KR20030075718A - 유전자 발현효율이 높으며 간세포 성장인자의 두 가지이형체를 동시에 발현하는 하이브리드 간세포 성장인자유전자 - Google Patents

유전자 발현효율이 높으며 간세포 성장인자의 두 가지이형체를 동시에 발현하는 하이브리드 간세포 성장인자유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간세포 성장인자(Hepatocyte Growth Factor; HGF) cDNA의 엑손(exon) 4와 엑손 5 사이에 고유의 또는 이종의 인트론(intron) 서열을 삽입함으로써 제조된, 서열번호: 2의 염기서열을 갖는 하이브리드 HGF 유전자에 관한 것으로, 이 유전자는 발현효율이 높으며, HGF의 두 가지 이형체 HGF 및 dHGF(deleted variant of HGF)를 동시에 발현함으로써 허혈성 질환 또는 간질환 예방 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

유전자 발현효율이 높으며 간세포 성장인자의 두 가지 이형체를 동시에 발현하는 하이브리드 간세포 성장인자 유전자{HYBRID HEPATOCYTE GROWTH FACTOR GENE WHICH HAS A HIGH EXPRESSION EFFICIENCY AND EXPRESSES TWO HETEROTYPES OF HEPATOCYTE GROWTH FACTOR}
본 발명은 유전자 발현 효율이 높으며, 간세포 성장인자(Hepatocyte Growth Factor; HGF)의 두 가지 이형체를 동시에 발현하는 하이브리드(hybrid) HGF 유전자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 간세포 성장인자를 코딩하는 cDNA 염기서열의 엑손(exon) 4와 엑손 5 사이에 고유의 또는 이종의 인트론(intron) 서열을 삽입함으로써 제조된, HGF cDNA에 비해 유전자 발현효율이 현저하게 높으며, HGF 및 dHGF(deleted varient of HGF)의 두 가지 이형체를 동시에 발현할 수 있는 하이브리드 HGF 유전자에 관한 것이다.
HGF는 분산인자(scatter factor)라고도 불리우는 헤파린 결합 당단백질로서 이의 유전자는 염색체 721.1에 위치하고 총 70kb 정도의 길이로 18개의 엑손과 17개의 인트론으로 구성되며, 유전자의 전체 누클레오티드 서열(서열번호: 1)도 알려져 있다(Seki, T. et al.,Gene,102:213-219 (1991)). 이 유전자로부터 6kb정도의 전사체(transcript)가 만들어지며 728개의 아미노산으로 구성된 HGF 전구체 폴리펩타이드가 합성된다. 이 때 선택적인 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 723개의 아미노산으로 구성된 dHGF 전구체 폴리펩타이드도 합성된다. 이후 이들 생물학적으로 불활성화된 전구체 폴리펩타이드는 혈청내에 존재하는 단백질 분해 효소에 의해 잘려서 활성화된 형태의 이황화 결합된 이종이합체(disulfide-linked heterodimer)로 변화된다. 이중 분자량이 큰 중쇄(heavy chain) 또는 알파 체인(alpha chain)은 플라스미노겐(plasminogen)의 전활성화(preactivation) 펩타이드 부분과 유사한 아미노기-말단의 머리핀 고리(hairpin loop) 구조와 4 개의 크링글(kringle) 도메인을 갖는다. 크링글 도메인은 약 80 개의 아미노산으로 구성된 삼중 이황화 결합된 루프(triple disulfide-bonded loop) 구조로서 단백질-단백질 상호작용에 중요하리라 추정된다. 분자량이 작은 경쇄(light chain) 또는 베타 체인(beta chain)은 불활성화된 세린 단백분해효소-유사 도메인(serine protease-like domain)을 지닌다. 723개의 아미노산으로 구성된 dHGF는 위의 구조 중 알파 체인의 첫 번째 크링글 도메인에 위치한 5개의 아미노산(FLPSS)이 결실되어 있다.
