CN113710255A - 治疗心力衰竭 - Google Patents

Abstract

本公开涉及包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物，以及使用此类组合物治疗病症的方法。所述方法至少部分地基于以下发现：可以通过将分离的线粒体本身以及连接至治疗剂、诊断剂和/或成像剂的分离的线粒体注射至患者的血管中而将它们递送至患者的组织。

Description

治疗心力衰竭

优先权要求

本申请要求于2019年2月15日提交的美国临时申请第62/806,473号的优先权。前述的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及线粒体和组合的线粒体试剂的治疗用途。

背景技术

线粒体是存在于有核真核细胞的细胞质中的双膜结合的细胞器。除红细胞之外，它们几乎存在于人体的每个细胞中。它们是细胞能量代谢的主要位点，并且生成用于不同的细胞功能的三磷酸腺苷(ATP)。通常，细胞对ATP的需求超过90％是由细胞自身的线粒体提供的。

线粒体由具有特定功能的两个同心膜构成。线粒体内膜含有用于ATP合酶的蛋白质。含有大量整合膜蛋白的线粒体外膜包围整个细胞器。

线粒体的结构与一些现代原核生物具有惊人的相似性。事实上，认为线粒体起源于当有核细胞吞噬需氧原核生物时的古老的共生。在共生关系中，宿主细胞开始依赖于所吞噬的原核生物来产生能量，并且原核生物细胞开始依赖于由宿主细胞提供的保护性环境。

由于线粒体在细胞代谢中的主要功能，因此线粒体可以用于治疗各种病症。还需要利用线粒体用于药物递送以及一些其他治疗和诊断目的。

发明内容

本公开提供了包含线粒体的药物组合物以及使用此类药物组合物治疗病症的方法。本说明书进一步提供了使用此类药物组合物的诊断和成像方法。所述方法至少部分地基于以下发现：可以通过将分离的线粒体本身以及连接至治疗剂、诊断剂和/或成像剂的分离的线粒体注射至患者的血管中而将它们递送至患者的组织。也就是说，将线粒体直接注射或应用至靶组织，虽然这是通过本文描述的某些方法构想的，但并非总是必需的。更确切地说，在一些情况下，本文描述的方法利用以下发现：在将线粒体注射或输注至例如动脉中之后，线粒体可以横穿过动脉壁并且被患者组织的细胞摄取。本文描述的方法可以出于多种治疗、诊断和/或成像目的，使用相对简单的医疗程序来为组织或细胞提供线粒体或带有治疗剂、诊断剂和/或成像剂的线粒体的局部和一般分布。

本文尤其提供了在受试者中治疗或预防心力衰竭的方法，该方法包括将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于受试者。在一些实施方案中，通过心肌内注射将组合物施用于受试者。在一些实施方案中，受试者患有以下心力衰竭或处于发展以下心力衰竭的风险中：右心室肥大(RVH)、左心室肥大(LVH)、右心室衰竭(RVF)或左心室衰竭(LVF)。在一些实施方案中，受试者患有肺疾病。在一些实施方案中，肺疾病影响右心室功能。在一些实施方案中，通过将组合物注射至受试者的血管中来将组合物施用于受试者。在一些实施方案中，线粒体是自体的。在一些实施方案中，线粒体是同种异体的。在一些实施方案中，线粒体是异种的。

本文尤其提供了在受试者中维持右心室(RV)收缩力、维持RV毛细血管密度、预防RV扩张或延迟RVF发作的方法，该方法包括将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于受试者。在一些实施方案中，通过心肌内注射将组合物施用于受试者。在一些实施方案中，受试者患有以下心力衰竭或处于发展以下心力衰竭的风险中：右心室肥大(RVH)、左心室肥大(LVH)、右心室衰竭(RVF)或左心室衰竭(LVF)。在一些实施方案中，受试者患有肺疾病。在一些实施方案中，肺疾病影响右心室功能。在一些实施方案中，通过将组合物注射至受试者的血管中来将组合物施用于受试者。在一些实施方案中，线粒体是自体的。在一些实施方案中，线粒体是同种异体的。在一些实施方案中，线粒体是异种的。

本文尤其提供了在受试者中维持左心室(LV)收缩力、维持LV毛细血管密度、预防LV扩张或延迟左心室衰竭(LVF)发作的方法，该方法包括将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于受试者。在一些实施方案中，通过心肌内注射将组合物施用于受试者。在一些实施方案中，受试者患有以下心力衰竭或处于发展以下心力衰竭的风险中：右心室肥大(RVH)、左心室肥大(LVH)、右心室衰竭(RVF)或左心室衰竭(LVF)。在一些实施方案中，受试者患有肺疾病。在一些实施方案中，肺疾病影响左心室功能。在一些实施方案中，通过将组合物注射至受试者的血管中来将组合物施用于受试者。在一些实施方案中，线粒体是自体的。在一些实施方案中，线粒体是同种异体的。在一些实施方案中，线粒体是异种的。

本文尤其提供了在受试者中维持心室收缩力的方法，该方法包括：

鉴定有此需要的受试者；以及

将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于受试者。在一些实施方案中，通过测量收缩末期压力容积(ESPV)来鉴定受试者。

本文尤其提供了在受试者中维持心室毛细血管密度的方法，该方法包括：

鉴定有此需要的受试者；以及

将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于受试者。

本文尤其提供了在受试者中降低心室扩张的风险的方法，该方法包括：

鉴定有此需要的受试者；以及

将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于受试者。

在一些实施方案中，受试者被鉴定为患有糖尿病、肥胖症、高血压、酒精滥用、可卡因使用和滥用、细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生物感染、暴露于毒素(例如，铅、汞或钴)、心律失常或晚期妊娠并发症。

本文尤其提供了在受试者中延迟心力衰竭发作的方法，该方法包括：

鉴定有此需要的受试者；以及

将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于受试者。在一些实施方案中，受试者被鉴定为患有右心室肥大或左心室肥大。

本文尤其提供了在受试者中治疗心力衰竭、延迟心力衰竭发作、减少发展心力衰竭的风险的方法，该方法包括将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于受试者。在一些实施方案中，通过心肌内注射将组合物施用于受试者。在一些实施方案中，该方法包括将受试者鉴定为具有发展心力衰竭的风险。在一些实施方案中，受试者患有肺疾病。在一些实施方案中，通过将组合物注射至通向心脏的血管中来将组合物施用于受试者。

本文尤其提供了在受试者中治疗心脏肥大、延迟心脏肥大发作、减少发展心脏肥大的风险的方法，该方法包括将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于受试者。在一些实施方案中，通过心肌内注射将组合物施用于受试者。在一些实施方案中，该方法包括将受试者鉴定为具有发展心脏肥大的风险。在一些实施方案中，受试者患有肺疾病。在一些实施方案中，通过将组合物注射至通向心脏的血管中来将组合物施用于受试者。

在某些实施方案中，血管是将血液传送至靶位点、靶器官或靶区域的血管或血管系统的一部分，例如，受试者的冠状动脉、受试者的肝门静脉、受试者的胰大动脉或受试者的前列腺动脉。

在某些实施方案中，线粒体可以具有不同的来源，例如，线粒体可以是自体的、同种异体的或异种的。在某些实施方案中，自体线粒体可以具有外源性mtDNA。在一些实施方案中，线粒体来自受试者的一级亲属。

在一些实施方案中，所描述的方法包括在施用之前从细胞收集分离的线粒体的步骤。可以在从细胞收集分离的线粒体之后，立即将分离的线粒体或组合的线粒体试剂施用于受试者。

在一个方面，本公开提供了包含分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂的组合物；以及载体。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。载体可以是任何合适的载体，例如，呼吸作用缓冲液、线粒体缓冲液、无菌线粒体缓冲液、University of Wisconsin(UW)溶液、血液、血清或造影剂。

在本文描述的所有方法和/或组合物中，组合的线粒体试剂可以包含药剂。药剂可以是治疗剂、成像剂、诊断剂或其任何组合。成像剂可以是放射性的。在一些实施方案中，成像剂是¹⁸F-罗丹明6G或氧化铁纳米颗粒。在一些实施方案中，药剂通过共价键连接至线粒体。替代地或另外，药剂包埋在线粒体中。组合的线粒体试剂可以包括抗体或抗原结合片段。此外，在本文描述的所有方法和/或组合物中，线粒体可以是自体的、同种异体的或异种的。在一些实施方案中，线粒体具有外源性DNA(例如，mtDNA)。

如本文所用，术语“分离的线粒体”意指不含外来真核细胞物质的功能性完整线粒体。

“组合的线粒体试剂”是与药剂、诊断剂或成像剂或任何其他试剂人工组合的分离的线粒体。试剂以任何方式与线粒体组合，例如，连接(例如，化学或静电连接)至线粒体、附接至线粒体、包埋在线粒体膜中、基本上封闭在线粒体内、或完全被线粒体包封，只要线粒体与试剂彼此物理接触即可。组合的线粒体试剂被设计成使得在注射之后线粒体充当可以将试剂传递至患者组织的“载体”。

在整个说明书中，使用术语“受试者”和“患者”来描述向其提供根据本公开的方法的治疗的动物、人或非人。本公开清楚地预期兽医应用。该术语包括但不限于鸟类、爬行动物、两栖动物和哺乳动物，例如，人、其他灵长类动物、猪、啮齿动物(如小鼠和大鼠)、兔子、豚鼠、仓鼠、牛、马、猫、狗、绵羊和山羊。优选的受试者是人、农场动物和家养宠物(如猫和狗)。

本文使用术语“治疗”来表示延迟病况(例如，本文描述的疾病)的发作，抑制此病况、减轻此病况的影响，或延长患有此病况的患者的寿命。

“缺血相关疾病”是涉及缺血的疾病。如本文所用，缺血是指流向器官和/或组织的血流量减少。血流量减少可以由任何合适的机制引起，这些机制包括向器官和/或组织供应血液的一个或更多个血管的部分或完全堵塞(阻塞)、变窄(缩窄)和/或渗漏/破裂等。

所谓“在从细胞收集线粒体之后立即”意味着在从细胞收集线粒体之后立即并且在线粒体的生存力发生任何实质性减少之前进行。

如本文所用，术语“移植”在整个说明书中用作描述将器官、组织、细胞团、单个细胞或细胞器移植至接受者中的过程的通用术语。术语“细胞移植”在整个说明书中用作描述将至少一种细胞(例如，胰岛细胞或干细胞)转移至接受者的过程的通用术语。例如，可以通过从供体胰腺中去除β-细胞(或完整的胰岛)并将它们放置在其胰腺不能产生足够的胰岛素的接受者患者中来进行此种移植。该术语包括本领域已知的所有类别的移植，输血除外。通过位点和供体与接受者之间的遗传关系对移植进行分类。该术语包括例如自体移植(将细胞或组织从患者的一个位置去除并且转移至同一受试者的相同位置或另一位置)、同种异体移植(在相同物种的成员之间的移植)和异种移植(在不同物种的成员之间的移植)。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有公开出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，应当以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的，并不意图是限制性的。

从以下详细描述以及权利要求中，本发明的其他特征和优点将是明显的。

附图说明

图1是描绘线粒体分离方法的示意图。

图2是描绘与心室超负荷相关联的疾病预后的示意图。

图3是描绘受试者中线粒体移植的方法概述的示意图。

图4是描绘利用肺动脉束扎术(PAB)的动物模型研究的示意图。

图5是描绘实验的测量和分析的时间线的示意图。

图6是示出了对照组(C，也被称为“假手术”组)、PAB-V(载剂)组和PAB-M(线粒体)组在基线处、在PAB后1个月和在安乐死时的功能区变化(FAC，以百分数表示)的线形图。

图7是示出了对照组(C，也被称为“假手术”组)、PAB-V(载剂)组和PAB-M(线粒体)组在基线处、在PAB后1个月和在安乐死时的三尖瓣环平面收缩偏移(TAPSE，以mm计)的线形图。

图8是示出了对照组(C，也被称为“假手术”组)、PAB-V(载剂)组和PAB-M(线粒体)组在基线处、在PAB后1个月和在安乐死时的右心室(RV)壁厚度(以mm计)的线形图。

图9是示出了对照组(C，也被称为“假手术”组)、PAB-V(载剂)组和PAB-M(线粒体)组在安乐死时的dP/dt max(以mmHg/秒计)的箱形图。

图10是示出了对照组(C，也被称为“假手术”组)、PAB-V(载剂)组和PAB-M(线粒体)组在基线处和在安乐死时的dP/dt max(以mmHg/秒计)的线形图。

图11A是示出了阐明TUNEL阳性对照组中的凋亡细胞(白色箭头)的TUNEL染色的免疫荧光图像。通过结蛋白染色对心肌细胞进行染色，并且通过DAPI染色对细胞核进行染色。

图11B是示出了阐明对照组/假手术组中的凋亡细胞(白色箭头)的TUNEL染色的免疫荧光图像。通过结蛋白染色对心肌细胞进行染色，并且通过DAPI染色对细胞核进行染色。

图11C是示出了阐明PAB-V组中的凋亡细胞(白色箭头)的TUNEL染色的免疫荧光图像。通过结蛋白染色对心肌细胞进行染色，并且通过DAPI染色对细胞核进行染色。

图11D是示出了阐明PAB-M组中的凋亡细胞(白色箭头)的TUNEL染色的免疫荧光图像。通过结蛋白染色对心肌细胞进行染色，并且通过DAPI染色对细胞核进行染色。

图11E是示出了每视野结蛋白/每视野细胞核数目的比率(％)(P<0.01**)的条形图。

图12A是示出了阐明对照组/假手术组中的毛细血管密度(白色箭头)的CD31染色的免疫荧光图像。经由结蛋白染色对心肌细胞进行染色，并且经由DAPI染色对细胞核进行染色。

