JP3965437B2 - 無細胞系タンパク質合成におけるミクロソーム膜添加による翻訳後修飾方法 - Google Patents

Description

本発明は、無細胞系タンパク質合成方法、特に翻訳後修飾が行なわれ得る無細胞系タンパク質合成方法に関する。

タンパク質の構造や機能を解析する上で、タンパク質の大量生産は不可欠な技術である。しかしながら、大腸菌をはじめとする数多くの生細胞を用いた発現系は、その生物の生命維持に支障となるタンパク質を合成することは事実上困難であり、限られたタンパク質のみの取得・解析しか行われてこなかった。これに対し、無細胞系タンパク質合成は、タンパク質合成に必要な装置のみを取り出した人工的なタンパク質合成に特化した系であるので、生細胞の発現系の抱える問題点を解決し得る手法であると期待されている。

また、ゲノム解析の進展に伴い、生体内に存在するすべてのタンパク質の構造と機能の網羅的な解明をめざしたプロテオーム解析が進行している。生体内のタンパク質は、細胞質に存在する遊離のリボソーム上で翻訳が開始した後、ほぼ例外なく翻訳中あるいは翻訳後にプロテアーゼによるプロセシングや、特定のアミノ酸残基の修飾といった翻訳後修飾を受ける。これらの翻訳後修飾は、多くの場合タンパク質の機能発現やその制御に直接関与することから、これらの解析はタンパク質機能の解明に不可欠である。

典型的なタンパク質の翻訳後修飾としてはシグナルペプチドの切断やＮ−グリコシル化が挙げられるが、これらの反応は無細胞タンパク質合成系を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで解析できることが知られている。この解析系では、まず目的遺伝子（ｃＤＮＡ）を転写反応用のベクターにサブクローニングし、対応するｍＲＮＡをＲＮＡポリメラーゼを用いて合成する。このｍＲＮＡを小胞体膜（犬膵臓ミクロソーム膜；犬膵臓ミクロソーム膜については非特許文献１〜３等参照）とＲＩ標識アミノ酸存在下でウサギ網状赤血球溶解液中、あるいはコムギ胚芽抽出液中に存在するリボソームで翻訳させる。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、フルオログラフィーに供与し、小胞体膜存在下、非存在下での分子量の変化やプロテアーゼ処理に対する感受性から翻訳後修飾が検出される。また、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）から小胞体画分、ゴルジ体画分、細胞膜画分をそれぞれ別々に調製し、ウサギ網状赤血球溶解液に添加する系が開発されている（例えば特許文献１等参照）。

このような実験系を用いてタンパク質の翻訳後修飾が解析できる無細胞タンパク質合成系としてはこれまでウサギ網状赤血球溶解液およびコムギ胚芽抽出液が知られているが、この２種以外にタンパク質翻訳後修飾の解析が可能な無細胞タンパク質合成系は報告されていない。

以上のことから、無細胞系タンパク質合成においては、依然、汎用性が高く新しい翻訳後修飾方法の開発が望まれていた。
特開２００２−２３８５９５号公報 ウォルター，ピー．とブローベル，ジー．（Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ． ａｎｄ Ｂｌｏｂｅｌ，Ｇ．），「メソッズ エンツァイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」，（米国），１９８３年，第９６巻，ｐ．８４−９３ ブレイド，エヌ．ジェイ．ら（Ｂｕｌｌｅｉｄ，Ｎ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．），「ザ バイオケミカル ジャーナル（Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ）」，（米国），１９９０年，第２６８巻，ｐ．７７７−７８１ パラディス，ジー．ら（Ｐａｒａｄｉｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．），「バイオケミストリー アンド セル バイオロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ）」，（カナダ国），１９８７年，第６５巻，ｐ.９２１−９２４

本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、無細胞系タンパク質合成における新規な翻訳後修飾方法ならびに当該翻訳後修飾反応を利用した新規な無細胞系タンパク質合成方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）
カイコ幼虫の後部絹糸腺、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ卵細胞由来昆虫培養細胞、及び、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣細胞由来昆虫培養細胞からなる群より選ばれる節足動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成において、翻訳反応を犬膵臓由来のミクロソーム膜の存在下で行うことを特徴とする、翻訳後のタンパク質の修飾方法。
（２）
ｍＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）と犬膵臓由来のミクロソーム膜の濃度（Ａ２６０）との比が１：０．１〜５で翻訳反応を行う上記（１）に記載の方法。
（３）
当該比が１：０．３〜２．３である、上記（２）に記載の方法。
（４）
翻訳後のタンパク質の修飾が、Ｎ−グリコシル化および／またはシグナル配列の切除である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。

本発明によれば、シグナルペプチドの切断やＮ−グリコシル化等のタンパク質の翻訳後修飾を行うことが可能な無細胞系タンパク質合成方法を提供することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、カイコ幼虫の後部絹糸腺、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ卵細胞由来昆虫培養細胞、及び、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣細胞由来昆虫培養細胞からなる群より選ばれる節足動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる無細胞系でのタンパク質合成方法であって、翻訳反応を犬膵臓由来のミクロソーム膜の存在下で行うことを特徴とする。

無細胞系タンパク質合成方法は、通常、翻訳装置としてのリボソームなどを含有する生体由来抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用反応液に、転写鋳型または翻訳鋳型を添加して行う。翻訳鋳型としては、鋳型ＤＮＡから転写して得られたｍＲＮＡであってもよい。本発明では生体由来抽出物として、節足動物由来の抽出物を用いる。

ここで「節足動物」とは、後生動物の一門であって、左右相称、裂体腔を有する旧口動物を指し、鋏角亜門、大顎亜門のいずれに属するものであってもよく、たとえば、昆虫綱、クモ綱などに属する動物を包含する。中でも、昆虫綱またはクモ綱（特に、クモ亜綱）に属する節足動物が好ましく、昆虫綱に属する節足動物が特に好ましい。昆虫綱に属する節足動物としては、たとえば、鱗翅目（チョウ目）、直翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目、甲虫目、脈翅目、半翅目などに属するものが挙げられ、特に制限されるものではないが、中でも、カイコガ科、ヤガ科などの鱗翅目に属するものが好適に使用される。

本発明における無細胞系タンパク質合成用反応液中に含有される上記抽出物は、上記節足動物由来であるならば、成長段階のいずれを問わずいかなる組織から抽出されたものであってもよく、また、節足動物のいずれの組織由来の培養細胞より抽出されたものであってもよい。中でも、カイコ組織または昆虫培養細胞から抽出されたものであるのが特に好ましい。

「カイコ」は、カイコガ科に属する鱗翅目昆虫（絹糸昆虫）と同義であり、その一生において「卵（胚）」（産卵直後より孵化直前までの間）、「幼虫」（孵化直後から繭の形成終了直前（１齢期〜５齢期に分けられる））、「蛹」（繭の形成終了直前から羽化する直前までの間）、ならびに「成虫（蛾）」（羽化直後より死亡までの間）の各状態を経るものであり、その一生にわたる形態のいずれをも含むものとする。カイコは、卵より孵化した後の幼虫の状態では、桑を食べて発育する期間（齢）と、食べずに脱皮の準備をする期間（眠）を交互に繰り返す。カイコの幼虫において、孵化してから１回目の脱皮までを１齢期、１回目の脱皮から２回目の脱皮までを２齢期といい、通常、４回脱皮して５齢期で成熟する（この成熟した状態のカイコ幼虫は「熟蚕」とも呼ばれる）。カイコの幼虫は、熟蚕になると体が透明になり絹糸を吐いて繭を形成し、蛹化する。蛹の後、羽化して成虫となる。

無細胞系タンパク質合成用反応液がカイコ組織由来の抽出物を含有する場合、組織としてはカイコの一生のうちのどの状態（卵、幼虫（１齢期〜５齢期）、蛹、成虫）のいずれの組織であってよい。またカイコ組織は、単一の状態における単一の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺のみ）に限らず、単一の状態における複数の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺および脂肪体）であってもよく、複数の状態における単一の組織（たとえば、３齢期、４齢期、５齢期の各カイコ幼虫における後部絹糸腺）であってもよいものとする。無論、複数の状態における複数の組織であってもよい。なおカイコ組織は、カイコ組織の全体（たとえば、後部絹糸腺全体）である必要はない。

ここで、カイコ組織の「絹糸腺」とは、カイコ幼虫の両体側において、頭部の下唇先端に位置する吐出口から盲管にまで連なる一対の管状の外分泌腺であり、前部絹糸腺、中部絹糸腺および後部絹糸腺に大きく分けられる。後部絹糸腺は、絹糸の中心部を為すフィブロインを分泌する。また中部絹糸腺は、セリシンを分泌する。フィブロインは中部絹糸腺に蓄積されるとともに、セリシンによってその外周を覆われて、ゲル状の絹物質となる。この絹物質は、前部絹糸腺を通って吐出口から排出され、固体化して絹糸となる。
またカイコ組織の「脂肪体」とは、カイコ幼虫において、体内の至るところに分布し、白色の柔らかい扁平な帯状、ひも状あるいは葉状の組織である。脂肪体は、ヒトの肝臓に似て栄養、エネルギー源を貯蔵する役目を果たしているので、細胞内には脂肪球、タンパク質、グリコーゲンその他の新陳代謝に関係する種々の物質を含んでいる。
また「胚」は、カイコの卵の状態の組織を指す。

またカイコ組織に由来する抽出物を含有する場合、カイコ幼虫の絹糸腺、脂肪体およびカイコの胚から選ばれる少なくともいずれか由来の抽出物であるのが好ましい。カイコ幼虫の絹糸腺（特に、後部絹糸腺）より調製を行うと、短時間で大量のタンパク質が合成可能であるという特に優れた利点がある。またカイコ幼虫の脂肪体から抽出液を調製すると、脂肪体が柔らかい組織であるために、すり潰す作業が短時間で済み、結果として容易に抽出液を調製できる利点がある。さらに、カイコの胚から調製を行うと、胚が１つの個体であるために他の組織とは異なり摘出する作業を要さず、結果として容易に抽出液を調製できるという利点がある。