최근의 연구결과에 따르면 HGF와 dHGF 모두는 생물학적으로 다양한 기능을 지니는데 예를들어 다양한 상피세포(epithelial cell), 멜라닌 세포(melanocyte), 내피세포(endothelial cell)의 성장을 촉진하는 기능, 형태발생(morphogenesis)에 영향을 주는 기능을 지닌다. 또한, HGF와 dHGF는 많은 유사한 점을 공유하는 반면면역학적, 생물학적 특성에 있어서 명확히 구분되기도 한다. 예를 들면 HGF는 인간 탯줄 정맥내피세포와 동맥평활근세포, NSF-60(murine myeloblast cells)의 DNA 합성을 촉진하는 면에서는 dHGF에 비하여 각각 20배, 10배 및 2배 정도 우수하며, dHGF는 LLC-PK1(pig kidney epithelial cells), OK(American opossum kidney epithelial cells), 쥐의 간세포의 DNA 합성을 촉진하는 면에서는 HGF에 비하여 각각 3배, 2배, 2배 우수하다. 또한 HGF는 dHGF에 비해 PBS에서 70배 이상 용해도가 우수하며 몇몇 dHGF에 대한 단일클론항체는 dHGF만을 인지하고 HGF 또는 환원된 형태의 dHGF는 인지하지 못하는 것은 두 단백질의 3차구조가 서로 다름을 제시한다. 이와 같이, 생체 내에서 서로 다른 특성을 지닌 HGF와 dHGF 두 단백질이 동시에 만들어진다는 것은 실제 생체 내에서 두 단백질이 상호작용하며 기능을 수행함을 제시한다(Shima, N. et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications,200: 808-815(1994)).
HGF는 중배엽 기원의 세포들로부터 분비되어 여러 세포에 작용하며 대상세포와 환경에 따라 다양한 기능들을 수행한다(Stella, M. C. and Comoglio, P. M.,The International Journal of Biochemistry & Cell Biology,31: 1357-1362(1999)). 그 기능들을 요약하면 첫째, 상피세포의 세포분열을 촉진하고 세포운동성을 촉진하며 기질(matrix) 침투능력을 증진하는데 이러한 기능들은 결과적으로 상피세포가 세뇨관 구조(tubular structure)를 형성하는 것을 유도한다. 둘째, 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 모두에서 내피세포에 의한 혈관신생을 촉진한다. 셋째, 항-세포자멸(anti-apoptosis) 활성을 지니고 있어 간과 신장의 재생과 연관이 있다. 넷째, 발생과정 중에서는 신장, 난소, 정소의 기관형성에 관여한다. 다섯째, 파골세포(osteoclast)와 조골세포(osteoblast)의 기능을 조절하여 뼈 생성과정을 조절한다. 여섯째, 적혈구 조혈(erythroid hematopoietic) 전구세포의 성장과 분화를 촉진한다. 일곱 번째, 신경의 축삭 발생(axon sprouting)에 관여한다. 이러한 다양한 기능들에 근거하여 간세포 성장인자는 다양한 질환, 예를 들어 허혈성 질환 및 간질환에 대한 치료제로 개발될 수 있다. 이러한 치료제는 단백질 형태로 개발될 수도 있으며 또는 유전자 치료제의 형태로 개발될 수도 있다. 하지만 실제 생체 내에서 간세포 성장인자는 HGF와 dHGF 두 가지 이형체로 존재하므로 적절한 비율로 HGF와 dHGF를 동시에 발현시키는 것이 치료효과 극대화에 도움이 될 수 있다. 또한 유전자 치료제의 형태로 개발될 경우 치료성공을 위해 가장 중요한 요소중 하나는 높은 유전자 발현량으로서 이를 위해 높은 유전자 발현효율을 나타낼 수 있는 유전자 형태의 개발이 필요하다.
이에 따라 본 발명자들은 HGF cDNA에 비하여 유전자 발현 효율이 우수하면서 두 가지 이형체인 HGF 및 dHGF를 동시에 발현할 수 있는 하이브리드 HGF 유전자를 개발하고자 계속 연구를 진행하던 중, HGF 유전자의 엑손 4와 엑손 5 사이에 고유의 또는 이종의 인트론을 삽입시킨 하이브리드 HGF 유전자가 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 모두에서 HGF cDNA에 비해 유전자 발현효율이 현저하게 우수하며, 두 가지 이형체 HGF와 dHGF를 동시에 발현할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 모두에서 발현효율이 우수하며, HGF의 두 가지 이형체를 모두 발현할 수 있는 하이브리드 HGF 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 하이브리드 HGF 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이브리드 HGF 유전자를 포함하는 허혈성 질환 또는 간질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.
