KR101325674B1 - 간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체들을 이용한 심장 질환의 치료 및 예방 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간세포 성장인자(HGF)의 둘 이상의 이형체들을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서의 심장 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 간세포 성장인자(HGF)의 둘 이상의 이형체들을 혈관에 투여하는 것을 포함하는 혈관에서의 내피세포 성장을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 있어서, HGF의 둘 이상의 이형체들은 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서 투여된다.

Description

간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체들을 이용한 심장 질환의 치료 및 예방 {TREATMENT AND PREVENTION OF CARDIAC CONDITIONS USING TWO OR MORE ISOFORMS OF HEPATOCYTE GROWTH FACTOR}

본 발명은 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF)의 둘 이상의 이형체들(isoforms)을 대상(subject)에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서의 심장 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체들을 혈관에 투여하는 것을 포함하는, 혈관에서의 내피세포 성장을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 있어서, HGF의 둘 이상의 이형체들은 상기 이형체들을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로서 투여된다.

간세포 성장인자(HGF)는 분산인자(scatter factor) 또는 헤파토포이에틴-A(hepatopoietin-A)로도 알려진 헤파린 결합 당단백질이다. 강력한 간영양성(hepatotrophic) 성장인자로 처음 확인된(Nakamura et al., Nature 342:440 (1989)) HGF는 다양한 형태의 세포의 미토게네시스(mitogenesis), 모토게네시스(motogenesis) 및 형태발생(morphogenesis)과 같은 다수의 생물학적 효과를 갖는 간엽 유래의 헤파린 결합 단백질이다. HGF를 암호화하는 유전자는 염색체 7q21.1에 위치하고 18개의 엑손(exon) 및 17개의 인트론(intron)을 포함하며, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다(Seki T., et al., Gene 102:213-219 (1991)). 상기 HGF 유전자로부터 약 6kb의 전사체가 전사되고 난 다음, 이로부터 하기의 도메인: N-말단 헤어핀 루프(hairpin loop)-크링글(kringle)1-크링글2-크링글3-크링글4-불활성화된 세린 단백분해효소 도메인을 포함하는, 728개의 아미노산으로 이루어진 전장 폴리펩타이드 HGF 전구체(flHGF)가 합성된다. 동시에, 상기 HGF 유전자의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 몇 가지 다른 HGF 폴리펩타이드 이형체들이 합성된다. 알려진 이형체들에는 결손된 변형(deleted variant) HGF (전장 HGF의 크링글1에서 5개의 아미노산이 결손된 형태), NK1(N-말단 헤어핀 루프-크링글1), NK2(N-말단 헤어핀 루프-크링글1-크링글2), 및 NK4(N-말단 헤어핀 루프-크링글1-크링글2-크링글3-크링글4)이 포함된다. 또한, 각 이형체의 대립형질 변형체(alleic variant)들이 존재한다. 상기 생물학적으로 불활성인 전구체들은 혈청 내 단백질 분해효소에 의해 활성화된 형태의 이황화 결합된 이종이합체(disulfide-linked heterodimer)로 변환될 수 있다. 상기 이종이합체들에서, 고분자량을 갖는 알파 사슬은 4개의 크링글 도메인 및 플라스미노겐(plasminogen)의 전활성화된(preactivated) 펩타이드 부분과 유사한 N-말단 헤어핀 루프를 형성한다. 약 80개의 아미노산으로 구성된 삼중 이황화 결합된 루프(triple disulfide-bonded loop) 구조의 크링글 도메인들은 단백질-단백질 상호작용에서 중요한 역할을 할 수 있다. 저분자량 베타 사슬은 불활성화인 세린 단백분해효소-유사 도메인을 형성한다. 723개의 아미노산으로 이루어진 dHGF는 엑손 4와 엑손 5 사이의 선택적 스플라이싱으로 인하여, 알파 사슬의 첫 번째 크링글 도메인 내의 5개의 아미노산, 즉 F, L, P, S 및 S가 결손된 폴리펩타이드이다.

생체 내(in vivo)에서, HGF의 두 가지 이형체들(728개의 아미노산을 갖는 flHGF 및 723개의 아미노산을 갖는 dHGF)은 엑손 4와 엑손 5 사이의 선택적 스플라이싱을 통해 생성된다. flHGF 및 dHGF 모두 몇 가지 생물학적 기능이 동일함에도 불구하고, 면역학적 특성 및 몇 가지 생물학적 특성들의 관점에서 상이하다.

HGF는 내피세포(endothelial cell)의 성장 및 혈관 평활근 세포(vascular smooth muscle cell)의 이동을 조절함으로써 혈관신생(angiogenesis)을 자극하는 것으로 나타났다. 그의 혈관신생 활성 때문에, HGF는 혈관신생 치료에 있어서 유망한 후보물질 중 하나로 간주된다. "혈관신생 치료(therapeutic angiogenesis)"는 관상동맥질환(coronary artery disease, CAD) 또는 말초동맥질환(peripheral artery disease, PAD)과 같은 허혈성 질환(ischemic disease)의 치료를 위해, 재조합 단백질이나 유전자로서 혈관신생인자들을 이용하는 개입(intervention)을 의미한다. HGF는 내피세포의 성장뿐만 아니라 이동을 자극한다고도 알려져 있고(Bussolino et al ., J Cell Biol . 119:629 (1992); Nakamura et al., J Hypertens 14:1067 (1996)), 재-내피세포화 자극제(re-endothelialization stimulating agent)로서의 역할도 시험되어 왔다(Yasuda et al ., Circulation 101:2546 (2000); Hayashi et al., Gene Ther 7:1664 (2000)).

HGF는 혈관신생 치료용 제제로 사용되어 왔다. 모리시타(Morishita) 및 동료들은 PAD 및 CAD 치료를 위해 HGF 유전자를 사용해왔다. 그들은 HGF 유전자를 투여한 후 PAD에 대한 몇 가지 치료적 반응을 관찰하긴 했지만, HGF 유전자 전달이 CAD를 치료하는데 효과적인지 여부는 확실치 않다. 현재까지, HGF 유전자 전달이 CAD를 위한 다양한 동물 모델에서 시험되고 있다(Miyagawa et al ., Circulation 105:2556 (2002); Azuma et al ., Gene Ther . 13:1206 (2006); Aoki et al ., Gene Ther. 7:417 (2000); Funatsu et al ., J. Thoracic Cardiovasc . Surg . 124:1099 (2002)). 하지만, HGF 유전자 전달이 CAD에 유익한 효과를 갖는지 여부는 아직 논란이 많다. 예를 들어, 미야가와 및 그의 동료들은 인간 HGF 전달이 랫트 심근경색(myocardial infarction) 모델에 투여 8주 후에 경색된 심장의 좌심실 박출 계수(left ventricle ejection fraction, LVEF)를 증가시킬 수 없었다는 것을 보여주었다(Miyagawa et al ., Circulation 105:2556 (2002), 도 2). 더욱이, HGF 유전자 전달은 동일한 모델에 투여 8주 후에 분획단축백분율(percent fractional shortening) 및 좌심실 전벽 두께(LV anterior wall thickness)에 거의 영향을 주지 않았다(Miyagawa et al ., Circulation 105:2556 (2002), 도 3 및 5).

HGF는 재협착증을 억제하는 제제로도 사용되어 왔다. 좁아진(obscured) 혈관의 치료 방법으로 관상동맥 성형술(Coronary angioplasty procedure), 예컨대 풍선(balloon)이나 스텐트(stent)가 널리 사용된다. 하지만, 성형술을 사용할 때, 내막 비후(intimal thickening), 예컨대 관상동맥 재협착증(artery restenosis)이 상당한 문제를 야기한다. 재협착증의 원인 중 하나는 혈관 손상에 대한 반응으로부터 야기되는, 세포외 기질의 합성을 수반하는 혈관 평활근 세포의 과다 증식(hyper-proliferation) 및 이동(migration)이다. 신속한 내피 재표면화(resurfacing)가 평활근 세포 증식을 억제하고, 이로써 재협착증을 억제할 수 있다는 증거가 있다(e.g., Bauters et al ., Prog Cardiovasc Dis . 40:107 (1997)). 협착증의 예방을 위한 한 가지 방법으로서, 혈관 내피 성장인자(VEGF) 또는 간세포 성장인자(HGF)와 같은 내피 성장인자를 손상된 혈관에 국소 전달하는 것이 시도되었고 재협착증의 약화에 효과를 나타내었다(Asahara et al., Circulation 94:3291 (1996); Yasuda et al ., Circulation 101:2546 (2000); Hayashi et al., Gene Ther 7:1664 (2000); Walter et al., Circulation 110:36 (2004)).

상기 기술된 HGF 유전자 치료법에 관한 모든 연구들은 723개의 아미노산을 암호화하는 dHGF cDNA가 아닌 728개의 아미노산을 암호화하는 flHGF cDNA를 이용하여 수행되어 왔다(Miyagawa et al .; Azuma et al.; Aoki et al .; Funatsu et al .; Yasuda et al .; and Hayashi et al .). 본 발명은 HGF의 다수의 이형체들(예컨대, flHGF 및 dHGF)을 발현하는 뉴클레오타이드 서열의 전달이, 대부분의 종래 보고들에서 시험되었던 flHGF에 대한 cDNA와 비교하여 볼 때, 동물 및 인간에서 CAD를 효과적으로 치료할 수 있다는 최초의 증명을 제공한다. 또한, 본 발명은 HGF의 다수의 이형체들을 발현하는 뉴클레오타이드 서열의 전달이 혈관의 재-내피세포화 과정을 가속화할 수 있다는 최초의 증명을 제공한다.

따라서, 본 발명의 목적은 HGF의 둘 이상의 이형체들을 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 실시형태는 HGF의 둘 이상의 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물의, 대상에서의 심장 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 HGF의 둘 이상의 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물의, 혈관에서 내피세포 성장을 촉진하기 위한 약제의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 HGF의 둘 이상의 이형체들을 투여함으로써 심장 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 HGF의 둘 이상의 이형체들을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서의 심근에서 허혈성 심장 조직의 관류를 증가시키거나 혈관 밀도를 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 HGF의 둘 이상의 이형체들을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서의 심장 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 실시형태는 HGF의 둘 이상의 이형체들을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 내피 회복(endothelial repair)을 향상시키거나 대상의 혈관 손상 부위 또는 병에 걸린 혈관에 치료를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 HGF의 둘 이상의 이형체들을 포함하는 조성물을 혈관에 투여하는 것을 포함하는, 혈관에서의 내피세포 성장을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 혈관은 손상되어 있다. 추가의 구체예에서, 상기 혈관의 재-내피세포화가 촉진된다.

일 구체예에 있어서, 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들은 전장(full length) HGF(본 명세서에서 flHGF로 지칭됨) 및 결손된 변형(deleted variant) HGF(본 명세서에서 dHGF로 지칭됨)를 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들은 또한 NK1을 포함한다.

추가의 구체예에 있어서, 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들은 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 형태로 투여된다.

본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 주사(injection)에 의해 투여된다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 전달 장치(delivery device)를 이용하여 투여된다. 일 구체예에 있어서, 상기 전달 장치는 스텐트이다. 추가의 구체예에 있어서, 상기 스텐트는 비중합체 기반의(non-polymer-based) 스테인레스 스틸 스텐트, 중합체 기반의 스테인레스 스틸 스텐트, 비중합체 기반의 코발트 크롬 스텐트 및 중합체 기반의 코발트 크롬 스텐트로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들은 대상 내 허혈성 심장 조직에 직접 투여된다.

본 발명의 추가의 실시형태는 HGF의 둘 이상의 이형체들을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 HGF의 둘 이상의 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

본 발명의 추가의 실시형태는 HGF의 둘 이상의 이형체들을 포함하는, 대상에서의 허혈성 심장 조직의 관류를 증가시키기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 실시형태는 HGF의 둘 이상의 이형체들을 포함하는, 대상의 혈관에서 내피세포 성장을 촉진시키기 위한 조성물에 관한 것이다.

일 구체예에 있어서, 상기 조성물의 대상의 혈관으로의 투여는 혈관의 내피세포화(endothelialization)를 촉진한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물의 대상의 혈관으로의 투여는 혈관의 재-내피세포화(re-endothelialization)를 촉진 및/또는 가속화한다.

추가의 구체예에 있어서, 상기 대상은 재협착증의 예방 또는 치료를 필요로 한다.

본 발명의 상기 및 기타 목적과 특징은 첨부되는 도면과 함께 고려할 때, 본 발명의 하기의 설명으로부터 명확해질 것이다.
도 1은 HUVEC 이동에 대한 HGF 이형체들의 효과를 나타낸다.
도 2는 C2C12 세포 이동에 대한 HGF 이형체들의 효과를 나타낸다.
도 3은 H9C2 세포 이동에 대한 HGF 이형체들의 효과를 나타낸다.
도 4는 HUVEC 증식에 대한 HGF 이형체들의 효과를 나타낸다.
도 5는 랫트 허혈성 심장 질환 모델에서 HGF의 약리학적 효능을 평가하는 실험 과정의 모식도를 나타낸다.
도 6은 좌심실 박출 계수의 기능에 대한 HGF의 효과를 나타낸다.
도 7은 수축-심실 중격(systolic-interventricular septum)의 기능에 대한 HGF의 효과를 나타낸다.
도 8은 혈관 밀도에 대한 허혈성 심근 내로의 HGF 주사의 효과를 나타낸다.
도 9는 심근 섬유증(myocardial fibrosis)에 대한 허혈성 심근 내로의 HGF 주사의 효과를 나타낸다.
도 10은 MIBI-SPECT의 20 분할 모델 상의 관상동맥 영역을 나타낸다.
도 11은 pCK-HGF-X7 주사에 대한 심근 영역의 선택성을 나타낸다. pCK-HGF-X7은 MIBI-SPECT 평가에 의해 관류가 감소된 심근 영역 내의 관상 동맥의 양쪽 면으로 심근내 주사에 의해 투여된다.
도 12는 MIBI-SPECT 하에 심근 관류에 대한 pCK-HGF-X7의 효과를 나타낸다.
도 13은 조영 부하 심초음파도(contrast stress echocardiogram)에 의해 평가된 심근 관류(κ)를 나타낸다.
도 14는 OCT 상의 HGF 플라스미드 용출성 스텐트에 의한 재-내피세포화의 가속화를 나타낸다.
도 15는 SEM 상의 HGF 플라스미드 용출성 스텐트에 의한 재-내피세포화의 가속화를 나타낸다.

본 발명은 CAD와 같은 심장 질환을 겪고 있는 대상에게 HGF의 둘 이상의 이형체들을 투여하는 것이 허혈성 심장 조직의 관류를 증가시키고 따라서 심장 질환을 치료 또는 예방하는데 효과적이라는 발견에 기초하고 있다. 본 발명의 추가의 실시형태들은 HGF의 두 가지 이형체들을 투여하는 것이, 예컨대 혈관의 신속한 재-내피세포화를 통해 재협착증을 약화시키기 때문에, 혈관의 내피세포화를 촉진한다는 발견에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 목적은 HGF의 둘 이상의 이형체들을 투여함으로써 심장 질환, 예컨대 CAD 또는 관상동맥 재협착증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 혈관에서, 예컨대 손상된 혈관에서, 내피세포 성장을 촉진하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 실시형태는 HGF의 둘 이상의 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물의, 대상에서의 심장 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 HGF의 둘 이상의 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물의, 혈관에서 내피세포 성장을 촉진하기 위한 약제의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 HGF의 둘 이상의 이형체들을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서의 심근 내 허혈성 심장 조직의 관류를 증가시키거나 혈관 밀도를 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 HGF의 둘 이상의 이형체들을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서의 심장 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 실시형태는 HGF의 둘 이상의 이형체들을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 내피 회복을 향상시키거나 대상의 혈관 손상 부위 또는 병에 걸린 혈관에 치료를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 HGF의 둘 이상의 이형체들을 포함하는 조성물을 혈관에 투여하는 것을 포함하는, 혈관에서의 내피세포 성장을 촉진하는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 혈관에서의 내피세포 성장이 촉진된다.

일 구체예에 있어서, 상기 방법들은 HGF의 셋 이상의 이형체들, 예컨대 HGF의 넷 이상의 이형체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 flHGF, dHGF, NK1, NK2 및 NK4로 이루어진 군으로부터 선택되는 HGF의 둘 이상의 이형체들을 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 flHGF, dHGF, NK1 및 NK2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 HGF의 둘 이상의 이형체들을 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 flHGF, dHGF 및 NK1으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 HGF의 둘 이상의 이형체들을 포함한다. 추가의 구체예에 있어서, 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들은 flHGF 및 dHGF를 포함한다. 추가의 구체예에 있어서, 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들은 flHGF 및 dHGF로 이루어진다. 또 다른 구체예에 있어서, HGF의 둘 이상의 이형체들은 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 형태로 투여된다.

본 발명에 있어서, 치료 또는 예방되는 심장 질환은 심장, 대동맥(aorta), 또는 심장 내 관상동맥 또는 허혈성 조직에서의 감소된 혈류와 관련된 임의의 질환이다. 심장 질환의 예에는 관상동맥 폐쇄(occlusion)(예컨대, 지질/콜레스테롤 침착(deposition), 대식세포/감염세포 점증(recruitment), 플라그 파열(plaque rupture), 혈전증(thrombosis), 혈소판 침착 또는 신생내막 증식(neointimal proliferation)으로부터 야기되거나 이와 연관됨); 허혈 증후군(예컨대, 심근경색, 안정성 협심증(stable angina), 불안정성 협심증, 관상동맥 재협착증 또는 재관류 손상을부터 야기되거나 이와 연관됨); 심근병증(cardiomyopathy)(예컨대, 허혈 증후군, 심장독(cardiotoxin), 감염, 고혈압, 대사성 질환(예컨대, 요독증(uremia), 각기병(beriberi), 또는 당원병(glycogen storage disease)), 방사선, 신경근육 질환(neuromuscular disease), 침윤성 질환(예컨대, 유육종증(sarcoidosis), 혈색소침착증(hemochromatosis), 아밀로이드증(amyloidosis), 파브리병(Fabry's disease), 또는 후를러 증후군(Hurler's syndrome)), 외상(trauma), 또는 특발성 원인(idiopathic cause); 부정맥(arrhythmia 또는 dysrrhythmia)(예컨대, 허혈증후군, 심장독, 감염, 고혈압, 대사성 질환, 방사선, 신경근육 질환, 침윤성 질환, 외상 또는 특발성 원인으로부터 야기되거나 연관됨); 감염(예컨대, 세균, 바이러스, 곰팡이 또는 기생충)과 같은 병원성 제제에 의해 야기됨); 및 염증 질환(예컨대, 심근염(myocarditis), 심낭염(pericarditis), 심장내막염(endocarditis), 면역 심장 거부(immune cardiac rejection) 또는 특발성, 자가면역 또는 결체 조직질환(connective tissue disease) 중 하나로부터 야기되는 염증 질환과 연관됨)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구체예에 있어서, 본 발명의 방법들은 (예컨대, 대동맥 또는 관상 동맥에서) 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis)을 치료 또는 예방하기 위해, 아테롬성 동맥경화증과 연관된 합병증(예컨대, 협심증(angina pectoris), 심근경색, 부정맥, 심부전, 신부전, 간경화(liver cirrhosis), 소아성 대퇴골두 무혈성 괴사증(Legg-Calve-Perthes disease), 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke), 말초 혈관 폐색(peripheral artery occlusion), 동맥류(aneurysm), 색전증(embolism))을 예방하기 위해, 또는 아테롬성 동맥경화증의 초기 증후군 및 신호(예컨대, 협심증(angina), 격렬운동(exertion), 또는 간헐적 파행(intermittent claudication)에서의 경우와 같이, 수요에 따라 증가하는 영향받은 조직으로의 혈류의 불능)을 감소시키기 위하여 사용될 수 있다.

또 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 혈관성형술(예컨대, 경피적 관동맥 확장성형술(percutaneous transluminal coronary angioplasty), 경동맥 경피적 확장성형술(carotid percutaneous transluminal angioplasty), 스텐트 이식을 갖는 관동맥 확장성형술), 스텐트 삽입(stenting), 죽상반절제술(atherectomy), 또는 이식(예컨대, 관상동맥 우회술(coronary bypass grafting))을 포함하는 혈관 외과적 개입으로부터 야기되는 심장 질환을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 본 구체예에서 있어서, 상기 본 발명의 방법들은 외과적 개입 이전, 중 및/또는 후에 수행될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 상기 심장 질환은 관상동맥 재협착증이다.