カイコを抽出対象とする場合、カイコは１齢期〜５齢期の幼虫であればよいが、５齢期のカイコ幼虫が好ましい。これは、カイコ幼虫は繭の形成期に近づくにつれて組織が成熟し、特に５齢期のカイコ幼虫においては組織が１齢期〜５齢期のうちで最も成熟しているため、同量の抽出物を得るために要する数は少なくて済むためである。中でも、５齢期のカイコ幼虫の絹糸腺または脂肪体（好ましくは５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺、より好ましくは５齢期の３日〜７日のカイコ幼虫の後部絹糸腺）からの抽出物を含有すると、他の齢期のものと比べて短時間で大量のタンパク質が合成可能な無細胞系タンパク質合成用反応液が得られるという利点もあり、特に好ましい。

また、上述したように無細胞系タンパク質合成用反応液に含有される節足動物由来の抽出物は、従来公知の節足動物を由来とする培養細胞から得られたものであってもよい。かかる培養細胞としては、培養細胞株が多く樹立されており、また、多くの哺乳類系の培養細胞と異なり二酸化炭素雰囲気下での培養を必要とせず、無血清培地においても培養が可能であることから、鱗翅目、半翅目などの昆虫由来の培養細胞（昆虫培養細胞）を使用するのが好ましい。昆虫培養細胞も、いかなる組織由来の細胞であってもよく、たとえば、血球細胞、生殖巣由来細胞、脂肪体由来細胞、胚由来細胞、孵化幼虫由来細胞などを特に制限なく使用することができるが、中でも、タンパク質生産能が高いと考えられる生殖巣由来の昆虫培養細胞を使用するのが好ましい。特には、細胞系においてタンパク質合成能が高く、また無血清培地にて培養が可能である、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来の細胞Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）やＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の細胞Ｓｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）が好適な昆虫培養細胞として例示される。

上記節足動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用反応液は、従来公知の適宜の組成の抽出用液を用いて、節足動物の組織または培養細胞より抽出操作を行って得られた抽出液（無細胞系タンパク質合成用抽出液；抽出液＝抽出用液＋抽出物）を調製し、これに後述するような翻訳反応に要する成分、場合によっては翻訳反応および転写反応に要する成分を適宜添加することで、調製することができる。

節足動物からの抽出操作に用いられる抽出用液としては、特には制限されるものではないが、プロテアーゼインヒビターを少なくとも含有するのが好ましい。プロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液を用いると、節足動物由来の抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパクの不所望な分解を防止でき、結果として節足動物由来の抽出物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すことができるようになるという利点がある。上記プロテアーゼインヒビターとしては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるならば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがある。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エチレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用することができるが、節足動物由来の抽出物にはセリンプロテアーゼが含まれることが多いことから、上記中でもセリンプロテアーゼに対して特異性の高いインヒビターとして働くＰＭＳＦを使用するのが好ましい。また、１種類のプロテアーゼインヒビターのみならず、数種類の混合物（プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いてもよい。

当該抽出用液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特に制限はないが、無細胞系タンパク質合成に必須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。

また本発明に用いる抽出用液は、上記プロテアーゼインヒビターに加えて、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴおよび緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。

上記カリウム塩としては、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
当該抽出用液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜３００ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。

上記マグネシウム塩としては、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
当該抽出用液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。

上記ＤＴＴは、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該抽出用液中において０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。

上記緩衝剤は、抽出用液に緩衝能を付与し、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こる抽出液のｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。
緩衝剤は、得られた抽出液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６．５〜８．５に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を使用するのが特に好ましい。
当該抽出用液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。

また抽出対象である節足動物が昆虫培養細胞である場合、上記組成に加えて、塩化カルシウムおよびグリセロールをさらに含有してなる抽出用液を用いると、タンパク質合成能がより向上された昆虫培養細胞抽出液を得ることができるため好ましい。
この場合、塩化カルシウムの含有量は特に制限されないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであるのが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭであるのがより好ましい。また、グリセロールの添加量についても特に制限されるものではないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、５（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのが好ましく、１０（ｖ／ｖ）％〜５０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのがより好ましい。

節足動物の組織または培養細胞より抽出液を抽出する方法についても特に制限はなく、従来公知の適宜の方法にて行うことができる。
たとえば、節足動物由来の抽出物として、カイコ組織由来の抽出物または昆虫培養細胞由来の抽出物を使用する場合、上述したような組成の抽出用液を使用して、本発明者らが提案している抽出方法にて抽出液を調製するのが、好適である。
以下、それぞれの場合について詳述する。

〔Ａ〕カイコ組織由来の抽出物を含有する抽出液の調製方法
まず、常法にしたがって、たとえばハサミ、ピンセット、メスなどの器具を使用して、カイコより所望の組織を摘出する。この摘出によって得る後述の抽出に使用する組織量としては、特に制限はないが、通常、１ｇ〜１００ｇの範囲内である。
次に、摘出した組織を、たとえば液体窒素で凍結した後、−８０℃で凍結させた乳鉢中ですり潰し、これに上述した抽出用液を添加して抽出操作を行う。
あるいは、上記抽出用液の添加後、一旦抽出用液も凍結させた後、シャーベット状になるまで（具体的には、ウェットな黄色いシャリシャリ状態の氷になるまで）、薬さじで攪拌しながら溶解する。その後、再度液体窒素で完全に凍結させた後、シャーベット状になるまで（具体的には、ウェットな黄色いシャリシャリ状態の氷になるまで）薬さじで攪拌しながら溶解させる。かかる方法によれば、タンパク質合成に関与する成分が効率的に抽出され且つ安定化されるという利点がある。
このようにして、まず、カイコの組織からの抽出物を含有する液状物を得る。

次に、上記抽出処理で得られた液状物を遠心分離にかける。該遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行う。該遠心分離を１回行った後の上清（上清Ａ１）をそのまま用いて抽出液とするようにしてもよいし、また、該上清Ａ１に上記と同様の条件にて再度の遠心分離を行い、得られた上清（上清Ａ２）を抽出液としてもよい。
また、上記上清Ａ１と、上記１回目の遠心分離後の沈殿から上記抽出用液を用いてさらに抽出を行った後に、上記と同様の条件にて遠心分離して得られた上清（上清Ａ３）とを混合して、抽出液として調製するようにしてもよい。このように上清Ａ１と上清Ａ３とを混合して抽出液を調製することで、上清Ａ１、上清Ａ３を単独で抽出液とする場合と比較して、タンパク質合成効率が向上するという利点がある。またさらに、上清Ａ２を、上清Ａ３と混合して抽出液を調製してもよい。これにより上記効果はさらに増強される。勿論、上記上清Ａ１〜上清Ａ３を混合して、抽出液を調製するようにしてもよい。
この場合、調製される混合物（抽出液）における上清Ａ１および／または上清Ａ２（両方混合する場合には、その総量）と上清Ａ３との混合割合に特に制限はないが、タンパク質の合成効率の観点からは、体積比で１０：９０〜９０：１０であるのが好ましく、２０：８０〜８０：２０であるのがより好ましい。

なお上述のようにそれぞれ調製した後に、ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分付近を分取して抽出液として調製するようにしてもよい。しかしながらタンパク質の合成効率の観点からは、当該ゲル濾過および画分の分取を経ずに抽出液として調製するのが好ましい。

なお、上記ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分付近を分取する場合には、具体的には以下の手順にて行えばよい。
たとえば脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）を使用し、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記抽出用液にて溶出する、というような条件にて行う。上記ゲル濾過用緩衝液は、上記抽出用液に、グリセロールをさらに添加したものであることが好ましい。グリセロールは、通常、５（ｖ／ｖ）％〜４０（ｖ／ｖ）％（好ましくは、２０（ｖ／ｖ）％）となるように添加すればよい。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
次に、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する。当該処理は、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャム バイオサイエンス社製）などの機器を用いて、各画分について上記２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、この吸光度が最も高い画分付近を分取し、これを抽出液とする。

〔Ｂ〕昆虫培養細胞由来の抽出物を含有する抽出液の調製方法
昆虫培養細胞から抽出液を調製する場合、本発明者らが提案する、抽出用液中に懸濁した昆虫培養細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有する方法によって調製するのが好ましい。ここで「急激に凍結」とは、凍結処理に付してから１０秒以下、好ましくは２秒以下にて、昆虫培養細胞を凍結させることを指す。また昆虫培養細胞を急激に凍結させる温度としては、通常−８０℃以下であり、好ましくは−１５０℃以下である。上記昆虫培養細胞の急激な凍結は、たとえば、液体窒素や液体ヘリウムなどの不活性ガスを使用することなどによって実現できるが、入手が容易であり安価な液体窒素を用いて行うのが好ましい。
かかる方法によって昆虫培養細胞からの抽出を行うことにより、緩和な状態で細胞の破砕を行うことができ、無細胞系タンパク質合成に必須な成分を破壊することなく細胞外に取り出すことができ、従来よりもタンパク質の合成量の高い無細胞系タンパク質合成用抽出液を容易に調製することができる。さらに、使用器具などからのＲＮａｓｅなどの混入も防ぐことができ、また、界面活性剤などの試薬を用いた細胞破砕法の場合に懸念される翻訳反応を阻害するような物質の持込みもない。

上記本発明者らが提案する抽出液の調製方法では、上述した急激に凍結させる工程を少なくとも含有しているならば、その他の工程について特に制限はない。たとえば、乳鉢中で乳棒を用いてすり潰す方法、ダウンスホモジナイザーを用いる方法、ガラスビーズを用いる方法など、大腸菌や小麦胚芽などから無細胞系タンパク質合成用抽出液を得る際に従来行われていた種々の手法にて昆虫培養細胞を破砕し、抽出を行えばよい。中でも、上記昆虫培養細胞を急激に凍結させた後、解凍し、遠心分離することによって昆虫培養細胞を破砕するのが好ましい。

