KR100730875B1

KR100730875B1 - 번역반응 촉진 ｄｎａ 단편 및 그것을 사용한 무세포계단백질 합성방법

Info

Publication number: KR100730875B1
Application number: KR1020050117981A
Authority: KR
Inventors: 다카시 스즈키; 마사아키 이토; 도루 에즈레; 마사미쯔 시카타; 신이치로 고바야시
Original assignee: 가부시키가이샤 시마즈세이사쿠쇼
Priority date: 2004-12-07
Filing date: 2005-12-06
Publication date: 2007-06-20
Also published as: KR20060063738A; CN1796554A; US20060121560A1

Abstract

목적으로 하는 유전자를 간편하게 클로닝할 수 있고, 더욱이 번역효율을 향상시킬 수 있는 DNA 단편, 해당 DNA 단편을 갖는 단백질 발현벡터 및 주형 DNA, 해당 주형 DNA로부터 얻어지는 mRNA, 해당 주형 DNA 또는 mRNA를 포함하는 무세포계 단백질 합성반응액, 해당 주형 DNA를 사용한 무세포계 단백질 합성법방법, 및 해당 발현벡터를 포함하는 무세포계 단백질 합성 키트를 제공한다. 번역반응 촉진을 위해 사용되는, 서열표의 서열번호 1~11 중 어느 하나에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DAN 단편, 해당 DNA 단편을 갖는 단백질 발현벡터 및 주형 DNA, 해당 주형 DNA로부터 얻어지는 mRNA, 해당 주형 DNA 또는 mRNA를 포함하는 무세포계 단백질 합성반응액, 해당 주형 DNA를 사용한 무세포계 단백질 합성법방법, 및 해당 발현벡터를 포함하는 무세포계 단백질 합성 키트.

DNA 단편, 무세포계 단백질 합성방법, 주형 DNA, mRNA, 합성 키트

Description

번역반응 촉진 ＤＮＡ 단편 및 그것을 사용한 무세포계 단백질 합성방법{DNA fragment to promote translation reaction and method for cell-free system protein synthesis using the same}

도 1은 실험예 2의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2는 실험예 3의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3은 실험예 4의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 실험예 5의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5는 실시예 1의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6은 실시예 2의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 7은 참고예 24에서 제작한 발현벡터 pTD1의 벡터 지도(vector map)이다.

도 8은 참고예 25에서 제작한 발현벡터 pTD2의 벡터 지도이다.

도 9는 실시예 3의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 10은 실시예 4의 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명의 기술분야

본 발명은 번역반응을 촉진시키는 DNA 단편, 해당 DNA 단편을 갖는 단백질 발현벡터 및 주형(鑄型) DNA, 해당 주형 DNA로부터 얻어지는 mRNA, 해당 주형 DNA 또는 mRNA를 포함하는 무세포계 단백질 합성반응액, 해당 주형 DNA를 사용한 무세포계 단백질 합성법방법, 및 해당 발현벡터를 포함하는 무세포계 단백질 합성 키트에 관한 것이다.

관련기술의 개시

최근, 인간 게놈을 비롯하여 많은 생물의 유전정보가 해독되어 오고 있다. 이러한 가운데, 포스트게놈 연구로서, 이들의 유전정보에 대응하는 단백질의 기능 해석이나 게놈 창약(創藥)이 주목을 모으고 있다. 이들 유전정보에 대응하는 단백질을 의약품 등에 응용, 이용하기 위해서는, 막대한 종류의 단백질을 단시간에 간단하게 합성하는 것이 필요해진다.

현재, 단백질의 생산방법으로는, 유전자 재조합기술에 의해 효모나 곤충세포(곤충 배양세포) 등의 생세포를 사용하는 발현계(이하, 「세포계」라고 하는 경우가 있다)가 널리 이용되고 있다. 그러나, 생세포는 자기기능(自己機能)을 유지하기 위해 외래 단백질을 배제하는 경향이 있고, 또한 생세포에서 세포독 단백질을 발현하면 세포가 생육하지 않는 등 발현이 곤란한 단백질도 많다.

한편, 세포계를 사용하지 않는 단백질의 생산방법으로서, 세포파쇄액이나 추출액에 기질(基質)이나 효소 등을 첨가하거나 하여, 생물의 유전정보 번역계 또는 유전정보 전사/번역계를 시험관 내에 갖추고, 반응 주형으로서 목적 단백질을 코드하는 구조유전자를 갖는 DNA(전사 주형) 또는 mRNA(번역 주형)를 사용하여, 아미노 산을 목적으로 하는 순번에 필요한 잔기 수 결합시킬 수 있는 합성계를 재구축하는, 무세포계의 단백질 합성이 알려져 있다. 이러한 무세포계 단백질 합성에서는, 상기 세포계의 단백질 합성과 같은 제약을 받기 어려워, 생물의 목숨을 끊지 않고 단백질의 합성을 행할 수 있고, 또한 단백질의 생산에 배양 등의 조작을 수반하지 않기 때문에 세포계와 비교하여 단시간에 단백질의 합성을 행할 수 있다. 더욱이 무세포계 단백질 합성에서는, 생명체가 이용하고 있지 않은 아미노산 서열로 되는 단백질의 대량생산도 가능해지기 때문에, 유망한 발현방법으로 기대되고 있다. 이러한 무세포계의 단백질 합성에 제공하는 추출액(무세포계 단백질 합성용 추출액)으로서, 각종 생물 유래의 것을 사용하는 것이 검토되어, 연구가 진행되고 있다.

그런데 진핵생물(眞核生物)의 mRNA는, DNA로부터 전사된 후, 스플라이싱(splicing)이나 폴리 A 꼬리(poly A tail)의 부가(付加), 5'캡구조의 부가 등의 각종 수식이 행해지고 있는 것이 알려져 있다. 폴리 A 꼬리 및 5'캡구조의 부가에 의해, 진핵생물 mRNA는, 리보솜의 4Os 서브유닛으로의 결합이 촉진된다. 따라서 종래, 진핵생물 유래의 무세포계 단백질 합성용 추출액을 사용하는 경우, 효율적인 번역반응을 행하기 위해, 전사반응계에 시판의 캡 아날로그(cap analog)를 첨가하여 mRNA의 캡핑(capping)을 행하여 왔다. 그러나, 캡 아날로그는 고가이고, 전사효율을 현저히 감소시켜 mRNA도 소량밖에 얻어지지 않는다고 하는 문제가 있었다. 더욱이, 미반응의 캡 아날로그는 번역반응도 저해하기 때문에, 전사반응 종료 후에는 이 미반응의 캡 아날로그를 스핀 칼럼(spin column) 등을 사용하여 완전히 제거할 필요가 있어, 하이 쓰로우풋(high throughput)으로 샘플을 처리해 가는데 커다란 문제로 되어 있었다.

이러한 배경하, 가와라사키 등은 담배식각바이러스(tobacco etch virus) 유래의 5'비번역영역(5' untranslated region, 이하 「5'UTR」로 약칭한다)이 캡 비의존성(캡구조를 취하지 않고) 번역 촉진활성을 갖는 것을 밝혔다(예를 들면, 가와라사키 et al. 「Biotechnol. Prog」Vol. 16, No. 3, p517-521(2000).을 참조). 가와라사키 et al, 「Biotechnol. Prog」Vol. 16, No. 3, p517-521(2000).에서는 소맥배아(小麥胚芽) 추출액을 사용한 무세포계 단백질 합성에 있어서, 담배식각바이러스 유래의 5'UTR을, 목적으로 하는 단백질을 코드하는 구조유전자의 5' 상류측에 부가시킨 DNA로부터 전사하여 얻어진 mRNA를 번역 주형으로서 사용한 바, 캡구조를 부가시킨 mRNA와 동일한 번역 효율이 얻어진 것이 보고되어 있다. 또한, 토끼 망상적혈구 유래의 추출액을 사용한 무세포계 단백질 합성에 있어서, 토끼 β-글로빈(rabbit β-globin)의 5'UTR이 동일한 작용을 갖는 것도 보고되어 있다(예를 들면, Annweiler et al, 「Nucleic acids Res」Vol. 19, No. 13, p3750(1991).을 참조).

무세포계 단백질 합성용 추출액으로서는, 상기 소맥배아, 토끼 망상적혈구 외에, 대장균, 곤충 배양세포 등 유래의 것이, 종래부터 알려져 있다. 본 발명자 등은, 지금까지 누에조직 유래의 추출액(누에추출액)이나 곤충 배양세포 유래의 추출액(곤충 배양세포 추출액) 포유동물 배양세포 유래의 추출액(이하, 포유동물 배양세포 추출액)을 사용한 무세포계 단백질 합성방법을 제안해오고 있다(예를 들면, 일본국 특허공개 제2003-235598호 공보, 일본국 특허공개 제2004-215651호 공보, 참조). 본 발명자 등이 제안하는 누에추출액이나 곤충 배양세포 추출액, 포유동물 배양세포 추출액을 사용한 무세포계 단백질 합성방법에서는, 종래의 방법과 비교하여, 추출액의 조제가 훨씬 용이하고, 진핵생물 유래이기 때문에 당단백질의 합성도 가능하다고 하는 이점이 있어, 매우 유용하다. 따라서 이러한 추출액을 사용한 무세포계 단백질 합성에 있어서도, 보다 신속하고 고수량으로 무세포계 단백질 합성을 행할 수 있게 하기 위해, 캡구조에 의존하지 않는 번역 촉진서열을 발견하고, 추가로 목적으로 하는 유전자를 간편하게 클로닝할 수 있는 발현벡터를 구축하는 것은 매우 중요한 과제였다.

발명의 개요

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해 이루어진 것으로서, 그 목적으로 하는 바는, 목적으로 하는 유전자를 간편하게 클로닝할 수 있고, 더욱이 번역효율을 향상시킬 수 있는 DNA 단편, 해당 DNA 단편을 갖는 단백질 발현벡터 및 주형 DNA, 해당 주형 DNA로부터 얻어지는 mRNA, 해당 주형 DNA 또는 mRNA를 포함하는 무세포계 단백질 합성반응액, 해당 주형 DNA를 사용한 무세포계 단백질 합성법방법, 및 해당 발현벡터를 포함하는 무세포계 단백질 합성 키트를 제공하는 것이다.

본 발명자 등은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 무세포계 단백질 합성에 있어서 번역반응 촉진을 위해 사용되는, 이하의 (a)~(l) 중 어느 하나의 DNA 단편.

(a) 서열표의 서열번호 1에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(b) 서열표의 서열번호 2에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(c) 서열표의 서열번호 3에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(d) 서열표의 서열번호 4에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(e) 서열표의 서열번호 5에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(f) 서열표의 서열번호 6에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(g) 서열표의 서열번호 7에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(h) 서열표의 서열번호 8에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(i) 서열표의 서열번호 9에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(j) 서열표의 서열번호 10에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(k) 서열표의 서열번호 11에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편, 및

(l) 상기 (a)~(k) 중 어느 하나의 염기서열에 있어서, 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DNA 단편.

[2] 번역반응 촉진활성을 갖는 이하의 (a)에서 (k)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종류의 DNA 단편을 포함하는 발현벡터.

[3] 단백질을 코드하는 구조유전자와, 구조유전자의 5' 상류측에 삽입된 DNA 단편을 갖는 무세포계 단백질 합성용의 주형 DNA로서, DNA 단편이 이하의 (a)~(l) 중 어느 하나로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 주형 DNA.

[4] [3]의 주형 DNA를 전사하여 얻어지는 mRNA로서, 무세포계 단백질 합성에 있어서의 번역 주형으로서 사용되는 mRNA.

[5] [3]의 주형 DNA 또는 상기 주형 DNA를 전사하여 얻어지는 mRNA를 함유하는 무세포계 단백질 합성용 반응액.

또한, 본 발명에 있어서는, 액(solution)은 현탁액(suspension)을 포함한다.

[6] [3]의 주형 DNA 또는 상기 주형 DNA를 전사하여 얻어지는 mRNA를 사용한 무세포계 단백질 합성방법.

[7] [6]에 있어서, 동물 유래의 추출물을 함유하는 무세포계 단백질 합성반응액을 사용한, 무세포계 단백질 합성방법.

[8] [7]에 있어서, 동물 유래의 추출물이 누에조직으로부터 추출된 것인, 무세포계 단백질 합성방법.

[9] [7]에 있어서, 동물 유래의 추출물이 곤충 배양세포로부터 추출된 것인, 무세포계 단백질 합성방법.

[10] [9]에 있어서, 곤충 배양세포가 Trichoplusia ni의 난세포(卵細胞) 유래 및/또는 Spodoptera frugiperda 난소세포 유래의 세포인, 무세포계 단백질 합성방법.

[11] [7]에 있어서, 동물 유래의 추출물이 포유동물세포로부터 추출된 것인, 무세포계 단백질 합성방법.

[12] [11]에 있어서, 포유동물세포가 토끼 망상적혈구인, 무세포계 단백질 합성방법.

[13] [11]에 있어서, 포유동물세포가 포유동물 배양세포인, 무세포계 단백질 합성방법.

[14] [13]에 있어서, 포유동물 배양세포가 Chinese hamster ovary 세포인, 무세포계 단백질 합성방법.

[15] [6]에 있어서, 소맥배아 유래의 추출물을 함유하는 무세포계 단백질 합성반응액을 사용한, 무세포계 단백질 합성방법.

[16] [2]의 발현벡터를 포함하는, 무세포계 단백질 합성용 키트.

발명의 상세한 설명

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 DNA 단편은, 캡구조에 의존하지 않고, 단백질 발현계에 있어서, 번역반응 촉진활성을 갖는 것이다. 여기에서 「번역반응 촉진활성을 갖는」이란, 본 발명의 DNA 단편을 사용하여 무세포계 단백질 합성반응을 행함으로써, 이 DNA 단편을 사용하지 않은 경우와 비교하여, 단백질 합성량이(예를 들면 1.2배 이상, 적합하게는 2배 이상) 향상되는 것을 가리킨다.

상기 번역반응을 촉진하는 DNA 단편의 효과를 간편하게 검출하는 수단으로서 무세포계 단백질 합성계를 사용하고 있지만, 본 발명의 발현벡터는 무세포계에 한정되지 않고, 종래 공지의 세포계에 있어서도 사용할 수 있다.

본 발명의 캡 비의존성 번역반응 촉진활성을 갖는 DNA 단편으로서는, 구체적으로는, 서열표의 서열번호 1~11 중 어느 하나에 나타내어지는 염기서열을 갖는 이중가닥 DNA 단편을 들 수 있다. 이들의 DNA 단편에는 이들과 균등한(상기 서열번호 1~11 중 어느 하나에 나타내어지는 염기서열로부터, 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된) 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 이중가닥 DNA 단편도 포함된다.

서열표의 서열번호 1~11에 나타내는 염기서열은, 각각, 누에 또는 바큘로바이러스(baculovirus)에 있어서의 5' 비번역영역(5'UTR)으로서 공지의 염기서열이다. 구체적으로는,

(1-1) 서열번호 1에 나타내는 염기서열은 누에의 피브로인 L사슬 유전자(fibroin L-chain gene)의 5'UTR의 염기서열,

(1-2) 서열번호 2에 나타내는 염기서열은 누에의 세리신(sericin) 유전자의 5'UTR의 염기서열,

(1-3) 서열번호 3에 나타내는 염기서열은 AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR의 염기서열,

(1-4) 서열번호 4에 나타내는 염기서열은 BmCPV(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR의 염기서열,

(1-5) 서열번호 5에 나타내는 염기서열은 EsCPV(Euxoa scandes cytoplasmic polyhedrosis virus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR의 염기서열,

(1-6) 서열번호 6에 나타내는 염기서열은 HcNPV(Hyphantria cunea nuclear polyhedrosis virus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR의 염기서열,

(1-7) 서열번호 7에 나타내는 염기서열은 CrNPV(Choristoneura rosaceana nucleopolyhedrovirus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR의 염기서열,

(1-8) 서열번호 8에 나타내는 염기서열은 EoNPV(Ecotropis oblique nuclear polyhedrosis virus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR의 염기서열,

(1-9) 서열번호 9에 나타내는 염기서열은 MnNPV(Malacosma neustria nucleopolyhedrovirus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR의 염기서열,

(1-10) 서열번호 10에 나타내는 염기서열은 SfNPV(Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR의 염기서열,

(1-11) 서열번호 11에 나타내는 염기서열은 WsNPV(Wiseana signata nucleopolyhedrovirus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR의 염기서열로서, 각각 공지이다.

