CN1643149A - 高效表达两种不同类型肝细胞生长因子的杂合肝细胞生长因子基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及杂合肝细胞生长因子(HGF)基因，通过在HGF cDNA的外显子4和5之间插入一个固有的或外源的内含子来制备，所述基因具有SEQ ID NO：2的碱基序列。该基因具有高表达效率并且同时表达两种不同类型的HGF和dHGF(缺失突变的HGF)。另外该基因可以用于治疗或预防缺血性疾病或者肝脏疾病。

Description

高效表达两种不同类型肝细胞生长因子的杂合肝细胞生长因子基因

发明领域

本发明涉及高效的肝细胞生长因子(HGF)，其同时表达两种不同类型的HGF。

发明背景

本发明涉及通过在HGF cDNA的外显子4和5之间插入一个固有的或外源的内含子来制备杂合HGF基因，具有比HGF cDNA更高的表达效率并且同时表达两种不同类型的HGF和dHGF(缺失突变的HGF)。

HGF是一种称作分散因子的肝素结合糖蛋白。编码HGF的基因位于染色体721.1上，包含18个外显子和17个内含子，具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列(Seki T等，基因 102：213-219，1991)。从HGF基因中转录得到一个约6kb的转录本，然后由此合成由728个氨基酸组成的HGF前体多肽。同时，由HGF基因的另一种剪接还合成由723个氨基酸组成的dHGF前体多肽。无生物活性的前体被血清中的蛋白酶转化成活性形式的二硫键连接的异二聚体。在异二聚体中，高分子量的α链形成四个三环域结构域和类似激活前(preactivated)的血纤维蛋白溶酶原的肽区域的N末端发卡环。三个二硫键环结构的三环结构域由约80个氨基酸组成，在蛋白-蛋白相互作用中起重要作用。低分子量的β链形成无活性的丝氨酸蛋白酶样结构域。由723个氨基酸组成的dHGF是在α链的第一个三环域结构域中缺失5个氨基酸的多肽，即F、L、P、S和S。

最近报道，HGF和dHGF都具有一些生物学功能，如促进上皮细胞、黑素细胞和内皮细胞的生长和形态发生。但是，它们在免疫学和生物学特征方面是不同的。

例如，在促进人脐带内皮细胞、动脉平滑肌细胞和NSF-60(鼠成髓细胞)的DNA合成方面，HGF的活性比dHGF分别高20倍、10倍和2倍。在促进LLC-PKI(猪肾脏上皮细胞)和OK(负鼠肾脏上皮细胞)和小鼠间质细胞的DNA合成方面，dHGF的活性比HGF分别高3倍和2倍。HGF在PBS的溶解性比dHGF高70倍。一些抗dHGF的单克隆抗体仅识别dHGF，而不识别HGF或还原形式的dHGF，这暗示HGF和dHGF的结构是不同的。因此，体内同时合成HGF和dHGF表明它们在生物学上相互影响(Shima，N.等，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochemical and Biophysical Research Communications) 200：808-815，1994)。

由来自中胚层的细胞分泌的HGF具有多种生物学功能，如1)诱导上皮细胞形成管状结构；2)在体内外刺激内皮细胞形成血管；3)由于其抗凋亡的活性，再生肝脏和肾脏；4)形成肾脏、卵巢和睾丸；5)控制骨生成；6)刺激造血前身红细胞的生长和分化；和7)神经细胞萌发轴突(Stella，M.C.和Comoglio，P.M.，国际生物化学和细胞生物学杂志(The International Journal of Biochemistry & CellBiology) 31：1357-1362，1999))。基于这些不同的功能，HGF或编码HGF的基因可以被开发成用于治疗缺血性的或肝脏的疾病的治疗剂。实际上，体内HGF可能以HGF或dHGF形式存在，因此，共表达HGF和dHGF对于最大化治疗效果来说是重要的。因此，本发明目的在于开发杂合HGF基因，能够同时表达具有高度基因治疗效果的HGF和dHGF。

发明概述

因此，本发明的第一个目的在于提供同时表达两种不同类型的HGF的杂合HGF基因。

按照本发明的一个方面，提供在HGF cDNA的外显子4和5之间插入一个固有的或外源的内含子的杂合HGF。

本发明的另一个目的在于提供包含杂合HGF基因的重组载体和用上述载体转化的微生物。

本发明还有一个目的在于提供一种用于治疗或预防缺血性的或肝脏的疾病的药物组合物，其包含HGF基因。

附图描述

当结合附随的附图，根据对发明的描述，本发明的上述和其他的目的及特征将是显而易见的，这些附图分别表示：

附图1：说明基因片段的位置的HGF-X原型的示意图，

附图2：从HepG2基因组DNA中克隆基因片段的过程，

附图3：从人胎盘cDNA中克隆基因片段的过程，

附图4A和4B：制备表达载体pCK-HGF-X的过程，

附图5：制备表达载体pCK-cHGF和pCK-dHGF的过程，

附图6：制备表达载体pCP-HGF-X家族的过程，

附图7：制备表达载体pCP-cHGF和pCP-dHGF的过程，

附图8：pCP-cHGF、pCP-dHGF和pCP-HGF-X的基因表达水平，

附图9：通过在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳观察pCP-cHGF、pCP-dHGF和pCP-HGF-X的基因表达模式，

附图10：体内pCP-cHGF、pCP-dHGF和pCP-HGF-X7的基因表达水平，

附图11：分别被施用pCP和pCP-HGF-X7的两组兔子的大脑血管发生。

发明详述

本发明的杂合肝细胞生长因子(HGF)基因包含对应于外显子1-18和在其外显子4和5之间插入固有的或外源的内含子cDNA的cDNA。该内含子包含固有的内含子片段或者重组序列。

本发明的包含固有内含子的杂合HGF基因的一个实施方案长7112bp，具有SEQ ID NO：2的序列。杂合HGF基因同时表达HGF和dHGF，具有比HGF cDNA更高的表达效率。密码子简并性使得本发明的杂合HGF基因的编码区和/或非编码区能够被修饰或改变，而不改变蛋白质的氨基酸序列和基因的表达。

因此，与SEQ ID NO：2的杂合HGF基因实质上相同的多核苷酸及其片段落入本发明的保护范围内。“实质上相同”是指序列同源性不低于80％，优选不低于90％，和更加优选的不低于95％。

