CN1878869A - 无细胞系蛋白质合成中通过添加微粒体膜的翻译后修饰方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供无细胞系蛋白质合成中的新型翻译后修饰方法以及利用该翻译后修饰反应的新型无细胞系蛋白质合成方法。是一种在使用无细胞系蛋白质合成用提取液的无细胞系中的蛋白质合成方法，其特征在于，在节肢动物来源的微粒体膜的存在下进行翻译反应。

Description

无细胞系蛋白质合成中通过添加微粒体膜的翻译后修饰方法

技术领域

本发明涉及一种无细胞系蛋白质合成方法，特别涉及一种可以进行翻译后修饰的无细胞系蛋白质合成方法。

背景技术

为了解析蛋白质的结构或功能，蛋白质的大量生产是不可缺少的技术。但是，使用以大肠杆菌为主的很多活细胞的表达系，事实上很难合成危及该生物的生命维持的蛋白质，只能获得/分析有限的蛋白质。对此，无细胞系蛋白质合成是在只取出蛋白质合成中必要的装置的人工蛋白质合成中专用的系统，所以是可以解决活细胞的表达系所存在的问题点的方法。

另外，伴随基因组解析的进展，旨在网罗阐明生物体内存在的所有蛋白质的结构和功能的蛋白质组(プロテオ一ム)解析正在进展之中。生物体内的蛋白质在细胞质中存在的游离核糖体上开始翻译之后，几乎都在翻译中或翻译后接受蛋白酶的加工或被称为特定氨基酸残基的修饰的翻译后修饰。这些翻译后修饰在很多情况下与蛋白质的功能表达或其控制直接相关，所以这些解析在蛋白质功能的阐明中不可缺少。

作为通常的无细胞系蛋白质合成法，已知有大肠杆菌溶解液、小麦胚芽提取液、兔网织红细胞溶解液等，但作为具有在高等动物/植物中产生的主要翻译后修饰能力的蛋白质合成系，已知有向兔网织红细胞溶解液中添加狗胰腺微粒体膜的系统(关于狗胰腺微粒体膜，参照Walter，P.andBlobel，G，“酶学方法(Method Enzymology)”，(美国)，1983年，第96卷，第84～93页；Bulleid，N.J.et al.，“生物化学杂志(The Biochemicaljournal)”，(美国)，1990年，第268卷，第777～781页；Paradis，G.etal.，“生物化学与细胞生物学(Biochemistry and cell biology)”，(加拿大)，1987年，第65卷，第921～924页等)。但是，狗胰腺微粒体膜价格非常高，所以在很多蛋白质的网络式合成中没有被使用。作为解决上述问题的手段，开发出从中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)分别制备内质网组分、高尔基体组分、细胞膜组分，添加到兔网织红细胞溶解液中的系统(例如，参照特开2002-238595号公报)。但是，翻译后修饰装置的制备需要很多人力。又开发出使用特殊装置，在惰性气体环境中加压，制备具有翻译后修饰活性的昆虫来源提取液的方法(例如，参照特开2000-325076号公报)，但存在所谓mRNA的5’-UTR(非翻译序列)与目的基因的信号序列的组合会控制修饰的有无这一不适合实际使用的问题。另外，由于装置特殊，所以缺乏通用性。

综上所述，需要开发出通用性高、存在于提取液中的无细胞系蛋白质合成过程中的翻译后修饰方法。

发明内容

本发明正是为了解决上述课题而进行的发明，其目的在于，提供一种在无细胞系蛋白质合成中的新型翻译后修饰方法以及使用该翻译后修饰反应的新型无细胞系蛋白质合成方法。

本发明人等为了解决上述课题而进行了潜心研究，以至完成本发明。

即，本发明如下所述。

(1)本发明提供一种在使用无细胞系蛋白质合成用提取液的无细胞系中的蛋白质合成方法，其中，包括在节肢动物来源的微粒体膜的存在下进行翻译反应。

(2)根据上述(1)中记载的方法，其中，在mRNA浓度(μg/ml)与节肢动物来源的微粒体膜的浓度(A260)的比值为1∶0.1～5的条件下，进行翻译反应。

(3)根据上述(2)中记载的方法，其中，该比值为1∶0.3～2.3。

(4)根据上述(1)～(3)中任意一项记载的方法，其中，节肢动物来源的微粒体膜是从昆虫组织提取出来的微粒体膜。

(5)根据上述(4)中记载的方法，其中，昆虫组织是蚕组织。

(6)根据上述(5)中记载的方法，其中，蚕组织是脂肪体。

(7)根据上述(1)～(3)中任意一项记载的方法，其中，节肢动物来源的微粒体膜为从昆虫培养细胞提取出来的微粒体膜。

(8)根据上述(7)中记载的方法，其中，昆虫培养细胞为粉丝夜蛾(Trichoplusia ni)卵细胞来源或草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞来源的培养细胞。

(9)根据上述(1)～(3)中任意一项记载的方法，其中，无细胞系蛋白质合成用提取液为含有节肢动物来源的提取物的提取液。

(10)根据上述(9)中记载的方法，其中，节肢动物来源的提取物为从昆虫组织提取的提取物。

(11)根据上述(10)中记载的方法，其中，昆虫组织为蚕组织。

(12)根据上述(11)中记载的方法，其中，蚕组织至少包括蚕幼虫的后部丝腺。

(13)根据上述(9)中记载的方法，其中，节肢动物来源的提取物为从昆虫培养细胞提取的提取物。

(14)根据上述(13)中记载的方法，其中，昆虫培养细胞为粉丝夜蛾卵细胞来源或草地夜蛾卵巢细胞来源的培养细胞。

(15)根据上述(1)～(3)中任意一项记载的方法，其中，无细胞系蛋白质合成用提取液为含有小麦胚芽来源的提取物的提取液。

(16)根据上述(1)～(3)中任意一项记载的方法，其中，无细胞系蛋白质合成用提取液为含有哺乳动物培养细胞来源的提取物的提取液。

(17)根据上述(1)～(3)中任意一项记载的方法，其中，无细胞系蛋白质合成用提取液为含有兔网织红细胞来源的提取物的提取液。

(18)根据上述(1)～(3)中任意一项记载的方法，其中，无细胞系蛋白质合成用提取液为含有大肠杆菌来源的提取物的提取液。

(19)根据上述(1)～(3)中任意一项记载的方法，其中，无细胞系蛋白质合成用提取液为含有酵母来源的提取物的提取液。

(20)本发明提供一种翻译后的蛋白质的修饰方法，其中，在使用无细胞系蛋白质合成用提取液的无细胞系中的蛋白质合成中，包括在节肢动物来源的微粒体膜的存在下进行翻译反应。

(21)根据上述(20)中记载的方法，其中，在mRNA浓度(μg/ml)与节肢动物来源的微粒体膜的浓度(A260)的比值为1∶0.1～5的条件下进行翻译反应。

(22)根据上述(21)中记载的方法，其中，该比值为1∶0.3～2.3。

(23)根据上述(20)～(22)中任意一项记载的方法，其中，节肢动物来源的微粒体膜为从昆虫组织提取的微粒体膜。

(24)根据上述(23)中记载的方法，其中，昆虫组织为蚕组织。

(25)根据上述(24)中记载的方法，其中，蚕组织为脂肪体。

(26)根据上述(20)～(22)中任意一项记载的方法，其中，节肢动物来源的微粒体膜为从昆虫培养细胞提取出来的微粒体膜。

(27)根据上述(26)中记载的方法，其中，昆虫培养细胞为粉丝夜蛾卵细胞来源或草地夜蛾卵巢细胞来源的培养细胞。

(28)根据上述(20)～(22)中任意一项记载的方法，其中，无细胞系蛋白质合成用提取液为含有节肢动物来源的提取物的提取液。

(29)根据上述(28)中记载的方法，其中，节肢动物来源的提取物为从昆虫组织提取的提取物。

(30)根据上述(29)中记载的方法，其中，昆虫组织为蚕组织。

(31)根据上述(30)中记载的方法，其中，蚕组织至少包括蚕幼虫的后部丝腺。

(32)根据上述(28)中记载的方法，其中，节肢动物来源的提取物为从昆虫培养细胞提取的提取物。

(33)根据上述(32)中记载的方法，其中，昆虫培养细胞为粉丝夜蛾卵细胞来源或草地夜蛾卵巢细胞来源的培养细胞。

(34)根据上述(20)～(22)中任意一项记载的方法，其中，无细胞系蛋白质合成用提取液为含有小麦胚芽来源的提取物的提取液。

(35)根据上述(20)～(22)中任意一项记载的方法，其中，无细胞系蛋白质合成用提取液为含有哺乳动物培养细胞来源的提取物的提取液。

(36)根据上述(20)～(22)中任意一项记载的方法，其中，无细胞系蛋白质合成用提取液为含有兔网织红细胞来源的提取物的提取液。

(37)根据上述(20)～(22)中任意一项记载的方法，其中，无细胞系蛋白质合成用提取液为含有大肠杆菌来源的提取物的提取液。

(38)根据上述(20)～(22)中任意一项记载的方法，其中，无细胞系蛋白质合成用提取液为含有酵母来源的提取物的提取液。

(39)根据上述(20)～(22)中任意一项记载的方法，其中，翻译后的蛋白质的修饰为N-糖基化和/或信号序列的切除。

(40)本发明提供一种N-糖基化的蛋白质，其中，是利用上述(1)～(3)中任意一项所述的蛋白质合成方法得到的。

(41)本发明提供一种切除了信号序列的蛋白质，其中，是利用上述(1)～(3)中任意一项所述的蛋白质合成方法得到的。

通过本发明，能够提供一种可以进行信号肽切割或N-糖基化等蛋白质的翻译后修饰的无细胞系蛋白质合成方法。

附图说明

图1是表示构建的表达质粒[体外pro-TNF-GLC基因转录用质粒-I(I)和体外pro-TNF-GLC基因转录用质粒-II(II)]的模式图。

图2是表示使用含有节肢动物来源的提取物(蚕来源(BML)、HighFive来源(HFL)、Sf21(Sf21L)来源)的无细胞系蛋白质合成用提取液，在微粒体膜(狗胰腺来源(CMM)、High Five来源(HFMM)、Sf21来源(Sf21MM))存在下或不存在下进行蛋白质合成，检查是否进行了N-糖基化的结果的图。

图3是表示使用含有兔网织红细胞溶解液的无细胞系蛋白质合成用提取液，在微粒体膜(High Five来源(HFMM)、Sf21来源(Sf21MM))存在下或不存在下进行蛋白质合成，检查是否进行了糖基化的结果的图。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

本发明是一种在使用无细胞系蛋白质合成用提取液的无细胞系中的蛋白质合成方法，其特征在于，在节肢动物来源的微粒体膜的存在下进行翻译反应。

无细胞系蛋白质合成方法通常是在含有生物体来源提取物的无细胞系蛋白质合成用反应液中，添加转录模板或翻译模板来进行的，其中所述的生物体来源提取物含有作为翻译装置的核糖体等。作为翻译模板，也可以是从模板DNA转录而得到的mRNA。

