JP4775663B2

JP4775663B2 - 血管新生制御方法

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Publication number: JP4775663B2
Application number: JP2007510294A
Authority: JP
Inventors: 克仁高橋; 倫子山村
Original assignee: 地方独立行政法人大阪府立病院機構
Priority date: 2005-03-30
Filing date: 2005-03-30
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2025-03-30
Also published as: WO2006103770A1; JPWO2006103770A1

Description

本発明は、カルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を制御する因子で処理された血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞の、血管新生に関連する疾病を治療するための使用に関する。また本発明は、血管新生に関連した疾病の治療を必要とする患者から得られた血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞を、カルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を制御する因子で処理し、次いで、該因子で処理された血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞を該患者に戻すことを特徴とする、血管新生に関連した疾病の治療方法に関する。さらに本発明は、カルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を制御する因子で処理された血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞にも関する。

自己末梢血血管内皮前駆細胞や自己骨髄単核細胞の移植による血管新生療法がすでに臨床応用され、動脈閉塞性疾患や虚血性心疾患患者の自覚症状の改善など一定の治療効果をあげている。また、血管内皮増殖因子（Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF）や肝細胞増殖因子 (Hepatocyte Growth Factor; HGF) のｃＤＮＡを直接虚血部位に注入する遺伝子治療法の臨床試験も開始され、同様に、自覚作用の改善など治療効果が認められている。しかし、従来の細胞移植療法では、血管新生と末梢血や自己骨髄単核細胞に含まれる血管内皮前駆細胞の数が極めて少なく、治療効果を高めるためには大量の末梢血や骨髄を採取する必要があるが、患者への負担から実際上は困難であった。また、遺伝子治療では、注入部位の筋肉細胞などの染色体ＤＮＡにプラスミドが挿入されることが推定され、ごく希な頻度であるとしても悪性腫瘍の発生など予期せぬ副作用を生じる可能性がある。

上記問題点を解決するために、遺伝子操作を用いた種々の方法が提案されている。例えば、特許文献１には血管新生に関連した疾患の治療における血管新生を制御するための内皮前駆細胞またはその変形型の使用が記載されているが、本発明のようなカルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を制御することは開示されていない。
特表２００１−５０３４２７号公報

使用可能な細胞数が少ないという問題がなく、患者への負担も軽く、副作用のリスクも少ない血管新生療法を開発することが本発明の課題であった。

本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ねた結果、血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞におけるカルポニン遺伝子の発現あるいはカルポニンの作用を制御することによって、これらの細胞によるＶＥＧＦの合成と分泌が制御されて血管新生が制御されることを見出し、本発明を完成させるに至った。

カルポニンは血管平滑筋においてミオシンとアクチンの解離を抑制し、筋肉の短縮速度を低下させることが知られている（J. Biol. Chem. 271, 28161-28167, 1996; Biochem. Biophys. Res.Commun. 279, 150-157, 2000; J. Physiol (London) 529, 811-824, 2000）。また、ヒトカルポニン遺伝子を線維芽細胞や血管平滑筋細胞および平滑筋肉腫細胞に導入すると、増殖が抑制され、腫瘍の悪性度が低下することも報告されている（Circulation 88, I-74, 1993; Circulation 92, I-295; J. Natl. Cancer Insti. 91, 790-796, 1999）。しかしながら、今回の発明のような知見は全く報告されていなかった。

本発明によれば、使用可能な細胞数が少ないという問題がなく、患者への負担も軽く、副作用のリスクも少ない血管新生促進療法あるいは血管新生抑制療法、そのための細胞、ならびにかかる細胞の使用が提供される。

