CN108070564A - 一种证明核转染小干扰rna安全性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种证明核转染小干扰RNA安全性的方法，包括如下步骤：分离得到骨髓单个核细胞；将所述骨髓单个核细胞通过加入针对目的基因设计的小干扰RNA和对照RNA进行核转染，得到转染细胞悬液；利用甲基纤维素半固体培养法分析小干扰RNA作用后对健康人骨髓单个核细胞体外分化和增值能力的影响，以证明转染小干扰RNA安全性。本发明所提供的证明核转染小干扰RNA安全性的方法，操作方法原理简单，周期短，避免了现有技术中尚没有方法能够证明现有的载体系统的安全性，即为是否可以高效、安全地向人体内转移siRNA片段，使之发挥预期抑癌作用，转移载体是否会诱发癌变等问题。

Description

一种证明核转染小干扰RNA安全性的方法
技术领域
本发明涉及基因工程的技术领域，具体而言，涉及一种证明核转染小干扰RNA安全性方法。
背景技术
肿瘤治疗基因药物是近10年来国内外研究的重点之一，主要包括反义核酸和siRNA。根据肿瘤细胞所表达的特异基因或高表达肿瘤相关基因，设计相应的反义核酸或通过RNA干扰技术筛选有效的特异干扰性小分子RNA(small interfering RNA,siRNA)。这些siRNA可靶向结合目的基因mRNA，从而下调相关基因的表达，达到抗肿瘤效果。RNA干扰现象(RNAi)最早是在20世纪90年代初观察到的，1995年和1998年分别由美国康乃尔大学的华人博士Guo等和华盛顿卡耐基研究院的Fire A等正式提出RNAi的概念。RNAi是在mRNA水平上由外源性或内源性双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的高度特异的基因沉默过程。
RNAi技术是将双链RNA(dsRNA)切割成21-23个核苷酸的siRNA，人为转染至靶细胞后，与细胞内的内切酶形成RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)，RISC特异性结合mRNA同源区，以siRNA为模板，特异地识别其同源性靶mRNA分子并对其进行递进式剪切,形成强有效的瀑布效应,诱导序列特异性的mRNA降解,从而沉默了目的基因的表达。此外，siRNA还可以使mRNA相对应的DNA甲基化，这一过程扩大了原有的甲基化，从而进一步增强基因沉默效应，即所谓转录水平基因沉寂。
研究表明，RNAi技术具有：(1)特异性：dsRNA只对同源基因的表达产生抑制作用，无关基因不受影响；(2)高效性：少量的dsRNA就可以使表型达到缺失突变体的程度，实现相应基因的表达抑制；(3)ATP依赖性：在Dicer酶将dsRNA切割成siRNA过程及RISC过程均需要ATP的参与；(4)时间浓度依赖性：RNAi作用在一定范围内与dsRNA的浓度呈正比；(5)遗传保守性：靶基因转录后沉默(Posttranscriptional gene silencing，PTGS)现象在低等多细胞动物和植物中出现时可以扩增、复制、并在细胞之间相互传递，在不同细胞甚至生物体间长距离的传递和维持；(6)完全抑制效应：发生过程中存在正反馈的信号放大效应。
由于RNAi作用能特异地沉默与疾病有关的外源性或内源基因，使疾病相关蛋白的mRNA发生特异性的降解，降解外源RNA病毒、逆转录病毒基因组，且作用的高效性和高特异性的特点，使RNAi成为肿瘤治疗领域中的新希望。
Ming等首次利用RNAi技术来抑制体外培养的宫颈癌细胞HPVE6、E7蛋白，发现被siRNA干扰的E7蛋白的mRNA水平降低了50％-60％，E6蛋白的mRNA水平降低了70％。已有研究将survivin(生存素)基因特异siRNA导入胰腺癌细胞，生存素mRNA的表达下调90％，从而抑制胰腺癌细胞的生长。Aloy等通过siRNA干扰降低热休克蛋白27的合成，对鼻咽癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤对放疗的敏感性有显著提高。