在本发明中使用的无细胞系蛋白质合成用反应液中含有的提取物，只要是可以翻译翻译模板而产生该模板编码的蛋白质，则任何提取物均可，可以没有特别限制地使用从以往公知的大肠杆菌、小麦、大麦、稻子、玉米等稻科植物以及菠菜等植物种子的胚芽、兔网织红细胞等提取的提取物、提取液。这些也可以使用市售的产品，也可以使用其本身已知的方法，具体地说，在是大肠杆菌、小麦胚芽或兔网织红细胞来源的提取液的情况下，按照“生物化学实验法43、基因表达研究法”(学会出版中心)中记载的方法等进行制备。作为市售的蛋白质合成用细胞提取液，为大肠杆菌来源时可以举出RTS100 E.coli HYKit(Roche Diagnostics公司制)等，为兔网织红细胞来源时，可以举出兔网织红细胞裂解物系统(RabbitReticulocyte Lysate System，Nuclease Treated)(Promega公司制)等，为小麦胚芽来源时可以举出PROTEIOS套(set)(东洋纺织公司制)等。进而，酵母来源的提取液可以按照Gasior等的方法(Gasior，E等、生物化学杂质(J.Biol.Chem.)、254、3965-3969、1979)或者Hussain等的方法(Hussain、I.等、基因(Gene)、46、13-23、1986)进行制备。另外，也可以按照本发明人等提出的方法进行制备(特愿2003-001317)。

这样，在本发明的无细胞系蛋白质合成用反应液中，也可以含有如上所述的公知的提取物、提取液，但也可以含有本发明人等提出的节肢动物来源的提取物。

在这里，“节肢动物”是后生动物的一个门，是指左右对称、具有裂体腔的原口动物，可以属于螯角亚门、有鄂亚门的任意一种，例如，包括属于昆虫纲、蜘蛛纲等的动物。其中，优选属于昆虫纲或蜘蛛纲(特别是蜘蛛亚纲)的节肢动物，特别优选属于昆虫纲的节肢动物。作为属于昆虫纲的节肢动物，例如可以举出属于鳞翅目(蝶目)、直翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目、甲虫目、脉翅目、半翅目等的动物，没有特别限制，其中，优选使用蚕蛾科、夜蛾科等属于鳞翅目的动物。

在本发明的无细胞系蛋白质合成用反应液中含有的上述节肢动物来源的提取物，可以是从节肢动物的生长阶段的任意阶段的任何组织提取出来的提取物，另外，也可以是从节肢动物的任意组织来源的培养细胞提取的提取物。其中，特别优选从蚕组织或昆虫培养细胞提取的提取物。

“蚕”与属于蚕蛾科的鳞翅目昆虫(蚕蛾昆虫)为相同的意思，是在其一生中经历“卵(胚)”(从刚刚产卵之后到即将孵化之前为止的期间)、“幼虫”(从刚刚孵化之后开始到茧形成即将结束之前(分为1龄期～5龄期))、“蛹”(从茧形成即将结束之前到即将羽化之前为止的期间)以及“成虫(蛾)”(从刚刚羽化之后到死亡为止的期间)的各状态的动物，还包括其一生中所经历的任意形态。蚕在从卵孵化后的幼虫状态下，吃桑叶发育的时期(龄：instar)和不吃桑叶而准备蜕皮的时期(眠)交替重复。蚕的幼虫在孵化后到第一次蜕皮称为1龄期，从第一次蜕皮到第二次蜕皮称为2龄期，通常蜕皮4次，在5龄期成熟(该成熟状态的蚕幼虫也称为“熟蚕”)。蚕的幼虫成为熟蚕时，身体变透明，吐丝，形成茧，蛹化。在蛹之后，羽化成为成虫。

在无细胞系蛋白质合成用反应液含有蚕组织来源的提取物时，作为组织，可以为蚕一生中的任何状态(卵、幼虫(1龄期～5龄期)、蛹、成虫)的任意组织。另外，蚕组织不限于单一状态下的单一组织(例如只有5龄期的蚕幼虫中的后部丝腺)，也可以是单一状态下的多种组织(例如5龄期的蚕幼虫中的后部丝腺和脂肪体)，也可以是多种状态下的单一组织(例如3龄期、4龄期、5龄期的各蚕幼虫中的后部丝腺)。当然也可以是多种状态下的多种组织。其中，蚕组织不需要是整个蚕组织(例如整个后部丝腺)。

在这里，蚕组织的“丝腺”是指在蚕幼虫的两个体侧，从位于头部的下唇顶端的吐出口到盲管连接的一对管状外分泌腺，大致可分为前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺。后部丝腺分泌成为丝的中心部的蚕丝蛋白。另外，中部丝腺分泌丝胶蛋白。蚕丝蛋白被蓄积在中部丝腺中，同时丝胶蛋白覆盖其外周，成为凝胶状绢物质。该绢物质通过前部丝腺从吐出口被排出，固化成丝。

另外，蚕组织的“脂肪体”是指在蚕幼虫中，分布在体内所有位置，白色柔软的扁平带状、绳状或者叶状的组织。脂肪体类似于人的肝脏，起到营养、储藏能源的作用，所以在细胞内含有脂肪球、蛋白质、糖原以及其它与新陈代谢有关的各种物质。

另外，“胚”是指蚕的卵的状态的组织。

另外，在含有蚕组织来源的提取物时，优选为从蚕幼虫的丝腺、脂肪体和蚕的胚中选择的至少一种组织来源的提取物。当从蚕幼虫的丝腺(特别是后部丝腺)进行制备时，存在可以在短时间内合成大量的蛋白质的特别出色的优点。另外，当从蚕幼虫的脂肪体制备提取液时，因为脂肪体是柔软的组织，所以优点是可以在短时间内完成磨碎的操作，可以更容易地制备提取液。进而，当从蚕的胚进行制备时，胚是一个个体，所以优点是与其它组织不同，不需要摘取操作，可以更容易地制备提取液。

将蚕作为提取对象时，蚕只要是1龄期～5龄期的幼虫即可，优选5龄期的幼虫。这是因为，蚕幼虫随着茧的形成期的临近而组织变成熟，特别是在5龄期的蚕幼虫中，其组织在1龄期～5龄期中是最成熟的，所以为了得到等量的提取物而需要的数目可以少。其中，如果含有来自5龄期的蚕幼虫的丝腺或脂肪体(优选5龄期的蚕幼虫的后部丝腺，更优选5龄期的3天～7天的蚕幼虫的后部丝腺)的提取物，与其它龄期的组织相比，可以得到能够在短时间内合成大量蛋白质的无细胞系蛋白质合成用反应液，所以特别优选。

另外，如上所述，在无细胞系蛋白质合成用反应液中含有的节肢动物来源的提取物，也可以是从来源于以往公知的节肢动物的培养细胞中得到的提取物。作为这种培养细胞，已经建立了很多培养细胞株，另外，与很多哺乳动物系的培养细胞不同，不需要在二氧化碳环境下进行培养，即使在无血清培养基中也可以培养，所以优选使用鳞翅目、半翅目等昆虫来源的培养细胞(昆虫培养细胞)。昆虫培养细胞还可以是任何组织来源的细胞，例如可以没有特别限制地使用血细胞、生殖腺来源细胞、脂肪体来源细胞、胚来源细胞、孵化幼虫来源细胞等，其中，优选使用蛋白质生产能力高的生殖腺来源的昆虫培养细胞。特别是可以例示在细胞系中蛋白质合成能力高且在无血清培养基中也可以培养的粉丝夜蛾(Trichoplusia ni)的卵细胞来源的细胞High Five(Invitrogen公司制)或草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)卵巢细胞来源的细胞Sf21(Invitrogen公司制)作为优选的昆虫培养细胞。

含有上述节肢动物来源的提取物的无细胞系蛋白质合成用反应液，可以通过如下所述的过程来制备：使用以往公知的适当组成的提取用液，制备从节肢动物的组织或培养细胞进行提取操作而得到的提取液(无细胞系蛋白质合成用提取液；提取液＝提取用液+提取物)，适当添加如后所述的翻译反应所需要的成分，根据不同情况而适当添加翻译反应和转录反应所需要的成分。

作为用于从节肢动物进行提取操作的提取用液，没有特别限制，但优选至少含有蛋白酶抑制剂。如果使用含有蛋白酶抑制剂的提取用液，节肢动物来源的提取物中含有的蛋白酶的活性被抑制，可以防止由该蛋白酶导致的提取物中的活性蛋白出现不希望的分解，这样可以有效地引导出节肢动物来源的提取物具有的蛋白质合成能力。作为上述蛋白酶抑制剂，只要是可以抑制蛋白酶的活性的物质，就没有特别限制，例如可以使用甲苯磺酰氟(phenylmethane sulphonyl fluorid，下面有时称为“PMSF”)、抑肽酶(aprotinin)、贝他定(bestatin)、亮肽素(leupeptin)、抑胃肽(pepstatin)A、E-64(L-转环氧琥珀酰亮氨酰酰胺-4-胍基丁烷：L-trans-epoxysuccinylleucylamide-4-guanidinobutane)、乙二胺四乙酸、磷酸阿米酮等，节肢动物来源的提取物中大多含有丝氨酸蛋白酶，所以上述中优选使用作为对丝氨酸蛋白酶的特异性高的抑制剂而发挥作用的PMSF。另外，不仅可以使用一种蛋白酶抑制剂，也可以使用多种的混合物(蛋白酶抑制剂混合物)。

对该提取用液中的蛋白酶抑制剂的含量没有特别限制，但从能够很好地发挥在无细胞系蛋白质合成中所必须的酶类的分解抑制能力的观点出发，优选含有1μM～50mM，更优选含有0.01mM～5mM。这是因为，当蛋白酶抑制剂不到1μM时，有不能充分抑制蛋白酶的分解活性的趋势，另外，当蛋白酶抑制剂超过50mM时，则有抑制蛋白质合成反应的趋势。

另外，用于本发明中的提取用液除了上述蛋白酶抑制剂以外，优选至少含有钾盐、镁盐、DTT和缓冲剂。

作为上述钾盐，例如可以以醋酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、氯化钾、磷酸氢二钾、柠檬酸氢二钾、硫酸钾、磷酸二氢钾、碘化钾、苯二甲酸钾等通常的形态使用，其中，优选使用醋酸钾。钾盐起到蛋白质合成反应中的辅助因子的作用。

对该提取用液中的钾盐的含量没有特别限制，但从保存稳定性的观点出发，例如在为醋酸钾等1价钾盐的情况下，优选含有10mM～500mM，更优选为含有50mM～300mM。这是因为，钾盐如果不到10mM或超过500mM，则蛋白质合成所必需的成分有变得不稳定的趋势。

作为上述镁盐，例如可以以醋酸镁、硫酸镁、氯化镁、柠檬酸镁、磷酸氢镁、碘化镁、乳酸镁、硝酸镁、草酸镁等通常的形态使用，其中，优选使用醋酸镁。镁盐也作为蛋白质合成反应中的辅助因子发挥作用。

对该提取用液中的镁盐的含量没有特别限制，从保存稳定性的观点出发，例如在为醋酸镁等2价盐的情况下，优选含有0.1mM～10mM，更优选含有0.5mM～5mM。这是因为，如果镁盐不到0.1mM或超过10mM，蛋白质合成所必需的成分有变得不稳定的趋势。

上述DTT是为了抗氧化而配合的，在该提取用液中优选含有0.1mM～10mM，更优选含有0.5mM～5mM。这是因为，如果DTT不到0.1mM或超过10mM，蛋白质合成所必需的成分有变得不稳定的趋势。

上述缓冲剂是为了向提取用液赋予缓冲能力而防止如酸性或碱性物质的添加等引起提取液pH急剧变化导致的提取物的变性而配合的。作为这样的缓冲剂，没有特别限制，例如可以使用HEPES-KOH、Tris-HCl、醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸、硼酸、MES、PIPES等。