図１は、野生型（Ｗｔ）マウスおよびカルポニン１（Ｃｎｎ１）遺伝子ノックアウト（Ｃｎｎ1^−／−）マウスの大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）におけるＰＤＧＦ−ＢＢ処理および低酸素処理がカルポニン蛋白とＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ１６５）蛋白の産生に及ぼす影響を示すウエスタンブロットの結果を示す。カルポニン遺伝子ノックアウトマウス（Ｃｎｎ１^−／−）にカルポニン１の全長ｃＤＮＡを導入した場合のＶＥＧＦ−ＡｍＲＮＡの発現を、リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ）により調べた結果を示す。図３は、マウス大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）におけるカルポニンＳｉＲＮＡによるカルポニン遺伝子発現抑制の効果を示す。左のパネルはカルポニン１ｍＲＮＡの発現量を定量的ＰＣＲにより調べた結果を示す。中央のパネルはＶＥＧＦ−ＡｍＲＮＡの発現量を定量的ＰＣＲにより調べた結果を示す。右のパネルはその時のＶＥＧＦ−Ａ蛋白の馴化培地上清への分泌レベルをＥＬＩＳＡ法により調べた結果を示す。Ｃｎｎ１^−／−マウスあるいはそのＷｔマウスの大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）とルイス肺癌細胞（ＬＬＣ）を９：１の割合で混合して培養することにより得られた馴化培地上清のＶＥＧＦ−Ａ蛋白量をＥＬＩＳＡにて調べた結果を示す。Ｃｎｎ１^−／−マウスあるいはそのＷｔマウスの大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）とＬＬＣを９：１の割合で混合したものを、同系マウス（Ｃ５７ＢＬ/６系）の背部皮下に移植し、形成されるＬＬＣ腫瘍の体積を調べた結果を示す。Ｃｎｎ１^−／−マウスあるいはそのＷｔマウスの大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）とＬＬＣを９：１の割合で混合したものを、同系マウス（Ｃ５７ＢＬ/６系）の背部皮下に移植し、微小血管密度(ＭＶＤ；ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｄｅｎｓｉｔｙ)を調べた結果を示す。図中＊はＰ＜０．０５であることを示す。マウス（ＷｔおよびＣｎｎ１^−／−）の背部皮下に腫瘍細胞（ＬＬＣおよびＢ１６黒色腫細胞）を移植し、腫瘍部位の血管新生の様子を調べた組織切片の免疫染色の結果を示す顕微鏡写真である。上段の左から３つめまでのパネルはＷｔマウスにＬＬＣを移植した部位の免疫染色を示し、上段の右端のパネルはＷｔマウスにＢ１６黒色腫細胞を移植した部位の免疫染色の結果を示す。下段の左から３つめまでのパネルはＣｎｎ１^−／−マウスにＬＬＣを移植した部位の免疫染色の結果を示し、下段の右端のパネルはＣｎｎ１^−／−マウスにＢ１６黒色腫細胞を移植した部位の免疫染色の結果を示す。免疫染色は、内皮細胞マーカーであるＣＤ３４に対する抗体および壁細胞マーカーであるα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）に対する抗体を用いて行った。各パネル右下のバーの長さは１００μｍを示す。図中＊はＰ＜０．０５であることを示す。

上述のごとく、本発明は、血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞におけるカルポニン遺伝子の発現あるいはカルポニン蛋白の作用を制御することによって、これらの細胞によるＶＥＧＦの合成と分泌が制御され血管新生が制御されることに基づくものである。

したがって、本発明は、下記のものを提供する：
（１）カルポニン遺伝子の発現またはカルポニン蛋白の作用を制御する因子で処理された血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞の、血管新生に関連する疾病を治療するための使用；
（２）因子がカルポニン遺伝子の発現またはカルポニン蛋白の作用を抑制するものである（１）記載の使用；
（３）因子がカルポニンＳｉＲＮＡまたはカルポニン遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである（２）記載の使用；
（４）因子が血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−Ｂ／Ｂ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃＦＧＦ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａｌｐｈａ）、抗カルポニン１抗体、低酸素条件からなる群より選択されるものである（２）記載の使用；
（５）因子がカルポニン遺伝子の発現を上昇させるかまたはカルポニン蛋白の作用を促進するものである（１）記載の使用；
（６）因子が腫瘍増殖因子ベータ（ＴＧＦｂｅｔａ）、ラパマイシン（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）からなる群より選択されるものである（５）記載の使用；
（７）細胞が血管内皮前駆細胞、血管構成細胞、骨髄単核細胞、臍帯血単核細胞、皮膚由来筋線維芽細胞、胚性幹細胞からなる群より選択されるものである、（１）記載の使用；
（８）細胞が血管内皮細胞、血管平滑筋細胞または皮膚由来筋線維芽細胞である、（７）記載の使用；
（９）血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞が患者由来のものであり、該患者の血管新生に関連した疾病を治療するために用いられるものである、（１）記載の使用；
（１０）カルポニン遺伝子の発現またはカルポニン蛋白の作用を制御する因子で処理された血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞を患者に移植することを特徴とする、血管新生に関連した疾病の治療方法；
（１１）因子がカルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を抑制するものである（１０）記載の方法；
（１２）因子がカルポニンＳｉＲＮＡまたはカルポニン遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである（１１）記載の方法；
（１３）因子がＰＤＧＦ−Ｂ／Ｂ、ＴＮＦａｌｐｈａ、ｂａｓｉｃＦＧＦ、抗カルポニン１抗体、低酸素条件からなる群より選択されるものである（１１）記載の方法；
（１４）因子がカルポニン遺伝子の発現を上昇させるかまたはカルポニンの作用を促進するものである（１０）記載の方法；
（１５）因子がＴＧＦｂｅｔａ、ラパマイシンからなる群より選択されるものである（１４）記載の方法；
（１６）細胞が血管内皮前駆細胞、血管構成細胞、骨髄単核細胞、臍帯血単核細胞、皮膚由来筋線維芽細胞、胚性幹細胞からなる群より選択されるものである、（１０）記載の方法；
（１７）細胞が血管内皮細胞、血管平滑筋細胞または皮膚由来筋線維芽細胞である、（１６）記載の方法；
（１８）血管新生に関連した疾病の治療を必要とする患者から血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞を得て、得られた細胞をカルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を制御する因子で処理し、次いで、該因子で処理された細胞を該患者に戻すことを特徴とする、（１０）記載の血管新生に関連した疾病の治療方法；
（１９）カルポニン遺伝子の発現またはカルポニン蛋白の作用を制御する因子で処理された血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞；
（２０）因子がカルポニン遺伝子の発現またはカルポニン蛋白の作用を抑制するものである（１９）記載の細胞；
（２１）因子がカルポニンＳｉＲＮＡまたはカルポニン遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである（２０）記載の細胞；
（２２）因子がＰＤＧＦ−Ｂ／Ｂ、ｂａｓｉｃＦＧＦ、ＴＮＦａｌｐｈａ、抗カルポニン１抗体、低酸素条件からなる群より選択されるものである（２０）記載の細胞；
（２３）因子がカルポニン遺伝子の発現を上昇させるかまたはカルポニン蛋白の作用を促進するものである（１９）記載の細胞；
（２４）因子がＴＧＦｂｅｔａ、ラパマイシンからなる群より選択されるものである（２３）記載の細胞；
（２５）細胞が血管内皮前駆細胞、血管構成細胞、骨髄単核細胞、臍帯血単核細胞、皮膚由来筋線維芽細胞、胚性幹細胞からなる群より選択されるものである、（１９）記載の細胞；
（２６）細胞が血管内皮細胞、血管平滑筋細胞または皮膚由来筋線維芽細胞である、（２５）記載の細胞；
（２７）血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞が患者由来のものであり、該患者の血管新生に関連した疾病を治療するために用いられるものである、（１９）記載の細胞。
（２８）細胞が臍帯血バンクから得られるものである、あるいは近親者から得られるものである（１）記載の使用、（１０）記載の方法、あるいは（１９）記載の細胞。