由于CML细胞存在Bcr-Abl融合基因，从而产生致白血病作用，故设计高效特异的针对融合基因的siRNA成为CML的治疗的一种新途径。体外培养慢性期CML原代细胞，设计针对Bcr-Abl的b3a2变异体的siRNA转染细胞后检测发现表达上述变异体的骨髓前体细胞的增殖明显抑制,这一方面表明Bcr-Abl对于CML细胞增殖的重要性,另一方面提示了RNAi技术做为一种特异的抗CML手段的潜能。在体外的细胞试验中,针对Bcr-Abl mRNA的小干扰RNA可以促进白血病细胞凋亡，显著地降低白血病细胞的增殖。Wohlbold等构建了同样针对Bcr-Abl融合位点b3a2的同源siRNA,结果表明特异性siRNA可以使过表达Bcr-Abl蛋白的细胞系，包括M07p210，32Dp210-wt，原代CD34+/CML细胞的Bcr-Abl蛋白量较对照组显著下降,同时，STI 571的最大半数抑制量(IC50)下降3-4倍。另外，还能提高这些细胞株对γ射线的敏感性，使得γ射线的IC50下降了215倍；特异性siRNA还可使点突变系细胞系32D p210-His396Pro对STI571的敏感性提高4倍。他们提出长期使用这种特异性siRNA可以使Bcr-Abl蛋白依赖性的细胞生长选择性地抑制并且可以逆转细胞循环调节作用，为进一步探索siRNA治疗CML的新途径提供了有利的实验依据。白血病的多药耐药(MDR)是多种机制、多种因素共同作用的结果。研究表明，由MDR-1编码的Pgp在肿瘤细胞表面的过表达是导致肿瘤多药耐药的主要机制，是逆转耐药的良好靶点。以MDR基因为靶基因设计合成3条小干扰RNA，将其导入具有抗药性的K562细胞内，流式细胞仪检测细胞内PgP蛋白合成水平明显降低，RT-PCR检测发现MDR基因表达明显降低。应用MTT检测阿霉素干预生长的K562细胞在导入siRNA后的IC50变化，发现柔红霉素对K562的有效抑制率达到70.4％，细胞生长抑制率达58.0％，有效地逆转了K562的耐药。由此可见利用RNAi技术具有较强的特异性和无毒性，为耐药型CML的治疗开辟了新路，具有广阔的应用前景。
RNAi技术治疗慢性粒细胞白血病的关键在于如何在体内实现靶基因siRNA转移并稳定持久地表达于慢性粒细胞白血病细胞从而抑制癌基因的表达。国外已有报道将siRNA通过质粒转入动物胚胎，阻断该基因的表达，但如何使siRNA药物在体内导向特定的靶细胞，提高治疗效率，提高其摄取率，而又无毒性反应尚无相关报道。
目前尽管在体外和向体内转移siRNA方面取得了一定的进展，然而现有的载体系统的安全性，即为是否可以高效、安全地向人体内转移siRNA片段，使之发挥预期抑癌作用，转移载体是否会诱发癌变，以及临床治疗时，反复多次使用是否会使机体产生免疫反应等问题，还需要实验室和临床进一步观察和验证。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种证明核转染小干扰RNA安全性的方法，旨在解决目前尚没有方法能够证明现有的载体系统的安全性，即为是否可以高效、安全地向人体内转移siRNA片段，使之发挥预期抑癌作用，转移载体是否会诱发癌变，以及临床治疗时，反复多次使用是否会使机体产生免疫反应等问题。
有鉴于此，本发明提供了一种证明核转染小干扰RNA安全性的方法，包括如下步骤：
S1，分离得到骨髓单个核细胞；
S2，将所述骨髓单个核细胞通过加入针对目的基因设计的小干扰RNA和对照RNA进行核转染，得到转染细胞悬液；
S3，利用甲基纤维素半固体培养法分析小干扰RNA作用后对健康人骨髓单个核细胞体外分化和增值能力的影响，以证明转染小干扰RNA安全性。
优选地，所述步骤S3，包括：
S31，在培养板中设立证明红细胞集落形成能力的BFU-E组、证明粒细胞巨噬细胞集落形成能力的CFU-GM组和证明巨核细胞集落形成能力的CFU-Meg组，在各组中均加入胎牛血清、干细胞因子、SCF、IL-3、RPMI1640培养基、甲基纤维素溶液和所述转染细胞悬液，并分别在BFU-E组中加入EPO，在CFU-GM组中加入GM-CSF，在CFU-Meg组中加入TPO，分别混匀并培养14天；
S32，在显微镜下计数CFU-GM组、BFU-E组和CFU-Meg组的细胞集落数。
优选地，所述步骤S31，包括：
S311，在培养板中，设立CFU-GM组、BFU-E组和CFU-Meg组，每组3孔，其内容物及添加顺序如下：