杂合HGF基因可能包含可选择地具有被插入到HGF cDNA的外显子4和5之间的小重组序列的固有内含子片段。在此，这种包含固有内含子片段的杂合HGF基因命名为“HGF-X”。分别具有SEQ ID No：19-21的HGFX-6、HGF-X7和HGF-X8是优选的。

按照已知的遗传工程方法，本发明的杂合HGF基因被合成和插入到表达载体中。然后该载体被导入到合适的宿主细胞如大肠杆菌和酵母中。例如，大肠杆菌ToplOF用本发明的HGF-X7基因转染。然后得到的大肠杆菌ToplOF’pCK-HGFX7和大肠杆菌ToplOF’pCP-HGFX7在2002年3月12日被保藏，保藏号分别为KCCM-10361和KCCM-10362。

采用被转化的细胞，高水平地制备本发明的基因及其编码的蛋白质。

根据宿主细胞，本发明的载体可选择性地包含调控基因表达的序列如启动子或终止子、自我复制序列和分泌信号。

此外，本发明包含用于治疗或预防缺血性和肝脏疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的杂合HGF基因或包含该基因的载体。优选地，该组合物被配制成用于注射。

本发明的组合物还包含药学上可接受的载体。制药领域中的任何常规操作被用于制备口服制剂如片剂、胶囊、药丸、颗粒、悬浮液和溶液；注射剂型如溶液、悬浮液、或注射前与蒸馏水混合的干粉；局部应用制剂如药膏、面霜和洗液；以及其他制剂。

通常用于制药领域的载体可以被应用于本发明的组合物中。例如，口服施用的制剂包括黏合剂、乳化剂、分解剂、赋形剂、溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂和香味剂。注射制剂包括防腐剂、拮抗剂(unagonizing agents)、溶解剂或稳定剂。制备局部施用的制剂包括碱、赋形剂、滑润剂或防腐剂。任何本领域知晓的适宜制剂(雷名顿药物科学(最新版)，Mack出版公司，Eaton PA))可被用于本发明。

本发明的组合物可以作为多种口服和胃肠外制剂在临床中应用。适宜的制剂可以采用这种赋形剂如添加剂、加强剂、黏合剂、润湿剂、分解剂和表面活性剂或稀释剂来制备。用于口服施用的固体制剂包括药丸、片剂、隔离剂、颗粒和胶囊。这些固体制剂可以通过将一种或多种赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和凝胶与二苯基丁基化的(dibenzylbuthyllacton)木脂体衍生物混合来制备。另外，本发明的制剂中包括滑润剂如硬脂酸镁和滑石粉。用于口服施用的液体制剂包括悬浮液、溶液、乳剂和糖浆。除了常规的简单稀释剂如水和液体石蜡外，这些制剂可以含有润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。胃肠外施用的制剂包括灭菌的水溶液、悬浮液、乳剂、可选择的冻干处理和栓剂。不溶液水的赋形剂和悬浮剂包括植物油如丙二醇、聚乙二醇和橄榄油和可注射的酯如乙基油酸盐。Witepsole^、Macrogol^、Tween^61、可可油、甘油月桂酸酯和甘油明胶可以用作栓剂的基础。

本发明的组合物可以口服施用或者通过胃肠外途径如静脉内、肌肉内、皮下、腹腔内、动脉内注射或灌注施用或者局部地通过直肠、鼻内、呼吸或眼内施用。

应当理解，本发明的组合物的常规日剂量应该根据不同的相关因素包括治疗的疾病、选择的施用路径、年龄、性别和各个患者的体重、患者症状的严重程度来确定，可以一次施用或者分开施用。因此，日剂量无论如何不应当被解释为对本发明的保护范围的限制。

下面的实施例被给出仅仅用于说明的目的，而不是用于限定本发明的保护范围。

实施例1：制备编码人HGF的杂合基因构建体

(1)得自基因组DNA的HGF基因片段的克隆

将人HepG2细胞(ATCC保藏号：HB-8065)悬浮在TES缓冲液中(10mM Tris-HCl；1mM EDTA；0.7％SDS)，并在50℃下用400μg/ml的蛋白酶K处理1h。接着按照本领域常规方法，通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀，从细胞悬浮液中提取基因组DNA。

在PCR扩增中，被提取的基因组DNA用作模板DNA。作为引物对，采用合成的SEQ ID NO：3和4的核苷酸来获得DNA片段，其分别含有：HGF基因片段2(HGF-F2)，SEQ ID NO：3和5；HGF-F3，SEQ ID NO：6和7；HGF-F5，SEQ ID NO：8和7；HGF-F7，SEQ ID NO：9和7；HGF-F8，SEQ IDNO：10和7；HGF-F6，(附图1)。通过将1μl模板DNA、1μl各种引物(10pmol/1μl)、10μl dNTP(10mM)、3.5单位扩增高保真酶(GibcoBRL，美国)和10μl酶缓冲液混合，并用蒸馏水将最终体积调节到100μl来制备PCR扩增混合物。进行30个循环的PCR扩增，每个循环由94℃下1min、55℃下1min和72℃下30sec组成。在此所用的引物和由此得到的被扩增的基因片段示于表1中。

表1

5’端引物	3’端引物	扩增的片段
			gHGF3(SEQ ID NO：3)	gHGF4(SEQ ID NO：4)	HGF基因片段2(HGF-F2)
gHGF3(SEQ ID NO：3)	gHGF10(SEQ ID NO：5)	HGF基因片段3(HGF-F3)
			gHGF5(SEQ ID NO：6)	gHGF7(SEQ ID NO：7)	HGF基因片段5(HGF-F5)
gHGF12(SEQ ID NO：8)	gHGF7(SEQ ID NO：7)	HGF基因片段7(HGF-F7)
			gHGF13(SEQ ID NO：9)	gHGF7(SEQ ID NO：7)	HGF基因片段8(HGF-F8)
gHGF6(SEQ ID NO：10)	GHGF7(SEQ ID NO：7)	HGF基因片段6(HGF-F6)

被扩增的HGF-F2包含范围在SEQ ID NO：2的人HGF cDNA原型(HGF-X1；由外显子1到4-内含子4-外显子5到18构成)的从392到2247的序列；HGF-F3是范围在从392到727的序列；HGF-5是范围在从2229到5471的序列；HGF-F6是范围从5117到5471的序列；HGF-F7是范围从3167到5471的序列；和HGF-F8是范围从4167到5471的序列。