도 1은 HGF-X의 원형(prototype)의 구조와 유전자 절편의 위치를 나타낸 것이고,
도 2는 HepG2 게노믹 DNA로부터 유전자 절편을 클로닝하는 과정을 나타난 것이고,
도 3은 인간 태반 cDNA로부터 유전자 절편을 클로닝하는 과정을 나타낸 것이고,
도 4A 및 4B는 본 발명의 발현벡터 pCK-HGF-X 군의 제조과정을 나타낸 것이고,
도 5는 발현벡터 pCK-cHGF 및 pCK-dHGF의 제조과정을 나타낸 것이고,
도 6은 본 발명의 발현벡터 pCP-HGF-X 군의 클로닝 과정을 나타낸 것이고,
도 7은 발현벡터 pCP-cHGF 및 pCP-dHGF의 클로닝 과정을 나타낸 것이고,
도 8은 본 발명의 HGF-X군과 HGF 및 dHGF의 유전자 발현량을 시험관내(invitro) 실험으로 비교측정하여 나타낸 것이고,
도 9는 본 발명의 HGF-X군과 HGF 및 dHGF의 유전자 발현 패턴을 12% 폴리아크릴아마이드젤 전기영동으로 확인한 결과이고,
도 10은 본 발명의 HGF-X군과 HGF 및 dHGF의 유전자 발현량을 생체내(in vivo) 실험으로 비교측정하여 나타낸 것이고,
도 11은 본 발명의 HGF-X7 유전자의 동맥생성(arteriogenesis)의 정도를 혈관조영술로 관찰하여 나타낸 사진이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 인간 간세포 성장인자 cDNA의 엑손(exon) 4와 엑손 5 사이에 고유의 또는 이종의 인트론 서열이 삽입된, 유전자 발현효율이 높으며 HGF 및 dHGF(deleted varient of HGF)의 두가지 이형체를 동시에 발현하는 하이브리드 HGF 유전자를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 하이브리드 HGF 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 하이브리드 HGF 유전자를 포함하는 허혈성 질환 또는 간질환 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명의 하이브리드 인간 간세포 성장인자(HGF) 유전자는 HGF의 엑손 1 내지 18에 해당하는 cDNA와 이 cDNA의 엑손 4와 5 사이에 삽입된 고유의 또는 이종의인트론 서열로 이루어지며, 고유의 인트론 서열의 절편 또는 재조합 서열을 인트론 서열로 포함할 수도 있다. 본 발명의 고유의 인트론 서열을 포함하는 하이브리드 HGF 유전자의 한 예는 서열번호: 2로 나타낸 바와 같은 7112 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다. 본 발명의 하이브리드 HGF 유전자로 HGF 및 dHGF의 두가지 이형체를 동시에 발현하며 유전자 발현효율이 HGF cDNA에 비하여 매우 우수하다.
본 발명의 하이브리드 HGF 유전자는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 HGF 및 dHGF 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 2의 하이브리드 HGF 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 하이브리드 HGF 유전자는 또한 HGF cDNA의 엑손 4와 엑손 5 사이에 고유의 인트론 유전자의 단편 또는 고유의 인트론 유전자내에서 재조합된 짧은 인트론 서열이 삽입된 단편 유전자일 수 있다. 본 발명에서는 이들 단편 유전자를 "HGF-X"라 명명하였으며, 이들 단편 유전자들 중 특히 서열번호: 19 내지 21의 염기서열을 갖는 HGF-X6, HGF-X7 및 HGF-X8이 바람직하다.
본 발명의 하이브리드 HGF 유전자는 공지의 유전공학적인 DNA 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 본원에서는 하이브리드 HGF 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환된 세포를 "HGF-X 형질전환 세포"로 지칭한다.
이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 예를 들면, 벡터를 사용하여 하이브리드 HGF 유전자 HGH-X7을 대장균 Top10F'에 형질감염(transfection)시키고, 이렇게 하여 얻어진 대장균 Top10F' pCK-HGFX7 및 대장균 Top10F' pCP-HGFX7을 각각 기탁번호 KCCM-10361 및 KCCM-10362으로서 2002년 3월 12일자로 기탁하였다.
벡터의 제작시에는, 상기 하이브리드 HGF 유전자를 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.
본 발명의 범위에는 또한, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 경우에 따라 다른 첨가제와 함께 본 발명의 하이브리드 HGF 유전자 또는 그를 포함하는 벡터를 활성성분으로 포함하는 허혈성 질환 또는 간질환 예방 및 치료용 조성물을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물을 주사제로 제제화하는 것이 바람직하다.