图12B是示出了阐明PAB-V组中的毛细血管密度(白色箭头)的CD31染色的免疫荧光图像。经由结蛋白染色对心肌细胞进行染色，并且经由DAPI染色对细胞核进行染色。

图12C是示出了照亮PAB-M组中的毛细血管密度(白色箭头)的CD31染色的免疫荧光图像。经由结蛋白染色对心肌细胞进行染色，并且经由DAPI染色对细胞核进行染色。

图13A是示出了对照组/假手术组中线粒体的数目和形状的电子显微镜分析。

图13B是示出了PAB-V组中线粒体的数目和形状的电子显微镜分析。

图13C是示出了PAB-C组中线粒体的数目和形状的电子显微镜分析。

图14是描绘与线粒体移植治疗相关联的疾病结果和预后的示意性图示。

图15是示出了对照、RV肥大(RVH)和具有线粒体移植的RVH的图片的免疫荧光图像。

图16是示出了对照心肌细胞、未治疗的肥大心肌细胞(H无线粒体)以及经线粒体治疗的肥大心肌细胞(H心脏线粒体、H腓肠肌线粒体和H比目鱼肌线粒体)中的ATP水平的箱形图，*对比对照，p＝0.05，#对比未治疗的肥大心肌细胞(H无线粒体)，p＝0.001。

图17A是示出了阐明对照组/假手术组、PAB-V组和PAB-M组中的凋亡细胞(白色箭头)的TUNEL染色的免疫荧光图像。经由结蛋白染色对心肌细胞进行染色，并且经由DAPI染色对细胞核进行染色。

图17B是示出了每1000个细胞核中的TUNEL阳性细胞核的箱形图，(*对比对照，p＝0.01，并且#PAB-V对比PAB-M，p＝0.05)。

图17C是示出了检测对照组/假手术组、PAB-V组和PAB-M组中纤维化的代表性组织切片的显微镜分析。

图17D是示出了在研究终点处每视野中的纤维化的比率(％)的箱形图，(*对比对照，p＝0.01，并且#PAB-V对比PAB-M，p＝0.05)。

图18A是示出了对照组(C，也被称为“假手术”组)、PAB-V组和PAB-M组在基线处的RV壁厚度(以cm计)的箱形图。

图18B是示出了对照组(C，也被称为“假手术”组)、PAB-V组和PAB-M组在PAB后1个月时的RV壁厚度(以cm计)的箱形图。

图18C是示出了对照组(C，也被称为“假手术”组)、PAB-V组和PAB-M组在安乐死时的RV壁厚度(以cm计)的箱形图。

图19A是示出了对照组(C，也被称为“假手术”组)、PAB-V组和PAB-M组在基线处的功能区变化(FAC，以百分数表示)的箱形图。

图19B是示出了对照组(C，也被称为“假手术”组)、PAB-V组和PAB-M组在PAB后1个月时的功能区变化(FAC，以百分数表示)的箱形图。

图19C是示出了对照组(C，也被称为“假手术”组)、PAB-V组和PAB-M组在安乐死时的功能区变化(FAC，以百分数表示)的箱形图。

图20A是示出了对照组(C，也被称为“假手术”组)、PAB-V组和PAB-M组在基线处的三尖瓣环平面收缩偏移(TAPSE，以mm计)的箱形图。

图20B是示出了对照组(C，也被称为“假手术”组)、PAB-V组和PAB-M组在PAB后1个月时的三尖瓣环平面收缩偏移(TAPSE，以mm计)的箱形图。

图20C是示出了对照组(C，也被称为“假手术”组)、PAB-V组和PAB-M组在安乐死时的三尖瓣环平面收缩偏移(TAPSE，以mm计)的箱形图。

图21A是示出了对照组(C，也被称为“假手术”组)、PAB-V组和PAB-M组在基线处的dP/dt max(以mmHg/秒计)的箱形图。

图21B是示出了对照组(C，也被称为“假手术”组)、PAB-V组和PAB-M组在安乐死时的dP/dt max(以mmHg/秒计)的箱形图。

图22是示出了利用肺动脉捆扎术(PAB)的动物模型研究以及临床发现中的一些的概要的示意图。

具体实施方式

右心室肥大(RVH)和衰竭(RVF)是影响患者长期预后的心脏病发病率和死亡率的主要原因，其中右心室(RV)由于肺动脉高血压、流出道阻塞而异常负荷，或作为系统性心室发挥功能。作为初始的代偿步骤，RV通过增加壁厚度来适应这些血流动力学变化，以提供更高的收缩力来克服后负荷的增加。最终，这些机制是不够的，并且肥大继续下去会引起扩张以及收缩衰竭。临床观察表明，与右侧相比，左侧的这些代偿性变化更有效地保持收缩功能并保持更长的时间段，而右侧则衰竭发生得更迅速。线粒体功能直接影响心脏功能和收缩力。Rv缺乏对长期增加的压力负荷的适应性与线粒体和钙处理机制无法跟上心肌组织增厚的需求相关联。具有三磷酸腺苷(ATP)消耗和电子传递链(ETC)功能障碍的无效钙循环进一步限制ATP合成，导致生物能量衰竭(McCully JD,Rousou AJ,Parker RA,Levitsky S.Ageand gender differences in mitochondrial oxygen consumption and free matrixcalcium during ischemia/reperfusion and with cardioplegia and diazoxide.AnnThorac Surg.2007；83:1102-1109)。这些事件最终会压倒细胞调控机制，并且导致RVH中心脏功能更迅速地恶化。

线粒体酶活性以及线粒体DNA(mtDNA)含量从肥大到衰竭逐步降低，在RV功能障碍中起着重要作用。与这些发现相对应，本公开已经使用匹配样品的组合微阵列和蛋白质组学分析证实，在使薄壁RV适应病理负荷方面，关于线粒体数量/质量的线粒体功能与心肌组织发育同样重要。另外，促凋亡途径的激活(特别是与线粒体有关的激活)和钙信号传导途径的下调与进展至衰竭相关联。作为响应，用于线粒体稳定的初始上调氧化磷酸化和相关联钙处理，是为了满足心肌生长的能量需求从而使薄壁RV适应压力超负荷。然而，随着长期暴露于增加的压力负荷，线粒体无法适应，从而导致因收缩功能下降而迅速恶化。进展至心力衰竭与能量储备能力下降相关联，并且代偿机制不再能够支持能量供应降低与适应性RV壁增厚需求增加之间的不平衡。

线粒体在肥大至心力衰竭的进展中的核心作用已经得到认可。目前用于患有右心衰竭的患者的疗法在很大程度上局限于靶向肺功能的治疗，而不是直接干预由于线粒体功能障碍而导致的严重心肌能量缺失。先前的研究证实了自体能胜任呼吸作用的线粒体的治疗性移植的成功技术和安全技术，这些技术使用从健康组织中分离的有活力的线粒体来替代和/或补充天然受损害线粒体的池。然而，主要在急性缺血再灌注损伤模型中证实了治疗成功，其中线粒体移植的有益效果已得到确认(McCully JD,Cowan DB,Pacak CA,Toumpoulis IK,Dayalan H,Levitsky S.Injection of isolated mitochondria duringearly reperfusion for cardioprotection.Am J Physiol Heart Circ Physiol.2009；296(1):H94105)。对于以下所知较少：线粒体移植是否能够实现由于进展性压力超负荷肥大而导致的除了线粒体功能适应性维持之外的长期线粒体功能障碍。此外，由于代谢适应性改变和线粒体功能障碍的组合，用于移植的线粒体的来源可能起着关键作用。如所报道的，线粒体使自己适应于它们所供应的组织所需要的作用(Ferná ndez-Vizarra E,Enríquez JA,Pé rez-Martos A,Montoya J,Ferná ndez-Silva P.Tissue-specificdifferences in mitochondrial activity and biogenesis.Mitochondrion.2011；11(1):207-213.)。与慢缩骨骼肌相比，快缩骨骼肌的线粒体习惯于高葡萄糖代谢细胞，这些细胞可以迅速地使自己适应于增加的能量需求。已经确认，肥大和衰竭的心肌转而使用葡萄糖作为代谢底物(Doenst T,Nguyen TD,Abel ED.Cardiac metabolism in heartfailure:Implications beyond ATP production.Circ Res.2013；113:709 724.)。因此，用于移植的线粒体的来源可能具有相关性，因为目的是在衰竭的心脏中恢复缺陷的能量产生和线粒体动力。由于衰竭心脏中的心肌线粒体已经受损，因此必须收集来自其他细胞来源的线粒体以用于移植。

本公开部分地基于以下令人惊讶的发现：线粒体可以用于预防、治疗和/或减少心力衰竭症状中的一种或多种，甚至在心力衰竭发生之前也是如此。因此，在一个方面，本公开提供了在处于心力衰竭风险的受试者中使心力衰竭最小化、减少心力衰竭风险、改善至少一种心力衰竭症状、预防或治疗与心力衰竭相关联的细胞损伤、组织损伤和/或器官损伤的方法。

在一些实施方案中，本文描述的在受试者中治疗或预防心力衰竭的方法包括将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于受试者。在一些实施方案中，通过直接注射、心肌内注射或输注将组合物施用于受试者。在一些实施方案中，受试者患有以下各项或处于发展以下各项的风险中：右心室肥大(RVH)、左心室肥大(LVH)、或右心室衰竭(RVF)、或左心室衰竭(LVF)。

本公开还至少部分地基于以下发现：可以通过将分离的线粒体以及连接至治疗剂、诊断剂和/或成像剂的分离的线粒体注射至患者的血管中而将它们递送至患者的组织。使用相对简单的医疗程序，熟练从业人员可以将线粒体局部地和/或一般地分布至患者的组织和/或细胞以用于多种目的。进一步地，线粒体可以用作载体试剂，例如，以将治疗剂、诊断剂和/或成像剂递送至患者的组织。与涉及纳米颗粒的一些传统治疗方案相比，进一步注意到线粒体没有毒性并且不会引起任何实质性的不利的免疫或自身免疫应答。

不意图受任何理论的束缚，认为输注的线粒体通过首先粘附至内皮而渗出通过毛细血管壁。在将线粒体注射或输注至动脉中之后，它们可以跨越血管的内皮并且通过内体肌动蛋白依赖性内化过程被组织细胞摄取。

组合的线粒体试剂

组合的线粒体试剂包括与试剂(如治疗剂、诊断剂和/或成像剂)物理相关联的线粒体。

治疗剂可以是具有治疗或预防用途的任何试剂。示例性的治疗剂包括例如用于缺血相关病症的治疗剂、用于治疗癌症的细胞毒性剂等。在一些情况下，线粒体可以将治疗剂递送至特定细胞，例如，肿瘤细胞。治疗剂可以是例如细胞内抑制剂、减活剂、毒素、阻止物质(arresting substance)和/或细胞抑制物质/细胞毒性物质，其一旦在细胞内，就会抑制、破坏、阻止、修饰和/或改变细胞，使得该细胞不再能正常发挥功能和/或存活。治疗剂可以是恢复细胞适当功能的试剂，例如，用于基因疗法的DNA载体。治疗剂可以是例如无机化合物或有机化合物；小分子(小于500道尔顿)或大分子；蛋白质分子(proteinaceousmolecule)，如肽、多肽、蛋白质、翻译后修饰的蛋白质、或抗体；或核酸分子，如双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA或三螺旋核酸分子。在一些实施方案中，治疗剂可以是衍生自任何已知的生物体(例如，衍生自动物、植物、细菌、真菌、原生生物或病毒)的天然产物或来自合成分子的文库。在一些实施方案中，治疗剂可以是单体化合物或多聚化合物。一些示例性治疗剂包括细胞毒性剂、DNA载体、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、反应性肽、纳米颗粒、微球和荧光分子。

诊断剂是具有诊断用途的试剂。在一些实施方案中，由于线粒体将诊断剂携带至细胞中，诊断剂可以被设计成用于确定细胞内的状况，例如，细胞内的pH和氧化应激(oxidative stress)。

成像剂是成像技术中所采用的试剂。该技术或模式包括但不限于X射线、计算机断层摄影术(CT)、磁共振成像(MRI)、闪烁扫描术、荧光、超声等。成像剂可以是荧光的和/或放射性的。在一些实施方案中，成像剂也可以是诊断剂。示例性成像剂包括但不限于MitoTracker荧光团(Thermo Fisher Scientific Inc.)、RFP、BacMam 2.0(Thermo FisherScientific Inc.)、pH敏感性pHrodo荧光染料(Thermo FisherScientific Inc.)、¹⁸F-罗丹明6G、¹⁸F标记的罗丹明B、磁性氧化铁纳米颗粒以及金基和铂基纳米颗粒。

如上文所讨论，组合的线粒体试剂包含彼此直接和/或间接物理接触的线粒体和试剂。例如，试剂可以连接至线粒体、附接至线粒体、包埋在线粒体膜中，或者完全或部分封闭在线粒体中。在一些情况下，药剂可以共价地连接至线粒体。在一些情况下，试剂通过共价键(例如，酰胺键和二硫键)直接连接至线粒体膜的成分，或通过接头(例如，肽接头)或另一共价键合的试剂间接连接至线粒体膜的成分。在其他情况下，试剂可以例如通过疏水相互作用、范德华力(Van der Waals)相互作用和/或静电相互作用等非共价地连接至线粒体。