每个被扩增的HGF基因片段被插入到pGEM-T easy载体(Promega，威斯康星州，美国)的多个克隆位点上来分别得到pGEM-Teasy-HGF-F2、pGEM-T easy-HGF-F3、pGEM-T easy-HGF-F5、pGEM-T easy-HGF-F6、pGEM-T easy-HGF-F7和pGEM-Teasy-HGF-F8(附图2)。通过序列分析来确认被扩增的HGF基因片段的核苷酸序列。

(2)得自cDNA的HGF基因片段的克隆

在PCR扩增中，在与实施例1所描述的相同条件下，人胎盘cDNA(Clontech，CA，美国)被用作模板DNA。作为引物对，合成的SEQ IDNO：11和12，和SEQ ID NO：13和14的寡核苷酸分别用来获得包含在HGF-F1和HGF-F4中的DNA片段。此外，HGF基因(cHGF)和缺失的HGF基因(dHGF)的cDNAs含有的DNA片段分别用合成的SEQ ID NO：15和16的寡核苷酸作为引物对进行扩增。dHGF基因是缺失5个碱基序列的HGF基因。

在此所用的引物和由此得到扩增基因片段示于表2中。

表2

5’端引物	3’端引物	扩增产物
			gHGF1(SEQ ID NO：11)	gHGF2(SEQ ID NO：12)	HGF基因片段1(HGF-F1)
gHGF8(SEQ ID NO：13)	gHGF9(SEQ ID NO：14)	HGF基因片段4(HGF-F4)
			cHGF5(SEQ ID NO：15)	cHGF3(SEQ ID NO：16)	HGF基因cDNA(cHGF)dHGF基因cDNA(dHGF)

被扩增的HGF-F1和HGF-F4分别包含SEQ ID NO：2的人HGFcDNA原型范围在从1到402和从6533到7113的核苷酸序列。HGF基因cDNA包含SEQ ID NO：1的人HGF基因的范围在从1-2184的核苷酸序列，而dHGF基因cDNA除了缺失范围在从483到495的序列外，具有与HGF基因cDNA相同的序列。

每个HGF基因的扩增片段被插入到pGEM-T easy载体(Promega，威斯康星州，美国)的多个克隆位点上来分别得到pGEM-T easy-HGF-F1、pGEM-T easy-HGF-F4、pGEM-T easy-cHGF和pGEM-T easy-dHGF(附图3)。通过序列分析来确认人HGF基因片段、HGF基因cDNA和dHGF基因cDNA的核苷酸序列。

(3)制备杂合HGF基因构建体

通过如下将步骤(1)和(2)中克隆的HGF基因片段组合来制备基因组DNA和cDNA的杂合HGF基因构建体(附图4A和4B)。

质粒pGEM-T-easy-HGF-F1用HindIII/BamHI处理来获得HGF-F1。质粒pCK( 见PCT国际公开号：WO/0040737)用HindIII/BamHI处理，并将HGF-F1插入其中来获得pCK-F1。然后，质粒pGEM-T-easy-HGF-F2和pGEM-T-easy-HGF-F3用MluI/BamHI处理，分别得到HGF-F2和HGF-F3。用MluI/BamHI处理pCK-1，其中插入HGF-F2和HGF-F3，分别得到pCK-F12M和pCKF13M。载体pCK-F12M和pCKF13M的MluI限制位点用HgaI限制区域通过区域—介导的突变试剂盒(Stratagene，CA，USA)取代以分别获得pCK-F12M和pCKF13M。

另外，用BamHI/XbaI处理质粒pGEM-T-easy-HGF-F4，得到HGF-F4。pCK-F12和pCKF13用BamHI/XbaI处理，其中插入HGF-F4，分别得到pCK-F124和pCK-F134。然后，用BamHI/XboI处理质粒pGEM-T-easy-HGF-F5、pGEM-T-easy-HGF-F6、pGEM-T-easy-HGF-F7和pGEM-T-easy-HGF-F8，分别得到HGF-F5、HGF-F6、HGF-F7和HGF-F8。用BamHI/XboI处理pCK-F124和pCK-F134，然后其中插入HGF-F5、HGF-F6、HGF-F7和HGF-F8，分别得到pCK-F1254、pCK-F1264、pCK-F1274、pCK-F1284、pCK-F1354、pCK-F1364、pCK-F1374和pCK-F1384。

然后，用XhoI处理pGEM-T easy-cHGF，得到约1100bp的HGF基因的cDNA片段(HGF-XhoI)。然后，将HGF-XhoI插入到pCK-F1254、pCK-F1264、pCK-F1274、pCK-F1284、pCK-F1354、pCK-F1364、pCK-F1374和pCK-F1384中，分别得到pCK-HGF-X1、pCK-HGF-X2、pCK-HGF-X3、pCK-HGF-X4、pCK-HGF-X5、pCK-HGF-X6、pCK-HGF-X7和pCK-HGF-X8。另一方面，pGEM-T easy-cHGF和pGEM-T easy-dHGF用BamHI处理来获得HGF基因cDNA和dHGF基因cDNA。然后，HGF基因cDNA和dHGF基因cDNA被插入到pCK的BamHI限制性位点上，分别得到pCK-cHGF和pCK-dHGF(附图5)。

(4)制备含有杂合HGF基因构建体的表达载体

质粒pCDNA3.1(Invitrogen，美国)用NdeI消化，Klenow片段处理来构建平端，然后用NheI消化来获得含有人细胞巨化病毒的启动子的DNA片段。

质粒pCK-HGF-X1、pCK-HGF-X2、pCK-HGF-X3、pCK-HGF-X4、pCK-HGF-X5、pCK-HGF-X6、pCK-HGF-X7和pCK-HGF-X8用SnaBI消化，用Klenow片段处理来生成平端和用NheI消化，然后上述含有人巨化病毒的启动子的DNA片段被插入到其中，分别得到pCP-HGF-X1、pCP-HGF-X2、pCP-HGF-X3、pCP-HGF-X4、pCP-HGF-X5、pCP-HGF-X6、pCP-HGF-X7和pCP-HGF-X8(附图6)。

质粒pCDNA3.1(Invitrogen，美国)用NheI消化，用Klenow片段处理来产生平端，并用NheI消化来获得含有人细胞巨化病毒的启动子的DNA片段。用MluI消化pCK-cHGF和pCK-dHGF，用Klenow片段处理来生成平端和用NheI消化，然后上述含有人巨化病毒的启动子的DNA片段被插入到其中，分别得到pCP-cHGF和pCP-dHGF(附图7)。