본 발명은 이들의 염기서열을 갖는 DNA 단편, 또는 기능을 손상시키지 않는 범위에서 균등한 DNA 단편이, 무세포계 단백질 합성에 있어서, 특히 유용한 번역반응 촉진활성을 발휘하는 것을 발견한 것이다. 또한, 본 발명에 있어서의 DNA 단편 은, 누에 또는 바큘로바이러스의 5'UTR에 유래하는 것이라면, 상기 염기서열을 반드시 갖지 않아도 된다.

본 발명의 DNA 단편은 종래 공지의 어떤 방법에 의해 얻어져도 된다. 예를 들면, 공지의 DNA 합성기를 사용하여 합성할 수 있다.

<발현벡터>

본 발명의 DNA 단편은, 단백질을 코드하는 구조유전자의 5' 상류측에 1 또는 복수 개 삽입되어, 발현벡터로서 구축되는 것이 바람직하다. 이러한 발현벡터도, 본 발명에 포함된다. 본 발명의 발현벡터는, 고리형상(環狀)이어도 직쇄형상(直鎖狀)이어도 된다.

또한, 본 발명의 발현벡터 중, 현저한 번역반응 촉진활성을 발휘하고, 특히 적합한 것으로서 이하의 것이 예시된다.

(2-1) 서열번호 2에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DNA 단편이, 프로모터 서열(promoter sequence)의 3' 하류측에 순방향(順方向)으로 1개 삽입된 발현벡터;

(2-2) 서열번호 3에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DNA 단편이, 프로모터 서열의 3' 하류측에 순방향으로 1개 삽입된 발현벡터;

(2-3) 서열번호 4에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DNA 단편이, 프로모터 서열의 3' 하류측에 순방향으로 1개 삽입된 발현벡터;

(2-4) 서열번호 5에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편 및 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DNA 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 DNA 단편으로서, 서로 동일 또는 상이한 염기서열을 갖는 2개의 DNA 단편이, 프로모터 서열의 3' 하류측에 역방향으로 삽입된 발현벡터;

(2-5) 서열번호 6에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DNA 단편이, 프로모터 서열의 3' 하류측에 역방향으로 1개 삽입된 발현벡터;

(2-6) 서열번호 6에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편 및 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DNA 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 DNA 단편으로서, 서로 동일 또는 상이한 염기서열을 갖는 2개의 DNA 단편이, 프로모터 서열의 3' 하류측에 역방향으로 삽입된 발현벡터;

(2-7) 서열번호 7에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DNA 단편이, 프로모터 서열의 3' 하류측에 순방향으로 1개 삽입된 발현벡터;

(2-8) 서열번호 7에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DNA 단편이, 프로모터 서열의 3' 하류측에 역방향으로 1개 삽입된 발현벡터;

(2-9) 서열번호 8에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DNA 단편이, 프로모터 서열의 3' 하류측에 역방향으로 1개 삽입된 발현벡터;

(2-10) 서열번호 9에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편 및 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DNA 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개의 DNA 단편, 또는, 상기 군으로부터 선택되는 2개의 DNA 단편으로서, 서로 동일 또는 상이한 염기서열을 갖는 2개의 DNA 단편이, 프로모터 서열의 3' 하류측에 순방향으로 삽입된 발현벡터;

(2-11) 서열번호 9에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DNA 단편이, 프로모터 서열의 3' 하류측에 역방향으로 1개 삽입된 발현벡터;

(2-12) 서열번호 10에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DNA 단편이, 프로모터 서열의 3' 하류측에 순방향으로 1개 삽입된 발현벡터;

(2-13) 서열번호 11에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DNA 단편이, 프로모터 서열의 3' 하류측에 순방향으로 1개 삽입된 발현벡터.

본 발명의 발현벡터는 상기 DNA 단편의 5' 상류측에, 통상 프로모터 서열을 적어도 하나 갖는다. 프로모터 서열로서는, 예를 들면, 종래 공지의 T7 프로모터 서열, SP6 프로모터 서열, T3 프로모터 서열 등을 들 수 있다.

본 발명의 발현벡터는, 상기 DNA 단편을 하나 또는 복수 개 포함한다. 상기 DNA 단편은, 프로모터 서열의 3' 하류측에 있어서, 순방향(5'→3')으로 삽입되어도 되고, 역방향(逆方向)으로 삽입되어도 된다. 복수 개의 상기 DNA 단편을 포함하는 경우, 상기 DNA 단편은 동일한 것이어도 서로 다른 것이어도 된다. 또한, 2개 이상의 DNA 단편이 삽입된 경우, 모든 DNA 단편이 동일한 방향으로 삽입되어 있지 않아도 된다.

또한, 본 발명의 발현벡터는, 발현시키는 단백질을 코드하는 구조유전자를 삽입하기 위한 서열을 갖는다. 삽입시키기 위한 서열로서는, 종래 공지의 멀티클로닝 사이트(multi-cloning site)나, 상동성(相同性) 재조합반응을 일으키는 서열 등을 들 수 있다. 이러한 단백질을 코드하는 구조유전자를 삽입시키기 위한 서열은, 상기 번역반응 촉진활성을 갖는 DAN 단편의 3' 하류측에 삽입된다. 이러한 구조유전자를 삽입하기 위한 서열에, 발현시킨 단백질의 정제를 용이하게 한다고 하는 관점에서 종래 공지의 히스티딘 태그(histidine tag)나, GST 태그를 코드하는 염기서열 등을 부가시켜도 된다.

또한, 본 발명의 발현벡터는 상기 단백질을 코드하는 구조유전자를 삽입시키기 위한 서열의 3' 하류측에, 합성된 mRNA의 안정성 등의 관점에서 3'비번역영역(3'UTR) 및 폴리 A 서열을 가지고 있는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 발현벡터는 상기 폴리 A 서열의 3' 하류측에 전사를 종결시키는 기능을 갖는 터미네이터 서열(terminator sequence)을 가지고 있는 것이 바람직하다. 상기 터미네이터 서열로서는, 예를 들면, 종래 공지의 T7 터미네이터 서열, SP6 터미네이터 서열, T3 터미네이터 서열 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 발현벡터는, 숙주(宿主) 내에서 안정하게 유지되기 위해 내약제성 마커를 갖는다. 내약제성 마커로서는, 예를 들면 종래 공지의 암피실린 (ampicillin) 내성 유전자, 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 발현벡터는 숙주 내에서 자립복제를 행하기 위해 복제기점(複製起点)을 갖는다. 복제기점으로서는, 예를 들면 종래 공지의 pBR322 Ori, pUC Ori, SV40 Ori 등을 들 수 있다. 또한, 셔틀 벡터(shuttle vector)로서 사용할 수 있도록, 상이한 숙주 사이에서 기능하는 복제기점을 가지고 있어도 된다.

상기 발현벡터는, 종래 공지의 유전자 재조합기술을 사용해서 제작할 수 있다.

상술한 본 발명의 발현벡터에, 무세포계에서 합성시키는 목적 단백질(펩티드를 포함한다)을 코드하는 구조유전자를 삽입한다. 구조유전자가 코드하는 단백질(펩티드를 포함한다)에 특별히 제한은 없고, 생세포에서 세포독으로 되는 단백질을 코드하는 염기서열을 갖는 것이어도 되고, 당단백질을 코드하는 염기서열을 갖는 것이어도 되며, 융합 단백질을 코드하는 염기서열이어도 된다. 또한 발현시킨 단백질의 정제를 용이하게 한다고 하는 관점에서 종래 공지의 히스티딘 태그나, GST 태그를 코드하는 염기서열 등을 부가시켜도 된다. 이들 태그 서열은 통상 목적 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 부가된다.

또한 구조유전자는, 그 염기 수에 특별히 제한은 없고, 목적으로 하는 단백질을 합성할 수 있다면 전부가 동일한 염기 수가 아니어도 된다. 또한, 목적으로 하는 단백질을 합성할 수 있을 정도로 상동한 서열이라면, 각 구조유전자는 복수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 것이어도 된다.

<주형 DNA>

상기 본 발명의 발현벡터에, 목적 단백질(펩티드를 포함한다)을 코드하는 구조유전자를 삽입한 벡터(이하 주형 DNA)는, 세포계 및 무세포계에 있어서 사용할 수 있다. 즉 본 발명의 DNA 단편이, 단백질을 코드하는 구조유전자의 5' 상류측에 1 또는 복수 개 삽입되어, 주형 DNA로서 구축되는 것도 바람직하다. 이러한 주형 DNA도, 본 발명에 포함된다. 본 발명의 주형 DNA는, 고리형상이어도 직쇄형상이어도 된다. 본 발명의 주형 DNA에 있어서, 상기 DNA 단편은, 구조유전자의 5' 상류측에 있어서, 순방향(5'→3')으로 삽입되어도 되고, 역방향(3'→5')으로 삽입되어도 된다. 또한, 본 발명의 주형 DNA에 있어서는, 2개 이상의 DNA 단편이 삽입된 것이어도 되고, 그 경우, 삽입된 DNA 단편은 동일한 것이어도 서로 다른 것이어도 된다. 또한, 2개 이상의 DNA 단편이 삽입된 경우, 모든 DNA 단편이 동일한 방향으로 삽입되어 있지 않아도 된다. DNA 단편은, 구조유전자의 5' 상류측에 있어서, 구조유전자에 인접하도록 삽입되어도 되고, 구조유전자와의 사이에 1염기 이상의 염기서열을 개재(介在)시킨 상태로 삽입되어도 된다. 이러한 주형 DNA는, 공지의 유전자 조작기술을 적용함으로써 적절히 구축할 수 있다.

본 발명의 주형 DNA에 있어서의 구조유전자는, 무세포계에서 합성시키는 목적 단백질을 코드하는 영역이다. 구조유전자가 코드하는 단백질(펩티드를 포함한다)에 특별히 제한은 없고, 생세포에서 세포독으로 되는 단백질을 코드하는 염기서열을 갖는 것이어도 되며, 또한 당단백질을 코드하는 염기서열을 갖는 것이어도 되고, 융합 단백질을 코드하는 염기서열이어도 된다.

본 발명의 주형 DNA는, DNA 단편의 5' 상류측에, 통상, 프로모터 서열을 적 어도 하나 갖는다. 프로모터 서열로서는, 예를 들면, 종래 공지의 T7 프로모터 서열, SP6 프로모터 서열, T3 프로모터 서열 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 주형 DNA는, 상기 구조유전자의 3' 하류측에 전사를 종결시키는 기능을 갖는 터미네이터 서열 및/또는 합성된 mRNA의 안정성 등의 관점에서 폴리 A 서열을 가지고 있는 것이 바람직하다. 상기 터미네이터 서열로서는, 예를 들면, 종래 공지의 T7 터미네이터 서열, SP6 터미네이터 서열, T3 터미네이터 서열 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 주형 DNA 중, 현저한 번역반응 촉진활성을 발휘하여, 특히 적합한 것으로 이하의 것이 예시된다.

(3-1) 서열번호 2에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DAN 단편이, 구조유전자의 5' 상류측에 순방향으로 1개 삽입된 주형 DNA;

(3-2) 서열번호 3에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DAN 단편이, 구조유전자의 5' 상류측에 순방향으로 1개 삽입된 주형 DNA;

(3-3) 서열번호 4에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DAN 단편이, 구조유전자의 5' 상류측에 순방향으로 1개 삽입된 주형 DNA;

(3-4) 서열번호 5에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편 및 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DAN 단편으로 이루어진 군으로부터 선 택되는 2개의 DNA 단편으로서, 서로 동일 또는 상이한 염기서열을 갖는 2개의 DNA 단편이, 구조유전자의 5' 상류측에 역방향으로 삽입된 주형 DNA;

(3-5) 서열번호 6에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DAN 단편이, 구조유전자의 5' 상류측에 역방향으로 1개 삽입된 주형 DNA;

(3-6) 서열번호 6에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편 및 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DAN 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 DNA 단편으로서, 서로 동일 또는 상이한 염기서열을 갖는 2개의 DNA 단편이, 구조유전자의 5' 상류측에 역방향으로 삽입된 주형 DNA;

(3-7) 서열번호 7에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DAN 단편이, 구조유전자의 5' 상류측에 순방향으로 1개 삽입된 주형 DNA;

(3-8) 서열번호 7에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DAN 단편이, 구조유전자의 5' 상류측에 역방향으로 1개 삽입된 주형 DNA;

(3-9) 서열번호 8에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DAN 단편이, 구조유전자의 5' 상류측에 역방향으로 1개 삽입된 주형 DNA;

(3-10) 서열번호 9에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편 및 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DAN 단편으로 이루어진 군으로부터 선 택되는 2개의 DNA 단편으로서, 서로 동일 또는 상이한 염기서열을 갖는 2개의 DNA 단편이, 구조유전자의 5' 상류측에 순방향으로 삽입된 주형 DNA;

(3-11) 서열번호 9에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DAN 단편이, 구조유전자의 5' 상류측에 역방향으로 1개 삽입된 주형 DNA;

(3-12) 서열번호 10에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DAN 단편이, 구조유전자의 5' 상류측에 순방향으로 1개 삽입된 주형 DNA;

(3-13) 서열번호 11에 나타내어지는 염기서열로 되는 DNA 단편, 또는 그것과 균등한 염기서열을 가지며 번역반응 촉진활성을 갖는 DAN 단편이, 구조유전자의 5' 상류측에 순방향으로 1개 삽입된 주형 DNA.

상술한 본 발명의 주형 DNA는, 무세포계 단백질 합성에 있어서의 전사 주형으로서 적합하게 사용할 수 있다.

<mRNA>

또한 본 발명의 주형 DNA를 전사해서 얻어진 mRNA는, 번역계의 무세포계 단백질 합성에 있어서의 번역 주형으로서 적합하게 사용할 수 있다. 이러한 상기 주형 DNA를 전사해서 얻어진 mRNA도, 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 mRNA는 종래 공지의 적절한 방법으로 상기 주형 DNA를 전사하여 조제할 수 있지만, 자체 공지의 인비트로 전사에 의해 상기 주형 DNA를 전사하여 조제하는 것이 바람직하다. 인비트로 전사는, 예를 들면, RiboMax Large Scale RNA production System-T7( 프로메가사제) 등을 이용해서 행할 수 있다. mRNA는, 전사 후, 자체 공지의 방법으로 정제하여 단리하고, 후술하는 바와 같이 무세포계 단백질 합성용 번역 주형으로서, 번역계용 반응액에 적용할 수 있다.

세포계에 있어서 주형 DNA를 사용하는 경우, 종래 공지의 방법으로 숙주가 되는 생물에 주형 DNA를 도입하여 형질전환체를 얻는다. 이 때에 사용하는 숙주는 어떠한 생물종을 사용해도 된다. 그 중에서도 본 발명 벡터에 포함되는 번역 촉진작용을 갖는 DNA 단편은, 누에 또는 바큘로바이러스 유래이기 때문에, 바큘로바이러스 발현계나 누에를 사용한 세포계에 있어서 특히 적합하게 사용할 수 있다.

<무세포계 단백질 합성반응액 및 무세포계 단백질 합성방법>

무세포계 단백질 합성은, 일반적으로, mRNA의 정보를 읽어 단백질을 합성하는 무세포 번역계만에 의한 단백질 합성(번역계), 및 DNA로부터 mRNA를 전사하는 전사공정과, 상기 전사공정에서 얻어진 mRNA의 정보를 읽어 단백질을 합성하는 번역공정을 포함하는 단백질 합성(전사/번역계)으로 크게 나뉘지만, 상기 주형 DNA는, 어느 계에 있어서도 적합하게 사용할 수 있다. 즉, 상기 주형 DNA 또는 그것을 전사해서 얻어진 mRNA가 반응 주형으로서 사용된다. 본 발명에는, 상기 주형 DNA 또는 그것을 전사해서 얻어진 mRNA를 사용한 무세포계 단백질 합성방법이 포함된다.