실제로 투여되는 하이브리드 HGF 유전자의 양은 치료하고자 하는 증상, 투여 경로, 환자의 연령 및 체중, 증상의 중증도와 같은 다양한 관련되는 인자를 고려하여 결정한다.
이하 하기 실시예에 의하여 본 발명을 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 하이브리드 인간 간세포성장인자 유전자의 제조
(1) 게노믹 DNA로부터 유전자 절편의 클로닝
인간 HepG2 세포(ATCC catalog number HB-8065)에 TES(10mM Tris-HCl; 1mM EDTA; 0.7% SDS) 완충용액을 가하고 프로테네이즈(proteinase) K를 400 ㎍/㎖로 처리한 뒤, 50℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이어서 통상의 방법으로 페놀:클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 통해 게노믹 DNA를 분리하였다. 이와 같이 추출된 게노믹 DNA를 주형으로 사용하고, 서열번호: 3 및 4의 합성 누클레오타이드를 프라이머로 이용하여 PCR을 수행하여 HGF 유전자 절편 2(HGF-F2)를 포함하는 DNA 절편을 얻었다. 또한, 프라이머로서 서열번호: 3 및 5의 합성 누클레오타이드를 이용하여 HGF 유전자 절편 3(HGF-F3)을, 서열번호: 6 및 7의 합성 누클레오타이드를 이용하여 HGF 유전자 절편 5(HGF-F5)를, 서열번호: 8 및 7의 합성 누클레오타이드를 이용하여 HGF 유전자 절편 7(HGF-F7)을, 서열번호: 9 및 7의 합성 누클레오타이드를 이용하여 HGF 유전자 절편 8(HGF-F8)을, 서열번호: 10 및 7의 합성 누클레오타이드를 이용하여 HGF 유전자 절편 6(HGF-F6)을 포함하는 DNA 절편을 각각 수득하였다(도 1). 상기 PCR 조건으로는, 주형 DNA 1㎕, 10p㏖/㎕ 프라이머 각 1㎕, 10 mM dNTP 10㎕, 확장 고성능 효소(Expand High Fidelity enzyme; Gibco BRL, USA) 3.5 단위와 효소용 완충 용액 10㎕를 혼합하여 총 100㎕의 혼합용액을 만든 후, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분 30초로 30 사이클을 수행하였다.
상기 PCR에 사용한 프라이머와 증폭된 유전자 절편은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
5' 프라이머 3' 프라이머 증폭산물
gHGF3(서열번호: 3) gHGF4(서열번호: 4) HGF 유전자 절편 2(HGF-F2)
gHGF3(서열번호: 3) gHGF10(서열번호: 5) HGF 유전자 절편 3(HGF-F3)
gHGF5(서열번호: 6) gHGF7(서열번호: 7) HGF 유전자 절편 5(HGF-F5)
gHGF12(서열번호: 8) gHGF7(서열번호: 7) HGF 유전자 절편 7(HGF-F7)
gHGF13(서열번호: 9) gHGF7(서열번호: 7) HGF 유전자 절편 8(HGF-F8)
gHGF6(서열번호: 10) gHGF7(서열번호: 7) HGF 유전자 절편 6(HGF-F6)
상기 증폭된 HGF 유전자 절편 2는 서열번호: 2로 표시되는 인간 간세포성장인자 유전자 cDNA 하이브리드 원형(prototype)(HGF-X1; 엑손1~엑손4-인트론4-엑손5~엑손18로 구성됨) 염기서열의 392번째부터 2247번째까지의 누클레오타이드를 포함한다. HGF 유전자 절편 3은 서열번호: 2의 392번째부터 727번째까지, HGF 유전자 절편 5는 서열번호: 2의 2229번째부터 5471번째까지, HGF 유전자 절편 6은 서열번호: 2의 5117번째부터 5471번째까지, HGF 유전자 절편 7은 서열번호: 2의 3167번째부터 5471번째까지, HGF 유전자 절편 8은 서열번호: 2의 4167번째부터 5471번째까지의 누클레오타이드를 각각 포함한다.