实施例2：检测杂合HGF基因构建体的表达效率和HGF/dHGF的共表达

进行试验来检测是否在实施例1中得到的杂合HGF基因构建体(HGF-X1到HGF-X8)是否能够同时表达HGF和dHGF，和杂合HGF基因构建体和HGF cDNA之间是否存在任何基因表达水平差异。

(1)基因表达效率

首先，按照生产商的介绍，用FuGENE6(Gibco BRL，马里兰，美国)将5μg的pCP-HGF-X2、pCP-HGF-X3、pCP-HGF-X6、pCP-HGF-X7和pCP-HGF-X8以及0.5μg DONAI-LacZ(TAKARA SHUZO，日本)DNA转染到5×10⁶个293细胞中(ATCC CRL 1573)。此时，5μg各种pCP-cHGF和pCP-dHGF用作对照，而DONAI-LacZ DNA用于校准感染效率。转染后3小时，细胞加入鲜新的培养液，继续培养48h。由此得到的培养液被分成两份。一部分293细胞培养液进行RNA提取，另一部分用于测定LacZ活性。采用活性测定试剂盒(Stratagene，CA，美国)，按照生产商的介绍测定LacZ活性。

为了比较基因表达水平，细胞培养物中HGF的含量通过酶联免疫吸收分析试剂盒(ELISA，R&D System，MN，美国)测定。在通过测定LacZ活性校准感染效率后，发现HGF-X基因的表达水平比HGF cDNA和dHGF cDNA的表达水平高20-150倍(附图8)。特别地，HGF-X7具有最高的基因表达水平。

(2)HGF和dHGF共表达

为了检测由杂合HGF基因构建体共表达HGF和dHGF，用Trizol方法(Trizol：Gibco BRL，美国)从被转染的293细胞中提取细胞总RNAs，进行RT-PCR来获得cDNA。然后将cDNA用作模板DNA，以合成的SEQ ID NO：17和18作为引物对进行PCR扩增。将1μl模板DNA、1μl各种引物(10pmol/μl)、10μl dNTP(10mM)、3.5单位Taq聚合酶(TAKARA SHUZO，日本)和10μl酶缓冲液混合，并用蒸馏水调节到100μl的最终体积来制备PCR扩增混合物。进行30个PCR扩增循环，每个循环由94℃下1min、55℃下1min和72℃下90sec构成。

被扩增的PCR产物对应于HGF基因的外显子4和5之间的边界区域；分别是142bp的HGF基因cDNA和127bp的dHGF基因cDNA。不进行剪接，长度至少1kb的PCR产物被扩增；如果发生可选择的剪接，142bp的HGF基因cDNA和127bp的dHGF基因cDNA同时被合成和扩增。在12％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳来区分扩增的PCR产物。

如附图9中所示，分别在加载了HGF基因cDNA和dHGF基因cDNA的泳道中检测到142bp和127bp的条带，在加载HGF-X的泳道中检测到142bp和127bp的条带。上述结果表明本发明的杂合HGF-X基因构建体同时表达HGF和dHGF。

实施例3：比较HGF-X7、HGF基因cDNA和dHGF基因cDNA的表达水平(体内)

用胰岛素注射器将100μl各种pCP-HGF-X7、pCP-cHGF和pCP-dHGF注射到小鼠后肢的胫骨前肌中。5天后，处死小鼠并取出注射部位周围的肌肉，在蛋白提取缓冲液(25mM Tris-HCl(pH7.4)、50mM NaCl、0.5％脱氧胆酸钠、2％NP-40、0.2％SDS)中捣碎来分离总蛋白。按照生产商的介绍，用DC蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories，CA，美国)来测定总蛋白质的含量，用ELISA试剂盒(R&D System)测定被表达的HGF的含量。

从附图10所示的结果可以看出，从HGF-X7表达的HGF的含量比从HGF基因cDNA或dHGF基因cDNA表达的含量高250倍。

结合实施例2的试验结果(体内)，这些结果说明HGF-X基因的表达效率比HGF基因cDNA或dHGF基因cDNA高得多。

实施例4：在兔缺血性后肢模型中采用HGF-X7的基因治疗

为了检测HGF-X7基因在治疗缺血性后肢疾病中是否有效，如下在兔缺血性后肢模型中进行基因治疗。

兔缺血性后肢模型是缺血性肢体疾病的标准动物模型，通过Takeshita等，临床研究杂志(Journal of Clinical Investigation)，93：662(1994)描述的方法进行制备。手术前一天(第0天)，30只新西兰大白兔(雄性，重3.8-4.2kg)肌肉内注射5mg/kg甲苯噻嗪，然后肌肉内注射50mg/kg克他命来麻醉。接着，切开兔的左大腿，将股动脉的所有分支分开并结扎。切开从近侧区到隐静脉和腘动脉的分支点的区域来制备模型。手术后，肌肉注射15mg/kg/天的塞发查令(cefazolin)5天，注射0.3mg/天吗啡10天。手术后10天(第10天)，对左后肢进行血管造影术，该左后肢引起缺血症，记录动脉形成程度作为基线水平。将兔子随机地分成两组，在大腿肌肉的四个部位上分别注射500μg质粒pCPHGF-X7(试验组)或500μg质粒pCP(对照组)。手术后40天(第40天)，再对左后肢进行血管造影术，测定细动脉水平的动脉形成程度，并与第10天的比较。

从附图11的结果可以看出，与施用pCP的对照组比较，施用pCPHGF-X7的试验组中的动脉形成程度显著增强。

这些结果说明HGF-X7基因能够有效用于缺血性疾病的基因治疗。

虽然本发明已经描述了上述的特定实施方案，应当认识到本领域技术人员对本发明的各种改进和变化也落入由附加的权利要求限定的本发明的保护范围内。

       微生物国际保藏证明(译文)

保藏人	百疗医株式会社
		地址	韩国，汉城
保藏日	2002年3月19日
		保藏号	KCCM-10361
微生物分类名	大肠杆菌ToplOF’pCK-HGFX7
		国际包藏单位名称	韩国微生物培养中心
代理机构盖章

             微生物国际保藏证明(译文)