在一些实施方案中，组合的线粒体试剂可以包含两种或更多种不同类型的试剂，例如，两种不同种类的治疗剂、三种不同种类的成像剂、一种治疗剂和一种成像剂、治疗剂和诊断剂等。熟练从业人员将理解任何变化都是可能的。

一种用于连接线粒体和试剂的特别有用的接头提供了注射后试剂的持续释放。这可以例如使用腙官能团来实现。例如，形成腙以将试剂共价地结合至线粒体膜上的成分。一旦该组合的线粒体试剂被细胞摄取，pH的变化将导致腙的水解，从而在细胞内释放结合的试剂。

在一些实施方案中，可以使用官能化表面化学法将治疗剂、诊断剂和/或成像剂连接至线粒体外膜。在一些情况下，异双官能化学法(heterobifunctional chemistries)可以将治疗剂、诊断剂和/或成像剂连接至线粒体表面，并且一旦这些试剂被内化，它们可以通过与细胞间酯酶的相互作用(例如经由与乙酰氧基甲酯的相互作用)或通过紫外光活化或近红外光活化策略而被释放。紫外光活化和近红外光活化策略描述例如在Zhou,Fang,Hanjie Wang和Jin Chang,"Progress in the Field of Constructing Near-InfraredLight-Responsive Drug Delivery Platforms,"Journal of Nanoscience andNanotechnology 16.3(2016):2111-2125；Bansal,Akshaya和Yong Zhang,"Photocontrolled nanoparticle delivery systems for biomedical applications,"Accounts of chemical research 47.10(2014):3052-3060；Barhoumi,Aoune,Qian Liu和Daniel S.Kohane,"Ultraviolet light-mediated drug delivery:Principles,applications,and challenges,"Journal of Controlled Release 219(2015):31-42中。它们中的每一个均通过引用以其整体并入。

药物组合物和其他组合物

本公开提供了包含分离的线粒体的组合物、包含组合的线粒体试剂的组合物、包含分离的线粒体和组合的线粒体试剂二者的组合物、以及使用此类组合物的方法。

本文描述的药物组合物可以包括线粒体和/或组合的线粒体试剂以及药学上可接受的载体。如本文所用，语言“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在一些实施方案中，药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水、盐水、Krebs缓冲液、Tyrode溶液、造影介质或欧乃派克(omnipaque)、或其混合物。在一些实施方案中，药学上可接受的载体是无菌线粒体缓冲液(300mM蔗糖；10mM K+-HEPES(钾缓冲的(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，pH 7.2)；1mM K+-EGTA(钾缓冲的乙二醇四乙酸，pH 8.0))。在一些实施方案中，药学上可接受的载体是呼吸作用缓冲液(250mM蔗糖，2mM KH₂PO₄，10mM mgCl₂，20mM K-HEPES缓冲液(pH 7.2)和0.5mMK-EGTA(pH 8.0))。

药物组合物通常被配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如，吸入)、舌下、透皮(例如，局部)、跨粘膜和直肠施用。

药物组合物可以被配制成用于多种临床用途，例如成像、治疗伤口、治疗损伤、保存器官、改善器官或组织中的线粒体功能、以及皮肤护理。在一些情况下，药学上可接受的载体是用于成像目的的造影剂。在一些实施方案中，药物组合物可以包括抗菌剂、抗细菌剂(例如，抗生素)、抗真菌剂、消毒剂、镇痛剂、麻醉剂、类固醇、营养补充剂、醚油(etherealoil)等。麻醉剂是可以预防手术或治疗期间疼痛的药物。示例性的镇痛剂包括但不限于对乙酰氨基酚、非类固醇抗炎药、水杨酸盐类、布洛芬和利多卡因。示例性的抗细菌剂包括但不限于二氯苯甲醇(dichlorobenzyl alcohol)、戊间甲酚和抗生素。示例性的抗生素包括青霉素类碳青霉烯类、头孢菌素氨基糖苷类、杆菌肽、短杆菌肽、莫匹罗星、氯霉素、甲砜霉素、林可霉素、克林霉素、大环内酯类、新生霉素、多黏菌素、利福霉素、壮观霉素、四环素类、万古霉素、替考拉宁、链阳性菌素、抗叶酸剂、磺胺类、甲氧苄啶、乙胺嘧啶、硝基呋喃、乌洛托品扁桃酸盐、乌洛托品马尿酸盐、硝基咪唑类、喹诺酮、氟喹诺酮类、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、对氨基水杨酸、环丝氨酸、卷曲霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、氨硫脲和紫霉素。抗菌剂是可以应用于活组织/皮肤以减少感染、败血症或腐烂的可能性的抗微生物物质。示例性的抗菌剂包括但不限于氯己定及其盐、苄烷铵及其盐、三氯生以及十六烷基氯化马洛芬(cetylpyridium chloride)。示例性的抗真菌剂包括但不限于托萘酯、咪康唑、氟康唑、克霉唑、益康唑、酮康唑、伊曲康唑、特比萘芬、两性霉素、制霉菌素和游霉素。示例性的类固醇类包括但不限于醋酸强的松(prednisone acetate)、戊酸强的松(prednisone valerate)、强的松龙(prednisolone)、阿氯米松二丙酸酯(alclometasone dipropionate)、氟新诺龙丙酮(fluocinolone acetonide)、地塞米松、甲基强的松龙、地奈德(desonide)、新戊酸酯(pivolate)、戊酸氯可托龙(clocortolone pivolate)、曲安奈德、泼尼卡酯、丙酸氟替卡松、氟氢缩松、糠酸莫米松、去羟米松、倍他米松、倍他米松二丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍他米松丙酸酯、倍他米松苯甲酸酯、二氟松二乙酸酯、氟轻松醋酸酯(fluocinonide)、哈西奈德(halcinonide)、安西奈德(amcinonide)、卤倍他索丙酸酯(halobetasol propionate)和丙酸氯倍他索(clobetasol propionate)。示例性的营养补充剂包括但不限于维生素、矿物质、草药产品以及氨基酸。维生素包括但不限于维生素A、维生素B族、维生素C、维生素D族、维生素E和维生素K。醚油包括但不限于衍生自薄荷、鼠尾草、冷杉、薰衣草、罗勒、柠檬、杜松、迷迭香、桉树、万寿菊、洋甘菊、橙等的那些。这些试剂中的许多描述例如在WO2008152626(其通过引用以其整体并入)中。包含线粒体和/或组合的线粒体试剂的组合物可以以任何形式(例如，液体、半固体或固体)配制。示例性的组合物包括液体、霜剂、软膏剂、药膏剂(salve)、油剂、乳状液、脂质体配制剂等。

制造包含线粒体和/或组合的线粒体试剂的组合物的方法

分离线粒体

用于本文描述的方法的线粒体可以从任何来源分离或提供，例如，从培养的细胞或组织中分离。示例性的细胞包括但不限于肌肉组织细胞、心脏成纤维细胞、培养的细胞、HeLa细胞、前列腺癌细胞、酵母等、以及其任何混合物。示例性的组织包括但不限于肝组织、骨骼肌、心脏、脑和脂肪组织。线粒体可以从自体来源、同种异体来源和/或异种来源的细胞中分离。在一些情况下，从具有遗传修饰的细胞(例如，具有经修饰的mtDNA或经修饰的核DNA的细胞)中分离线粒体。

可以通过本领域技术人员已知的任何方式从细胞或组织中分离线粒体。在一个实例中，收集组织样品或细胞样品，然后均质化。均质化后，通过重复离心分离线粒体。替代地，可以通过尼龙筛网过滤器过滤细胞匀浆。分离线粒体的典型方法描述例如在McCullyJD,Cowan DB,Pacak CA,Toumpoulis IK,Dayalan H和Levitsky S,Injection ofisolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection,Am JPhysiol 296,H94-H105.PMC2637784(2009)；Frezza,C.,Cipolat,S.,&Scorrano,L,Organelle isolation:functional mitochondria from mouse liver,muscle andcultured filroblasts.Nature protocols,2(2),287-295(2007)；以及标题为“Productsand Methods to Isolate Mitochondria”的PCT申请(PCT/US2015/035584；WO2015192020)中；它们中的每一个均通过引用并入。

制造组合的线粒体试剂的方法

熟练从业人员将理解，试剂可以以多种方式连接至线粒体，例如，通过附接至线粒体、部分或完全包埋在线粒体膜中、封闭在线粒体中或包封在线粒体内。

不意图受任何理论或任何特定方法的束缚，认为线粒体的外膜是粘性的，因此特别适合于与多种试剂组合。在一些实施方案中，可以简单地通过孵育将药剂附接至线粒体的外膜。例如，可以在对分离的线粒体有利的温度(例如0℃至26℃、0℃至4℃，或约0℃、4℃、26℃)下将有效量的药剂与分离的线粒体在缓冲液(例如，呼吸作用缓冲液)中充分混合。该程序可用于将有效量的药剂(例如，纳米颗粒、DNA载体、RNA载体)附接至线粒体。

在一些实施方案中，由于线粒体膜上的电位，因此有机阳离子(例如，罗丹明和四甲基罗丹明(tetramethylrosamine))容易被功能性线粒体螯合。健康的线粒体膜维持细胞器内部与外部之间的电位差，其被称为膜电位。该膜电位是线粒体功能过程的直接结果，如果线粒体不能正常工作，则该膜电位可能丧失。脂溶性阳离子由于它们的正电荷以及它们在内膜脂质和基质水性空间二者中的溶解度而被线粒体螯合。类似地，在一些其他实施方案中，阴离子由于其负电荷而可以附接至线粒体的外膜。为了将线粒体与这些药剂连接，应在对分离的线粒体有利的温度(例如，约0℃或4℃)下将有效量的药剂与分离的线粒体在缓冲液(例如，呼吸作用缓冲液)中充分混合。

可以通过化学键将治疗剂、诊断剂和/或成像剂连接至线粒体膜上的磷脂、肽或蛋白质。例如，可以使用琥珀酰亚胺酯缀合物将包括荧光团(pHrodo Red(ThermoFisherScientific,Inc.))和金属颗粒(例如，30nm磁性氧化铁纳米颗粒(Sigma))的分子共价地连接至完整线粒体的外膜上暴露的蛋白质和肽上所暴露的胺基团。这些反应性试剂与非质子化的脂族胺基团(包括蛋白质的胺末端和赖氨酸残基的ε氨基)进行反应，从而产生稳定的酰胺键。在另一实例中，当药剂(例如，Mito Orange CMTMRos(Invitrogen,Carlsbad,CA，现在是Thermo-Fisher Scientific,Cambridge,MA))与功能性线粒体混合时，它们被氧化，然后与线粒体上的蛋白质和多肽上的巯基进行反应以形成缀合物。

有许多反应性化学部分可用于将治疗剂、诊断剂和/或成像剂附接至线粒体的表面(例如，羧酸、胺官能化(amine functionalized)等)。

可以经由蛋白质键合、胺键合或其他附接方法将试剂附接至线粒体外膜或内膜。替选地或另外，可以通过疏水相互作用、范德华力相互作用和/或静电相互作用将试剂附接至线粒体膜。

在许多情况下，可以将治疗剂、诊断剂和成像剂与分离的线粒体在有利的条件(例如，0℃至26℃，0℃至4℃，或约0℃、4℃、26℃，pH 7.2～8.0)下简单地混合，并且在缓冲液(例如，呼吸作用缓冲液)中一起孵育足够的时间(例如，几分钟、5分钟、10分钟或者1小时)。

制备组合的线粒体试剂的示例性方法描述在McCully et al,Injection ofisolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection,Am JPhysiol 296,H94-H105.PMC2637784(2009)；以及Masuzawa et al,Transplantation ofautologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury,Am J Physiol 304,H966-982.PMC3625892(2013)中。前述中的每一个均通过引用以其整体并入。

制备包含线粒体和/或组合的线粒体试剂的组合物的方法

可以将分离的线粒体和组合的线粒体试剂与药学上可接受的载体混合，以制造药物组合物。药学上可接受的载体包括可用于促进线粒体和/或组合的线粒体试剂的储存、稳定性、施用、细胞靶向和/或递送的任何化合物或组合物，包括但不限于合适的载剂、稀释剂、溶剂、赋形剂、pH改性剂、盐、着色剂、流变改性剂、润滑剂、包衣、填充剂、消泡剂、聚合物、水凝胶、表面活性剂、乳化剂、佐剂、防腐剂、磷脂、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯及其衍生物、蜡、油以及水。在一些实施方案中，将分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂混悬浮在水、盐水、缓冲液、呼吸作用缓冲液或无菌线粒体缓冲液中，以用于体内递送。药学上可接受的盐、缓冲液或缓冲系统包括但不限于可以包括在本文描述的组合物中的盐水、磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或呼吸作用缓冲液。可以利用具有促进体内递送至细胞的能力的载剂(例如，脂质体)来促进将组合的线粒体试剂递送至靶细胞。

制造组合物(例如，液体组合物、半固体组合物和固体组合物(例如，液体、霜剂、洗剂、软膏剂、油剂等))的方法是本领域众所周知的。熟练从业人员将理解，可以修改此类已知方法，以添加一个或更多个步骤，从而添加线粒体和/或组合的线粒体试剂并形成本文描述的组合物。熟练从业人员将理解，在一些情况下，本文描述的组合物可以包括多于一种类型的组合的线粒体试剂。例如，包括包含线粒体的组合物，其中基本上每个线粒体与多种类型的试剂相关联。还包括包含线粒体的组合物，其中每个线粒体仅与一种类型的试剂配对，但其中组合物包含线粒体/试剂配对的混合物。