본 발명의 일 실시형태에 있어서, HGF의 둘 이상의 이형체들은 관상동맥 질환을 갖는 대상에게 투여된다. 일 구체예에 있어서, 상기 대상은 하나 이상의 관상동맥의 일부 또는 전부가 막혀 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 대상은 심근 경색을 가졌거나 가지고 있거나 위험 상태에 있다. 추가의 구체예에 있어서, 상기 대상은, 예를 들어 혈관촬영도(angiogram), 심전도(electrocardiogram), 심초음파도(echocardiogram) 또는 기타 과정에 기초하여, 허혈성 심장 조직을 갖는다고 결정되어 왔거나 갖는다고 의심받는다. 일 구체예에 있어서, 상기 대상은 관상 동맥 우회술(CABG)을 위한 후보이다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 대상은 부분적으로 또는 완전히 차단되었지만 CABG에 적합하지 않은 하나 이상의 관상동맥을 갖는다. 추가의 구체예에 있어서, 상기 대상은 CABG를 갖지만 심근의 불완전한 재관류술(revascularization)이 있어왔다.

본 발명의 일 실시형태에 있어서, HGF의 둘 이상의 이형체들은 혈관으로 투여되어 내피세포 성장을 촉진한다. 일 구체예에 있어서, 상기 혈관은 혼탁하거나 손상되어 있다. 특정 구체예에 있어서, 상기 혼탁한 혈관은 혈관의 루멘이 협소해지고, 혈관을 통한 혈류가 감소된 동맥 또는 정맥을 포함할 수 있다. 일 구체예에 있어서, HGF의 둘 이상의 이형체들을 투여는, 예컨대, 혈관성형술 과정 중, 예컨대 혈관 벽의 손상 후, 혈관의 재-내피세포화를 촉진한다. 특정 구체예에 있어서, 재-내피세포화는 HGF의 둘 이상의 이형체들이 존재하지 않을 시 내피세포 성장과 비교하여, 예컨대, 증가된 내피세포 성장 속도과 같이 촉진 및/또는 가속화될 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 예컨대, 재협착증의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 HGF의 둘 이상의 이형체들의 투여는 혈관에서 평활근 세포 증식을 억제한다.

본 명세서에 사용된 용어, 질환, 예컨대, 심장 질환 또는 혼탁하거나 손상된 혈관의 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는, 예컨대, 혈관신생 또는 내피세포 성장의 촉진으로 인한, 상기 질환의 하나 이상의 증후군을 개선시키거나, 상기 질환의 진전을 예방하거나, 또는 상기 질환의 퇴행을 야기하기에 충분한 양으로 대상에게 투여하는 것을 의미한다. 예를 들어, 심장 질환의 증후군의 개선과 관련하여, 치료는 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%의 증후군에서의 주목할 만한 감소를 야기한다. 치료를 확정하기 위해 검출 또는 측정될 수 있는 심장 질환의 치료와 관련된 생리적 효과에는 심장 효율의 증가(심박출량(cardiac output), 폐동맥 및 중심정맥압(central venous pressure) 또는 심실 박출계수와 같은 적어도 하나의 심장 기능의 임상 지수에 의해 측정된 바와 같음), 휴식시 또는 부하(stress) 상태 하의 심근에서의 경심벽(transmural) 혈류, 심근 조직의 재생, 형성, 성숙 및/또는 측부(collateral) 혈관의 성장(예컨대, 국소적 신생혈관형성(local neoangiogenesis), 혈관 밀도 증가, 동맥신생(arteriogenesis), 림프관시생(lymphangiogenesis), 혈관형성(vasculogenesis)), 심근생성(cardiomyogenesis)(예컨대, 가로무늬(striated), 평활(smooth) 또는 근상피세포(myoepithelial cell)), 심근 조직의 혈관신생(vascularization), 심장의 수축 기능, 좌심실 박출 계수, 또는 심실 중격; 또는 심근 섬유증의 감소, 내막 비후(신생내막(neointimal) 증식/비대증(hyperplasia)), 내피 또는 평활근 세포 증식, 흉부 통증, 또는 숨가뿜(shortness of breath)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 사용된 용어, "예방하다", "예방하는", 및 "예방"은 동물에서 질환의 하나 이상의 증후군(예를 들어, 혼탁하거나 손상된 혈관으로 인한 심장 기능의 변화 또는 혈류의 감소)의 발생의 감소를 지칭한다. 상기 예방은 완전한, 예컨대, 대상에서의 증상이 완전히 없어질 수 있다. 상기 예방은 또한 대상에서의 증상의 발생이 본 발명이 없으면 발생했을 것보다 적은 것과 같은, 부분적일 수 있다.

일 구체예에 있어서, HGF 이형체들 또는 상기 HGF 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 대상의 맥관 구조(vasvulature) 또는 심장, 예컨대, 손상된 혈관, 부분적으로 또는 전체적으로 차단된 동맥, 허혈성 심근 조직, 심막강(pericardial space), 또는 관상 정동맥(coronary sinus)으로 투여된다.

HGF 이형체들 또는 상기 HGF 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 본 기술분야에 알려진 임의의 수단을 이용하여 원하는 부위에 전달될 수 있다. 사용될 수 있는 전달 장치의 예에는 카테터(예컨대, 풍선 카테터, 주입 카테터, 스틸레토(stiletto) 카테터), 바늘, 바늘이 없는 주사기, 스텐트, 주입 캐뉼러(cannula), 메쉬, 심장 하네스(harness), 션트(shunt), 심장 박동기(cardiac pacemakers), 삽입형 제세동기(implantable defibrillator), 봉합(suture), 스테이플(staple), 혈관주위 랩(perivascular wrap), 상처 부위, 채널링 장치, 이식편(graft), 및 펌프의 윤곽(contour)에 상당히 일치할 수 있는 유연성 시트(pliable sheets) 또는 막이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. HGF 이형체들의 전달 방법의 특정 예에는 관상 정동맥(coronary sinus)(예컨대, 대심장정맥, 중심장정맥, 좌심실의 후정맥 또는 전심실 정맥(anterior interventricular vein) 또는 이들의 곁가지 중 하나)으로 흘러가는 정맥 내에 위치하는 풍선 카테터를 통한 전달; 그 부위에서 팽창되거나 카테터의 끝으로부터 주입되는 풍선 상에 HGF 이형체들이 코팅된, 하나 이상의 관상 동맥(예컨대, 우 또는 좌 관상동맥)의 루멘으로 안내되는 카테터를 통한 전달; 개심술(open heart surgery) 또는 (예컨대, 좌 또는 우심방 또는 좌 또는 우심실로의) 심장 이식 중 바늘을 통한 전달; 좌심방, 우심실 또는 좌심실을 통한 내부 도입을 이용하거나, 또는 주사, 도자법(catheterization), 레이저-형성 관류 채널의 생성, 캐뉼러 삽입(cannulization), 입자총(particle gun)의 사용 또는 펌프의 사용에 의해 달성되는 개흉수술(open chest procedure), 최소 침습 수술(minimally invasive surgery) 또는 경피적 도입을 이용한, 심막강으로의 전달; 혈액을 조직으로 전달하는 도관 내에 위치한 카테터로부터의 선행성 관류(anterograde perfusion)에 의한 전달 또는 조직으로부터 혈액을 받는 도관 내에 위치한 카테터로부터의 후행성 관류(retrograde perfusion)에 의한 전달; 또는 혈관 개통성(vascular patency)을 유지하기 위한 내강 장치(intraluminal device) 또는 혈관내 보형물(prosthesis)(예컨대, 스텐트, 이식편, 스텐트-이식편, 하대정맥 필터(vena cava filter))을 통한 전달이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에 있어서, 상기 장치는 더 이상 필요하지 않게 된 이후에 제거될 필요가 없게 하기 위하여 생분해된다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 두 가지 HGF 이형체들은 스텐트를 이용하여 전달된다. 추가의 구체예에 있어서, 상기 스텐트는 비중합체 기반의 스테인레스 스틸 스텐트, 중합체 기반의 스테인레스 스틸 스텐트, 비중합체 기반의 코발트 크롬 스텐트 및 중합체 기반의 코발트 크롬 스텐트로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

일 구체예에 있어서, 상기 HGF 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며 HGF 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 형태로 전달된다. 상기 세포는 자가조직(autologous) 또는 비-자가조직(예컨대, 동종이계(aloogeneic) 또는 이종(xenogeneic)) 세포일 수 있다. 예를 들어, 섬유아세포, 심근세포, 내피세포 또는 줄기세포(예컨대, 배아줄기세포, 조혈모 줄기세포, 간엽 줄기세포)를 포함하는, 이식 후 생존가능한 임의의 세포가 사용될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포는, 예컨대, 손상된 심근으로 또는 정맥 내로주사를 위하여, 주사가능한 액상 현탁액 제제로 도입될 수 있다. 세포는 흉터 형성 정도를 감소시키고, 심실 기능을 증대시키기 위하여 경색 영역(infarct zone)으로 도입될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드가 생체 외(ex vivo) 세포로 도입될 때, 상기 세포는 생체검사, 스크래핑 및 외과적 조직 제거를 포함하는 본 기술분야에 알려진 임의의 기술에 의해 대상으로부터 수득될 수 있다. 상기 분리된 세포는 폴리뉴클레오타이드가 세포 내로 도입되기에 충분한 시간, 예컨대, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36, 48 시간 이상 동안 배양될 수 있다. 짧은 시간 동안 일차 세포를 배양하는 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 세포를 부착하거나 현탁시켜 플레이트(예컨대, 마이크로웰 플레이트)에서 배양할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 세포 내 폴리뉴클레오타이드가 존재하는지 여부는 세포를 다시 대상에게 도입하기 전에 결정된다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 세포가 선별되고(예컨대, 폴리뉴클레오타이드 내의 선별 마커의 존재에 기초하여), 상기 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 세포들만이 대상 내로 재도입된다.

HGF 이형체들 또는 상기 HGF 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 주사에 의해 전달될 때, 상기 주사는 심장내 주사(intracardiac injection), 예컨대, 심방내(intraatrial)(좌 및/또는 우) 또는 심실내(intraventricular)(좌 및/또는 우) 주사일 수 있다. 상기 주사는 또한 심근내 주사(intramyocardial injection)일 수 있다. 주사 부위는 허혈성/저산소성 영역 또는 근처, 정상 조직 및 허혈성/저산소성 영역의 경계, 또는 정상 조직 내일 수 있다. 주사 부위는 하나 이상의 관상동맥, 예컨대 폐색된 관상 동맥의 부위일 수 있다. 주사는 심외막(transepicardial) 또는 심내막(transendocardial) 주사일 수 있다. 전달은 하나 이상의 부위에 한 번의 주사 또는 다수의 주사로 이루어질 수 있다. 전달은 심막내(intrapericardial) 주사에 의해 수행될 수 있다. 혈관 부위로의 전달은 혈관내 주사, 예컨대, 정맥내 또는 동맥내(관상동맥내, 대동맥내) 주사에 의할 수 있다. 적어도 2개의 관상동맥, 예컨대, 적어도 하나의 좌 및 하나의 우 관상동맥으로, 예컨대 관상동맥의 루멘으로 적어도 약 1 ㎝ 부위에 전달될 수 있다. 혈관 주사는, 예를 들어, 허혈성 조직이나 병에 걸린 조직 부근의 부위, 혈관 손상의 부위, 또는 협착증 부위에 수행될 수 있다.

HGF 이형체들의 투여는, 예컨대, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 이상의 간격 후에, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10주 이상의 간격 후에 일 회를 초과하여 반복될 수 있다. 일 구체예에 있어서, HGF 이형체들을 각각 투여한 후, 대상의 심장 관류 상태 또는 혈관 건강을, 예컨대, 혈관촬영도(angiogram), 심전도(electrocardiogram), 심초음파도(echocardiogram) 또는 기타 과정에 의해 추적관찰하며, 필요한 경우 추가로 투여한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, HGF의 둘 이상의 이형체들은 현재 허혈 사례(ischemic event)를 겪고 있는 대상에게 투여된다. 또 다른 구체예에 있어서, HGF의 둘 이상의 이형체들은 허혈 사례가 발생한 후 가능한 한 빨리, 예컨대, 허혈성 사례의 0.5, 1, 2, 3, 4,5, 6, 12, 18, 24, 36, 48 또는 72시간 내에 투여된다.

상기 HGF의 둘 이상의 이형체들은 치료적 유효 투여량, 예컨대, 대상의 심장 및/또는 혈관 상태에 주목할만한 개선, 예컨대, 허혈성 심장 조직의 관류의 증가, 허혈성 심장 조직에서의 혈관 밀도의 증가, 허혈성 심장 조직에서의 섬유증(fibrosis)의 감소, 혈관 손상 범위의 감소, 내피세포화의 증가 등을 야기하는 투여량으로 투여된다. 상기 유효 투여량은 질환의 정도 및/또는 내피세포화의 필요성, 선택된 투여경로, 나이, 성별 및 각 대상의 체중, 대상의 건강 상태, 및 대상의 증상의 심각도에 따라 대상마다 달라질 것이며, 단일 투여량 또는 개별 투여량으로 투여될 수 있다. 따라서, 상기 일일 투여량은 어떤 방식으로든 본 발명의 범주는 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 예를 들어, 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들이 단백질로서 투여될 때, 치료적 유효 투여량은 각 단백질의 약 1 ㎍ 내지 약 100 ㎎, 예컨대, 약 10 ㎍ 내지 약 10 ㎎의 범위일 수 있다. 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들이 폴리뉴클레오타이드로서 투여될 때, 치료적 유효 투여량은 약 1 ㎍ 내지 약 10 ㎎, 예컨대, 5 ㎍ 내지 약 5 ㎎, 예컨대, 약 10 ㎍ 내지 약 2 ㎎, 100 ㎍ 내지 약 1 ㎎의 범위일 수 있다. 상기 HGF 이형체의 투여가 일 회를 초과하여 반복될 때, 투여량은 매회 동일하거나 다를 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 방법은 심장 및/또는 혈관 질환을 치료하는데 효과적인 것으로 알려진 추가의 치료제 또는 과정(예컨대, 혈관성형술)을 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 치료제의 예에는 혈관신생 촉진제(예컨대, 혈관 내피 성장인자, 산화질소 방출 또는 생성제, 섬유아세포 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 인터루킨-6, 단핵세포 주화성 단백질-1(monocyte chemotactic protein-1), 과립구-대식세포 군락 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor), 전환성장인자-β(transforming growth factor-β), 항혈전제제(anti-thrombotic agent)(예컨대, 아스피린, 헤파린 PPACK, 에녹사파린(enoxaparin), 히루딘), 항응고제, 항생제, 항혈소판제, 혈전용해제(thrombolytics)(예컨대, 조직 플라스미노겐 활성제), 항증식제, 항염증제, 비대증(hyperplasia)을 억제하는 제제, 재협착증을 억제하는 제제, 평활근 세포 억제제, 성장인자, 성장인자 억제제, 세포 부착 억제제, 화학치료제, 및 이의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

하기 정의가 제공되며, 본 발명의 범주 및 실행을 이해하는데 도움이 되어야 한다.

본 발명의 위한 용어 "분리된(isolated)"은 원래의 환경(자연적으로 존재하는 환경)으로부터 제거된 생물학적 물질(세포, 핵산 또는 단백질)을 표시한다. 예를 들어, 식물 또는 동물 내에 자연적인 상태로 존재하는 폴리뉴클레오타이드는 분리된 것이 아니지만, 자연적으로 존재하는 인접 핵산으로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드는 "분리된" 것으로 간주된다.

"핵산", "핵산 분자", "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용되고, 단일 가닥 형태나 이중 가닥 나선(helix)으로의 리보뉴클레오사이드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오사이드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티민 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 인산 에스테르의 중합체 형태 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 및 티오에스테르와 같은 이의 임의의 인산 에스테르 유사체를 지칭한다. 이중 나선 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선이 가능하다. 용어 핵산 분자, 및 특히 DNA 또는 RNA 분자는 상기 분자의 일차 및 이차 구조만을 지칭하며 어느 특정 삼차 형태에 제한하지는 않는다. 따라서, 이 용어는 그 중에서도 선형 또는 환형 DNA 분자(예컨대, 제한효소 단편), 플라스미드, 초나선형(supercoiled) DNA 및 염색체로 발견되는 이중 가닥 DNA를 포함한다. 특정 이중 가닥 DNA 분자의 구조를 논할 때, 서열을 전사되지 않은 DNA 가닥(즉, mRNA에 일치하는 서열을 갖는 가닥)을 따라 5'에서 3' 방향으로만 제시하는 일반적인 규약에 따라 본 명세서에 서열이 기술될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 거친 DNA 분자이다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA 및 반합성 DNA를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

폴리뉴클레오타이드 서열들에 적용되는 용어 "단편(fragment)"은 언급한 핵산에 비해 길이가 감소된 핵산 서열을 지칭하며, 상기 언급된 핵산과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 공통 부분 이상 포함한다. 이러한 본 발명에 따른 핵산 단편은, 적절한 경우, 구성성분으로서 보다 큰 폴리뉴클레오타이드 내에 포함될 수 있다. 이러한 단편들은 본 발명에 따른 핵산의 적어도 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 범위의 길이의 올리고뉴클레오타이드를 포함하거나, 그렇지 않으면 구성한다.

"유전자"는 전사에 의해서만 생성되는 기능성 분자(예컨대, 생활성 RNA종) 또는 전사 및 번역에 의해 생성되는 기능성 분자(예컨대, 폴리펩타이드)를 포함하는 기능성 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 상기 용어 "유전자"는 cDNA 및 게놈 DNA 핵산을 포함한다. "유전자"는 암호화 영역에 선행하는 조절 서열(5'-비암호화 서열) 및 후행하는 조절 서열(3'-비암호화 서열)을 포함하는, 특정 RNA, 단백질 또는 폴리펩타이드를 발현하는 핵산 단편을 지칭하기도 한다. "천연형(native) 유전자"는 자기 자신의 조절 서열을 갖는, 자연에서 발견되는 유전자를 지칭한다. "키메릭 유전자"는 자연에서는 함께 발견되지 않는 조절 및/또는 암호화 서열을 포함하는, 천연 유전자가 아닌 임의의 유전자를 지칭한다. 따라서, 키메릭 유전자는 다른 공급원으로부터 유래된 조절 서열 및 암호화 서열을 포함하거나, 동일 공급원으로부터 유래되었지만, 자연에서 발견되는 것과는 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 암호화 서열을 포함할 수 있다. 키메릭 유전자는 다른 공급원으로부터 유래된 암호화 서열 및/또는 다른 공급원으로부터 유래된 조절 서열을 포함할 수 있다. "내생적(endogenous) 유전자"는 생물의 게놈 내에 원래의 위치에 있는 천연형 유전자를 지칭한다. "외래(foreign)" 유전자 또는 "이종(heterologous)" 유전자는 정상적으로는 숙주 생물에서 발견되지 않지만, 유전자 전달에 의해 숙주 생물로 전달된 유전자를 지칭한다. 외래 유전자는 비천연형 생물 내로 삽입된 천연형 유전자, 또는 키메릭 유전자를 포함할 수 있다. "이식 유전자(transgene)"는 유전자 전달 과정에 의해 세포 내로 도입된 유전자이다.

"이종 DNA"는 세포 내 또는 세포의 염색체 부위에 자연적으로 위치하지 않는 DNA를 지칭한다. 상기 이종 DNA는 세포에 이질적인 유전자를 포함할 수 있다.

용어 "게놈"은 미토콘드리아, 염색체 및 바이러스 DNA 또는 RNA 뿐만 아니라 염색체 DNA 또는 RNA를 포함한다.

단일 가닥 형태의 핵산 분자가 적절한 온도 및 용액 이온 강도의 조건하에서 다른 핵산 분자에 결합할 수 있을 때, 핵산 분자가 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA와 같은 또 다른 핵산 분자에 "혼성화"될 수 있다. 혼성화 및 세척 조건은 널리 공지되어 있으며 Sambrook et al . in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), ㅌ트특히 11장 및 표 11.1(본 명세서에 참조로 통합되어 있음)에 예시되어 있다. 온도 및 이온 강도 조건이 혼성화의 "엄격성(stringency)"를 결정한다.