상기 증폭된 PCR 산물들을 pGEM-T 이지(easy) 벡터(Promega, WI, USA)의 PCR산물 클로닝 부위에 삽입하여 pGEM-T easy-HGF-F2, pGEM-T easy-HGF-F3, pGEM-T easy-HGF-F5, pGEM-T easy-HGF-F6, pGEM T easy-HGF-F7 및 pGEM T easy-HGF-F8 플라스미드를 각각 제조하였다(도 2). 증폭된 인간 HGF 유전자 절편의 염기서열은 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
(2) cDNA로부터 유전자 또는 유전자 절편의 클로닝
한편, 간세포성장인자의 엑손부위는 인간 태반 cDNA(Clontech, CA, USA)를 주형으로 상기 (1)에서와 같은 조건의 PCR을 통해 클로닝하였다. 서열번호: 11 및 12의 합성 누클레오타이드를 프라이머로 이용하여 PCR을 통해 HGF 유전자절편1(HGF-F1)를 포함하는 DNA 절편을 수득하였다. 이와 유사하게 서열번호: 13 및 14의 합성 누클레오타이드를 프라이머로 이용하여 HGF 유전자 절편 4(HGF-F4)를 포함하는 DNA 절편을 얻었다. 또한 서열번호: 15 및 16의 합성 누클레오타이드를 프라이머로 이용하여 HGF 유전자의 cDNA(cHGF)를 포함하는 DNA 절편과 완전한 형태의 HGF에 비하여 15개의 염기서열이 결손된 dHGF 유전자의 cDNA(dHGF)를 각각 얻었다.
상기 PCR에 사용한 프라이머와 증폭된 유전자절편은 하기 표 2와 같다.
5' 프라이머 3' 프라이머 증폭산물
gHGF1(서열번호: 11) gHGF2(서열번호: 12) HGF 유전자 절편 1(HGF-F1)
gHGF8(서열번호: 13) gHGF9(서열번호: 14) HGF 유전자 절편 4(HGF-F4)
cHGF5(서열번호: 15) cHGF3(서열번호: 16) HGF 유전자 cDNA(cHGF)dHGF 유전자 cDNA(dHGF)
상기 증폭된 HGF 유전자 절편 1은 서열번호: 2로 표시되는 인간 간세포성장인자 유전자 cDNA 하이브리드의 원형(HGF-X1; 엑손1~엑손4-인트론4-엑손5~엑손18로 구성됨) 염기서열의 1번째부터 402번째까지의 누클레오타이드를 포함하며, HGF 유전자 절편 4는 서열번호: 2의 6533번째부터 7113번째까지의 누클레오타이드를 포함한다. HGF 유전자 cDNA는 서열번호: 1로 표시되는 인간 간세포 성장인자 유전자의 1번째부터 2184번째까지의 누클레오타이드를 포함하며 dHGF유전자의 cDNA는 서열번호: 1에서 483번 내지 495번의 누클레오타이드가 결손된 것을 제외하면 HGF 유전자 cDNA와 염기서열이 동일하다.
상기 증폭된 PCR 산물들을 pGEM-T easy 벡터(Promega, WI, USA)의 PCR 산물 클로닝 부위에 삽입하여 pGEM-T easy-HGF-F1, pGEM-T easy-HGF-F4, pGEM-T easy-cHGF, pGEM-T easy-dHGF 플라스미드를 제조하였다(도 3). 증폭된 인간 HGF 유전자 절편과 HGF cDNA, dHGF의 cDNA의 염기서열은 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
(3) 하이브리드 HGF 유전자의 제조
게노믹-cDNA 하이브리드 형태의 HGF의 유전자는 상기에서 클로닝한 HGF 유전자절편을 다음과 같이 조합하여 제조하였다(도 4a 및 4b).
우선 상기 pGEM-T easy-HGF-F1 플라스미드를HindIII와BamHI으로 절단하여 HGF 유전자 절편 1을 얻고 이를 동일효소로 절단한 pCK(PCT 특허출원 제 PCT/KR99/00855호) 벡터에 삽입하여 pCK-F1 벡터를 제조하였다. 이후 pGEM-T easy-HGF-F2와 pGEM-T easy-HGF-F3 플라스미드를MluI/BamHI으로 각각 절단하여 HGF 유전자 절편 2와 HGF 유전자 절편 3을 얻은 다음, 동일효소로 절단된 pCK-F1 벡터에 삽입하여 pCK-F12M와 pCK-F13M를 각각 제조하였다.
이후 제조된 벡터 pCK-F12M 및 pCK-F13M의MluI 인지부위를 부위-특이적 돌연변이 유발 키트(site-directed mutagenesis kit, STRATAGENE, CA, USA)를 이용하여HgaI 인지부위로 치환하여 pCK-F12 및 pCK-F13 벡터를 각각 제조하였다.