以下において、本発明を詳細に説明する。特に断らない限り、用語は当該分野で通常に使用されている意味を有するものと解される。

本発明は、１の態様において、カルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を制御する因子で処理された血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞の、血管新生に関連する疾病を治療するための使用に関するものである。ここで、「治療」とは当該分野で用いられる一般的意味を有し、例えば、発症した疾病の進行を遅延、逆行あるいは停止させ、当該疾病を軽減、寛解、消失あるいは治癒させることを包含する。さらに本明細書における疾病の「治療」は当該疾病の予防目的での処置も包含する。

本発明者らは、血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞におけるカルポニンの発現を制御するとＶＥＧＦの合成と分泌が制御されることを新たに見出した。ＶＥＧＦは血管新生を促進する因子であるため（Nature Rev. 3, 391-399, 2004）、血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞におけるカルポニン遺伝子の発現あるいはカルポニンの作用を制御することによって、血管新生に関連した疾病を治療することができる。ここで、「制御」とは、抑制および促進を包含するものとする。

本発明において発現を制御されるカルポニン遺伝子としてはカルポニン１遺伝子、カルポニン２遺伝子およびカルポニン３遺伝子があり、いずれの遺伝子の発現を制御してもよい。なかでもカルポニン１遺伝子の発現を制御した場合に、より大きな効果が得られる。

本発明において作用を制御されるカルポニン蛋白としてはカルポニン１蛋白、カルポニン２蛋白およびカルポニン３蛋白があり、いずれの蛋白の作用を制御してもよい。なかでもカルポニン１蛋白の発現を制御した場合に、より大きな効果が得られる。

さらに、本発明においてカルポニン遺伝子の発現またはカルポニン蛋白の作用を制御することによって合成と分泌が制御されるＶＥＧＦにはＶＥＧＦ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＰＩＧＦ（Placenta growth factor）があるが、ＶＥＧＦ−Ａの場合に最も顕著な効果が得られる。

例えば、カルポニン１遺伝子の発現あるいはカルポニンの作用を抑制する因子でもって血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞を処理することによって、これらの細胞におけるＶＥＧＦ-Ａの合成と分泌を促進することができる。その結果、これらの細胞およびその周囲における血管新生が促進される。したがって、カルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を抑制する因子で処理された血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞を用いて、血管新生の促進が有益である疾病を治療することができる。