엄격성 조건은 관련성이 먼 생물로부터의 상동 서열과 같이 적당히 유사한 단편들 내지 관련성이 가까운 생물로부터의 기능성 효소들을 복제하는 유전자와 같이 매우 유사한 단편들을 선별하기 위해 조정될 수 있다. 상동 핵산들을 예비 선별하는 경우, 55℃의 녹는점(Tm)에 해당되는 엄격성이 낮은 혼성화 조건, 예컨대, 5X SSC, 0.1% SDS, 0.25% 우유, 및 포름아마이드 없음; 또는 30% 포름아마이드, 5X SSC, 0.5% SDS가 사용될 수 있다. 보통의 엄격성 혼성화 조건은 높은 녹는점에 해당하며, 예컨대 5X 또는 6X SSC를 갖는 40% 포름아마이드에 해당한다. 높은 엄격성 혼성화 조건은 가장 높은 녹는점, 예컨대 50% 포름아마이드, 5X 또는 6X SSC에 해당한다.

혼성화 염격성에 따라 염기 사이에 불일치(mismatch)가 가능함에도 불구하고, 혼성화는 두 개의 핵산이 상보적인 서열을 함유할 것을 요구한다. 용어 "상보적인(complementary)"은 서로 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 염기들 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들어, DNA와 관련하여, 아데노신은 티민에 상보적이고 사이토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 명세서에 개시되거나 사용된 전체 서열들에 상보적인 분리된 핵산 단편들뿐만 아니라 실질적으로 유사한 핵산 서열들도 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 55℃의 녹는점에서의 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 이용하고 상기 언급한 조건을 이용함으로써 검출된다. 다른 구체예에 있어서, 상기 녹는점은 60℃, 63℃ 또는 65℃이다.

혼성화 후 세척 역시 엄격성 조건을 결정한다. 한가지 세트의 조건은 6X SSC, 0.5% SDS로 상온에서 15분간 시작한 다음, 2X SSC, 0.5% SDS로 45℃에서 30분간 반복하고 나서, 0.2X SSC, 0.5% SDS로 50℃에서 30분간 2회 반복하는 일련의 세척과정을 이용한다. 엄격한 조건의 바람직한 세트는 보다 높은 온도를 이용하는데, 2X SSC, 0.5% SDS에서 마지막 2회의 30분간의 세척 온도가 60℃로 상승된 것을 제외하고는 상기와 동일하게 세척한다. 매우 엄격한 조건의 또 다른 바람직한 세트는 0.1X SSC, 0.1% SDS에서 65℃에서 마지막 2회의 세척을 이용한다.

핵산을 혼성화시키기 위한 적절한 엄격성은 핵산의 길이 및 상보성 정도와 같은 본 기술분야에 널리 알려진 변수들에 의해 달라진다. 두 개의 뉴클레오타이드 서열간의 유사성 또는 상동성 정도가 크면 클수록 상기 서열을 갖는 핵산의 혼성체에 대한 녹는점 수치가 높아진다. 핵산 혼성화의 상대적 안정성(더 높은 녹는점에 해당)은 다음 순서로 감소한다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100개의 뉴클레오타이드보다 큰 혼성체의 경우, 녹는점을 계산하기 위한 방정식이 도출되었다(Sambrook et al ., supra, 9.50-0.51 참조). 보다 짧은 핵산, 즉 올리고뉴클레오타이드의 혼성화의 경우, 불일치 위치가 보다 중요하게 되고, 상기 올리고뉴클레오타이드의 길이가 그 특이성을 결정한다(Sambrook et al ., supra, 11.7-11.8 참조).

본 발명의 일 구체예에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 500 mM 미만의 염 및 적어도 37℃에서의 혼성화 단계 및 적어도 63℃의 온도에서 2X SSPE에서의 세척 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하여 검출된다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 혼성화 조건은 혼성화 단계를 위한 200 mM 미만의 염 및 적어도 37℃를 포함한다. 추가의 구체예에 있어서, 상기 혼성화 조건은 혼성화 및 세척 단계 모두의 경우 2X SSPE 및 63℃를 포함한다.

또 다른 구체예에 있어서, 혼성화될 수 있는 핵산의 길이는 적어도 약 10개의 뉴클레오타이드이다. 바람직하게는, 혼성화될 수 있는 핵산의 최소 길이는 적어도 약 15개의 뉴클레오타이드; 예컨대, 적어도 약 20개의 뉴클레오타이드; 예컨대 적어도 30개의 뉴클레오타이드이다. 나아가, 숙련된 당업자라면 상기 온도 및 세척 용액 염 농도가 프로브의 길이와 같은 인자들에 따라 필요한 경우 조절될 수 있음을 인식할 것이다.

용어 "프로브"는 상보적인 단일 가닥의 표적 핵산과 염기쌍을 이루어 이중 가닥의 분자를 형성할 수 있는 단일 가닥의 핵산 분자를 지칭한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 게놈 DNA 분자, cDNA 분자, 플라스미드 DNA 또는 mRNA 분자에 혼성화될 수 있는 짧은 핵산을 지칭한다. 올리고뉴클레오타이드는, 예컨대, 바이오틴과 같은 표지(label)가 공유 결합된 ³²P-뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드로 표지화될 수 있다. 표지된 올리고뉴클레오타이드는 핵산의 존재를 검출하는 프로브로 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드(이 중 하나 또는 모두가 표지화될 수 있음)는 핵산의 전장 또는 단편을 클로닝하기 위해, DNA 서열분석을 위해, 또는 핵산의 존재를 검출하기 위해, PCR 프라이머로 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 DNA 분자와 삼중 나선(triple helix)을 형성하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드는 합성적으로, 바람직하게는 핵산 합성기 상에서 제조된다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드는 티오에스테르 결합 등과 같은 비-자연적으로 발생하는 포스포에스테르 유사체 결합을 이용하여 제조될 수 있다.

"프라이머"는 표적 핵산과 혼성화하여 적절한 조건하에서 DNA 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있는 이중 가닥의 핵산 영역을 형성하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 이러한 프라이머들은 중합효소 연쇄반응에서 사용되거나 DNA 서열분석을 위해 사용될 수 있다.

"중합효소 연쇄 반응"은 PCR로 축약되며 특정 핵산 서열을 효소적으로 증폭시키는 시험관 내(in vitro) 방법을 지칭한다. PCR은 세 가지 단계: 표적 분자의 가닥을 분리시키기 위한 주형 핵산의 변성(denaturation), 단일 가닥의 PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 상기 주형 핵산에 결합시키는 것(annealing), 및 상기 결합된 프라이머의 DNA 중합효소에 의한 확장(extension)을 포함하는 각 싸이클을 갖는, 반복된 일련의 온도 싸이클을 포함한다. PCR은 표적 분자의 존재를 검출하는 수단 및 정량적 또는 반정량적 조건하에서 이용가능한 핵산 내에서의 표적 분자의 상대적 양을 결정하기 위한 수단을 제공한다.

"역전사-중합효소 연쇄 반응"은 RT-PCR로 축약되며 RNA 분자 또는 분자들로부터 표적 cDNA 분자 또는 분자들을 효소적으로 생성한 다음, 상기 기술된 바와 같이 상기 표적 cDNA 분자 또는 분자들 내의 특정 핵산 서열 및 서열들을 효소적으로 증폭시키는 시험관 내(in vitro) 방법을 지칭한다. RT-PCR은 또한 상기 표적 분자의 존재를 검출하고, 정량적 또는 반정량적 조건하에서 이용가능한 핵산 내 표적 분자의 상대적 양을 결정하기 위한 수단을 제공한다.

DNA "암호화 서열"은 폴리펩타이드를 암호화하고 적절한 조절 서열의 통제하에 놓여졌을 때 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo) 세포에서 폴리펩타이드로 전사 및 번역될 수 있는 이중 가닥 DNA 서열을 지칭한다. "적절한 조절 서열"은 암호화 서열의 상류(5' 비암호화 서열), 내부, 또는 하류(3' 비암호화 서열)에 위치하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭하며, 이는 연관된 암호화 서열의 전사, RNA 가공 또는 안정성 또는 번역에 영향을 미친다. 조절 서열에는 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐레이션 인식 서열, RNA 가공 부위, 작동자(effector) 결합부위 및 줄기-루프(stem-loop) 구조가 포함될 수 있다. 상기 암호화 서열의 경계는 5'(아미노) 말단의 개시 코돈 및 3'(카르복실) 말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 암호화 서열은 원핵 서열, mRNA로부터의 cDNA, 게놈 DNA 서열 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 만약 상기 암호화 서열을 진핵 세포에서 발현시키고자 한다면, 폴리아데닐레이션 신호 및 전사 종결 서열이 일반적으로 상기 암호화 서열의 3'쪽에 위치할 것이다.

"오픈 리딩 프레임(Open reading frame)"은 ORF로 축약되며, ATG 또는 AUG와 같은 번역 출발 또는 개시 코돈 및 종결 코돈을 포함하고 잠재적으로 폴리뉴클레오타이드 서열로 번역될 수 있는 길이의 핵산 서열, DNA ,cDNA 또는 RNA를 지칭한다.

용어 "하류(downstream)"는 언급된 핵산 서열에서 3'쪽에 위치한 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 특히, 하류 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 전사 출발점에 후행하는 서열에 관한 것이다. 예를 들어, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사의 출발 부위의 하류에 위치한다.

용어 "상류(upstream)"는 언급된 핵산 서열의 5'쪽에 위치하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 특히, 상류 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 암호화 서열 또는 전사 출발점의 5'쪽에 위치한 서열에 관한 것이다. 예를 들어, 대부분의 프로모터들은 전사 출발 부위의 상류에 위치한다.

"동종 재조합(homologous recombination)"은 또 다른 DNA 분자 내로의 외래 DNA 서열의 삽입, 예컨대 염색체 내에서의 벡터의 삽입을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 벡터는 동종 재조합을 위한 특정 염색체 부위를 표적으로 한다. 특정 동종 재조합의 경우, 상기 벡터는 염색체 서열에 상동성이 있는 충분히 긴 영역을 함유하여 상보적 결합 및 염색체 내로의 벡터의 혼입을 가능하게 할 것이다. 상동성 있는 영역이 길면 길수록, 서열 유사성 정도가 커져 동종 재조합 효율을 증가시킬 수 있다.

"벡터"는 핵산의 클로닝 및/또는 숙주 세포로의 전달을 위한 임의의 운반체를 지칭한다. 벡터는 부착된 절편을 증폭시키기 위하여 또 다른 DNA 절편이 부착된 레플리콘(replicon)일 수 있다. "레플리콘"은 생체 내(in vivo) DNA 복제의 자율 단위로 작용할 수 있는, 즉 그 자신의 통제 하에 복제를 할 수 있는, 임의의 유전 요소(예컨대, 플라스미드, 파아지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 지칭한다. 용어 "벡터"는 핵산을 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo) 세포로 도입하기 위한 바이러스성 운반체 뿐만 아니라 비바이러스성 운반체 모두를 포함한다. 본 기술분야에서 알려진 상당수의 벡터들이 핵산을 조작하고, 반응 요소(response element) 및 프로모터를 유전자로 혼입하는 등에 사용될 수 있다. 바람직한 벡터에는, 예를 들어, 플라스미드 또는, 예를 들어 아데노바이러스, 레트로바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체 또는 블루스크립트(Bluescript) 벡터와 같은 플라스미드를 포함하는 변형된 바이러스를 포함한다. 예를 들어, 반응 요소 및 프로모터에 해당하는 DNA 단편의 적절한 벡터로의 삽입은, 상기 적절한 DNA 단편을 상보적인 접착말단(cohesive termini)을 갖는 선택된 벡터와 결합시킴으로써 달성될 수 있다. 그렇지 않으면, DNA 분자의 말단이 효소적으로 변형될 수 있거나, 또는 뉴클레오타이드 서열(링커)를 DNA 말단과 결합시킴으로써 임의의 부위가 생성될 수 있다. 그러한 벡터들은 세포 게놈으로 마커를 혼입한 세포를 선별하기 위한 선별 마커 유전자를 함유하도록 조작될 수 있다. 그러한 마커들은 마커에 의해 암호화된 단백질을 혼입하여 발현하는 숙주 세포를 확인 및/또는 선별할 수 있게 한다.

바이러스 벡터는 살아있는 동물 대상 뿐만 아니라 세포에서의 광범위한 유전자 전달 적용 분야에 사용되어 왔다. 사용될 수 있는 바이러스 벡터들은 아데노바이러스, 레트로바이러스, 백시나(vaccinia) 바이러스, 수두바이러스(poxvirus), 아데노 관련 바이러스, 단순포진바이러스(herpes simplex virus), 렌티바이러스(lentivirus), 배큘로바이러스(baculovirus), 센다이 바이러스(sendai virus), 홍역 바이러스(measles virus), 시미안 바이러스(simian virus) 40 및 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 비-바이러스성 벡터는 플라스미드, 리포플렉스(lipoplex)(양이온 리포좀-DNA 복합체), 폴리플렉스(polyplex)(양이온 중합체-DNA 복합체) 및 단백질-DNA 복합체를 포함한다. 핵산 이외에, 벡터는 핵산 전달 결과(조직으로의 전달, 발현 지속성 등)를 선별, 측정 및 추적관찰하는데 유용한 하나 이상의 조절 영역 및/또는 선별 마커를 포함할 수 있다.

용어 "플라스미드"는 종종 세포의 중심 대사(central metabolism)의 일부가 아닌 유전자를 갖는 염색체 밖의 요소를 지칭하며, 일반적으로 환형 이중 가닥의 DNA 분자의 형태이다. 그러한 요소들은 임의의 공급원으로부터 유래한 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의, 자가 복제(autologous replicating) 서열, 게놈 삽입(genome integrating) 서열, 파아지 또는 뉴클레오타이드 서열, 선형, 환형 또는 초나선형일 수 있으며, 여기에 수많은 뉴클레오타이드 서열들이 결합되거나 재조합되어, 프로모터 단편 및 선택된 유전자 생성물용 DNA 서열을 적절한 3' 비번역된 서열과 함께 세포 내로 도입시킬 수 있는 독특한 구조체를 형성한다.

"클로닝 벡터"는 플라스미드, 파아지 또는 코스미드와 같이, 연속적으로 복제하며 복제 원점을 포함하는, 단위 길이의 핵산, 바람직하게는 DNA인 "레플리콘"을 지칭하며, 여기에 부착된 절편을 복제시키기 위하여 또 다른 핵산 절편이 부착될 수 있다. 클로닝 벡터는 하나의 세포형에서 복제할 수 있고 또 다른 세포형에서 발현할 수 있다("셔틀 벡터"). 클로닝 벡터는 상기 벡터를 포함하는 세포를 선별하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 서열 및/또는 원하는 서열의 삽입을 위한 복수 클로닝 부위(multiple cloning site)를 포함할 수 있다.

용어 "발현 벡터"는 삽입된 핵산 서열을 발현한 후 숙주를 형질전환시킬 수 있도록 고안된 벡터, 플라스미드 또는 운반체를 지칭한다. 클론된 유전자, 즉, 삽입된 핵산 서열은 일반적으로 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서 등과 같은 조절 요소의 통제 하에 놓여진다. 원하는 숙주 세포에서의 핵산의 발현을 유도하는데 유용한 개시 조절 영역 또는 프로모터들은 무수히 많으며 본 기술분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있다. 실질적으로 이들 유전자들의 발현을 유도할 수 있는 임의의 프로모터는 바이러스 프로모터, 박테리아 프로모터, 동물 프로모터, 포유동물 프로모터, 합성 프로모터, 구성 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 발병(pathogenesis) 또는 질병 관련 프로모터, 발생 특이적 프로모터(developmental specific promoter), 유도성 프로모터(inducible promoter), 약하게 조절된 프로모터(light regulated promoter)를 포함하나, 이에 제한되지는 않으며; SV40 초기(SV40) 프로모터 영역, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV)의 3' 긴 말단 반복(LTR)에 함유된 프로모터, 아데노바이러스(Ad)의 E1A 또는 주요 후기 프로모터(major late promoter, MLP), 인간 사이토메갈로바이러스(human cytomegalovirus, HCMV) 즉시 초기 프로모터(immediate early promoter), 단순 포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나아제(TK) 프로모터, 배큘로바이러스 IE1 프로모터, 신장 인자(elongation factor) 1 알파(EF1) 프로모터, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GSPDH) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 유비퀴틴 C(Ubc) 프로모터, 알부민 프로모터, 마우스 메탈로티오네인(metallothionein)-L 프로모터 및 전사 조절 영역의 조절 서열, 유비쿼터스 프로모터(HPRT, 비멘틴(vimentin), β-액틴, 튜불린 등), 중간필라멘트(intermediate filament)(데스민(desmin), 신경미세섬유, 케라틴, GFAP 등), 치료 유전자의 프로모터(MDR, CFTR 또는 인자 VIII 형태 등의), 발병 또는 질병 관련 프로모터, 및 췌장 선방세포(pancreatic acinar cell)에서 활성인 엘라스타제(elastase) I 유전자 조절 영역과 같은, 조직 특이성을 나타내며 형질전환 동물에서 이용되어 온 프로모터; 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역, 림프계(lymphoid) 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역, 고환, 유방, 림프계 및 대식 세포에서 활성인 마우스 유방암 바이러스 조절 영역; 간에서 활성인 알부민 유전자, Apo AI 및 Apo AII 조절 영역, 간에서 활성인 알파-태아단백질(fetoprotein) 유전자 조절 영역, 간에서 활성인 알파1-안티트립신 유전자 조절 영역, 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 조절 영역, 뇌에서의 희소돌기아교세포(oligodendrocyte cell)에서 활성인 마이엘린 염기성 단백질(myelin basic protein) 조절 영역, 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역 및 시상하부에서 활성인 생식선자극호르몬 방출 호르몬(gonadotropic releasing hormone), 피루브산 키나아제 프로모터, 빌린(villin) 프로모터, 지방산 결합 장내 단백질의 프로모터, 평활근 세포 β-액틴의 프로모터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 제조된 발현 벡터는 그 후 약제학적 조성물의 형태로 대상에 투여된다. HGF의 둘 이상의 이형체들은 분리되어 투여될 수 있는데, 연속적으로 또는 동시에, 즉 병용 투여될 수 있고; 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들에 대한 각각의 플라스미드가 투여되거나 병용투여되거나, 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들에 대한 유전자를 함유하고 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들에 대한 유전자를 발현할 수 있는 단일 발현 플라스미드가 투여될 수 있다. 예를 들어, 두 가지 이형체 flHGF 및 dHGF가 두개의 별도의 플라스미드를 이용하여 투여될 수 있다. 그 대신에, flHGF 및 dHGF에 대한 유전자를 함유하는 두 가지 별도의 플라스미드가 병용 투여를 위해 사용될 수 있다. 마지막으로, flHGF 및 dHGF 모두에 대한 유전자를 함유하는 단일 발현 플라스미드가 투여될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에 있어서, 단일 발현 플라스미드 상의 flHGF 및 dHGF는 동일한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되거나 개별적인 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다. 단일 플라스미드 상에 HGF 이형체를 발현할 수 있는 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 수많은 접근법이 있다. 이들은, 예를 들어, 내부 리보좀 도입 부위(Internal Ribosome Entry Site, IRES) 서열, 이중 프로모터/발현 카세트 및 융합 단백질의 사용을 포함한다. 상기에서 논의한 바와 같이, 동일한 플라스미드로부터 발현되거나 두 개의 개별적인 플라스미드 상에서 발현된 둘 이상의 이형체들은 flHGF, dHGF, NK1 및 NK2로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 서열번호 2-5 및 11-12로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 상기 둘 이상의 이형체들은 본 기술분야의 숙련자에게 알려진 추가의 HGF 이형체들을 포함할 수도 있다.

벡터는 본 기술분야에서 알려진 방법, 예컨대, 주사, 형질감염, 전기천공법, 미세주사(microinjection), 형질도입, 세포 융합, 리포펙션(lipofection), 유전자 총의 사용 또는 DNA 벡터 전달체(DNA vector transporter)에 의하여, 원하는 숙주 세포로 도입될 수 있다(e.g., Wu et al., J. Biol . Chem . 267:963 (1992); Wu et al ., J. Biol . Chem . 263:14621 (1988); and Hartmut et al ., Canadian Patent Application No. 2,012,311, 참조).

