を調製した。
グリセロールに換えて、10(v/v)%のキシロースを含有すること以外は実施例7と同様の抽出用液を用いて、実施例7と同様にして抽出液を調製した。
グリセロールに換えて、10(v/v)%のマルトースを含有すること以外は実施例7と同様の抽出用液を用いて、実施例7と同様にして抽出液を調製した。
グリセロールに換えて、10(v/v)%のイノシトールを含有すること以外は実施例7と同様の抽出用液を用いて、実施例7と同様にして抽出液を調製した。
グリセロールを含有しないこと以外は実施例7で用いたのと同様の抽出用液を用いて抽出を行った以外は、実施例7と同様にして抽出液を調製した。
:ベクターpT N T−Lucの構築
ルシフェラーゼをコードする構造遺伝子を有するpGEM−Luc Vector(プロメガ社製)5ngを鋳型とし、配列表配列番号1に示す塩基配列を有するプライマー(Luc T7−F3−Kpn)と、配列表配列番号2に示す塩基配列を有するプライマー(Luc T7−R4−Kpn)と、KOD plus(東洋紡績社製)を用い、96℃2分で鋳型を変性させた後、96℃15秒、50℃30秒、68℃120秒、30サイクルのPCRを行い、構造遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)を増幅した。エタノール沈殿によりPCR産物を精製した後、KpnIで消化した。これとは別に、pTNT Vector(プロメガ社製)をKpnIで消化した。これらの反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、Gen Elute Gel Purification Kit(シグマ社製)を用いて精製した。Ligation High(東洋紡績社製)を用いて、これらをライゲーションした後、大腸菌DH5α(東洋紡績社製)を形質転換した。形質転換した大腸菌からアルカリ−SDS法により調製したプラスミドを、配列表配列番号3に示す塩基配列を有するプライマー(T7 promoter)およびBig Dye Terminator Cycle Sequencing FS(アプライドバイオシステムズ社製)を用いてシークエンシング反応(96℃10秒、50℃5秒、60℃4分、25サイクル)を行った。この反応液をABI PRISM 310 Genetic Analyzer(アプライドバイオシステムズ社製)に供し、塩基配列解析を行った。pTNT Vector由来の5'−βグロビンリーダー配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンが挿入されたプラスミドをpTNT−Lucと命名した。
:鋳型DNA(ベクターpSphd−Luc)の作製
上記参考例1で作成したプラスミドベクターpTNT−Lucを鋳型にして、配列表配列番号4に示す塩基配列を有するプライマー(T7p Rv)と、配列表配列番号5に示す塩基配列を有するプライマー(Luc−ATG)を用い、96℃15秒、50℃30秒、68℃5分、30サイクルのPCRを行った。反応終了後、電気泳動でPCR産物を分離した後、Gen Elute Gel Purification Kit(シグマ社製)を用いて精製し、これをライゲーション反応に用いた。このようにして、プラスミドベクターpTNT−LucからSP6プロモーター配列、5'−βグロビンリーダー配列およびルシフェラーゼをコードする構造遺伝子の5’上流側マルチクローニングサイトを欠失せしめたプラスミドベクターを得た。
配列表配列番号6に示す塩基配列を有するSfNPV(Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus)のポリへドリン遺伝子の5’UTRのセンス鎖、アンチセンス鎖をDNA合成機で合成し、T4 Polynucleotide Kinase(東洋紡績社製)によってその5’末端のリン酸化を行った。反応終了後、センス鎖とアンチセンス鎖とを混合し、95℃5分間熱処理した。これを室温になるまで静置しセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせた。エタノール沈殿により精製した後、水に溶解させた。SigmaSpin Post Reaction Purification Columns(シグマ社製)によって、過剰のATPを取り除いた後、再度エタノール沈殿により精製した。得られた二本鎖DNA断片をインサートとし、上記SP6プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の5’上流側マルチクローニングサイトを欠失したpTNT−Luc由来のベクターとライゲーションし、大腸菌DH5αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、SfNPVのポリへドリン遺伝子の5’UTRが順方向(5’→3’)に1個組み込まれたベクター(鋳型DNA)を選択した。このようにして、T7プロモーター配列と構造遺伝子との間にSfNPVのポリへドリン遺伝子の5’UTRが順方向に1個組み込まれたベクター(鋳型DNA)を作製した。得られた鋳型DNAを、pSphd−Lucと名付けた。
:カイコ組織由来の抽出物を含有する反応液を用いた無細胞系タンパク質合成
(1)インビトロ転写反応およびmRNAの精製
上記参考例2で作製したベクターを、BamHIまたはBglIIで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。得られたベクター1μgを鋳型として、RiboMax Large Scale RNA production System−T7(プロメガ社製)を用い20μlスケールで37℃4時間のインビトロ転写反応を行い、mRNAを合成した。