缓冲剂优选使用将得到的提取液的pH保持在4～10的缓冲剂，更优选使用将pH保持在6.5～8.5的缓冲剂。这是因为，如果提取液的pH不到4或pH超过10，则本发明的反应中必须的成分可能发生变性。从这样的观点出发，在上述中特别优选使用HEPES-KOH(pH6.5～8.5)

对该提取用液中的缓冲剂的含量没有特别限制，但从保持适当的缓冲能力的观点出发，优选含有5mM～200mM，更优选含有10mM～100mM。这是因为，如果缓冲剂不到5mM，酸性或碱性物质的添加会引起pH的急剧变动，有提取物发生变性的趋势，另外，如果缓冲剂超过200mM，则盐浓度变得过高，蛋白质合成所必需的成分有变得不稳定的趋势。

另外，在作为提取对象的节肢动物为昆虫培养细胞时，如果使用除了含有上述组成还含有氯化钙和甘油而成的提取用液，可以得到蛋白质合成能力被进一步提高的昆虫培养细胞提取液，所以优选。

在这种情况下，对氯化钙的含量没有特别限制，从能有效地发挥提高上述蛋白质合成能力的效果的观点出发，优选0.1mM～10mM，更优选0.5mM～5mM。另外，对甘油的添加量没有特别限制，但从能有效地发挥提高上述蛋白质合成能力的效果的观点出发，优选将其添加至5(v/v)％～80(v/v)％，更优选添加至10(v/v)％～50(v/v)％。

对从节肢动物的组织或培养细胞提取出提取液的方法没有特别限制，可以通过以往公知的适当的方法进行。

例如，作为节肢动物来源的提取物，当使用蚕组织来源的提取物或昆虫培养细胞来源的提取物时，优选使用如上所述的组成的提取用液，按照本发明人等提出的提取方法制备提取液。

以下，分别对各情况进行详述。

[A]含有蚕组织来源的提取物的提取液的制备方法

首先，按照常规方法，例如使用剪刀、镊子、手术刀等器械，从蚕中摘取需要的组织。作为通过摘取得到的在后述的提取中使用的组织量，没有特别限制，通常在1g～100g的范围内。

接着，将摘取出的组织用如液氮冻结之后，在-80℃下冻结的研钵中磨碎，向其中添加上述的提取用液，进行提取操作。

或者，添加上述提取用液之后，也使提取用液冻结，然后用药匙边搅拌边溶解，直至变成果子露(sherbet)状(具体地说，直至变成湿的黄色凉爽状态的冰)。然后，重新用液氮完全冻结之后，然后用药匙边搅拌边溶解，直至变成果子露状(具体地说，直至变成湿的黄色凉爽状态的冰)。通过这样的方法，可以有效地提取与蛋白质合成相关的成分，而且可以使其稳定化。

这样，首先得到含有来自蚕组织的提取物的液状物。

接着，离心分离在上述提取处理中得到的液状物。该离心分离是在该领域中通常进行的条件(10,000×g～50,000×g、0℃～10℃、10分钟～60分钟)下进行的。可以直接使用进行1次该离心分离之后的上清(上清A1)作为提取液，另外，可以在与上述相同的条件下对该上清A1进行再次离心分离，将得到的上清(上清A2)作为提取液。

另外，进一步使用上述提取用液从上述第一次离心分离之后的沉淀进行提取之后，在与上述相同的条件下进行离心分离得到上清(上清A3)，可以混合上述上清A1和上清A3，作为提取液进行制备。通过这样混合上清A1和上清A3制备提取液，与将上清A1、上清A3单独作为提取液的情况相比，蛋白质合成效率提高。另外，也可以进一步混合上清A2和上清A3，制备提取液。这样，上述效果进一步被增强。当然也可以混合上述上清A1～上清A3，制备提取液。

在这种情况下，对制备的混合物(提取液)中的上清A1和/或上清A2(当混合双方时为其总量)与上清A3的混合比例没有特别限制，但从蛋白质的合成效率的观点出发，体积比优选为10∶90～90∶10，更优选为20∶80～80∶20。

此外，也可以在如上所述分别进行制备之后，实施凝胶过滤，从凝胶过滤后的滤液中分取出在280nm下的吸光度最高的组分(fraction)附近，作为提取液进行制备。但是，从蛋白质的合成效率的观点出发，优选不经过该凝胶过滤和组分的分取(fractionation)而作为提取液进行制备。

此外，在实施了上述凝胶过滤并从凝胶过滤之后的滤液中分取出在280nm下的吸光度最高的组分附近的情况下，具体地说，可以按照下述的步骤进行。

例如，使用脱盐柱PD-10(Amersham Biosciences公司制)，按照常规方法，在如下所述的条件下进行：即，在用凝胶过滤缓冲液平衡化柱之后，供给样品，用上述提取用液洗脱。上述凝胶过滤用缓冲液优选向上述提取用液中进一步添加甘油而成的液体。通常添加甘油至5(v/v)％～40(v/v)％(优选20(v/v)％)即可。像通常利用凝胶过滤进行的操作那样，可以将凝胶过滤得到的滤液的0.1mL～1mL作为1个组分，从有效地分取出具有高蛋白质合成能力的组分的观点出发，优选将0.4mL～0.6mL作为1个组分

接着，从凝胶过滤后的滤液分取出在280nm下的吸光度为10以上的组分。该处理使用例如Ultrospec3300pro(Amersham Bioscience公司制)等仪器，对各组分在上述280nm下的吸光度进行测定，分取出其吸光度最高的组分附近，将其作为提取液。

[B]含有昆虫培养细胞来源的提取物的提取液的制备方法

在从昆虫培养细胞制备提取液的情况下，优选通过本发明人等提出的、至少含有使悬浮在提取用液中的昆虫培养细胞急剧冻结的工序的方法进行制备。在这里，“急剧地冻结”是指从交付冻结处理后的10秒以下、优选2秒以下，使昆虫培养细胞冻结。另外，作为使昆虫培养细胞急剧冻结的温度，通常为-80℃以下，优选为-150℃以下。上述昆虫培养细胞的急剧冻结，例如可以通过使用液氮或液氦等惰性气体等来实现，优选使用容易得到且廉价的液氮进行冻结。

通过利用该方法从昆虫培养细胞进行提取，可以在温和的状态下破碎细胞，可以在不破坏无细胞系蛋白质合成所必需的成分的情况下取出到细胞外，可以容易地制备蛋白质的合成量比以往更高的无细胞系蛋白质合成用提取液。进而，还可以防止混入来自使用器具等的RNA酶(RNase)等，另外，在是使用了界面活性剂等试剂的细胞破碎法的情况下，不会带入有可能抑制翻译反应之类的物质。

在上述本发明人等提出的提取液的制备方法中，如果至少包括上述急剧冻结的工序，则对其它工序没有特别限制。例如，可以通过在研钵中使用研杵磨碎的方法、使用杜恩斯匀浆器(Dounce homogenizer)的方法、使用玻璃珠(glass beads)的方法等在从大肠杆菌或小麦胚芽等得到无细胞系蛋白质合成用提取液时一直应用的各种手段，破碎昆虫培养细胞，进行提取。其中，优选通过急剧地冻结上述昆虫培养细胞之后，解冻，离心分离，来破碎昆虫培养细胞。

在对上述已急剧冻结的昆虫培养细胞进行解冻之后，进行离心分离时，解冻可以通过例如在-10℃～20℃的水浴或冰水浴中的解冻、在室温(25℃)下的放置等实现，但为了防止蛋白质合成所必需的成分失活，确实可靠地防止蛋白质合成能力的降低，优选在0℃～20℃(特别是4℃～10℃)的水浴或冰水浴中进行解冻。已解冻的昆虫培养细胞的离心分离可以在该区域通常进行的条件下(10,000×g～50,00×g、0℃～10℃、10分钟～60分钟)下进行。在该离心分离后的上清中含有需要的昆虫培养细胞的提取物。

细胞破碎之后，可以直接将上述离心分离之后的上清(上清B1)作为提取液，也可以将上清B1进一步离心分离(10,000×g～100,000×g、0℃～10℃、10分钟～120分钟)得到的上清(上清B2)作为提取液。进而，可以凝胶过滤上述上清B1或上清B2，从凝胶过滤后的滤液分取出280nm下的吸光度为10以上的组分(吸收大的组分)，将其作为提取液。在这种情况下，具体按照以下步骤进行。

首先，对上清B1或上清B2进行凝胶过滤，凝胶过滤可以适当使用例如脱盐柱PD-10(Amersham Bioscience公司制)，按照常规方法，在如下所述的条件下进行即可：即，在用凝胶过滤用缓冲液平衡化柱之后，供给样品，用上述凝胶过滤用缓冲液洗脱。作为上述凝胶过滤用缓冲液，可以没有特别限制地使用以往公知的适当组成的缓冲液，例如可以使用含有10mM～100mM的HEPES-KOH(pH6.5～8.5)、50mM～300mM的醋酸钾、0.5mM～5mM的醋酸镁、0.5mM～5mM的DTT、0.01mM～5mM的PMSF的凝胶过滤用缓冲液。凝胶过滤得到的滤液，可以像用通常的凝胶过滤进行操作那样，将0.1mL～1mL作为1个组分，从有效地分取具有高蛋白质合成能力的组分的观点出发，优选将0.4mL～0.6mL作为1个组分。

接着，例如使用Ultrospec3300pro(Amersham Bioscience公司制)等仪器，从凝胶过滤后的滤液分取出280nm下的吸光度为30以上的组分(吸收大的组分)，将其作为提取液。

另外，也可以进一步离心分离在上述凝胶过滤中得到的吸收大的组分，将得到的上清(上清B3)作为提取液。从除去抑制翻译反应的不溶性的成分的理由出发，该凝胶过滤后的离心分离优选在30,000×g～100,000×g、0℃～10℃、10分钟～60分钟的条件下进行。

此外，就供于本发明的制备方法的昆虫培养细胞而言，为了避免带入到在培养中使用的培养基的翻译反应液中，在进行上述急剧冻结之前，不含有蛋白酶抑制剂和甘油，除此之外，优选预先用组成与上述昆虫培养细胞用的适当提取用液相同的清洗液进行清洗。用清洗液的清洗是通过向昆虫培养细胞中添加清洗液并对其进行离心分离(例如，700×g、10分钟、4℃的条件)而进行的。为了完全地冲走培养基，清洗中使用的清洗液的量相对湿重1g的昆虫培养细胞优选为5mL～100mL，更优选10mL～50mL。清洗次数优选进行1次～5次，更优选进行2次～4次。

对本发明的提取液中的节肢动物来源的提取物的含量没有特别限制，优选以蛋白质浓度计为1mg/mL～200mg/mL，其中，更优选10mg/mL～100mg/mL。这是因为，该提取物的含量如果以蛋白质浓度计不到1mg/mL，无细胞系蛋白质合成所必需的成分的浓度变低，不能进行充分的合成反应，另外，还因为该提取物的含量如果以蛋白质浓度计超过200mg/mL，提取液自身具有高粘性，有可能难以操作。

此外，含有上述范围的量的节肢动物来源的提取物的提取液，可以利用提取液的蛋白质浓度测定来制备。如同在该领域中通常进行的那样，该蛋白质浓度测定例如按照如下步骤进行：即，使用BCA蛋白质检测试剂盒(Protein assay Kit)(PIERCE公司制)，相对2mL反应试剂，加入0.1mL样品，在37℃下反应30分钟，测定562nm下的吸光度。使用分光光度计(Ultrospec3300pro，Amersham Bioscience公司制)，测定562nm下的吸光度。作为对照，通常使用牛血清白蛋白(BSA)。