본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 리포펙션에 의해 생체 내에서 도입될 수 있다. 과거 수십년 동안, 시험관 내(in vitro) 핵산의 캡슐화 및 형질감염을 위해 리포좀의 사용이 증가해왔다. 리포좀-매개 형질감염이 맞닥뜨린 어려움과 위험을 제한하고자 고안된 합성 양이온성 지질(synthetic cationic lipid)이 유전자의 생체 내(in vivo) 형질감염을 위한 리포좀을 제조하는데 사용될 수 있다(Felgner et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA . 84:7413 (1987); Mackey et al ., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 85:8027 (1988); 및 Ulmer et al ., Science 259:1745 (1993)). 양이온성 지질의 사용은 음성 전하를 띠는 핵산의 캡슐화를 촉진할 수 있고, 또한 음성 전하를 띠는 세포막과의 융합을 촉진할 수 있다(Felgner et al ., Science 337:387 (1989)). 핵산의 전달을 위한 특히 유용한 지질 화합물 및 조성물이 WO95/18863, WO96/17823 및 U.S. 5,459,127에 기술되어 있다. 외인성(exogenous) 유전자를 생체 내(in vivo) 특정 조직 내로 도입하기 위한 리포펙션의 사용은 몇 가지 실용적인 장점이 있다. 리포좀의 특정 세포로의 분자 표적화는 한가지 영역의 이점을 제시한다. 특정 세포형으로의 직접적인 형질감염이, 췌장, 간, 신장 및 뇌와 같이 세포 이질성을 갖는 조직에 특히 바람직할 것임이 분명하다. 지질은 표적화를 위해 다른 분자들과 화학적으로 결합할 수 있다(Mackey et al . 1988). 표적화된 펩타이드, 예컨대, 호르몬 또는 신경전달물질, 및 항체와 같은 단백질, 또는 비-펩타이드성 분자가 화학적으로 리포좀에 결합될 수 있다.

양이온성 올리고펩타이드(예컨대, WO95/21931), DNA 결합 단백질로부터 유래된 펩타이드(예컨대, WO96/25508), 또는 양이온성 중합체(예컨대, WO95/21931)와 같은, 다른 분자들이 또한 생체 내 핵산의 형질감염을 용이하게 하는데 유용하다.

생체 내(in vivo) 벡터를 순수한(naked) DNA 플라스미드로서 도입하는 것 또한 가능하다(미국 특허번호 제5,693,622호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호 참조). 수용체-매개 DNA 전달법이 사용될 수도 있다(Curiel et al ., Hum . Gene Ther . 3:147 (1992); and Wu et al ., J. Biol . Chem . 262:4429 (1987)).

용어 "형질감염(transfection)"은 세포에 의한 외인성 또는 이종(heterologous) RNA 또는 DNA의 흡수(uptake)를 지칭한다. 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA가 세포 내부로 도입될 때, 이러한 RNA 또는 DNA에 의해 세포가 "형질감염"된다. 상기 형질감염된 RNA 또는 DNA가 표현형(phenotypic)의 변화를 가져올 때, 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA에 의해 세포는 "형질전환"된다. 상기 형질전환시키는 RNA 또는 DNA는 염색 DNA 내로 삽입(공유 결합)되어 세포의 게놈을 구성할 수 있다.

"형질전환(transformation)"은 핵산 단편을 숙주 생물 내로 전달하여 유전학적으로 안정적인 유전(inheritance)을 일으키는 것을 지칭한다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 생물은 "형질전환(transgenic)" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된(transformed)" 생물로 지칭된다.

나아가, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터는 증폭 또는 발현시키고자 하는 세포 숙주에서의 복제를 위한 하나 이상의 원점(origin), 마커 또는 선별 마커를 포함할 수 있다.

용어 "선별 마커"는 마커 유전자의 효과, 즉 항생제 저항성, 제초제 저항성, 비색(colorimetric) 마커, 효소, 형광 마커 등에 기초하여 선별될 수 있는 확인 인자, 일반적으로 항생제 또는 화학적 저항성 유전자이며, 여기서 상기 효과는 원하는 핵산의 유전을 추적 및/또는 원하는 핵산의 유전시킨 세포 또는 생물을 확인하는데 사용된다. 본 기술분야에 알려져 사용되는 선별 마커 유전자의 예에는 암피실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 히그로마이신, 비알라포스(bialaphos) 제초제, 술폰아마이드 등; 및 표현형 마커, 즉, 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 전달효소 유전자 등을 포함한다.

용어 "리포터 유전자"는 리포터 유전자의 효과에 근거하여 확인될 수 있는 확인 인자를 암호화하는 핵산을 지칭하며, 여기서 상기 효과는 원하는 핵산의 유전을 추적하고, 원하는 핵산을 유전시킨 세포 또는 생물을 확인 및/또는 유전자 발현 유도 또는 전사를 측정하는 데 사용된다. 본 기술분야에 알려져 사용되는 리포터 유전자의 예에는 루시퍼라아제(Luc), 녹색형광단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), β-갈락토시다아제(LacZ), β-글루쿠로니다아제(Gus) 등이 포함된다. 선별 마커 유전자들 역시 리포터 유전자로 고려될 수 있다.

"프로모터" 및 "프로모터 서열"은 상호교환적으로 사용되며, 암호화 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로, 암호화 서열은 프로모터 서열의 3'쪽에 위치한다. 프로모터는 그 전체가 천연형 유전자로부터 유래되거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터들로부터 유래한 상이한 요소들로 구성되거나, 합성 DNA 절편들을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터들이 상이한 조직 또는 세포형 내의 유전자, 또는 상이한 발전 단계에 있는 유전자, 또는 상이한 환경적 또는 생리적 조건에 반응하는 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 대부분의 세포형에서 대부분의 시간에 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 일반적으로 "구성(constitutive) 프로모터"로 지칭된다. 특정 세포형에서 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 "세포-특이적 프로모터" 또는 "조직-특이적 프로모터"로 지칭된다. 특정 발전 단계 또는 세포 분화에서 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 일반적으로 "발달-특이적 프로모터" 또는 "세포 분화-특이적 프로모터"로 지칭된다. 프로모터를 유도하는 제제, 생물학적 물질, 화학물질, 리간드, 빛 등에 세포가 노출되거나 이들로 처리된 다음 유도되어 유전자가 발현되게 하는 프로모터들은 일반적으로 "유도성 프로모터" 또는 "조절가능한 프로모터(regulatable promoter)"로 지칭된다. 또한, 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완벽히 나타나 있지 않기 때문에 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 인식된다.

프로모터 서열은 일반적으로 3' 말단에서 전사 개시 부위에 의해 경계를 이루고, 상류(5' 방향)로 확장되어 백그라운드 이상의 검출가능한 수준으로 전사를 개시하는데 필요한 최소한의 개수의 염기 또는 요소를 포함한다. 상기 프로모터 서열 내에는, RNA 중합효소의 결합을 책임지는 단백질 결합 도메인(공통 서열(consensus sequence) 뿐만 아니라 전사 개시 부위(예를 들어 뉴클레아제 S1을 이용한 맵핑(mapping)에 의해 간편하게 정의됨)가 발견될 것이다.

RNA 중합효소가 암호화 서열을 mRNA로 전사할 때, 암호화 서열이 세포 내 전사 및 번역 조절 서열의 "통제 하"에 있게 되며, 그리고 나서 트랜스-RNA 스플라이싱(trans-RNA splicing)되고(암호화 서열이 인트론을 함유하는 경우), 상기 암호화 서열에 의해 암호화된 단백질로 번역된다.

"전사 및 번역 조절 서열"은 프로모터, 인핸서, 종결자(terminator) 등과 같이, 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 위해 제공되는 DNA 조절 서열을 지칭한다. 진핵 세포에서, 폴리아데닐레이션 신호가 조절 서열이다.

용어 "반응 인자(response element)"는 전사인자의 DNA 결합 도메인과의 상호작용을 통해 매개되는 프로모터에 대한 반응성에 기여하는 하나 이상의 작용위치 DNA 요소(cis-acting DNA element)를 지칭한다. 이 DNA 요소는 회문식(palindromic) 서열이거나 다양한 수의 뉴클레오타이드에 의해 분리된 서열 모티프 또는 반 부위(half site)로 구성될 수 있다. 상기 반 부위는 유사하거나 동일할 수 있으며, 동향 반복(direct repeat) 또는 역 반복(inverted repeat) 또는 단일 반 부위 또는 일렬의 인접한 반 부위의 다합체(multimer)로 배열될 수 있다. 상기 반응 인자는 반응 인자가 혼입되는 세포 또는 생물의 특성에 따라 다른 생물로부터 분리된 최소한의 프로모터를 포함할 수 있다. 전사 인자의 DNA 결합 도메인은 리간드의 존재 또는 비존재시, 이 반응 요소의 조절 하에 하류 유전자의 전사를 개시 또는 억제하는 반응 인자의 DNA 서열에 결합한다.

용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 하기 위하여 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열의 회합(association)을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 암호화 서열의 발현에 영향을 줄 수 있을 때(즉, 암호화 서열이 프로모터의 전사 조절 하에 있는 것), 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 암호화 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "발현"은 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드로부터 유래한 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정적인 축적(accumulation)을 지칭한다. 발현은 mRNA의 단백질 또는 폴리펩타이드로의 번역을 지칭할 수도 있다.

용어 "카세트(cassette)", "발현 카세트" 및 "유전자 발현 카세트"는 특정 제한효소 부위에서 또는 동종 재조합에 의해 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드로 삽입될 수 있는 DNA의 절편을 지칭한다. 상기 DNA의 절편은 원하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 카세트 및 제한효소 부위는 전사 및 번역을 위한 적절한 리딩 프레임(reading frame)에서 카세트의 삽입을 보장하도록 고안된다. "형질전환 카세트"는 원하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 특정 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 폴리뉴클레오타이드 외의 요소를 갖는 특정 벡터를 지칭한다. 카세트, 발현 카세트, 유전자 발현 카세트 및 형질전환 카세트는 숙주 내 원하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 향상시키는 요소를 포함할 수도 있다. 이러한 요소들에는 프로모터, 최소한의 프로모터, 인핸서, 반응 인자, 종결자 서열, 폴리아데닐레이션 서열 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "유전자 스위치(gene swithch)"는 프로모터, 및 하나 이상의 리간드 존재시 반응인자 및 프로모터가 혼입된 유전자의 발현을 조절하는 리간드-의존성 전사인자-계열 시스템과 결합된 반응 인자의 조합을 지칭한다.

용어 "조절하는"은 핵산 또는 유전자 발현을 유도, 감소 또는 억제하여 각각 단백질 또는 폴리펩타이드 생산의 유도, 감소, 또는 억제를 야기하는 것을 의미한다.

본 발명의 구체예에 사용될 수 있는 인핸서에는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서, 신장 인자 1(EF1) 인핸서, 효소 인핸서, 바이러스 유전자 인핸서 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

종결 조절 영역, 즉 종결자 또는 폴리아데닐레이션 서열은 또한 바람직한 숙주에서 얻은 다양한 유전자로부터 유래할 수 있다. 선택적으로, 종결 부위가 불필요할 수 있지만, 포함되는 경우가 가장 바람직하다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 종결 조절 영역은 합성 서열, 합성 폴리아데닐레이션 신호, SV40 후기 폴리아데닐레이션 신호, SV40 폴리아데닐레이션 신호, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐레이션 신호, 바이러스 종결자 서열 등을 포함하거나 이로부터 유래될 수 있다.

용어 "3' 비암호화 서열(3' non-coding sequence)" 또는 "3' 비번역 영역(3' untranslated region, UTR)"은 코딩 서열의 하류 (3')에 위치한 DNA 서열을 지칭하며, 폴리아데닐레이션[poly(A)] 인식 서열 및 mRNA 가공 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 신호를 암호화하는 기타 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리아데닐레이션 신호는 일반적으로 mRNA 전구체의 3' 말단에 폴리아데닐산 계열이 첨가되는 것에 영향을 미치는 데에 특징이 있다.

"조절 영역(regulatory region)"은 2차 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 지칭한다. 조절 영역은 특정 핵산을 발현하는데 선천적으로 책임을 지고 있는 서열들(동종 영역)을 포함할 수 있으며, 상이한 단백질이나 나아가 합성 단백질을 발현하는 책임을 지고 있는 유래가 다른 서열(이종 영역)을 포함할 수 있다. 특히, 상기 서열들은 특정 또는 비특정 방식 및 유도성 또는 비유도성 방식으로 유전자의 전사를 촉진 또는 억제하는, 원핵, 진핵, 또는 바이러스 유전자의 서열 또는 이로부터 유래한 서열일 수 있다. 조절 영역은 복제 원점, RNA 스플라이스 부위, 프로모터, 인핸서, 전사 종결 서열, 및 폴리펩타이드의 표적 세포의 분비 경로로 유도하는 분비 신호를 포함한다.

"이종 공급원(heterologous source)"으로부터의 조절 영역은 발현된 핵산과 선천적으로 연관되지 않은 조절 영역을 지칭한다. 상기 이종 조절 영역 중에는 상이한 종으로부터의 조절 영역, 상이한 유전자로부터의 조절 영역, 하이브리드 조절 서열 및 자연에서는 나타나지는 않지만 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 고안된 조절 서열을 포함한다.

"RNA 전사체"는 DNA 서열의 RNA 중합효소-촉매된 전사로부터 야기된 생성물을 지칭한다. RNA 전사체가 DNA 서열의 완벽한 상보적인 복사체일 때, 이는 일차 전사체로 지칭되거나 상기 일차 전사체의 전사후 가공으로부터 유래된 RNA 서열일 수 있으며 이는 성숙한 RNA로 지칭된다. "메신저 RNA(mRNA)"는 인트론이 없으며, 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 지칭한다. "cDNA"는 mRNA에 상보적이고 mRNA로부터 유래된 이중 가닥의 DNA를 지칭한다. "센스" RNA는 mRNA를 포함하고, 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA 전사체를 지칭한다. "안티센스 RNA"는 표적 일차 전사체의 전부 또는 일부분에 상보적이고, 표적 유전자의 발현을 차단하는 RNA 전사체를 지칭한다. 안티센스 RNA의 상보성은, 즉 5' 비-암호화 서열, 3' 비-암호화 서열 또는 암호화 서열에 있는 특정 유전자 전사체의 임의의 부분으로 인한 것일 수 있다. "기능적 RNA"는 안티센스 RNA, 리보자임 RNA, 또는 번역되지는 않지만 세포 가공에 영향을 미치는 기타 RNA를 지칭한다.

"폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되고, 공유결합된 아미노산 잔기로 구성된 중합체 화합물을 지칭한다.

"분리된 폴리펩타이드", "분리된 펩타이드", 또는 "분리된 단백질"은 자연 상태에서 정상적으로 결합하는 화합물(예컨대, 다른 단백질 또는 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질)이 실질적으로 없는 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. "분리된"은 다른 화합물과의 인공적 또는 합성 혼합물을 제외하거나, 생물학적 활성을 간섭하지 않는 불순물의 존재를 제외하거나, 예를 들어 불완전한 정제, 안정제의 첨가 또는 약학적으로 허용가능한 제제로의 조제로 인해 존재할 수 있는 불순물의 존재를 제외하는 것을 의미하지는 않는다.

돌연변이는, 시험관 내(in vitro) 특정위치 돌연변이(site-directed mutagenesis)(Hutchinson et al., J. Biol . Chem . 253:6551 (1978); Zoller et al ., DNA 3:479 (1984); Oliphant et al ., Gene 44:177 (1986); Hutchinson et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 83:710 (1986)); TAB® 링커(Pharmacia)의 사용, 제한효소 엔도뉴클레아제 분해/단편 결손 및 치환, PCR-매개/올리고뉴클레오타이드-지정 돌연변이 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본 기술분야에 알려진 임의의 돌연변이 생성(mutagenesis) 기술에 의해 이루어질 수 있다. 특정위치 돌연변이 생성을 위해 PCR 기반의 기술들이 바람직하다(Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70, 참조).

폴리펩타이드 또는 단백질의 "변형체(variant)"는 폴리펩타이드 또는 단백질로부터 유래하고 상기 폴리펩타이드 또는 단백질의 적어도 하나의 생물학적 특성을 유지하고 있는 임의의 유사체, 단편, 유도체 또는 돌연변이를 지칭한다. 상기 폴리펩타이드 또는 단백질의 상이한 변형체들이 자연 내에 존재할 수 있다. 이들 변형체들은 단백질을 암호화하는 구조 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 다른 것에 특징이 있는 대립 유전자의 변이일 수 있거나, 차별적 스플라이싱 또는 번역 후 수식(modification)을 포함할 수 있다. 숙련된 당업자는 하나 또는 복수의 아미노산 치환, 결손, 부가 또는 대체를 갖는 변형체를 생성할 수 있다. 이들 변형체들은 그중에서도: (a) 하나 이상의 아미노산 잔기들이 보존적 또는 비보존적 아미노산들로 치환된 변형체, (b) 하나 이상의 아미노산이 폴리펩타이드 또는 단백질에 부가된 변형체, (c) 아미노산 중 하나 이상이 치환기를 포함하는 변형체, 및 (d) 폴리펩타이드 또는 단백질이 혈청 알부민과 같은 또 다른 폴리펩타이드와 융합된 변형체를 포함할 수 있다. 유전적(억제, 결손, 돌연변이 등), 화학적 및 효소적 기술들을 포함하는, 이러한 변형체를 수득하는 기술들이 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 알려져 있다.

용어 "상동성(homology)"은 두 개의 폴리뉴클레오타이드 또는 두 개의 폴리펩타이드 부분들간의 동일성(identity)의 백분율을 지칭한다. 한 부분 내지 다른 부분의 서열 간의 관련성(correspondence)은 본 기술분야에 알려진 기술들에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 상동성은 서열 정보를 정렬하여 그리고 즉시 이용가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리펩타이드 분자 간의 서열 정보를 직접적으로 비교함으로써 결정될 수 있다. 그렇지 않으면, 상동성은 동종 영역들 간에 안정적인 이중체(duplex)를 형성하는 조건 하에서 폴리뉴클레오타이드들을 혼성화한 후, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 이용하여 절단하고 절단된 단편들의 크기 결정에 의해 결정될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 모든 문법적 형태 및 철자 변형된 용어 "상동의"는 수퍼패밀리(예컨대, 면역글로불린 수퍼패밀리)로부터의 단백질 및 다른 종(예컨대, 미오신 경쇄 등)으로부터의 동종 단백질을 포함하는, "공통의 진화 기원(common evolutionary origin)"을 지니는 단백질 간의 관련성을 지칭한다(Reeck et al ., Cell 50:667 (1987)). 이러한 단백질(및 이들의 암호화 유전자)은 이들의 높은 서열 유사정도에 비추어 볼 때 서열 상동성을 갖는다. 하지만, 일반적인 사용에 있어서 및 본 출원에 있어서, "매우"와 같은 부사를 이용하여 변형될 때, 용어 "상동의"는 서열 상동성을 지칭하며 공통의 진화 기원을 지칭하지는 않는다.

따라서, 모든 문법적 형태의 용어 "서열 유사성"은 공통의 진화적 기원을 갖거나 갖지 않을 수 있는 핵산 또는 아미노산 서열들 간의 동일성 또는 관련성 정도를 지칭한다(Reeck et al ., Cell 50:667 (1987) 참조). 일 구체예에 있어서, 뉴클레오타이드들의 약 50%(예컨대, 적어도 약 75%, 90%, 또는 95%)가 정의된 길이의 DNA 서열 이상 일치할 때, 두 개의 DNA 서열들은 "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"하다. 실질적으로 상동인 서열들은 서열 데이터 뱅크 또는, 예를 들어, 특정 시스템을 위해 정의된 바와 같이 엄격한 조건하에서의 서던 혼성화 실험에서 이용가능한 표준 소프트웨어를 이용하여 서열을 비교함으로써 확인될 수 있다. 적절한 혼성화 조건을 정의하는 것은 본 기술분야의 기술 범주 내이다(예컨대, Sambrook et al ., 1989, 참조).

본 명세서에 사용된 바와 같이, "실질적으로 유사"는 하나 이상의 뉴클레오타이드 염기의 변화가 하나 이상의 아미노산의 치환을 야기하지만 상기 DNA 서열에 의해 암호화되는 단백질의 기능적 특성에는 영향을 미치는 않는 핵산 단편을 지칭한다. "실질적으로 유사"는 또한 하나 이상의 뉴클레오타이드 염기의 변화가 안티센스 또는 동시억제(co-suppression) 기법에 의해 유전자 발현의 변화를 매개하는 핵산 단편의 능력에 영향을 미치지 않는 핵산 단편을 지칭한다. "실질적으로 유사"는 또한 얻어지는 전사체의 기능적 특성에는 실질적으로 영향을 주지 않는 하나 이상의 뉴클레오타이드 염기의 결손 또는 삽입과 같은, 본 발명의 핵산 단편의 변형을 지칭한다. 따라서, 본 발명은 예시된 특정 서열보다 더 포함한다고 이해된다. 제안된 각각의 변형들은 암호화된 생성물의 생물학적 활성의 유지(retention)를 결정하는 것과 같이, 본 기술분야에서 통상적인 기술 내에 속한다.