본 발명에는, 상기 주형 DNA 또는 그것을 전사해서 얻어진 mRNA를 반응 주형으로서 사용하는 무세포계 단백질 합성용 반응액도 포함된다. 이 무세포계 단백질 합성용 반응액은, 본 발명의 무세포계 단백질 합성에 적합하게 사용된다. 본 발명의 무세포계 단백질 합성용 반응액은, 상기 번역계의 합성반응을 행하기 위한 반응액(이하, 「번역계용 반응액」이라 부른다.), 상기 전사/번역계의 합성반응을 행하기 위한 반응액(이하, 「전사/번역계용 반응액」이라 부른다.) 중 어느 형태여도 된다. 즉, 상기 주형 DNA를 전사 주형으로서 함유하는 전사/번역계용 반응이어도 되고, 상기 주형 DNA로부터 전사해서 얻어지는 mRNA를 번역 주형으로서 함유하는 번역계용 반응액이어도 된다.

무세포계 단백질 합성용 반응액에는, 통상, 번역장치로서의 리보솜 등을 함유하는 생체 유래 추출물이 포함된다. 또한, 본 발명의 무세포계 단백질 합성용 반응액에 포함되는 추출물은, 주형 DNA에 코드되는 단백질을 생성시킬 수 있는 것이면 어떠한 것이어도 되고, 종래 공지의 대장균, 소맥, 대맥, 벼, 옥수수 등의 벼과의 식물, 및 시금치 등 식물종자의 배아, 토끼 망상적혈구 등으로부터 추출된 추출물, 추출액을 특별히 제한 없이 사용할 수 있다. 이들은 시판의 것을 사용하는 것도 가능하고, 그 자체 기지의 방법, 구체적으로는, 대장균 추출액의 경우, Zubay G「Ann Rev Genet」Vol.7, p267-287(1973) 등에 기재된 방법 등에 준하여 조제하는 것도 가능하다. 시판의 단백질 합성용 세포 추출액으로서는, 대장균 유래에서는, E. coli S30 extract for linear templates(프로메가사제) 등을 들 수 있고, 토끼 망상적혈구 유래에서는 rabbit reticulocyte lysate systems(프로메가사제) 등, 소맥배아 유래에서는 wheat germ extract(프로메가사제), PROTEIOS(도요보세키사제) 등을 들 수 있다.

무세포계 단백질 합성용 반응액에는, 상술한 바와 같은 공지의 추출물, 추출액이 포함되어 있어도 되지만, 본 발명자 등이 제안해오고 있는 동물 유래의 추출물이 포함되어 있는 것인 것이 바람직하다. 동물 유래의 추출물로서는 절족동물(節足動物) 유래의 추출물, 포유동물 배양세포 유래의 추출물 등을 들 수 있다.

상기 절족동물 유래의 추출액으로서, 절족동물의 성장단계 중 어느 것이든 상관없이 어떠한 조직으로부터 추출된 것이어도 되고, 또한, 절족동물의 어느 조직 유래의 배양세포로부터 추출된 것이어도 된다. 그 중에서도, 누에조직 또는 곤충 배양세포로부터 추출된 것인 것이 바람직하다. 누에조직을 추출 대상으로 하는 경우, 5령기(齡期)의 3일~7일의 누에 유충의 후부견사선(後部絹絲腺)으로부터의 추출물을 함유하면, 단시간에 대량의 단백질이 합성 가능한 무세포계 단백질 합성용 반응액이 얻어진다고 하는 이점도 있어, 특히 바람직하다(일본국 특허공개 제2003-235598호 명세서 참조). 또한, 곤충 배양세포를 추출 대상으로 하는 경우, 단백질 합성능이 높고, 또한 무혈청배지에서 배양이 가능한, Trichoplusia ni의 난세포 유래의 세포 High Five(Invitrogen사제) 및 Spodoptera frugiperda 난소세포 유래의 세포 Sf21(Invitrogen사제)이 적합한 곤충 배양세포로서 예시된다(일본국 특허공개 제2004-215651 명세서 참조).

또한, 상기 포유동물 배양세포 유래의 추출액으로서, 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 인간, 랫트, 마우스, 원숭이 등의 종래 공지의 절절한 포유동물 유래의 배양세포를 사용할 수 있다.

또한, 포유동물 배양세포로서는, 어떠한 조직 유래의 세포여도 되고, 예를 들면, 혈구세포, 생식소(生殖巢) 유래 세포, 림프종(림포마) 유래 세포, 기타 종양세포, 간세포(幹細胞) 등을 특별히 제한 없이 사용할 수 있다. 그 중에서도, 부유배양이 가능하기 때문에, 배양 및 계대(繼代)가 용이하여, 림프종 유래 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, Chinese hamster ovary(CHO) K1-SFM 세포는, 부유배양이 가능할 뿐 아니라, 무혈청배지에서 배양이 가능하여, 보다 배양 및 계대가 용이하다. 추가로, 세포계에 있어서 널리 이용되고, 높은 단백질 합성능을 가지고 있어, 무세포계에 있어서도 동일한 것을 기대할 수 있기 때문에, CHO K1-SFM 세포를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 단일종의 포유동물에 있어서의 단일 조직 유래의 포유동물 배양세포에 한정되지 않고, 단일종의 포유동물에 있어서의 복수 종의 조직 유래의 포유동물 배양세포로부터 추출을 행해도 되고, 복수 종의 포유동물에 있어서의 단일 조직 유래의 포유동물 배양세포로부터 추출을 행해도 되며, 물론, 복수 종의 포유동물에 있어서의 복수 종의 조직 유래의 포유동물 배양세포로부터 추출을 행해도 된다.

상기 동물 유래의 조직 또는 배양세포로부터의 추출조작에 사용되는 추출용 액(抽出用液)으로서는, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 프로테아제 인히비터를 적어도 함유하는 것이 바람직하다. 프로테아제 인히비터를 함유하는 추출용 액을 사용하면, 추출물에 함유되는 프로테아제의 활성이 저해되어, 해당 프로테아제에 의한 추출물 중의 활성 단백의 원하지 않는 분해를 방지할 수 있어, 추출물이 갖는 단백질 합성능을 유효하게 이끌어낼 수 있게 된다고 하는 이점이 있다. 상기 프로테아제 인히비터로서는, 프로테아제의 활성을 저해할 수 있는 것이라면 특별히 제 한은 없고, 예를 들면, 페닐메탄설포닐 플루오라이드(이하, 「PMSF」라고 하는 경우가 있다.), 아프로티닌(aprotinin), 베스타틴(bestatin), 류펩틴(leupeptin), 펩스타틴 A(pepstatin A), E-64(L-trans-에폭시숙시닐로이실아미드-4-구아니디노부탄), 에틸렌디아민사초산, 포스포라미돈(phosphoramidon) 등을 사용할 수 있지만, 추출물에는 세린 프로테아제(serine protease)가 포함되는 경우가 많기 때문에, 상기 중에서도 세린 프로테아제에 대해 특이성이 높은 인히비터로서 작용하는 PMSF를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 1종류의 프로테아제 인히비터 뿐 아니라, 수종류의 혼합물(프로테아제 인히비터 칵테일(protease inhibitor cocktail))을 사용해도 된다.

해당 추출용 액 중에 있어서의 프로테아제 인히비터의 함유량에 특별히 제한은 없지만, 무세포계 단백질 합성에 필수인 효소류의 분해 저해능을 적합하게 발휘할 수 있는 관점에서, 1 μM~50 mM 함유되는 것이 바람직하고, 0.01 mM~5 mM 함유되는 것이 보다 바람직하다. 프로테아제 인히비터가 1 μM 미만이면 프로테아제의 분해활성을 충분히 억제할 수 없는 경향이 있기 때문이고, 또한 프로테아제 인히비터가 50 mM를 초과하면 단백질 합성반응을 저해하는 경향이 있기 때문이다.

또한 상기 동물 유래의 조직 또는 배양세포에 사용하는 추출용 액은, 상기 프로테아제 인히비터에 더하여, 칼륨염, 마그네슘염, 디티오트레이톨(dithiothreitol)(이하 DTT) 및 완충제를 적어도 함유하는 것이 바람직하다.

상기 칼륨염으로서는, 예를 들면 초산칼륨, 탄산칼륨, 탄산수소칼륨, 염화칼륨, 인산수소이칼륨, 구연산수소이칼륨, 황산칼륨, 인산이수소칼륨, 요오드화칼륨, 프탈산칼륨 등 일반적인 형태로 사용할 수 있고, 그 중에서도 초산칼륨을 사용하는 것이 바람직하다. 칼륨염은, 단백질 합성반응에 있어서의 보조인자로서 작용한다.

해당 추출용 액 중에 있어서의 칼륨염의 함유량에 특별히 제한은 없지만, 보존안정성의 관점에서, 예를 들면 초산칼륨 등 1가의 칼륨염인 경우, 10 mM~500 mM 함유되는 것이 바람직하고, 20 mM~300 mM 함유되는 것이 보다 바람직하다. 칼륨염이 10 mM 미만 또는 500 mM를 초과하면 단백질 합성에 필수인 성분이 불안정해지는 경향이 있기 때문이다.

상기 마그네슘염으로서는, 예를 들면 초산마그네슘, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 구연산마그네슘, 인산수소마그네슘, 요오드화마그네슘, 락트산마그네슘, 질산마그네슘, 옥살산마그네슘 등 일반적인 형태로 사용할 수 있고, 그 중에서도 초산마그네슘을 사용하는 것이 바람직하다. 마그네슘염도, 단백질 합성반응에 있어서의 보조인자로서 작용한다.

해당 추출용 액에 있어서의 마그네슘염의 함유량에 특별히 제한은 없지만, 보존안정성의 관점에서, 예를 들면 초산마그네슘 등 2가의 염인 경우, 0.1 mM~10 mM 함유되는 것이 바람직하고, 0.5 mM~5 mM 함유되는 것이 보다 바람직하다. 마그네슘염이 0.1 mM 미만 또는 10 mM를 초과하면 단백질의 합성에 필수인 성분이 불안정해지는 경향이 있기 때문이다.

상기 DTT는, 산화방지의 목적으로 배합되는 것으로, 해당 추출용 액 중에 있어서 0.1 mM~10 mM 함유되는 것이 바람직하고, 0.5 mM~5 mM 함유되는 것이 보다 바람직하다. DTT가 0.1 mM 미만 또는 10 mM를 초과하면 단백질의 합성에 필수인 성분 이 불안정해지는 경향이 있기 때문이다.

상기 완충제는, 추출용 액에 완충능을 부여하고, 예를 들면 산성 또는 염기성 물질의 첨가 등에 의해 일어나는 추출액의 pH의 급격한 변화에 의한 추출물의 변성을 방지할 목적으로 배합된다. 이러한 완충제로서는 특별히 제한은 없고, 예를 들면, HEPES-KOH, Tris-HCl, 초산-초산나트륨, 구연산-구연산나트륨, 인산, 붕산, MES, PIPES 등을 사용할 수 있다.

완충제는, 얻어진 추출액의 pH가 4~10으로 유지되는 것을 사용하는 것이 바람직하고, pH가 6.0~8.5로 유지되는 것을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 추출액의 pH가 4 미만 또는 pH가 10을 초과하면 본 발명의 반응에 필수인 성분이 변성될 우려가 있기 때문이다. 이러한 관점으로부터, 상기 중에서도 HEPES-KOH(pH 6.0~8.5)를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

해당 추출용 액 중에 있어서의 완충제의 함유량에 특별히 제한은 없지만, 적합한 완충능을 유지하는 관점에서, 5 mM~200 mM 함유되는 것이 바람직하고, 10 mM~100 mM 함유되는 것이 보다 바람직하다. 완충제가 5 mM 미만이면 산성 또는 염기성 물질의 첨가에 의해 pH의 급격한 변동을 일으켜, 추출물이 변성되는 경향이 있기 때문이고, 또한 완충제가 200 mM를 초과하면 염농도가 지나치게 높아져, 단백질 합성에 필수인 성분이 불안정해지는 경향이 있기 때문이다.

더욱이, 추출 대상이 절족동물이나 포유동물 유래의 배양세포인 경우, 얻어지는 추출액의 단백질 합성능 향상을 목적으로 하여, 칼슘염 및 글리세롤이 추가로 첨가된 것인 것이 바람직하다. 칼슘염으로서는 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 염 화칼슘, 초산칼슘, 황산칼슘, 구연산칼슘, 요오드화칼슘, 락트산칼슘, 질산칼슘, 옥살산칼슘 등, 일반적인 형태로 사용할 수 있고, 그 중에서도 염화칼슘을 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우, 염화칼슘의 함유량은 특별히 제한되지 않지만, 단백질 합성능의 향상효과를 유효하게 발휘할 수 있는 관점에서, 0.1 mM~10 mM 함유되는 것이 바람직하고, 0.5 mM~5 mM 함유되는 것이 보다 바람직하다. 또한, 글리세롤의 첨가량에 대해서도 특별히 제한되는 것은 아니지만, 단백질 합성능의 향상효과를 유효하게 발휘할 수 있는 관점에서, 5(v/v)%~80(v/v)%가 되도록 첨가되는 것이 바람직하고, 10(v/v)%~50(v/v)%가 되도록 첨가되는 것이 보다 바람직하다.

상기 절족동물 유래의 추출액은 종래 공지의 적절한 추출조작을 행하여 얻어질 수 있지만, 그 중에서도 추출조작이 간편하여 높은 단백질 합성 활성이 얻어지기 때문에, 누에조직 유래의 추출액은 일본국 특허공개 제2003-235598 명세서에 기재된 방법, 배양세포 유래의 추출액은 일본국 특허공개 제2004-215651 명세서에 기재된 방법에 의해 제작하는 것이 바람직하다.

또한 포유동물 배양세포 유래 추출액을 제작할 때에 있어서의 세포 파쇄방법에 대해서도 특별히 제한은 없고, 종래 공지의 적절한 방법으로 행할 수 있다. 그 중에서도, 동결·해동에 의해 세포를 파쇄하는 방법이 바람직하다. 상기 방법은, 종래의 수법과 비교하여, 보다 온화한 상태에서 세포의 파쇄를 행할 수 있기 때문에, 단백질 합성에 필수인 성분을 파쇄하지 않고 세포밖으로 꺼낼 수 있기 때문에, 종래 보다도 무세포계에서 단백질의 합성량이 높은 포유동물 배양세포 추출액을 용이하게 조제할 수 있다.

상기 포유동물 배양세포의 세포 파쇄방법에서는, 추출용 액 중에 현탁한 포유동물 배양세포를 급격하게 동결시키는 것을 필요로 한다. 상기 파쇄방법에 있어서, 「급격하게 동결」이란, 10초 이하, 바람직하게는 2초 이하에서, 포유동물 배양세포를 동결시키는 것을 가리킨다. 포유동물 배양세포의 동결을 급격하게 행하지 않은 경우에는, 단백질 합성에 필수인 성분이 불활성화될 우려가 있기 때문에, 상기 추출방법의 상기 효과를 달성할 수 없다.

상기와 같이 포유동물 배양세포를 급격하게 동결시키는 온도로서는, 통상 -80℃ 이하이고, 바람직하게는 -150℃ 이하이다. -80℃를 초과하는 온도에서 급격히 동결시키면, 단백질 합성에 필수인 성분이 실활(失活)되어 단백질 합성능이 저하되어 버리는 경향이 있기 때문이다.

상기 포유동물 배양세포의 급격한 동결은, 예를 들면, 액체 질소나 액체 헬륨 등의 불활성 가스를 사용하는 것 등에 의해 실현할 수 있지만, 입수가 용이하고 저렴한 액체 질소를 사용해서 행하는 것이 바람직하다.

상기 급격하게 동결한 포유동물 배양세포를 해동한 후, 원심분리하는 경우, 해동은, 예를 들면 -10℃~20℃의 수욕(水浴) 또는 빙수욕 중에서의 해동, 실온(25℃)에서의 방치 등에 의해 실현할 수 있지만, 단백질 합성에 필수인 성분의 실활을 방지하고, 단백질 합성능의 저하를 확실하게 방지하는 것으로부터, 0℃~20℃(특히, 4℃~10℃)의 수욕 또는 빙수욕 중에서 해동을 행하는 것이 바람직하다.

해동한 포유동물 배양세포의 원심분리는, 당분야에 있어서 통상 행해지고 있는 조건(10,000×g~50,000×g, 0℃~10℃, 10분간~60분간)에서 행하면 된다.

포유동물 배양세포 추출액의 조제방법에 있어서, 세포 파쇄후로부터 무세포계 단백질 합성용의 포유동물 배양세포 추출액을 얻을 때까지의 순서 등에 대해서는 특별히 제한되는 것은 아니다.