保藏人	百疗医株式会社
		地址	韩国，汉城
保藏日	2002年3月12日
		保藏号	KCCM-10362
微生物分类名	大肠杆菌ToplOF’pCK-HGFX7
		国际包藏单位名称	韩国微生物培养中心
代理机构盖章

                                序列表

<110>百疗医株式会社

<120>高效表达两种不同类型肝细胞生长因子的杂合肝细胞生长因子基因

<130>PCA30320/VML

<160>21

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>2187

<212>DNA

<213>肝细胞生长因子

<400>1

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc     60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat    120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa    180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt    240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc    300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa    360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta    420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac    480

agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct    540

cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc    600

tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga    660

ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca    720

caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc    780

cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg    840

gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg     900

gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt     960

tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact    1020

cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct    1080

gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt    1140

ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg    1200

ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa    1260

gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc    1320

cgaaatccag atgatgatgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct    1380

tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgatacca cacctacaat agtcaattta    1440

gaccatcccg taatatcttg tgccaaaacg aaacaattgc gagttgtaaa tgggattcca    1500

acacgaacaa acataggatg gatggttagt ttgagataca gaaataaaca tatctgcgga    1560

ggatcattga taaaggagag ttgggttctt actgcacgac agtgtttccc ttctcgagac    1620

ttgaaagatt atgaagcttg gcttggaatt catgatgtcc acggaagagg agatgagaaa    1680

tgcaaacagg ttctcaatgt ttcccagctg gtatatggcc ctgaaggatc agatctggtt    1740

ttaatgaagc ttgccaggcc tgctgtcctg gatgattttg ttagtacgat tgatttacct    1800

aattatggat gcacaattcc tgaaaagacc agttgcagtg tttatggctg gggctacact    1860

ggattgatca actatgatgg cctattacga gtggcacatc tctatataat gggaaatgag    1920

aaatgcagcc agcatcatcg agggaaggtg actctgaatg agtctgaaat atgtgctggg    1980

gctgaaaaga ttggatcagg accatgtgag ggggattatg gtggcccact tgtttgtgag    2040

caacataaaa tgagaatggt tcttggtgtc attgttcctg gtcgtggatg tgccattcca    2100

aatcgtcctg gtatttttgt ccgagtagca tattatgcaa aatggataca caaaattatt    2160

ttaacatata aggtaccaca gtcatag                                        2187

<210>2

<211>7112

<212>DNA

<213>肝细胞生长因子杂合体

<400>2

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc     60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat    120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa    180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt    240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc    300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa    360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta    420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac    480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc    540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat    600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata    660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg    720