나아가, 숙련된 당업자는 엄격한 조건(0.1X SSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 2X SSC, 0.1% SDS로 세척 후, 0.1X SSC, 0.1% SDS) 하에서 본 명세서에 예시된 서열들과 혼성화하는 능력에 의해 본 발명에 의해 포함된 실질적으로 유사한 서열들이 정의된다는 것을 인식한다. 실질적으로 유사한 본 발명의 핵산 단편들은 DNA 서열들이 본 명세서에 보고된 핵산 단편의 DNA 서열과 적어도 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일한 핵산 단편들이다.

두 개의 아미노산 서열들은 아미노산 중 40% 초과가 동일하거나 60% 초과가 유사할 때(기능적으로 동일), "실질적으로 상동"이거나 "실질적으로 유사"하다. 바람직하게는, 상기 유사한 또는 상동의 서열들은, 예를 들어, GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) 중첩(pileup) 프로그램을 이용한 정렬에 의해 확인된다.

본 명세서에 사용된 용어 "~에 해당하는"은 정확한 위치가 유사성 또는 상동성이 측정된 분자와 동일하거나 상이하든 간에 유사하거나 상동인 서열을 지칭한다. 핵산 또는 아미노산 서열 배열은 공간(space)을 함유할 수 있다. 따라서, 용어 "~에 해당하는"은 아미노산 잔기 또는 핵산 염기의 수가 아닌, 서열 유사성을 지칭한다.

아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열의 "실질적인 부분(substantial portion)"은 본 기술분야의 숙련자에 의한 서열의 수동 평가(manual evaluation)에 의해, 또는 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al ., J. Mol . Biol . 215:403 (1993)); ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 에서 이용가능)와 같은 알고리즘을 이용한 컴퓨터-자동화 서열 비교 및 확인에 의해, 추정상으로 폴리펩타이드 또는 유전자를 확인하기 위해 충분한 폴리펩타이드의 아미노산 서열 또는 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일반적으로, 폴리펩타이드 또는 핵산 서열이 알려진 단백질 또는 유전자에 상동하는 것으로 추정상 확인하기 위해서는 10개 이상의 인접한 아미노산 또는 30개 이상의 뉴클레오타이드의 서열이 필요하다. 더욱이, 뉴클레오타이드 서열과 관련하여, 20-30개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드 프로브가 유전자 확인의 서열-의존적 방법(예컨대, 서던 혼성화) 및 분리(예컨대, 세균 군락 또는 박테리오파아지 플라크의 제자리 혼성화(in situ hybridization)에 사용될 수 있다. 또한, 12-15개의 염기의 짧은 올리고뉴클레오타이드가 상기 프라이머를 포함하는 특정 핵산 단편을 얻기 위해 PCR에서 증폭 프라이머로 사용될 수 있다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열의 "실질적인 부분"은 상기 서열을 포함하는 핵산 단편을 특이적으로 확인 및/또는 분리하는 충분한 서열을 포함한다.

본 기술분야에 알려진 바와 같이, 용어 "백분율 동일성(percent identity)"은 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같이 둘 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 간의 관계이다. 또한, 본 기술분야에서, "동일성"은 경우에 따라, 상기 서열의 문자열 간의 일치에 의해 결정되는 바와 같이, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열간의 서열 관련 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 Computational Molecular Biology((Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); and Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)에 기술된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는, 알려진 방법들에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험한 서열 간의 최적의 일치를 제공하도록 고안된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공공이 이용가능한 컴퓨터 프로그램에서 성문화된다. 서열 정렬 및 백분율 동일성 계산은 레이져진 바이오인포매틱스 컴퓨팅 스위트(LASERGENE bioinformatics computing suite, DNASTAR Inc., Madison, WI)의 메갈린(Megalign) 프로그램과 같은 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 수행될 수 있다. 서열의 다중 정렬(multiple alignment)은 기본 매개변수(default parameter)(GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10)을 갖는 클러스탈(Clustal) 정렬 방법(Higgins et al., CABIOS. 5:151 (1989))을 이용하여 수행될 수 있다. 클러스탈 방법을 이용한 쌍정렬(pairwise alignment)을 위한 기본 매개변수는 KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5로부터 선택될 수 있다.

용어 "서열 분석 소프트웨어"는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 분석하는데 유용한 임의의 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램이다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 이용가능하거나 독립적으로 개발될 수 있다. 전형적인 서열 분석 소프트웨어는 GCG 프로그램 묶음(Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)) 및 DNASTAR(DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 문맥 내에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석을 위해 사용되는 경우 달리 특정하지 않는 한, 분석 결과는 표시된 프로그램의 "기본 매개변수"에 기초하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에 사용된 "기본 수치(default value)"는 처음 시작할 때 본래 소프트웨어에 담겨있는 임의의 세트의 수치 또는 매개변수를 의미할 것이다.

DNA 서열과 관련하여, "화학적으로 합성된"은 구성요소인 뉴클레오타이드들이 시험관 내에서(in vitro) 조립된 것을 의미한다. DNA의 수동 화학적 합성은 잘 확립된 과정을 이용하여 달성될 수 있거나, 자동화된 화학적 합성은 상업적으로 이용가능한 수많은 기계 중 하나를 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기 유전자들은 숙주 세포의 코돈 편향(bias) 반영하기 위해 뉴클레오타이드 서열의 최적화에 기초하여 최적의 유전자 발현을 위해 조정될 수 있다. 숙련된 당업자는 만약 코돈 사용이 숙주에 의해 선호되는 코돈을 향해 편향되면 성공적인 유전자 발현 가능성을 인식한다. 바람직한 코돈의 결정은 서열 정보가 이용가능한 숙주 세포로부터 유래된 유전자의 조사에 기초할 수 있다.

용어 "외인성(exogenous) 유전자"는 대상에 이질적인(외래의) 유전자, 즉, 형질전환 과정을 통해 대상 내로 도입된 유전자, 내생적 돌연변이된 유전자의 돌연변이되지 않은 형태, 또는 내생적 돌연변이되지 않은 유전자의 돌연변이된 형태를 의미한다. 형질전환 방법은 본 발명에 핵심은 아니며, 본 기술분야의 숙련자들에게 알려진 대상에게 적합한 임의의 방법일 수 있다. 외인성 유전자들은 역전사효소에 의해서와 같이, DNA 중간체를 통해 기능할 수 있는 DNA 또는 RNA의 형태로 대상 내로 도입되는 천연 또는 합성 유전자들일 수 있다. 그러한 유전자들은 표적 세포로 도입되거나, 대상으로 직접 도입되거나 형질 전환된 세포에 의해 대상으로 간접적으로 도입될 수 있다.

용어 "대상(subject)"은 온전한 동물, 바람직하게는 척추동물, 가장 바람직하게는 포유동물을 의미한다.

용어 "HGF의 이형체"는 모든 대립 유전자 변형체들을 포함하는, 동물에서 자연적으로 생성되는 HGF 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한(예컨대, 적어도 90% 또는 95% 동일한) 아미노산 서열을 갖는 HGF 폴리펩타이드를 지칭한다. 일 구체예에 있어서, 상기 용어는 세포 증식 활성을 갖는다고 알려진 이형체들을 지칭한다. HGF의 이형체들은 flHGF, dHGF, NK1, NK2 및 NK4를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "flHGF"는 동물, 예컨대 포유동물의 전장 HGF 단백질, 예컨대, 인간 HGF의 아미노산 1-728을 지칭한다.

용어 "dHGF"는 동물, 예컨대 포유동물에서 HGF 유전자의 선택적 스플라이싱에 의해 생성되는 HGF 단백질의 결손된 변형체, 예컨대, 전장 HGF 서열로부터 알파 사슬의 첫 번째 크링글 도메인에서 5개의 아미노산(F, L, P, S 및 S)이 결손된 723개의 아미노산으로 이루어지는 인간 HGF를 지칭한다.

용어 "NK1"은 N-말단 헤어핀 루프 및 크링글1 도메인으로 이루어지는, 동물, 예컨대 포유동물, 예컨대 인간으로부터의 HGF의 이형체를 지칭한다.

용어 "NK2"는 N-말단 헤어핀 루프, 크링글1 및 크링글2 도메인으로 이루어지는, 동물, 예컨대 포유동물, 예컨대 인간으로부터의 HGF의 이형체를 지칭한다.

용어 "NK4"는 N-말단 헤어핀 루프, 크링글1, 크링글2, 크링글3, 및 크링글4 도메인으로 이루어지는, 동물, 예컨대 포유동물, 예컨대 인간으로부터의 HGF의 이형체를 지칭한다.

본 발명의 방법들은 HGF의 둘 이상의 이형체들을 포함하는 조성물을 심장 및/또는 혈관 질환을 갖는 대상에 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들은 포유동물의 HGF, 예컨대 인간 HGF의 이형체들이다. 다양한 종으로부터의 HGF의 아미노산 서열은 본 기술분야에 널리 알려져 있으며, GenBank와 같은 서열 데이터베이스에서 발견될 수 있다(본 명세서에 참조로 통합된, 등록번호 BAA14348을 갖는 인간 HGF의 아미노산 서열). 일 구체예에 있어서, HGF 이형체들 중 하나는 인간 flHGF(서열번호 2)이다. 또 다른 구체예에 있어서, HGF 이형체들 중 하나는 인간 dHGF(서열번호 3)이다. 또 다른 구체예에 있어서, HGF의 이형체들 중 하나는 인간 NK1(서열번호 4)이다. 또 다른 구체예에 있어서, HGF의 이형체들 중 하나는 인간 NK2(서열번호 5)이다. 또 다른 구체예에 있어서, HGF의 이형체들 중 하나는 인간 NK4(서열번호 6)이다. 추가의 구체예에 있어서, 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들은 flHGF 및 dHGF를 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들은 flHGF 및 dHGF로 이루어진다.

일 구체예에 있어서, HGF의 이형체들은 인간 야생형 HGF 이형체들의 변형체들이다. 예를 들어, 상기 이형체들은 야생형 인간 flHGF(서열번호 2), dHGF(서열번호 3), NK1(서열번호 4), NK2(서열번호 5) 또는 NK4(서열번호 6) 서열과 적어도 80% 서열 동일성, 예컨대, 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는 인간 flHGF, dHGF, NK1, NK2 또는 NK4 서열의 변형체들일 수 있다. 상기 변형체는 야생형 인간 HGF 이형체의 아미노산 서열에 대한 부가, 결손, 치환 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 부가 또는 치환은 자연적으로 발생하지 않는 아미노산의 사용을 포함하며, N-말단 및/또는 C-말단에서 내부로 임의의 수로 발생할 수 있다.

바람직하게는, 임의의 치환은 보존적 아미노산 치환이다. "보존적(conservative) 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 곁사슬(side chain)을 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 곁사슬을 갖는 아미노산 잔기들의 패밀리는 본 기술분야 내에서 정의되어 왔다. 이들 패밀리는 염기성 결사슬을 갖는 아미노산(예컨대, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 곁사슬을 갖는 아미노산(예컨대, 아스파트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 곁사슬을 갖는 아미노산(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 곁사슬을 갖는 아미노산(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-가지의 곁사슬을 갖는 아미노산(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 곁사슬을 갖는 아미노산(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다.

서열 동일성은 최적으로 정렬된 두 개의 서열들을 비교 영역과 비교하고, 동일한 아미노산 잔기가 양쪽 서열에서 발생하여 일치된 위치 수를 생성하는 위치 수(number of positions)를 결정하고, 상기 일치된 위치 수를 비교 영역 내의 총 위치 수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 상기 결과에 100을 곱해 서열 동일성 백분율을 얻음으로써 산출된다. 일 실시형태에 있어서, 정렬을 최대화하기 위하여 100개의 아미노산 길이에 4개의 틈(gap)이 도입될 수 있을 때, 백분율 동일성은 비교되는 서열 내의 동일한 아미노산 잔기를 정렬하는 보다 작은 2개의 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 계산된다(Dayhoff, in Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, p. 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. (1972), 본 명세서에 참조로 통합됨). 동일성의 결정은 전형적으로 본 기술분야에 알려진 컴퓨터 상동성 프로그램에 의해 이뤄진다. 예시적인 프로그램은 스미스와 워터맨(Smith and Waterman)의 알고리즘을 이용하는, 기본 셋팅(default setting)을 이용한 갭(Gap) 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI, 본 명세서에 참조로 통합됨)이다.

일 구체예에 있어서, HGF 이형체의 변형체는 야생형 HGF 이형체 단백질의 임의의 하나 이상의 생물학적 활성 모두를 실질적으로 유지한다. 본 명세서에 사용된 용어 "야생형 HGF의 실질적으로 모든 생물학적 활성"은 HGF 이형체의 임의의 하나 이상의 생물학적 활성(예컨대, 혈관신생을 자극하거나 세포 증식을 촉진하는 능력) 중 적어도 70% 이상을 유지하는 HGF 이형체의 변형체를 지칭한다. 일부 구체예에 있어서, HGF 이형체의 하나 이상의 생물학적 활성 중 적어도 75, 80, 85, 90 또는 95%가 유지된다. HGF 활성은 본 기술분야에 널리 알려진 통상의 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 분석에 의해 결정될 수 있다(예컨대, 생체 내 마트리젤 플러그(Matrigel plug) 및 각막 신생혈관(corneal neovascularization) 분석, 생체 내/시험관 내 병아리 장뇨막(chick chorioallantoic membrane, CAM) 분석, 시험관 내 세포(증식, 이동, 맥관 형성(tube formation)) 및 기관형태적(organotypic)(대동맥환(aortic ring)) 분석).

HGF의 구조 및 기능은 광범위하게 연구되어 왔으며, 본 기술분야의 숙련자는 실질적으로 단백질의 모든 생물학적 활성을 유지하는데 중요하고, 바람직하게는 HGF의 임의의 서열 변형체에서 변하지 않거나 단지 보존적으로 변한, HGF 서열 내 아미노산을 알고 있다(예컨대, Hartmann et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:11574 (1992); Lokker et al ., EMBO J. 11:2503 (1992), Zhou et al ., Structure 6:109 (1998), Ultsch et al ., Structure 6:1383 (1998), Shimizu et al ., Biochem . Biophys. Res . Commun . 189:1329 (1992), Yoshiyama et al ., Biochem . Biophys . Res . Commun . 175:660 (1991) 참조, 각각은 전체가 참조로써 본 명세서에 통합되어 있음). 예를 들어, N-말단 헤어핀 루프 및 크링글1 도메인이 세포 증식 활성에 요구되는 것으로 보인다. 생물학적 활성에 중요하지 않은 기타 아미노산들은 보다 자유롭게 결손 및/또는 치환될 수 있다. 본 기술분야의 숙련자는 상기 언급된 참고문헌에 기술된 바와 같은 통상적인 돌연변이 발생 기술들을 이용하여 HGF 이형체들의 변형체들을 제조할 수 있고, 실질적으로 HGF 이형체의 모든 생물학적 활성을 유지하는 변형체를 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에 있어서, HGF의 둘 이상의 이형체들은 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서 대상에 투여된다. 일 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 포유동물 HGF, 예컨대 인간 HGF의 이형체들을 암호화한다. 다양한 종으로부터의 HGF 유전자의 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 기술분야에 널리 알려져 있고, GenBank와 같은 서열 데이터베이스에서 발견될 수 있다(등록번호 NM00061을 갖는 인간 HGF 유전자의 폴리뉴클레오타이드 서열, 본 명세서에 참조로 통합되어 있음). 일 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 flHGF를 암호화한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 dHGF를 암호화한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NK1을 암호화한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NK2를 암호화한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NK4를 암호화한다. 추가의 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 flHGF 및 dHGF 모두를 암호화한다. 추가의 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 flHGF, dHGF 및 NK1을 암호화한다.

일 구체예에 있어서, HGF의 둘 이상의 이형체들을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 야생형 인간 HGF 유전자 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 야생형 HGF 유전자의 서열 변형체를 포함하지만, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 여전히 상기 HGF 이형체의 야생형 아미노산 서열을 암호화한다. 추가의 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기에서 기술한 바와 같이 HGF 이형체 단백질 서열 변형체들을 암호화한다. 일 구체예에 있어서, 인간 HGF 이형체 유전자 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열 변형체들은 야생형 인간 HGF 이형체 유전자 서열과 적어도 80%의 서열 동일성, 예컨대, 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는다.

본 발명의 일 실시형태에 있어서, HGF의 둘 이상의 이형체들은 둘 이상의 이형체들, 예컨대 flHGF 및 dHGF를 동시에 발현하는 하이브리드(hybrid) HGF 유전자에 의해 암호화된다. US 2005/0079581 A1(본 명세서에 전체가 참조로 통합되어 있음)에 기술된 상기 하이브리드 HGF 유전자는 HGF의 엑손 1 내지 18에 해당하는 cDNA, 및 상기 CDNA의 엑손 4와 5 사이에 삽입된 고유의(inherent) 또는 외래의 인트론을 포함하며, 여기서 상기 하이브리드 유전자는 엑손 4와 5 사이의 인트론 외에는 엑손 사이의 다른 인트론이 없다. 상기 인트론은 고유의 인트론의 단편 또는 재조합 서열을 포함한다.

고유의 인트론을 포함하는 상기 하이브리드 HGF 유전자의 구체예는 7113 bp 길이이며, 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 상기 하이브리드 HGF 유전자는 flHGF 및 dHGF 모두를 동시에 발현하고 flHGF cDNA보다 높은 발현 효율을 갖는다.

코돈 축퇴성(codon degeneracy)은 단백질의 아미노산 서열 및 유전자의 발현을 변화시키기 않고 상기 하이브리드 HGF 유전자의 암호화 및/또는 비-암호화 영역을 변형시키거나 변화시킨다. 따라서, 서열번호 7의 하이브리드 HGF 유전자 및 이의 단편들과 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 범주에 속한다. "실질적으로 동일한"은 서열 동일성이 80% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 95% 이상인 것을 의미한다.

하이브리드 HGF 유전자는 선택적으로 HGF cDNA의 엑손 4와 5 사이에 삽입된 작은 재조합 서열을 갖는 고유의 인트론의 단편을 포함할 수 있다. 여기에서, 고유의 인트론의 단편을 포함하는 그러한 하이브리드 HGF 유전자는 "HGF-X"로 명명된다. 예에는 각각 서열번호 8 내지 10의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 HGF-X6, HGF-X7 및 HGF-X8이 포함된다.

투여되는 HGF의 둘 이상의 이형체들은 별도의 폴리뉴클레오타이드 또는 단일 뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 HGF 이형체들의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열, 예컨대, 프로모터 또는 인핸서에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 프로모터는 구조 프로모터(예컨대, 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터) 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 상기 조절 서열은 특정 리간드의 부가 또는 제거에 의해 HGF 이형체의 발현을 조절하는 유전자 스위치의 일부일 수 있다. 본 발명의 유전자 스위치에 사용될 수 있는 리간드 의존적 전사인자의 예에는 그들 각각의 리간드에 의해 활성화된 핵수용체 수퍼패밀리 중 하나(예컨대, 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 에스트로겐, 프로게스틴, 레티노이드, 엑디손(ecdysone) 및 이의 유사체 및 모사체) 및 테트라사이클린에 의해 활성화된 rTTA가 포함된다. 추가의 구체예에 있어서, 상기 프로모터는 심근세포-특이적 프로모터(예컨대, 심장 안키린 반복 단백질(cardiac ankyrin repeat protein), MYBPC3)일 수 있다. HGF의 둘 이상의 이형체들이 별도의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 때, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 그들 자신의 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드는, 모든 이형체들의 발현을 촉진하기 위해 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드 사이에 삽입된 서열, 예컨대 내부 리보좀 결합 부위를 선택적으로 갖는, 직렬 카세트(tandem cassette)의 일부로서 단일 조절 서열의 통제 하에 있을 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, HGF의 둘 이상의 이형체들을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 벡터, 예컨대 발현 벡터의 일부이다. 상기 벡터는, 예를 들어, 플라스미드 벡터(예컨대, Lee et al ., Biochem . Biophys . Res . Commun . 272:230 (2000); WO 2000/040737에 개시된 바와 같은 pCK 벡터) 또는 단일가닥 또는 이중 가닥의 RNA 또는 DNA 바이러스 벡터일 수 있다. 그러한 벡터들은 세포 내로 DNA 및 RNA를 도입하는 널리 알려진 기술들에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 바이러스 벡터들은 복제가능(replication competent)이거나 복제불능(replication defective)일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 증식이 일반적으로 숙주 세포를 보완(complementing)할 때에만 일어날 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포" 또는 "숙주"는 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 가지고 있는 본 발명의 세포를 의미하기 위해 사용된다.