또한, pGEM-T easy-HGF-F4 플라스미드를BamHI/XbaI으로 절단하여 HGF 유전자 절편 4를 얻고 동일효소로 절단한 pCK-F12 및 pCK-F13 벡터에 각각 삽입하여 pCK-F124와 pCK-F134벡터를 각각 제조하였다. 동일한 방법으로 pGEM-T easy-HGF-F5, pGEM-T easy-HGF-F6, pGEM-T easy-HGF-F7, pGEM-T easy-HGF-F8를BamHI/XhoI으로 각각 절단하여 HGF 유전자 절편 5, HGF 유전자 절편 6, HGF 유전자 절편 7, HGF 유전자 절편 8을 얻고 이들을BamHI/XhoI으로 절단한 pCK-F124와 pCK-F134에 각각 삽입하여, pCK-F1254, pCK-F1274, pCK-F1284, pCK-F1264, pCK-F1354, pCK-F1374, pCK-F1384 및 pCK-F1364를 각각 제조하였다.
이어서, pGEM-T easy-cHGF를XhoI으로 절단하여 HGF 유전자의 약 1100bp의 cDNA 절편(HGF-XhoI)을 얻고 이를 상기에서 제조된 벡터들의XhoI 부위에 각각 삽입하여 pCK-HGF-X1, pCK-HGF-X2, pCK-HGF-X3, pCK-HGF-X4, pCK-HGF-X5, pCK-HGF-X6, pCK-HGF-X7, pCK-HGF-X8를 제조하였다. 한편, pGEM-T easy-cHGF와 pGEM-T easy-dHGF를BamHI으로 절단하여 HGF 유전자의 cDNA와 dHGF 유전자의 cDNA를 각각 얻은 뒤 이를 pCK 벡터의BamHI 부위에 삽입하여 pCK-cHGF와 pCK-dHGF를 제조하였다(도 5).
(4) 하이브리드 HGF 유전자 발현벡터의 제조
플라스미드 pCDNA3.1(Invitrogen, USA)을NdeI으로 절단하고 Klenow로 둔단화한 뒤NheI으로 절단하여 인간 사이토메갈로바이러스의 프로모터를 포함하는 DNA 절편을 얻은 다음, 이를SnaBI으로 절단하고 둔단화하여NheI으로 절단한 pCK-HGF-X1, pCK-HGF-X2, pCK-HGF-X3, pCK-HGF-X4, pCK-HGF-X5, pCK-HGF-X6, pCK-HGF-X7, pCK-HGF-X8 벡터에 삽입하여 pCP-HGF-X1, pCP-HGF-X2, pCP-HGF-X3, pCP-HGF-X4, pCP-HGF-X5, pCP-HGF-X6, pCP-HGF-X7, pCP-HGF-X8 벡터를 각각 제조하였다(도 6).
한편, pCDNA3.1을NheI으로 절단하고 Klenow로 둔단화한 뒤NdeI으로 절단하여 수득된 인간 사이토메갈로바이러스의 프로모터를 포함하는 DNA 절편을,MluI으로 절단하고 둔단화한 뒤NdeI으로 절단한 pCK-cHGF 벡터와 pCK-dHGF 벡터에 각각 삽입하여 pCP-cHGF와 pCP-dHGF를 각각 제조하였다(도 7).
실시예 2: HGF-X 유전자들의 발현효율 및 HGF/dHGF 동시발현 확인
상기 실시예 1에서 제조한 일련의 HGF-X가 HGF와 dHGF를 동시에 발현하며 HGF 유전자의 cDNA와 비교했을 때 유전자 발현량에서는 어떤 차이가 있는지 다음과 같은 방법으로 조사하였다.
(1) 발현효율 조사
먼저, pCP-HGF-X2, pCP-HGF-X3, pCP-HGF-X6, pCP-HGF-X7, pCP-HGF-X8 벡터들과 이에 대한 대조군으로 pCP-cHGF와 pCP-dHGF 벡터의 DNA들을 FuGENE6(GIBCO BRL,MD, USA)를 이용하여 제조사의 지시대로 5 X 106개의 293 세포(ATCC CRL 1573)에 각각 형질감염(transfection)시켰다. 이 때 감염효율을 보정하기 위하여 0.5 ㎍의 DONAI-LacZ(TAKARA Shuzo, Japan) DNA를 함께 형질감염시켰다. 형질감염 3시간 후에 새로운 배지로 교환한 후, 48시간 뒤에 세포 배양액을 얻고 1/2의 293 세포로부터 RNA를 추출하였으며 1/2의 293 세포에 대해서는 LacZ 활성을 측정하였다. LacZ 활성은 활성측정키트(Stratagene, CA, USA)를 이용하여 제조사의 지시대로 측정하였다.