カルポニン遺伝子の発現を抑制する因子は、カルポニンｍＲＮＡまたは蛋白の合成を抑制するものであってもよく、あるいはカルポニンｍＲＮＡまたは蛋白の作用および機能を抑制するものであってもよい。本明細書において、特に断らないかぎり、遺伝子の「発現を抑制する」とは、その遺伝子の発現を通常レベルよりも低下させること、ならびに完全に消失させてしまうことを包含する。具体的には、遺伝子の「発現を抑制する」とは、その遺伝子の合成を不活性化あるいは消失させること、その遺伝子の制御・調節機構を発現抑制の方向にシフトさせることなどを包含する。例えば、細胞のカルポニン遺伝子を、公知の方法によりノックダウン、ノックアウト、あるいは欠失させてもよい。また例えば、同種の機能を有する蛋白、例えばアイソザイムをコードする遺伝子が複数ある場合において、それらの遺伝子のうち１つまたはそれ以上、あるいはすべての発現を抑制してもよい。本明細書において、特に断らないかぎり、遺伝子はＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。したがって、「カルポニン遺伝子」とはカルポニンをコードするＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。カルポニン遺伝子の発現を抑制する因子の例としては、カルポニンＳｉＲＮＡ、カルポニン遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡを包含）、あるいはＰＤＧＦ−Ｂ／Ｂ、ＴＮＦａｌｐｈａ、ｂａｓｉｃＦＧＦのごとき因子や薬剤、あるいは低酸素条件等が挙げられるが、これらに限らない。細胞をこれらの因子や条件で処理することにより、例えば、細胞をこれらの因子と接触させ、あるいは細胞にこれらの因子を導入することにより、カルポニン遺伝子の発現を抑制することができる。これらの因子をコードする遺伝子を細胞に導入してもよい。これらの因子で細胞を処理する方法、例えば、これらの因子またはこれらの因子をコードする遺伝子を細胞に接触させ、あるいは細胞に導入する方法は当該分野で公知である。例えば、細胞への遺伝子の導入には、ベクターによる方法、細胞融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクション、塩酸カルシウム共沈法などの方法を用いることができる。当業者は細胞の種類、因子の種類等に応じて、これらの方法を適宜選択して用いることができる。また、当該分野で公知の他の方法により、細胞のカルポニン遺伝子の発現を抑制してもよい。

本発明に用いられるカルポニン遺伝子の発現を抑制する好ましい因子の例としては、カルポニンＳｉＲＮＡ、カルポニン遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡを包含）、低酸素条件等が挙げられる。カルポニンＳｉＲＮＡやカルポニン遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはカルポニン遺伝子に対する特異性が高く、ノックダウンあるいはノックアウト効率も高く、副作用のリスクも小さいという利点を有する。そのうえこれらの因子の細胞への導入方法（例えば、トランスフェクション法）も確立されており、導入が容易で使用しやすいという利点もある（ＳｉＲＮＡ導入用キットも市販されている）。特に、カルポニンＳｉＲＮＡは商業的に入手可能である。

カルポニン蛋白の作用を抑制する因子の例としては、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、カルポニンのアクチン結合領域を含むペプチドなどのカルポニン阻害物質、カルポニン抗体等が挙げられるが、これらに限らない。本発明に用いられるカルポニンの作用を抑制する好ましい因子の例としては、カルポニン抗体等が挙げられる。本明細書において、特に断らないかぎり、ある物質の「作用を抑制する」とは、その物質の作用を通常レベルよりも低下させること、ならびに完全に消失させてしまうことを包含する。細胞をこれらの因子で処理することにより、例えば、細胞をこれらの因子と接触させ、あるいは細胞にこれらの因子を導入することにより、カルポニン遺伝子の発現を抑制することができる。また、これらのカルポニンの作用を抑制する因子をコードする遺伝子を細胞に導入してもよい。これらの因子で細胞を処理する方法、例えば、これらの因子またはこれらの因子をコードする遺伝子を細胞に接触させ、あるいは細胞に導入する方法は当該分野で公知であり、当業者は細胞の種類、因子の種類等に応じて、これらの方法を適宜選択して用いることができる。例えば、細胞への遺伝子の導入には、ベクターによる方法、細胞融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクション、塩酸カルシウム共沈法などの方法を用いることができる。

逆に、カルポニン遺伝子の発現あるいはカルポニンの作用を促進する因子でもって血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞を処理することによって、これらの細胞におけるＶＥＧＦ-Ａの合成と分泌を抑制することができる。その結果、これらの細胞およびその周囲における血管新生が抑制される。したがって、カルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を促進する因子で処理された血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞を用いて、血管新生の抑制が有益である疾病を治療することができる。

カルポニン遺伝子の発現を促進する因子は、カルポニンｍＲＮＡまたは蛋白の合成を促進するものであってもよく、あるいはカルポニンｍＲＮＡまたは蛋白の作用および機能を促進するものであってもよい。本明細書において、特に断らないかぎり、遺伝子の「発現を促進する」とは、その遺伝子の発現を通常レベルよりも高めることをいう。具体的には、遺伝子の「発現を促進する」とは、その遺伝子の合成を活性化させること、その遺伝子の制御・調節機構を発現促進の方向にシフトさせることなどを包含する。カルポニン遺伝子の発現を促進する因子の例としては、ＴＧＦｂｅｔａ、ラパマイシン、カルポニンｃＤＮＡ等が挙げられるが、これらに限らない。本発明に用いられるカルポニン遺伝子の発現を促進する好ましい因子の例としては、カルポニンｃＤＮＡ等が挙げられる。細胞をこれらの因子で処理することにより、例えば、細胞をこれらの因子と接触させ、あるいは細胞にこれらの因子を導入することにより、カルポニン遺伝子の発現を抑制することができる。これらの因子をコードする遺伝子を細胞に導入してもよい。これらの因子で細胞を処理する方法、例えば、これらの因子をまたはこれらの因子をコードする遺伝子を細胞に接触させ、あるいは細胞に導入する方法は当該分野で公知であり、当業者は細胞の種類、因子の種類等に応じて、これらの方法を適宜選択して用いることができる。例えば、細胞への遺伝子の導入には、ベクターによる方法、細胞融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクション、塩酸カルシウム共沈法などの方法を用いることができる。