tatttgtgaa ataataacgt aaacttcgtt taaaaggatt cttcttcctg tctttgagaa    780

agtacggcac tgtgcagggg gagaggttga ttgtgaaaaa tcagaggtag atgagaatct    840

tactgagggc tgagggttct ttaaccttgg tggatctcaa cattggttgc acattaaaat    900

cacctgctgc aagcccttga cgaatcttac ttagaagatg acaacacaga acaattaaat    960

cagaatctct ggggagaata gggcaccagt attttttgag ctcccaccat gattccaaag   1020

tgcagccaaa tttgagaacc actgctaaaa gctcaagctt cagattgacc agcttttcca   1080

tctcacctat cgcctaaaga ccaaattgga taaatgtgtt cattacgaca gatgggtact   1140

atttaaagat gagtaaacac aatatactta ggctcgtcag actgagagtt ttaatcatca   1200

ctgaggaaaa acatagatat ctaatactga ctggagtatt agtcaaggct tatttcacac   1260

acaattttat cagaaaccaa agtagtttaa aacagctctc cccttattag taatgcattg    1320

gagggtttac tttaccatgt accttgctga gcactgtacc ttgttaatct catttacttg    1380

taatgagaac cacacagcgg gtagttttat tggttctatt ttacctacat gacaaaactg    1440

aagcataaaa acacttagta agttttcagt gtcatgcaca actaggaagt gacatggcca    1500

gaatataagc ccagtcacca tcactctata acctgcgctt ttaacaactt cagggcatga    1560

cacatttggc cggtcagtag aacccatgct gtgatttgtt tttgcagtgg tggtgatgac    1620

tgccttgttg aatccacttt ttattctatt ccattttggg gacacaattc tgcaagatga    1680

ttcttcatta ggaaacagag atgagttatt gaccaacaca gaaagaaaaa gagtttgttg    1740

ctccacactg ggattaaacc tatgatcttg gcctaattaa cactagctag taagtgtcca    1800

agctgatcat ctctacaaca tttcaataac agaaaacaac aattttcaaa attagttact    1860

tacaattatg tagaaatgcc tctaaaacac agtattttcc ttatattaca aaaacaaaaa    1920

ttataattgg ttttgtcctc ttttgagagt ttgcatggtg ttactccctg catagtgaag    1980

aaaacatttt atttaagtag atggatctaa gtttttcatg aacaaaggaa tgacatttga    2040

aatcaatcct accctagtcc aggagaatgc attagattaa cctagtagag gtcttatttc    2100

accctgagtt ttctatgatc gtgattctct gctggaggag taattgtgaa atagatctct    2160

ctgggaactg gcttcctagt ccaatcagct cttttaccaa tgaacacttc cttgtgatat    2220

agatgtttat ggccgagagg atccagtata ttaataaaat ccctttttgt attcaatgag    2280

ggaaacacat aattttcatc aattagcagc ttattggaat atctgcatga tggtttaaca    2340

cttttaagtg ttgactaaag attaatttta cagaaaatag aaaaagaaat atgtttctgt    2400

ctggaggaat gatttattgt tgacccctaa attgaaatat tttactagtg gcttaatgga    2460

aagatgatga aagatgatga aattaatgta gaagcttaac tagaaaatca ggtgacctga    2520

tatctacatc tgtatccttc attggccacc cagcattcat taatgaatca gatgatggaa    2580

tagatcaagt ttcctaggaa cacagtgaat attaaaagaa aacaaaggga gcctagcacc    2640

tagaagacct agtttatatt tcaaagtata tttggatgta acccaatttt aaacatttcc    2700

tcacttgtct ctcttaaagc cttgccaaca gcaaggacag agaaccaaaa atagtgtata    2760

tatgaataaa tgcttattac agaatctgct gactggcaca tgctttgtgt gtaatgggtt    2820

ctcataaaca cttgttgaat gaacacacat aagtgaaaga gcatggctag gcttcatccc    2880

ttggtcaaat atggggtgct aaagaaaagc aggggaaata cattgggaca ctaacaaaaa    2940

aaaacagtta atttaggtaa aagataaaat acaccacaga atgaagaaaa gagatgaccc    3000

agactgctct ttaaccttca tgtcctagag aggtttttga tatgaattgc attcagaatt    3060

gtggaaagga gcccatcttt tctcttcatt ttgattttat taactccaat gggggaattt    3120

tattcgtgtt ttggccatat ctacttttga tttctacatt attctctctt cctttctacc    3180

tgtatttgtc ctaataaatt gttgacttat taattcacta cttcctcaca gctttttttt    3240

ggctttacaa atccactgga aaggtatatg ggtgtatcac tttgtgtatt tcggtgtgca    3300

tgtgtagagg ggacaaaaat cctctctcaa actataaata ttgagtattt gtgtattgaa    3360

catttgctat aactactagg tttcttaaat aatcttaata tataaaatga tatagaaaaa    3420

gggaaattat agttcgtatt attcatctaa gtgaagagat taaaacccag ggagtaaata    3480

aattgtctaa ggactaaggt tgtatactat ttaggtgata gatatggggc aaccgtatgg    3540

gttttatgat taacaaataa acttctcacc actctaccat atcaactttt ccataaaaga    3600

gagctatagt attctttgct taaataaatt tgattagtgc atgacttctt gaaaacatat    3660

aaagcaaaag tcacatttga ttctatcaga aaagtgagta agccatggcc caaacaaaag    3720

atgcattaaa atattctgga atgatggagc taaaagtaag aaaaatgact ttttaaaaaa    3780

gtttactgtt aggaattgtg aaattatgct gaattttagt tgcattataa tttttgtcag    3840

tcatacggtc tgacaacctg tcttatttct atttccccat atgaggaatg ctagttaagt    3900

atggatatta actattacta cttagatgca ttgaagttgc ataatatgga taatacttca    3960

ctggttccct gaaaatgttt agttagtaat aagtctctta cactatttgt tttgtccaat    4020

aatttatatt ttctgaagac ttaactctag aatacactca tgtcaaaatg aaagaatttc    4080

attgcaaaat attgcttggt acatgacgca tacctgtatt tgttttgtgt cacaacatga    4140

aaaatgatgg tttattagaa gtttcattgg gtaggaaaca catttgaatg gtatttacta    4200

agatactaaa atccttggac ttcactctaa ttttagtgcc atttagaact caaggtctca    4260

gtaaaagtag aaataaagcc tgttaacaaa acacaagctg aatattaaaa atgtaactgg    4320

attttcaaag aaatgtttac tggtattacc tgtagatgta tattctttat tatgatcttt    4380

tgtgtaaagt ctggcagaca aatgcaatat ctaattgttg agtccaatat cacaagcagt    4440

acaaaagtat aaaaaagact tggccttttc taatgtgtta aaatacttta tgctggtaat    4500

aacactaaga gtagggcact agaaatttta agtgaagata atgtgttgca gttactgcac    4560

tcaatggctt actattataa accaaaactg ggatcactaa gctccagtca gtcaaaatga    4620

tcaaaattat tgaagagaat aagcaattct gttctttatt aggacacagt agatacagac    4680

tacaaagtgg agtgtgctta ataagaggta gcatttgtta agtgtcaatt actctattat    4740

cccttggagc ttctcaaaat aaccatataa ggtgtaagat gttaaaggtt atggttacac    4800

tcagtgcaca gtaagctaat aggctgagag aagctaaatt acttactggg gtctcacagt    4860

aagaaagtga gctgaagttt cagcccagat ttaactggat tctgggctct ttattcatgt    4920

tacttcatga atctgtttct caattgtgca gaaaaaaggg ggctatttat aagaaaagca    4980

ataaacaaac aagtaatgat ctcaaataag taatgcaaga aatagtgaga tttcaaaatc    5040

agtggcagcg atttctcagt tctgtcctaa gtggccttgc tcaatcacct gctatctttt    5100

agtggagctt tgaaattatg tttcagacaa cttcgattca gttctagaat gtttgactca    5160

gcaaattcac aggctcatct ttctaacttg atggtgaata tggaaattca gctaaatgga    5220

tgttaataaa attcaaacgt tttaaggaca gatgaaaatg acagaatttt aaggtaaaat    5280

atatgaagga atataagata aaggattttt ctaccttcag caaaaacata cccactaatt    5340

agtaaaatta ataggcaaaa aaaagttgca tgctcttata ctgtaatgat tatcatttta    5400

aaactagctt tttgccttcg agctatcggg gtaaagacct acaggaaaac tactgtcgaa    5460

atcctcgagg ggaagaaggg ggaccctggt gtttcacaag caatccagag gtacgctacg    5520

aagtctgtga cattcctcag tgttcagaag ttgaatgcat gacctgcaat ggggagagtt    5580

atcgaggtct catggatcat acagaatcag gcaagatttg tcagcgctgg gatcatcaga    5640

caccacaccg gcacaaattc ttgcctgaaa gatatcccga caagggcttt gatgataatt    5700

attgccgcaa tcccgatggc cagccgaggc catggtgcta tactcttgac cctcacaccc    5760

gctgggagta ctgtgcaatt aaaacatgcg ctgacaatac tatgaatgac actgatgttc    5820

ctttggaaac aactgaatgc atccaaggtc aaggagaagg ctacaggggc actgtcaata    5880

ccatttggaa tggaattcca tgtcagcgtt gggattctca gtatcctcac gagcatgaca    5940

tgactcctga aaatttcaag tgcaaggacc tacgagaaaa ttactgccga aatccagatg    6000

ggtctgaatc accctggtgt tttaccactg atccaaacat ccgagttggc tactgctccc    6060

aaattccaaa ctgtgatatg tcacatggac aagattgtta tcgtgggaat ggcaaaaatt    6120

atatgggcaa cttatcccaa acaagatctg gactaacatg ttcaatgtgg gacaagaaca    6180

tggaagactt acatcgtcat atcttctggg aaccagatgc aagtaagctg aatgagaatt    6240

actgccgaaa tccagatgat gatgctcatg gaccctggtg ctacacggga aatccactca    6300

ttccttggga ttattgccct atttctcgtt gtgaaggtga taccacacct acaatagtca    6360

atttagacca tcccgtaata tcttgtgcca aaacgaaaca attgcgagtt gtaaatggga    6420