상기에서 얻은 세포 배양액 속에 포함된 HGF의 양을 효소-결합 면역측정(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트(ELISA, R&D System, MN, USA)를 이용하여 측정함으로써 유전자 발현량을 비교하였다. 측정된 LacZ 활성을 이용하여 감염효율을 보정한 결과, HGF-X의 유전자 발현량이 대조군인 HGF cDNA와 dHGF cDNA의 유전자 발현량에 비하여 20 - 150배 정도 많았다(도 8). 특히 HGF-X 유전자 중에서도 HGF-X7의 유전자 발현량이 가장 많았다.
(2) HGF와 dHGF의 동시 발현 확인
한편, 형질감염된 293세포로부터 RNA를 추출한 후 RT-PCR을 수행하여 HGF-X로부터 HGF와 dHGF의 RNA가 동시에 만들어짐을 조사하였다.
상기 293 세포로부터 트라이졸(Trizol; Gibco BRL, USA) 방법을 이용하여 RNA를 추출하고 이 RNA를 역전사효소(RT) 중합 반응시켜 cDNA를 얻었다. 이 cDNA을 주형으로 사용하고 서열번호: 17 및 18의 합성 뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하였다. 이 때 PCR 조건으로는, 주형 DNA 1㎕, 10p㏖/㎕ 프라이머 각 1㎕, 10 mM dNTP 10㎕, Taq 중합효소(TAKARA SHUZO, Japan) 3.5 단위와 효소용 완충액 10㎕를 혼합하여 총 100㎕의 혼합액을 만든 후, 이 용액을 94??에서 1분, 55??에서 1분, 72??에서 1분 30초 동안 반응시키는 과정을 30회 반 복하여 수행하였다. 이렇게 증폭된 PCR 산물은 엑손 4와 엑손 5의 경계부분으로 HGF cDNA는 142bp, dHGF cDNA는 127bp의 염기서열이 증폭된다. HGF-X 유전자의 경우 스플라이싱이 일어나지 않은 경우엔 1kb 이상의 염기서열이 증폭되며 선택적인 스플라이싱이 일어나 HGF와 dHGF가 동시에 만들어질 경우 142bp와 127bp가 동시에 증폭된다. 증폭된 PCR 산물은 12% 폴리아크릴아마이드젤(polyacrylamide gel)에서 전기영동하여 확인하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었으며, 여기에서 보듯이, HGF cDNA의 경우 142bp, dHGF의 경우 127bp가 나타났으며 HGF-X의 경우 142bp와 127bp가 동시에 나타났음을 알 수 있다. 이러한 결과는 HGF-X 유전자들로부터 HGF와 dHGF가 동시에 발현됨을 제시한다.
실시예 3: HGF-X7 유전자와 HGF 유전자의 cDNA, dHGF 유전자의 cDNA의 유전자 발현량 비교(in vivo)
유전자 발현량을 생체내(in vivo) 시스템인 마우스 골격근에서 다음과 같이 비교측정하였다.
먼저, 상기 실시예 1에서 수득한 pCP-HGF-X7, pCP-cHGF, pCP-dHGF 플라스미드 DNA를 각각 100㎍씩 Balb/c 생쥐의 하지 전경골근에 인슐린 주사기를 사용하여주사하고 5일 후 생쥐를 도살하고 주사부위의 근육을 잘라내어 단백질 추출완충액(25mM Tris-HCl pH7.4, 50mM NaCl, 0.5% Na-데옥시콜레이트, 2% NP-40, 0.2% SDS)에 분쇄하여 총단백질을 분리하였다. 총단백질의 양은 DC 단백질 분석키트(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)를 이용하여 측정하며 동일한 양의 단백질을 이용하여 HGF 발현량을 측정하였다. HGF의 발현량은 상기 실시예 2에서와 같이 ELISA 키트(R&D System)를 이용하여 제조업자의 지시대로 측정하였다.
그 결과는 도 10에 나타내었으며, 여기에서 보듯이, HGF-X7로부터의 유전자 발현량은 HGF cDNA 혹은 dHGF cDNA에 비하여 250배 많음을 알 수 있었다.