在无细胞系蛋白质合成方法中，例如使用如上所述制备而成的提取液，制备翻译系用反应液或转录/翻译系用反应液。在是翻译系用反应液、转录/翻译系用反应液的任何情况下，均优选制备成含有上述提取液10(v/v)％～80(v/v)％、特别是30(v/v)％～60(v/v)％。即，在整个反应液中，节肢动物来源的提取物的含量优选被制备成以蛋白质浓度计为0.1mg/mL～160mg/mL，更优选制备成3mg/mL～60mg/mL。该提取物的含量如果以蛋白质浓度计不到0.1mg/mL或超过160mg/mL，蛋白质的合成速度有降低的趋势。

以下将使用含有节肢动物来源的提取物的提取液的情况作为例子，对(1)翻译系用反应液、(2)转录/翻译系用反应液，分别进行说明。在使用含有节肢动物来源的提取物以外的提取物的提取液时，根据其来源适当设定必要的试剂或反应条件。

(1)翻译系用反应液

作为除了上述节肢动物来源提取液以外的成分，翻译系用反应液优选至少含有翻译模板、钾盐、镁盐、DTT、三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、磷酸肌酸、肌酸激酶、氨基酸成分、RNA酶抑制剂、tRNA、缓冲剂，为了实现本发明的目的即蛋白质的翻译后修饰，含有微粒体膜，更具体地说是含有后述的节肢动物来源的微粒体膜。通过使用该翻译系用反应液进行翻译系合成反应，可以在短时间内合成大量的蛋白质。

就在翻译系用反应液中含有的翻译模板(mRNA)而言，对其碱基数没有特别限制，只要可以合成目的蛋白质，所有mRNA不是相同的碱基数也可以。另外，只要序列与可以合成目的蛋白质的程度相同，各mRNA可以是缺失、置换、插入或附加几个碱基的mRNA。mRNA可以用以往公知的适当的方法转录模板DNA(其制备如后所述)来制备，优选通过本身公知的体外(in vitro)转录来转录并制备模板DNA。体外转录例如可以利用RiboMax大规模RNA生产系统-T7(RiboMax Large Scale RNAproduction System-T7)(Promega公司制)等进行。mRNA在转录后利用本身公知的方法纯化并分离，如后所述，可以作为无细胞系蛋白质合成用的翻译模板用于翻译系用反应液中。

在翻译系用反应液中，从蛋白质合成的速度的观点出发，翻译模板优选含有翻译模板1μg/mL～2000μg/mL，更优选含有10μg/mL～1000μg/mL。如果mRNA不到1μg/mL或超过2000μg/mL，蛋白质合成的速度有降低的趋势。

在翻译系用反应液中，从蛋白质的翻译后的修饰效率的观点出发，含有的节肢动物来源的微粒体膜在260nm的吸光度(以后称为A260)为1～50(A260＝1～50)，优选为2～15(A260＝2～15)。这是因为，当微粒体膜在A260不到1时，翻译后修饰有进行不充分的趋势，如果超过50，有显著抑制蛋白质合成本身的趋势。进而，从蛋白质的翻译后修饰效率的观点出发，在翻译反应液中，最好mRNA浓度(μg/mL)与节肢动物来源的微粒体膜浓度(A260)的比值为1∶0.1～5，优选0.3～2.3。

在求得mRNA浓度(μg/mL)与哺乳动物来源的微粒体膜的浓度(A260)的比值时的节肢动物来源的微粒体膜的纯度，通常为A260/A280＝1.3～2.0，优选为1.4～1.8。该比值为1∶0.1～5(优选为0.3～2.3)是指反应液1mL中存在1μg mRNA时，微粒体膜的浓度在A260下为0.1～5(优选为0.3～2.3)。

该微粒体膜优选在翻译开始时存在于反应液中，也可以根据需要适当调节其添加时期。

作为节肢动物来源的微粒体膜，是昆虫组织(特别是蚕组织)、昆虫培养细胞(特别是粉丝夜蛾卵细胞、草地夜蛾卵巢细胞)来源，只要是不失去微粒体膜的活性的方法即可，对其制备方法没有限制，例如，基本上可以是基于Walter，P和Blobel，G的方法(酶学(Enzymol.96，pp.84-93，1983年)的方法，通过利用蔗糖密度梯度的超速离心分离而制备。即，将每1g昆虫组织、或利用离心分离收集的昆虫培养细胞悬浮于1～10ml的微粒体膜提取用液(提取液的组成可以根据使用的组织或细胞的种类适当变更)，然后，利用匀浆器(homonizer)(优选杜恩斯匀浆器)处理来破碎细胞。破碎后，通过离心分离等，除去细胞残渣，回收上清。通过利用蔗糖密度梯度的超速离心分离，从已回收的上清分离出微粒体膜组分。更具体的制备方法在实施例中描述。

作为翻译系用反应液中的钾盐，可以使用上述各种钾盐、优选醋酸钾作为提取用液的成分。从与上述提取用液中的钾盐的情况相同的观点出发，在该翻译系用反应液中，优选含有钾盐10mM～500mM，更优选含有50mM～150mM。

作为翻译系用反应液中的镁盐，可以优选使用上述各种镁盐、优选醋酸镁作为提取用液的成分。从与上述提取用液中的镁盐的情况相同的观点出发，在该翻译系用反应液中，优选含有镁盐0.1mM～10mM，更优选含有0.5mM～3mM。

从与上述提取用液中的DTT的情况相同的观点出发，翻译系用反应液中的DTT优选含有0.1mM～10mM，更优选含有0.2mM～5mM。

从蛋白质合成的速度的观点出发，翻译系用反应液中的三磷酸腺苷(以下有时称为“ATP”)优选含有0.01mM～10mM，更优选含有0.1mM～5mM。这是因为，ATP如果不到0.01mM或超过10mM，蛋白质合成速度有降低的趋势。

从蛋白质合成的速度的观点出发，翻译系用反应液中的三磷酸鸟苷(以下有时称为“GTP”)优选含有0.01mM～10mM，更优选含有0.1mM～5mM。这是因为，GTP如果不到0.01mM或超过10mM，蛋白质合成速度有降低的趋势。

翻译系反应液中的磷酸肌酸是用于持续合成蛋白质的成分，是为了再生ATP和GTP而配合的。从蛋白质合成的速度的观点出发，优选在该反应液中含有磷酸肌酸1mM～200mM，更优选含有10mM～100mM。这是因为，磷酸肌酸如果不到1mM，则难以再生足够量的ATP和GTP，结果蛋白质的合成速度有降低的趋势，另外，还因为磷酸肌酸如果超过200mM，起到抑制物质的作用，蛋白质的合成速度有降低的趋势。

翻译系用反应液中的肌酸激酶是用于持续合成蛋白质的成分，其配合目的是与磷酸肌酸一起再生ATP和GTP。从蛋白质的合成速度的观点出发，优选在该反应液中含有肌酸激酶1μg/mL～1000μg/mL，更优选含有10μg/mL～500μg/mL。这是因为，肌酸激酶如果不到1μg/mL，则难以再生足够量的ATP和GTP，结果蛋白质的合成速度有降低的趋势，另外，还因为肌酸激酶如果超过1000μg/mL，则起到抑制物质的作用，蛋白质的合成速度有降低的趋势。

翻译系用反应液中的氨基酸成分至少含有20种氨基酸，即缬氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、胱氨酸、精氨酸20种氨基酸。在该氨基酸中也含有放射性同位素标记了的氨基酸。进而，根据需要，也可以含有修饰氨基酸。该氨基酸成分通常是以大致等量含有各种氨基酸而成的。

在本发明中，从蛋白质合成的速度的观点出发，在该反应液中，优选含有上述氨基酸成分1μM～1000μM，更优选含有10μM～200μM。这是因为，氨基酸成分如果不到1μM或超过1000μM，蛋白质的合成速度有降低的趋势。

翻译系用反应液的中RNA酶抑制剂，是为了防止提取液中混在的节肢动物来源的RNA酶在无细胞系蛋白质合成时消化mRNA或tRNA而妨碍蛋白质的合成而配合的，在该反应液中优选含有0.1U/μL～100U/μL，更优选含有1U/μL～10U/μL。这是因为，RNA酶抑制剂如果不到0.1U/μL，有不能充分抑制RNA酶的分解活性的趋势，另外，还因为RNA酶抑制剂如果超过100U/μL，有抑制蛋白质合成反应的趋势。

翻译系用反应液中的tRNA是以大致等量含有与上述20种氨基酸的种类对应的tRNA而成的。在本发明中，从蛋白质合成的速度的观点出发，在该反应液中优选含有1μg/mL～1000μg/mL，更优选含有10μg/mL～500μg/mL。这是因为，tRNA如果不到1μg/mL或超过1000μg/mL，蛋白质合成的速度有降低的趋势。

作为翻译系用反应液中含有的缓冲剂，可以优选使用与上述用于提取用液的缓冲剂相同的缓冲剂，由于相同的原因，优选使用HEPES-KOH(pH6～8)。另外，从与上述提取用液中的缓冲剂的情况相同的观点出发，优选含有缓冲剂5mM～200mM，更优选含有10mM～50mM。

另外，翻译系用反应液更优选进一步添加甘油。这是因为，如果添加甘油，在翻译系合成反应中，可以稳定化蛋白质合成所必需的成分。添加甘油时，通常添加到5(v/v)％～20(v/v)％。

进而，翻译系用反应液优选含有乙二醇双(2-氨基乙基醚)四醋酸(以下有时称为“EGTA”)。这是因为，如果含有EGTA，通过EGTA与提取液中的金属离子形成螯合物而使核糖核酸酶、蛋白酶等失活，这样可以抑制无细胞系蛋白质合成所必需的成分发生分解。从能够很好地发挥上述分解抑制能力的观点出发，该EGTA在上述反应液中优选含有0.01mM～10mM，更优选含有0.1mM～5mM。这是因为，EGTA如果不到0.01mM，则有不能充分抑制必须成分的分解活性的趋势，还因为如果超过10mM，则有抑制蛋白质合成反应的趋势。

即，作为翻译系用反应液，优选在含有含节肢动物来源提取物的提取液30(v/v)％～60(v/v)％的同时，含有50mM～150mM的醋酸钾、0.5mM～3mM的醋酸镁、0.2mM～5mM的DTT、5(v/v)％～20(v/v)％的甘油、0.1mM～5mM的ATP、0.1mM～5mM的GTP、10mM～100mM的磷酸肌酸、10μg/mL～500μg/mL的肌酸激酶、10μM～200μM的氨基酸成分、1U/μL～10U/μL的RNA酶抑制剂、10μg/mL～500μg/mL的tRNA、10μg/mL～100μg/mL的翻译模板、翻译系反应液中在A260下为1～50的哺乳动物微粒体膜(与翻译模板的浓度比为mRNA(μg/mL)∶微粒体膜浓度(A260)＝1∶0.1～5)、10mM～50mM的HEPES-KOH(pH6～8)而实现的。

另外，除了上述，更优选还含有0.1mM～5mM的EGTA而实现。

使用了上述翻译系用反应液的无细胞系蛋白质合成反应(翻译系合成反应)，在以往公知的如低温恒温槽中进行。反应温度通常在10℃～40℃、优选在20℃～30℃的范围内。这是因为，反应温度如果不到10℃，蛋白质的合成速度有降低的趋势，另外，还因为反应温度如果超过40℃，必需的成分有变性的趋势。反应的时间通常为1小时～72小时，优选3小时～24小时。