따라서, 최소한 상기 벡터들은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함해야 한다. 상기 벡터의 기타 요소들에는 선별 마커, 염색질 변형 도메인(chromatin modification domain), 벡터 상에 또한 존재할 수 있는 기타 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 추가의 프로모터(예컨대, 치사(lethal) 폴리펩타이드), 게놈 삽입 부위, 재조합 부위, 및 분자 삽입 피봇(molecular insertion pivot)이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터들은 상기 폴리뉴클레오타이드 내부 또는 외부에 임의의 수의 이러한 추가의 요소들을 포함할 수 있으며, 이로써 상기 벡터는 원하는 치료 방법의 특정 목표에 맞게 조정될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 세포 내로 도입되는 벡터들은 발현될 때 상기 벡터가 숙주 세포 내로 도입되었음을 나타내는 "선별 마커 유전자"를 추가로 포함한다. 이 방식에서, 상기 선택 유전자(selector gene)가 벡터의 존재를 위한 양성 마커일 수 있다. 본 발명의 방법에 중요하진 않지만, 선별 마커 유전자의 존재가 실험자가 벡터 구조체가 세포 내로 도입된 살아있는 세포 집단을 선별할 수 있게 해준다. 따라서, 본 발명의 특정 구체예는 상기 벡터가 성공적으로 도입된 세포를 선별하는 것을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "선별" 또는 이의 변형은, 세포와 함께 사용될 때, 특정 유전적 기질이나 표현형을 갖는 세포를 선택하는 잘 알려진 표준 방법을 의미한다고 의도된다. 전형적인 방법에는 G418, 퓨로마이신(puromycin) 및 암피실린과 같은 항생제의 존재하에 세포를 배양하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 선별 마커 유전자의 다른 예에는 메토트렉세이트(methotrexate), 히그로마이신(hygromycin), 또는 마이코페놀산(mycophenolic acid)에 대한 저항성을 부여하는 유전자들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항생제 저항성 유전자 또는 유전자들을 포함하는 벡터 구조체를 포함하는 세포들은 배양시 상기 항생제를 견뎌낼 수 있을 것이다. 마찬가지로, 항생제 저항성 유전자 또는 유전자들을 포함하는 벡터 구조체를 포함하지 않는 세포들은 배양시 상기 항생제를 견뎌낼 수 없을 것이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "염색질 변형 도메인"(chromatin modification domain, CMD)은 이에 제한되지 않는 DNA 절연체(insulator)와 같이, 염색질 구조를 유지 및/또는 변형시키는 것과 연관된 다양한 단백질과 상호작용하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다(Ciavatta et al ., Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A. 103:9958 (2006) 참조, 본 명세서에 참조로 통합됨). CMD의 예에는 닭 β-글로불린 절연체 및 닭 과민성 부위 4(cHS4)가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 유전자 프로그램 간에 상이한 CMD 서열들을 사용(즉, 프로모터, 암호화 서열, 및 3' 조절 영역)하면, 예를 들어, 존재하는 다유전인자(multigenic) 또는 단일유전인자(monogenic) 셔틀 벡터 간의 유전자 프로그램들을 "바꾸기(swap)" 위해 다양한 미생물 또는 시험관 내 리컴바이니어링(recombineering) 기술과 조합되어 "미니 상동성 암(mini homology arm)"으로서 차별적인 CMD DNA 서열들의 용이하게 사용할 수 있다. 염색질 변형 도메인의 다른 예들은 본 기술분야에 알려져 있거나 쉽게 확인될 수 있다.

본 발명에 사용하기 위한 특정 벡터들은 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 발현 벡터이다. 일반적으로, 상기 벡터들은 숙주에서의 발현에 효과적인, 발현된 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 작용위치(cis-acting) 조절 영역을 포함한다. 적절한 작용전달인자(trans-acting factor)가 숙주로 도입시 숙주에 의해 공급되거나, 보완 벡터에 의해 공급되거나 벡터 자체에 의해 공급된다.

상당히 다양한 발현 벡터들이 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 벡터들에는 염색체, 에피솜 및 바이러스 유래 벡터들, 예컨대 세균 플라스미드, 박테리오파아지, 효소 에피솜, 효소 염색체 요소, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스, 배큘로바이러스, 파포바(papova) 바이러스, SV40, 우두(vaccinia) 바이러스, 아데노바이러스, 계두(fowl pox) 바이러스, 가성광견병(pseudorabies) 바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스, 코스미드 및 파아지미드와 같은 플라스미드 및 박테리오파아지 유전 요소로부터 유래한 것과 같은, 이의 조합으로 유래한 벡터들이 포함된다. 모두 본 발명의 실시형태에 따른 발현을 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 숙주에서 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질을 유지, 연장 또는 발현하기에 적합한 임의의 벡터가 발현을 위해 사용될 수 있다.

상기 발현 벡터 내의 폴리뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, mRNA 전사를 유도하기 위한 프로모터를 포함하는 적절한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 추가의 프로모터의 대표적인 예에는 구조 프로모터 및 조직 특이적 또는 유도성 프로모터가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 구조 진핵 프로모터의 예에는 마우스 메탈로티오네인 I 유전자(Hamer et al ., J. Mol . Appl . Gen . 1:273 (1982)); 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터(McKnight, Cell 31:355 (1982)); SV40 초기 프로모터(Benoist et al ., Nature 290:304 (1981)); 및 우두 바이러스 프로모터가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 열거된 모든 참고문헌들은 본 명세서에 참고로 통합되어 있다. 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도하는데 사용될 수 있는 프로모터의 추가의 예에는 알부민 프로모터(간세포), 프로인슐린 프로모터(췌장 베타 세포) 등과 같은, 조직-특이적 프로모터 및 특정 단백질을 위한 기타 내생적 프로모터가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로, 발현 구조체는 전사, 개시 및 종결 부위 및 전사된 영역 내에 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 함유할 것이다. 상기 구조체의 의해 발현된 성숙한 전사체의 암호화 부분은 시작부분에 있는 번역 개시 AUG 및 번역될 폴리펩타이드의 말단에 적절히 위치한 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)을 포함할 수 있다.

나아가, 상기 구조체들은 발현시킬 뿐만 아니라 발현을 조절하는 조절 영역을 함유할 수 있다. 일반적으로, 그러한 영역들은 그 중에서도 억제물질(repressor) 결합 부위 및 인핸서와 같이, 전사를 조절함으로써 작동할 것이다.

진핵 벡터의 예에는 스트라타진(Stratagene)으로부터 이용가능한 pW-LNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG; 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech)으로부터 이용가능한 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL; 및 클론테크(Clontech)로부터 이용가능한 pCMVDsRed2-express, pIRES2-DsRed2, pDsRed2-Mito 및 pCMV-EGFP를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 많은 다른 벡터들이 잘 알려져 있으며 상업적으로 이용가능하다.

숙주에서의 발현을 위한 적절한 벡터 및 프로모터의 선별은 잘 알려진 과정이며, 벡터 제조 및 숙주로의 도입 뿐만 아니라 숙주에서의 발현을 위한 필요한 기술들은 본 기술분야에서 통상적인 기술들이다.

폴리뉴클레오타이드의 세포로의 도입은 벡터의 일시적(transient) 형질감염 또는 안정적 형질감염일 수 있다. 벡터의 숙주 세포로의 일시적 형질감염은 직접 주사, 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질-매개 형질감염, 전기천공법, 형질전환, 형질도입(transduction), 감염 또는 기타 방법에 의해 수행될 수 있다. 그러한 방법들은 Davis et al ., Basic Methods in Molecular Biology (1986); Keown et al ., Meth . Enzymol . 185:527 (1990); Sambrook et al ., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.(본 명세서에 참조로써 통합됨)와 같은, 많은 표준 실험실 매뉴얼에 기술되어 있다.

HGF의 둘 이상의 이형체들 또는 상기 HGF 이형체들을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 약학적 조성물의 형태로 대상에 투여될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 주사로 제형화된다.

약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적 분야에서의 통상적인 임의의 절차들이 정제, 캡슐, 환약, 과립, 현탁액 및 용액과 같은 경구 제형; 용액, 현탁액, 주사 전에 증류수와 혼합될 수 있는 건조 분말과 같은 주사 제형; 연고, 크림 및 로션과 같은 국소적으로 적용가능한 제형들 및 기타 제형들을 제조하는데 사용될 수 있다.

약제학적 분야에서 일반적으로 사용되는 담체들이 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 제형은 결합제, 유화제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁제, 착색제 또는 향신료를 포함할 수 있다. 주사 제형들은 방부제, 가용화제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 국소 투여용 제제는 염기, 부형제, 윤활제 또는 방부제를 함유할 수 있다. 본 기술분야에 알려진 임의의 적절한 제형(Remington's Pharmaceutical Science (18th edition), Mack Publishing Company, Eaton PA)이 본 발명에 사용될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 다양한 경구 및 비경구 제형으로서 임상적으로 투여될 수 있다. 적절한 제형은 첨가제, 개선제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 또는 희석제와 같은 부형제를 이용하여 제조될 수 있다. 경구 투여용 고상 제형에는 환약, 정제, 미세분말(dusting powder), 과립 및 캡슐이 포함된다. 그러한 고상 제형은 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴을 디벤질부틸락톤 리그난(dibenzylbuthyllacton lignan) 유도체와 혼합함으로써 제조할 수 있다. 또한, 마그네슘 스테아레이트 및 탈크와 같은 윤활제가 상기 제형에 포함될 수 있다. 경구 투여용 액상 제형에는 현탁액, 용액, 유화액 및 시럽이 포함된다. 그러한 제형은 물 및 액상 파라핀과 같은 일반적인 단순 희석제 외에 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제를 함유할 수 있다. 비경구 투여용 제형에는 살균 수용액, 현탁액, 유화액, 동결 건조된 대체 치료 및 좌제(suppository)가 포함된다. 수불용성 부형제 및 현탁제에는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 지방, 및 에틸 올레에이트와 같은 주사가능한 에스테르가 포함된다. 위텝솔®(Witepsol®), 마크로골®(Macrogol®), 트윈® 61(Tween® 61), 카카오 지방, 라우린 지방 및 글리세로젤라틴이 좌제의 기제로 사용될 수 있다.

하기의 실시예는 단지 예시의 목적을 위해 제시되며 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 플라스미드의 제조

pCK 벡터는 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 프로모터로부터 유전자 발현을 유도할 수 있으며, 이전 문헌에 설명된 바 있다(Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 272:230 (2000); WO 2000/040737).

pCK-VEGF165는 VEGF165 cDNA를 상기 pCK 벡터로 삽입하여 제조되었고, 이전 문헌에 설명된 바 있다(Lee et al., Biochem . Biophys . Res . Commun . 272:230 (2000); WO 2000/040737).

pCK-cHGF는 HCMV 프로모터의 통제 하에 HGF₇₂₈를 암호화하는 cDNA를 함유하며, 이전 문헌에 설명된 바 있다(US 2005/0079581).

pCK-dHGF는 HCMV 프로모터의 통제 하에 HGF₇₂₃을 암호화하는 cDNA를 함유하며, 이전 문헌에 설명된 바 있다(PCT/KR03/00548).

pCK-HGF-X7는 상기 pCK 벡터로 동시에 삽입된 2개의 이형체들을 발현하고자 고안된 하이브리드 HGF cDNA(서열번호 9)를 함유하며, 이전 문헌에 설명된 바 있다(US 2005/0079581).

실시예 2: 세포 이동 및 증식에 대한 HGF 의 효과

본 연구의 목적은 시험관 내(in vitro) 세포 이동 및 증식에 대한 HGF의 효과를 평가하기 위한 것이었다.

1. 물질 및 방법

(1) HGF 단백질의 제조

pCK-HGF-X7을 FuGENE6^TM (Roche Diagnostics, Germany)을 이용하여 293T 세포로 형질감염시켰다. 대조군으로서, pCK, pCK-cHGF 및 pCK-dHGF를 사용하였다. 형질감염 이틀 후, HGF 단백질을 함유하는 세포 상등액을 얻은 다음, 제조업체의 지시에 따라 인간 HGF ELISA(R&D Systems, MN, USA)을 이용하여 HGF의 양을 측정하였다.

(2) 세포 이동 분석

인간 제대정맥 내피세포(HUVEC, Agiolab Co., Ltd., AL01-0122S), 마우스 골격근 아세포(skeletal myoblast cell)(C2C12, ATCC No. CRL-1772) 및 랫트 심장근육아세포(cardiomyoblast cell)(H9C2, ATCC No. CRL-1446)의 이동에 대한 HGF의 효과를, 변형된 보이덴 챔버 분석(Boyden chamber assay)을 통해 평가하였다. 다공성 폴리카보네이트 필터(8-μm 공극 크기)를 갖는 24 트랜스웰 세포 배양 챔버(Corning, NY, US)의 삽입물들(inserts)을 PBS에 녹인 1% 젤라틴으로 코팅하였다. 1% FBS가 첨가된 M199 배지에 현탁된 HUVEC(n=15) 및 각각 3% FBS가 첨가된 DMEM 배지에 현탁된 C2C12(n=10) 또는 H9C2(n=10) 세포를 웰 당 1×10⁴ 세포로 상기 삽입물에 첨가하였다. 시험 물질(pCK, pCK-cHGF, pCK-dHGF 또는 pCK-HGF-X7로 형질감염된 293T 세포로부터의 상등액)을 각각 1% 또는 3% FBS가 첨가된 M199 또는 DMEM에서 50 ng/mL의 최종 HGF 농도로 희석하고, 상기 희석된 시험 물질 600 μL를 챔버 하부에 두었다. 세포를 CO₂ 배양기에서 37℃에서 3시간 동안 이동하게 한 다음, 상기 삽입물들을 들어올려, PBS로 세척하고 4% 포름알데하이드로 10분 동안 고정시키고, 0.2% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 상기 삽입물들의 반대편에 위치한 세포를 계수하여 세포 이동을 정량하였다. 각 삽입물에 그룹에 대하여 고배율 시야(high-power field, ×200)에서 세포를 계수하였다. 이미지를 이미지-프로® 플러스(Image-Pro®　plus (Media Cybernetics, US))를 이용하여 분석하였다.

(3) 세포 증식 분석

HUVEC 세포의 증식에 대한 HGF의 효과를 [³H]티미딘 혼입 분석을 이용하여 평가하였다. 1% FBS가 첨가된 M199 배지에 현탁된 HUVEC 세포(n=10)를 웰 당 5×10³ 세포로 96 웰 플레이트에 도말하였다. HGF 단백질(pCK, pCK-cHGF, pCK-dHGF 또는 pCK-HGF-X7로 형질감염된 293T 세포로부터의 상등액) 10 나노그램을 상기 세포에 첨가하였다. 세포를 CO₂ 배양기에서 37℃에서 48시간 동안 증식시켰다. 그 후, 각 웰에 1μCi의 [³H]티미딘을 첨가하고 세포를 37℃에서 16시간 동안 더 배양하였다. 세포를 회수하고 [³H]티미딘 혼입을 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter, Wallac, Turku, Finland)를 이용하여 측정하였다.

2. 결과 및 토의

두 가지 HGF 단백질 이형체들의 생물학적 결과를 살펴보기 위해, 세포 이동 및 증식에 대한 이들의 효과를 조사하였다. 이들 분석을 물질 및 방법에 기술된 바와 같이 각 발현 벡터로 형질감염된 293T 세포로부터 얻은 상등액을 이용하여 수행하였다. 모든 실험에서, 동일한 양의 HGF를 사용하였다.

도 1, 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 단지 하나의 이형체가 존재할 때와 비교하여 볼 때, pCK-HGF-X7로부터 생성된 두 가지 HGF 이형체들이 존재시 각각 HUVEC, C2C12 및 H9C2 세포의 이동을 보다 효율적으로 유도하였다. 또한, 두 가지 HGF 이형체들의 존재시 HUVEC 세포의 효과적인 증식을 촉진하였다(도 4). pCK-HGF-X7로부터 생성된 상등액은 pCK-dHGF 형질감염된 세포로부터 생성된 상등액보다 HUVEC 세포 증식을 보다 효율적으로 유도하였다. 이러한 결과들은 두 가지 HGF의 이형체들의 조합된 효과가 내피세포에서 보다 강한 이동 및 증식 활성 및 골격 및 심장 근아세포에서 보다 강한 이동을 생성하였다는 것을 보여준다.

혈관 내피세포 이동은 혈관신생과 강하게 연관되어 있으며, 심근 및 골격근 전구세포의 이동은 근육 발달 및 손상 후의 근육 재생에 있어 중요한 단계이다. 따라서, 이러한 결과들은 HGF의 두 가지 이형체들의 투여가 신혈관형성(neovascularization) 및 허혈성 조직의 재생을 유도하는 보다 효과적인 방법을 제공할 수 있다는 것을 보여준다. 또한, 혈관 내피세포 이동 및 증식은 혈관 벽 형성과 연관된 자연적인 과정이다. 그러므로, 이들 결과들은 또한 HGF의 두 가지 이형체들의 투여가 혈관 벽의 재-내피세포화를 촉진할 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 3: 랫트허혈성 심장 질병 모델에서의 HGF 의 효능 평가

본 연구의 목적은 랫트 허혈성 심장 질병 모델에서의 HGF의 심근내 주사의 심장-보호 효과를 평가하기 위한 것이었다. 실험 과정은 도 5에 제시되어 있다.

1. 물질 및 방법

(1) 동물

38마리의 스프라구에-다울리(Sprague-Dawley) 랫트(수컷, 12주령, 350 내지 400 g, SLC)가 도착하자마자 자유롭게 먹이와 물을 제공하고, 수술 전 7일간 휴식을 취하게 하였다.

(2) 심근 경색 모델

본 연구에서 HGF의 약리 효능의 분석을 위하여, 널리 사용되는 CAD 병리 모델 중 하나인 랫트 허혈성 심장 질환 모델을 사용하였다. 상기 랫트에 자일라진(Xylazine) (5 ㎎/㎏)을 근육주사한 다음 케타민(Ketamine)(50 ㎎/㎏)을 근육주사하여 마취시켰다. 95% 알콜 및 요오드로 살균한 후, 흉부를 살균된 수술용 천으로 덮고 절개 부위를 노출시킴으로써 수술을 위한 완벽한 살균 조건을 제공하였다. 구강 경로를 통해 기관내 삽관(Endotracheal intubation)을 수행하였다. 수술 동안에, 양압환기(positive pressure ventilation)를 유지하였다. 심전도 및 산소 포화도를 계속해서 추적관찰하였다. 중간 개흉(Mid thoracotomy)을 수행하였다. 심낭(pericardium)을 열고 좌심실의 전벽(anterial wall)을 살펴본 후, 작은 조각의 넬라톤(Nelaton)(5Fr)으로 지지된 6-0 폴리프로필렌 봉합을 이용하여 좌전하행 관상 동맥(left anterior descending coronary artery, LAD)의 근위부(proximal) 1/3 지점을 결찰하였다. 관찰된 심전도 상에서 ST-분절(segment) 상승을 확인하였다. 60분 동안 LAD 결찰시킨 후, 랫트 허혈성 심근을 재관류시켰다. 심낭 및 개흉 상처를 닫았다. 충분한 자발호흡이 돌아온 후 중간 벽 흡인기(suction)에 연결된 단일 흉부 튜브를 제거하고, 기관삽관 튜브를 제거하였다. 그리고 나서, 출혈 존재여부를 위해 절개부위를 확인하였다. 출혈이 멎은 후, 절개된 근육, 근막(fascia) 및 피부를 봉합하였다. 수술 후, 젠타마이신(3 ㎎/㎏/일)을 3일 동안 근육내로 투여하여 감염을 예방하였다. 수술 후 28일째에 경흉부 심장초음파(Transthoracic echocardiogram)를 수행하여 랫트에서의 심근경색의 유도를 확인하였다.

(3) 효능 평가 연구 설계

HGF의 효능은 HGF를 함유하는 플라스미드를 허혈성 심근에 직접 주사하고 생리학상으로 그리고 해부학상으로 심장-보호 효과를 관찰함으로써 시험하였다. 허혈 유도(0일) 후 HGF 유전자를 함유하는 플라스미드를 즉시 투여하였다. 각 동물에게 총 투여량 250 ㎍의 pCK-cHGF(n=12) 또는 pCK-HGF-X7(n=10)을 심근내로 주사하였다. 음성 및 양성 대조군을 위해, HGF 암호화 서열이 없는 동일한 양의 pCK 벡터(n=7) 및 pCK-VEGF165(n=9)를 주사하였다. DNA 주사 후 1, 14, 28 및 56일째에 경흉부 심장초음파에 의해 심장의 생리적 기능의 향상을 평가하였다. 부검 후, 혈관신생 및 항-섬유화 효과의 수치를 측정하였다.