예를 들면, 추출용 액 중에 현탁한 포유동물 배양세포를 급격하게 동결시키는 공정 후에, 해동하고, 원심분리하는 경우에는, 이 원심분리 후의 상청(상청 1)을 그대로 포유동물 배양세포 추출액으로 해도 되고, 또한, 상청 1을 추가로 원심분리하고, 얻어진 상청(상청 2)을 포유동물 배양세포 추출액으로 해도 된다. 상기 상청 1의 원심분리의 조건으로서는, 상술한 것과 동일한 조건(10,000×g~50,000×g, 0℃~10℃, 10분간~60분간)에서 행하면 된다.

또한 상술한 바와 같이 각각 조제한 후에, 겔여과를 행하고, 겔여과 후의 여액으로부터 280 nm에 있어서의 흡광도가 10 이상인 분획을 분취(分取)하여 추출액으로서 조제하도록 해도 된다.

또한, 조제방법에 제공하는 포유동물 배양세포는, 배양에 사용하는 배지의 번역반응액으로의 반입을 피하기 위해, 상기 급격한 동결을 행하기 전에, 세정액으로 미리 세정해두는 것이 바람직하다. 세정액의 조성으로서는, 상술한 추출용 액과 동일한 조성의 것이면 된다. 세정액으로의 세정은, 포유동물 배양세포에 세정액을 첨가하고, 이것을 원심분리(예를 들면, 700×g, 10분간, 4℃라고 하는 조건)함으로써 행한다.

세정에 사용하는 세정액의 양은, 배지를 완전히 씻어흘린다고 하는 이유에서, 습중량(濕重量) 1 g의 포유동물 배양세포에 대해 5 mL~100 mL인 것이 바람직하 고, 10 mL~50 mL인 것이 보다 바람직하다.

세정횟수는 1회~5회 행하는 것이 바람직하고, 2회~4회 행하는 것이 보다 바람직하다.

포유동물 배양세포의 양은, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 추출효율을 최적으로 유지하기 위해, 추출용 액 1 mL에 대해 0.1 g~5 g인 것이 바람직하고, 0.5 g~2 g인 것이 보다 바람직하다.

포유동물 배양세포 유래의 추출액 중에 있어서의 추출물의 함유량에 특별히 제한은 없지만, 단백질 농도로 1 ㎎/mL~200 ㎎/mL인 것이 바람직하고, 그 중에서도 10 ㎎/mL~100 ㎎/mL인 것이 보다 바람직하다. 해당 추출물의 함유량이 단백질 농도로 1 ㎎/mL 미만이면 무세포계 단백질 합성에 필수인 성분의 농도가 낮아져, 충분한 합성반응을 행할 수 없게 될 우려가 있기 때문이고, 또한 해당 추출물의 함유량이 단백질 농도로 200 ㎎/mL를 초과하면 추출액 자체가 높은 점성을 가져, 조작하기 어려울 우려가 있기 때문이다.

또한, 상기 범위의 양의 추출물을 함유하는 추출액은, 추출액의 단백질 농도측정을 이용하여 조제할 수 있다. 해당 단백질 농도측정은, 당분야에 있어서 통상 행해지고 있는 바와 같이, 예를 들면 BCA Protein assay Kit(PIERCE사제)를 사용하여, 반응시약 2 mL에 대해 샘플을 0.1 mL 첨가하고, 37℃에서 30분간 반응시켜, 562 nm에 있어서의 흡광도를 측정한다고 하는 순서로 행한다. 분광광도계(Ultrospec 3300 pro, 아마샴 바이오사이언스사제)를 사용하여, 562 nm에 있어서의 흡광도를 측정한다. 대조로서는 통상 소혈청 알부민(BSA)을 사용한다.

포유동물 배양세포 유래의 추출액은, 추출물을 단백질 농도로 10 ㎎/mL~100 ㎎/mL 함유하는 동시에, 20 mM~300 mM의 초산칼륨, 0.5 mM~5 mM의 초산마그네슘, 0.5 mM~5 mM의 DTT, 0.01 mM~5 mM의 PMSF, 10 mM~100 mM의 HEPES-KOH(pH 6~8.5)를 함유하도록 실현되는 것이 바람직하다. 또한 상기에 더하여, 추가로 0.5 mM~5 mM의 염화칼슘염 및 10(v/v)%~50(v/v)%의 글리세롤을 함유하는 것이 바람직하다.

무세포계 단백질 합성반응액에 있어서는, 예를 들면 상술한 바와 같이 조제된 절족동물 유래 또는 포유동물 배양세포 추출액을 사용해서 조제한다. 상기 반응액은 상기 추출액을 10(v/v)%~80(v/v)%, 특히 30(v/v)%~60(v/v)% 함유하도록 조제된 것인 것이 바람직하다. 즉, 반응액의 전체에 있어서, 상기 절족동물 유래 또는 포유동물 배양세포 유래의 추출물의 함유량이, 단백질 농도로 0.1 ㎎/mL~160 ㎎/mL가 되도록 조제되는 것이 바람직하고, 3 ㎎/mL~60 ㎎/mL가 되도록 조제되는 것이 보다 바람직하다. 해당 추출물의 함유량이 단백질 농도로 0.1 ㎎/mL 미만 또는 160 ㎎/mL를 초과하면 단백질의 합성속도가 저하되는 경향이 있기 때문이다.

또한, 해당 추출물의 함유량이 상기 범위라면, 상기 절족동물 유래 또는 포유동물세포 유래의 추출액을 단독으로 사용해도 되고, 다른 추출액을 혼합해도 된다. 또한 다른 추출액을 혼합하는 경우는 어떠한 비율이어도 된다.

상기 절족동물 유래의 추출물을 함유하는 추출액을 사용한 경우에 있어서의 번역계용 반응액, 전사/번역계용 반응액에 있어서, 특별히 제한은 없고 종래 공지의 적절한 성분을 함유하고 있어도 된다. 그 중에서도, 단시간에 대량의 단백질을 합성할 수 있다고 하는 관점에서 번역계용 반응액에 있어서, 누에조직 유래의 번역 계용 반응액의 경우, 일본국 특허공개 제2003-235598 명세서, 배양세포 유래 추출액의 경우, 일본국 특허공개 제2004-215651 명세서에 기재된 성분이 함유되는 것이 바람직하다. 또한 전사/번역계용 반응액의 경우, 예를 들면 일본국 특허공개 제2003-245094 명세서에 기재된 성분이 함유된다.

상기 포유동물 배양세포 유래의 추출물을 함유하는 추출액을 사용한 무세포계 단백질 합성반응액은, 상기에 기재된 포유동물 배양세포 추출액을 제외한 성분으로서, 외래 mRNA, 칼륨염, 마그네슘염, DTT, 아데노신 삼인산, 구아노신 삼인산, 크레아틴 인산, 크레아틴 키나아제, 아미노산성분, 완충제를 적어도 함유하는 것이 바람직하다. 이러한 반응액을 사용해서 번역반응을 행함으로써, 단시간에 대량의 단백질 합성이 가능하다.

상기 반응액에 사용하는 외래 mRNA란, 주형 DNA(본 발명의 발현벡터에 목적 단백질을 코드하는 구조유전자가 삽입된 것)로부터 전사한 mRNA를 가리키고, 코드하는 단백질(펩티드를 포함한다)에 특별히 제한은 없으며, 독성을 갖는 단백질을 코드하는 것이어도 되고, 당단백질을 코드하는 것이어도 되며, 융합 단백질을 코드하는 염기서열이어도 되고, 또한 발현시킨 단백질의 정제를 용이하게 한다고 하는 관점에서 종래 공지의 히스티딘 태그나, GST 태그를 코드하는 염기서열 등을 부가시켜도 된다. 이들 태그 서열은 통상 목적 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 부가된다.

또한 반응액에 사용하는 외래 mRNA는, 그 염기 수에 특별히 제한은 없고, 목적으로 하는 단백질을 합성할 수 있다면 mRNA 전부가 동일한 염기 수가 아니어도 된다. 또한, 목적으로 하는 단백질을 합성할 수 있을 정도로 상동한 서열이라면, 각 mRNA는 복수 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 것이어도 된다.

반응액 중에 있어서, 외래 mRNA는, 단백질 합성의 속도 관점에서, 1 ㎍/mL~1000 ㎍/mL 함유되는 것이 바람직하고, 10 ㎍/mL~500 ㎍/mL 함유되는 것이 보다 바람직하다. 외래 mRNA가 1 ㎍/mL 미만 또는 1000 ㎍/mL를 초과하면 단백질 합성의 속도가 저하되는 경향이 있기 때문이다.

해당 반응액 중에 있어서의 칼륨염으로서는, 추출용 액의 성분으로서 상술한 각종 칼륨염, 적합하게는 초산칼륨을 바람직하게 사용할 수 있다. 칼륨염은, 상술한 추출용 액에 있어서의 칼륨염의 경우와 동일한 관점에서, 해당 반응액 중에 있어서, 10 mM~50 mM 함유되는 것이 바람직하고, 20 mM~300 mM 함유되는 것이 보다 바람직하다.

해당 반응액 중에 있어서의 마그네슘염으로서는, 추출용 액의 성분으로서 상술한 각종 마그네슘염, 적합하게는 초산마그네슘을 바람직하게 사용할 수 있다. 마그네슘염은, 상술한 추출액에 있어서의 마그네슘염의 경우와 동일한 관점에서, 해당 반응액 중에 있어서, 0.1 mM~10 mM 함유되는 것이 바람직하고, 0.5 mM~5 mM 함유되는 것이 보다 바람직하다.

해당 반응액 중에 있어서의 DTT는, 상술한 추출용 액에 있어서의 DTT의 경우와 동일한 관점에서, 0.1 mM~10 mM 함유되는 것이 바람직하고, 0.5 mM~5 mM 함유되는 것이 보다 바람직하다.

해당 반응액 중에 있어서의 아데노신 삼인산(이하, 「ATP」라고 하는 경우가 있다.)은, 단백질 합성의 속도 관점에서, 해당 반응액 중에 있어서 0.01 mM~10 mM 함유되는 것이 바람직하고, 0.1 mM~5 mM 함유되는 것이 보다 바람직하다. ATP가 0.01 mM 미만 또는 10 mM를 초과하면 단백질의 합성속도가 저하되는 경향이 있기 때문이다.

해당 반응액 중에 있어서의 구아노신 삼인산(이하, 「GTP」라고 하는 경우가 있다.)은, 단백질 합성의 속도 관점에서, 해당 반응액 중에 있어서 0.01 mM~10 mM 함유되는 것이 바람직하고, 0.05 mM~5 mM 함유되는 것이 보다 바람직하다. GTP가 0.01 mM 미만 또는 10 mM를 초과하면 단백질 합성의 속도가 저하되는 경향이 있기 때문이다.

해당 반응액 중에 있어서의 크레아틴 인산은, 단백질을 계속적으로 합성하기 위한 성분으로서, ATP와 GTP를 재생할 목적으로 배합된다. 크레아틴 인산은, 단백질 합성의 속도 관점에서, 해당 반응액 중에 있어서 1 mM~200 mM 함유되는 것이 바람직하고, 10 mM~100 mM 함유되는 것이 보다 바람직하다. 크레아틴 인산이 1 mM 미만이면 충분한 양의 ATP와 GTP가 재생되기 어려워, 결과적으로 단백질의 합성속도가 저하되는 경향이 있기 때문이고, 또한 크레아틴 인산이 200 mM를 초과하면 저해물질로서 작용하여, 단백질의 합성속도가 저하되는 경향이 있기 때문이다.

해당 반응액 중에 있어서의 크레아틴 키나아제는, 단백질을 계속적으로 합성하기 위한 성분으로서, 크레아틴 인산과 함께 ATP와 GTP를 재생할 목적으로 배합된다. 크레아틴 키나아제는, 단백질 합성의 속도 관점에서, 해당 반응액 중에 있어서 1 ㎍/mL~1000 ㎍/mL 함유되는 것이 바람직하고, 10 ㎍/mL~500 ㎍/mL 함유되는 것이 보다 바람직하다. 크레아틴 키나아제가 1 ㎍/mL 미만이면 충분한 양의 ATP와 GTP가 재생되기 어려워, 결과적으로 단백질의 합성속도가 저하되는 경향이 있기 때문이고, 또한 크레아틴 키나아제가 1000 ㎍/mL를 초과하면 저해물질로서 작용하여, 단백질의 합성속도가 저하되는 경향이 있기 때문이다.

해당 반응액 중에 있어서의 아미노산성분은, 20종류의 아미노산, 즉, 발린(valine), 메티오닌(methionine), 글루타민산(glutamic acid), 알라닌(alanine), 류신(leucine), 페닐알라닌, 글리신(glycine), 프롤린(proline), 이소류신, 트립토판(tryptophan), 아스파라긴(asparagine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 히스티딘(histidine), 아스파라긴산(aspartic acid), 티로신(tyrosine), 리신(lysine), 글루타민, 시스틴(cystine), 아르기닌(arginine)의 20종류의 아미노산을 적어도 함유한다. 이 아미노산에는, 방사선동위원소(radioisotope) 표지된 아미노산도 포함된다. 추가로, 필요에 따라 수식 아미노산을 함유하고 있어도 된다. 해당 아미노산성분은, 통상, 각 종류의 아미노산을 대략 등량씩 함유해서 된다.

단백질 합성의 속도 관점에서, 해당 반응액 중에 있어서 상기 아미노산성분이 1 μM~1000 μM 함유되는 것이 바람직하고, 10 μM~200 μM 함유되는 것이 보다 바람직하다. 아미노산성분이 1 μM 미만 또는 1000 μM를 초과하면 단백질의 합성속도가 저하되는 경향이 있기 때문이다.

반응액에 함유되는 완충제로서는, 상술한 추출액과 동일한 것을 적합하게 사용할 수 있고, 동일한 이유에서, HEPES-KOH(pH 6~8.5)를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 완충제는, 상술한 추출액에 있어서의 완충제의 경우와 동일한 관점에서, 5 mM~200 mM 함유되는 것이 바람직하고, 10 mM~100 mM 함유되는 것이 보다 바람직하다.

더욱이, 반응액에 있어서는, RNase 인히비터가 추가로 첨가된 것인 것이 바람직하다. RNase 인히비터는, 추출액에 혼재하는 포유동물 배양세포 유래의 RNase에 의해, 무세포계 단백질 합성시에 외래 mRNA나 tRNA가 원하지 않게 소화되어, 단백질의 합성을 방해하는 것을 방지할 목적으로 배합되는 것으로, 해당 반응액 중에 있어서 0.1 U/μL~100 U/μL 함유되는 것이 바람직하고, 0.5 U/μL~10 U/μL 함유되는 것이 보다 바람직하다.

더욱이, 반응액에 있어서는, tRNA가 추가로 첨가된 것인 것이 바람직하다. tRNA는, 상기 20종류의 아미노산에 대응한 종류의 tRNA를 대략 등략씩 함유해서 된다. 단백질 합성의 속도 관점에서, 해당 반응액 중에 있어서 1 ㎍/mL~1000 ㎍/mL 함유되는 것이 바람직하고, 10 ㎍/mL~500 ㎍/mL 함유되는 것이 보다 바람직하다.

더욱이, 반응액에 있어서는, 칼슘염이 추가로 첨가된 것인 것이 바람직하다. 칼슘염으로서는, 추출용 액의 성분으로서 상술한 각종 칼슘염, 적합하게는 염화칼슘을 바람직하게 사용할 수 있다. 칼슘염은, 상술한 추출용 액에 있어서의 칼슘염의 경우와 동일한 관점에서, 해당 반응액 중에 있어서, 0.05 mM~10 mM 함유되는 것이 바람직하고, 0.1 mM~5 mM 함유되는 것이 보다 바람직하다.

즉, 포유동물 배양세포 유래의 추출액을 사용한 반응액으로서는, 해당 추출액을 30(v/v)%~60(v/v)% 함유하는 동시에, 20 mM~300 mM의 초산칼륨, 0.5 mM~5 mM의 초산마그네슘, 0.5 mM~5 mM의 DTT, 0.1 mM~5 mM의 ATP, 0.05 mM~5 mM의 GTP, 10 mM~100 mM의 크레아틴 인산, 10 ㎍/mL~500 ㎍/mL의 크레아틴 키나아제, 10 μM~200 μM의 아미노산성분, 10 ㎍/mL~500 ㎍/mL의 외래 mRNA, 10 mM~100 mM의 HEPES-KOH(pH 6~8.5)를 함유하도록 실현되는 것이 바람직하다. 또한, 상기에 더하여 추가로 0.5 U/μL~10 U/μL의 RNase 인히비터, 10 ㎍/mL~500 ㎍/mL의 tRNA, 0.1 mM~5 mM의 염화칼슘을 함유하도록 실현되는 것이 보다 바람직하다.