治疗心血管疾病

心脏是一个高能量器官，其需要持续供氧才能维持正常功能。在有氧条件下，心脏主要通过线粒体获得其能量，线粒体占心肌细胞总体积的30％。缺血发作后，高能磷酸水平迅速下降，同时线粒体结构、体积、耗氧量和ATP合成发生改变。

本公开提供了治疗或预防心血管疾病(例如，心力衰竭)的方法。心血管疾病是指涉及心脏或血管的一类疾病。心血管疾病包括例如冠状动脉疾病(CAD)(如心绞痛和心肌梗死(通常称为心脏病发作))、中风、心力衰竭、高血压性心脏疾病、风湿性心脏疾病、心肌病、心律失常、先天性心脏病、瓣膜性心脏疾病、心脏炎、主动脉瘤、外周动脉疾病、血栓栓塞性疾病和静脉血栓形成等。

心力衰竭也称为慢性心力衰竭，是指心脏无法维持足够的血流量来满足身体需要的病症。心力衰竭的体征和症状通常包括呼吸急促、过度疲劳和腿部肿胀。锻炼能力有限在心力衰竭患者中也很常见。如在本上下文中所使用，所谓“治疗”是指改善与疾病相关联的病症的至少一种症状。通常，治疗会导致血液供应的改善，以及一种或多种症状(例如，呼吸急促、过度疲劳和腿部肿胀)的改善。

通常，方法涉及将如本文所描述的组合物(例如，包含分离的线粒体的组合物或包含组合的线粒体试剂的组合物)施用于需要此种治疗或已确定需要此种治疗的受试者。

在一些方面，本文描述的方法还可以用于维持心室收缩力(例如，右心室(RV)收缩力)、维持毛细血管密度(例如，RV毛细血管密度)、预防心室扩张(例如，RV扩张)、延迟心力衰竭(例如，RVF)的发作或减少发展心血管疾病(例如，心力衰竭)的风险。

本公开提供了在处于心力衰竭风险的受试者中使心力衰竭最小化、减少心力衰竭风险、改善心力衰竭的至少一种症状、预防或治疗与心力衰竭相关联的细胞损伤、组织损伤和/或器官损伤的方法。

如本文所用，术语“处于心力衰竭风险”是指与人群中(例如，同一年龄组内)正常人的心力衰竭风险相比，心力衰竭风险增加。在一些实施方案中，风险比人群中正常人的心力衰竭风险高出约或至少50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，风险比人群中正常人的心力衰竭风险高出约或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍。在一些实施方案中，年龄组为至少40、50、60、70或80岁。

该增加的心力衰竭风险可能是由于各种因素造成的，例如，遗传因素(例如，遗传突变)、环境因素(例如，职业风险、污染)、各种疾病、医疗程序(例如，手术、器官/组织移植)、行为(例如，吸烟、不活动)等。一旦受试者被鉴定为具有心力衰竭风险，就可以将治疗有效量的如本文所描述的组合物施用于受试者以减少心力衰竭风险。风险也可能由潜在的医疗程序引起。如本文所用，术语“医疗程序”是指旨在实现卫生保健递送结果的行动过程。医疗程序可以包括例如诊断程序、治疗程序和手术程序。一些医疗程序包括例如体外膜肺氧合(ECMO)、化学疗法、放射疗法、气管插管、基因疗法、麻醉、消融、切断术、心肺复苏(CPR)、冷冻手术、内窥镜手术、偏侧椎板切除术、图像引导手术、膝关节软骨替代疗法、椎板切除术、腹腔镜手术、切石术、碎石术、脑叶切除术、新阴道成形术(neovaginoplasty)、放射手术、立体定向手术、阴道成形术、移植(例如，组织或器官移植)、异种移植等。卫生保健提供者可以确定医疗程序和行为(例如，吸烟)是否能够增加心力衰竭风险。许多风险因素是本领域已知的，包括例如高血压、心肌梗死、心脏瓣膜异常、心肌病、心脏疾病家族史和糖尿病。在这些情况下，可以在这些程序之前将治疗有效量的如本文所描述的组合物施用于受试者，以使风险最小化。

在一些实施方案中，本文描述的方法可以用于在受试者中治疗或预防心力衰竭。在一些实施方案中，受试者患有以下各项或处于发展以下各项的风险中：右心室肥大(RVH)、左心室肥大(LVH)、右心室衰竭(RVF)或左心室衰竭(LVF)。

右心室肥大(RVH)是一种由包围右心室的心肌的异常增大定义的病况。RVH通常由于慢性肺病或心脏结构缺陷而发生。RVH的最常见原因之一是肺动脉高血压(PH)。肺动脉高血压被表征为向肺供应血液的血管中的血压升高。肺动脉高血压可能导致肺动脉压力升高。右心室试图通过改变其形状和大小来代偿该种升高的压力。单个肌细胞的肥大导致右心室壁厚度的增加。肺动脉高血压的常见原因包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺栓塞和其他限制性肺病。RVH常常由于这些病症而发生。RVH还响应于心脏结构缺陷而发生。一个常见的原因是三尖瓣关闭不全。三尖瓣关闭不全是一种由于三尖瓣无法正常关闭而使血液回流的病症。其他可能导致RVH的结构缺陷包括法洛四联症(tetralogy of Fallot)、室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄和房间隔缺损。RVH还与腹部肥胖症、空腹血糖升高、高收缩压以及左心室中壁部分缩短相关联。RVH的其他危险因素包括吸烟、睡眠呼吸暂停和剧烈活动。

因此，在一个方面，本公开提供了减少发展右心室肥大的风险的方法。该方法涉及将受试者鉴定为处于发展右心室肥大的风险中，以及将如本文所描述的组合物施用于受试者。在一些实施方案中，方法涉及将受试者鉴定为患有例如肺动脉高血压、COPD、肺栓塞、限制性肺病、三尖瓣关闭不全、法洛四联症、室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄、房间隔缺损、腹部肥胖症、空腹血糖升高、高收缩压和/或左心室中壁部分缩短等。

左心室肥大(LVH)是心脏左心室的心脏肌肉增厚。虽然LVH本身不是一种疾病，但它通常是涉及心脏的疾病的标志。可能导致LVH的疾病过程包括增加致使心脏必须收缩的后负荷的任何疾病，以及心脏肌肉的一些原发性疾病。可能导致LVH的后负荷增加的原因包括主动脉瓣狭窄、主动脉瓣关闭不全和高血压。导致LVH的心脏肌肉原发性疾病被称为肥大型心肌病，其可能导致心力衰竭。长期存在的二尖瓣关闭不全也可能作为代偿机制导致LVH。

因此，在一个方面，本公开提供了减少发展左心室肥大的风险的方法。该方法涉及将受试者鉴定为处于发展左心室肥大的风险中，以及将如本文所描述的组合物施用于受试者。在一些实施方案中，该方法涉及将受试者鉴定为患有例如主动脉瓣狭窄、主动脉瓣关闭不全、高血压、肥大型心肌病和/或二尖瓣关闭不全等。

心力衰竭(HF)也称为充血性心力衰竭，是指心脏无法充分泵送来维持血液流动以满足身体需要的情况。心力衰竭的体征和症状通常包括呼吸急促、过度疲劳和腿部肿胀。锻炼能力有限也是常见特征。心力衰竭的常见原因包括冠状动脉疾病，包括先前的心肌梗死(心脏病发作)、高血压、心房颤动、瓣膜性心脏疾病、过量饮酒、感染和心肌病。心脏的左侧从肺接收富含氧的血液，并且将其向前泵送至体循环(除肺循环之外的身体其他部位)。心脏左侧衰竭会导致血液回流(充血)至肺中，从而导致呼吸系统症状以及由于氧合血供应不足而引起的疲劳。右侧心力衰竭通常由肺源性心脏病引起，肺源性心脏病通常由肺循环困难引起，如肺动脉高血压或肺动脉狭窄。

因此，在一个方面，本公开提供了减少发展心力衰竭的风险的方法。该方法涉及将受试者鉴定为处于发展心力衰竭的风险中，以及将如本文所描述的组合物施用于受试者。在一些实施方案中，受试者患有LVH或RVH，因此发展心力衰竭的风险增加。在另一方面，本文描述的方法还可以用于治疗以下各项或减少发展以下各项的风险：肺源性心脏病或肺部病症(例如，慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎、肺气肿、囊性纤维化、胸腔积液或支气管扩张)。

诊断心血管病症的方法是本领域已知的。诊断心血管病症的一种主要方法是超声心动图，其可以用于测量心脏肌肉的厚度。例如，心电图(ECG)通常用于显示LVH个体心脏电压升高的体征。

本公开还提供了治疗缺血性心脏和其他缺血相关疾病的方法。使用药物学和/或外源性底物干预(单独或与手术技术组合)来减轻心肌组织坏死和改善缺血后功能的尝试仅提供了有限的心脏保护作用。尽管进行了这些干预，但线粒体损伤和功能障碍仍然是心肌缺血后的主要问题，并且仍然是发病率和死亡率的重要原因。线粒体损伤主要发生在缺血期间而不是再灌注期间，并且线粒体呼吸作用功能的保持增强了收缩恢复并缩小了心肌梗死的尺寸。

本文描述的方法可以用于治疗缺血性心脏。例如，可以将有效量的分离的线粒体注射至受试者的血管中，例如，受试者的冠状血管系统。例如，可以将约1×10⁷个线粒体施用至受试者的冠状血管系统中。注射的线粒体在移植后被心肌细胞内化并提供增强的氧消耗，上调增强梗死后的心脏功能的趋化因子，并且上调对保持心肌能量特性很重要的蛋白质途径的表达。在另一实例中，可以将有效量的线粒体直接注射至风险区域(局部缺血区域)。可以在心脏的不同位点处重复注射若干次。

再灌注损伤是当血液在一段时间的缺血或缺氧后返回组织时，由血液供应造成的组织损伤。当血流量恢复时，缺血期间氧气和营养物的缺乏会导致炎症和氧化性损伤。炎症应答进一步在组织中导致再灌注损伤。因此，在一些情况下，治疗还涉及将免疫抑制剂施用于患者。免疫抑制剂可以例如单独地施用，但作为与线粒体试剂的同时治疗。替代地或另外，免疫抑制剂可以连接至线粒体，以形成可以用于治疗的组合的线粒体试剂。特别有用的免疫抑制剂是双膦酸盐类。

一些其他器官中的缺血/再灌注损伤通常也与线粒体损伤和功能障碍相关联。这些器官包括但不限于肺、肾、肝、骨骼肌、脑等。这些损伤或疾病包括但不限于缺血性结肠炎、肠系膜缺血、脑缺血、中风、急性肢体缺血、紫绀(cyanosis)和坏疽。所描述的方法也可以用于在这些器官/组织中治疗缺血损伤。对于这些治疗，可以将分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂直接注射至器官组织或注射至将血液携带至受试者的靶器官/组织或损伤位点的血管中。

心脏手术

可以将分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂递送至心脏，以降低心肌顿抑，并且允许心脏从手术程序(例如，心麻痹)中脱离、以及在不增加心率或心脏氧需求的情况下恢复心脏。在一些实施方案中，该方法涉及将分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂直接注射至心脏。在一些方法中，将分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂注射至冠状动脉中。

成像

通常通过将线粒体与成像剂的共孵育，可以将成像剂附接至线粒体。此类成像剂包括但不限于来自Thermo Fisher Scientific Inc.的MitoTracker和pHrodo荧光团、¹⁸F-罗丹明6G以及氧化铁纳米颗粒。

可以将包括成像剂的组合的线粒体试剂注射至组织(例如，心脏组织)中，或通过血管灌注。可以使用成像技术(如正电子发射断层扫描术(PET)、显微计算机断层扫描术(μCT)和磁共振成像(MRI)、亮视野显微术以及3-D超分辨率显微术等)来检查含有标记的线粒体的组织。熟练从业人员将理解，可以使用其他成像技术或模式。它们包括但不限于X射线、闪烁扫描术、荧光和超声。

施用

可以通过静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内注射和/或通过骨内输注将分离的线粒体和组合的线粒体试剂施用于患者。在一些实施方案中，可以通过直接注射或通过血管输注来递送分离的线粒体和组合的线粒体试剂。