本発明に用いられるカルポニンの作用を促進する好ましい因子の例としては、カルポニンｃＤＮＡ等が挙げられる。本明細書において、特に断らないかぎり、ある物質の「作用を促進する」とは、その物質の作用を通常レベルよりも上昇させることを包含する。細胞をこれらの因子で処理することにより、例えば、細胞をこれらの因子と接触させ、あるいは細胞にこれらの因子を導入することにより、カルポニン遺伝子の発現を促進することができる。また、これらのカルポニンの作用を促進する因子をコードする遺伝子を細胞に導入してもよい。これらの因子で細胞を処理する方法、例えば、これらの因子またはこれらの因子をコードする遺伝子を細胞と接触させ、あるいは細胞に導入する方法は当該分野で公知であり、当業者は細胞の種類、因子の種類等に応じて、これらの方法を適宜選択して用いることができる。例えば、細胞への遺伝子の導入には、ベクターによる方法、細胞融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクション、塩酸カルシウム共沈法などの方法を用いることができる。

本発明に使用することのできる細胞はカルポニン遺伝子を有するものであればよく、血管形成能を有する幹細胞および血管構成細胞が含まれる。血管形成能を有する幹細胞の例としては血管内皮前駆細胞、骨髄単核細胞、臍帯血単核細胞、皮膚由来筋線維芽細胞、胚性幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。血管構成細胞の例としては血管内皮細胞、血管平滑筋細胞等が挙げられる。本発明において好ましい細胞は血管構成細胞である。血管構成細胞の好ましい例としては血管平滑筋細胞等が挙げられる。血管平滑筋細胞のごとき血管構成細胞においてカルポニン遺伝子の発現またはカルポニン蛋白の作用を制御することにより、これらの細胞に内在するＶＥＧＦ-Ａ遺伝子の発現を制御し、直接的に血管新生能を制御することで、外来遺伝子の挿入による予期せぬ副作用のリスクを回避することが可能である。また、皮膚由来筋線維芽細胞も本発明において好ましい細胞の１つである。血管平滑筋細胞および皮膚由来筋線維芽細胞は、採取および増殖が容易であるため、従来技術における細胞数が少ないという問題を解決することに好適である。これらの細胞の採取方法は公知であり、コラゲナーゼ等を使用する方法やエクスプラント法などがある。

上述のごとく、本発明により治療することのできる疾病は血管新生に関連するものである。一般的には、本発明のカルポニン遺伝子の発現またはカルポニン蛋白の作用が制御された細胞を患者に移植することにより治療を行うことができる。細胞の移植方法は当該分野において公知であり、細胞の種類、移植部位等に応じて適切な移植方法を選択することができ、例えば、静脈内注入、注射やカテーテルによる局所注入法などがある。好ましい細胞移植方法としては静脈内注入、注射による局所注入等が挙げられる。

カルポニン遺伝子の発現またはカルポニン蛋白の作用が抑制された細胞を用いることにより、ＶＥＧＦの合成および分泌を促進し、血管新生を促進することにより、血管新生の促進が有益な疾病を治療することができる。かかる疾病としては、糖尿病や動脈硬化に起因する動脈閉塞性疾患、ビュルガー病、狭心症または心筋梗塞などの虚血性心疾患、冠動脈インターベンション後の再狭窄、脳梗塞等の脳虚血疾患等が挙げられる。

カルポニン遺伝子の発現が増加しているかまたはカルポニン蛋白の作用が促進された細胞を用いることにより、ＶＥＧＦの合成および分泌を抑制し、血管新生を抑制することにより、血管新生の抑制が有益な疾病を治療することができる。かかる疾病としては、癌、肉腫等の悪性腫瘍、過誤腫、筋腫等の良性腫瘍、糖尿病性網膜症等が挙げられる。

患者における血管新生に関連した疾病の治療の際の組織適合性や拒絶反応の問題をなくし、あるいは免疫抑制処理の必要性をなくすという観点から、血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞が、血管新生に関連した疾病の治療を必要とする患者本人あるいはその患者の近親者に由来する細胞であることが好ましく、その患者本人に由来する細胞であることが特に好ましいが、臍帯血バンクを用いることもできる。

本発明は、もう１つの態様において、血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞をカルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を制御する因子で処理し、次いで、該因子で処理された細胞を患者に移植することを特徴とする、血管新生に関連した疾病の治療方法を提供する。

患者における血管新生に関連した疾病の治療の際の組織適合性や拒絶反応の問題をなくし、あるいは免疫抑制処理の必要性をなくすという観点から、本発明の治療方法に使用する細胞は上記のものが好ましい。したがって、本発明は好ましい態様において、血管新生に関連した疾病の治療を必要とする患者から血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞を得て、得られた細胞をカルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を制御する因子で処理し、次いで、該因子で処理された細胞を該患者に戻すことを特徴とする、血管新生に関連した疾病の治療方法を提供する。