상기 절족동물 유래의 추출액 또는 포유동물 배양세포 추출액을 함유하는 반응액을 사용한 무세포계 단백질 합성반응은, 종래 공지의 예를 들면 저온 항온조에서 행한다. 반응온도는, 통상, 10℃~40℃, 바람직하게는 20℃~30℃의 범위 내이다. 반응온도가 10℃ 미만이면 단백질의 합성속도가 저하되는 경향이 있고, 또한 반응온도가 40℃를 초과하면 필수 성분이 변성(變姓)되는 경향이 있기 때문이다. 반응의 시간은, 통상 1시간~72시간, 바람직하게는 3시간~24시간이다.

또한, 포유동물 배양세포 추출액을 함유하는 반응액을 사용한 무세포계 단백질 합성의 경우, 합성반응을 행하기 전에, 추출액에 mRNA 이외의 반응액 조성의 성분을 첨가한 상태에 있어서, 일정시간 보온을 행하는 것이 바람직하다. 보온은, 종래 공지의 예를 들면 저온 항온조에서 행한다. 보온시간은, 통상 0℃~50℃, 바람직하게는 15℃~37℃의 범위이다. 보온온도가 0℃ 미만이면 보온의 효과가 얻어지기 어렵고, 또한 보온온도가 50℃를 초과하면 필수 성분이 변성되는 경향이 있기 때문이다. 보온의 시간은, 통상 1분~120분, 바람직하게는 10분~60분이다.

또한 상기 전사/번역계용 반응액을 사용한 무세포계 단백질 합성반응(전사/번역계 합성반응)에 대해서도, 상기 번역계 합성반응의 경우와 동일하게, 종래 공 지의 예를 들면 저온 항온조에서 행하면 된다. 전사공정의 반응온도는, 통상 10℃~60℃, 바람직하게는 20℃~50℃의 범위 내이다. 전사공정의 반응온도가 10℃ 미만이면 전사의 속도가 저하되는 경향이 있고, 또한 전사공정의 반응온도가 60℃를 초과하면 반응에 필수인 성분이 변성되는 경향이 있기 때문이다. 또한 번역공정의 온도는, 10℃~40℃, 바람직하게는 20℃~30℃의 범위 내이다. 번역공정의 반응온도가 10℃ 미만이면 단백질의 합성속도가 저하되는 경향이 있고, 또한 번역공정의 반응온도가 40℃를 초과하면 반응에 필수인 성분이 변성되는 경향이 있기 때문이다.

전사/번역계 합성반응에서는, 전사, 번역공정을 연속해서 실시할 수 있다고 하는 관점에서 양 공정에 적합한 20℃~30℃의 범위에서 반응을 행하는 것이 특히 바람직하다. 반응시간은, 전체 공정 합쳐서, 통상, 1시간~72시간, 바람직하게는 3시간~24시간이다.

상기 번역계용 반응액, 전사/번역계용 반응액을 사용해서 합성할 수 있는 단백질에 특별히 제한은 없다. 합성된 단백질의 양은, 효소 활성의 측정, SDS-PAGE, 면역검정법 등에 의해 측정할 수 있다.

<무세포계 단백질 합성 키트>

또한, 본 발명은, 상술한 본 발명의 발현벡터를 포함하는 무세포계 합성용 키트도 제공한다. 해당 무세포계 단백질 합성용 키트에는, 무세포계 단백질 합성반응액을 포함한다. 해당 무세포계 단백질 합성용 키트에 있어서의 적합한 발현벡터, 무세포계 단백질 합성반응액의 조성, 농도, 기타 적합한 조성에 대해서는 상술한 바와 같다. 이러한 무세포계 단백질 합성용 키트는, 발현벡터, 무세포계 단백질 합 성반응액을 수용한 적절한 용기와, 기타 적당한 요소로 구성되어 있으면 되고, 특별히 제한되는 것은 아니다. 또한, 무세포계 단백질 합성에 사용하는 추출물은, 보존 면에서, 무세포계 단백질 합성용 반응액과 나눠 수용하고 있어도 된다.

실시예

이하에 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

[참고예 1: 벡터 pTNT-Luc의 구축]

루시페라아제(luciferase)를 코드하는 구조유전자를 갖는 pGEM-Luc Vector(프로메가사제) 5 ng를 주형으로 하고, 서열표 서열번호 12에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Luc T7-F3-Kpn), 서열표 서열번호 13에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Luc T7-R4-Kpn), KOD plus(도요보세키사제)를 사용하여, 96℃ 2분에서 주형을 변성시킨 후, 96℃ 15초, 50℃ 30초, 68℃ 120초, 30사이클의 PCR을 행하고, 구조유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 증폭하였다. 에탄올 침전에 의해 PCR 산물을 정제한 후, KpnI로 소화하였다. 이와는 별도로, pTNT Vector(프로메가사제)를 KpnI로 소화하였다. 이들 반응액을 아가로스겔 전기영동으로 분리한 후, Gen Elute Gel Purification Kit(시그마사제)를 사용해서 정제하였다. Ligation High(도요보세키사제)를 사용하여, 이들을 라이게이션한 후, 대장균 DH5α(도요보세키사제)를 형질전환하였다. 형질전환한 대장균으로부터 알칼리-SDS법에 의해 조제한 플라스미드를, 서열표 서열번호 14에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(T7 promoter) 및 Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS(어플라이드 바이오 시스템즈사제)를 사용하여 시퀀싱반응(96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 4분, 25사이클)을 행하였다. 이 반응액을 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(어플라이드 바이오 시스템즈사제)에 제공하고, 염기서열 해석을 행하였다. pTNT Vector 유래의 5'-β 글로빈 리더서열(leader sequence)의 하류에 루시페라아제 유전자의 개시 코돈이 삽입된 플라스미드를 pTNT-Luc라 명명하였다.

[참고예 2: 주형 DNA(벡터 pFib-Luc)의 제작]

상기 참고예 1에서 작성한 플라스미드 벡터 pTNT-Luc를 주형으로 하고, 서열표 서열번호 15에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(T7p Rv), 서열표 서열번호 16에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Luc-ATG)를 사용하여, 96℃ 15초, 50℃ 30초, 68℃ 5분, 30사이클의 PCR을 행하였다. 반응종료 후, 전기영동으로 PCR 산물을 분리한 후, Gen Elute Gel Purification Kit(시그마사제)를 사용해서 정제하고, 이것을 라이게이션반응에 사용하였다. 이와 같이 하여, 5'UTR의 삽입 효과를 확인하기 위해, 플라스미드 벡터 pTNT-Luc로부터 SP6 프로모터 서열, 5'-β 글로빈 리더서열 및 루시페라아제를 코드하는 구조유전자의 5' 상류측 멀티클로닝 사이트를 결실시킨 플라스미드 벡터를 얻었다.

서열표 서열번호 1에 나타내는 염기서열을 갖는 누에의 피브로인 L사슬 유전자의 5'UTR의 센스가닥을 DNA 합성기로 합성하고, T4 Polynucleotide Kinase(도요보세키사제)에 의해 그 5' 말단의 인산화를 행하였다. 반응종료 후, 센스가닥과 안 티센스가닥을 혼합하고, 95℃에서 5분간 열처리하였다. 이것을 실온이 될 때까지 정치(靜置)하고 센스가닥과 안티센스가닥을 어닐링(annealing)시켰다. 에탄올 침전에 의해 정제한 후, 물에 용해시켰다. SigmaSpin Post Reaction Purification Columns(시그마사제)에 의해, 과잉의 ATP를 제거한 후, 다시 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 얻어진 이중가닥 DNA 단편을 인서트(insert)로 하고, 상기 SP6 프로모터 서열, β 글로빈 리더서열 및 구조유전자의 5' 상류측 멀티클로닝 사이트를 결실한 pTNT-Luc 유래의 벡터와 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 염기서열 해석을 행하였다. 이와 같이 하여, 누에의 피브로인 L사슬 유전자의 5'UTR이 순방향(5'→3')으로 1개 삽입된 벡터를 선택하였다. 이와 같이 하여, T7 프로모터 서열과 구조유전자 사이에 누에의 피브로인 L사슬 유전자의 5'UTR이 순방향으로 1개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 제작하였다. 얻어진 주형 DNA를, pFib-Luc라 이름붙였다.

[참고예 3: 주형 DNA(벡터 pSer-Luc)의 제작]

서열표 서열번호 2에 나타내는 염기서열을 갖는 누에의 세리신 유전자의 5'UTR을 사용한 것 이외에는 참고예 2와 동일하게 하여, T7 프로모터 서열과 구조유전자 사이에, 서열표 서열번호 2에 나타내는 염기서열을 갖는 누에의 세리신 유전자의 5'UTR이 순방향(5'→3')으로 1개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 제작하였다. 얻어진 주형 DNA를, pSer-Luc라 이름붙였다.

[참고예 4: 주형 DNA(벡터 pAphd-Luc)의 제작]

서열표 서열번호 3에 나타내는 염기서열을 갖는 AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR을 사용한 것 이외에는 참고예 2와 동일하게 하여, T7 프로모터 서열과 구조유전자 사이에, 서열표 서열번호 3에 나타내는 염기서열을 갖는 AcNPV의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR이 순방향(5'→3')으로 1개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 제작하였다. 얻어진 주형 DNA를 pAphd-Luc라 이름붙였다.

[참고예 5: 주형 DNA(벡터 pFAphd-Luc)의 제작]

참고예 2에서 누에의 피브로인 L사슬 유전자의 5'UTR로부터 조제한 이중가닥 DNA 단편과, 참고예 4에서 AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR로부터 조제한 이중가닥 DNA 단편을 함께 인서트로서 사용하여, 상기 SP6 프로모터 서열, β 글로빈 리더서열 및 구조유전자의 5' 상류측 멀티클로닝 사이트를 결실한 pTNT-Luc 유래의 벡터와 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 염기서열 해석을 행하였다. 이와 같이 하여, 5'측으로부터 순서대로 누에의 피브로인 L사슬 유전자의 5'UTR 및 AcNPV의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR이 각각 순방향(5'→3')으로 1개씩 삽입된 벡터(주형 DNA)를 선택한 것 이외에는, 참고예 2와 동일하게 해서 행하였다. 얻어진 주형 DNA를, pFAphd-Luc라 이름붙였다.

[참고예 6: 주형 DNA(벡터 pBphd-Luc)의 제작]

서열표 서열번호 4에 나타내는 염기서열을 갖는 BmCPV(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR을 사용한 것 이외에는 참고예 2와 동일하게 하여, T7 프로모터 서열과 루시페라아제 유전자 사이에, 서열표 서열번호 4에 나타내는 염기서열을 갖는 BmCPV의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR이 순방향(5'→3')으로 1개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 제작하였다. 얻어진 주형 DNA를, pBphd-Luc라 이름붙였다.

[참고예 7: 주형 DNA(벡터 pBphd-R-Luc)의 제작]

BmCPV의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR이 역방향(3'→5')으로 1개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 선택한 것 이외에는, 참고예 6과 동일하게 해서 행하였다. 얻어진 주형 DNA를, pBphd-R-Luc라 이름붙였다.

[참고예 8: 주형 DNA(벡터 pEphd-FF-Luc)의 제작]

서열표 서열번호 5에 나타내는 염기서열을 갖는 EsCPV(Euxoa scandes cytoplasmic polyhedrosis virus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR을 사용한 것 이외에는, 참고예 2와 동일하게 하여 제작한 이중가닥 DNA 단편을 인서트로 하고, 상기 SP6 프로모터 서열, β 글로빈 리더서열 및 구조유전자의 5' 상류측 멀티클로닝 사이트를 결실한 pTNT-Luc 유래의 벡터와 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 염기서열 해석을 행하였 다. 이와 같이 하여, 5'측으로부터 순서대로 EsCPV의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR이 각각 순방향(5'→3')으로 2개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 선택한 것 이외에는, 참고예 2와 동일하게 해서 행하였다. 얻어진 주형 DNA를, pEphd-FF-Luc라 이름붙였다.

[참고예 9: 주형 DNA(벡터 pEphd-RR-Luc)의 제작]

5'측으로부터 순서대로 EsCPV의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR이 각각 역방향(3'→5')으로 2개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 선택한 것 이외에는, 참고예 8과 동일하게 해서 행하였다. 얻어진 주형 DNA를, pEphd-RR-Luc라 이름붙였다.

[참고예 10: 주형 DNA(벡터 pHphd-Luc)의 제작]

서열표 서열번호 6에 나타내는 염기서열을 갖는 HcNPV(Hyphantria cunea nuclear polyhedrosis virus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR을 사용한 것 이외에는, 참고예 2와 동일하게 하여 제작한 이중가닥 DNA 단편을 인서트로 하고, 상기 SP6 프로모터 서열, β 글로빈 리더서열 및 구조유전자의 5' 상류측 멀티클로닝 사이트를 결실한 pTNT-Luc 유래의 벡터와 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 염기서열 해석을 행하였다. 이와 같이 하여, HcNPV의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR이 순방향(5'→3')으로 1개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 선택한 것 이외에는, 참고예 2와 동일하게 해서 행하였다. 얻어진 주형 DNA를, pHphd-Luc라 이름붙였다.

[참고예 11: 주형 DNA(벡터 pHphd-R-Luc)의 제작]

HcNPV의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR이 역방향(3'→5')으로 1개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 선택한 것 이외에는, 참고예 10과 동일하게 해서 행하였다. 얻어진 주형 DNA를, pHphd-R-Luc라 이름붙였다.

[참고예 12: 주형 DNA(벡터 pHphd-RR-Luc)의 제작]

5'측으로부터 순서대로 HcNPV의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR이 각각 역방향(3'→5')으로 2개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 선택한 것 이외에는, 참고예 10과 동일하게 해서 행하였다. 얻어진 주형 DNA를, pHphd-RR-Luc라 이름붙였다.

[참고예 13: 주형 DNA(벡터 pCphd-Luc)의 제작]

서열표 서열번호 7에 나타내는 염기서열을 갖는 CrNPV(Choristoneurarosaceananucleopolyhedrovirus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR을 사용한 것 이외에는, 참고예 2와 동일하게 하여 제작한 이중가닥 DNA 단편을 인서트로 하고, 상기 SP6 프로모터 서열, β 글로빈 리더서열 및 구조유전자의 5' 상류측 멀티클로닝 사이트를 결실한 pTNT-Luc 유래의 벡터와 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 염기서열 해석을 행하였다. 이와 같이 하여, CrNPV의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR이 순방향(5'→3')으로 1개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 선택한 것 이외에는, 참고예 2와 동일하게 해서 행하였다. 얻어진 주형 DNA를, pCphd-Luc라 이름붙였다.

[참고예 14: 주형 DNA(벡터 pCphd-R-Luc)의 제작]

CrNPV의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR이 역방향(3'→5')으로 1개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 선택한 것 이외에는, 참고예 13과 동일하게 해서 행하였다. 얻어진 주형 DNA를, pCphd-R-Luc라 이름붙였다.

[참고예 15: 주형 DNA(벡터 pEophd-R-Luc)의 제작]

서열표 서열번호 8에 나타내는 염기서열을 갖는 EoNPV(Ecotropis oblique nuclear polyhedrosis virus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR을 사용한 것 이외에는, 참고예 2와 동일하게 하여 제작한 이중가닥 DNA 단편을 인서트로 하고, 상기 SP6 프로모터 서열, β 글로빈 리더서열 및 구조유전자의 5' 상류측 멀티클로닝 사이트를 결실한 pTNT-Luc 유래의 벡터와 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 염기서열 해석을 행하였다. 이와 같이 하여, EoNPV의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR이 역방향(3'→5')으로 1개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 선택한 것 이외에는, 참고예 2와 동일하게 해서 행하였다. 얻어진 주형 DNA를, pEophd-R-Luc라 이름붙였다.