(2)转录/翻译系用反应液

作为除了上述提取液之外的成分，转录/翻译系用反应液优选至少含有转录模板、RNA聚合酶、ATP、GTP、胞苷5’-三磷酸、尿苷5’-三磷酸、磷酸肌酸、肌酸激酶、氨基酸成分和tRNA，为了实现作为本发明的目的的对蛋白质的翻译后修饰，含有微粒体膜，更具体地说含有节肢动物来源的微粒体膜。通过使用该转录/翻译系用反应液进行转录/翻译系合成反应，可以在短时间内合成大量的蛋白质。

此外，转录模板(模板DNA)只要至少含有启动子序列和编码蛋白质的结构基因，就可以是任意碱基序列、碱基数的模板。对结构基因编码的蛋白质(包括肽)没有特别限制，也可以具有对在活细胞中成为细胞毒的蛋白质进行编码的碱基序列，另外，也可以具有编码糖蛋白质的碱基序列。在模板DNA中，通常启动子序列被配置在结构基因的5’上游侧。作为启动子序列，例如可以举出以往公知的T7启动子序列、SP6启动子序列、T3启动子序列等。

另外，本发明的模板DNA优选在结构基因的3’下游侧具有终止子(terminator)序列。作为上述终止子序列，例如可以举出以往公知的T7终止子序列、SP6终止子序列、T3终止子序列等。另外，从已合成的mRNA的稳定性等观点出发，模板DNA也可以在结构基因的3’下游侧具有多聚A序列。

该模板DNA也可以通过至少含有(1)连接已预先被分隔成多个区域的模板DNA的工序、(2)利用PCR对连接后的DNA进行扩增的工序的方法来合成。在这里，就区域的数量而言，可以通过一系列的连接反应和随后的PCR被接合并扩增的区域为2个，为了进一步接合和扩增其它区域，必须进一步进行一系列的连接和PCR，所以优选被分隔为尽可能少的区域。该区域数优选为2个～5个，更优选为2个～3个，特别优选为2个。模板DNA被预先分隔，是为了在该模板DNA中不扩增区域内没有的碱基序列部分、或在各区域中彼此重复的碱基序列部分，换言之，接合整个区域而成为模板DNA。已分隔的各区域可以是质粒DNA已被限制性酶切断并制备而成的DNA，也可以是利用PCR扩增成的DNA，也可以是利用DNA合成机合成的DNA。

首先，在已预先分隔模板DNA的区域中，使彼此邻接的区域连接。在进行连接反应时，最好将DNA的末端制备成双方的DNA可以顺向连结。具体地说，将要接合的两个DNA的末端制备成平滑末端。或者是用相同的限制性酶切断的片断。另外，也可以通过T4多核苷酸激酶磷酸化一方DNA的末端，制备成可以有效连接的状态。连接时使用的试剂或反应条件可以按照在该领域通常实施的条件进行。例如，使用NEB公司制快速连接试剂盒(Quick Ligation Kit)，按照流程(protocol)，混合DNA、反应缓冲液、快速T4连接酶，在25℃下孵育5分钟即可。

接着，利用PCR扩增上述连接后的DNA。PCR可以没有特别限制地使用市售的PCR用热循环机(thermal cycler)等以往公知的装置来进行。对PCR的条件没有特别限制，在该领域中通常实施的条件下进行即可。例如使用东洋纺织公司制KOD plus，按照其流程即可。此时使用的引物使用以需要扩增的DNA的端部的序列为基础制作的正义引物和反义引物。这样，通过连接产生多种接合的DNA，但PCR只扩增需要的DNA。

进而，当模板DNA被分为3个以上的区域时，使用在上述PCR中扩增了的DNA和进一步接合的DNA，进行连接、PCR，制备模板DNA。

另外，本发明中的模板DNA优选进一步具有有促翻译反应活性的序列(以下有时称为“促翻译反应序列”)。在此，“促翻译反应序列”是指通过使用具有该促翻译反应序列的模板DNA来进行无细胞系蛋白质合成反应，与使用没有该促翻译反应序列的模板DNA进行无细胞系蛋白质合成反应的情况相比，翻译效率被提高到1.2倍以上(优选2倍以上)的序列。

作为该促翻译反应活性序列，可以适当使用如上所述的具有促翻译反应活性的公知的序列，没有特别限制。作为促翻译反应活性序列的具体例子，是蚕或杆状病毒(baculovirus)中作为5’非翻译区(5’UTR)公知的碱基序列。具体而言，可以举出蚕的蚕丝蛋白L链基因的5’UTR的碱基序列、蚕的丝胶蛋白基因的5’UTR的碱基序列、AcNPV(苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒：Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列、BmCPV(家蚕胞质型多角体病毒：Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列、EsCPV(Euxoa scandes胞质型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列、HcNPV(Hyphantria cunea核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列、CrNPV(Choristoneura rosaceana核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列、EoNPV(Ecotropis oblique核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列、MnNPV(Malacosma neustria核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列、SfNPV(草地夜蛾核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列、WsNPV(Wiseana signata核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列等。这些促翻译反应序列可以利用以往公知的任何方法得到。例如，可以使用公知的DNA合成机进行合成。

上述促翻译反应序列优选在模板DNA中被一个或几个结合(introduce into)到上述结构基因的5’上游侧。促翻译反应序列在结构基因的5’上游侧可以按照顺向(5’→3’)结合，也可以按逆向(3’→5’)结合。另外，也可以结合两个以上的促翻译反应序列，在这种情况下，结合的促翻译反应序列可以相同，也可以彼此不同。另外，当结合两个以上促翻译反应序列时，也可以不是全部促翻译反应序列向相同的方向结合。促翻译反应序列也可以在结构基因的5’上游侧被结合成为与结构基因邻接，也可以以与结构基因之间存在一个碱基以上的碱基序列的状态进行结合。

进而，该模板除了上述序列以外，也可以导入需要的序列。具体而言，当纯化已接受翻译后修饰的蛋白质而在以后的实验等中使用时，可以导入适当的序列。例如，有时优选进行纯化以便容易进行交付电泳之前的SDS化。在利用镍柱等进行纯化的情况下，在该模板DNA上附加His-tag。

在转录/翻译系用反应液中优选含有转录模板0.1μg/mL～8000μg/mL，更优选含有3μg/mL～600μg/mL。这是因为，如果转录模板不到0.1μg/mL或超过8000μg/mL时，蛋白质合成的速度有降低的趋势。

在转录/翻译系用反应液中，从蛋白质的翻译后的修饰效率的观点出发，节肢动物来源的微粒体膜在A260下含有1～50(A260＝1～50)，优选含有2～15(A260＝2～15)。这是因为，如果微粒体膜在A260下不到1，有不能充分进行翻译后修饰的趋势，如果超过50，会存在显著抑制蛋白质合成本身的趋势。进而，从蛋白质的翻译后的修饰效率的观点出发，在翻译反应液中，最好mRNA浓度(μg/mL)和哺乳动物来源的微粒体膜的浓度(A260)的比值为1∶0.1～5，优选为0.3～2.3。

作为节肢动物来源微粒体膜，与在上述翻译系用反应液中使用的相同，可以通过相同的制备方法利用。

在转录/翻译系用反应液中使用的RNA聚合酶，可以根据转录模板具有的启动子序列适当选择。例如，当转录模板具有T7启动子序列时，优选使用识别该序列的T7 RNA聚合酶。另外，当转录模板具有SP6或T3启动子序列时，优选分别使用SP6 RNA聚合酶或T3 RNA聚合酶。

从mRNA合成的速度和蛋白质合成的速度的观点出发，优选在转录/翻译系用反应液中含有RNA聚合酶0.01U/μL～100U/μL，更优选含有0.1U/μL～10U/μL。这是因为，当RNA聚合酶不到0.01U/μL时，mRNA的合成量变少，蛋白质合成的速度有降低的趋势，另外，还因为当RNA聚合酶超过100U/μL时，有抑制蛋白质合成反应的趋势。

从蛋白质合成的速度的观点出发，转录/翻译系用反应液中的ATP优选含有0.01mM～10mM，更优选含有0.1mM～5mM。这是因为，ATP如果不到0.01mM或超过10mM，蛋白质的合成速度有降低的趋势。

从蛋白质合成的速度的观点出发，转录/翻译系用反应液中的GTP优选含有0.01mM～10mM，更优选含有0.1mM～5mM。这是因为，GTP如果不到0.01mM或超过10mM，蛋白质的合成速度有降低的趋势。

从蛋白质合成的速度的观点出发，转录/翻译系用反应液中的胞苷5’-三磷酸(下面有时称为“CTP”)优选含有0.01mM～10mM，更优选含有0.1mm～5mM。这是因为，CTP如果不到0.01mM或超过10mM，蛋白质的合成速度有降低的趋势。

从蛋白质合成的速度的观点出发，转录/翻译系用反应液中的尿苷5’-三磷酸(下面有时称为“UTP”)优选含有0.01mM～10mM，更优选含有0.1mM～5mM。这是因为，UTP如果不到0.01mM或超过10mM，蛋白质的合成速度有降低的趋势。

转录/翻译系用反应液中的磷酸肌酸是用于持续合成蛋白质的成分，配合目的是再生ATP和GTP。从蛋白质合成的速度的观点出发，优选在转录/翻译系用反应液中含有磷酸肌酸1mM～200mM，更优选含有10mM～100mM。这是因为，磷酸肌酸如果不到1mM，则难以再生足够量的ATP和GTP，结果蛋白质的合成速度有降低的趋势，另外，还因为磷酸肌酸如果超过200mM，则成为抑制物质，蛋白质的合成速度有降低的趋势。

转录/翻译系用反应液中的肌酸激酶是用于持续合成蛋白质的成分，配合目的是与磷酸肌酸一起再生ATP和GTP。从蛋白质合成的速度的观点出发，优选在转录/翻译系用反应液中含有肌酸激酶1μg/mL～1000μg/mL，更优选含有10μg/mL～500μg/mL。这是因为，肌酸激酶如果不到1μg/mL，则难以再生足够量的ATP和GTP，结果蛋白质的合成速度有降低的趋势，另外，还因为肌酸激酶如果超过1000μg/mL，则成为抑制物质，蛋白质的合成速度有降低的趋势。

转录/翻译系用反应液中的氨基酸成分至少含有20种氨基酸，即缬氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、胱氨酸、精氨酸20种氨基酸。该氨基酸中也含有放射性同位素标记的氨基酸。进而，根据需要，也可以含有修饰氨基酸。该氨基酸成分通常分别大致等量含有各种氨基酸而成。

从蛋白质合成的速度的观点出发，转录/翻译系用反应液中优选含有上述氨基酸成分1μM～1000μM，更优选含有10μM～500μM。这是因为，氨基酸成分如果不到1μM或超过1000μM，蛋白质的合成速度有降低的趋势。

转录/翻译系用反应液中的tRNA是大致等量含有与上述20种氨基酸的种类对应的tRNA而成的。从蛋白质合成的速度的观点出发，在转录/翻译系用反应液中tRNA优选含有1μg/mL～1000μg/mL，更优选含有10μg/mL～500μg/mL。这是因为，tRNA如果不到1μg/mL或超过1000μg/mL，蛋白质合成的速度有降低的趋势。

转录/翻译系用反应液中优选进一步含有钾盐、镁盐、DTT、RNA酶抑制剂、亚精胺和缓冲剂。

作为转录/翻译系用反应液中的钾盐，可以优选使用上述各种钾盐、优选醋酸钾作为提取用液的成分。从与上述提取用液中钾盐的情况相同的观点出发，在该转录/翻译系用反应液中，优选含有钾盐10mM～500mM，更优选含有50mM～150mM。

