JP5428255B2 - 無細胞タンパク質合成系−バキュロウイルス発現系両用ベクター - Google Patents
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Description
特に、複雑なタンパク質を大量に取得する目的では、バキュロウイルス発現系が頻繁に利用されている。バキュロウイルスについてはよく研究されており、Miller, L.K.(1998), Ann. Rev. Microbiol. 42:177-199(非特許文献1)、米国特許第4745051号明細書(特許文献1)、米国特許第4879236号明細書(特許文献2)などに記載されている。また、米国特許第6589783号明細書(特許文献3)では、大腸菌、昆虫細胞(バキュロウイルス)、哺乳類細胞などの異種細胞間で共用可能なベクターが報告されている。
下記(1)〜(3)は、所望の構造遺伝子を挿入するための配列を含むバキュロウイルストランスファーベクターに関する。
上流側から下流側へ、バキュロウイルス後期遺伝子プロモーター配列(a)、バキュロウイルス後期遺伝子5’非翻訳領域配列(b)、及び所望の構造遺伝子を挿入するための配列(c)を含むバキュロウイルストランスファーベクターであって、
前記バキュロウイルス後期遺伝子プロモーター配列(a)の上流側に、ファージ由来RNAポリメラーゼ認識配列(d)を含む、バキュロウイルストランスファーベクター。
前記バキュロウイルス後期遺伝子5’非翻訳領域配列(b)が、ポリヘドリン遺伝子5’非翻訳領域配列及びP10遺伝子5’非翻訳領域配列からなる群から選ばれる、(1)に記載のバキュロウイルストランスファーベクター。
前記ファージ由来RNAポリメラーゼ認識配列(d)が、T7プロモーター配列、T3プロモーター配列、及びSP6プロモーター配列からなる群から選ばれる、(1)又は(2)に記載のバキュロウイルストランスファーベクター。
所望の構造遺伝子の配列(x)を含むDNA断片を(1)〜(3)のいずれかに記載のバキュロウイルストランスファーベクターに組み込んだ組み換えバキュロウイルストランスファーベクターを、タンパク質産生工程に供することによって、前記組み換えバキュロウイルストランスファーベクターにおける前記所望の構造遺伝子がコードするタンパク質を得る、タンパク質調製法。
前記タンパク質産生工程が、
前記組み換えバキュロウイルストランスファーベクターとバキュロウイルスDNAをコトランスフェクションした昆虫培養細胞において相同組み換えを起こすことにより組み換えバキュロウイルスを調製し、
前記組み換えバキュロウイルスを宿主としての昆虫又は昆虫培養細胞に感染させることによって行われる、(4)に記載のタンパク質調製法。
前記タンパク質産生工程が、
前記組み換えバキュロウイルストランスファーベクターにおける、前記バキュロウイルス後期遺伝子プロモーター配列(a)と、前記バキュロウイルス後期遺伝子5’非翻訳領域配列(b)と、前記ファージ由来RNAポリメラーゼ認識配列(d)と、前記所望の構造遺伝子の配列(x)とを含む領域の増幅産物又はその転写物を調製し、
前記増幅産物又はその転写物を鋳型とし、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いて前記鋳型から前記所望の構造遺伝子がコードするタンパク質を合成することによって行われる、(4)又は(5)に記載のタンパク質調製法。
前記無細胞タンパク質合成用細胞抽出液が、昆虫細胞由来抽出液である、(6)に記載のタンパク質調製方法。
(1)〜(3)のいずれかに記載のバキュロウイルストランスファーベクターを含むタンパク質調製キット。
(9)
無細胞タンパク質合成用抽出液をさらに含む、(8)に記載のタンパク質調製キット。
(10)
バキュロウイルスDNA及び/又はバキュロウイルス発現系に用いられる宿主細胞をさらに含む、(8)又は(9)に記載のタンパク質調製キット。
本発明のバキュロウイルストランスファーベクターは、バキュロウイルス後期遺伝子プロモーター配列(a)、バキュロウイルス後期遺伝子5’非翻訳領域配列(b)、及び所望の構造遺伝子を挿入するための配列(c)と、ファージ由来RNAポリメラーゼ認識配列(d)とを含む。
また、バキュロウイルス後期遺伝子プロモーター配列(a)又はファージ由来RNAポリメラーゼ認識配列(d)と、バキュロウイルス後期遺伝子5’非翻訳領域配列(b)との間は、5塩基以下、好ましくは0塩基とすることができる。
組み換えバキュロウイルストランスファーベクターは、上記のバキュロウイルストランスファーベクターに、発現させたい所望の構造遺伝子の配列(x)を挿入したものである。
挿入される所望の構造遺伝子がコードするタンパク質(ペプチドを含む)に特に制限はなく、生細胞で細胞毒となるタンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよいし、糖タンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよいし、融合タンパク質をコードする塩基配列であってもよい。所望の構造遺伝子の配列(x)は、その塩基数に特に制限はない。