上記急激に凍結した昆虫培養細胞を、解凍した後、遠心分離する場合、解凍は、たとえば−１０℃〜２０℃の水浴または氷水浴中での解凍、室温（２５℃）にての放置などによって実現できるが、タンパク質合成に必須な成分の失活を防止し、タンパク質合成能の低下を確実に防ぐことから、０℃〜２０℃（特には、４℃〜１０℃）の水浴または氷水浴中で解凍を行うのが好ましい。解凍した昆虫培養細胞の遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行えばよい。かかる遠心分離後の上清には、目的とする昆虫培養細胞の抽出物が含有される。

細胞破砕後、上記遠心分離後の上清（上清Ｂ１）をそのまま抽出液としてもよいし、上清Ｂ１をさらに遠心分離（１０，０００×ｇ〜１００，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜１２０分間）にかけて、得られた上清（上清Ｂ２）を抽出液としてもよい。さらに、上記上清Ｂ１または上清Ｂ２をゲル濾過し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分（吸収の大きな画分）を分取して、これを抽出液としてもよい。この場合、具体的には以下の手順にて行う。
まず、上清Ｂ１または上清Ｂ２についてゲル濾過を行うが、ゲル濾過は、たとえば脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）を好適に使用することができ、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記ゲル濾過用緩衝液にて溶出する、というような条件にて行えばよい。上記ゲル濾過用緩衝液としては、従来公知の適宜の組成のものを特に制限なく使用することができ、たとえば、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）、５０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦを含有するゲル濾過用緩衝液を用いることができる。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
続いて、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャム バイオサイエンス社製）などの機器を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分（吸収の大きな画分）をゲル濾過後の濾液より分取して、これを抽出液とする。

また上記ゲル濾過で得られた吸収の大きな画分を、さらに遠心分離にかけて、得られた上清（上清Ｂ３）を抽出液とするようにしてもよい。このゲル濾過後の遠心分離は、翻訳反応を阻害する不溶性の成分を除去するという理由から、３０，０００×ｇ〜１００，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間の条件で行うのが、好ましい。

なお、本発明の調製方法に供する昆虫培養細胞は、培養に用いる培地の翻訳反応液への持込みを避けるため、上記急激な凍結を行う前に、プロテアーゼインヒビターおよびグリセロールを含有しない以外は、上述した昆虫培養細胞用の好適な抽出用液と同じ組成の洗浄液にて予め洗浄しておくのが好ましい。洗浄液での洗浄は、昆虫培養細胞に洗浄液を添加し、これを遠心分離（たとえば、７００×ｇ、１０分間、４℃という条件）することによって行う。洗浄に用いる洗浄液の量は、培地を完全に洗い流すという理由から、湿重量１ｇの昆虫培養細胞に対し５ｍＬ〜１００ｍＬであるのが好ましく、１０ｍＬ〜５０ｍＬであるのがより好ましい。洗浄回数は、１回〜５回行うのが好ましく、２回〜４回行うのがより好ましい。

本発明の抽出液中における節足動物由来の抽出物の含有量に特に制限はないが、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬであるのが好ましく、中でも１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、無細胞系タンパク質合成に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを越えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しづらい虞があるためである。
なお上記範囲の量の節足動物由来の抽出物を含有する抽出液は、抽出液のタンパク質濃度測定を利用して、調製できる。当該タンパク質濃度測定は、当分野において通常行われているように、たとえばＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する、といった手順によって行う。分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用する。

無細胞系タンパク質合成方法においては、たとえば上述したようにして調製された抽出液を用いて、翻訳系用反応液または転写／翻訳系用反応液を調製する。翻訳系用反応液、転写／翻訳系用反応液のいずれの場合であっても、上記抽出液を１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するように調製されたものであるのが好ましい。すなわち、反応液の全体において、節足動物由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
以下、節足動物由来の抽出物を含有する抽出液を用いた場合における（１）翻訳系用反応液、（２）転写／翻訳系用反応液について、それぞれ説明する。

（１）翻訳系用反応液
翻訳系用反応液は、上記節足動物由来抽出液を除く成分として、翻訳鋳型、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましく、本発明の目的である、タンパク質の翻訳後修飾の為には、ミクロソーム膜、より具体的には哺乳動物由来のミクロソーム膜を含む。かかる翻訳系用反応液を使用して翻訳系合成反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。

翻訳系用反応液に含める翻訳鋳型（ｍＲＮＡ）は、その塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならばｍＲＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各ｍＲＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。ｍＲＮＡは、従来公知の適宜の方法にて鋳型ＤＮＡ（その調製は例えば後述の通り）を転写して調製することができるが、自体公知のインビトロ転写によって鋳型ＤＮＡを転写し、調製するのが好ましい。インビトロ転写は、たとえばＲｉｂｏＭａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）などを利用して行うことができる。ｍＲＮＡは、転写後、自体公知の方法にて精製して単離し、後述するように無細胞系タンパク質合成用の翻訳鋳型として、翻訳系用反応液に適用することができる。

翻訳系用反応液中において、翻訳鋳型は、タンパク質合成の速度の観点から、１μｇ／ｍＬ〜２０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または２０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。

翻訳系用反応液中において、哺乳動物由来のミクロソーム膜は、タンパク質の翻訳後の修飾効率の観点から、２６０ｎｍの吸光度（以降Ａ２６０）で１〜５０（Ａ２６０＝１〜５０）、好ましくは２〜１５（Ａ２６０＝２〜１５）含有される。ミクロソーム膜がＡ２６０で１未満では、翻訳後修飾が充分に行われない傾向にあり、５０を越えるとタンパク質合成自体を顕著に阻害する傾向にあるためである。さらに、翻訳反応液中においてｍＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）と哺乳動物由来のミクロソーム膜濃度（Ａ２６０）との比が１：０．１〜５、好ましくは０．３〜２．３であることがタンパク質の翻訳後修飾効率の観点からいっそう好ましい。
ｍＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）と哺乳動物由来のミクロソーム膜の濃度（Ａ２６０）との比を求める際の哺乳動物由来のミクロソーム膜の純度は、通常Ａ２６０／Ａ２８０＝１．３〜２．０で、好ましくは１．４〜１．８のものである。該比が１：０．１〜５（好ましくは０．３〜２．３）とは、反応液１ｍＬ中にｍＲＮＡが１μｇ存在する場合にミクロソーム膜の濃度がＡ２６０で０．１〜５（好ましくは０．３〜２．３）であることを意味する。

当該ミクロソーム膜は翻訳開始時に反応液中に存在していることが好ましいが、所望により適宜その添加時期を調節してもよい。

哺乳類由来のミクロソーム膜としては、後述する犬膵臓由来ミクロソーム膜のように市販されているものに加え、ＣＯＳ細胞（アフリカミドリザル由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト由来）、Ｌ５１７８Ｙ細胞（マウス由来）、Ｓｈａｙ細胞（ラット由来）などからも調製することができる。
哺乳類由来のミクロソーム膜の調製は、具体的には非特許文献１に記載される方法等公知の手法に基づいて行うことができる。例えば犬膵臓由来のミクロソーム膜はプロメガ社から入手できる。

翻訳系用反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該翻訳系用反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。

翻訳系用反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出用液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該翻訳系用反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。

翻訳系用反応液中におけるＤＴＴは、上述した抽出用液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。

翻訳系用反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。

翻訳系用反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。

翻訳系用反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。

翻訳系用反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。

翻訳系用反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。

翻訳系用反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在する節足動物由来のＲＮａｓｅによって、無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μｌ〜１００Ｕ／μｌ含有されることが好ましく、１Ｕ／μｌ〜１０Ｕ／μｌ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μｌ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μｌを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。

翻訳系用反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。

翻訳系用反応液に含有される緩衝剤としては、上述した抽出用液に用いたものと同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出用液における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。

また翻訳系用反応液は、さらにグリセロールを添加されたものであるのがより好ましい。グリセロールを添加すると、翻訳系合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるという利点があるためである。グリセロールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。

さらに、翻訳系用反応液は、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（以下、「ＥＧＴＡ」ということがある。）を含有するのが好ましい。ＥＧＴＡを含有すると、ＥＧＴＡが抽出液中の金属イオンとキレートを形成することでリボヌクレアーゼ、プロテアーゼなどを不活化させることにより、無細胞系タンパク質合成に必須な成分の分解を阻害することができるためである。該ＥＧＴＡは、上記反応液中において、上記分解阻害能を好適に発揮し得る観点から０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＥＧＴＡが０．０１ｍＭ未満であると必須な成分の分解活性を充分に抑えることができない傾向にあるためであり、また、１０ｍＭを越えるとタンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。

すなわち、翻訳系用反応液としては、節足動物由来抽出物を含有する抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロール、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、１Ｕ／μｌ〜１０Ｕ／μｌのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、１０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの翻訳鋳型、翻訳系反応液中、Ａ２６０で１〜５０の哺乳動物ミクロソーム膜（翻訳鋳型との濃度比は、ｍＲＮＡ（μｇ／ｍＬ）：ミクロソーム膜濃度（Ａ２６０）＝１：０．１〜５、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．１ｍＭ〜５ｍＭのＥＧＴＡを含有するように実現されるのがより好ましい。

上記翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応（翻訳系合成反応）は、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。反応の時間は、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。

（２）転写／翻訳系用反応液
転写／翻訳系用反応液は、上記抽出液を除く成分として、転写鋳型、ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、シチジン５'−三リン酸、ウリジン５'−三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分およびｔＲＮＡを少なくとも含有するのが好ましく、本発明の目的である、タンパク質の翻訳後修飾の為には、ミクロソーム膜、より具体的には哺乳動物由来のミクロソーム膜を含む。かかる転写／翻訳系用反応液を使用して転写／翻訳系合成反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。

なお転写鋳型（鋳型ＤＮＡ）は、プロモーター配列およびタンパク質をコードする構造遺伝子を少なくとも有するものであれば、いかなる塩基配列、塩基数のものであってもよい。構造遺伝子がコードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、生細胞で細胞毒となるタンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよいし、また糖タンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよい。鋳型ＤＮＡにおいて、通常、プロモーター配列は構造遺伝子の５’上流側に配置される。プロモーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列などが挙げられる。
また、本発明の鋳型ＤＮＡは、構造遺伝子の３’下流側にターミネーター配列を有するのが好ましい。上記ターミネーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７ターミネーター配列、ＳＰ６ターミネーター配列、Ｔ３ターミネーター配列などが挙げられる。また、鋳型ＤＮＡは、合成されたｍＲＮＡの安定性などの観点から、構造遺伝子の３’下流側にポリＡ配列を有していてもよい。