CFU-GM组：依次加入75μL的终体积百分数15％的新生牛血清、50μL的终浓度30ng/mL的SCF、50μL的终浓度100IU/mL的IL-3、50μL的终浓度30IU/mL的EPO、100μL的RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素溶液；
BFU-E组：依次加入75μL的终体积百分数15％的新生牛血清、50μL的终浓度30ng/mL的SCF、50μL的终浓度100IU/mL的IL-3、50μL的终浓度10μg/mL的GM-CSF、100μL的RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素溶液；
CFU-Meg组：依次加入75μL的终体积百分数15％的新生牛血清、50μL的终浓度30ng/mL的SCF、50μL的终浓度100IU/mL的IL-3、50μL的终浓度50μg/mL的TPO、100μL的RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素溶液；
S312，将CFU-GM组、BFU-E组和CFU-Meg组的内容物进行混匀，并在每孔均加入50μL的所述转染细胞悬液，置于37℃、饱和湿度、5％CO2下培养14天。
优选地，所述步骤S32，包括：
在显微镜下分别计数各组的细胞集落数；其中，
所述CFU-GM组为大于40个细胞记为1个细胞集落；
所述BFU-E组为大于50个细胞记为1个细胞集落；
所述CFU-Meg组大于3个细胞记为1个细胞集落。
优选地，所述步骤S1，包括：
S11，取淋巴细胞分离液3-4mL加入离心管内，将稀释后的骨髓抗凝血标本混悬液置于所述淋巴细胞分离液上，离心分离；
S12，吸取中间层，再加入PBS吹打，离心弃上清，加入PBS至2mL，混匀，取其中0.02mL加入至含0.38mL的白细胞稀释液中，混匀并计数。
优选地，所述步骤S12中PBS的浓度为10mm。
优选地，所述白细胞稀释液为2％冰醋酸。
优选地，所述步骤S2，包括：
S21，取骨髓单个核细胞与转染液混合；
S22，分别加入1-3μg针对目的基因设计的小干扰RNA和对照RNA，并设置对照组，通过转染仪进行转染，得到转染细胞液；
S23，取转染细胞液置于包含有胎牛血清、青霉素和链霉素的培养板中进行培养，得到转染细胞悬液。
优选地，所述步骤S23，包括：
S231，取转染细胞液置于5％CO2培养箱37℃预热后的含有体积分数为10％-15％的胎牛血清、100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的培养板中，中体积为2mL；
S232，将所述培养板放入培养箱8-12小时，得到转染培养液；
S233，取所述转染培养液离心10分钟去上清液，更换为含有10％或15％胎牛血清、100IU/mL青-链霉素的完全培养基继续培养，即得转染细胞悬液。
优选地，所述步骤S22之前，还包括：
根据StealthTM RNAi的设计法则，在GenBank查找目的基因序列，并设计针对所述目的基因序列的小干扰RNA和与所述目的基因序列无同源性的对照RNA。
本发明提供一种证明核转染小干扰RNA安全性的方法，通过分离得到骨髓单个核细胞，将所述骨髓单个核细胞通过加入针对目的基因设计的小干扰RNA和对照RNA进行核转染，得到转染细胞悬液，再利用甲基纤维素半固体培养法分析小干扰RNA作用后对健康人骨髓单个核细胞体外分化和增值能力的影响，从而证明转染小干扰RNA安全性。本发明通过转染技术对骨髓单个核细胞通过加入针对目的基因设计的小干扰RNA和对照RNA进行转染，并对小干扰RNA通过甲基纤维素半固体培养方法进行分析，即为与对照组进行计数比较，从而通过统计学分析可以证明核转染小干扰RNA安全性，操作方法原理简单，周期短，避免了现有技术中尚没有方法能够证明现有的载体系统的安全性，即为是否可以高效、安全地向人体内转移siRNA片段，使之发挥预期抑癌作用，转移载体是否会诱发癌变，以及临床治疗时，反复多次使用是否会使机体产生免疫反应等问题。
附图说明
应当理解的是，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明证明核转染小干扰RNA安全性的方法的实施例中健康人骨髓单个核细胞体外诱导分化图(14天倒置显微镜Bar＝50μm种板密度2×105)；