(4) 심장-생리학적 분석

1일째에, 경흉부 심장초음파를 이용하여 좌심실 박출계수 및 수축-심실 중격을 측정하였다. 1일에 얻어진 수치들을 기준 수치로 정하였다. 14, 28 및 56일째에, 심장초음파를 재수행하였다. 1, 14, 28 및 56일에 얻어진 수치들을 pCK, pCK-HGF-X7, pCK-cHGF 및 pCK-VEGF165 군 사이에서 비교하였다. 나아가, 허혈성 심장으로부터 조직 슬라이스를 채취하여 좌심실에서의 모세관 밀도 및 섬유화정도의 변화를 분석하였다.

(5) 혈관 밀도 분석

56일째에, 허혈성 심장으로부터 심근 조직을 얻어 2일 동안 10% 포르말린 용액에서 고정시킨 다음, 파라핀에 포매하였다. 각 표본으로부터 몇 개의 연속 분절을 제조하였다. 조직 절단시, CD31 항체로 염색하여 혈관의 내피세포를 확인하였다. 혈관 밀도를 400X 배율의 현미경 하에서 정량적으로 분석하고 0.15 ㎟ 당 혈관 수로서 나타내었다(Image-Pro® plus, Version 4.1, Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, USA). 그리고 나서, 상기 수치를 처리군 사이에서 비교하였다.

(6) 항-섬유화 효과 분석

56일째에, 허혈성 심장으로부터 심근 조직을 얻어 2일 동안 10% 포르말린 용액에서 고정시킨 다음, 파라핀에 포매하였다. 각 표본으로부터 몇 개의 연속 분절을 제조하고 트리크롬(Trichrom)으로 염색하여 콜라겐 함량을 평가하였다. 좌심실 내 섬유화된 영역(fibrotic area)을 8X 배율의 현미경 하에서 정량적으로 분석하였다. 그리고 나서, 상기 수치를 처리군 사이에 비교하였다.

(7) 통계

결과를 SPSS(version 10.0, SPSS. Inc, Chicago, IL, USA)를 이용하여 평균±평균의 표준오차(SEM)로 나타내었다. 모든 데이터의 통계 분석을 일원분산분석(one-way ANOVA) 후 LSD 검정법 또는 터키 검정법(Tukey's test)을 이용하여 수행하여 다중 비교시 유의차를 측정하였다. 0.05 이상의 P 값을 유의하다고 간주하였다.

2. 결과

(1) 랫트에서의 좌심실 심근경색의 유도

심근 경색의 유도 후 28일에 경흉부 심장초음파를 수행하여 동물 질병 모델을 확인하였다. 심근 허혈의 외과적 유도 후에 좌심실의 생리적 기능이 현저히 감소하였음이 관찰되었다. 또한, 심근 섬유증은 좌심실의 전측부벽(anterolateral wall)에서 관찰되었다.

(2) 좌심실 기능에 대한 HGF의 효과

DNA 주사 후 좌심실 박출계수(LVEF)의 변화를 처리군 사이에서 비교하였다. 1일 및 14일째에, 군들 사이에서 LVEF에 통계학적으로 유의한 차이는 없었다. 하지만, 심근내로 DNA를 처리한 후 28일까지, LVEF 수치는 pCK 군(31.24±3.58%, p=0.028) 또는 pCK-cHGF 군(33.99±2.26%, p=0.069)과 비교하여 볼 때, pCK-HGF-X7 처리군(40.77±2.92%)에서 통계학적으로 유의하게 더 높았다. pCK-VEGF165 군에서의 LVEF 수치(39.63±2.44%)가 pCK 군(p=0.056) 또는 pCK-cHGF 군(p=0.138)보다 높은 것으로 보이지만, 그 차이는 통계학적으로 유의하지는 않았다. 비슷한 패턴이 처리 후 54일째에 관찰되었다(도 6).

DNA 처리 후 수축-심실 중격(IVS)의 변화 또한 비교하였다. 수축 IVS는 pCK-HGF-X7-처리군에서만 유의하게 증가하였고; 56일째에 pCK-HGF-X7 처리군의 IVS는 pCK(p=0.061), pCK-VEGF165(p=0.012) 또는 pCK-cHGF(p=0.011)-처리군보다 상당히 더 높았다(도 7).

(3) 혈관 밀도에 대한 HGF의 효과

56일째에, pCK-HGF-X7 처리군의 경우 허혈성 경계 부분(ischemic border area)의 심근 조직 내 모세관 밀도는 0.15 ㎟ 당 300.00±14.71이었다. 이 모세관 밀도는 pCK 군의 0.15 ㎟ 당 227.54±6.16(p<0.001), pCK-VEGF165 군의 0.15 ㎟ 당 247.38±7.52(p=0.001), 또는 pCK-cHGF 군의 0.15 ㎟ 당 231.35±5.55(p<0.001)보다 유의하게 더 높았다(도 8).

(4) 심근 섬유화에 대한 HGF의 효과

56일째에, pCK-HGF-X7 처리군의 경우 좌심실 내 섬유화 정도는 18.88±1.81%였다. 이 백분율 섬유화 정도는 pCK 군의 30.20±2.35%(p=0.009)보다 유의하게 더 낮았다. 또한, pCK-HGF-X7 군과 비교하여 볼 때 통계학적으로 덜 유의함에도 불구하고, pCK-VEGF165 군(20.96±2.25%)에서의 섬유화 정도는 pCK 군(p=0.049)보다 더 낮았다. 하지만, pCK-cHGF 군(25.02±2.49%)에서의 섬유화 정도는 pCK 처리군(p=0.411)보다 상당히 더 낮지는 않았다(도 9)

3. 토의

잘 알려진 CAD 동물모델인 랫트 허혈성 심장 질병 모델에서, HGF의 치료가능성을 평가하였다. 0일째에, 외과적 과정을 통해 심장 허혈을 발생시키고, HGF 유전자 또는 대조군 DNA를 함유하는 총 250 μg의 플라스미드를 허혈성 심근내로 주사하였다. 심장초음파 및/또는 조직학적 분석에 의해 HGF의 효과를 평가하였다. 허혈성 심장의 기능은 pCK-HGF-X7 처리군에서 유의하게 개선되었다. pCK-cHGF가 HGF 단백질의 한 가지 이형체를 발현함에도 불구하고, pCK-cHGF 군은 심장 기능에 어떠한 유의한 개선을 나타내지 않았다.

실시예 4: 인체 임상 시험에서의 pCK - HGF - X7 의 효능 평가

인체 임상 시험에서 pCK-HGF-X7의 효능을 평가하였다. 관상동맥 우회로 이식술(coronary artery bypass graft, CABG)을 받은 2명의 환자에게 0.5 ㎎의 pCK-HGF-X7을 주사하였다.

1. 방법

(1) 대상

대상들은 하기의 조건을 충족시키는 경우 시험에 포함되었다: 1) 19 내지 75세, 2) MIBI-SPECT 평가에 의한 가역적 관류결손(reversible perfusion defect)(휴식(rest) 및 부하(stress) 관류 간에 7퍼센트 초과의 차이)을 가짐, 3) CABG 후 불완전한 재관류 영역을 여전히 갖는 것으로 추정되거나, CABG에 적합하지 않은 심근 관류 영역을 갖는 것으로 추정됨.

대상들은 하기의 이전 병력 또는 현재의 증거가 있는 경우 제외되었다: 1) 악성 종양(malignancy), 2) 치료되지 않은 심실 부정맥, 3) 진행성 심부전 또는 킬립 클래스(Killip class) II 이상의 좌심실 기능장애 및 경흉부 2D 심장초음파에 의해 <25%의 좌심실 박출계수를 가짐, 4) 심각한 감염성 질환, 5) 치료되지 않은 혈액 질환, 6) 심장판막 질환(valvular heart disease) 및 좌심실의 감축수술(debulking surgery)을 필요로 함, 6) 증식성 망막병증(proliferative retinopathy), 7) 뇌졸중, 8) JNC II의 평가에 의한 치료되지 않은 본태성 고혈압(essential hypertension), 9) 심각한 간 및 신장 질환, 또는 10) 이전의 CABG.

상기 프로토콜은 한국 식약청 뿐만 아니라 서울대학병원 임상시험심사위원회(Institutional Review Board)에 의해 승인받았다.

(2) MIBI-SPECT 심근 관류 연구

pCK-HGF-X7 처리 전에, 그리고 pCK-HGF-X7 처리 후 3개월 및 6개월 후에, 모든 환자들에게 휴식시 및 아데노신을 이용한 생리학적 부하 후 ^99mTc-MIBI 게이트 SPECT(Vertex EPIC, ADAC Labs, CA., USA)를 수행하였다. SPECT 이미지는 심전도 게이팅(electrocardiography gating)에 의해 구축하였고 자동-정량화 프로그램(AutoQUANT, ADAC Labs, CA., USA)를 이용하여 반-정량적 20-분절 모델을 분석하였다.

SPECT 하에서 휴식 및 부하 관류 스코어 간의 7%의 차이가 심근 허혈에서의 가역적 관류 결손의 최저선이다. 따라서, 휴식 및 부하 관류 사이의 ≥7%의 차이는 심근이 가역적 관류 결손을 갖는다는 것을 가리키고 ≤7%의 차이는 심근이 정상 관류를 갖는다는 것을 가리킨다.

휴식 및 부하 관류의 스코어를 SPECT 불스-아이 이미지(bull's eye image)의 분절수 10 및 16으로부터 얻었고, 스코어 차이는 스크리닝 기간, pCK-HGF-X7 주사 후 3 및 6개월째에 평가하였다(도 10).

(3) CABG 하에서 심근내 pCK-HGF-X7 주사

좌전하행 관상동맥 및 회선(circumflex) 관상동맥의 우회 이식술을 표준 정중흉부절개술(median sternotomy)를 통해 완료하였다. 감소된 관류를 가짐에도 불구하고, MIBI SPECT에 의해 평가될 때 CABG에 적합하지 않았던 후하행동맥(posterior descending artery)의 양쪽 면으로, 0.5 ㎎의 pCK-HGF-X7(0.125 ㎎/0.25 mL/주사; 4 부위/환자)을 심근내 주사로 투여하였다. pCK-HGF-X7이 투여된 분절수는 MIBI-SPECT로부터 얻어진 불스아이 이미지의 10 및 16이었다(도 11).

2. 결과 및 논의

(1) MIBI-SPECT 하에 심근 관류에 대한 pCK-HGF-X7의 효과

pCK-HGF-X7 주사 전 및 후에 SPECT 하의 휴식 및 부하 관류 스코어 사이의 차이를 비교하였다. 첫 번째 환자에서, pCK-HGF-X7 주사 전 휴식 및 부하 관류 스코어 사이의 평균 차이는 16%였다. pCK-HGF-X7 주사 후 3 및 6개월 후에, 주사 영역(분절수 10 및 16)에서의 휴식 및 부하 관류 스코어 사이의 평균 차이는 기준 수치와는 유의하게 다른 3.5% 및 0.5%였다. 두 번째 환자에서, pCK-HGF-X7 주사 전 휴식 및 부하 관류 스코어 사이의 평균 차이는 9%였다. pCK-HGF-X7 주사 후 3 및 6개월에, 주사 영역(분절수 10 및 16)에서의 휴식 및 부하 관류 스코어 사이의 평균 차이는 기준 수치와는 현저히 다른 4% 및 3.5%였다(도 12).

결론적으로, 병에 걸린 환자에게 pCK-HGF-X7을 심근내로 주사시 심근 관류의 상태를 가역적 결손으로부터 정상으로 변화시킬 수 있다. 이러한 결과들은 pCK-HGF-X7의 투여가 심근 관류를 현저하게 향상시킬 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 5: 돼지 아메로이드 ( ameroid ) 허혈성 모델에서의 pCK - HGF - X7 의 효능 평가

본 연구의 목적은 돼지 아메로이드 허혈성 모델에서 심장 이미지 시스템의 안내 하에 카테터를 이용하여 pCK-HGF-X7의 경피 심장내 주사의 심장-보호 효과를 평가하는 것이었다.

1, 물질 및 방법

(1) 동물

거세한 요크셔 식용돼지(n=9, 수컷, 20 내지 40 ㎏)가 도착하자마자 자유롭게 먹이와 물을 제공하고 수술하기 전에 7일간의 휴식을 제공하였다.

(2) 돼지 아메로이드 허혈성 모델

아메로이드 구축을 통한 만성 심근 허혈의 돼지 모델은 잘 확립된, 임상학적으로 활용할 수 있는, 그리고 신규 혈관신생 치료법의 시험에서의 만성 심근 허혈의 허용된 전임상학적 모델이다. 이 모델은 인간에서의 허혈에 따른 혈관 형성 정도 뿐만 아니라 인간 관상 해부 모두를 자극한다. 더욱이, 이 돼지 모델은 인간 심혈관계와 크기 및 해부가 유사하기 때문에, 심혈관 의료 장치 실험에 있어 잘 확립되어 있다.

돼지의 근위부 좌회선(left circumflex)에 아메로이드 수축기를 외과적으로 이식하여 만성 허혈을 야기하였다. 텔라졸®(Telazol®) 4-6 ㎎/㎏ 및 아트로핀 설페이트(Atropine Sulfate) 0.02 내지 0.05 ㎎/㎏을 근육내로 주사하여 돼지를 진정시켰다. 그리고 나서, 안면마스크를 통해 이소플루란(Isoflurane)을 투여하여 외과 개입을 위한 일반적 마취를 유도하였다. 상기 돼지에 관을 삽입하고 수술을 위해 적절히 준비하였다. 상기 돼지를 좌측 횡와위(left lateral recumbency)에 두었다. 정맥 내로 플라즈마라이트(Plasmalyte) 및 리도카인(Lidocaine)을 천천히 주입하여 수술 중 수화(hydration)를 유지하고 부정맥을 억제하였다. 스크럽(scrub) 용액을 사용하여 멸균 상태로 수술 부위를 준비하고, 흉부를 멸균된 천 드레이프(drape)로 덮고 동물 전체를 바디 드레이프로 덮었다. 깊은 수준의 마취가 확립된 후, 근육 이완을 위해 판쿠로늄 브로마이드(Pancuronium bromide)를 정맥 내로 투여하였다. 5번째 갈비뼈 사이공간(intercostal space)에 있는 좌흉부에서 20-㎝ 절개를 수행하였다. 갈비뼈를 벌린 다음 폐를 식염수로 적신 거즈 스폰지로 감쌌다. 수평 절개에 의해 격막 신경(phrenic nerve)에서 원위부(distal) 심낭을 열고 심장을 심막 크레이들(pericardial cradle)에 현탁하였다. 회선동맥(circumflex coronary artery, LCX)을 첫 번째 변연분지(marginal branch) 근위부의 약 0.5 ㎝의 거리로 절개하고 동맥을 위한 적절한 크기의 아메로이드 수축기를 그 주위에 놓는다. LCX 베드(bed)에 충격을 줄 수 있는 모든 부차적인 물질들을 영구적으로 묶었다. 부정맥 억제를 위해 필요한 경우 리도카인 볼루스(Lidocaine bolus)를 투여하였다. 상기 심막을 통상적으로 봉합하여 막지는 않았지만, 동맥 상에 위치한 아메로이드를 보장하기 위한 보조로 사용되었다. 연속 패턴의 크로믹 거트(Chromic gut)(PDS II) 봉합을 사용하여 근육층을 닫았다. 브래이디드 덱손(Braided DexonTM) 봉합을 피하로 사용하였다. 외과 스테이플(Surgical staple)을 사용하여 피부를 닫았다. 그리고 나서, 감염을 예방하기 위하여, 모든 돼지에게 3일 동안 근육내로 엔로플록사신(Enrofloxaxin)(0.5 ㎎/㎏/day)을 주사하였다.

(3) 효능 평가 연구 설계

아메로이드 이식 4주 후에, 돼지에게 무작위로 1 ㎎의 pCK-HGF-X7[저용량군: 1 ㎎/2 mL (n-3)], 4 ㎎의 pCK-HGF-X7[고용량군: 4 ㎎/8 mL (n=3)] 또는 pCK-HGF-X7과 함께 사용된 동일한 부형제 완충액으로 이루어진 대조군[운반체 대조군:8 mL (n=3)]을 주사하였다. 상기 군들에 심내막(transendocardial) 경로로 NOGA®　MyoStar 전달 카테터(Biosense Webster, USA)를 이용하여 투여하였다. 각 동물들에게 전벽 및 후벽 상의 생존 및 허혈성 심근의 가장자리 영역으로 pCK-HGF-X7의 8(저용량군: 0.125 ㎎/0.25 mL/주사 부위) 또는 16(고용량군: 0.25 ㎎/0.5 nL/주사 부위) 주사 또는 대조군(운반체 대조군: 0.5 mL/주사 부위)을 처리하였다. pCK-HGF-X7 처리의 기능상의 결과를 평가하기 위해, 심근 조영 부하 심장초음파(contrast stress echocardiography)에서 측정된 바와 같이, DNA 처리 전 및 후의 최대 응력(peak stress)에서의 심근 관류(κ)를 결정하였다.

2. 결과

플라스미드 DNA 주사 전 및 후의 최대 응력에서의 심근 관류의 변화를 처리군들 사이에서 비교하였다. 운반체 대조군에서, 30일이 0일째에 비해 감소된 관류 경향을 나타내었다. 하지만, 30일째에 두 가지 pCK-HGF-X7 군들은 0일에 비해 관류 보존 경향을 나타내었다(도 13). 이러한 결과들은 pCK-HGF-X7의 심내막 전달이 심근 허혈에 의해 유도되는 심근 관류의 감소를 예방할 수 있다는 것을 제시하였다.

이러한 결과들은 HGF가 카테터를 이용하여 전달될 수 있다는 것을 나타낸다. 상기 경피적 심내막 주사 카테터는 임상 시험에서 전기기계적 심장 항법 시스템(cardiac navigation system)의 안내 하에 다양한 약물, 예컨대 줄기세포, 아데노바이러스 및 순수한 DNA의 심내막 주사에 사용되어 왔다. 이러한 결과들은 pCK-HGF-X7 플라스미드 DNA가 전기기계적 지도하에 카테터를 이용한 경피 심내막 주사로서 관류 감소를 갖는 심근으로 안전하게 투여될 수 있다는 것을 보여준다. 따라서, pCK-HGF-X7을 심장으로 전달하기 위한 카테터 주입 시스템이 안정, 불안정 협심증 또는 급성, 만성 심근경색과 같은 허혈성 심장 조직을 갖는 환자에게 사용될 수 있다.

실시예 6: HGF 발현 세포의 전달

HGF는 pCK-HGF-X7을 포함하는 세포의 형태로 전달될 수 있다. 대상으로부터 간엽 줄기세포가 회수된다. 간엽 줄기세포의 공급원은 골수 흡인물(marrow aspirate) 또는 가동화 말초혈액(mobilized peripheral blood)일 수 있다. 회수된 간엽줄기세포를 배양하고 리포좀을 이용하여 pCK-HGF-X7로 형질감염시킨다. 그리고 나서, 세포를 회수하고 식염수로 세척하며, 수액에 재현탁시킨 다음 환자 내로 주입한다. pCK-HGF-X7로 형질감염된 간엽 줄기세포는 i) 주사기를 이용한 심근내 주사로서, 또는 ii) 전기기계적 지도하에 카테터를 이용하여 경피 심내막 주사로서, 허혈성 및 경색된 심장 조직 내로 주입될 수 있다.

실시예 7: pCK - HGF - X7 - 용출성 스텐트( eluting stent )

본 실시예는 플라스미드-용출성 스텐트의 생산을 입증한다.

A. 플라스미드-용출성 스테인레스 스틸 스텐트의 생산

1. 물질 및 방법

(1) 스테인레스 스틸 스텐트

스테인레스 스틸 스텐트(SS stent, Liberte®, 3.0 ㎜ x 20 ㎜)를 보스턴 사이언티픽(Boston Scientific, USA)으로부터 구입하였다.