当該鋳型ＤＮＡは、（１）予め複数の領域に分割された鋳型ＤＮＡをライゲーションする工程と、（２）ライゲーション後のＤＮＡをＰＣＲによって増幅させる工程とを少なくとも含有する方法によって、合成されたものであってもよい。ここで、領域の数は、一連のライゲーション反応とその後のＰＣＲによってつなぎ合わせて増幅させることが可能な領域は２つであり、さらに別の領域をつなぎ合わせて増幅させるためには、さらに一連のライゲーションとＰＣＲを行わなければならないため、可能な限り少ない領域に分割されたものであるのが好ましい。該領域数は、２個〜５個であるのが好ましく、２個〜３個であるのがより好ましく、２個であるのが特に好ましい。鋳型ＤＮＡは、当該鋳型ＤＮＡにおいて領域内にない塩基配列部分や、各領域において互いに重複する塩基配列部分が増幅されないように、換言すれば、全ての領域をつなぎ合わせると鋳型ＤＮＡとなるように予め分割される。分割された各領域は、プラスミドＤＮＡより制限酵素にて切断し調製したＤＮＡであってもよいし、ＰＣＲによって増幅させたＤＮＡであってもよいし、ＤＮＡ合成機にて合成したＤＮＡであってもよい。

まず、鋳型ＤＮＡを予め分割した領域のうち、互いに隣り合う領域をライゲーションさせる。ライゲーション反応を行う際には、予め、ＤＮＡの末端を、両方のＤＮＡは順方向で連結できるようなかたちに調製しておくとよい。具体的には、つなぎ合わせたい２つのＤＮＡの末端を平滑末端に調製しておく。あるいは、同じ制限酵素で切断した断片としておく。また、片方のＤＮＡの末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化しておき、効率よくライゲーション可能な状態に調製しておくとよい。ライゲーションの際に用いる試薬や反応条件は、当分野にて通常実施されているように行えばよい。たとえば、ＮＥＢ社製Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用い、プロトコルに従い、ＤＮＡ、反応バッファー、Ｑｕｉｃｋ Ｔ４ Ｌｉｇａｓｅを混合し、２５℃にて５分間インキュベーションすればよい。

次に、上記ライゲーション後のＤＮＡをＰＣＲによって増幅させる。ＰＣＲは、市販のＰＣＲ用サーマルサイクラーなど、従来公知の装置を特に制限なく使用して行うことができる。ＰＣＲの条件に特に制限はなく、当分野において通常行われている条件にて行えばよい。例えば、東洋紡績社製ＫＯＤ ｐｌｕｓを用い、そのプロトコルに従えばよい。この際用いるプライマーは、増幅させたいＤＮＡの端部の配列をもとに作製したセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いる。これにより、ライゲーションにより多種類のつなぎ合わされたＤＮＡが生じるが、ＰＣＲによって所望のＤＮＡのみが増幅される。
さらに、鋳型ＤＮＡが３つ以上の領域に分かれる場合は、上述のＰＣＲで増幅したＤＮＡとさらにつなぎ合わせたいＤＮＡを用い、ライゲーション、ＰＣＲを行い、鋳型ＤＮＡを調製する。

また、本発明における鋳型ＤＮＡは、翻訳反応促進活性を有する配列（以下、「翻訳反応促進配列」ということがある。）をさらに有するのが好ましい。ここで「翻訳反応を促進」とは、この翻訳反応促進配列を有する鋳型ＤＮＡを使用して無細胞系タンパク質合成反応を行うことで、この翻訳反応促進配列を有しない鋳型ＤＮＡを使用して無細胞系タンパク質合成反応を行った場合と比較して、翻訳効率が１．２倍以上（好適には、２倍以上）に向上される配列を指す。

かかる翻訳反応促進活性配列としては、上記のような翻訳反応促進活性を有する公知の配列を適宜使用することができ、特に制限されるものではない。翻訳反応促進活性配列の具体的な例としては、カイコまたはバキュロウイルスにおける５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）として公知の塩基配列である。具体的には、カイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、カイコのセリシン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、ＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、ＢｍＣＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｎ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、ＥｓＣＰＶ（Ｅｕｘｏａ ｓｃａｎｄｅｓ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｎ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、ＨｃＮＰＶ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、ＣｒＮＰＶ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｒｏｓａｃｅａｎａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、ＥｏＮＰＶ（Ｅｃｏｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、ＭｎＮＰＶ（Ｍａｌａｃｏｓｍａ ｎｅｕｓｔｒｉａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、ＳｆＮＰＶ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列、ＷｓＮＰＶ（Ｗｉｓｅａｎａ ｓｉｇｎａｔａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列等が挙げられる。これらの翻訳反応促進配列は、従来公知のいかなる方法により得られてもよい。たとえば、公知のＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。

上記翻訳反応促進配列は、鋳型ＤＮＡにおいて、上記構造遺伝子の５’上流側に１または複数個組み込まれてなるのが好ましい。翻訳反応促進配列は、構造遺伝子の５’上流側において、順方向（５’→３’）に組み込まれてもよいし、逆方向（３’→５’）に組み込まれてもよい。また、２個以上の翻訳反応促進配列が組み込まれたものであってもよく、その場合、組み込まれた翻訳反応促進配列は同じものであっても互いに異なるものであってもよい。また、２個以上の翻訳反応促進配列が組み込まれた場合、全ての翻訳反応促進配列が同じ方向に組み込まれていなくともよい。翻訳反応促進配列は、構造遺伝子の５’上流側において、構造遺伝子に隣り合うように組み込まれてもよいし、構造遺伝子との間に１塩基以上の塩基配列を介在させた状態で組み込まれてもよい。

転写鋳型は、転写／翻訳系用反応液中において、０．１μｇ／ｍＬ〜８０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、３μｇ／ｍＬ〜６００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。転写鋳型が０．１μｇ／ｍＬ未満または８０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。

転写／翻訳系用反応液中において、哺乳動物由来のミクロソーム膜は、タンパク質の翻訳後の修飾効率の観点から、Ａ２６０で１〜５０（Ａ２６０＝１〜５０）、好ましくは２〜１５（Ａ２６０＝２〜１５）含有される。ミクロソーム膜がＡ２６０で１未満では、翻訳後修飾が充分に行なわれない傾向にあり、５０を越えるとタンパク質合成自体を顕著に阻害する傾向にあるためである。さらに、翻訳反応液中においてｍＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）と哺乳動物由来のミクロソーム膜の濃度（Ａ２６０）比が１：０．１〜５、好ましくは０．３〜２．３であることがタンパク質の翻訳後の修飾効率の観点からいっそう好ましい。

当該ミクロソーム膜は、転写／翻訳反応の開始時に反応液中に存在してもいいし翻訳開始時点に添加してもよい。所望により適宜その添加時期を調節し得る。

哺乳類由来ミクロソーム膜としては、上記翻訳系用反応液で用いたものと同様なものが、同様な調製方法にて利用できる。

転写／翻訳系用反応液に用いるＲＮＡポリメラーゼは、転写鋳型が有するプロモーター配列に応じて適宜選択することができる。たとえば、転写鋳型がＴ７プロモーター配列を有している場合は、その配列を認識するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。また転写鋳型が、ＳＰ６またはＴ３プロモーター配列を有している場合は、それぞれ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。
ＲＮＡポリメラーゼは、ｍＲＮＡ合成の速度およびタンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中に０．０１Ｕ／μｌ〜１００Ｕ／μｌ含有されることが好ましく、０．１Ｕ／μｌ〜１０Ｕ／μｌ含有されることがより好ましい。ＲＮＡポリメラーゼが０．０１Ｕ／μｌ未満であると、ｍＲＮＡの合成量が少なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためであり、またＲＮＡポリメラーゼが１００Ｕ／μｌを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。

転写／翻訳系用反応液中におけるＡＴＰは、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。

転写／翻訳系用反応液中におけるＧＴＰは、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。

転写／翻訳系用反応液中におけるシチジン５'−三リン酸（以下、「ＣＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＣＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。

転写／翻訳系用反応液中におけるウリジン５'−三リン酸（以下、「ＵＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＵＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。

転写／翻訳系用反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。

転写／翻訳系用反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。

転写／翻訳系用反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
タンパク質合成の速度の観点からは、転写／翻訳系用反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜５００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。

転写／翻訳系用反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。ｔＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点からは、転写／翻訳系用反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。

転写／翻訳系用反応液は、さらに、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅインヒビター、スペルミジンおよび緩衝剤を含有するのが好ましい。

転写／翻訳系用反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該転写／翻訳系用反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。

転写／翻訳系用反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出用液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該転写／翻訳系用反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。

転写／翻訳系用反応液中におけるＤＴＴは、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜２０ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１００ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。

転写／翻訳系用反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在する節足動物由来のＲＮａｓｅによって、転写／翻訳系合成反応の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で添加されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μｌ〜１００Ｕ／μｌ含有されることが好ましく、１Ｕ／μｌ〜１０Ｕ／μｌ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μｌ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μｌを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。

上記スペルミジンは、転写における伸張反応を促進する目的で添加されるものであり、転写／翻訳系用反応液中において０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることが好ましく、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることがより好ましい。スペルミジンが０．０１ｍＭ未満であると、ｍＲＮＡの合成速度が低下し生成するｍＲＮＡの量が少なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下するというような傾向にあるためであり、またスペルミジンが１００ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。

転写／翻訳系用反応液に含有される緩衝剤としては、上述した抽出用液に用いたものと同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出用液における緩衝剤の場合と同様の観点から、１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、５ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。

また転写／翻訳系用反応液は、さらにグリセロールを添加されたものであるのがより好ましい。グリセロールを添加すると、転写／翻訳系合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるという利点があるためである。グリセロールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。