上記方法の第１工程は、血管新生に関連した疾病の治療を必要とする患者から血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞を得る工程である。血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞については上述のとおりであり、好ましい細胞は、骨髄ＣＤ３４陽性単核細胞、臍帯血ＣＤ３４陽性単核細胞、血管構成細胞（血管内皮細胞、血管平滑筋細胞）および皮膚由来筋線維芽細胞である。特に血管構成細胞（血管内皮細胞、血管平滑筋細胞）および皮膚由来筋線維芽細胞は採取および増殖が容易であるため、従来技術における細胞数が少ないという問題を解決することに好適である。また、血管構成細胞、好ましくは血管平滑筋細胞を用いる場合、これらの細胞に内在するＶＥＧＦ-Ａ遺伝子の発現を制御し、直接的に血管新生能を制御することで、ＶＥＧＦ-Ａ等の外来遺伝子の挿入による予期せぬ副作用のリスクを回避することができる。これらの細胞の患者からの採取、増殖方法は当該分野において公知であり、当業者は患者の状態、細胞の種類等に応じてこれらの方法を適宜選択して用いることができる。患者からの細胞の採取方法の例としては、皮膚切開、外科的手術などの方法がある。細胞の増殖方法についてはあとで説明する。

該方法の第２工程は、得られた細胞をカルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を制御する因子で処理する工程である。治療すべき疾病の性質に応じて、カルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を抑制する因子、あるいはカルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を促進する因子で、患者から得た細胞を培養容器に接着培養あるいは浮遊培養の状態で処理する。これらの因子および処理については上述のとおりである。特に、カルポニン遺伝子の発現を抑制する因子としてはカルポニンＳｉＲＮＡおよびカルポニン遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。上記因子での処理方法も当業者に公知であり、当業者は適切な方法を適宜することができる。

該方法の第３工程は、該因子で処理された細胞を、血管新生に関連した疾病を有する該患者に戻す工程である。血管新生に関連した疾病については上で説明したとおりである。この工程は種々の方法で行うことができる。細胞を該患者に戻すには静脈注射などにより移植するのが一般的であるが、他の方法、例えば、注射やカテーテルを用いた直接注入法を用いてもよい。処理細胞を患者に戻した後、患者における血管新生の促進あるいは抑制、ならびに治療すべき疾病の様子を一定期間あるいは定期的にモニターすることが好ましい。血管新生の促進あるいは抑制のモニター法としては血流ドップラー法、血管造影法等がある。

治療に使用する細胞数を増加させるために、患者から得た細胞を適切な培地で培養する工程を上記方法に含めてもよい。この培養工程はカルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を制御する因子で細胞を処理する前、すなわち第１工程と第２工程の間に行ってもよく、あるいは該因子で細胞を処理した後、すなわち第２工程と第３工程の間に行ってもよい。患者の状態、使用する細胞の種類、必要な数、因子の種類等に応じて培養方法および目的とする細胞数を決定することができる。培地組成、培養温度、ｐＨ、培養時間、酸素あるいは二酸化炭素の分圧、通気等の培養条件を考慮して培養方法を決定することができる。例えば、一般的な培地としてＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ウイルス産生用の無血清培地であるＶＰ−ＳＦＭ等を挙げることができるが、これらに限らない。

本発明は、もう１つの態様において、カルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を制御する因子で処理された血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞を提供する。かかる細胞の作出は上記方法ならびに当該分野で知られた他の方法により、当業者が容易に行うことができる。かかる細胞は研究や治療において多くの用途を有しており、例えば、血管新生に関連した疾病の治療目的にかかる細胞を使用することもでき、あるいはインビトロ実験あるいは動物実験のごときインビボ実験に用いて、血管新生が関連する疾病の病理を研究することもできる。

加えて、本発明における細胞は、血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞を含む組織であってもよい。カルポニン遺伝子の発現またはカルポニンの作用を制御する因子をかかる組織中に導入してもよい。組織へのかかる因子またはかかる因子をコードする遺伝子の導入方法は、当該分野において公知であり、例えば、リポゾームとともに注射やカテーテルによって局所に注入する方法などがある。当業者はこれらの組織、因子、導入方法を適宜選択して本発明を実施することができる。

以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。

マウス大動脈平滑筋細胞におけるカルポニン遺伝子発現制御の効果
Ｃ５７ＢＬ／６系野生型（Ｗｔ）マウスおよびそのカルポニン１遺伝子ノックアウト（Ｃｎｎ１^−／−）マウス（いずれもオス、８週齢）の大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）を、コラゲナーゼ法により分離し、それぞれＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ不含）中、３７℃で４８時間培養した。なお、Ｃｎｎ１^−／−マウスの作成は既に報告した(Genes Cells 3, 685-695, 1998)。培養系は、無処理系、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）（１０ｎｇ／ｍｌ）添加系、および低酸素系（Ｏ_２１％、ＣＯ_２５％、Ｎ_２９４％）の３つで、それぞれの条件で２４時間培養した後、常法により培養細胞抽出物を得て、ウエスタンブロッティングに供した。各蛋白に対する抗体は、カルポニン１抗体(Genes Cells 3, 685-695, 1998)、Hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF1α)抗体（Santa Cruz, sc-10790）、ＶＥＧＦ抗体（R & D systems, AF-493-NA）を用いた。