(2) pCK-HGF-X7-용출성 SS 스텐트의 생산

a. 비중합체 기반의, pCK-HGF-X7-용출성 SS 스텐트의 생산

SS 스텐트 지주(strut)의 표면을 세척하기 위하여, 스텐트를 3분 동안 에탄올에서 3회 초음파분해(Vibra-Cell^TM, Sonics & Materials INC., Switzland)하고, 37℃에서 30분 동안 건조시켰다. 그리고 나서, 상기 스텐트를 5 ㎎/mL의 pCK-HGF-X7 용액에 5분 동안 담근 후 37℃에서 30분간 건조시켰다.

b. 중합체 기반의 pCK-HGF-X7-용출성 SS 스텐트의 생산

중합체 기반의 SS 스텐트를 만들기 위해, 스텐트를 에탄올에 녹인 5 ㎎/mL의 포스포릴콜린(PC) 중합체(CM5208, Vertellus Specilities INC., UK)용액에 1회 담갔다. 그리고 나서, 상기 PC 중합체 기반의 SS 스텐트를 5 ㎎/mL의 pCK-HGF-X7에 5분 동안 1회 담근 후 37℃에서 20분간 건조시켰다.

(3) SS 스텐트로부터 용출된 pCK-HGF-X7의 정량

SS 스텐트에 로딩된 pCK-HGF-X7의 양을 분석하기 위하여, 제거되고 보충된 다량의 용액(1 mL 중 0.8 mL)을 선택하여 신속하고 효율적인 방식으로 pCK-HGF-X7 용출을 정량하였다.

pCK-HGF-X7이 코팅된 SS 스텐트를 각각 1 mL의 정상 식염수를 함유하는 크라이오튜브(cryotube)에 침지시켰다. 스텐트를 함유하는 상기 튜브를 분당 40 회전의 조건 하에 60분 동안 롤러 믹서(HIP-RMF40, Hyunil LAB-MATE, Korea) 상에 두었다. pCK-HGF-X7 용출물을 1, 5, 10, 20 및 40분에 회수하였다. 각 시점에, UV 분석을 위해 0.8 mL의 용액을 빼내고, 용액의 총 부피를 유지하기 위해 크라이오튜브에 다시 0.8 mL의 신선한 정상 식염수를 첨가하였다. 그리고 나서, 상기 크라이오튜브를 롤러 믹서에 놓아 실험을 계속하였다. 각 시점에 얻어진 빼낸 pCK-HGF-X7 용출물의 농도를 울트라스펙(Ultraspec) 3000(Amersham Pharmacia Biotech., Sweden)을 이용하여 260 ㎚에서 측정하였다. 또한, 음성 대조군으로서, pCK-HGF-X7이 없는 SS 스텐트를 상기 정량 방법을 이용하여 시험하였다.

2. 결과

결과를 표 1 및 2에 나타내었다. 1분에 비중합체 기반의 SS 스텐트로부터 거의 78 ㎍의 pCK-HGF-X7이 용출되었고, 40분에 115 ㎍이 용출되었다. 또한, 60분에 중합체 기반의 SS 스텐트로부터 거의 43 ㎍의 pCK-HGF-X7이 용출되었다. 이러한 결과들은 상기 플라스미드가 모든 비중합체 및 중합체 기반의 SS 스텐트 상에 코팅될 수 있다는 것과, 상기 코팅된 플라스미드가 SS 스텐트로부터 용출될 수 있다는 것을 보여준다. 그러므로, 플라스미드-용출성 SS 스텐트가 성공적으로 제조되었다고 결론 내렸다.

비중합체 기반의 SS 스텐트로부터 용출된 pCK-HGF-X7의 정량

추출 시간 (분)	추출된 pCK-HGF-X7 누적
	음성 대조군		비중합체 기반의 SS 스텐트
	μg(pCK-HGF-X7)	상대적 회복(%)	μg(pCK-HGF-X7)	상대적 회복(%)
1	0.53 ±0.14	0	77.98 ± 29.29	67.88
5	0.87 ± 0.03	0	108.97 ± 13.20	94.86
10	1.41 ± 0.18	0	112.48 ± 14.23	97.92
20	1.55 ± 0.11	0	114.15 ± 13.76	99.38
40	1.83 ± 0.24	0	114.87 ± 13.84	100.00

중합체 기반의 SS 스텐트로부터 용출된 pCK-HGF-X7의 정량

추출 시간 (분)	추출된 pCK-HGF-X7 누적
	음성 대조군		중합체 기반의 SS 스텐트
	μg(pCK-HGF-X7)	상대적 회복(%)	μg(pCK-HGF-X7)	상대적 회복(%)
10	1.85 ±0.07	0	39.74 ± 9.27	84.45
20	1.37 ± 0.03	0	41.64 ± 9.14	88.49
30	1.35 ± 0.00	0	43.35 ± 9.12	92.12
40	1.41 ± 0.07	0	44.55 ± 9.03	94.69
50	1.00 ± 0.08	0	45.82 ± 8.89	97.37
60	0.96 ± 0.05	0	47.05 ± 9.02	100.00

B. 플라스미드-용출성 코발트 크롬 스텐트의 생산

1. 물질 및 방법

(1) 코발트 크롬 스텐트

코발크 크롬 스텐트(Co-Cr 스텐트, ARTHOSPico, 2.75 ㎜ × 12 ㎜)를 AMG 인터네셔널(AMG international, Germany)로부터 구입하였다.

(2) pCK-HGF-X7-용출성 Co-Cr 스텐트의 생산

a. 비중합체 기반의 pCK-HGF-X7-용출성 Co-Cr 스텐트의 생산

SS 스텐트 지주의 표면을 세척하기 위하여, 스텐트를 에탄올에서 3분 동안 3회 초음파분해하고 37℃에서 30분 동안 건조시켰다.

b. pCK-HGF-X7-용출성 Co-Cr 스텐트의 생산

중합체 기반의 Co-Cr 스텐트를 만들기 위해, 스텐트를 에탄올에 녹인 5 mg/mL의 포스포릴콜린(PC) 중합체(CM5208, Vertellus Specilities INC., UK)에서 1회 침지하였다. 그리고 나서, 상기 PC 중합체 기반의 Co-Cr 스텐트를 5분 동안 5 ㎎/mL의 pCK-HGF-X7에 3회 침지하고 37℃에서 10분 동안 건조시켰다.

(3) Co-Cr 스텐트로부터 용출된 pCK-HGF-X7의 정량

Co-Cr 스텐트 상에 로딩된 pCK-HGF-X7의 양을 분석하기 위하여, 제거되고 보충된 다량의 용액(1 mL 중 0.8 mL)을 선택하여 신속하고 효율적인 방식으로 pCK-HGF-X7을 정량하였다.

Co-Cr 스텐트를 코팅한 pCK-HGF-X7을 각각 1 mL의 정상 식염수를 함유하는 크라이오튜브(cryotube)에 첨가하였다. 상기 튜브를 분당 40 회전의 조건 하에 60분 동안 롤러 믹서(HIP-RMF40, Hyunil LAB-MATE, Korea) 상에 두었다. pCK-HGF-X7 용출물을 10, 20, 30, 40, 50 및 60분에 회수하였다. 각 시점에, UV 분석을 위해 0.8 mL의 용액을 빼내고, 용액의 총 부피를 유지하기 위해 크라이오튜브에 다시 0.8 mL의 신선한 정상 식염수를 첨가하였다. 그리고 나서, 상기 크라이오튜브를 롤러 믹서에 놓아 실험을 계속하였다. 각 시점에 얻어진 빼낸 pCK-HGF-X7 용출물의 농도를 울트라스펙(Ultraspec) 3000(Amersham Pharmacia Biotech., Sweden)을 이용하여 260 ㎚에서 측정하였다. 또한, 음성 대조군으로서, pCK-HGF-X7이 없는 Co-Cr 스텐트를 상기 정량 방법을 이용하여 시험하였다.

2. 결과 및 논의

결과를 표 3 및 4에 나타내었다. 1분 및 20분에 비중합체 기반의 Co-Cr 스텐트로부터 거의 60 ㎍ 및 85 ㎍의 pCK-HGF-X7이 각각 용출되었다. 또한, 60분에 중합체 기반의 Co-Cr 스텐트로부터 거의 43 ㎍의 pCK-HGF-X7이 용출되었다. 이러한 결과들은 상기 플라스미드가 비중합체 및 중합체 기반의 모든 Co-Cr 스텐트 상에 코팅될 수 있다는 것과, Co-Cr 스텐트로부터 용출된 플라스미드의 양이 SS 스텐트보다 적음에도 불구하고 상기 코팅된 플라스미드가 Co-Cr 스텐트로부터 용출될 수 있다는 것을 보여준다. 그러므로, 플라스미드-용출성 Co-Cr 스텐트가 성공적으로 제조되었다고 결론내려졌다.

비중합체 기반의 Co-Cr 스텐트로부터 용출된 pCK-HGF-X7의 정량

추출 시간 (분)	추출된 pCK-HGF-X7의 누적
	음성 대조군		Non-polymer based Co-Cr stent
	μg(pCK-HGF-X7)	상대적 회복(%)	μg(pCK-HGF-X7)	상대적 회복(%)
1	0.53 ±0.14	0	60.20 ± 11.18	70.48
5	0.87 ± 0.03	0	80.52 ± 4.13	94.28
10	1.41 ± 0.18	0	83.52 ± 4.10	97.79
20	1.55 ± 0.11	0	84.77 ± 3.99	99.25
40	1.83 ± 0.24	0	85.41 ± 4.11	100.00

중합체 기반의 Co-Cr 스텐트로부터 용출된 pCK-HGF-X7의 정량

추출 시간(분)	추출된 pCK-HGF-X7의 누적
	중합체 기반의 CO-Cr 스텐트
	μg(pCK-HGF-X7)
60	21.9 ± 0.00

실시예 8: 토끼 풍선 나화 모델( rabbit balloon denudation model )에서의 HGF - X7 -용출성 스텐트의 효능 평가

본 연구의 목적은 토끼 풍선 나화 모델에서의 HGF-X7-용출성 스텐트에 의한 재-내피세포화의 가속을 평가하기 위한 것이었다.

1. 물질 및 방법

(1) 동물

10마리의 뉴질랜드 흰토끼(수컷, 3.5 내지 4.0 ㎏, 두열 바이오텍)에게 도착하자마자 자유롭게 먹이와 물을 제공하였고, 스텐트 이식 전에 7일간의 휴식을 제공하였다.

(2) 토끼 풍선 나화 모델 및 스텐트 이식

자일라진(Xylazine, 5 ㎎/㎏)의 근육 내 주사 후 케타민(50 ㎎/㎏)을 주입하여 토끼를 마취시켰다. 95% 알코올 및 요오드로 살균한 후, 목을 멸균 수술용 천으로 덮고 절개 부위만을 노출시켜, 수술을 위한 완벽한 살균 조건을 제공하였다. 외부 경동맥을 외과적으로 노출시킨 후, 5F 유도관(introducer sheath, Cordis, USA)을 외부 경동맥 내로 전진시켰다. 표준 형광투시법(standard fluoroscopy method)을 이용하여 1.4F 가이드-와이어(guide-wire, Terumo, Japan)를 대퇴 동맥으로 삽입한 후, 2.8F 마이크로-카테터를 외부 장골 동맥(iliac artery)의 인접 부분으로 전진시켰다. 1000 U 헤파린 및 0.1 ㎎의 니트로글리세린을 투여하였다.

다음과 같이 외부 장골 동맥의 풍선 나화를 수행하였다: 가이드-와이어를 통해 외부 장골 동맥으로 2.5×8 ㎜ 풍선 카테터를 삽입한 다음, 토끼로부터 마이크로-카테터를 제거하였다. 풍선 카테터를 팽창시킨 후(10 atm), 연속적으로 10회 철수(withdrawal)시켜 약 1.0 ㎝의 거리로 외부 장골 동맥의 내피를 노출시켰다. 장골 노출용 카테터를 토끼로부터 제거하고 pCK-HGF-X7-용출성 SS 스텐트(PES) 또는 코팅되지 않은 금속(bare-metal) 스텐트(BMS)가 고정된 새로운 풍선 카테터를 노출된 외부 장골 동맥으로 전진시켰다. 12 atm의 풍선 팽창에서 15초 동안 스텐트 이식을 수행하였다. PES(n=10) 및 BMS(n=10)은 좌우 양측으로 이식하였다.

(3) 광학 간섭성 단층촬영(Optical coherent tomography , OCT) 분석

광학 간섭성 단층촬영(OCT) 분석을 위해, 헬리오스 오클루전(Helios occlusion) 풍선 카테터(LightLab, USA)를 가이드-와이어를 통해 외부 장골 동맥의 근위부로 전진시킨 다음, 토끼로부터 제거하였다. 그리고 나서, OCT 이미지 와이어(LightLab, USA)를 이식된 스텐트의 원위부 가장자리로부터 1.5 ㎝ 거리에 두었다. 10 mL의 정상적인 식염수를 흘려주어 OCT 이미지를 얻었다. 토끼에게서 모든 장치를 제거한 후, 3-0 실크 봉합을 이용하여 외부 경동맥(carotid artery)을 연결하였다. 그리고 나서, 출혈의 존재여부를 위해 절개 부위를 확인하였다. 출혈을 억제한 후, 절개된 근육, 근막(fascia) 및 피부를 봉합하였다. 젠타마이신(3 ㎎/㎏/일)을 근육내로 3일 동안 투여하여 감염을 예방하였다. 또한, 32.5 ㎎의 클로피도그렐(Sanofi-Aventis, France) 및 25 ㎎의 아스피린(Bayer, Germany)를 매일 투여하였다.

(4) 주사 전자 현미경(Scanning electron microscopy, SEM)

스텐트 이식 후 14일 및 28일에, 동물을 희생시켜 혈관을 수거하고, 2.5% 글루타르알데하이드 용액으로 2시간 동안 고정시켰다. 상기 고정된 혈관을 인산 완충 식염수(PBS)로 3회 세척하고 1% OsO₄ 용액으로 후-고정을 수행하였다. 상기 후-고정된 혈관을 PBS로 3회 세척하고 60 내지 95% 에틸 알코올로 연속적으로 탈수 과정을 수행하였다. 마지막으로, 상기 탈수된 혈관에 금 코팅을 수행하였다.

(5) 통계

결과들을 SPSS(version 10.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 평균±평균의 표준오차(SEM)로 나타내었다. 스튜던트의 t-검정법을 이용하여 모든 데이터의 통계 분석을 수행하였다. 0.05 미만의 P 값을 유의한 것으로 간주하였다.

2. 결과 및 논의

pCK-HGF-X7-용출성 스텐트가 재-내피세포화 과정을 가속화할 수 있는지 여부를 평가하기 위하여, OCT 및 SEM에 의해 스텐트를 덮은 세포의 내막 면적(intimal dimension)의 변화 및 특성을 각각 조사하였다.

스텐트 이식 후 0, 14 및 28일에 OCT 이미지를 수득하였다. 각 스텐트로부터 9개의 단면 이미지를 수득하였다. OCT의 기준 및 추적 데이터가 도 14에 나타나있다. 후-개입(post-intervention) 결과들은 양쪽 군에서 유사하였다(도 14A; 0일). 하지만, 스텐트 이식 후 14일에 PEG 군의 단면 부위의 내부 면적(ID-CSA, ㎟)은 BMS 군에 비해 유의하게 확장되었다(도 14B; PES vs BMS, 0.23 ±0.05 ㎟ vs 0.48 ±0.09 ㎟, p=0.03). 스텐트 이식 후 28일에, 두 군간의 ID-CSA는 유사하였다(도 14B; PES vs BMS, 0.91±0.08 ㎟ vs 0.98±0.09 ㎟, p=0.76). 이러한 결과들은 pCK-HGF-X7-용출성 스텐트가 코팅되지 않은 금속 스텐트에 비해 스텐트의 표면 상의 세포의 성장을 향상시켰다는 것을 보여준다.

다음으로, SEM 분석에 의해 스텐트 상에 증식된 세포의 종류를 조사하였다. SEM은 14일 및 28일에 수행하였다. 도 15는 내피세포(검정 화살표 참조)가 PES 군에서는 스텐트의 표면을 균일하게 덮은데 반해, BMS 군에서는 평활근 세포 및 내피세포로 구성된 혼합 신생내막(neointima)이 관찰되었다는 것을 보여준다.

이러한 결과들은 PCK-HGF-X7-용출성 스텐트가 재-내피세포화를 가속화시킬 수 있고, 따라서 혼탁한 혈관을 치료하는 유용한 도구임을 증명한다.

상기 결과들은 HGF의 두 가지 이형체들(HGF 및 dHGF)의 존재가 HGF 또는 dHGF 단독에 비해 시험관 내(in vitro) 내피세포의 성장 및 이동을 보다 효과적으로 유도할 수 있다는 것과, 생체 내(in vivo) HGF의 두 가지 이형체들(HGF 및 dHGF) 모두를 발현하는 뉴클레오타이드 서열의 전달이 혈관의 재-내피세포화 과정을 가속화할 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 결과들은 HGF의 두 가지 이형체들이 HGF의 단일 이형체보다 신속한 재-내피세포화 활성을 통해 보다 효과적으로 재협착증을 약화시킬 수 있다는 것을 가리킨다.

본 명세서에 언급된 모든 문헌(특허, 특허출원, 저널 기사, 실험 매뉴얼, 또는 기타 문헌)의 전체 개시가 참조로 통합되어 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (40)

1. HGF의 둘 이상의 이형체 또는 상기 이형체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 약제학적 유효량을 포함하는, 혈관 외과적 개입 후 불완전한 재관류 영역을 갖는 혈관에서의 내피세포 성장 촉진용 약제학적 조성물로서, 상기 HGF의 둘 이상의 이형체가 전장 HGF(flHGF) 및 결손된 변이형 HGF(dHGF), NK1, NK2 및 NK4로 구성된 군으로부터 선택되는 이형체인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관은 손상된 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 내피세포 성장은 혈관의 재-내피세포화(re-endothelialization)가 촉진 또는 가속화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관은 재협착증의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상 내에 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HGF의 둘 이상의 이형체는 상기 이형체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 주사를 이용하여 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 전달 장치를 이용하여 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
12. 제 11 항에 있어서, 상기 전달 장치는 스텐트인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
13. 제 12 항에 있어서, 상기 스텐트는 비-중합체 기반의 스테인레스 스틸 스텐트, 중합체 기반의 스테인레스 스틸 스텐트, 비-중합체 기반의 코발트 크롬 스텐트 및 중합체 기반의 코발트 크롬 스텐트로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
14. 제 12 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 스텐트로부터 용출되는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
15. 삭제
16. 제 1 항에 있어서, 상기 HGF의 둘 이상의 이형체는 flHGF 및 dHGF를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
17. 제 16 항에 있어서, 상기 HGF의 둘 이상의 이형체는 NK1을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
18. 삭제
19. 삭제
20. 제 1 항에 있어서, 상기 flHGF 및 dHGF는 인간 flHGF 및 인간 dHGF인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
21. 제 1 항에 있어서, 상기 HGF의 둘 이상의 이형체는 서열목록 제2서열-제6서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
22. 제 1 항에 있어서, 상기 flHGF 및 상기 dHGF는 별도의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
23. 제 1 항에 있어서, 상기 flHGF 및 상기 dHGF는 동일한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
24. 제 1 항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 조성물.
    
25. 제 24 항에 있어서, 상기 프로모터는 구성 프로모터인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
26. 제 1 항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 상이한 벡터 상에 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
27. 제 1 항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
28. 제 26 항 또는 제 27항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
29. 제 28 항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터는 pCK 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
30. 제 26 항 또는 제 27 항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
31. 제 1 항에 있어서, 상기 flHGF 및 상기 dHGF가, HGF 엑손 1-18 또는 암호화된 아미노산 서열을 바꾸지 않는 이의 축퇴물(degenerate)을 포함하고, 엑손 4와 5 사이에 인트론을 추가로 포함하는 하이브리드 HGF 컨스트럭트에 의해 암호화되며, 여기서 상기 컨스트럭트는 엑손 4와 5 사이의 상기 인트론 외에는 엑손 사이에 다른 인트론이 없는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
32. 제 31 항에 있어서, 상기 인트론은 고유의(inherent) 인트론인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
33. 제 32 항에 있어서, 상기 하이브리드 HGF 컨스트럭트는 서열목록 제7서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
34. 제 31 항에 있어서, 상기 인트론은 고유의 인트론의 단편인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
35. 제 34 항에 있어서, 상기 하이브리드 HGF 컨스트럭트는 서열목록 제8서열, 제9서열 또는 제10서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
36. 제 1 항에 있어서, 상기 HGF의 이형체는 각각 1 μg 내지 100 mg의 투여량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
37. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 각각 1 μg 내지 10 mg의 투여량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
38. 삭제
39. 삭제
40. 삭제

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