すなわち、転写／翻訳系用反応液としては、当該抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、さらに３μｇ／ｍＬ〜６００μｇ／ｍＬの転写鋳型、転写／翻訳系用反応液中Ａ２６０で１〜５０の哺乳動物ミクロソーム膜（最終的に翻訳鋳型との濃度比が、ｍＲＮＡ（μｇ／ｍＬ）：ミクロソーム膜濃度（Ａ２６０）＝１：０．１〜５となるような量）、０．１Ｕ／μｌ〜１０Ｕ／μｌのＲＮＡポリメラーゼ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＣＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＵＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜５００μＭのアミノ酸成分、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡを含有するのが好ましい。さらには、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜２０ｍＭのＤＴＴ、１Ｕ／μｌ〜１０Ｕ／μｌのＲＮａｓｅインヒビター、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭのスペルミジン、５ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロールを含有するように実現されるのが好ましい。

上記転写／翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応（転写／翻訳系合成反応）についても、上記翻訳系合成反応の場合と同様、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行えばよい。転写工程の反応温度は、通常、１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲内である。転写工程の反応温度が１０℃未満であると、転写の速度が低下する傾向にあり、また転写工程の反応温度が６０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。また翻訳工程の温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。翻訳工程の反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また翻訳工程の反応温度が４０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。
転写／翻訳系合成反応では、転写、翻訳工程を連続して実施し得るという観点から両工程に好適な２０℃〜３０℃の範囲で反応を行うことが特に好ましい。反応の時間は、全工程あわせて、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。

上記翻訳系用反応液、転写／翻訳系用反応液を使用して合成できるタンパク質に特に制限はないが、本発明の目的を鑑みるに、翻訳後の修飾が行なわれるタンパク質であることが好ましい。合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。翻訳後の修飾が適切に行われたか否かは、合成されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、フルオログラフィーに供与し、ミクロソーム膜存在下、非存在下での分子量の変化やプロテアーゼ処理に対する感受性から判定し得る。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。

（実施例１）
シグナルペプチドの切断の検出
１．節足動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製
（カイコ抽出液の調製）
５齢期４日目のカイコ幼虫１５匹よりハサミ、ピンセット、メス、スパーテルを使用して、後部絹糸腺３．０７ｇを摘出し、これを−８０℃で凍結させた乳鉢ですり潰し、下記組成の抽出用液を用いて、抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３０，０００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。
遠心分離後、上清のみを単離し、再び３０，０００×ｇ、１０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離した。脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）に、２０％グリセロールを含む抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上清を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。
ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取して、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。
得られた抽出液について、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用い、タンパク質濃度を測定した。まず反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとして、ＢＳＡを用い、検量線を作成した。
抽出液中におけるカイコ幼虫の後部絹糸腺の含有量は、タンパク質濃度で１７．５ｍｇ／ｍＬであった。

（昆虫培養細胞抽出液の調製）
（１）Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ由来抽出液
細胞数２．１×１０^７個の昆虫培養細胞Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、Ｌ−グルタミンを添加したＥｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を入れた培養フラスコ（６００ｃｍ^２）内で２７℃で６日間培養した。結果、細胞数１．０×１０^８個、湿重量１．２１ｇとなった。
次いで上記培養した昆虫培養細胞を集め、下記組成の洗浄液で３回洗浄（７００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離）した。
〔洗浄液の組成〕
・６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・２００ｍＭ 酢酸カリウム
・４ｍＭ 酢酸マグネシウム
・４ｍＭ ＤＴＴ
洗浄後の昆虫培養細胞に、下記組成の抽出用液を１ｍＬ加え、懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・２０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・１ｍＭ ＤＴＴ
・１ｍＭ ＰＭＳＦ
この懸濁液を液体窒素中にて急速に凍結させた。充分に凍結させた後、約４℃の氷水浴中で解凍した。完全に解凍した後、３０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）し、上清を回収した。回収した上清１．５ｍＬを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
・１ｍＭ ＰＭＳＦ
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液４ｍＬにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分を回収し、昆虫培養細胞抽出液とした。

（２）Ｓｆ２１由来抽出液
同様にして、細胞数６．１×１０^５個の昆虫培養細胞Ｓｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、Ｓｆ−９００ＩＩ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を入れた培養フラスコ（６００ｃｍ^２）内で２７℃で６日間培養し、得られた細胞数１．０×１０^８個、湿重量３ｇの細胞を用いて昆虫培養細胞抽出液を調製した。

次いで、上記培養した昆虫細胞を集め、下記組成の洗浄液にて３回洗浄（７００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離）した後、３ｍＬの下記組成の抽出用液中に懸濁した。
〔洗浄液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
〔抽出用液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・２０％（ｖ／ｖ） グリセロール
・１ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
この細胞懸濁液を液体窒素中にて急速に凍結させた。充分に凍結させた後、約４℃の氷水浴中で解凍した。完全に解凍した後、３００００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）し、上清１Ａを回収した。回収した上清１Ａをさらに４５０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）して上清１Ｂを回収した。回収した上清１Ｂを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャム バイオサイエンス社製）に２.５ｍＬアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液３ｍＬにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分を回収し、これを昆虫細胞抽出液とした。

２．ｍＲＮＡ
プロメガ社の犬膵臓ミクロソーム膜に付属しているβ−ラクタマーゼｍＲＮＡ（１μｇ／μｌ）を用いた。

３．翻訳反応（タンパク質合成）およびシグナルペプチド切断の検出
３−１：材料
［Ａ］翻訳系用反応液の組成（ミクロソーム膜不含）（１０μｌ）
５０（ｖ／ｖ）％ 節足動物由来抽出液 ５．０μｌ
１μｇ／μｌ ｍＲＮＡ ０．５μｌ
ｐｒｅ ｍｉｘ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２．５μｌ
１ｍＭ アミノ酸混合物（ロイシンを除く） ０．４μｌ
１ｍＭ ［^３Ｈ］ロイシン（１ｍＣｉ／ｍＬ） １．０μｌ
ＤＥＰＣ（diethyl pyrocarbonate）処理水 ０．６μｌ
［Ｂ］翻訳系用反応液の組成（ミクロソーム膜含有）（１０μｌ）
５０（ｖ／ｖ）％ 節足動物由来抽出液 ５．０μｌ
１μｇ／μｌ ｍＲＮＡ ０．５μｌ
ｐｒｅ ｍｉｘ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２．５μｌ
１ｍＭ アミノ酸混合物（ロイシンを除く） ０．４μｌ
１ｍＭ ［^３Ｈ］ロイシン（１ｍＣｉ／ｍＬ） １．０μｌ
犬膵臓ミクロソーム膜（Ａ２６０＝５０） ０．４μｌ
ＤＥＰＣ（diethyl pyrocarbonate）処理水 ０．２μｌ

アミノ酸混合物および犬膵臓ミクロソーム膜はプロメガ社製のものを、［^３Ｈ］ロイシンはアマシャム バイオサイエンス社製のものをそれぞれ用いた。
ｐｒｅ ｍｉｘ ｓｏｌｕｔｉｏｎは以下に示す成分から構成されている（各成分の濃度は翻訳系用反応液中の最終濃度である）。
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．２５ｍＭ ＧＴＰ
・２０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
・１Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター(宝酒造社製)、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。

３−２：反応
上記［Ａ］および［Ｂ］に示した組成の反応混合液（［Ａ］は１サンプル、［Ｂ］は２サンプル）を調製し、２６℃で４時間反応させた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。
［Ａ］、［Ｂ］それぞれ１サンプルについては、反応後、２μｌＰＭＳＦ（４０ｍＭ）、２０μｌ滅菌蒸留水、１５μｌＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（×４）を加え、沸騰浴中で３分間処理してＳＤＳ化した。
［Ｂ］の１サンプルについては、反応後、プロテアーゼＫ（１ｍｇ／ｍＬ；ストラタジーン社製）を１μｌ加え、穏やかに撹拌後氷上で１時間処理した後、前述のサンプルと同様の方法によりＳＤＳ化した。
これらの３サンプル各２５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、Ａｍｐｌｉｆｙ（アマシャム バイオサイエンス社製）で処理した後、乾燥してフルオログラフィーに供した。

４．結果
節足動物由来の抽出液としてＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ抽出液（ＨＦＬ）を用いた場合の結果を、参考として抽出液としてウサギ網状赤血球溶解液（ＲＲＬ）を用いた場合の結果とともに図１に示す。ＲＲＬを用いた反応については参考例１に後述する。
Ｎ−末端にシグナルペプチドを有するβ−ラクタマーゼのｍＲＮＡを、犬膵臓ミクロソーム膜非存在下でＲＲＬを用いて翻訳させると図１に示すように３２ｋＤａの前駆体タンパク質が合成された。犬膵臓ミクロソーム膜存在下で同様の反応を行うと、シグナルペプチドが切断された２９ｋＤａのタンパク質が検出され、さらにこの２９ｋＤａのタンパク質はプロテアーゼＫ処理により切断を生じなかった。これらの結果から、ＲＲＬを用いた無細胞タンパク質合成系においてβ−ラクタマーゼは、犬膵臓ミクロソーム膜存在下でタンパク質合成に伴いミクロソーム膜を通過し、これに伴いシグナルペプチドの切断が生ずることが確認された。
ＨＦＬを用いた無細胞タンパク質合成系においても、犬膵臓ミクロソーム膜非存在下で３２ｋＤａ、存在下で２９ｋＤａとＲＲＬを用いた場合と全く同様のタンパク質バンドが検出された。またＲＲＬを用いた場合と同様、プロテアーゼＫ処理による２９ｋＤａタンパク質の切断は生じなかった。
以上の結果より、ＨＦＬを用いた無細胞タンパク質合成系においても、ＲＲＬを用いた無細胞タンパク質合成系の場合と同様、犬膵臓ミクロソーム膜存在下でシグナルペプチドの切断が生じることが示された。