一旦将线粒体注射至组织中，线粒体就会被注射位点周围的细胞摄取。因此，在一些实施方案中，注射位点是靶位点。在一些其他实施方案中，将线粒体注射至将血液携带至靶位点(例如，器官、组织或损伤位点)的血管中。不意图受任何理论的束缚，证据表明，通过直接注射递送的线粒体通过肌动蛋白依赖性内吞作用被细胞内化。然而，通过血管递送的线粒体摄取似乎更为复杂。当通过血管输注递送线粒体时，线粒体被迅速地和广泛地摄取，这表明，涉及了允许线粒体迅速穿过血管壁的机制。一些研究支持了细胞可以常规地从循环中逃逸的概念。已经表明，某些心脏和间充质干细胞似乎以不同于血细胞渗出的过程而被主动地从血管系统排出(Cheng,K.,Shen,D.,Xie,Y.,Cingolani,E.,Malliaras,K.,Marbá n,E.,2012,Brief report:Mechanism of extravasation of infused stemcells.Stem Cells.30,2835-2842.；Allen,T.A.,Gracieux,D.,Talib,M.,Tokarz,D.A.,Hensley,M.T.,Cores,J.,Vandergriff,A.,Tang,J.,de Andrade,J.B.,Dinh,P.U.,Yoder,J.A.,Cheng,K.,2017.Angiopellosis as an Alternative Mechanism of CellExtravasation.Stem Cells.35,170-180)。干细胞穿过血管壁的迁移需要内皮的广泛重塑。线粒体可以使用类似的重塑机制来穿过血管壁。线粒体摄取的另一可能机制可能类似于血细胞渗出。一些细胞常规地从循环中逃逸。例如，静脉内皮细胞之间的白细胞外渗(即，血细胞渗出)是众所周知的涉及细胞粘附蛋白的过程。进一步地，输注的线粒体也可能通过内皮细胞之间的空间而穿过毛细血管壁渗出。在线粒体穿过血管内皮后，线粒体通过内体肌动蛋白依赖性内化过程被组织细胞摄取。

可以将线粒体或组合的线粒体试剂作为单次的一次性治疗或者替选地多次治疗施用于受试者，例如，间歇地或连续地持续约1、2、5、8、10、20、30、50或60天、一年、无限期的治疗过程，或直至医师确定不再需要施用线粒体或组合的线粒体试剂。

在一种施用方法中，将线粒体或组合的线粒体试剂直接注射至器官组织(例如，心脏组织)中。在一些情况下，可以在器官的不同位点处重复注射若干次。在此种方法中，可以使用带有小针(例如，28号)的无菌1ml胰岛素注射器进行注射，并且每个注射位点可以接受例如约1.2×10⁶个线粒体。

熟练从业人员将理解，应该施用于患者的线粒体和/或组合的线粒体试剂(例如，包含线粒体和/或组合的线粒体试剂的组合物)的量将根据例如专利中所治疗的病症的类型、施用途径、治疗持续时间、要治疗区域的大小和/或治疗位点的位置等而变化。熟练从业人员将能够根据这些和其他变量确定要施用的剂量。例如，可以将总共约1×10⁷个线粒体施用至受试者的血管中，例如，以治疗心肌局部缺血。作为另一实例，在较大器官或受影响区域的情况下，可以将更大数目的线粒体(例如，1×10¹⁰至1×10¹⁴个线粒体)注射至血管中。相反，在小的局灶性病变的情况下，可以将1×10³至1×10⁶个线粒体输注至患者中。因此，线粒体或组合的线粒体试剂(或包含其的组合物)的有效量是足以产生期望治疗效果的线粒体或组合的线粒体试剂的总量。有效量可以是，例如，至少或约1×10²个线粒体或组合的线粒体试剂，例如，约1×10³至约1×10¹⁴、约1×10⁴至约1×10¹³、约1×10⁵至约1×10¹²、约1×10⁶至约1×10¹¹、约1×10⁷至约1×10¹⁰、约1×10³至约1×10⁷、约1×10⁴至约1×10⁶、约1×10⁷至约1×10¹⁴、或约1×10⁸至约1×10¹³、约1×10⁹至约1×10¹²、约1×10⁵至约1×10⁸，或者至少或约1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³，或至少或约1×10¹⁴，或例如，多于1×10¹⁴的量。如本文所用，在施用于患者的背景下，术语“总量”可以指单次施用(例如，一次注射、一次输注中施用的用量)或多次施用(例如多次注射)中线粒体或组合的线粒体试剂的总量，这取决于所执行的给药方案。

可以通过多种途径(例如，直接注射、血管递送)每12至24小时将分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂施用于受试者。在一些实施方案中，可以通过多种途径(例如，直接注射、血管输注)每5至10分钟(例如，每5分钟、每10分钟)将分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂施用于受试者。

为了治疗心血管疾病或肺病，可以将分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂施用至各种血管中，这些血管包括例如主动脉、腔静脉(例如上腔静脉或下腔静脉)、冠状静脉、旋动脉、左冠状动脉、左前降支、多条肺静脉、右冠状动脉、肺静脉或肺动脉。

可以在右心室肥大(RVH)、左心室肥大(LVH)、右心室衰竭(RVF)或左心室衰竭(LVF)发作之前至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30天或者至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或者至少或约1、2、3、4或5年，将分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂施用于受试者。在一些实施方案中，可以在受试者被鉴定为处于发展可能导致心力衰竭的心血管疾病(例如，肥胖症、右心室肥大等)的风险中之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30天内或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24个月内或者约1、2、3、4或5年内，将分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂施用于受试者。

在一些实施方案中，可以在受试者被鉴定为患有可能导致心力衰竭的心血管疾病和一些其他病症(例如，肥胖症、右心室肥大等)之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30天内或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24个月内或者约1、2、3、4或5年内，将分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂施用于受试者。

在一些实施方案中，可以在右心室肥大(RVH)、左心室肥大(LVH)、右心室衰竭(RVF)或左心室衰竭(LVF)发作和/或诊断之后至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30天或者至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或者至少或约1、2、3、4或5年，将分离的线粒体和/或组合的线粒体试剂施用于受试者。

在一些实施方案中，可以通过容量规格24、25、26、27、28、29、30、31、32、33和34号针将分离的线粒体或组合的线粒体试剂直接注射至组织或器官中。在一些其他情况下，可以通过导管将分离的线粒体或组合的线粒体试剂递送至靶位点。

在一些情况下，线粒体是新鲜分离的并且是有活力的。可以在将线粒体分离之后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟、约70分钟、约80分钟、约90分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟内，将线粒体或组合的线粒体试剂施用于受试者。在一些情况下，在开始线粒体分离过程之后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟、约70分钟、约80分钟、约90分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟内，将线粒体或组合的线粒体试剂施用于受试者。在一些情况下，线粒体和/或组合的线粒体试剂可以在使用之前短期(例如，约或至少10分钟、约或至少20分钟、约或至少30分钟、约或至少40分钟、约或至少50分钟、约或至少60分钟、约或至少1小时、约或至少2小时、约或至少3小时、约或至少4小时、或者约或至少24小时)储存。

用于治疗的线粒体可以从自体来源、同种异体来源和异种来源的细胞或器官中分离。在一些情况下，从受试者的培养的细胞或组织中收集线粒体，并且将这些线粒体施用回同一受试者。在一些其他情况下，从第二受试者的培养的细胞或组织中收集线粒体，并且将这些线粒体施用于第一受试者。在一些情况下，从来自不同物种(例如，小鼠、猪、酵母)的培养的细胞或组织中收集线粒体。

实施例

在以下实例中进一步描述了本发明，这些实例不限制权利要求中所描述的本发明的范围。

实施例1：从组织样品或培养的细胞中分离线粒体的示例性方法

制备

可以制备以下溶液以分离完整的、有活力的、有呼吸作用能力的线粒体。为了使用本方法成功分离线粒体，将溶液和组织样品保持在冰上以保存线粒体的生存力。即使当保持在冰上时，分离的线粒体将随着时间表现出功能活性的降低(Olsonet al.,J Biol Chem242:325-332,1967)。如果可能的话，预先制备好这些溶液。

1M K-HEPES储备溶液(用KOH调节pH至7.2)。

0.5M K-EGTA储备溶液(用KOH调节pH至8.0)。

1M KH₂PO₄储备溶液。

1M mgCl₂储备溶液。

均质化缓冲液(pH 7.2)：300mM蔗糖，10mM K-HEPES和1mM K-EGTA。可以将该缓冲液储存在4℃下。

呼吸作用缓冲液：250mM蔗糖，2mM KH₂PO₄，10mM mgCl₂，20mM K-HEPES缓冲液(pH7.2)和0.5mM K-EGTA(pH 8.0)。可以将该缓冲液储存在4℃下。

10X PBS储备溶液：将80g NaCl、2g KCl、14.4g Na₂HPO₄和2.4g KH₂PO₄溶解在1L双蒸馏H₂O(pH 7.4)中。

通过将100mL 10X PBS移液至1L双蒸馏H₂O中来制备1X PBS。

通过将4mg枯草杆菌蛋白酶A称量至1.5mL微量离心管中来制备枯草杆菌蛋白酶A储液。可以将该储液储存在-20℃下直至使用。

通过将20mg BSA称量至1.5mL微量离心管中来制备BSA储液。可以将该储液储存在-20℃下直至使用。

从组织中分离线粒体

图1中示出了概述使用组织解离和差异过滤分离线粒体的程序步骤的图。将两份6mm活检样品冲孔物转移至解离C管中的5mL均质化缓冲液中，并且使用组织解离器的1分钟均质化程序将样品均质化(A)。将枯草杆菌蛋白酶A储备溶液(250μL)添加至解离C管中的匀浆中，并且在冰上一起孵育10分钟(B)。将匀浆以750x G离心4分钟(作为任选步骤)。将匀浆通过在冰上的50mL锥形离心管中的预润湿的40μm筛网过滤器进行过滤，然后将250μL BSA储备溶液添加至滤液中(C)。将滤液通过在冰上的50mL锥形离心管中新的预湿润的40μm筛网过滤器进行再过滤(D)。将滤液通过在冰上的50mL锥形离心管中的新的预润湿的10μm筛网过滤器进行再过滤(E)。将滤液通过在冰上的50mL锥形离心管中的新的预润湿的6μm筛网过滤器进行再过滤。所得滤液可以立即使用，或可以通过离心浓缩。在浓缩的情况下，将滤液转移至1.5mL微量离心管中，并且在4℃下以9000x g离心10分钟(F)。将上清液去除，并且将含有线粒体的沉淀重悬浮于1mL呼吸作用缓冲液中并在其中组合(G)。

在紧接的分离之前，将枯草杆菌蛋白酶A溶解在1mL的均质化缓冲液中。在紧接的分离之前，将BSA溶解在1mL的均质化缓冲剂中。使用6mm活检样品冲孔器收集两份新鲜组织样品，并且将其储存在冰上的50mL锥形离心管中的1X PBS中。将两份6mm的组织冲孔物转移至含有5mL冰冷的均质化缓冲液的解离C管中。通过将解离C管装配在组织解离器上并选择预设的线粒体分离周期(60秒均质化)来均质化组织。

将解离C管移至冰桶。将枯草杆菌蛋白酶A储备溶液(250μL)添加至匀浆中，通过倒置进行混合，将匀浆在冰上孵育十分钟。将40μm筛网过滤器放置在冰上的50mL锥形离心管上，并且用均质化缓冲液预润湿过滤器，并且将匀浆过滤至在冰上的50mL锥形离心管中。

将新鲜制备的BSA储备溶液(250μL)添加至滤液中，并且通过倒置进行混合。(如果需要线粒体蛋白质测定，则省略该步骤。)将40μm筛网过滤器放置在冰上的50mL锥形离心管上，并且用均质化缓冲液预润湿过滤器，并且将匀浆过滤至在冰上的50mL锥形离心管中。将10μm过滤器放置在冰上的50mL锥形离心管上，并且用均质化缓冲液预润湿过滤器，并且将匀浆过滤至在冰上的50mL锥形离心管中。将滤液转移至两个预冷的1.5mL微量离心管中，并且在4℃以9000x g离心10分钟。将上清液去除，并且将沉淀重悬浮在1mL冰冷的呼吸作用缓冲液中并在其中组合(G)。

将从组织中分离的线粒体立即用于注射或用于制备组合的线粒体试剂。

从培养的细胞中分离线粒体

可以从培养的细胞中分离线粒体。该程序与用于从组织样品中分离线粒体的程序基本相同，不同之处在于使用培养的细胞(例如，人成纤维细胞)而不是活检样品。

线粒体数目

通过用MitoTracker Orange CMTMRos或MitoTracker Red CMXRos(5μmol/l；Invitrogen,Carlsbad,CA，现在的Thermo-Fisher Scientific,Cambridge,Ma)标记等分试样(10μL)的分离的线粒体来确定有活力的线粒体的数目。将标记的线粒体的等分试样点在载玻片上，并且使用具有63×C-复消色差物镜(1.2W Korr/0.17NA，Zeiss)的旋转盘共聚焦显微镜来计数。线粒体用线粒体特异性染料MitoFluor Green或MitoTracker Deep Red FM(Invitrogen,Carlsbad,CA，现在的Thermo-Fisher Scientific,Cambridge,MA)进行复染。选择适当的波长以用于使用未染色的细胞和组织测量自发荧光和背景荧光。简言之，将1μl的标记的线粒体放置在显微镜载玻片上并盖上。使用MetaMorph成像分析软件在覆盖整个试样区域的低(×10)放大率下测定线粒体数目。

实施例2：制备组合的线粒体试剂的示例性方法

通过电位将线粒体与¹⁸F-罗丹明6G组合

用线粒体分离溶液A(均质化缓冲液：300mM蔗糖，10mM K-HEPES和1mM K-EGTA，pH7.2)在4℃下将¹⁸F-罗丹明6G(在20μl体积中40-100μCi)稀释至体积为1.0mL，然后在线粒体分离溶液A中与分离的线粒体(0.5ml，含有1×10⁷至1×10⁸)充分混合。在混合物中，响应于跨越线粒体内膜的电位，¹⁸F-罗丹明6G电泳式分布至线粒体基质中，并且因此被功能性线粒体隔绝。将混合物在冰上孵育10至30分钟。通过在9,000rpm(10,000g)下离心10分钟将混合物洗涤3次，并且每次将沉淀重悬浮在线粒体分离溶液A中。在最终洗涤之后，将沉淀重悬浮在呼吸作用缓冲液中。