作为转录/翻译系用反应液中的镁盐，可以优选使用上述各种镁盐、优选醋酸镁作为提取用液的成分。从与上述提取用液中镁盐的情况相同的观点出发，在该转录/翻译系用反应液中，优选含有镁盐0.1mM～10mM，更优选含有0.5mM～3mM。

转录/翻译系用反应液中的DTT是为了防止氧化而配合的物质，在该反应液中优选含有0.1mM～100mM，更优选含有0.2mM～20mM。这是因为，DTT如果不到0.1mM或超过100mM，蛋白质合成所必需的成分有变得不稳定的趋势。

转录/翻译系用反应液中的RNA酶抑制剂是为了防止在提取液中混在的节肢动物来源的RNA酶在转录/翻译系合成反应时不希望地消化mRNA或tRNA而妨碍蛋白质的合成而添加的，在该反应液中优选含有0.1U/μL～100U/μL，更优选含有1U/μL～10U/μL。这是因为，RNA酶抑制剂如果不到0.1U/μL，有不能充分抑制RNA酶的分解活性的趋势，另外，还因为RNA酶抑制剂如果超过100U/μL，有抑制蛋白质合成反应的趋势。

上述亚精胺是为了促进在转录中的延伸反应而添加的，在转录/翻译系用反应液中优选含有0.01mM～100mM，更优选含有0.05mM～10mM。这是因为，亚精胺如果不到0.01mM，mRNA的合成速度有降低，生成的mRNA的量变少，结果蛋白质合成的速度有降低的趋势，另外，还因为亚精胺如果超过100mM，有抑制蛋白质合成反应的趋势。

作为转录/翻译系用反应液中含有的缓冲剂，可以适当使用与上述用于提取用液的缓冲剂相同的缓冲剂，由于相同的原因，优选使用HEPES-KOH(pH6～8)。另外，从与上述提取用液中的缓冲剂的情况相同的观点出发，优选含有缓冲剂1mM～200mM，更优选含有5mM～50mM。

另外，转录/翻译系用反应液更优选进一步添加甘油。这是因为，如果添加甘油，在转录/翻译系合成反应中，存在可以稳定化蛋白质合成所必需的成分的优点。添加甘油时，通常添加到5(v/v)％～20(v/v)％。

即，作为转录/翻译系用反应液，优选在含有该提取液30(v/v)％～60(v/v)％的同时，还含有3μg/mL～600μg/mL的转录模板、转录/翻译系反应液中在A260下为1～50的哺乳动物微粒体膜(与翻译模板的最终浓度比值为mRNA(μg/mL)∶微粒体膜浓度(A260)＝1∶0.1～0.5的量)、0.1U/μL～10U/μL的RNA聚合酶、0.1mM～5mM的ATP、0.1mM～5mM的GTP、0.1mM～5mM的CTP、0.1mM～5mM的UTP、10mM～100mM的磷酸肌酸、10μg/mL～500μg/mL的肌酸激酶、10μM～500μM的氨基酸成分、10μg/mL～500μg/mL的tRNA。进而，优选含有50mM～150mM的醋酸钾、0.5mM～3mM的醋酸镁、0.2mM～20mM的DTT、1U/μL～10U/μL的RNA酶抑制剂、0.05mM～10mM的亚精胺、5mM～50mM的HEPES-KOH(pH7.4)、5(v/v)％～20(v/v)％的甘油来实现。

对于使用了上述转录/翻译系用反应液的无细胞系蛋白质合成反应(转录/翻译系合成反应)，与上述翻译系用反应液的情况相同，可以在以往公知的如低温恒温槽中进行。转录工序的反应温度通常在10℃～60℃、优选在20℃～50℃的范围内。这是因为，转录工序的反应温度如果不到10℃，转录的速度有降低的趋势，另外转录工序的反应温度如果超过60℃，反应所必需的成分有变性的趋势。另外，翻译工序的温度通常在10℃～40℃，优选在20℃～30℃的范围内。这是因为，翻译工序的反应温度如果不到10℃，蛋白质的合成速度有降低的趋势，另外翻译工序的反应温度如果超过40℃，反应所必需的成分有变性的趋势。

在转录/翻译系合成反应中，从可以连续实施转录/翻译工序的观点出发，特别优选以对两个工序较适合的20℃～30℃的范围进行反应。整个工序加在一起的反应的时间为1小时～72小时，优选为3小时～24小时。

对可以使用上述翻译系用反应液、转录/翻译系用反应液合成的蛋白质，没有特别限制，鉴于本发明的目的，优选进行翻译后的修饰的蛋白质。合成的蛋白质的量可以通过酶的活性测定、SDS-PAGE、免疫检测法等进行测定。可以通过将已合成的蛋白质供给到SDS-PAGE、荧光显影(fluorography)，根据在微粒体膜存在下、不存在下的分子量的变化或对蛋白酶处理的敏感性，来判定是否恰当地进行了翻译后的修饰。

实施例

下面利用实施例对本发明进一步详细说明，但这些实施例不对本发明有任何限定。

[实施例1]

(1)表达质粒的制备

在翻译后修饰中，将糖链修饰(N-糖基化)作为模型，使用已知产生糖链修饰的pro-TNF-GLC(在蛋白质的成熟区域内人为地导入N-糖基化部位的突变型人抗肿瘤因子)，尝试该糖蛋白质的体外合成。图1表示构建的表达质粒的模式图。另外，将使用的多角体蛋白5’-UTR的碱基序列表示为序列号1，将pro-TNF-GLC基因的全碱基序列表示为序列号2。

表达质粒的构建是通过将pT_NT载体(Promega公司制)作为模板，使用在序列号3和序列号4所示的碱基序列的末端附加了BamHI位点的PCR引物，在BamHI消化后进行自身连接(selfligation)，由此在多克隆位点的XhoI位点的前方导入BamHI位点。进而，使用在序列号5和6显示碱基序列的PCR引物，进行PCR，在HindIII消化后进行自身连接，由此将在pT_NT载体中原本存在的紧邻T7终止子序列后方的BamHI位点变为HindIII位点。接着，利用PCR，从BamHI位点到T7启动子进行扩增，将此间合成如上所述的多角体蛋白5’-UTR的正义链和反义链并使其退火后的产物作为插入片断而使其连接，这样，构建改变(modified)型pT_NT载体。退火的插入序列制备方法如下所述进行。利用T4多核苷酸激酶(TOYOBO公司制)对已合成的正义链、反义链进行5’末端磷酸化。反应后，混合正义链和反义链，95℃、热处理5分钟。将其静置直至达到室温，进行退火。利用乙醇沉淀进行纯化后，使其溶解于水中。利用SigmaSpin后反应纯化柱(SigmaSpin Post Reaction Purification Column)(Sigma公司制)，除去过剩的ATP之后，再次用乙醇沉淀进行纯化。

接着，用BamHI-EcoRI消化该改变型pT_NT载体，同样用BamHI-EcoRI消化已在pBluescript载体的BamHI-EcoRI位点导入pro-TNFGLC cDNA的质粒，得到约0.7Kb的DNA片断(pro-TNF-GLC cDNA)，将该DNA片断作为插入片断与该改变型pT_NT载体连接，构建体外pro-TNF-GLC基因转录用质粒-I。

另外，还制作已在转录用质粒-I内的pro-TNF GLC的下游插入组氨酸标签的体外pro-TNF GLC基因转录用质粒-II。就转录用质粒-II而言，在用SmaI消化改变型pT_NT载体之后，将此间合成序列号7中记载的组氨酸标签的正义链、反义链并使其退火产生的产物作为插入片断，使其连接，由此构建改变型pT_NT载体(His-Tag)。用BamHI-EcoRI消化该载体，将转录用质粒-I作为模板，使用在序列号8和序列号9中记载的PCR引物并扩增，得到约0.7Kb的DNA片断，将其作为插入片断并进行连接，由此制作。

全部PCR条件是使用KOD-plus(TOYOBO公司制)，在96℃下使模板DNA变性2分钟，然后进行96℃15秒、50℃30秒、68℃5分钟的循环反应30次。

已构建的质粒的碱基序列是将DNA 250ng作为模板，使用大染料终止子循环测序FS快速反应试剂盒(Big Dye Terminator Cycle Sequence FSReady Reaction Kit)(ABI公司制)，进行PCR(96℃10秒、50℃5秒、60℃4分钟、25个循环反应)，用ABI PRISM310遗传分析器(GeneticAnalyzer)(ABI公司制)对反应液进行解析。

全部连接样品在使用Ligation High(TOYOBO公司制)进行连接之后，转化大肠杆菌DH5α(TOYOBO公司制)，利用碱-SDS法从转化后的大肠杆菌制备质粒，进行DNA碱基序列的解析。

(2)体外转录反应和mRNA的纯化

用HindIII消化已在上述(1)中制备的质粒之后，利用苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀进行纯化。将得到的1μg DNA作为模板，使用RiboMax大规模RNA生产系统-T7(Promega公司制)，以20μL体系(scale)，37℃、4小时合成mRNA。反应后，添加1U的RQ1无RNA酶DNA酶(RNase Free DNase)(Promega公司制)，在37℃下孵育15分钟，消化模板DNA。在利用苯酚-氯仿抽提除去蛋白质之后，进行乙醇沉淀。将得到的沉淀溶解于100μl灭菌水中，用NICK柱(Amersham公司制)进行纯化，然后再次进行乙醇沉淀，用灭菌水溶解使其最终为A260/A280＝1.8～2.0、RNA浓度为2mg/mL。直接将这样制备的mRNA用于无细胞系蛋白质合成。从转录用质粒-I转录得到的产物称为mRNA-I、从转录用质粒-II转录得到的产物称为mRNA-II。

(3)来自昆虫培养细胞High Five、Sf21的微粒体膜制备方法

(3-1)昆虫培养细胞High Five以及Sf21的培养

细胞数2.1×10⁷个的昆虫培养细胞High Five(Invitrogen公司制)，在已放入添加了L-谷氨酰胺的Express Five(Invitrogen公司制)无血清培养基的培养瓶(600cm²)内，27℃培养6天。结果变为细胞数1.0×10⁸个、湿重1.2g。

用Sf-900IISFM(Invitrogen公司制)无血清培养基，在27℃下培养昆虫培养细胞Sf21(Invitrogen公司制)。在125ml三角烧瓶内的培养基50ml中，在27℃、130rpm下，悬浮培养每1ml培养基细胞数为6.0×10⁵个的Sf21，培养5天，结果变为细胞数1.0×10⁸个、湿重3g。

(3-2)微粒体膜制备方法

来自昆虫培养细胞High Five和Sf21的微粒体膜的制备，基本上以Walter，P和Blobel，G(1983)，酶学(Enzymol.)96，pp.84-93等的方法为基础，通过利用蔗糖密度梯度的超速离心分离来制备。即，收集在上述(3-1)中培养的昆虫培养细胞，用下述提取用液清洗1次(700×g、4℃、10分钟的离心条件)，然后将每1g培养细胞悬浮于4ml的提取用液中。

[High Five提取用液的组成]

30mM HEPES-KOH(pH7.9)、100mM KOAc、2mM Mg(OAc)₂、0.25mMEGTA、250mM蔗糖、2mM DTT、0.5mM PMSF

[Sf21提取用液的组成]

40mM HEPES-KOH(pH7.9)、100mM KOAc、1.5mM Mg(OAc)₂、0.1mMEGTA、250mM蔗糖、2mM DTT、0.5mM PMSF