（参考例１）
ＲＲＬを用いた翻訳反応（タンパク質合成）およびシグナルペプチド切断の検出は以下のようにして行った。
以下の［Ａ’］および［Ｂ’］に示した組成の反応混合液（［Ａ’］は１サンプル、［Ｂ’］は２サンプル）を調製し、３０℃で９０分間反応させた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。
［Ａ’］、［Ｂ’］それぞれ１サンプルについては、反応後、２μｌＰＭＳＦ（４０ｍＭ）、２０μｌ滅菌蒸留水、１５μｌＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（×４）を加え、沸騰浴中で３分間処理してＳＤＳ化した。
［Ｂ’］の１サンプルについては、反応後、プロテアーゼＫ（１ｍｇ／ｍＬ；ストラタジーン社製）を１μｌ加え、穏やかに撹拌後氷上で１時間処理した後、前述のサンプルと同様の方法によりＳＤＳ化した。
これらの３サンプル各２５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、Ａｍｐｌｉｆｙ（アマシャム バイオサイエンス社製）で処理した後、乾燥してフルオログラフィーに供した。
［Ａ’］翻訳系用反応液の組成（ミクロソーム膜不含）（１０μｌ）
５０（ｖ／ｖ）％ ＲＲＬ ７．０μｌ
１μｇ／μｌ ｍＲＮＡ ０．５μｌ
１ｍＭ アミノ酸混合物（ロイシンを除く） ０．２μｌ
１ｍＭ ［^３Ｈ］ロイシン（１ｍＣｉ／ｍＬ） １．０μｌ
ＤＥＰＣ（diethyl pyrocarbonate）処理水 １．３μｌ
［Ｂ’］翻訳系用反応液の組成（ミクロソーム膜含有）（１０μｌ）
５０（ｖ／ｖ）％ ＲＲＬ ７．０μｌ
１μｇ／μｌ ｍＲＮＡ ０．５μｌ
１ｍＭ アミノ酸混合物（ロイシンを除く） ０．２μｌ
１ｍＭ ［^３Ｈ］ロイシン（１ｍＣｉ／ｍＬ） １．０μｌ
犬膵臓ミクロソーム膜（Ａ２６０＝５０） ０．５μｌ
ＤＥＰＣ（diethyl pyrocarbonate）処理水 ０．８μｌ
ウサギ網状赤血球溶解液はプロメガ社製のものを用いた。それ以外は上記したものと同様なものを用いた。

（実施例２）
Ｎ−グリコシル化の検出（１）
翻訳後修飾の中でも糖鎖修飾（Ｎ−グリコシル化）をモデルとしてとらえ、糖鎖修飾が生じることが既に判明しているｐｒｏ−ＴＮＦ−ＧＬＣ（タンパク質の成熟領域内にＮ−グリコシル化部位を人為的に導入した変異型のヒト抗腫瘍因子）を用い、この糖タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏの合成を試みた。
（１）発現プラスミドの調製
また、用いるポリヘドリン５’−ＵＴＲの塩基配列を配列番号１に、ｐｒｏ−ＴＮＦ−ＧＬＣ遺伝子の全塩基配列を配列番号２に示した。
発現プラスミドの構築は、ｐＴ_ＮＴベクター（プロメガ社製）を鋳型として、配列番号３および４に塩基配列を示した末端にＢａｍＨＩサイト付加したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＢａｍＨＩ消化後にセルフライゲーションを行うことによって、マルチクローニングサイトのＸｈｏＩサイトの前にＢａｍＨＩサイトを導入した。更に配列番号５および６に塩基配列を示したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＨｉｎｄＩＩＩ消化後にセルフライゲーションを行うことによって、ｐＴ_ＮＴベクターにもともと存在しているＴ７ターミネーター配列直後のＢａｍＨＩサイトをＨｉｎｄＩＩＩサイトに変更した。次に、ＰＣＲによって、ＢａｍＨＩサイトからＴ７プロモーターまでを増幅し、この間に前述したポリヘドリン５’−ＵＴＲのセンス鎖、アンチセンス鎖を合成し、アニーリングさせたものをインサートとしてライゲーションさせることで改変型ｐＴ_ＮＴベクターを構築した。アニーリングのインサート調製方法は、以下のように行った。合成したセンス鎖、アンチセンス鎖をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）によって５’末端リン酸化を行った。反応後、センス鎖とアンチセンス鎖を混合し、９５℃、５分間熱処理した。これを室温になるまで静置し、アニーリングを行った。エタノール沈殿により精製した後、水に溶解させた。ＳｉｇｍａＳｐｉｎ Ｐｏｓｔ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ（シグマ社製）によって、過剰のＡＴＰを除いた後、再度エタノール沈殿により精製した。
続いて、この改変型ｐＴ_ＮＴベクターをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイトにｐｒｏ−ＴＮＦＧＬＣｃＤＮＡを導入したプラスミドを同じくＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ消化して得られた約０．７ＫｂのＤＮＡ断片（ｐｒｏ−ＴＮＦ−ＧＬＣ ｃＤＮＡ）をインサートとしてライゲーションさせることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏ−ＴＮＦ−ＧＬＣ遺伝子転写用プラスミド−Ｉを構築した。
全てのＰＣＲの条件は、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて９６℃２分で鋳型ＤＮＡを変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃５分のサイクル反応を３０回行った。
構築したプラスミドの塩基配列は、ＤＮＡ２５０ｎｇを鋳型として、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＢＩ社製）を用いてＰＣＲ（９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分、２５サイクル）を行い、反応液をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ社製）で解析した。
全てのライゲーションサンプルは、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてライゲーションを行った後、大腸菌ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に形質転換し、形質転換後の大腸菌からアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡ塩基配列の解析を行った。

（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応およびｍＲＮＡの精製
転写用プラスミド−ＩをＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。得られたＤＮＡ１μｇを鋳型として、ＲｉｂｏＭａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）を用いて、２０μｌスケールで３７℃４時間、ｍＲＮＡ合成を行った。反応後、１ＵのＲＱ１ ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を添加し、３７℃１５分間インキュベートし、鋳型ＤＮＡを消化した。フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１００μｌの滅菌水に溶解し、Ｎｉｃｋ ｃｏｌｕｍｎ（アマシャム社製）で精製した後、再度エタノール沈殿を行い、最終的にＡ２６０／Ａ２８０＝１．８〜２．０、ＲＮＡ濃度が２ｍｇ／ｍＬとなるように滅菌水に溶解した。このようにして調製したｍＲＮＡは無細胞系タンパク質合成にそのまま使用した。
転写用プラスミド−Ｉから転写したものをｍＲＮＡ−Ｉ（ｐｒｏ−ＴＮＦ ＧＬＣ ｍＲＮＡ−Ｉ）とした。

（３）カイコ、Ｈｉｇｈ ＦｉｖｅおよびＳｆ２１抽出液による無細胞系タンパク質合成
ｐｒｏ−ＴＮＦ ＧＬＣ ｍＲＮＡ−Ｉおよび種々の濃度で犬膵臓ミクロソーム膜（プロメガ社製）を用いて、節足動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる無細胞系タンパク質合成を行った。抽出液としては、実施例１で調製した節足動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液（カイコ抽出液および昆虫培養細胞（Ｈｉｇｈ ＦｉｖｅおよびＳｆ２１））抽出液を用いた。

（翻訳系用反応液の組成）
ここで示す各成分の濃度は、反応液中の最終濃度である。
カイコ抽出液の場合
・犬膵臓ミクロソーム膜（翻訳系反応液１μｌ中Ａ２６０＝０〜５０）
・５０（ｖ／ｖ）％節足動物由来（カイコ由来）抽出液
・１６０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ
・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１．５ｍＭ 酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％グリセロール
・０．７５ｍＭ ＡＴＰ
・０．５ｍＭ ＧＴＰ
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
・２５ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・１００μＭ アミノ酸（２０種）
・２Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅインヒビター
・１００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ

昆虫培養細胞（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）抽出液の場合
・犬膵臓ミクロソーム膜（翻訳系反応液１μｌ中Ａ２６０＝０〜５０）
・５０（ｖ／ｖ）％節足動物由来（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ由来）抽出液
・３２０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％グリセロール
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．２５ｍＭ ＧＴＰ
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
・２０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・８０μＭ アミノ酸（２０種）
・１Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ

昆虫培養細胞（Ｓｆ２１）抽出液の場合
・犬膵臓ミクロソーム膜（翻訳系反応液１μｌ中Ａ２６０＝０〜５０）
・５０（ｖ／ｖ）％節足動物由来（Ｓｆ２１由来）抽出液
・３２０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１．５ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％グリセロール
・０．２５ｍＭ ＡＴＰ
・０．１ｍＭ ＧＴＰ
・０．１ｍＭ ＥＧＴＡ
・２０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・８０μＭ アミノ酸（２０種）
・１Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ

上記組成の反応混合液を調製し、２５℃で６時間反応させた。反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。

（４）（３）で合成した翻訳反応産物の脱糖鎖
上記（３）で調製したＮ−グリコシル化タンパク質（ｐｒｏ−ＴＮＦ ＧＬＣ）が糖鎖修飾された糖タンパク質であることを確認するために、Ｎ型糖鎖分解酵素で脱糖鎖化を行った。Ｎ型糖鎖分解酵素としてＧｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＦ（Ｔａｋａｒａ社製）を用い、これを翻訳反応終了後の反応液１０μｌあたり１μｌ添加し、２５℃で２時間反応させた。

（５）Ｎ−グリコシル化タンパク質の検出
Ｎ−グリコシル化タンパク質の検出は、抗ＴＮＦ抗体（Ｒ＆Ｄ社製）を用いたウェスタンブロット法とＥＣＬ−ｐｌｕｓ（アマシャム バイオサイエンス社製）による化学発光により行った。すなわち、翻訳反応および脱糖鎖反応終了後、ＳＤＳ化のため等量の×２ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｎ．（Ｗａｋｏ社製）を加えて９５℃、３分間熱処理を行いＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後ＰＶＤＦ膜にタンパク質の転写を行った。転写後の膜は、３％ゼラチンを含むＴＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）で室温で穏やかに振とうし、ブロッキング処理を行った。ブロッキング後ＴＴＢＳで１０分間振とうして膜を洗浄した。１／２０００量の抗ＴＮＦ抗体および１％ゼラチンを含むＴＴＢＳで穏やかに２時間〜１２時間反応させた。膜をＴＣＢＳ（２０ｍＭ ｃｉｔｒａｔｅ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０，ｐＨ５．５）で５分間×２回、振とうして洗浄した。膜を１％ゼラチンを含むＴＣＢＳ １００ｍＬあたり３３μｌのＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）を加えて２時間穏やかに振とうさせて反応させた。ＴＴＢＳで１０分間振とうして洗浄後、ＥＣＬ−ｐｌｕｓを用いて化学発光を行い、Ｘ線フィルムに露光後現像した。