通过线粒体外膜将线粒体与氧化铁纳米颗粒组合

将含有琥珀酰亚胺酯(10mg)的氧化铁纳米颗粒悬浮在4℃的呼吸作用缓冲液中，然后与分离的线粒体(1.0ml，含有1×10⁷至1×10⁸)充分混合。通过琥珀酰亚胺酯胺反应，氧化铁与线粒体外膜上的线粒体胺基团结合。将混合物在冰上孵育10至30分钟。通过在9,000rpm(10,000g)下离心10分钟将混合物洗涤3次，并且每次将沉淀重悬浮在线粒体分离溶液A中。在最终洗涤之后，将沉淀重悬浮在呼吸作用缓冲液中。

将线粒体与两种药剂组合

将¹⁸F-罗丹明6G(在20μl体积中40至100μCi)和含有琥珀酰亚胺酯的氧化铁纳米颗粒(10mg)组合，并且用线粒体分离溶液A在4℃下稀释至体积为1.0mL，然后在线粒体分离溶液中与分离的线粒体(0.5ml，含有1×10⁷至1×10⁸)充分混合。将混合物在冰上孵育10至30分钟。通过在9,000rpm(10,000g)下离心10分钟将混合物洗涤3次，并且每次将沉淀重悬浮在线粒体分离溶液A中。在最终洗涤之后，将沉淀重悬浮在呼吸作用缓冲液中。

通过巯基组合线粒体

将

荧光团(5μmol/l；Invitrogen,Carlsbad,CA，现在的Thermo-Fisher Scientific,Cambridge,Ma)与分离的线粒体(1.0mL)在呼吸作用缓冲液中混合。当探针与功能性线粒体混合时，它们被氧化，然后与线粒体上的蛋白质和肽上的巯基进行反应以形成缀合物。将混合物在冰上于4℃在黑暗中孵育10分钟。通过在9,000rpm(10,000g)下离心10分钟将混合物洗涤3次，并且每次将沉淀重悬浮在线粒体分离溶液A中。在最终洗涤之后，将沉淀重悬浮在呼吸作用缓冲液中。

实施例3：通过自体线粒体移植预防压力超负荷肥大心力衰竭

目标：

右心室肥大(RVH)进展为衰竭(RVF)的关键事件是由于线粒体功能障碍而导致的心肌细胞凋亡。随着有呼吸能力的线粒体的移植可用，这些实验的目的是确定注射自体线粒体是否可以预防心力衰竭。

方法：

通过在未成熟仔猪(n＝6/组)中将肺动脉捆扎50％(梯度＝15-20mmHg)来创建RVH/RVF模型。假手术操作的动物用作对照(Ctr)。通过超声心动图(以M-Mode测得的RV游离壁厚度，TAPSE)跟踪动物8周。手术后四周，用从仔猪自己的小腿肌肉中分离出来的线粒体(PAB-线粒体)或者载剂(PAB-V)通过注射至RV游离壁中来治疗被捆扎的动物。在安乐死时，对组织进行组织学分析，以确定心肌细胞肥大、纤维化(H&E、Masson’s Trichrome、结蛋白)和凋亡(通过TUNEL检测)。在基线处和安乐死时获得侵袭性PV回路测量(Ved、Dp/Dt max、Pdev)。

结果：

所有动物都存活至研究终点。手术后一个月，被捆扎的动物示出了肥大体征，与Ctr相比，其RV游离壁显著更厚(0.27±0.03cm对比0.4±0.02cm；P<0.01；图8)。在PAB-线粒体动物中，其RV壁厚度进一步增加直至研究终点，然而PAB-V心脏已经严重扩张(0.5±0.04cm对比0.28±0.08cm；P<0.01；图8)。心脏总重量(Ctr：100.6±11.4g，PAB-V：132.4±31.9g，PAB-线粒体：141.5±31.4g；P<0.05)和组织学肥大计算(结蛋白/细胞核比率：Ctr：0.17±0.02，PAB-V：0.45±0.01，PAB-线粒体：0.42±0.；P<0.05；图11A至11E)与这些发现相对应。在Ctr和PAB-线粒体心脏中没有凋亡心肌细胞丢失，但在PAB-V心脏中有3±1个/总细胞核(图12A至12C)。在基线处，所有组的Dp/Dt max为831.9±170.5，在安乐死时，在PAB-V中该值下降到501.2±158.9，与此相比，在PAB-线粒体中该值显著增加到1006±178.2，并且在Ctr心脏中该值为843.5±27.6保持不变(P<0.05)(图9-10)。在基线处，TAPSE为10.3±1.7mm，在PAB-线粒体心脏中该值显著改善，为12.3±1.1mm，与此相比，在PAB-V心脏中该值显著降低，为6.5±0.6mm(P<0.01)(图7)。

结论：

线粒体移植维持了RV的肥大性适应并且保持了收缩功能。通过针对线粒体功能障碍而直接解决心肌功能障碍，可以用于治疗患有影响右心功能的肺疾病的患者。

实施例4：用于治疗右心衰竭的自体线粒体的移植

右心室肥大(RVH)和衰竭(RVF)是心脏病发病率和死亡率的主要原因。进展为衰竭(RVF)的关键事件是由于线粒体功能障碍而导致的心肌细胞凋亡。随着有呼吸能力的线粒体的移植可用，该研究的目的是确定局部心肌内注射自体线粒体是否可以治疗心力衰竭。

在培养的肥大心肌细胞中确定了来自不同来源的移植线粒体的有益作用。通过在带有假手术组对照的未成熟仔猪(n＝6/组)中将肺动脉捆扎来建立RVH/RVF模型，使用从仔猪自身小腿肌肉分离的自体线粒体(PAB-M)以及对比使用载剂(PAB-V)通过注射至RV游离壁中来对该模型进行治疗。通过超声心动图(游离壁厚度、收缩功能)跟踪动物8周，并且在进行用于心肌细胞肥大、纤维化和凋亡的组织学分析时在研究终点处测量Dp/Dt max。无论是内化还是ATP水平，使用哪种线粒体来源没有显著差异。在4周时，被捆扎的动物示出了RVH(C 0.27±0.03cm对比PAB 0.4±0.02cm壁厚度；P＝0.01)，其在PAB-M中进一步增加，但PAB-V已经严重扩张(0.5±0.04cm对比0.28±0.08cm；P＝0.01)。在基线处，收缩功能没有不同，但在PAB-M中该功能显著改善，与此相比，在PAB-V心脏中该功能显著降低，这也通过研究终点处的Dp/Dtmax体现出来。在C中，凋亡心肌细胞损失和纤维化可以忽略不计，但在PAB-V心脏中，肥大心脏中显著的损失和纤维化的数目最高(C：1±0.4对比PAB-V：13±1.6；P＝0.001以及对比PAB-M:8±1.9；p＝0.01。PAB-V对比PAB-M p＝0.05)。通过线粒体移植直接解决心肌功能障碍，维持了RV的肥大性适应并且保持了收缩功能。

方法和结果：

动物模型

未成熟的雄性约克郡仔猪(N＝18)，称量为5-10kg，经受肺动脉捆扎术(PAB)或假手术。仔猪用特拉唑(telazol)(4.5mg/kgim)、甲苯噻嗪(2mg/kgim)和阿托品(0.04mg/kgim)镇静。经口气管插管后，用异氟醚(1-3％)和空气开始通气。监测EKG、血氧饱和度(维持在>97％)、体温和呼气末二氧化碳。放置股动脉和静脉线。将仔猪放置在它们的右侧上，将仔猪覆盖，并且在第四肋间隙中进行左胸廓切开术。在胸廓切开术之前，施用利多卡因(1％,iv)以预防心室纤维性颤动。从升主动脉剥离肺动脉(PA)，并且放置带，同时通过针穿刺监测RV和远端PA压力。将PA捆扎至其原始直径的50％。将4F血管造影导管(MeritMedical Systems,South Jordan,Ut)插入至PA中并且连接至PowerLab数据采集系统(DAQ，ADInstruments，16/35系列)，以采集数据用于基线压力计算。在放置PA带之前和之后，在心外膜获得基线超声心动图。胸廓切开术分三层关闭，并且胸膜空气通过胸管排出。将布比卡因(0.25％；<0.03mg/kg)作为局部镇痛剂滴注，并且通过苯那敏(benamine)/glunixin葡甲胺(1-2mg/kg im)和芬太尼贴剂(1-4ug/kg透皮)来提供手术后全身镇痛第一72小时。使仔猪在37℃的孵育器中恢复健康，并且在不久以后将其带回围栏。假手术(C,N＝6)涉及在PA位点处通过局部操作打开和关闭胸部。术中超声心动图后，每隔一周确定RV肥大的进展。在这些程序期间，将动物维持在异氟醚(1-3％)镇静下。

PAB后四周，按照与上文相同的麻醉方案，通过将载剂(PAB-V，N＝6)或自体线粒体(PAB-M，N＝6)直接注射至RV游离壁中来治疗动物。在无菌条件下，获得来自仔猪腓肠肌的肌肉活检，并且如上所述分离线粒体。在直视下，通过剑突下路径，使用30G针将含有10×10⁶/ml自体线粒体(PAB-M，N＝6)的1ml缓冲液(300mM蔗糖、10mM K-HEPES和1mM K-EGTA，pH为7.2并且温度为4℃)或者仅缓冲液(PAB-V，N＝6)注射至RV游离壁中的10个点上。在注射之前以及在线粒体/载剂注射之后直接进行超声心动图。切口分层闭合，并且动物恢复健康。

所有动物都存活了另外4周(初始PAB后8周)，并且每隔一周通过超声心动图监测。在研究终点处，除通过面罩而非插管维持麻醉之外，以如上所述的相同方式对仔猪进行麻醉。进行正中胸骨切开术，并且使用4F血管造影导管(Merit Medical Systems,SouthJordan,UT)侵袭性地测量PA(在PA带的近端和远端处)和主动脉压力。另外，根据使用7FScisense压力-容积(PV)环导管(Transonic,Ithaca,Ny)所获得的数据来计算PA和RV压力-容积曲线，该环导管通过RVOT插入。将PV环导管连接至Powerlab，并且使用ADVantage压力-容积系统(ADV500,Transonic,Ithaca,NY)自动校准信号。在采取所有测量之后，施用Fetal

以进行安乐死，并且切除心脏并将其在冰上用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗。获得RV游离壁活检，速冻并且储存在液氮中直至进一步使用。将单独的RV游离壁组织包埋在最佳切割温度(OCT)化合物中，速冻并且储存在-80℃下直至进行切片。使用新鲜RV游离壁进行湿/干重量计算。

分离的心肌细胞细胞培养模型

新生大鼠心肌细胞的细胞培养模型用于确定肥大心肌细胞中线粒体的内化。此外，在该模型中测试了不同线粒体来源的功能益处。我们将药物诱导的肥大样品与非肥大的对照样品进行了比较。以一式两份进行所有的分离细胞实验。

简而言之，使用市售的分离试剂盒(Worthington)来分离新生大鼠心肌细胞，并且如先前更详细的描述进行培养(Choi YH,Stamm C,Hammer PE,et al.Cardiac conductionthrough engineered tissue.Am J Pathol.2006；169:72-85)。培养两天后，细胞被分配给对照或肥大。为了在体外刺激心脏肥大，在血清饥饿24小时之后用血管紧张素II(100nM；Sigma-Aldrich)处理心肌细胞24小时。

从肌肉组织中分离线粒体

为了确定线粒体来源是否在恢复线粒体功能的益处中发挥作用，通过对从母大鼠获得的腓肠肌和比目鱼肌进行穿孔活检来收获来自两种不同骨骼肌来源(快缩肌和慢缩肌)的线粒体，并且将其与RV心肌线粒体进行比较。该方法从100mg组织样本中得到>99.5％的有活力的线粒体。用商业组织解离器将肌肉组织在均质化缓冲液(300mM蔗糖、10mM K-HEPES和1mM K-EGTA，pH为7.2并且温度为4℃)中进行均质化，随后将250μl含有枯草杆菌蛋白酶A的缓冲溶液添加在1ml均质化缓冲液中。通过倒置来混合匀浆并将其在冰上孵育10分钟，随后进行差异过滤。将滤液转移至两个预冷的微量离心管中，并且在4℃下以9,000xg离心10分钟。将上清液去除，并且将合并的沉淀重悬浮在1ml冰冷的呼吸作用缓冲液(250mmol/l蔗糖、2mmol/l KH2PO4、10mmol/l MgCl2、20mmol/l K+-HEPES缓冲液，pH 7.2，0.5mmol/l K+-EGTA，pH 8.0，5mmol/l谷氨酸盐，5mmol/l苹果酸盐，8mmol/l琥珀酸盐，1mmol/l ADP)中。用Coulter计数器(Beckman Coulter Life Sciences,Indianapolis,In)对线粒体的数目进行计数。