[참고예 16: 주형 DNA(벡터 pMphd-FF-Luc)의 제작]

서열표 서열번호 9에 나타내는 염기서열을 갖는 MnNPV(Malacosma neustria nucleopolyhedrovirus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR을 사용한 것 이외에는, 참고 예 2와 동일하게 하여 제작한 이중가닥 DNA 단편을 인서트로 하고, 상기 SP6 프로모터 서열, β 글로빈 리더서열 및 구조유전자의 5' 상류측 멀티클로닝 사이트를 결실한 pTNT-Luc 유래의 벡터와 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 염기서열 해석을 행하였다. 이와 같이 하여, MnNPV의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR이 순방향(5'→3')으로 2개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 선택한 것 이외에는, 참고예 2와 동일하게 해서 행하였다. 얻어진 주형 DNA를, pMphd-FF-Luc라 이름붙였다.

[참고예 17: 주형 DNA(벡터 pMphd-R-Luc)의 제작]

MnNPV의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR이 역방향(3'→5')으로 1개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 선택한 것 이외에는, 참고예 16과 동일하게 해서 행하였다. 얻어진 주형 DNA를, pMphd-R-Luc라 이름붙였다.

[참고예 18: 주형 DNA(벡터 pSphd-Luc)의 제작]

서열표 서열번호 10에 나타내는 염기서열을 갖는 fNPV(Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR을 사용한 것 이외에는, 참고예 2와 동일하게 하여 제작한 이중가닥 DNA 단편을 인서트로 하고, 상기 SP6 프로모터 서열, β 글로빈 리더서열 및 구조유전자의 5' 상류측 멀티클로닝 사이트를 결실한 pTNT-Luc 유래의 벡터와 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 염기서열 해석을 행하였 다. 이와 같이 하여, SfNPV의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR이 순방향(5'→3')으로 1개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 선택한 것 이외에는, 참고예 2와 동일하게 해서 행하였다. 얻어진 주형 DNA를, pSphd-Luc라 이름붙였다.

[참고예 19: 주형 DNA(벡터 pWphd-Luc)의 제작]

서열표 서열번호 11에 나타내는 염기서열을 갖는 WsNPV(Wiseana signata nucleopolyhedrovirus)의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR을 사용한 것 이외에는, 참고예 2와 동일하게 하여 제작한 이중가닥 DNA 단편을 인서트로 하고, 상기 SP6 프로모터 서열, β 글로빈 리더서열 및 구조유전자의 5' 상류측 멀티클로닝 사이트를 결실한 pTNT-Luc 유래의 벡터와 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 염기서열 해석을 행하였다. 이와 같이 하여, WsNPV의 폴리헤드린 유전자의 5'UTR이 순방향(5'→3')으로 1개 삽입된 벡터(주형 DNA)를 선택한 것 이외에는, 참고예 2와 동일하게 해서 행하였다. 얻어진 주형 DNA를, pWphd-Luc라 이름붙였다.

[참고예 20: 곤충 배양세포(High Five) 추출액의 조제]

(1) 곤충 배양세포의 배양

세포수 2.1×10⁷개의 곤충 배양세포 High Five(Invitrogen사제)를, L-글루타민을 첨가한 Express Five 무혈청배지(Invitrogen사제)를 넣은 배양 플라스크(600 ㎠) 내에서 27℃에서 6일간 배양하였다. 결과, 세포수 1.0×10⁸개, 습중량 1.21 g이 되었다.

(2) 곤충 배양세포 추출액의 조제

먼저, 상기 (1)에서 배양한 곤충 배양세포를 수집하고, 하기 조성의 세정액으로 3회 세정(700×g, 4℃, 10분간의 조건에서 원심분리)하였다.

[세정액의 조성]

·60 mM HEPES-KOH(pH 7.9)

·200 mM 초산칼륨

·4 mM 초산마그네슘

·4 mM DTT

세정 후의 곤충 배양세포에, 하기 조성의 추출용 액을 1 mL 첨가하고, 현탁하였다.

[추출용 액의 조성]

·40 mM HEPES-KOH(pH 7.9)

·100 mM 초산칼륨

·2 mM 초산마그네슘

·2 mM 염화칼슘

·20(v/v)% 글리세롤

·1 mM DTT

·1 mM PMSF

이 현탁액을 액체 질소 중에서 급속하게 동결시켰다. 충분히 동결시킨 후, 약 4℃의 빙수욕 중에서 해동하였다. 완전히 해동한 후, 30,000×g, 4℃에서 10분간 원심분리(himacCR20B3, 히타치고기사제)하고, 상청을 회수하였다. 회수한 상청 1.5 mL를 하기 조성의 겔여과용 완충액으로 평형화한 PD-10 탈염칼럼(아마샴 바이오사이언스사제)에 어플라이하였다.

[겔여과용 완충액의 조성]

·40 mM HEPES-KOH(pH 7.9)

·100 mM 초산칼륨

·2 mM 초산마그네슘

·1 mM DTT

·1 mM PMSF

어플라이한 후, 겔여과용 완충액 4 mL로 용출하고, 분광광도계(Ultrospec3300pro, 아마샴 바이오사이언스사제)를 사용하여, 280 nm에 있어서의 흡광도가 30 이상인 분획을 회수하고, 곤충 배양세포 추출액으로 하였다.

[참고예 21: 곤충 배양세포(Sf21) 추출액의 조제]

[(1) 곤충 배양세포의 배양]

곤충세포 Sf21(Invitrogen사제)을, Sf900-II 무혈청배지(Invitrogen사제) 중 27℃에서 배양하였다. 배지 1 mL당 세포수 6.0×10⁵개의 Sf21을 125 mM 삼각플라스크 내의 배지 50 mL 중에서 27℃·130 rpm·5일간 현탁배양을 행하였다. 결과, 배지 1 mL당의 세포수 1.0×10⁸개, 습중량 3 g이 되었다. 이 세포를 사용하여 세포 추출액을 조제하였다.

[(2) 곤충 배양세포 추출액의 조제]

[세정액의 조성]

·40 mM HEPES-KOH(pH 7.9)

·100 mM 초산칼륨

·2 mM 초산마그네슘

·2 mM 염화칼슘

·1 mM DTT

세정 후의 곤충 배양세포에, 하기 조성의 추출용 액을 3 mL 첨가하고, 현탁하였다.

[추출용 액의 조성]

·40 mM HEPES-KOH(pH 7.9)

·100 mM 초산칼륨

·2 mM 초산마그네슘

·2 mM 염화칼슘

·20(v/v)% 글리세롤

·1 mM DTT

·0.5 mM PMSF

이 현탁액을 액체 질소 중에서 급속하게 동결시켰다. 충분히 동결시킨 후, 약 4℃의 빙수욕 중에서 해동하였다. 완전히 해동한 후, 30,000×g, 4℃에서 10분간 원심분리(himacCR20B3, 히타치고기사제)하고, 상청을 회수하였다. 회수한 상청을 추가로 45,000×g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상청을 회수하였다. 회수한 상청 2.5 mL를 하기 조성의 겔여과용 완충액으로 평형화한 PD-10 탈염칼럼(아마샴 바이오사이언스사제)에 어플라이하였다.

[겔여과용 완충액의 조성]

·40 mM HEPES-KOH(pH 7.9)

·100 mM 초산칼륨

·2 mM 초산마그네슘

·1 mM DTT

·0.5 mM PMSF

어플라이한 후, 겔여과용 완충액 3 mL로 용출하고, 분광광도계(Ultrospec3300pro, 아마샴 바이오사이언스사제)를 사용하여, 280 nm에 있어서의 흡광도가 30 이상인 분획을 회수하여, 곤충 배양세포 추출액으로 하였다.

[참고예 22: 누에 추출액의 조제]

5령기 4일째의 누에 유충 15마리로부터 가위, 핀셋, 메스, 약수저를 사용하여, 후부견사선 3.07 g을 적출하고, 이것을 -80℃에서 동결시킨 유발(乳鉢)로 갈아 으깨고, 하기 조성의 추출용 액을 사용하여 추출을 행하였다.

[추출용 액의 조성]

·20 mM HEPES-KOH(pH 7.4)

·100 mM 초산칼륨

·2 mM 초산마그네슘

·2 mM DTT

·0.5 mM PMSF

추출 후, 얻어진 액상물을 원심분리기(himacCR20B3(히타치고기사제))로, 30,000×g, 30분간, 4℃의 조건에서 원심분리를 행하였다.

원심분리 후, 상청만을 단리하고, 다시 30,000×g, 10분간, 4℃의 조건에서 원심분리를 행하였다. 원심분리 후, 상청만을 단리하였다. 탈염칼럼 PD-10(아마샴 바이오사이언스사제)에, 20% 글리세롤을 포함하는 추출용 액을 첨가하여 칼럼을 평형화한 후, 상청을 공급하고, 상기 추출용 액으로 용출함으로써 겔여과를 행하였다.

겔여과 후의 여액의 분획을, 분광광도계(Ultrospec3300pro, 아마샴 바이오사이언스사제)를 사용하여, 280 nm에 있어서의 흡광도가 10 이상인 분획을 분취하고, 5령기의 누에 유충의 후부견사선 유래의 무세포계 단백질 합성용 추출액을 얻었다.

[참고예 23: 포유동물 배양세포(CHO) 추출액의 조제]

[(1) 포유동물 배양세포의 배양]

세포농도 4.9×10⁵ cells/mL의 차이니즈 햄스터 난소세포 CHO K1-SFM(동북대학 가령의학연구소부속 의용세포자원센터로부터 분양)을 CHO SERUM-FREE MEDIUM(SIGMA사제) 200 mL가 든 삼각플라스크(500 mL) 내에서 130 rpm·37℃·5% CO₂ 분위기하에서 120시간 배양하였다. 그 결과, 세포농도 8.8×10⁶ cells/mL, 습중량 3.2 g이 되었다.

[(2) 포유동물 배양세포(CHO) 추출액의 조제]

먼저, 상기 (1)에서 배양한 동물 배양세포를 원심분리(700×g, 10분간)에 의해 수집하고, 하기 조성의 세정용 완충액으로 3회 세정(700×g, 10분간의 조건에서 원심분리)하였다.

[세정용 완충액의 조성]

·40 mM HEPES-KOH(pH 7.9)

·100 mM 초산칼륨

·2 mM 초산마그네슘

·2 mM 염화칼슘

·1 mM DTT

세정 후의 포유동물 배양세포에, 세포 습중량 1 g당 0.8 mL의 하기 조성의 추출용 액을 첨가하고, 세포를 현탁하였다.

[추출용 액의 조성]

·40 mM HEPES-KOH(pH 7.9)

·100 mM 초산칼륨

·2 mM 초산마그네슘

·2 mM 염화칼슘

·20(v/v)% 글리세롤

·1 mM DTT

이 현탁액을 액체 질소 중에서 급속하게 동결시켰다. 충분히 동결시킨 후, 약 4℃의 빙수욕 중에서 해동하였다. 완전히 해동한 후, 30,000×g, 4℃에서 10분간 원심분리(himacCR20B3, 히타치고기사제)하고, 상청을 회수하였다. 회수한 상청을 추가로 30,000×g, 4℃에서 30분간 원심분리하여 상청을 회수하였다. 회수한 상청 2.0 mL를 하기 조성의 겔여과용 완충액으로 평형화한 PD-10 탈염칼럼(아마샴 바이오사이언스사제)에 어플라이하였다.

[겔여과용 완충액의 조성]

·40 mM HEPES-KOH(pH 7.9)

·100 mM 초산칼륨

·2 mM 초산마그네슘

·1 mM DTT

어플라이한 후, 겔여과용 완충액 3 mL로 용출하고, 분광광도계 (Ultrospec3300pro, 아마샴 바이오사이언스사제)를 사용하여, 280 nm에 있어서의 흡광도가 30 이상인 분획을 회수하여, 포유동물 배양세포 추출액으로 하였다.

[실험예 1: 인비트로 전사반응 및 mRNA의 정제]

상기 참고예 1-19에서 제작한 각 벡터(주형 DNA)를, BamHI 또는 BglII로 소화한 후, 페놀-클로로포름 추출, 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 얻어진 벡터 1 ㎍을 주형으로 하고, RiboMax Large Scale RNA production System-T7(프로메가사제)을 사용하여 20 ㎕ 스케일로 37℃ 4시간의 인비트로 전사반응을 행하여, mRNA를 합성하였다.

전사반응 종료 후, 1U의 RQ1 RNase Free DNase(프로메가사제)를 첨가하여, 37℃ 15분 인큐베이트하고, 주형을 소화하였다. 페놀-클로로포름 추출에 의해 단백질을 제거한 후, 에탄올 침전을 행하였다. 얻어진 침전을 100 ㎕의 멸균수에 용해하고, Nick column(아마샴 바이오사이언스사제)에 어플라이한 후, 멸균수로 용출하였다. 용출 분획에 초산칼륨을 종농도 0.3 M가 되도록 첨가하고, 에탄올 침전을 행하였다. 합성된 mRNA의 정량은 260 nm와 280 nm의 흡광도를 측정해서 행하였다.

[실험예 2: 곤충 배양세포(High Five) 유래의 추출물을 함유하는 번역계용 반응액을 사용한 무세포계 단백질 합성]

참고예 20에서 조제한 곤충세포 추출액을 사용하여, 상기 참고예 2~7, 11~19에서 제작한 주형 DNA로부터 상기 실험예 1에 기재된 방법으로 제작한 각 mRNA 각 각에 대해, 하기 조성의 번역계용 반응액을 조제하고, 번역반응을 행하였다.

[번역계용 반응액의 조성]

·50(v/v)% 곤충 배양세포 추출액

·320 ㎍/mL mRNA

·30 mM HEPES-KOH(pH 7.9)

·100 mM 초산칼륨

·2 mM 초산마그네슘

·2 mM DTT

·0.5 mM ATP

·0.25 mM GTP

·20 mM 크레아틴 인산

·200 ㎍/mL 크레아틴 키나아제

·40 μM 아미노산(20종)

·0.25 mM EGTA

·1 U/μL RNase 인히비터(인간태반 유래)

·200 ㎍/mL tRNA

ATP(시그마사제), GTP(시그마사제), 아미노산(20종)(시그마사제), RNase 인히비터(다카라주조사제), tRNA(로슈·다이아그노스틱스사제)를 각각 사용하였다.

반응장치로서 저온 알루미늄 블록 항온조 MG-1000(도쿄리카기카이사제)을 사용하였다. 번역반응은 반응온도 25℃에서 5시간 행하고, 반응액량은 25 μL로 하였 다.

합성된 루시페라아제는 루시페라아제 어세이 키트(E-1500, 프로메가사제)를 사용해서 정량하였다. 루시페라아제 어세이시약 50 μL에 반응액 2.5 μL를 첨가하고, 루미노미터(Tuner Designs TD-20/20, 프로메가사제)를 사용하여, 루시페라아제에 의한 발광을 측정하였다.

도 1은, 실험예 2의 결과를 나타내는 그래프로, 루시페라아제 컨트롤 RNA(프로메가사제)를 100%로 한 경우의 상대합성량을 세로축에 나타내고 있다.

[실험예 3: 곤충 배양세포(Sf21) 유래의 추출물을 함유하는 번역계용 반응액을 사용한 무세포계 단백질 합성]

참고예 21에서 조제한 곤충세포 추출액을 사용하여, 상기 참고예 2~4, 6~16, 18, 19에서 제작한 주형 DNA로부터 상기 실험예 1에 기재된 방법으로 제작한 각 mRNA 각각에 대해서, 하기 조성의 번역계용 반응액을 조제하고, 번역반응을 행하였다.

[번역계용 반응액의 조성]

·50(v/v)% 곤충 배양세포 추출액

·320 ㎍/mL mRNA

·40 mM HEPES-KOH(pH 7.9)

·100 mM 초산칼륨

·1.5 mM 초산마그네슘

·2 mM DTT

·0.25 mM ATP

·0.1 mM GTP

·20 mM 크레아틴 인산

·200 ㎍/mL 크레아틴 키나아제

·80 μM 아미노산(20종)

·0.1 mM EGTA

·1 U/μL RNase 인히비터(인간태반 유래)

·200 ㎍/mL tRNA

반응장치로서 저온 알루미늄 블록 항온조 MG-1000(도쿄리카기카이사제)을 사용하였다. 번역반응은 반응온도 25℃에서 5시간 행하고, 반응액량은 25 μL로 하였다.