転写反応終了後、1UのRQ1 RNase Free DNase(プロメガ社製)を添加し、37℃15分インキュベートし、鋳型を消化した。フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を100μlの滅菌水に溶解し、Nick column(アマシャムバイオサイエンス社製)にアプライした後、滅菌水で溶出した。溶出画分に酢酸カリウムを終濃度0.3Mとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。合成されたmRNAの定量は260nmと280nmの吸光度を測定して行った。
(2)無細胞系タンパク質合成反応
実施例12〜20及び比較例2で調製したカイコ抽出液ならびに上記(1)で得られたmRNAを用い、下記組成の反応液を調製し、無細胞系タンパク質合成反応を行った。
〔反応液の組成〕
・50(v/v)% カイコ抽出液
・160μg/mL mRNA
・30mM HEPES−KOH(pH7.4)
・100mM 酢酸カリウム
・1.75mM 酢酸マグネシウム
・2.0mM DTT
・0.75mM ATP
・0.5mM GTP
・0.25mM EGTA
・25mM クレアチンリン酸
・200μg/mL クレアチンキナーゼ
・40μM アミノ酸(20種)
・2U/μL RNaseインヒビター
・100μg/mL tRNA
ATP(シグマ社製)、GTP(シグマ社製)、アミノ酸(20種)(シグマ社製)、RNaseインヒビター(宝酒造社製)、tRNA(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)をそれぞれ用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽MG−1000(東京理化器械社製)を用いた。翻訳反応は反応温度25℃で6時間行い、反応液量は25μLとした。合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット(E−1500、プロメガ社製)を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬50μLに反応液2.5μLを添加し、ルミノメーター(Tuner Designs TD−20/20、プロメガ社製)を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
:鋳型DNA(ベクターpAphd−Luc)の作製
配列表配列番号7に示す塩基配列を有するAcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)のポリへドリン遺伝子の5’UTRを用いた以外は参考例2と同様にして、T7プロモーター配列と構造遺伝子との間に、配列表配列番号7に示す塩基配列を有するAcNPVのポリへドリン遺伝子の5’UTRが順方向(5’→3’)に1個組み込まれたベクター(鋳型DNA)を作製した。得られた鋳型DNAを、pAphd−Lucと名付けた。
:カイコ組織由来の抽出物を含有する反応液を用いた無細胞系タンパク質合成
(1)インビトロ転写反応およびmRNAの精製
ベクターとして参考例3で調製したpAphd−Lucを用いた以外は、実験例4(1)と同様の方法により、mRNAを調製した。
(2)抽出液として実施例7及び比較例1で調製したカイコ抽出液を用い、mRNAとして上記(1)で得られたmRNAを用いる以外は実験例4(2)と同様の反応液を調製し、無細胞系タンパク質合成反応を行った。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽MG−1000(東京理化器械社製)を用いた。反応液量は25μLとした。経時的にサンプリングを行い、実験例4(2)と同様に合成されたルシフェラーゼ量を定量した。
配列番号2:プライマー Luc T7−R4−Kpn
配列番号3:プライマー T7プロモーター
配列番号4:プライマー T7p Rv
配列番号5:プライマー Luc−ATG
配列番号6:SfNPVポリヘドリン遺伝子5’UTRの塩基配列
配列番号7:AcNPVポリヘドリン遺伝子5’UTRの塩基配列
Claims (5)
- 多価アルコールを含有する抽出用液を用いてカイコ組織からの抽出を行う、無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法。
- 多価アルコールが、グリセロール、ジグリセロール、エチレングリコール、ポリエリスリトール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、キシロース、マルトースおよびイノシトールのうちから選ばれる少なくともいずれかである、請求項1に記載の方法。
- 抽出後に遠心分離して得られた上清と、該遠心分離後の沈殿からさらに上記抽出用液を用いて抽出を行った後に遠心分離して得られた上清とを混合して、抽出液を調製することを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 多価アルコールを含有する抽出用液を有するカイコ組織用抽出キット。
- 多価アルコールが、グリセロール、ジグリセロール、エチレングリコール、ポリエリスリトール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、キシロース、マルトースおよびイノシトールのうちから選ばれる少なくともいずれかである、請求項4に記載のキット。
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