移植线粒体内化的确定

将线粒体在4℃下用pHrodo红色颗粒标记(ThermoFisher,Waltham,MA)预标记10分钟，然后在呼吸作用缓冲液中洗涤4次。Phrodo荧光提供了内化的阳性指示，因为它仅在被有活力的线粒体摄取后才发出荧光。将标记的线粒体重悬浮在新鲜的呼吸作用缓冲液中，并且保存最后的洗涤上清液。该洗涤用于通过将对照细胞与该上清液一起孵育来确定非特异性标记(数据未示出)。将标记的线粒体(1x100/孔)与心肌细胞(约50,000/孔)共孵育。24小时后，将培养基去除并用1x PBS洗涤细胞4次，并且将200μl新鲜培养基添加至每孔中。为了染色，将细胞在PBS中的0.1％Triton X-100中透化3分钟，并且将其与在PBS中的10％胎牛血清(FBS)中以1:1000稀释的第一抗体一起孵育1小时。作为第一抗体用于心肌细胞的结蛋白与物种适当的Alexa Fluor 488缀合的第二抗体(ThermoFisher,Waltham,MA)一起使用。使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(ThermoFisher)同时对细胞核进行染色。内化检测基于红色荧光线粒体进入结蛋白染色的呈绿色的心肌细胞中。用Zeiss荧光显微镜评估内化。

线粒体功能的确定

使用ATPlite发光ATP检测测定系统(Perkin Elmer,Waltham,MA)来确定ATP含量。单独一组细胞用于这些实验，因为标记线粒体的荧光染料可能会干扰线粒体功能。

超声心动图测量

在基线处、在治疗之前(捆扎后4周)和在研究终点(捆扎后8周)处获得超声心动图测量。所有研究均使用配备有S8-3转换器的Philips iE33设备(Philips Healthcare,Amsterdam,Netherlands)来进行，并且所有周期均通过同步ECG记录来保存。通过面积变化分数(FAC)和三尖瓣环平面收缩偏移(TAPSE)从4腔视图来评估RV功能。在舒张末期，从胸骨旁长轴(PLAX)和胸骨旁短轴(PSA)视图获得M型记录，在该记录上测量RV游离壁厚度。

侵袭性压力容积(PV)测量

根据使用7F Scisense压力-容积(PV)环导管(Transonic Systems Inc,Ithaca,NY)所获得的数据来计算PA和RV压力-容积曲线，该环导管通过右心耳插入并且用4-0Prolene缝合线固定(Ethicon Inc.,Somerville,NJ)。连接PV环导管，并且使用ADVantage压力-容积系统(ADV500,Transonic,Ithaca,NY)自动校准。在基线处和在安乐死时获得测量。使用Powerlab数据采集系统(DAQ，ADInstruments，16/35系列)采集数据，并且用所提供的软件LabChart 7采集软件(AD Instruments，Sidney，Australia)进行分析。测量了RV峰进展压力(Pdev,mmHg)、RV舒张末期压力(Ped,mmHg)以及RV压力随时间的最大变化(dp/dtmax,mmHg/s)。使用PV环导管来计算最大容积(Vmax)和舒张末期容积(Ved)。

RV组织的组织学分析

将RV组织包埋在最佳切割温度(OCT)化合物中，速冻并且储存在-80℃下直至进一步使用。获得切片，并且将冷冻载玻片储存在-80℃下直至用于染色。所有载玻片均使用带有Nikon 20x物镜(NA＝20x/0.45)的Zeiss Observer.Z1荧光显微镜进行观察。用Leica彩色数字相机对从每个载玻片中十个随机选择的视野进行拍照，并且进行分析ImageJ(版本2.0.0-rc-43，从National Institute of Health,Bethesda,MD获得)。

心肌细胞肥大的确定

除超声心动图测量之外，还使用免疫荧光染色和DAPI(1:1000，Dako，Carpinteria，CA)来评估RV肥大，该免疫荧光染色用于结蛋白(1:50，Santa CruzBiotechnology Inc.,Dallas,Tx)以使心肌细胞可视化，并且该DAPI用于确定每视野中细胞核的数目。使用ImageJ，计算每视野中结蛋白与细胞核数目的比率。

心肌细胞凋亡的确定

不受理论的束缚，已示出心肌细胞凋亡主要是线粒体功能障碍的结果，因此我们使用ApopTag Plus荧光素原位凋亡检测试剂盒(MilliporeSigma,Burlington,MA)通过TUNEL染色来确定心肌细胞凋亡。心肌细胞使用结蛋白(1:50,Santa Cruz BiotechnologyInc.,Dellas,Tx)进行复染，并且细胞核用DAPI(1:1000,Dako,Carpinteria,CA)进行复染。对TUNEL阳性细胞核进行人工计数。使用ImageJ确定每视野中细胞核的总数目。数据被表达为每1000个心肌细胞细胞核中凋亡细胞核的比率。

心肌纤维化的确定

将单独一组组织切片用Masson’s trichrome进行染色，这导致纤维化(富含胶原蛋白)区域呈蓝色，而心肌呈红色。我们测量了蓝色区域和红色区域(纤维化对比心肌)，该比率用作对纤维化的评估。用Nikon 10x物镜观察载玻片。获得每个组织样品的十个随机选择的视野，并且使用ImageJ进行分析。结果被表达为蓝色区域与红色区域的比率。

统计分析

所有结果均被报告为平均值±平均值标准误差(SEM)。在确认数据的正态分布后，进行用于多组比较的ANOVA以及Bonferroni事后分析，以获得统计显著性的计算(SPSS 23,IBM Corporation,Armonk,NY)。≤0.05的概率值被认为是统计上显著的。

心肌细胞细胞培养模型

心肌细胞大小被确定为暴露于血管紧张素II后肥大(H)的指标。治疗后，与对照心肌细胞相比，心肌细胞大小显著增大，其被表达为每视野中每细胞核数目的比率(C：2.4±0.2对比H：4.2±0.5；p＝0.01)。线粒体以与内化至对照心肌细胞中相同的量级内化至肥大的RV心肌细胞中(图15)。

与对照相比，肥大心肌细胞中每数目心肌细胞表达的ATP水平降低(C：404±28对比H-无线粒体：256±23；P＝0.01)，但在线粒体移植后被归一化至超常水平。没有观察到使用哪种线粒体来源的统计学差异(H-心脏线粒体：541±36对比H-腓肠肌线粒体：527±98对比H-比目鱼肌线粒体：531±19；n.s.)。骨骼肌线粒体与从心肌分离出来的线粒体同样地应答(图16)。

动物模型

所有18头仔猪均存活至研究终点。在PAB-V(12.1±1.6)与PAB-M(9.7±1.9)组之间，在研究终点处在PA带(mmHg，平均±SEM)上测得的平均梯度没有显著性差异(P＝0.8)。无论是在任何干预之前(C：12.2±1.5，PAB-V：11.4±1.5，PAB-M：11.9±0.9；P＝0.9)，还是在研究终点处(C：17.3±3.1，PAB-V：16.6±1.2，PAB-M：17.8±0.9；P＝0.4)，三组之间的体重(单位：kg)均没有差异。然而，在研究终点处，与假手术组对照相比，PA捆扎的动物的全心重量(单位：克)显著更高(C：100.6±4.7对比PAB-V：132.4±13和PAB-M：141.6±12.8；P<0.05)。三组之间的RV湿重/干重比率(湿-干重/干重)没有显著差异(C：4.1±0.05，PAB-V：5.3±0.09，PAB-M：4.9±0.3；P＝0.5)。

组织学分析

通过计算每视野中心肌面积与细胞核数目的比率，从组织学上评估肥大。在研究终点处，与假手术组对照相比，两个PAB组的肌肉质量均示出显著增加(C：0.2±0.02对比PAB-V：0.36±0.02和PAB-M：0.36±0.3；P＝0.001)。该发现与心肌细胞凋亡的存在有关，其中PAB-V心脏已示出最高数目的凋亡阳性心肌细胞细胞核(C：1±0.4对比PAB-V：13±1.7对比PAB-M：8±1.9；P<0.05；图11A至11E和17A至17B)。PAB-V线粒体还是肿胀的，并且嵴减少(图13A至13C)。如下结果也支持了这些发现：与线粒体治疗的肥大心脏相比，在载剂治疗的肥大心脏中，心肌纤维化显著增加(C：4±0.55对比PAB-V：15±1.3对比PAB-M：10±1.1；P<0.05；图17C至17D)。

超声心动图测量

除心肌细胞肥大的组织学评估之外，还在舒张末期的M模式记录上测量了以厘米为单位的右心室壁厚度。在任何干预之前，各组之间的基线壁厚度没有显著性差异(C：0.25±0.01，PAB-V：0.24±0.01，PAB-M：0.25±0.01；P＝0.48)，但在捆扎后4周内，在捆扎组中，该值显著增加(C：0.28±0.01对比PAB-V：0.4±0.02和PAB-M：0.38±0.02；P<0.001)。在研究终点处，线粒体治疗的心脏保持其壁厚度，然而载剂治疗的心脏回到基线，这指示了扩张(C：0.28±0.01对比PAB-V：0.34±0.03；P＝0.15；对比PAB-M：0.47±0.02；P＝0.05)。(图8和18A至18C)。

各组之间的基线三尖瓣环平面收缩偏移(TAPSE，单位：mm)没有差异(C：10.6±0.2，PAB-V：10±0.4，PAB-M：9.8±0.2；P＝0.2)，但在PAB后4周，与假手术对照相比，在捆扎组中，该值显著降低(C：12.3±0.6对比PAB-V：8.2±0.3和PAB-M：8±0.3，P<0.001).在用线粒体治疗之前，两个肥大组之间没有差异(PAB-V对比PAB-M；P＝0.9)。线粒体移植后四周，经治疗的肥大心脏在功能上显著优于载剂治疗的心脏(PAB-V：6.7±0.2对比PAB-M：12.2±0.4；P<0.001)，并且线粒体治疗的心脏与假手术组对照之间没有差异(C：13±0.5对比PAB-M：12.2±0.4；P＝0.42)。(图6和19A至19C)

在基线处，三组之间的功能区变化(FAC，以％表示)没有差异(C：38.2±1.4，PAB-S：41.2±3.4，PAB-M：41.3±2.1；P＝0.60)，但与假手术组对照相比，捆扎后4周肥大组发生显著变化(C：43±1.6，PAB-V：23.7±1.5，PAB-M：25±2.5，P<0.001)。在线粒体治疗之前，两个肥大组彼此没有不同，但在研究终点处，与线粒体治疗和假手术组对照相比，载剂治疗的心脏的收缩功能显著下降(C：46.3±1.9和PAB-M：45.7±0.9对比PAB-V：21.5±1.9；P<0.001)。(图7和20A至20C)

侵袭性压力容积(PV)测量

在研究终点处，与C组和PAB-M组相比，PAB-V组的Vmax(ml/分钟)和Ved(ml/分钟)更高，但差异未达到显著性(C：83.7±11.8，PAB-V：122.1±30.3，PAB-M：94.5±13.8；P＝0.42以及C：73.8±8.3，PAB-V：99.9±25.3，PAB-M：84.8±13.6；P＝0.57)。在研究终点处，与假手术组对照相比，被捆扎的动物的Pdev(mmHg)更高，但也没有达到显著性(C：10±0.9，PAB-V：18.6±6.2，PAB-M：20.5±1.9，P＝0.16)。

在任何干预之前，所有动物的平均dP/dt max(mmHg/秒)均为831.9±56.8；在基线处，动物彼此之间没有显著差异(P>0.05)。然而，在研究终点处，与载剂治疗的心脏相比，线粒体治疗的肥大心脏的DP/dt max(mmHg/秒)显著更高(PAB-V：506.6±88.1对比PAB-M：894.9±119.23；P<0.05)，而PAB-M心脏与假手术组对照心脏没有显著差异(C：777±29.4；P＝0.9)。(图9-10和21A-21B)

结论：

线粒体移植维持了RV的肥大性适应并且保持了收缩功能。通过针对线粒体功能障碍而直接解决心肌功能障碍，可以用于治疗患有影响右心功能的肺疾病的患者。

该研究的目标是针对影响线粒体能量特性的缺陷以延迟心力衰竭的发作。不受理论的束缚，心肌线粒体功能障碍在心力衰竭中起着关键作用，这部分地是由于增厚RV的能量需求增加所致，我们的干预旨在改善线粒体功能，以便通过移植有呼吸能力的线粒体来使能量产生最大化。我们已确认，将从骨骼肌来源获得的自体外源性线粒体内化至肥大心肌细胞中，并且该线粒体与从RV心肌获得的线粒体一样增加线粒体功能。在肺动脉捆扎术的大型动物模型中移植自体线粒体，确认了保护心肌细胞免受凋亡细胞丢失。此外，与示出了扩张和收缩衰竭体征的未治疗的肥大心脏相比，维持肥大性生长导致了收缩功能的保持。因此，在一些实施方案中，本文描述了预防或减少心肌细胞的凋亡细胞丢失和保持或改善心脏的收缩功能的方法，该方法包括将包含线粒体的组合物施用于患者。

不受理论的束缚，右心室是肺疾病相关联心力衰竭预后的主要决定因素。在该疾病的过程中，RV的适应和适应不良是至关重要的。最初，RV收缩力通过肌肉特性的改变和代偿性肌肉肥大而增加，直至后负荷超过收缩力时解偶联的某一点，这指示适应不良，其为心室扩张的标志。在右心衰竭中，治疗主要限于针对肺功能，而不是直接干预RV心肌的严重能量缺失，该能量缺失是线粒体功能障碍的结果(Hoeper MM,Kramer T,Pan Z,etal.Mortality in pulmonary arterial hypertension:prediction by the2015European pulmonary hypertension guidelines risk stratification model.EurRespir J.2017；50(2):pii:1700740；Galie N,Humbert M,Vachiery J-L,et al.2015ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension.EurResp J.2015；46:903-975；Tonelli AR,Arelli V,Minai OA,et al.Causes andcircumstances of death in pulmonary arterial hypertension.Am J Respir CritCare Med.2013；188(3):365369)。