ttccaacacg aacaaacata ggatggatgg ttagtttgag atacagaaat aaacatatct    6480

gcggaggatc attgataaag gagagttggg ttcttactgc acgacagtgt ttcccttctc    6540

gagacttgaa agattatgaa gcttggcttg gaattcatga tgtccacgga agaggagatg    6600

agaaatgcaa acaggttctc aatgtttccc agctggtata tggccctgaa ggatcagatc    6660

tggttttaat gaagcttgcc aggcctgctg tcctggatga ttttgttagt acgattgatt    6720

tacctaatta tggatgcaca attcctgaaa agaccagttg cagtgtttat ggctggggct    6780

acactggatt gatcaactat gatggcctat tacgagtggc acatctctat ataatgggaa    6840

atgagaaatg cagccagcat catcgaggga aggtgactct gaatgagtct gaaatatgtg    6900

ctggggctga aaagattgga tcaggaccat gtgaggggga ttatggtggc ccacttgttt    6960

gtgagcaaca taaaatgaga atggttcttg gtgtcattgt tcctggtcgt ggatgtgcca    7020

ttccaaatcg tcctggtatt tttgtccgag tagcatatta tgcaaaatgg atacacaaaa    7080

ttattttaac atataaggta ccacagtcat ag                                  7112

<210>3

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gHGF3引物

<400>3

gtaaaggacg cgtctacaag ggaacagtat ctat                                34

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gHGF4引物

<400>4

actggatcct ctcggccata aacatct                                        27

<210>5

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gHGF10引物

<400>5

gaagcttagc accatgtggg tgaccaaact cctg                                34

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gHGF5引物

<400>6

tggccgagag gatccagtat attaata                                        27

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gHGF7引物

<400>7

cccctcgagg atttcgacag tagtttt                                        27

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gHGF12引物

<400>8

gggatccctt cctttctacc tgtatttg                                       28

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gHGF13引物

<400>9

gggatcctgg gtaaacacat ttgaa                                          25

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gHGF6引物

<400>10

gggatcctta tgtttcagac aacttcga                                       28

<210>11

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gHGF1引物

<400>11

gaagcttgcc accatgtggg tgaccaaact cctg                                34

<210>12

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gHGF2引物

<400>12

gggatccaga acgcgtcctt taccgatgat gcag                                34

<210>13

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gHGF8引物

<400>13

gggatccctt ctcgagactt gaaagattat gaagc                               35

<210>14

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gHGF9引物

<400>14

gtctagagcg gccgctatga ctgtggtacc tt                                  32

<210>15

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>cHGF5引物

<400>15

ggatccacgc gtagcagcac catgtgggtg accaaa                              36

<210>16

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>cHGF3引物

<400>16

ggatcctcta gattacttca gctatgactg tggtac                              36

<210>17

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GHGF5’引物

<400>17

caaatgtcag ccctggagtt ccatga                                         26

<210>18

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GHGF3’引物

<400>18

ctggattgct tgtgaaacag ggt                                            23

<210>19

<211>4679

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HGF-X6基因

<400>19

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc     60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat    120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa    180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt    240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc     300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa     360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatc ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta     420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac     480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc     540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat     600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata     660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg     720

tatttgtgga tcccttcctt tctacctgta tttgtcctaa taaattgttg acttattaat     780

tcactacttc ctcacagctt ttttttggct ttacaaatcc actggaaagg tatatgggtg     840

tatcactttg tgtatttcgg tgtgcatgtg tagaggggac aaaaatcctc tctcaaacta     900

taaatattga gtatttgtgt attgaacatt tgctataact actaggtttc ttaaataatc     960

ttaatatata aaatgatata gaaaaaggga aattatagtt cgtattattc atctaagtga    1020

agagattaaa acccagggag taaataaatt gtctaaggac taaggttgta tactatttag    1080

gtgatagata tggggcaacc gtatgggttt tatgattaac aaataaactt ctcaccactc    1140

taccatatca acttttccat aaaagagagc tatagtattc tttgcttaaa taaatttgat    1200

tagtgcatga cttcttgaaa acatataaag caaaagtcac atttgattct atcagaaaag    1260

tgagtaagcc atggcccaaa caaaagatgc attaaaatat tctggaatga tggagctaaa    1320

agtaagaaaa atgacttttt aaaaaagttt actgttagga attgtgaaat tatgctgaat    1380

tttagttgca ttataatttt tgtcagtcat acggtctgac aacctgtctt atttctattt    1440

ccccatatga ggaatgctag ttaagtatgg atattaacta ttactactta gatgcattga    1500

agttgcataa tatggataat acttcactgg ttccctgaaa atgtttagtt agtaataagt    1560

ctcttacact atttgttttg tccaataatt tatattttct gaagacttaa ctctagaata    1620

cactcatgtc aaaatgaaag aatttcattg caaaatattg cttggtacat gacgcatacc    1680

tgtatttgtt ttgtgtcaca acatgaaaaa tgatggttta ttagaagttt cattgggtag    1740

gaaacacatt tgaatggtat ttactaagat actaaaatcc ttggacttca ctctaatttt    1800

agtgccattt agaactcaag gtctcagtaa aagtagaaat aaagcctgtt aacaaaacac    1860

aagctgaata ttaaaaatgt aactggattt tcaaagaaat gtttactggt attacctgta    1920

gatgtatatt ctttattatg atcttttgtg taaagtctgg cagacaaatg caatatctaa    1980

ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa aagacttggc cttttctaat    2040

gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag ggcactagaa attttaagtg    2100

aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta ttataaacca aaactgggat    2160

cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa gagaataagc aattctgttc    2220

tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg tgcttaataa gaggtagcat    2280

ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct caaaataacc atataaggtg    2340

taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta agctaatagg ctgagagaag    2400

ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct gaagtttcag cccagattta    2460

actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc tgtttctcaa ttgtgcagaa    2520

aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag taatgatctc aaataagtaa    2580

tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt tctcagttct gtcctaagtg    2640

gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga aattatgttt cagacaactt    2700

cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg ctcatctttc taacttgatg    2760

gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt caaacgtttt aaggacagat    2820

gaaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata taagataaag gatttttcta    2880

ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata ggcaaaaaaa agttgcatgc    2940

tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt gccttcgagc tatcggggta    3000

aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt    3060

tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg    3120

aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca    3180

agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat    3240

atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat    3300

ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg    3360

acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag    3420

gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg    3480

attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac    3540

gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc    3600

caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag    3660

attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac    3720

taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac    3780

cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc agatgatgat gctcatggac    3840

cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg    3900

aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa    3960

cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac aaacatagga tggatggtta    4020

gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt gataaaggag agttgggttc    4080

ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga ttatgaagct tggcttggaa    4140

ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca ggttctcaat gtttcccagc    4200

tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa gcttgccagg cctgctgtcc    4260

tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga    4320

ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat caactatgat ggcctattac    4380

gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg    4440

tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg    4500

agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg    4560

tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag    4620

catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata taaggtacca cagtcatag     4679

<210>20

<211>3679

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HGF-X7基因

<400>20

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc     60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat    120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa    180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt    240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc    300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa    360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatc ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta    420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac    480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc    540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat    600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata    660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg    720

tatttgtgga tcctgggtag gaaacacatt tgaatggtat ttactaagat actaaaatcc    780

ttggacttca ctctaatttt agtgccattt agaactcaag gtctcagtaa aagtagaaat    840

aaagcctgtt aacaaaacac aagctgaata ttaaaaatgt aactggattt tcaaagaaat     900

gtttactggt attacctgta gatgtatatt ctttattatg atcttttgtg taaagtctgg     960

cagacaaatg caatatctaa ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa    1020

aagacttggc cttttctaat gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag    1080

ggcactagaa attttaagtg aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta    1140

ttataaacca aaactgggat cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa    1200

gagaataagc aattctgttc tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg    1260

tgcttaataa gaggtagcat ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct    1320

caaaataacc atataaggtg taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta    1380

agctaatagg ctgagagaag ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct    1440

gaagtttcag cccagattta actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc    1500

tgtttctcaa ttgtgcagaa aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag    1560

taatgatctc aaataagtaa tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt    1620

tctcagttct gtcctaagtg gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga    1680

aattatgttt cagacaactt cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg    1740

ctcatctttc taacttgatg gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt    1800

caaacgtttt aaggacagat gaaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata    1860

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tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat    2160

ggatcataca gaatcaggca agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca    2220

caaattcttg cctgaaagat atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc    2280

cgatggccag ccgaggccat ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg    2340

tgcaattaaa acatgcgctg acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac    2400

tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg    2460

aattccatgt cagcgttggg attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa    2520

tttcaagtgc aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc    2580

ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg    2640

tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt    2700

atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca    2760

tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc    2820

agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta    2880

ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc    2940

cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac    3000

aaacatagga tggatggtta gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt    3060

gataaaggag agttgggttc ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga    3120

ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca    3180

ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa    3240

gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg    3300

atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat    3360

caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag    3420

ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa    3480

gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa    3540

aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc    3600

tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata    3660

taaggtacca cagtcatag                                                 3679

<210>21

<211>2729

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HGF-X8基因

<400>21

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc    60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat    120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa    180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt    240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc    300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa    360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatc ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta    420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac    480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc    540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat    600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata    660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg    720

tatttgtgga tccttatgtt tcagacaact tcgattcagt tctagaatgt ttgactcagc    780

aaattcacag gctcatcttt ctaacttgat ggtgaatatg gaaattcagc taaatggatg    840

ttaataaaat tcaaacgttt taaggacaga tgaaaatgac agaattttaa ggtaaaatat    900

atgaaggaat ataagataaa ggatttttct accttcagca aaaacatacc cactaattag    960

taaaattaat aggcaaaaaa aagttgcatg ctcttatact gtaatgatta tcattttaaa   1020

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cctcgagggg aagaaggggg accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa    1140

gtctgtgaca ttcctcagtg ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg ggagagttat    1200

cgaggtctca tggatcatac agaatcaggc aagatttgtc agcgctggga tcatcagaca    1260

ccacaccggc acaaattctt gcctgaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat    1320

tgccgcaatc ccgatggcca gccgaggcca tggtgctata ctcttgaccc tcacacccgc    1380

tgggagtact gtgcaattaa aacatgcgct gacaatacta tgaatgacac tgatgttcct    1440

ttggaaacaa ctgaatgcat ccaaggtcaa ggagaaggct acaggggcac tgtcaatacc    1500

atttggaatg gaattccatg tcagcgttgg gattctcagt atcctcacga gcatgacatg    1560

actcctgaaa atttcaagtg caaggaccta cgagaaaatt actgccgaaa tccagatggt    1620

ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac tgctcccaaa    1680

ttccaaactg tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc aaaaattata    1740

tgggcaactt atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg    1800

aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat gagaattact    1860

gccgaaatcc agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc    1920

cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt    1980

tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc    2040

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aatgcaaaca ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg    2280

ttttaatgaa gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattt tgttagtacg attgatttac    2340

ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca    2400

ctggattgat caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata atgggaaatg    2460

agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg    2520

gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca cttgtttgtg    2580

agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc    2640

caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata cacaaaatta    2700

ttttaacata taaggtacca cagtcatag                                      2729

Claims (10)

1.一种杂合肝细胞生长因子(HGF)基因，其具有被插入到HGFcDNA的外显子4和5之间的一个固有的或外源内含子。

2.权利要求1的杂合HGF基因，其具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

3.权利要求1的杂合HGF基因，其具有SEQ ID NO：19-21的任何一种的核苷酸序列。

4.包含权利要求1-3任一项的基因的载体。

5.权利要求4的载体，其是pCK-HGF-X2、pCK-HGF-X3、pCK-HGF-X6、pCK-HGF-X7、pCK-HGF-X8、pCP-HGF-X2、pCP-HGF-X3、pCP-HGF-X6、pCP-HGF-X7或pCP-HGF-X8。

6.用权利要求4或5任一项的载体转化的微生物。

7.权利要求6的微生物，其是大肠杆菌Top10F’pCK-HGFX7(保藏号：KCCM-10361)或大肠杆菌Top10F’pCP-HGFX7(保藏号：KCCM-10362)。

8.用于治疗或预防缺血性疾病的药物组合物，其包含权利要求1-3任一项的杂合HGF基因。

9.用于治疗或预防肝脏疾病的药物组合物，其包含权利要求1-3任一项的杂合HGF基因。

10.权利要求8或9的药物组合物，其包含权利要求4的载体。

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