図１に示すように、Ｗｔマウス細胞においてＰＤＧＦ−ＢＢ処理および低酸素処理によりカルポニン蛋白量が減少した。低酸素条件下で産生される蛋白であるＨＩＦ１αが野生型細胞を低酸素処理した場合に産生されることが確認された。ＰＤＧＦ−ＢＢ処理または低酸素処理、およびカルポニン蛋白量の減少に伴い、ＶＥＧＦ_１６５（アミノ酸数が１６５個のＶＥＧＦ主要種）の量が増加した。Ｃｎｎ１^−／−マウス細胞においてはいずれの系でも蛋白産生に差は見られず、ＶＥＧＦ_１６５が産生されていることがわかった。また、ＷｔおよびＣｎｎ１^−／−マウス由来の大動脈平滑筋培養細胞の馴化培養上清をマウス皮下に注射し、Ｍｉｌｅｓの血管透過性試験に供したところ、Ｃｎｎ１^−／−マウス由来の大動脈平滑筋の馴化培養上清を用いた場合に血管透過性が上昇することが示された（データ示さず）。そして、この活性はマウスＶＥＧＦに特異的な中和抗体によって消失した。したがって、カルポニン遺伝子の発現を抑制あるいは欠失させると、ＶＥＧＦの合成および分泌が増大することがわかった。

次に、上述のカルポニン遺伝子ノックアウトマウス（Ｃｎｎ１^−／−マウス）に全長のマウスカルポニン１ｃＤＮＡを導入し、ＶＥＧＦ−ＡｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ）法（ABI PRISM 7000 Sequence Detection System）で調べた。全長のマウスカルポニン１ｃＤＮＡの導入は、FuGENE6 Transfection Reagent（Roche）により行った。実験は上記のごとくＣｎｎ１^−／−マウスの大動脈平滑筋細胞をあらかじめＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ不含）中、通常酸素条件下、37 ℃で２４時間培養し（上記無処理系と同じ培養系にて）、ｃＤＮＡ導入後さらに２４時間培養した後、細胞からｔｏｔａｌＲＮＡを抽出しリアルタイムＰＣＲを行った。ｔｏｔａｌＲＮＡの調製は、ISOGEN（和光、ニッポンジーン）を用いて行った。リアルタイムＰＣＲにはマウスＣｎｎ１とマウスＶＥＧＦ−Ａ、マウスＧ３ＰＤＨのカスタム合成プライマー（ＡＢＩ）を用いた。図２に示すように、カルポニン１ｃＤＮＡを導入することによりＶＥＧＦ−ＡｍＲＮＡの発現が約４分の１に減少することがわかった。これらの結果から、カルポニン遺伝子の発現を促進すると、ＶＥＧＦの産生が減少することがわかった。

マウス大動脈平滑筋細胞におけるカルポニンＳｉＲＮＡによるカルポニン遺伝子発現抑制の効果
実施例１で説明したようにＣ５７ＢＬ／６系Ｗｔマウスから大動脈平滑筋細胞を分離し、これにカルポニンＳｉＲＮＡを導入したものと、導入しないものを実施例１の無処理系と同じ培養系にて培養した（４８時間、７２時間）。マウスカルポニン１に対するＳｉＲＮＡはＤＨＡＲＭＡＣＯＮ社に注文して得た。リポソーム法（siLentFect・Bio-Rad社製）を用いて４０ｎＭのカルポニンＳｉＲＮＡを細胞に導入した。細胞中のカルポニン１ｍＲＮＡおよびＶＥＧＦ−ＡｍＲＮＡの発現、ならびにＶＥＧＦ−Ａ蛋白レベルを、リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ）、ならびにＥＬＩＳＡ法により調べた。ＥＬＩＳＡにはＲ＆Ｄ SystemsのMouse VEGF Immunoassay (MMV00)を用いた。結果を図３に示す。

カルポニン１ｍＲＮＡ発現量はカルポニンＳｉＲＮＡ導入細胞において減少し、培養４８時間および７２時間で、それぞれカルポニンＳｉＲＮＡを導入していない細胞の約８分の１および約５分の１となった。ＶＥＧＦ−ＡｍＲＮＡ発現量はカルポニンＳｉＲＮＡ導入細胞において増加し、培養４８時間および７２時間でそれぞれカルポニンＳｉＲＮＡを導入していない細胞の約２倍および約３倍となった。ＶＥＧＦ−Ａ蛋白量もカルポニンＳｉＲＮＡ導入細胞において増加し、培養４８時間および７２時間でそれぞれカルポニンＳｉＲＮＡを導入していない細胞の約８倍および約１．５倍となった。この実験から、血管構成細胞である平滑筋細胞においてカルポニンＳｉＲＮＡによりカルポニン遺伝子発現を抑制することで、有効にＶＥＧＦ-Ａ産生量を増加させ得ることがわかった。