悬浮后，通过将紧密安装的杜恩斯匀浆器(Dounce homogenizer)来回20次，破碎细胞。破碎后，100×g、4℃、10分钟离心分离，除去细胞残渣，回收上清。通过利用蔗糖的密度梯度的超速离心分离，从该上清中分离出微粒体膜组分。超速离心分离时，以1∶3的体积比(v/v)，从容器下方开始，按照顺序，装含有1.3M的蔗糖的提取用液和前面回收的上清。140000×g、4℃、2.5小时超速离心分离(使用HITACHI公司制超速离心分离机CP80MX和摇摆转子(swing roter)P40ST)该样品。超速离心分离后，弃去全部上清，每1g开始时的细胞湿重，用100μl的提取用液静置悬浮沉淀，将其作为微粒体膜。该微粒体膜的A260/A280为1.4～1.5，A260约为150。

(4)无细胞系蛋白质合成

(4-1)利用含有节肢动物来源的提取物的无细胞系蛋白质合成用提取液的无细胞系蛋白质合成

使用在上述(2)中制备的pro-TNF GLC的mRNA-I和在上述(3)中制备的微粒体膜，进行用含有节肢动物来源的提取物的无细胞系蛋白质合成用提取液的无细胞系蛋白质合成。

(蚕提取液的制备)

使用剪刀、镊子、手术刀、刮勺，从15只5龄期第4天的蚕幼虫摘取后部丝腺3.07g，将其在-80℃下冻结后，用研钵磨碎，使用下述组成的提取用液，进行抽提。

[提取用液的组成]

·20mM       HEPES-KOH(pH7.4)

·100mM      醋酸钾

·2mM        醋酸镁

·2mM        DTT

·0.5mM      PMSF

提取后，用离心分离机(himacCR20B3(日立工机公司制))，在30，000×g、30分钟、4℃的条件下，对得到的液状物进行离心分离。

离心分离后，只分离上清，再次在30,000×g、10分钟、4℃的条件下进行离心分离。离心分离后，只分离上清。加入含有20％甘油的提取用液，平衡化脱盐柱PD-10(Amersham Bioscience公司制)之后，将上清供给到其中，通过用上述提取用液洗脱，进行凝胶过滤。

使用分光光度计(Ultrospec3300pro、Amersham Bioscience公司制)，从凝胶过滤后的滤液的组分分取出在280nm下的吸光度为10以上的组分，得到5龄期的蚕幼虫的后部丝腺来源的无细胞系蛋白质合成用提取液。

对于得到的提取液，使用BCA蛋白质检测试剂盒(PIERCE公司制)，测定蛋白质浓度。首先，相对反应试剂2mL加入样品0.1mL，在37℃下反应30分钟，使用分光光度计(Ultrospec330pro、Amersham Bioscience公司制)，测定562nm下的吸光度。作为对照，使用BSA，制作校准线。

提取液中的蚕幼虫的后部丝腺的含量以蛋白质浓度计为17.5mg/mL。

(昆虫培养细胞提取液的制备)

(1)High Five来源提取液

细胞数为2.1×10⁷个的昆虫培养细胞High Five(Invitrogen公司制)，在已放入添加了L-谷氨酰胺的Express Five无血清培养基(Invitrogen公司制)的培养瓶(600cm²)内，27℃培养6天。结果变为细胞数1.0×10⁸个、湿重1.21g。

接着，收集上述培养的昆虫培养细胞，用下述组成的清洗液清洗3次(在700×g、4℃、10分钟条件下离心分离)。

[清洗液的组成]

·60mM       HEPES-KOH(pH7.9)

·200mM      醋酸钾

·4mM        醋酸镁

·4mM        DTT

向清洗后的昆虫培养细胞中加1mL下述组成的提取用液，悬浮。

[提取用液的组成]

·40mM       HEPES-KOH(pH7.9)

·100mM      醋酸钾

·2mM        醋酸镁

·2mM        氯化钙

·20(v/v)％  甘油

·1mM        DTT

·1mM        PMSF

在液氮中急剧冻结该悬浮液。充分冻结后，在约4℃的冰水浴中解冻。完全解冻后，在30,000×g、4℃下离心分离10分钟(himacCR20B3、日立工机公司制)，回收上清。将已回收的上清1.5mL上样(apply)到用下述组成的凝胶过滤用缓冲液平衡化之后的PD-10脱盐柱(AmershamBioscience公司制)。

[凝胶过滤用缓冲液的组成]

·40mM   HEPES-KOH(pH7.9)

·100mM  醋酸钾

·2mM    醋酸镁

·1mM    DTT

·1mM    PMSF

上样之后，用凝胶过滤用缓冲液4mL洗脱，使用分光光度计(Ultrospec3300pro、Amersham Bioscience公司制)，回收在280nm处的吸光度为30以上的组分，作为昆虫培养细胞提取液。

(2)Sf21来源提取液

在Sf900-II无血清培养基(Invitrogen公司制)中，27℃下培养昆虫细胞Sf21(Invitrogen公司制)。在125ml三角烧瓶内的培养基50mL中，在27℃、130rpm下悬浮培养每1ml培养基细胞数为6.0×10⁵个的Sf21，培养5天，结果变为每1ml培养基的细胞数为1.0×10⁸个，湿重3g。

接着，收集上述培养的昆虫细胞，用下述组成的清洗液清洗3次(在700×g、4℃、10分钟条件下离心分离)，然后，将其悬浮于3mL的下述组成的提取用液中。

[清洗液的组成]

·40mM      HEPES-KOH(pH7.9)

·100mM  醋酸钾

·2mM    醋酸镁

·2mM    氯化钙

·1mM    DTT

[提取用液的组成]

·40mM     HEPES-KOH(pH7.9)

·100mM    醋酸钾

·2mM      醋酸镁

·2mM      氯化钙

·20(v/v)％甘油

·1mM      DTT

·0.5mM    PMSF

在液氮中急剧冻结该细胞悬浮液。充分冻结后，在约4℃的冰水浴中解冻。完全解冻后，在30,000×g、4℃下离心分离10分钟(himacCR20B3、日立工机公司制)，回收上清1A。将回收后的上清1A进一步在45,000×g、4℃下离心分离(himacCR20B3、日立工机公司制)30分钟，回收上清1B。将2.5mL已回收的上清1B上样到用下述组成的凝胶过滤用缓冲液平衡化之后的PD-10脱盐柱(Amersham Bioscience公司制)中。

[凝胶过滤用缓冲液的组成]

·40mM   HEPES-KOH(pH7.9)

·100mM  醋酸钾

·2mM    醋酸镁

·1mM    DTT

·0.5mM  PMSF

上样之后，用凝胶过滤用缓冲液3mL洗脱，使用分光光度计(Ultrospec3300pro、Amersham Bioscience公司制)，回收在280nm处吸光度为30以上的组分，将其作为昆虫细胞提取液。

对蚕后部丝腺来源提取液、昆虫培养细胞(High Five、Sf21)来源提取液这3种，进行无细胞系蛋白质合成。另外，此时，在各反应开始时刻，以各种浓度添加在上述(3)中制备的节肢动物来源的微粒体膜，通过使其共反应，进行蛋白质的糖基化。另外，在参考例中，使用狗胰腺微粒体膜(Promega公司制)，代替节肢动物来源的微粒体膜。

下面记载了使用各种提取液的情况下的反应组成，各成分的浓度只要没有事先说明，均用反应液中的最终浓度表示。

使用蚕后部丝腺来源提取液的合成

·昆虫来源微粒体膜(反应液1μl中A260＝0～50)

·50(v/v)％            节肢动物来源(蚕后部丝腺来源)提取液

·160μg/mL            mRNA

·30mM                 HEPES-KOH(pH7.4)

·100mM                醋酸钾

·1.5mM                醋酸镁

·0.5mM                DTT

·10(v/v)％            甘油

·0.75mM               ATP

·0.5mM                GTP

·0.25mM               EGTA

·25mM                 磷酸肌酸

·200μg/mL            肌酸激酶

·100μM               氨基酸(20种)

·2U/μL               RNA酶抑制剂

·100μg/mL            tRNA

分别使用ATP(Sigma公司制)、GTP(Sigma公司制)、氨基酸(20种)(Sigma公司制)、RNA酶抑制剂(宝酒造公司制)、tRNA(RocheDiagnostics公司制)。

作为反应装置，使用低温铝封闭(aluminum block)恒温槽MG-1000(东京理化器械公司制)。翻译反应在反应温度25℃下进行6小时，反应液量为25μL。

使用昆虫培养细胞来源提取液的合成

(1)使用High Five来源提取液的情况

·昆虫来源微粒体膜(反应液1μl中A260＝0～50)

·50(v/v)％       节肢动物来源(High Five来源)提取液

·320μg/mL        mRNA

·40mM             HEPES-KOH(pH7.9)

·100mM            醋酸钾

·2mM              醋酸镁

·2mM              DTT

·10(v/v)％        甘油

·0.5mM            ATP

·0.25mM           GTP

·20mM             磷酸肌酸

·200μg/mL        肌酸激酶

·80μM            氨基酸(20种)

·0.25mM           EGTA

·1U/μL           RNA酶抑制剂

·200μg/mL        tRNA

分别使用ATP(Sigma公司制)、GTP(Sigma公司制)、氨基酸(20种)(Sigma公司制)、RNA酶抑制剂(宝酒造公司制)、tRNA(RocheDiagnostics公司制)。

作为反应装置，使用低温铝封闭(aluminum block)恒温槽MG-1000(东京理化器械公司制)。翻译反应在反应温度25℃下进行8小时，反应液量为25μL。

(2)使用Sf21来源提取液的情况

·昆虫来源微粒体膜(反应液1μL中A260＝0～50)

·50(v/v)％             节肢动物来源(Sf21来源)提取液

·40mM                  HEPES-KOH(pH7.9)

·100mM                 醋酸钾

·1.5mM                 醋酸镁

·2mM                   DTT

·10(v/v)％             甘油

·0.25mM                ATP

·0.1mM                  GTP

·20mM                   磷酸肌酸

·200μg/mL              肌酸激酶

·80μM                  氨基酸(20种)

·0.1mM                  EGTA

·1U/μL                 RNA酶抑制剂

·200μg/mL              tRNA

·320μg/mL              外来mRNA(pro-TNF-GLC基因)

分别使用ATP(Sigma公司制)、GTP(Sigma公司制)、氨基酸(20种)(Sigma公司制)、RNA酶抑制剂(宝酒造公司制)、tRNA(RocheDiagnostics公司制)。作为反应装置，使用低温铝封闭(aluminum block)恒温槽MG-1000。在反应液量为25μL、反应温度为25℃、反应时间为6小时的条件下进行。

(4-2)利用含有哺乳动物来源的提取物的无细胞系蛋白质合成用提取液的无细胞系蛋白质合成

使用在上述(2)中制备的pro-TNF GLC的mRNA-II和在上述(3)中制备的微粒体膜，进行利用兔网织红细胞提取液(RRL；Promega公司制)的无细胞系蛋白质合成。另外，此时，在各反应开始时刻，以各种浓度添加在上述(3)中制备的微粒体膜，使其共反应，由此进行蛋白质的糖基化。

·翻译系反应液中A260＝0～50的微粒体膜

·50(v/v)％  兔网织红细胞提取液    17.5μl

·2mg/mL     mRNA                  2μl

·40U/μL    RNA酶抑制剂           1μl

·1mM        氨基酸(20种)          1μl

氨基酸(20种)使用的是Sigma公司制的产品，RNA酶抑制剂使用的是宝酒造公司制的产品。

作为反应装置，使用低温铝封闭(aluminum block)恒温槽MG-1000(东京理化器械公司制)。翻译反应在反应温度30℃下进行90分钟，反应液量为25μL。