不受理论的束缚，已知导致生成ATP的能力减少的线粒体功能障碍会影响心脏功能，因为约90％的细胞ATP用于收缩和放松以及钙调控(Doenst T,Nguyen TD,AbelED.Cardiac metabolism in heart failure:Implications beyond ATPproduction.Circ Res.2013；113:709-724)。线粒体功能障碍可能是由于缺乏线粒体质量控制，从而导致代谢信号传导、生物能量特性、钙传递、活性氧(ROS)生成和细胞死亡途径激活等方面的缺陷。这导致恶性前馈循环，其导致心肌细胞因凋亡而死亡(Brown DA,PerryJB,Allen ME,et al.Expert consensus document:mitochondrial function as atherapeutic target in heart failure.Nat Rev Cardiol.2016；14:238-250)。线粒体功能的改变被认为是压力超负荷肥大和衰竭的首要原因。在对终末期心力衰竭的人体研究中，已经示出衰竭心脏中能量代谢的标志物已降低，这产生了以下概念：正在衰竭的心脏是燃料耗尽的发动机(Doenst T,Nguyen TD,Abel ED.Cardiac metabolism in heartfailure:Implications beyond ATP production.Circ Res.2013；113:709724；NeubauerS.The failing heartan engine out of fuel.N Engl J Med.2007；356:1140-1151)。然而，线粒体在调控新陈代谢和细胞死亡方面起着更复杂的作用，而不是使衰竭的心肌能量饥饿。右心衰竭仔猪模型示出了线粒体的氧化磷酸化受损和显著的结构损伤，强调了线粒体功能和结构质量对压力超负荷导致的右心衰竭的重要性(Noly P-E,Piquereau J,Coblence M,et al.Right ventricular mitochondrial respiratory function in apiglet model of chronic pulmonary hypertension.J Thorac Cardiovasc Surg 2020；159(1):129-140)。本文的数据指示，在用线粒体治疗后更好地保护了心肌细胞免受凋亡细胞丢失，而载剂治疗的肥大心脏示出更多的凋亡性细胞死亡。

不受理论的束缚，肥大RV的代谢需求显著增加，并且薄RV增加肌肉质量以代偿增加的压力负荷的必要性需要增强的线粒体支持，该支持需要迅速地发生。然而，线粒体无法跟上迅速增长的肌肉生长(Friehs I,Cowan DB,Choi Y-H,et al.Pressure-overloadhypertrophy of the developing heart reveals activation of divergent gene andprotein pathways in the left and right ventricular myocardium.Am J PhysiolCirc Physiol.2013；304(5):H697708；Phillips D,Aponte AM,Covian R,Neufeld E,YuZX,Balaban RS.Homogenous protein programming in the mammalian left and rightventricle free walls.Physiol Genomics.2011；43(21):1198-1206)。在我们的动物模型中，压力超负荷不会逆转，并且需要线粒体适应增厚的RV肌肉以维持功能。基于我们的结果，此种容纳增加的压力负荷的代偿性适应不会如载剂治疗的肥大心脏中壁厚度下降所指示的长期发生。与此相反，线粒体移植保持RV的肥大性适应性生长。此外，数据示出了用于移植的线粒体的来源并不是其益处的决定性因素。使用哪种线粒体来源没有差异。骨骼肌线粒体与从心肌分离出来的线粒体同样地应答。因此，心肌线粒体对于治疗RVH/RVF介导的线粒体功能障碍不是必需的。外源性自体骨骼肌线粒体保持衰竭RV的收缩功能。

作为治疗性干预的线粒体移植针对线粒体功能和结构的各个方面。单独对线粒体进行代谢操作不足以治疗衰竭的右心室，因为还必须解决线粒体的结构完整性问题。此外，线粒体移植针对肥大/衰竭右心中受损的线粒体动态变化。正在审查的潜在机制是线粒体生物合成(新线粒体的产生)的中断，其是心力衰竭病理生理学的早期事件。在代偿型肥大的早期阶段期间，线粒体生物合成信号传导被保持。与此相反，一旦失代偿型心力衰竭变得明显，线粒体生物合成信号就会下降。

总之，该项研究中，我们扩大了我们对线粒体移植益处的理解。具体地，结果表明，外源性自体骨骼肌线粒体保持衰竭心脏的收缩功能。

实施例5：通过冠状动脉内注射来进行自体线粒体移植以用于心肌保护

在猪模型中进行实验以研究缺血前冠状动脉内自体线粒体移植(MT)，其作为用于预防性心肌保护的治疗策略。

方法：

在约克郡猪(n＝26)中对左冠状动脉进行插管。以单次推注方式(MT_S)或连续方式(60分钟内10次注射；MT_SS)递送线粒体(1×10⁹)或缓冲液(载剂[Veh])。将单次注射以顺行推注方式递送至左冠状动脉主干中(6mL中的1×10⁹)。每5分钟递送连续注射(10次注射，每次注射6mL呼吸作用缓冲液中的1×10⁹)。在注射后15分钟处，通过勒紧(snaring)左前降支使心脏经受暂时性局部缺血(RI)。RI 30分钟后，释放勒紧器，并且再灌注心脏120分钟。

结果：

在RI时期前的期间，冠状动脉血流量(CBF)和心肌功能暂时增加。RI 30分钟后，MT_S和MT_SS心脏的CBF显著增加，并且在整个再灌注过程中持续存在(Veh对比MT_S和MT_SS；P＝0.04)。MT_S和MT_SS示出了显著增强的射血分数(Veh对比MT_S，P<0.001；Veh对比MT_SS，P＝0.04)和发展压力(Veh对比MT_S，P<0.001；Veh对比MT_SS，P＝0.03)。通过节段性缩短(Veh对比MT_S，P＝0.03；Veh对比MT_SS，P<0.001)、部分缩短(Veh对比MT_S，P<0.001；Veh对比MT_SS，P＝0.04)和应变分析(Veh对比MT_S，P＝0.002；Veh对比MT_SS，P＝0.003)评估的区域功能也显著改善。尽管治疗组之间的风险区没有差异，但两个MT组的梗死面积均显著减少(Veh对比MT_S和MT_SS，P<0.001)。

结论：

通过单次或连续冠状动脉内注射进行的缺血前MT提供了预防性心肌保护，显著降低了梗死面积并增强了整体和局部心脏功能。

实施例6：通过冠状动脉内递送线粒体进行心肌保护

自体线粒体移植涉及为缺血组织提供从自己身体中分离出来的有活力的、有呼吸作用能力的线粒体，以减轻天然线粒体损伤的影响。在临床相关猪模型中进行实验，以研究冠状动脉内递送线粒体的安全性和功效。

方法：

对成年猪进行麻醉，并且分离自体线粒体。动物用特拉唑(2.2-4.4mg/kg)/甲苯噻嗪(1-2mg/kg)镇静并对其进行插管。用0.5-2％异氟醚-氧气混合物维持全身麻醉。进行正中胸骨切开术，并且将心脏悬浮在心包支架中。然后，在荧光镜检查下，将5F JR血管造影导管(Merit Medical Sys,UT)漂浮通过右颈动脉(5F鞘)至左冠状动脉开口，建立至左冠状动脉(LCA)的血管造影通路。通过用¹⁸F-罗丹明-6G标记的线粒体血管造影注射左冠状动脉、随后进行位置发射断层扫描术(PET)来评价线粒体的摄取和生物分布(n＝3)。在正常条件下、在冠状血管收缩期间和在心动过速期间评价冠状动脉内线粒体注射的安全性概况(n＝18)。为了评估冠状动脉内线粒体移植的治疗功效，将左前降支勒紧30分钟。在再灌注开始时，动物接受线粒体(n＝8)或载剂溶液(n＝8)，随后进行2小时的再灌注。

结果：

冠状动脉内递送线粒体导致线粒体在整个心脏中的迅速摄取和特异性生物分布。在所有测试条件下，冠状动脉通畅性(patency)和心肌功能均得以保持。冠状动脉内注射线粒体导致冠状动脉血流量(CBF)中浓度依赖性增加。线粒体诱导的充血需要线粒体生存力、ATP产生，以及部分地需要血管内向整流性钾通道(K_IR)的激活。与对照相比，冠状动脉内线粒体递送导致缺血后心肌功能的显著增强、CBF的改善以及梗死面积的减少。

冠状动脉内线粒体移植是一种用于改善心肌灌注、心肌功能和心脏组织存活的安全有效的方法。

其它实施方案

应当理解，虽然已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。

Claims (45)

1.一种在受试者中治疗或预防心力衰竭的方法，所述方法包括将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于所述受试者。

2.根据权利要求1所述的方法，其中通过心肌内注射将所述组合物施用于所述受试者。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有以下心力衰竭或处于发展以下心力衰竭的风险中：右心室肥大(RVH)、左心室肥大(LVH)、右心室衰竭(RVF)或左心室衰竭(LVF)。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有肺疾病。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述肺疾病影响右心室功能。

6.根据权利要求1所述的方法，其中通过将所述组合物注射至所述受试者的血管中来将所述组合物施用于所述受试者。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述线粒体是自体的。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述线粒体是同种异体的。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述线粒体是异种的。

10.一种在受试者中维持右心室(RV)收缩力、维持RV毛细血管密度、预防RV扩张或延迟RVF发作的方法，所述方法包括将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于所述受试者。

11.根据权利要求10所述的方法，其中通过心肌内注射将所述组合物施用于所述受试者。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述受试者患有以下各项或处于发展以下各项的风险中：右心室肥大(RVH)或右心室衰竭(RVF)。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述受试者患有肺疾病。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述肺疾病影响右心室功能。

15.根据权利要求10所述的方法，其中通过将所述组合物注射至所述受试者的血管中来将所述组合物施用于所述受试者。

16.根据权利要求10所述的方法，其中所述线粒体是自体的。

17.根据权利要求10所述的方法，其中所述线粒体是同种异体的。

18.根据权利要求10所述的方法，其中所述线粒体是异种的。

19.一种在受试者中维持左心室(LV)收缩力、维持LV毛细血管密度、预防LV扩张或延迟左心室衰竭(LVF)发作的方法，所述方法包括将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于所述受试者。

20.根据权利要求19所述的方法，其中通过心肌内注射将所述组合物施用于所述受试者。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述受试者患有以下各项或处于发展以下各项的风险中：左心室肥大(LVH)或左心室衰竭(LVF)。

22.根据权利要求19所述的方法，其中所述受试者患有肺疾病。

23.根据权利要求19所述的方法，其中所述肺疾病影响左心室功能。

24.根据权利要求19所述的方法，其中通过将所述组合物注射至所述受试者的血管中来将所述组合物施用于所述受试者。

25.根据权利要求19所述的方法，其中所述线粒体是自体的。

26.根据权利要求19所述的方法，其中所述线粒体是同种异体的。

27.根据权利要求19所述的方法，其中所述线粒体是异种的。

28.一种在受试者中维持心室收缩力的方法，所述方法包括

鉴定有此需要的所述受试者；以及

将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于所述受试者。

29.根据权利要求28所述的方法，其中通过测量收缩末期压力容积(ESPV)、LV峰发展压力、射血分数、收缩期缩短、LV舒张末期压力或dP/dt(压力随时间的变化)来鉴定所述受试者。

30.一种在受试者中维持心室毛细血管密度的方法，所述方法包括

鉴定有此需要的所述受试者；以及

将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于所述受试者。

31.根据权利要求30所述的方法，其中通过微血管循环的磁共振成像(MRI)或血管造影成像来测量所述心室毛细血管密度。

32.一种在受试者中减少心室扩张的风险的方法，所述方法包括

鉴定有此需要的所述受试者；以及

将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于所述受试者。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述受试者被鉴定为患有糖尿病、肥胖症、高血压、酒精滥用、可卡因使用和滥用、细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生物感染、暴露于毒素(例如，铅、汞或钴)、心律失常或晚期妊娠并发症。

34.一种在受试者中延迟心力衰竭发作的方法，所述方法包括

鉴定有此需要的所述受试者；以及

将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于所述受试者。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述受试者被鉴定为患有右心室肥大或左心室肥大。

36.一种在受试者中治疗心力衰竭、延迟心力衰竭发作、减少发展心力衰竭的风险的方法，所述方法包括将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于所述受试者。

37.根据权利要求36所述的方法，其中通过心肌内注射将所述组合物施用于所述受试者。

38.根据权利要求36所述的方法，其中所述方法包括将所述受试者鉴定为具有发展心力衰竭的风险。

39.根据权利要求36所述的方法，其中所述受试者患有肺疾病。

40.根据权利要求36所述的方法，其中通过将所述组合物注射至通向所述心脏的血管中来将所述组合物施用于所述受试者。

41.一种在受试者中治疗心脏肥大、延迟心脏肥大发作、减少发展心脏肥大的风险的方法，所述方法包括将治疗有效量的包含分离的线粒体或组合的线粒体试剂的组合物施用于所述受试者。

42.根据权利要求41所述的方法，其中通过心肌内注射将所述组合物施用于所述受试者。

43.根据权利要求41所述的方法，其中所述方法包括将所述受试者鉴定为具有发展心脏肥大的风险。

44.根据权利要求41所述的方法，其中所述受试者患有肺疾病。

45.根据权利要求41所述的方法，其中通过将所述组合物注射至通向所述心脏的血管中来将所述组合物施用于所述受试者。

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