マウス個体におけるカルポニン遺伝子発現制御細胞の移植効果
実施例１で用いたのと同じＣｎｎ１^−／−マウスあるいはそのＷｔマウスの大動脈平滑筋細胞とルイス肺癌細胞（ＬＬＣ）（ＲＩＫＥＮＣＥＬＬＢＡＮＫ；ＲＣＢ０５５８）を９：１の割合（１．１ｘ１０^７個／ｍｌ：１．２ｘ１０^６個／ｍｌ）で混合し、ＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ１０％含）中、３７℃で７２時間培養し、馴化培地上清のＶＥＧＦ−Ａ蛋白量をＥＬＩＳＡにて調べた。結果を図４に示す。Ｃｎｎ１^−／−マウス細胞とＬＬＣを混合培養した上清中に分泌されたＶＥＧＦ−Ａ量は、Ｗｔマウス細胞とＬＬＣを混合培養した上清中に分泌されたＶＥＧＦ−Ａ量の約３倍であった。

次に、Ｃｎｎ１^−／−マウスあるいはそのＷｔマウスの背部皮下に、Ｃｎｎ１^−／−マウスあるいはそのＷｔマウスの大動脈平滑筋細胞とＬＬＣを背部皮下に３０μｌ注射することにより移植し、腫瘍量および血管形成量を調べた。移植前にこれらの細胞をＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ１０％含）中、３７℃で７２時間培養し、必要数を得ておいた。移植後１０日目および１５日目のＣｎｎ１^−／−マウスに移植した腫瘍の体積を図５に示す。腫瘍体積の測定は、０．５２ｘ（短径）^２ｘ（長径）により行った。Ｃｎｎ１^−／−マウス大動脈平滑筋細胞とともに移植したＬＬＣの腫瘍体積は、１０日目および１５日目において、Ｗｔマウス大動脈平滑筋細胞とともに移植したＬＬＣの腫瘍体積の約４倍大きかった。腫瘍部位の微小血管密度も調べた。微小血管密度の測定はＣＤ３４またはＣＤ３１で血管内皮細胞を染色し、ｘ４０対物レンズで１０視野以上について１ｍｍ^２あたりの血管数を計測した。結果を図６に示す。移植後１５日目において、Ｃｎｎ１^−／−マウス大動脈平滑筋細胞とともに移植したＬＬＣ腫瘍の微小血管密度は、Ｗｔマウス大動脈平滑筋細胞とともに移植したＬＬＣ腫瘍の微小血管密度の約３倍多かった。これらの結果より、インビボにおいても本発明の効果が証明されたことがわかった。すなわち、カルポニン遺伝子発現を抑制または欠失させた細胞を移植した部位において効果的に血管新生が起こることが示された。

１ｘ１０^７個／５０μＬのＬＬＣまたはＢ１６黒色腫細胞（Cancer Res. 48, 1456-1459, 1988）をＣｎｎ１^−／−マウスとＷｔマウスの背部皮下に移植し、腫瘍部位の血管新生の様子を調べた。図７は腫瘍辺縁部位の組織連続切片の免疫染色の結果を示す。染色は、内皮細胞マーカーであるＣＤ３４に対する抗体および壁細胞マーカーであるα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）に対する抗体を用いて行った。各蛋白に対する抗体は、ＣＤ３４抗体(HyCult biotechnology, MEC14.7)、αＳＭＡ抗体（Sigma Chemicals、clone 1A4）を用いた。いずれの抗体を用いた場合にも、Ｃｎｎ１^−／−マウスに移植した腫瘍において血管新生促進が確認された。また、Ｃｎｎ１^−／−マウスにＬＬＣを移植した場合に、移植後２８日目においても血管新生促進が確認され、長期にわたる治療効果が期待される。

本発明は、血管新生に関連した分野、特に血管再生医療の分野において利用可能である。また本発明は、血管新生に関連した病気の研究にも利用可能である。

Claims

カルポニンＳｉＲＮＡまたはカルポニン遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞を含む、血管新生促進剤。
細胞が血管内皮前駆細胞、血管構成細胞、骨髄単核細胞、臍帯血単核細胞、皮膚由来筋線維芽細胞、胚性幹細胞からなる群より選択されるものである、請求項１記載の剤。
細胞が血管内皮細胞、血管平滑筋細胞または皮膚由来筋線維芽細胞である、請求項１記載の剤。
血管形成能を有する幹細胞または血管構成細胞が患者由来のものであり、該患者の血管新生に関連した疾病を治療するために用いられるものである、請求項１記載の剤。
細胞が臍帯血バンクから得られるもの、あるいは近親者から得られるものである、請求項１記載の剤。