(5)利用上述(4)的无细胞系蛋白质合成而合成的翻译反应产物的脱糖链

为了确认在上述(4)中合成的N-糖基化蛋白质(pro-TNF GLC)为已被糖链修饰的糖蛋白质，用N型糖链分解酶进行脱糖链化。作为N型糖链分解酶，使用糖肽酶F(TAKARA公司制)，将其添加到翻译反应结束后的反应液中，每10μl反应液中添加1μl，在25℃下反应2小时。

(6)N-糖基化蛋白质的检测

通过利用抗TNF抗体(R&D公司制)的Western Blot法和基于ECL-plus(Amersham公司制)的化学发光来检测N-糖基化蛋白质。即，在昆虫提取液中，在翻译反应和脱糖链反应结束后，加入等量×2样品缓冲液溶液(Sample Buffer Soln.)(Wako公司制)以用于SDS化，在95℃下进行3分钟热处理，提供给SDS-PAGE。在兔网织红细胞提取液中，作为SDS化的前处理，相对反应液10μl，添加2μl的PMSF(40mM)、200μl的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl PH7.5、150mM NaCl、1％Nonidet(诺乃洗涤剂)P-40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS)，使用搅拌子，在4℃下搅拌1小时。进而，用His-MicroSpin纯化组件(His-MicroSpin Purification Module)(Amersham Bioscience公司制)，简单地纯化，将其作为样品，加入等量的×2样品缓冲液溶液(Wako公司制)，在95℃下进行3分钟热处理，提供给SDS-PAGE。电泳后，将蛋白质转印到PVDF膜。用含有3％明胶的TTBS(20mM Tris、500mM NaCl、0.05％Tween-20、pH7.5)，在室温下，缓慢振荡转印后的膜，进行封闭处理。封闭后，用TTBS振荡10分钟，清洗膜。在含有1/2000量的抗TNF抗体和1％明胶的TTBS中，缓慢反应2小时～12小时。在TCBS(20mM citrate，500mM NaCl，0.05％Tween-20，pH5.5)中，对膜进行振荡清洗5分钟×2次。在每100mL含有1％明胶的TCBS中加入33μl的蛋白G-辣根过氧化物酶偶联(Protein G-Horseradish Peroxidase Conjugate)(Bio Rad公司制)后，在该液体中缓慢振荡膜2小时，使其发生反应。在TTBS中振荡清洗10分钟之后，使用ECL-plus，进行化学发光，用X线胶卷(film)曝光后显影。

(7)Western Blot的结果

通过上述方法检测的Western Blot结果显示于图2和图3。

在图2中，上段显示使用蚕后部丝腺来源提取液(BML)在微粒体膜存在下进行翻译的结果，中段显示使用昆虫培养细胞High Five提取液(HFL)、昆虫培养细胞Sf21细胞提取液(Sf21L)，在微粒体膜存在下进行翻译的结果。就添加的微粒体膜而言，从左开始分别添加狗胰腺微粒体膜(CMM，Promega公司制)、昆虫培养细胞High Five来源微粒体膜(HFMM)、昆虫培养细胞Sf21来源微粒体膜(Sf21MM)，与翻译同时进行反应而成。微粒体膜的添加量用A260的值表示。

从这些结果可以明确：在BML、FHL、Sf21L的所有提取液中，与添加狗胰腺微粒体膜时相比，在分别添加HFMM和Sf21MM的情况下产生的N-糖基化效率更高。另外，该漂移带(shift band)在糖肽酶F消化下显著减少，所以可以确认为N型糖链附加蛋白质。

以上表明：通过在昆虫来源提取液中添加昆虫来源微粒体膜，可以更高效率地进行蛋白质的糖链修饰。

同样地，图3表示使用兔网织红细胞提取液，在微粒体膜存在下进行翻译的结果。就添加的微粒体膜而言，从左开始分别为昆虫培养细胞HighFive来源微粒体膜(HFMM)、昆虫培养细胞Sf21来源微粒体膜(Sf21MM)。可以明确：在分别添加的情况下，高效率地产生N-糖基化。另外，该漂移带(shift band)在糖肽酶F消化下显著减少，所以可以确认为N型糖链附加蛋白质。

以上表明：即使在兔网织红细胞提取液中，通过添加昆虫来源微粒体膜，可以高效率地进行蛋白质的糖链修饰。

此外，在说明序列表中的人工序列(Artificial Sequence)的文本(freetext)项目<223>中，序列号1表示EoNPV(杆状病毒)多角体蛋白基因5’UTR的碱基序列；序列号2表示pro-TNF GLC cDNA的碱基序列；序列号3表示PCR引物；序列号4表示PCR引物；序列号5表示PCR引物；序列号6表示PCR引物；序列号7表示编码His-Tag(组氨酸标签)的DNA；序列号8表示PCR引物；序列号9表示PCR引物。

序列表

<110>株式会社岛津制作所、国立大学法人山口大学

<120>无细胞系蛋白质合成中通过添加微粒体膜的翻译后修饰方法

<130>G104090WO

<150>JP 2003-384387

<151>2003-11-13

<160>9

<210>1

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5’UTR(EoNPV多角体蛋白基因)

<400>1

agtattgtag tcctttcgta attgtttgtg aaatctaaaa tacaccgta 49

<210>2

<211>702

<212>DNA

<213>人

<220>

<223>pro-TNF GLC

<400>2

atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag    60

acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc    120

gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg    180

gaagagtccc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt cagatcatct    240

tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg    300

cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga    360

gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc    420

aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc    480

gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag    540

accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc  600

cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt  660

gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctgt ga

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>3

ttggatcctg caaaaagaac                20

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>4

gttcttggat ccctcgagaa t            21

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>5

cccaagctta aaaaacccct c            21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>6

aaaaagcttc ccctggcgta a              21

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码组氨酸标签(His-Tag)DNA(His-Tag coding DNA)

<400>7

ccaccaccac caccaccact ga             22

<210>8

<211>26

<212>KNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>8

cgggatccat gagcactgaa agcatg             26

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>9

cggaattcca gggcaatgat cccaaa             26

Claims (41)

1.一种在使用无细胞系蛋白质合成用提取液的无细胞系中的蛋白质合成方法，其中，

包括在节肢动物来源的微粒体膜的存在下进行翻译反应。

2.如权利要求1所述的方法，其中，

在mRNA浓度(μg/ml)与节肢动物来源的微粒体膜的浓度(A260)的比值为1∶0.1～5的条件下进行翻译反应。

3.如权利要求2所述的方法，其中，

该比值为1∶0.3～2.3。

4.如权利要求1所述的方法，其中，

节肢动物来源的微粒体膜为从昆虫组织提取出来的微粒体膜。

5.如权利要求4所述的方法，其中，

昆虫组织为蚕组织。

6.如权利要求5所述的方法，其中，

蚕组织为脂肪体。

7.如权利要求1所述的方法，其中，

节肢动物来源的微粒体膜为从昆虫培养细胞提取出来的微粒体膜。

8.如权利要求7所述的方法，其中，

昆虫培养细胞为粉丝夜蛾卵细胞来源或草地夜蛾卵巢细胞来源的培养细胞。

9.如权利要求1所述的方法，其中，

无细胞系蛋白质合成用提取液为含有节肢动物来源的提取物的提取液。

10.如权利要求9所述的方法，其中，

节肢动物来源的提取物为从昆虫组织提取的提取物。

11.如权利要求10所述的方法，其中，

昆虫组织为蚕组织。

12.如权利要求11所述的方法，其中，

蚕组织至少包括蚕幼虫的后部丝腺。

13.如权利要求9所述的方法，其中，

节肢动物来源的提取物为从昆虫培养细胞提取的提取物。

14.如权利要求13所述的方法，其中，

昆虫培养细胞为粉丝夜蛾卵细胞来源或草地夜蛾卵巢细胞来源的培养细胞。

15.如权利要求1所述的方法，其中，

无细胞系蛋白质合成用提取液为含有小麦胚芽来源的提取物的提取液。

16.如权利要求1所述的方法，其中，

无细胞系蛋白质合成用提取液为含有哺乳动物培养细胞来源的提取物的提取液。

17.如权利要求1所述的方法，其中，

无细胞系蛋白质合成用提取液为含有兔网织红细胞来源的提取物的提取液。

18.如权利要求1所述的方法，其中，

无细胞系蛋白质合成用提取液为含有大肠杆菌来源的提取物的提取液。

19.如权利要求1所述的方法，其中，

无细胞系蛋白质合成用提取液为含有酵母来源的提取物的提取液。

20.一种翻译后的蛋白质的修饰方法，其中，

在使用无细胞系蛋白质合成用提取液的无细胞系中的蛋白质合成中，包括在节肢动物来源的微粒体膜的存在下进行翻译反应。

21.如权利要求20所述的方法，其中，

在mRNA浓度(μg/ml)与节肢动物来源的微粒体膜的浓度(A260)的比值为1∶0.1～5的条件下进行翻译反应。

22.如权利要求21所述的方法，其中，

该比值为1∶0.3～2.3。

23.如权利要求20所述的方法，其中，

节肢动物来源的微粒体膜为从昆虫组织提取的微粒体膜。

24.如权利要求23所述的方法，其中，

昆虫组织为蚕组织。

25.如权利要求24所述的方法，其中，

蚕组织为脂肪体。

26.如权利要求20所述的方法，其中，

节肢动物来源的微粒体膜为从昆虫培养细胞提取出来的微粒体膜。

27.如权利要求26所述的方法，其中，

昆虫培养细胞为粉丝夜蛾卵细胞来源或草地夜蛾卵巢细胞来源的培养细胞。

28.如权利要求20所述的方法，其中，

无细胞系蛋白质合成用提取液为含有节肢动物来源的提取物的提取液。

29.如权利要求28所述的方法，其中，

节肢动物来源的提取物为从昆虫组织提取的提取物。

30.如权利要求29所述的方法，其中，

昆虫组织为蚕组织。

31.如权利要求30所述的方法，其中，

蚕组织至少包括蚕幼虫的后部丝腺。

32.如权利要求28所述的方法，其中，

节肢动物来源的提取物为从昆虫培养细胞提取的提取物。

33.如权利要求28所述的方法，其中，

昆虫培养细胞为粉丝夜蛾卵细胞来源或草地夜蛾卵巢细胞来源的培养细胞。

34.如权利要求20所述的方法，其中，

无细胞系蛋白质合成用提取液为含有小麦胚芽来源的提取物的提取液。

35.如权利要求20所述的方法，其中，

无细胞系蛋白质合成用提取液为含有哺乳动物培养细胞来源的提取物的提取液。

36.如权利要求20所述的方法，其中，

无细胞系蛋白质合成用提取液为含有兔网织红细胞来源的提取物的提取液。

37.如权利要求20所述的方法，其中，

无细胞系蛋白质合成用提取液为含有大肠杆菌来源的提取物的提取液。

38.如权利要求20所述的方法，其中，

无细胞系蛋白质合成用提取液为含有酵母来源的提取物的提取液。

39.如权利要求20所述的方法，其中，

翻译后的蛋白质的修饰为N-糖基化和/或信号序列的切除。

40.一种N-糖基化的蛋白质，其中，

是利用权利要求1所述的蛋白质合成方法得到的。

41.一种切除了信号序列的蛋白质，其中，

是利用权利要求1所述的蛋白质合成方法得到的。

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