도 2는, 실험예 3의 결과를 나타내는 그래프로, 루시페라아제 컨트롤 RNA(프로메가사제)를 100%로 한 경우의 상대합성량을 세로축에 나타내고 있다.

[실험예 4: 누에조직 유래의 추출물을 함유하는 번역계용 반응액을 사용한 무세포계 단백질 합성]

참고예 22에서 조제한 누에 추출액을 사용하여, 상기 참고예 2-19에서 제작한 주형 DNA로부터 상기 실험예 1에 기재된 방법으로 제작한 각 mRNA 각각에 대해서, 하기 조성의 번역계용 반응액을 조제하여, 번역반응을 행하였다.

[번역계용 반응액의 조성]

·50(v/v)% 누에 추출액

·160 ㎍/mL mRNA

·30 mM HEPES-KOH(pH 7.4)

·100 mM 초산칼륨

·1.0 mM 초산마그네슘

·0.5 mM DTT

·10(v/v)% 글리세롤

·0.5 mM ATP

·0.5 mM GTP

·0.25 mM EGTA

·25 mM 크레아틴 인산

·200 ㎍/mL 크레아틴 키나아제

·40 μM 아미노산(20종)

·2 U/μL RNase 인히비터

·200 ㎍/mL tRNA

ATP(시그마사제), GTP(시그마사제), 아미노산(20종)(시그마사제), RNase 인히비터(다카라주조사제), tRNA(로슈·다이아그노스틱스사제)를 각각 사용하였다. 외래 mRNA로서는, 루시페라아제를 코드하는 mRNA(루시페라아제 컨트롤 RNA, 프로메가사제)를 사용하였다.

반응장치로서 저온 알루미늄 블록 항온조 MG-1000(도쿄리카기카이사제)을 사용하였다. 번역반응은 반응온도 25℃에서 5시간 행하고, 반응액량은 25 μL로 하였다. 합성된 루시페라아제는 루시페라아제 어세이 키트(E-1500, 프로메가사제)를 사용해서 정량하였다. 루시페라아제 어세이시약 50 μL에 반응액 2.5 μL를 첨가하고, 루미노미터(Tuner Designs TD-20/20, 프로메가사제)를 사용하여, 루시페라아제에 의한 발광을 측정하였다.

도 3은, 실험예 4의 결과를 나타내는 그래프로, 루시페라아제 컨트롤 RNA(프로메가사제)를 100%로 한 경우의 상대합성량을 세로축에 나타내고 있다.

[실험예 5: 포유동물 배양세포(CHO) 유래의 추출물을 함유하는 번역계용 반응액을 사용한 무세포계 단백질 합성]

참고예 23에서 조제한 포유동물 배양세포 추출액을 사용하여, 상기 참고예 1, 5, 6, 8, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19에서 제작한 주형 DNA로부터 상기 실험예 1에 기재된 방법으로 제작한 각 mRNA 각각에 대해서, 하기 조성의 번역계용 반응액 을 조제하여, 번역반응을 행하였다.

[번역계용 반응액의 조성]

·50(v/v)% 포유동물 배양세포 추출액

·160 ㎍/mL mRNA

·50 mM HEPES-KOH(pH 7.9)

·175 mM 초산칼륨

·1 mM 초산마그네슘

·0.5 mM 염화칼슘

·2 mM DTT

·0.5 mM ATP

·0.25 mM GTP

·30 mM 크레아틴 인산

·200 ㎍/mL 크레아틴 키나아제

·80 μM 아미노산(20종)

·0.25 mM EGTA

ATP(시그마사제), GTP(시그마사제), 아미노산(20종)(시그마사제)을 각각 사용하였다.

반응장치로서 저온 알루미늄 블록 항온조 MG-1000(도쿄리카기카이사제)을 사용하였다. 번역반응을 개시하는데 있어서 상기 번역반응액 중 mRNA를 포함하지 않는 번역반응액을 먼저 제작하고, 25℃에서 30분간 인큐베이트를 행하였다. 그 후, mRNA를 첨가하고 번역반응을 개시(25℃에서 4시간)하였다. 반응액량은 25 μL로 하였다.

도 4는, 실험예 5의 결과를 나타내는 그래프로, 상기 참고예 1에서 제작한 벡터 pTNT-Luc로부터 전사한 mRNA를 100%로 한 경우의 상대합성량을 세로축에 나타내고 있다. 또한, 상기 참고예 1에서 제작한 벡터 pTNT-Luc는, 포유류 유래의 추출액에 있어서 적합하게 번역반응을 촉진하는 DNA 단편(5'β-글로빈 리더서열)을 가지고 있기 때문에, 여기에서는, 참고예 1에 대해 80% 이상의 합성량을 나타내는 상기 DNA 단편을 번역반응을 촉진하는 DNA 단편으로 하였다.

[참고예 24: 발현벡터(pTD1 Vector)의 제작]

서열표 서열번호 17에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(T7 pMn-Eco) 및 그의 안티센스가닥을 DNA 합성기로 합성하고, T4 Polynucleotide Kinase에 의해 그 5'말단의 인산화를 행하였다. 반응종료 후, 센스가닥과 안티센스가닥을 혼합하고 95℃ 5분간 열처리하였다. 이것을 실온이 될 때까지 정치하고 센스가닥과 안티센스가닥을 어닐링시켰다. 에탄올 침전에 의해 정제한 후, 물에 용해시켰다. SigmaSpin Post Reaction Purification Columns에 의해, 과잉의 ATP를 제거한 후, 다시 에탄 올 침전에 의해 정제하였다. 얻어진 이중가닥 DNA 단편을 EcoRI(도요보세키사제)로 소화하고, 이것을 인서트로 하였다. 이와는 별도로 pUC19를 EheI(도요보세키사제) 및 EcoRI로 소화하고, 전기영동으로 분리한 후, Gen Elute Gel Purification Kit를 사용하여 약 2.5 kb의 DNA 단편을 정제하였다. pUC19 유래의 벡터와 인서트를 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 서열표 서열번호 18에 나타내는 M13Reverse 프라이머를 사용하여 염기서열 해석을 행하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를, pUM이라 이름붙였다.

BD BaculoGold Linearized Baculovirus DNA(BD Biosciences사제) 0.5 ㎍을 주형으로 하고, 서열표 서열번호 19에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Phd3 Fw), 서열표 서열번호 20에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Phd3 Rv-Hind), KOD plus(도요보세키사제)를 사용하여, 96℃ 2분으로 주형을 변성시킨 후, 96℃ 15초, 50℃ 30초, 68℃ 30초, 30사이클의 PCR을 행하고, AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)의 폴리헤드린 유전자의 3'UTR을 증폭하였다. T4 Polynucleotide Kinase에 의해 DNA 단편의 5'말단의 인산화를 행하였다. 반응액을 에탄올 침전에 의해 정제한 후, HindIII(도요보세키사제)로 소화하고, 이것을 인서트로 하였다. 이와는 별도로, pUM을 HincII(도요보세키사제) 및 HindIII로 소화하였다. 전기영동으로 분리한 후, Gen Elute Gel Purification Kit를 사용하여 약 2.7 kb의 DNA 단편을 정제하였다. pUM 유래의 벡터와 인서트를 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 서열표 서열번호 18에 나타내는 M13Reverse 프라이머를 사용하여 염기서열 해석을 행하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를, pTM이라 이름붙였다.

서열표 서열번호 21에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(A25T7t)의 센스가닥, 안티센스가닥을 DNA 합성기로 합성하고, T4 Polynucleotide Kinase에 의해 그 5'말단의 인산화를 행하였다. 반응종료 후, 센스가닥과 안티센스가닥을 혼합하고 95℃ 5분간 열처리하였다. 이것을 실온이 될 때까지 정치하고 센스가닥과 안티센스가닥을 어닐링시켰다. 에탄올 침전에 의해 정제한 후, 물에 용해시켰다. SigmaSpin Post Reaction Purification Columns에 의해, 과잉의 ATP를 제거한 후, 다시 에탄올 침전에 의해 정제하고, 이것을 인서트로 하였다. 이와는 별도로 pTM 5 ng를 주형으로 하고, 서열표 서열번호 22에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Not Fw), 서열표 서열번호 23에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Phd3 Rv), KOD plus(도요보세키사제)를 사용하여, 96℃ 2분으로 주형을 변성시킨 후, 96℃ 15초, 50℃ 30초, 68℃ 3분, 30사이클의 PCR을 행하였다. PCR 산물을 전기영동으로 분리한 후, Gen Elute Gel Purification Kit를 사용하여 약 3.0 kb의 DNA 단편을 정제하였다. 정제한 PCR 산물과 인서트를 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 서열표 서열번호 18에 나타내는 M13Reverse 프라이머를 사용하여 염기서열 해석을 행하였다. AcNPV 폴리헤드린 3'UTR 서열의 하류에 폴리 A 꼬리부가 순방향으로 삽입된 플라스미드 DNA를, pTMA라 이름붙였다.

pTMA 5 ng를 주형으로 하고, 서열표 서열번호 22에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Not Fw), 서열표 서열번호 24에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머 (Not Rv), KOD plus(도요보세키사제)를 사용하여, 96℃ 2분으로 주형을 변성시킨 후, 96℃ 15초, 50℃ 30초, 68℃ 3분, 30사이클의 PCR을 행하였다. T4 Polynucleotide Kinase에 의해 PCR 산물의 5'말단의 인산화를 행하였다. 반응액을 전기영동으로 분리한 후, Gen Elute Gel Purification Kit를 사용하여 약 3.0 kb의 DNA 단편을 정제하였다. 정제한 PCR 산물을 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 서열표 서열번호 18에 나타내는 M13Reverse 프라이머를 사용하여 염기서열 해석을 행하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를, pTD1 Vector라 이름붙였다. 제작한 pTD1 Vector는, 서열표 서열번호 29에 나타내는 염기서열을 갖는다. 도 7에, 작성한 pTD1 Vector의 지도(map)를 나타낸다. 도면 중 T7은 T7 프로모터, Enhancer는 MnNPV 유래의 폴리헤드린 유전자 5'UTR(순방향), MCS는 멀티클로닝 사이트, 3'UTR은 AcNPV 유래의 폴리헤드린 유전자 3'UTR, poly A는 폴리 A 꼬리부, terminator는 T7 터미네이터 서열이다.

[참고예 25: 발현벡터(pTD2 Vector)의 제작]

서열표 서열번호 25에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(T7pEo-Eco) 및 그의 안티센스가닥을 DNA 합성기로 합성하고, T4 Polynucleotide Kinase에 의해 그 5'말단의 인산화를 행하였다. 반응종료 후, 센스가닥과 안티센스가닥을 혼합하고, 95℃ 5분간 열처리하였다. 이것을 실온이 될 때까지 정치하고 센스가닥과 안티센스가닥을 어닐링시켰다. 에탄올 침전에 의해 정제한 후, 물에 용해시켰다. SigmaSpin Post Reaction Purification Columns에 의해, 과잉의 ATP를 제거한 후, 다시 에탄 올 침전에 의해 정제하였다. 얻어진 이중가닥 DNA 단편을 EcoRI(도요보세키사제)로 소화하고, 이것을 인서트로 하였다. 이와는 별도로, pUC19를 EheI(도요보세키사제) 및 EcoRI로 소화하고, 전기영동으로 분리한 후, Gen Elute Gel Purification Kit를 사용하여 약 2.5 kb의 DNA 단편을 정제하였다. pUC19 유래의 벡터와 인서트를 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 서열표 서열번호 18에 나타내는 M13Reverse 프라이머를 사용하여 염기서열 해석을 행하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를, pUE라 이름붙였다.

BD BaculoGold Linearized Baculovirus DNA(BD Biosciences사제) 0.5 ㎍를 주형으로 하고, 서열표 서열번호 19에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Phd3 Fw), 서열표 서열번호 20에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Phd3 Rv-Hind), KOD plus(도요보세키사제)를 사용하여, 96℃ 2분으로 주형을 변성시킨 후, 96℃ 15초, 50℃ 30초, 68℃ 30초, 30사이클의 PCR을 행하고, AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)의 폴리헤드린 유전자의 3'UTR을 증폭하였다. T4 Polynucleotide Kinase에 의해 DNA 단편의 5'말단의 인산화를 행하였다. 반응액을 에탄올 침전에 의해 정제한 후, HindIII(도요보세키사제)로 소화하고, 이것을 인서트로 하였다. 이와는 별도로 pUE를 HincII(도요보세키사제) 및 HindIII로 소화하였다. 전기영동으로 분리한 후, Gen Elute Gel Purification Kit를 사용하여 약 2.7 kb의 DNA 단편을 정제하였다. pUE 유래의 벡터와 인서트를 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 서열표 서열번호 18에 나타내는 M13Reverse 프라이머를 사용하여 염기서열 해석을 행하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를, pTE라 이름붙였다.

서열표 서열번호 21에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(A25T7t)의 센스가닥, 안티센스가닥을 DNA 합성기로 합성하고, T4 Polynucleotide Kinase에 의해 그의 5'말단의 인산화를 행하였다. 반응종료 후, 센스가닥과 안티센스가닥을 혼합하고, 95℃ 5분간 열처리하였다. 이것을 실온이 될 때까지 정치하고 센스가닥과 안티센스가닥을 어닐링시켰다. 에탄올 침전에 의해 정제한 후, 물에 용해시켰다. SigmaSpin Post Reaction Purification Columns에 의해, 과잉의 ATP를 제거한 후, 다시 에탄올 침전에 의해 정제하고, 이것을 인서트로 하였다. 이와는 별도로, pTE 5 ng를 주형으로 하고, 서열표 서열번호 22에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Not Fw), 서열표 서열번호 23에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Phd3 Rv), KOD plus(도요보세키사제)를 사용하여, 96℃ 2분으로 주형을 변성시킨 후, 96℃ 15초, 50℃ 30초, 68℃ 3분, 30사이클의 PCR을 행하였다. PCR 산물을 전기영동으로 분리한 후, Gen Elute Gel Purification Kit를 사용하여 약 3.0 kb의 DNA 단편을 정제하였다. 정제한 PCR 산물과 인서트를 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 서열표 서열번호 18에 나타내는 M13Reverse 프라이머를 사용하여 염기서열 해석을 행하였다. AcNPV 폴리헤드린 3'UTR 서열의 하류에 폴리 A 꼬리부가 순방향으로 삽입된 플라스미드 DNA를, pTEA라 이름붙였다.

pTEA 5 ng를 주형으로 하고, 서열표 서열번호 22에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Not Fw), 서열표 서열번호 24에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머 (Not Rv), KOD plus(도요보세키사제)를 사용하여, 96℃ 2분으로 주형을 변성시킨 후, 96℃ 15초, 50℃ 30초, 68℃ 3분, 30사이클의 PCR을 행하였다. T4 Polynucleotide Kinase에 의해 PCR 산물의 5'말단의 인산화를 행하였다. 반응액을 전기영동으로 분리한 후, Gen Elute Gel Purification Kit를 사용하여 약 3.0 kb의 DNA 단편을 정제하였다. 정제한 PCR 산물을 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 서열표 서열번호 18에 나타내는 M13Reverse 프라이머를 사용하여 염기서열 해석을 행하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를, pTD2 Vector라 이름붙였다. 제작한 pTD2 Vector는, 서열표 서열번호 30에 나타내는 염기서열을 갖는다. 도 8에, 작성한 pTD1 Vector의 지도를 나타낸다. 도면 중 T7은 T7 프로모터, Enhancer는 EoNPV 유래의 폴리헤드린 유전자 5'UTR(역방향), MCS는 멀티클로닝 사이트, 3'UTR은 AcNPV 유래의 폴리헤드린 유전자 3'UTR, poly A는 폴리 A 꼬리부, terminator는 T7 터미네이터 서열이다.