[3−1.組み換えバキュロウイルス発現ベクター]
組み換えバキュロウイルス発現ベクターは、生体細胞中で、前記の組み換えバキュロウイルストランスファーベクターのバキュロウイルス後期遺伝子プロモーター配列(a)、バキュロウイルス後期遺伝子5’非翻訳領域配列(b)、所望の構造遺伝子の配列(x)、及びファージ由来RNAポリメラーゼ認識配列(d)を含む一連の配列がバキュロウイルスDNAに組み込まれたものである。
あるいは、予めバキュロウイルスで感染させた生体細胞に上記の組み換えバキュロウイルストランスファーベクターを移入し、組み換えバキュロウイルストランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えバキュロウイルスを構築することができる。
上記のようにして得られた当該所望の構造遺伝子の配列(x)を有する組み換えバキュロウイルスを、宿主としての昆虫又は昆虫培養細胞に感染させることによって、所望のタンパク質を産生することができる。
また、宿主の他の具体例としては、Bombyx mori N由来の株化細胞であるBmN細胞、カイコ幼虫個体などが挙げられる。これらの細胞は、ウイルスが例えばBmNPVの場合に好ましく用いることができる。
培養条件としても、当該所望のタンパク質をコードするDNAの発現が可能な条件を、当業者が容易に決定することができる。
無細胞系タンパク質合成は、一般に、mRNAの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系のみによるタンパク質合成(翻訳系)、ならびにDNAよりmRNAを転写する転写工程と、該転写工程で得られたmRNAの情報を読み取ってタンパク質を合成する翻訳工程とを含むタンパク質合成(転写/翻訳系)とに大きく分けられるが、本発明は、いずれの系においても使用することができる。
上記抽出物を含有する抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成反応液は、上記抽出液を除く成分として、上記の鋳型核酸、カリウム塩、マグネシウム塩、DTT、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、緩衝剤(、及び鋳型核酸がDNAの場合はRNAポリメラーゼ)を少なくとも含有することができる。好ましくは、無細胞系タンパク質合成反応液は、RNaseインヒビター、tRNA、カルシウム塩をさらに含有することができる。
mRNAを鋳型とする翻訳系合成反応では、反応温度は、通常、10℃〜40℃、好ましくは20℃〜30℃の範囲内とし、反応時間は、通常、1時間〜72時間、好ましくは3時間〜24時間とすることができる。
DNAを鋳型とする転写/翻訳系合成反応では、転写工程の反応温度を、通常、10℃〜60℃、好ましくは20℃〜50℃の範囲内とし、翻訳工程の温度を、通常、10℃〜40℃、好ましくは20℃〜30℃の範囲内とすることができる。転写及び翻訳工程を連続して実施し得るという観点から、反応温度は両工程に好適な20℃〜30℃の範囲とし、反応時間は、全工程あわせて、通常、1時間〜72時間、好ましくは3時間〜24時間とすることができる。
本発明のタンパク質調製キットは、上記のバキュロウイルストランスファーベクターを必須アイテムとして含む。適宜、無細胞タンパク質合成用抽出液や、バキュロウイルス細胞系に用いられるバキュロウイルスDNAや宿主細胞などのアイテムをさらに含ませることができる。それぞれのアイテムについては上述したとおりである。それぞれのアイテムは、適宜容器に収容されて提供されうる。
大腸菌β-ガラクトシダーゼが組み込まれたバキュロウイルス、BacPAK6(Clontech、BacPAKTMBaculovirus Expression System)の精製ゲノムDNAを鋳型にし、配列番号1又は2に示すプライマー(LP-T7-5UTR又はT7-LP-5UTR)と配列番号3に示すプライマー(pBP8-gal-rv)とを用いてPCRを行った。これらプライマーにより、バキュロウイルス後期遺伝子プロモーター(ATAAG)の直前、或いは直後にT7プロモーター配列(TAATACGACTCACTATAGG:配列番号9)を挿入させてβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を含む領域を増幅した。
具体的には、PCRは、5ngの上記精製ゲノムDNAと各15pmolの上記プライマーのセットとを用いて、KOD -Plus- Ver.2(東洋紡)の取扱説明書に従って行った。
ATAAGTAATACGACTCACTATAGGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAAT(配列番号1)
T7-LP-5UTR:
TAATACGACTCACTATAGGATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAAT(配列番号2)
pBP8-gal-rv:
CAATTGTACACTAACGAC(配列番号3)