（６）ウェスタンブロットの結果
上記方法により検出したウェスタンブロットの結果を図２に示した。
図２において、カイコ後部絹糸腺由来抽出液（ＢＭＬ）、昆虫培養細胞Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ抽出液（ＨＦＬ）、昆虫培養細胞Ｓｆ２１細胞抽出液（Ｓｆ２１Ｌ）を用いて犬膵臓ミクロソーム膜（ＣＭＭ、プロメガ社製）存在下で翻訳反応を行った結果を示した。
ＢＭＬ、ＨＦＬおよびＳｆ２１Ｌの全ての抽出液において、犬膵臓ミクロソーム膜を添加することによりＮ−グリコシル化が生じることが判明した。またこのシフトバンドはＧｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＦ消化により顕著に減少したことから、Ｎ型糖鎖付加タンパク質であることが確認できた。

（実施例３）
Ｎ−グリコシル化の検出（２）
１．ｍＲＮＡ
ｐＴ_ＮＴベクター（プロメガ社製）にサブクローニングしたグリコシル化ＴＮＦ ｃＤＮＡ（エンハンサー配列としてｐＴ_ＮＴベクター由来のウサギβ−グロブリンリーダー配列を利用）を鋳型とし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてｐｏｌｙ−Ａ ｔａｉｌが付加されｃａｐ化されていないグリコシル化ＴＮＦ ｍＲＮＡは（３μｇ／μｌ）を作製し用いた。

２．翻訳反応（タンパク質合成）およびＮ−グリコシル化の検出
２−１：材料
ｍＲＮＡ以外の各成分の詳細は実施例１と同様である。
［Ａ］翻訳系用反応液の組成（ミクロソーム膜不含）（２０μｌ）
５０（ｖ／ｖ）％ 節足動物由来抽出液 １０．０μｌ
３μｇ／μｌ ｍＲＮＡ １．０μｌ
ｐｒｅ ｍｉｘ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５．０μｌ
１ｍＭ アミノ酸混合物（ロイシンを除く） ０．８μｌ
１ｍＭ ［^３Ｈ］ロイシン（１ｍＣｉ／ｍＬ） ２．０μｌ
ＤＥＰＣ（diethyl pyrocarbonate）処理水 １．２μｌ
［Ｂ］翻訳系用反応液の組成（ミクロソーム膜含有）（２０μｌ）
５０（ｖ／ｖ）％ 節足動物由来抽出液 １０．０μｌ
３μｇ／μｌ ｍＲＮＡ １．０μｌ
ｐｒｅ ｍｉｘ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５．０μｌ
１ｍＭ アミノ酸混合物（ロイシンを除く） ０．８μｌ
１ｍＭ ［^３Ｈ］ロイシン（１ｍＣｉ／ｍＬ） ２．０μｌ
犬膵臓ミクロソーム膜（Ａ２６０＝５０） ０．８μｌ
ＤＥＰＣ（diethyl pyrocarbonate）処理水 ０．４μｌ

２−２：反応
上記［Ａ］および［Ｂ］に示した組成の反応混合液を調製し、２６℃で４時間反応させた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。
反応後、２μｌ ＰＭＳＦ（４０ｍＭ）、２００μｌ ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ＰＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）、４μｌ抗ＴＮＦ抗体（１ｍｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ社製）を加え、ローテーターを用いて４℃で１時間撹拌した。これに３０μｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ−セファロース（５０％、アマシャム バイオサイエンス社製）を加え、４℃でさらに１時間撹拌した。撹拌後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ−セファロースをＲＩＰＡバッファーで２回、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で１回洗浄した後、３０μｌ ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（×２）を加え、沸騰浴中で３分間処理してＳＤＳ化した。
これらのサンプル各２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、Ａｍｐｌｉｆｙ処理後乾燥してフルオログラフィーに供した。

３．結果
節足動物由来の抽出液としてＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ抽出液（ＨＦＬ）を用いた場合の結果を、参考として抽出液としてウサギ網状赤血球溶解液（ＲＲＬ）を用いた場合の結果とともに図３に示す。ＲＲＬを用いた反応については参考例２に後述する。
成熟領域にＮ−グリコシル化部位を導入したグリコシル化ｐｒｏ−ＴＮＦのｍＲＮＡを犬膵臓ミクロソーム膜非存在下でＲＲＬを用いて翻訳させたところ、図３に示すように２６ｋＤａのｐｒｏ−ＴＮＦが合成された。犬膵臓ミクロソーム膜存在下で同様の反応を行うと、Ｎ−グリコシル化を生じた２９ｋＤａのタンパク質が検出された。これらの結果から、ＲＲＬを用いた無細胞タンパク質合成系において、グリコシル化ｐｒｏ−ＴＮＦは犬膵臓ミクロソーム膜存在下で、タンパク質合成に伴いその成熟領域がミクロソーム膜を通過し、これに伴い成熟領域に導入したＮ−グリコシル化部位が効率の良いＮ−グリコシル化を受けることが確認された。
一方、本発明の態様である、ＨＦＬを用いた無細胞タンパク質合成系においても、犬膵臓ミクロソーム膜非存在下で２６ｋＤａ、存在下で２９ｋＤａとＲＲＬを用いた場合と全く同様のタンパク質バンドが検出された。
以上の結果より、ＨＦＬを用いた無細胞タンパク質合成系においても、ＲＲＬを用いた無細胞タンパク質合成系の場合と同様、犬膵臓ミクロソーム膜存在下でタンパク質のＮ−グリコシル化が生じることが示された。

（参考例２）
ＲＲＬを用いた翻訳反応（タンパク質合成）およびＮ−グリコシル化の検出は以下のようにして行った。
以下の［Ａ’］および［Ｂ’］に示した組成の反応混合液を調製し、３０℃で９０分間反応させた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。
反応後、２μｌ ＰＭＳＦ（４０ｍＭ）、２００μｌ ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ＰＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）、４μｌ抗ＴＮＦ抗体（１ｍｇ／ｍＬ）を加え、ローテーターを用いて４℃で１時間撹拌した。これに３０μｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ−セファロース（５０％）を加え、４℃でさらに１時間撹拌した。撹拌後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ−セファロースをＲＩＰＡバッファーで２回、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で１回洗浄した後、３０μｌ ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（×２）を加え、沸騰浴中で３分間処理してＳＤＳ化した。
これらのサンプル各２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、Ａｍｐｌｉｆｙ処理後乾燥してフルオログラフィーに供した。

［Ａ’］翻訳系用反応液の組成（ミクロソーム膜不含）（２０μｌ）
５０（ｖ／ｖ）％ ＲＲＬ １４．０μｌ
３μｇ／μｌ ｍＲＮＡ １．０μｌ
１ｍＭ アミノ酸混合物（ロイシンを除く） ０．４μｌ
１ｍＭ ［^３Ｈ］ロイシン（１ｍＣｉ／ｍＬ） ２．０μｌ
ＤＥＰＣ（diethyl pyrocarbonate）処理水 ２．６μｌ
［Ｂ’］翻訳系用反応液の組成（ミクロソーム膜含有）（２０μｌ）
５０（ｖ／ｖ）％ ＲＲＬ １４．０μｌ
３μｇ／μｌ ｍＲＮＡ １．０μｌ
１ｍＭ アミノ酸混合物（ロイシンを除く） ０．４μｌ
１ｍＭ ［^３Ｈ］ロイシン（１ｍＣｉ／ｍＬ） ２．０μｌ
犬膵臓ミクロソーム膜（Ａ２６０＝５０） １．０μｌ
ＤＥＰＣ（diethyl pyrocarbonate）処理水 １．６μｌ
ウサギ網状赤血球溶解液はプロメガ社製のものを用いた。それ以外は上記したものと同様なものを用いた。

（実施例４）
Ｎ−グリコシル化の検出（３）
（１）動物培養細胞ＣＨＯの培養
動物培養細胞ＣＨＯを、Ｌ−グルタミンを添加したＣＨＯ ＳＥＲＵＭ−ＦＲＥＥ ＭＥＤＩＵＭ（シグマ社製）にて５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で培養した。培地１ｍＬあたり細胞数５.０×１０^５個のＣＨＯを１２５ｍＬ三角フラスコ内の培地５０ｍＬ中で５％ＣＯ_２雰囲気下で３７℃、１３０ｒｐｍ、８日間懸濁培養を行った結果、細胞数１.０×１０^７個、湿重量０.５ｇとなった。

（２）ミクロソーム膜調製方法
動物培養細胞ＣＨＯからのミクロソーム膜の調製方法は、基本的にＷａｌｔｅｒ，Ｐ．ａｎｄ Ｂｌｏｂｅｌ，Ｇ．（１９８３），Ｅｎｚｙｍｏｌ．９６，８４−９３の方法を基に、ショ糖密度勾配による超遠心分離にて調製した。すなわち、上記（１）で培養した動物培養細胞を集め、下記の抽出用液で１回洗浄（７００×ｇ、４℃、１０分間の遠心条件）した後、培養細胞１ｇあたり４ｍＬの抽出用液中に懸濁した。
［ＣＨＯ抽出用液の組成］
３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１００ｍＭ ＫＯＡｃ、２ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）_２、０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ、２５０ｍＭ シュクロース、２ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ

懸濁後、きつく合せられたダウンスホモジナイザー（Ｄｏｕｎｃｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）を２０回往復することにより、細胞を破砕した。破砕後、１０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離して細胞残渣を取り除き、上清を回収した。この上清からシュクロースの密度勾配による超遠心分離でミクロソーム膜画分を分離した。超遠心分離の際、容器の下から順に１．３Ｍのシュクロースを含む抽出用液と先程回収した上清を１：３の体積比（ｖ／ｖ）で満たした。このサンプルを１４００００×ｇ、４℃、２時間半超遠心分離（ＨＩＴＡＣＨＩ社製超遠心分離機ＣＰ８０ＭＸとスイングローターＰ４０ＳＴを用いた）した。超遠心分離後、上清を全て破棄し、沈殿をスタート時の細胞湿重量１ｇあたり１０μｌの抽出用液で静かに懸濁し、これをミクロソーム膜とした。このミクロソーム膜のＡ２６０／Ａ２８０は１．４〜１．５、Ａ２６０は５０であった。

（３）無細胞系タンパク質合成
（３−１）発現プラスミドの調製
用いるポリヘドリン５’−ＵＴＲの塩基配列を配列番号１に、ｐｒｏ−ＴＮＦ−ＧＬＣ遺伝子の全塩基配列を配列番号２に示した。
発現プラスミドの構築は、ｐＴ_ＮＴベクター（プロメガ社製）を鋳型として、配列番号３および４に塩基配列を示した末端にＢａｍＨＩサイト付加したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＢａｍＨＩ消化後にセルフライゲーションを行うことによって、マルチクローニングサイトのＸｈｏＩサイトの前にＢａｍＨＩサイトを導入した。更に配列番号５および６に塩基配列を示したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＨｉｎｄＩＩＩ消化後にセルフライゲーションを行うことによって、ｐＴ_ＮＴベクターにもともと存在しているＴ７ターミネーター配列直後のＢａｍＨＩサイトをＨｉｎｄＩＩＩサイトに変更した。次に、ＰＣＲによって、ＢａｍＨＩサイトからＴ７プロモーターまでを増幅し、この間に前述したポリヘドリン５’−ＵＴＲのセンス鎖、アンチセンス鎖を合成し、アニーリングさせたものをインサートとしてライゲーションさせることで改変型ｐＴ_ＮＴベクターを構築した。アニーリングのインサート調製方法は、以下のように行った。合成したセンス鎖、アンチセンス鎖をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）によって５’末端リン酸化を行った。反応後、センス鎖とアンチセンス鎖を混合し、９５℃、５分間熱処理した。これを室温になるまで静置し、アニーリングを行った。エタノール沈殿により精製した後、水に溶解させた。ＳｉｇｍａＳｐｉｎ Ｐｏｓｔ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ（シグマ社製）によって、過剰のＡＴＰを除いた後、再度エタノール沈殿により精製した。
続いて、この改変型ｐＴ_ＮＴベクターをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイトにｐｒｏ−ＴＮＦＧＬＣｃＤＮＡを導入したプラスミドを同じくＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ消化して得られた約０．７ＫｂのＤＮＡ断片（ｐｒｏ−ＴＮＦ−ＧＬＣ ｃＤＮＡ）をインサートとしてライゲーションさせることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏ−ＴＮＦ−ＧＬＣ遺伝子転写用プラスミド−Ｉを構築した。
全てのＰＣＲの条件は、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて９６℃２分で鋳型ＤＮＡを変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃５分のサイクル反応を３０回行った。
構築したプラスミドの塩基配列は、ＤＮＡ２５０ｎｇを鋳型として、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＢＩ社製）を用いてＰＣＲ（９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分、２５サイクル）を行い、反応液をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ社製）で解析した。
全てのライゲーションサンプルは、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてライゲーションを行った後、大腸菌ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に形質転換し、形質転換後の大腸菌からアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡ塩基配列の解析を行った。

（３−２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応およびｍＲＮＡの精製
転写用プラスミド−ＩをＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。得られたＤＮＡ１μｇを鋳型として、ＲｉｂｏＭａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）を用いて、２０μｌスケールで３７℃４時間、ｍＲＮＡ合成を行った。反応後、１ＵのＲＱ１ ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を添加し、３７℃１５分間インキュベートし、鋳型ＤＮＡを消化した。フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１００μｌの滅菌水に溶解し、Ｎｉｃｋ ｃｏｌｕｍｎ（アマシャム社製）で精製した後、再度エタノール沈殿を行い、最終的にＡ２６０／Ａ２８０＝１．８〜２．０、ＲＮＡ濃度が２ｍｇ／ｍＬとなるように滅菌水に溶解した。このようにして調製したｍＲＮＡは無細胞系タンパク質合成にそのまま使用した。
転写用プラスミド−Ｉから転写したものをｍＲＮＡ−Ｉ（ｐｒｏ−ＴＮＦ ＧＬＣ ｍＲＮＡ−Ｉ）とした。

（３−３）Ｓｆ２１抽出液による無細胞系タンパク質合成
上記（３−２）で調製したｐｒｏ−ＴＮＦ ＧＬＣ ｍＲＮＡ−Ｉおよび上記（２）で調製したＣＨＯ細胞由来のミクロソーム膜を用いて、無細胞系タンパク質合成用抽出液による無細胞系タンパク質合成を行った。Ｓｆ２１抽出液としては、実施例１で調製した節足動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液（昆虫培養細胞Ｓｆ２１）抽出液を用いた。

（翻訳系用反応液の組成）
ここで示す各成分の濃度は、反応液中の最終濃度である。
・ＣＨＯミクロソーム膜（翻訳系反応液１μｌ中Ａ２６０＝０〜５０）
・５０（ｖ／ｖ）％節足動物由来（Ｓｆ２１由来）抽出液
・３２０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１．５ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％グリセロール
・０．２５ｍＭ ＡＴＰ
・０．１ｍＭ ＧＴＰ
・０．１ｍＭ ＥＧＴＡ
・２０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・８０μＭ アミノ酸（２０種）
・１Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ

上記組成の反応混合液を調製し、２５℃で６時間反応させた。反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。

（４）Ｎ−グリコシル化タンパク質の検出
Ｎ−グリコシル化タンパク質の検出は、抗ＴＮＦ抗体（Ｒ＆Ｄ社製）を用いたウェスタンブロット法とＥＣＬ−ｐｌｕｓ（アマシャム バイオサイエンス社製）による化学発光により行った。すなわち、翻訳反応および脱糖鎖反応終了後、ＳＤＳ化のため等量の×２ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｎ．（Ｗａｋｏ社製）を加えて９５℃、３分間熱処理を行いＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後ＰＶＤＦ膜にタンパク質の転写を行った。転写後の膜は、３％ゼラチンを含むＴＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）で室温で穏やかに振とうし、ブロッキング処理を行った。ブロッキング後ＴＴＢＳで１０分間振とうして膜を洗浄した。１／２０００量の抗ＴＮＦ抗体および１％ゼラチンを含むＴＴＢＳで穏やかに２時間〜１２時間反応させた。膜をＴＣＢＳ（２０ｍＭ ｃｉｔｒａｔｅ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０，ｐＨ５．５）で５分間×２回、振とうして洗浄した。膜を１％ゼラチンを含むＴＣＢＳ １００ｍＬあたり３３μｌのＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）を加えて２時間穏やかに振とうさせて反応させた。ＴＴＢＳで１０分間振とうして洗浄後、ＥＣＬ−ｐｌｕｓを用いて化学発光を行い、Ｘ線フィルムに露光後現像した。

（５）ウェスタンブロットの結果
上記方法により検出したウェスタンブロットの結果を図４に示した。
図４において、昆虫培養細胞Ｓｆ２１細胞抽出液（Ｓｆ２１Ｌ）を用いて犬膵臓ミクロソーム膜（ＣＭＭ、プロメガ社製）とＣＨＯミクロソーム膜（ＣＨＯＭＭ）存在下で翻訳反応を行った結果を示した。
Ｓｆ２１Ｌにおいて、ＣＨＯミクロソーム膜を添加することで犬膵臓ミクロソーム膜と同様にＮ−グリコシル化が生じることが判明した。

節足動物由来の抽出物またはウサギ網状赤血球溶解液を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いて、哺乳動物由来のミクロソーム膜存在下、あるいは非存在下でタンパク質合成を行い、シグナルペプチドが切断されているか否かを調べた結果を示す図である。 節足動物由来の抽出物（カイコ由来、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ由来、Ｓｆ２１由来）を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いて、哺乳動物由来のミクロソーム膜存在下、あるいは非存在下でタンパク質合成を行い、Ｎ−グリコシル化が行われているか否かを調べた結果を示す図である。 節足動物由来の抽出物またはウサギ網状赤血球溶解液を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いて、哺乳動物由来のミクロソーム膜存在下、あるいは非存在下でタンパク質合成を行い、グリコシル化が行われているか否かを調べた結果を示す図である。 節足動物由来の抽出物（Ｓｆ２１由来）を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いて、哺乳動物由来（ＣＨＯ細胞由来）のミクロソーム膜存在下、あるいは非存在下でタンパク質合成を行い、Ｎ−グリコシル化が行われているか否かを調べた結果を示す図である。

配列番号１：ＥｏＮＰＶ（バキュロウイルス）ポリヘドリン遺伝子５’ＵＴＲの塩基配列
配列番号２：ｐｒｏ−ＴＮＦ ＧＬＣ ｃＤＮＡの塩基配列
配列番号３：ＰＣＲプライマー
配列番号４：ＰＣＲプライマー
配列番号５：ＰＣＲプライマー

Claims (4)

1. カイコ幼虫の後部絹糸腺、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ卵細胞由来昆虫培養細胞、及び、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣細胞由来昆虫培養細胞からなる群より選ばれる節足動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成において、翻訳反応を犬膵臓由来のミクロソーム膜の存在下で行うことを特徴とする、翻訳後のタンパク質の修飾方法。
2. ｍＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）と犬膵臓由来のミクロソーム膜の濃度（Ａ２６０）との比が１：０．１〜５で翻訳反応を行う請求項１に記載の方法。
3. 当該比が１：０．３〜２．３である、請求項２に記載の方法。
4. 翻訳後のタンパク質の修飾が、Ｎ−グリコシル化および／またはシグナル配列の切除である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

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