[실시예 1: pTD1 Vector를 사용한 유전자의 클로닝과 그것을 사용한 무세포계 단백질 합성]

[(1) 주형 DNA(벡터 pTD1-Luc)의 제작]

루시페라아제를 코드하는 구조유전자를 갖는 pGEM-Luc Vector(프로메가사제) 5 ng를 주형으로 하고, 서열표 서열번호 16에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Luc-ATG), 서열표 서열번호 13에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Luc T7-R4-Kpn), KOD plus(도요보세키사제)를 사용하여, 96℃ 2분으로 주형을 변성시킨 후, 96℃ 15초, 50℃ 30초, 68℃ 120초, 30사이클의 PCR을 행하고, 오픈 리딩 프레임(ORF)을 증폭하였다. T4 Polynucleotide Kinase에 의해 PCR 산물의 5'말단의 인산화를 행한 후, 에탄올 침전에 의해 PCR 산물을 정제하였다. 이 DNA 단편을 KpnI로 소화한 후, 전기영동에 제공하고, Gen Elute Gel Purification Kit를 사용하여 약 1.6 kb의 DNA 단편을 정제하고, 이것을 인서트로 하였다. 이와는 별도로 pTD1 Vector 5 ng를 주형으로 하고, 서열표 서열번호 26에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Eco-Kpn), 서열표 서열번호 27에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Mn29 Rv), KOD plus(도요보세키사제)를 사용하여, 96℃ 2분으로 주형을 변성시킨 후, 96℃ 15초, 50℃ 30초, 68℃ 3분, 30사이클의 PCR을 행하였다. PCR 산물을 에탄올 침전에 의해 정제한 후, KpnI로 소화하였다. 전기영동으로 분리한 후, Gen Elute Gel Purification Kit를 사용하여 약 3.0 kb의 DNA 단편을 정제하였다. pTD1 Vector 유래의 DNA 단편과 인서트를 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 서열표 서열번호 14에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(T7 promoter) 및 서열표 서열번호 18에 나타내는 M13Reverse 프라이머를 사용하여 염기서열 해석을 행하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를, pTD1-Luc라 이름붙였다.

[(2) 인비트로 전사반응 및 mRNA의 정제]

인비트로 전사반응 및 mRNA의 정제는, 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일하게 하여 행하였다.

[(3) 번역반응]

번역반응은, 상기 참고예 21에서 제작한 곤충 배양세포(Sf21) 추출액을 사용하여, 상기 실험예 3에 기재된 방법에 따라 번역반응을 행하였다. 합성된 루시페라아제는 상기 실험예 3에 기재된 방법에 따라 정량하였다.

도 5는, 실시예 1의 결과를 나타내는 그래프로, 가로축이 합성시간(시간), 세로축이 루시페라아제 합성량(㎍/mL)을 나타낸다. 또한, 비교예로서 참고예 16에서 제작한 pMphd-FF-Luc로부터 전사한 mRNA를 사용한 합성결과를 나타낸다. 도 5에 나타내는 바와 같이, 참고예 24에 있어서 제작한, 번역반응을 촉진하는 DNA 단편으로서, 서열표 서열번호 9에 나타내는 염기서열을 나타내는 DNA 단편을 사용하여 제작한 단백질 발현벡터는, 주형 DNA로서 참고예 16에서 제작한 pMphd-FF-Luc를 사용한 경우와 동일한 정도의 합성량을 나타내는 것을 알 수 있었다.

[실시예 2: pTD2 Vector를 사용한 유전자의 클로닝과 그것을 사용한 무세포계 단백질 합성]

[(1) 주형 DNA(벡터 pTD2-Luc)의 제작]

루시페라아제를 코드하는 구조유전자를 갖는 pGEM-Luc Vector(프로메가사제) 5 ng를 주형으로 하고, 서열표 서열번호 16에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Luc-ATG), 서열표 서열번호 13에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Luc T7-R4-Kpn), KOD plus(도요보세키사제)를 사용하여, 96℃ 2분으로 주형을 변성시킨 후, 96℃ 15초, 50℃ 30초, 68℃ 120초, 30사이클의 PCR을 행하고, 오픈 리딩 프레임(ORF)을 증폭하였다. T4 Polynucleotide Kinase에 의해 PCR 산물의 5'말단의 인산 화를 행한 후, 에탄올 침전에 의해 PCR 산물을 정제하였다. 이 DNA 단편을 KpnI로 소화한 후, 전기영동에 제공하고, Gen Elute Gel Purification Kit를 사용하여 약 1.6 kb의 DNA 단편을 정제하고, 이것을 인서트로 하였다. 이와는 별도로 pTD2 Vector 5 ng를 주형으로 하고, 서열표 서열번호 26에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Eco-Kpn), 서열표 서열번호 28에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Eco21 Fw), KOD plus(도요보세키사제)를 사용하여, 96℃ 2분으로 주형을 변성시킨 후, 96℃ 15초, 50℃ 30초, 68℃ 3분, 30사이클의 PCR을 행하였다. PCR 산물을 에탄올 침전에 의해 정제한 후, KpnI로 소화하였다. 전기영동으로 분리한 후, Gen Elute Gel Purification Kit를 사용하여 약 3.0 kb의 DNA 단편을 정제하였다. pTD2 Vector 유래의 DNA 단편과 인서트를 라이게이션하고, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 서열표 서열번호 14에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(T7 promoter) 및 서열표 서열번호 18에 나타내는 M13Reverse 프라이머를 사용하여 염기서열 해석을 행하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를, pTD2-Luc라 이름붙였다.

[(2) 인비트로 전사반응 및 mRNA의 정제]

인비트로 전사반응 및 mRNA의 정제는, 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일하게 해서 행하였다.

[(3) 번역반응]

번역반응은, 상기 참고예 20에서 제작한 곤충 배양세포(High Five) 추출액을 사용하여, 상기 실험예 2에 기재된 방법에 따라 번역반응을 행하였다. 합성된 루시 페라아제는 상기 실험예 2에 기재된 방법에 따라 정량하였다.

도 6은 실시예 2의 결과를 나타내는 그래프로, 가로축이 합성시간(시간), 세로축이 루시페라아제 합성량(㎍/mL)을 나타낸다. 또한, 비교예로서 참고예 15에서 제작한 pEophd-R-Luc로부터 전사한 mRNA를 사용한 합성결과를 나타낸다. 도 6에 나타내는 바와 같이, 참고예 25에 있어서 제작한, 번역반응을 촉진하는 DNA 단편으로서, 서열표 서열번호 8에 나타내는 염기서열을 나타내는 DNA 단편을 사용하여 제작한 단백질 발현벡터는, 주형 DNA로서 참고예 15에서 제작한 pEophd-R-Luc를 사용한 경우와 동일한 정도의 합성량을 나타내는 것을 알 수 있었다.

[참고예 26: 주형 DNA(벡터 pEU3-N2-Luc)의 제작]

루시페라아제를 코드하는 구조유전자를 갖는 pGEM-Luc Vector(프로메가사제) 5 ng를 주형으로 하고, 서열표 서열번호 16에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Luc-ATG), 서열표 서열번호 13에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(Luc T7-R4-Kpn), KOD plus(도요보세키사제)를 사용하여, 96℃ 2분으로 주형을 변성시킨 후, 96℃ 15초, 50℃ 30초, 68℃ 120초, 30사이클의 PCR을 행하고, 오픈 리딩 프레임(ORF)을 증폭하였다. T4 Polynucleotide Kinase에 의해 PCR 산물의 5'말단의 인산화를 행한 후, 에탄올 침전에 의해 PCR 산물을 정제하였다. 이 DNA 단편을 KpnI로 소화한 후, 전기영동에 제공하고, Gen Elute Gel Purification Kit를 사용하여 약 1.6 kb의 DNA 단편을 정제하고, 이것을 인서트로 하였다. 이와는 별도로 pEU3-N2 Vector(번역 촉진서열로서 담배모자이크바이러스(tobacco mosaic virus) 유래의 Ω 서열을 갖는 소맥배아 추출액 용의 발현벡터, 도요보세키사제)를 EcoRV 및 KpnI로 소화하고, 여기에 상기에서 제작한 인서트를 라이게이션한 후, 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 얻어진 대장균으로부터 플라스미드를 조제한 후, 서열표 서열번호 14에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머(T7 promoter) 및 M13 Reverse 프라이머를 사용하여 염기서열 해석을 행하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를, pEU3-N2-Luc라 이름붙였다. 본 단백질 발현용 플라스미드는, 소맥배아 추출액을 사용한 무세포계 단백질 합성에 있어서, 적합하게 발현될 것이 예상된다.

[실시예 3: pTD1 Vector를 사용한 소맥배아 추출액으로의 무세포계 단백질 합성]

[(1) 주형 DNA]

주형 DNA로서, 실시예 1에서 제작한 pTD1-Luc를 사용하였다.

[(2) 인비트로 전사반응 및 mRNA의 정제]

[(3) 번역반응]

번역반응은, 상기 (2)에서 제작한 mRNA를 주형으로 하여, 소맥배아 추출액을 사용한 무세포계 단백질 합성을 행하였다. 소맥배아 추출액으로서는, PROTEIOSTM ver.2(도요보세키사제)를 사용하였다. mRNA를 종농도 240 ㎍/mL가 되도록 첨가하고, 취급설명서에 따라 50 μL의 반응 스케일(배치반응)로 단백질 합성반응을 행하였다. 합성된 루시페라아제는 상기 실험예 2에 기재된 방법에 따라 정량하였다.

도 9가 결과로, 세로축에 루시페라아제의 상대합성량(%)을 나타낸다. 참고적으로, 주형 DNA로서 참고예 26에서 제작한 pEU3-N2-Luc를 사용하고, 소맥배아 추출액을 사용한 무세포계 단백질 합성을 행한 결과를 나타낸다(참고예 26). 도 9에 나타내는 바와 같이, 실시예 1에서 제작한 pTD1-Luc는 pEU3-N2-Luc와 비교하여 약 170%의 합성량을 나타내는 것을 알 수 있고, pTD1 Vector가 소맥배아 추출액을 사용한 무세포계 단백질 합성에 있어서도, 번역반응을 촉진할 수 있는 발현벡터로서 적합하게 사용할 수 있는 것이 명백해졌다.

[실시예 4: pTD1 Vector를 사용한 토끼 망상적혈구 추출액으로의 무세포계 단백질 합성]

[(1) 주형 DNA]

주형 DNA로서, 실시예 1에서 제작한 pTD1-Luc를 사용하였다.

[(2) 인비트로 전사반응 및 mRNA의 정제]

[(3) 번역반응]

번역반응은, 상기 (2)에서 제작한 mRNA를 주형으로 하여, 토끼 망상적혈구 추출액을 사용한 무세포계 단백질 합성을 행하였다. 토끼 망상적혈구 추출액으로서 Rabbit Reticulocyte Lysate, Nuclease Treated(프로메가사제)를 사용하였다. mRNA를 종농도 40 ㎍/mL가 되도록 첨가하고, 취급설명서에 따라 50 μL의 반응 스케일 로 단백질 합성반응을 행하였다. 합성된 루시페라아제는 상기 실험예 2에 기재된 방법에 따라 정량하였다.

도 10에 결과를 나타낸다. 세로축에 루시페라아제의 상대합성량(%)을 나타낸다. 참고적으로, 주형 DNA로서 참고예 1에서 제작한 pTNT-Luc를 사용하고, 토끼 망상적혈구 추출액을 사용한 무세포계 단백질 합성을 행한 결과를 나타낸다(참고예 1). 도 10에 나타내는 바와 같이, 토끼 망상적혈구 추출액을 사용한 무세포계 단백질 합성에 있어서, pTD1-Luc는 pTNT-Luc와 동일한 정도의 합성량을 나타내는 것을 알 수 있고, pTD1 Vector가 토끼 망상적혈구 추출액을 사용한 무세포계 단백질 합성에 있어서도, 번역반응을 촉진할 수 있는 발현벡터로서 적합하게 사용할 수 있는 것이 명백해졌다.

참고예 24 및 25에서는, 번역반응 활성을 갖는 DNA 단편으로서, 각각 서열표 서열번호 9 및 8에 나타내는 염기서열을 갖는 DNA 단편을 사용하여 단백질 발현벡터를 제작하였지만, 그 외의 서열번호에 나타내는 염기서열을 갖는 DNA 단편을 사용하여 단백질 발현벡터에 대해서도 용이하게 제작할 수 있다.

더욱이, 이들 발현벡터를 사용함으로써 무세포계 단백질 합성에 있어서, 단백질의 합성량이 향상되는 것은 실험예 2~5 및 실시예 1~4로부터 명백하다.

본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않고, 다른 여러 형태로 실시할 수 있다. 그 때문에, 상기 실시예는 모든 점에서 단순한 예시에 지나지 않아, 한정적으로 해석해서는 안 된다. 더욱이, 청구범위의 균등 범위에 속하는 변경은, 모두 본 발명의 범위 내이다.

본 발명에 의하면, 목적으로 하는 유전자를 간단하게 클로닝할 수 있고, 더욱이 번역 효율을 향상시키는 것이 가능하다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

무세포계 단백질 합성에 있어서 번역반응 촉진을 위해 사용되는, 이하의 (a)~(k) 중 어느 하나의 DNA 단편:

(a) 서열표의 서열번호 1에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(b) 서열표의 서열번호 2에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(c) 서열표의 서열번호 3에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(d) 서열표의 서열번호 4에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(e) 서열표의 서열번호 5에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(f) 서열표의 서열번호 6에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(g) 서열표의 서열번호 7에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(h) 서열표의 서열번호 8에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(i) 서열표의 서열번호 9에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(j) 서열표의 서열번호 10에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(k) 서열표의 서열번호 11에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편.
번역반응 촉진활성을 갖는 이하의 (a)에서 (k)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종류의 DNA 단편을 포함하는 발현벡터:

(a) 서열표의 서열번호 1에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(b) 서열표의 서열번호 2에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(c) 서열표의 서열번호 3에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(d) 서열표의 서열번호 4에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(e) 서열표의 서열번호 5에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(f) 서열표의 서열번호 6에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(g) 서열표의 서열번호 7에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(h) 서열표의 서열번호 8에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(i) 서열표의 서열번호 9에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(j) 서열표의 서열번호 10에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(k) 서열표의 서열번호 11에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편.
단백질을 코드하는 구조유전자와, 구조유전자의 5' 상류측에 삽입된 DNA 단편을 갖는 무세포계 단백질 합성용의 주형 DNA로서, DNA 단편이 이하의 (a)~(k) 중 어느 하나로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 주형 DNA:

(a) 서열표의 서열번호 1에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(b) 서열표의 서열번호 2에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(c) 서열표의 서열번호 3에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(d) 서열표의 서열번호 4에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(e) 서열표의 서열번호 5에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(f) 서열표의 서열번호 6에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(g) 서열표의 서열번호 7에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(h) 서열표의 서열번호 8에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(i) 서열표의 서열번호 9에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(j) 서열표의 서열번호 10에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편,

(k) 서열표의 서열번호 11에 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 단편.
제3항의 주형 DNA를 전사하여 얻어지는 mRNA로서, 무세포계 단백질 합성에 있어서의 번역 주형으로서 사용되는 mRNA.
제3항의 주형 DNA 또는 상기 주형 DNA를 전사하여 얻어지는 mRNA를 함유하는 무세포계 단백질 합성용 반응액.
제3항의 주형 DNA 또는 상기 주형 DNA를 전사하여 얻어지는 mRNA를 사용한 무세포계 단백질 합성방법.
제6항에 있어서, 동물 유래의 추출물을 함유하는 무세포계 단백질 합성반응액을 사용한, 무세포계 단백질 합성방법.
제7항에 있어서, 동물 유래의 추출물이 누에조직으로부터 추출된 것인, 무세포계 단백질 합성방법.
제7항에 있어서, 동물 유래의 추출물이 곤충 배양세포로부터 추출된 것인, 무세포계 단백질 합성방법.
제9항에 있어서, 곤충 배양세포가 Trichoplusia ni의 난세포 유래 세포 및 Spodoptera frugiperda 난소세포 유래의 세포로부터 선택된 하나 이상인, 무세포계 단백질 합성방법.
제7항에 있어서, 동물 유래의 추출물이 포유동물세포로부터 추출된 것인, 무세포계 단백질 합성방법.
제11항에 있어서, 포유동물세포가 토끼 망상적혈구인, 무세포계 단백질 합성 방법.
제11항에 있어서, 포유동물세포가 포유동물 배양세포인, 무세포계 단백질 합성방법.
제13항에 있어서, 포유동물 배양세포가 Chinese hamster ovary 세포인, 무세포계 단백질 합성방법.
제6항에 있어서, 소맥배아 유래의 추출물을 함유하는 무세포계 단백질 합성반응액을 사용한, 무세포계 단백질 합성방법.
제2항의 발현벡터를 포함하는, 무세포계 단백질 합성용 키트.