이와 같은 결과는 상기 실시예 2의 생체내 실험결과와 함께, HGF-X의 유전자 발현효율이 HGF cDNA 또는 dHGF cDNA에 비하여 매우 우수함을 보여준다.
실시예 4: 토끼 허혈성 하지모델(Rabbit Ischemic Hind Limb Model)에서의 HGF-X7를 이용한 유전자 치료
HGF-X7 유전자가 허혈성 하지 질환 치료에 효과적으로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 토끼 허혈성 하지모델에서 HGF-X7를 이용하여 다음과 같이 유전자 치료를 수행하고 치료효과를 측정하였다.
먼저, 토끼 허혈성 하지모델은 말초동맥질환인 허혈성 하지질환의 표준 동물 모델로서 타케시타(Takeshita) 등의 방법(Takeshita et al.,Journal of Clinical Investigation,93:662(1994))에 따라 제조하였다. 실험 0일째(day 0) 뉴질랜드산 흰토끼(수컷, 3.8 - 4.2 kg)에 자일라진(Xylazine)(5mg/kg)을 근육주사하여 전처치시킨 후 케타민(Ketamine)(50mg/kg)을 근육주사하여 마취시켰다. 이후 토끼의 왼쪽 대퇴부를 절개한 뒤 대퇴(femoral)동맥의 분지들을 모두 박리하여 묶고 근위부로부터 복재(saphenous)동맥과 슬와(popliteal)동맥의 분기점까지를 절제하여 모델을 제조하였다. 수술후 세파졸린(cefazolin)(15mg/kg/day)를 5일간 근육주사하였고 몰핀(morphine)(0.3mg/day)를 10일간 근육주사하였다. 실험 10일째 (day 10) 토끼의 좌측 허혈유발 하지의 혈관조영술을 실시하여 기준값으로 삼았다. 토끼를 무작위로 나눈 뒤 500㎍의 pCP-HGF-X7 또는 대조물질인 pCP 플라스미드 DNA를 대퇴근육 4부위에 125㎍씩 주사하였다. 실험 40일째 (day 40) 좌측허혈유발 하지에 대해 혈관조영술을 재실시하여 10일째의 결과와 비교하여 세동맥(arteriole)수준의 동맥생성(arteriogenesis)의 정도를 비교하였다.
그 결과는 도 11에 나타내었으며, 여기에서 보듯이, 본 발명의 pCP-HGF-X7을 투여한 군에서 동맥생성이 pCP 투여군에 비하여 현저히 증가하였음을 알 수 있다. 상기 데이터는 HGF-X7 유전자가 허혈성 질환에 대한 유전자치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 제시한다.
이와 같이 본 발명의 하이브리드 간세포성장인자(HGF) 유전자는 HGF와 dHGF를 동시에 발현하며 시험관내 및 생체내 모두에서 HGF 유전자의 cDNA 혹은 dHGF 유전자의 cDNA에 비해 유전자 발현효율이 우수하여 허혈성질환, 간질환 등과 같은 질환의 유전자 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims (9)

  1. 인간 간세포 성장인자(Hepatocyte Growth Factor; HGF) cDNA의 엑손(exon) 4와 엑손 5 사이에 고유의 또는 이종의 인트론(intron) 서열이 삽입된, 유전자 발현효율이 높으며 HGF 및 dHGF(deleted varient of HGF)의 두 가지 이형체를 동시에 발현하는 하이브리드(hybrid) HGF 유전자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    서열번호: 2의 염기서열을 갖는 하이브리드 HGF 유전자.
  3. 제 1 항에 있어서,
    서열번호: 19 내지 서열번호: 21의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 하이브리드 HGF 유전자.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 유전자를 포함하는 벡터.
  5. 제 4 항에 있어서,
    pCK-HGF-X2, pCK-HGF-X3, pCK-HGF-X6,pCK-HGF-X7,pCK-HGF-X8, pCP-HGF-X2, pCP-HGF-X3, pCP-HGF-X6, pCP-HGF-X7 또는 pCP-HGF-X8인 벡터.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항의 벡터에 의해 형질전환된 미생물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    대장균 Top10F' pCK-HGFX7(기탁번호: KCCM-10361) 또는 대장균 Top10F' pCP-HGFX7(기탁번호: KCCM-10362)인 미생물.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 하이브리드 HGF 유전자를 포함하는 허혈성 질환 또는 간질환 치료 및 예방용 약학 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    제 4 항의 벡터를 포함하는 조성물.
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