具体的には、PCRは、5ngの上記DNAと各15pmolの上記プライマーのセットを用いて、KOD -Plus- Ver.2(東洋紡)の取扱説明書に従って行った。
TTATTTGCGAGATGGTTATCATTTTAATTATCTCC(配列番号4)
BP8fw:
GCGGCCGCTTAATTAATGGATCCGGGTTATTAGTACATTTATTAA(配列番号5)
その後、β-ガラクトシダーゼ遺伝子を含む断片とpBacPAK8由来の断片とを組合せて、T4 DNAポリメラーゼ(Quick Ligation Kit、NEB)を用いて連結した。
CAATTGTACACTAACGAC(配列番号3)
BP8_seq:
GTCTGCGAGCAGTTGTTTG(配列番号6)
BacPAKTM Baculovirus Expression System(タカラバイオ)付属のBacPAK6 Viral DNA(Bsu36 I digest)と、pT7LP-gal或いはpLPT7-galとを、キット付属の取扱説明書に従いSf21細胞にコトランスフェクションすることで組換えウイルスを作成した。
上記のようにして得られた組換えウイルスを用い、バキュロウイルス発現系においてβ-ガラクトシダーゼを発現した。
1μLの細胞液に、4μLのmilliQ水と、2×SDS Sample Buffer(100mM Tris-HCl(pH6.8)、4% SDS、16% グリセロール、0.1% Bromophenol blue、 4% 2-メルカプトエタノール)とを添加し、98℃、5分間の熱処理を行った。その後、SDS-PAGE(12.5% e・PAGEL、アトー)を行い、CBB染色(Quick-CBB PLUS、和光純薬工業)により分離タンパク質を検出した(図2)。
上記のようにして得られた組み換えバキュロウイルストランスファーベクターを用い、無細胞タンパク質合成系においてβ-ガラクトシダーゼを発現した。
GGAAACAGCTATGACCATG(配列番号8)
Claims (10)
- 上流側から下流側へ、バキュロウイルス後期遺伝子プロモーター配列(a)、バキュロウイルス後期遺伝子5’非翻訳領域配列(b)、及び所望の構造遺伝子を挿入するための配列(c)を含むバキュロウイルストランスファーベクターであって、
前記バキュロウイルス後期遺伝子プロモーター配列(a)の上流側に、ファージ由来RNAポリメラーゼ認識配列(d)を含む、バキュロウイルストランスファーベクター。 - 前記バキュロウイルス後期遺伝子5’非翻訳領域配列(b)が、ポリヘドリン5’非翻訳領域遺伝子配列及びP10遺伝子5’非翻訳領域配列からなる群から選ばれる、請求項1に記載のバキュロウイルストランスファーベクター。
- 前記ファージ由来RNAポリメラーゼ認識配列(d)が、T7プロモーター配列、T3プロモーター配列、及びSP6プロモーター配列からなる群から選ばれる、請求項1又は2に記載のバキュロウイルストランスファーベクター。
- 所望の構造遺伝子の配列(x)を含むDNA断片を請求項1〜3のいずれか1項に記載のバキュロウイルストランスファーベクターに組み込んだ組み換えバキュロウイルストランスファーベクターを、タンパク質産生工程に供することによって、前記組み換えバキュロウイルストランスファーベクターにおける前記所望の構造遺伝子がコードするタンパク質を得る、タンパク質調製法。
- 前記タンパク質産生工程が、
前記組み換えバキュロウイルストランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとをコトランスフェクションした昆虫培養細胞において相同組み換えを起こすことにより組み換えバキュロウイルスを調製し、
前記組み換えバキュロウイルスを宿主としての昆虫又は昆虫培養細胞に感染させることによって行われる、請求項4に記載のタンパク質調製法。 - 前記タンパク質産生工程が、
前記組み換えバキュロウイルストランスファーベクターにおける、前記バキュロウイルス後期遺伝子プロモーター配列(a)と、前記バキュロウイルス後期遺伝子5’非翻訳領域配列(b)と、前記ファージ由来RNAポリメラーゼ認識配列(d)と、前記所望の構造遺伝子の配列(x)とを含む領域の増幅産物又はその転写物を調製し、
前記増幅産物又はその転写物を鋳型とし、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いて前記鋳型から前記所望の構造遺伝子がコードするタンパク質を合成することによって行われる、請求項4又は5に記載のタンパク質調製法。 - 前記無細胞タンパク質合成用細胞抽出液が、昆虫細胞由来抽出液である、請求項6に記載のタンパク質調製法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のバキュロウイルストランスファーベクターを含むタンパク質調製キット。
- 無細胞タンパク質合成用抽出液をさらに含む、請求項8に記載のタンパク質調製キット。
- バキュロウイルスDNA及び/又はバキュロウイルス発現系に用いられる宿主細胞をさらに含む、請求項8又は9に記載のタンパク質調製キット。
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