图2为本发明证明核转染小干扰RNA安全性的方法的实施例中体外诱导14d各组BFU-E、CFU-GM、CFU-Meg形成情况(n＝3，±S，P>0.05)；
图3为本发明证明核转染小干扰RNA安全性的方法的简要实验流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例的方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。
但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明提供了一种证明核转染小干扰RNA安全性的方法，包括如下步骤：
S1，分离得到骨髓单个核细胞；
上述，需要理解的是，外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。骨髓单个核细胞，亦为BM-MNCs，目前国内外分离骨髓单个核细胞(BM-MNCs)的常用方法是聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法。
S2，将所述骨髓单个核细胞通过加入针对目的基因设计的小干扰RNA和对照RNA进行核转染，得到转染细胞悬液；
上述，需要理解的是，小干扰RNA(Small interfering RNA；siRNA)有时称为短干扰RNA(short interfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA)，是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，在生物学上有许多不同的用途。目前已知siRNA主要参与RNA干扰(RNAi)现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。此外，也参与一些与RNAi相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。不过这些复杂机制的反应途径目前尚未明了。
上述，需要理解的是，基因转染是一种“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”的技术。其中，核酸包括DNA(质粒和线性双链DNA)，反义寡核苷酸及RNAi(RNA interference)。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究(基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究)和基因治疗研究。
S3，利用甲基纤维素半固体培养法分析小干扰RNA作用后对健康人骨髓单个核细胞体外分化和增值能力的影响，以证明转染小干扰RNA安全性。
上述，甲基纤维素半固体培养法采用甲基纤维素半固体培养基，需要理解的是，甲基纤维素为白色或类白色纤维状或颗粒状粉末；无臭，无味。本品在水中溶胀成澄清或微浑浊的胶体溶液；在无水乙醇、氯仿或乙醚中不溶。
上述，在本发明中，具体的证明核转染小干扰RNA安全性的证明方法为在小干扰RNA转染后，健康人骨髓单个核细胞体外BFU-E、CFU-GM、CFU-Meg的形成与MOCK对照组比较，计数各组集落数，经统计学分析，若无统计学差异(P>0.05)，则证明小干扰RNA转染后对健康人骨髓单个核细胞体外增殖和分化无影响。
本发明通过转染技术对骨髓单个核细胞通过加入针对目的基因设计的小干扰RNA和对照RNA进行转染，并对小干扰RNA通过甲基纤维素半固体培养方法进行分析，即为与对照组进行计数比较，从而通过统计学分析可以证明核转染小干扰RNA安全性，操作方法原理简单，周期短，避免了现有技术中尚没有方法能够证明现有的载体系统的安全性，即为是否可以高效、安全地向人体内转移siRNA片段，使之发挥预期抑癌作用，转移载体是否会诱发癌变，以及临床治疗时，反复多次使用是否会使机体产生免疫反应等问题。
优选地，所述步骤S3，包括：
S31，在培养板中设立证明红细胞集落形成能力的BFU-E组、证明粒细胞巨噬细胞集落形成能力的CFU-GM组和证明巨核细胞集落形成能力的CFU-Meg组，在各组中均加入胎牛血清、干细胞因子、SCF、IL-3、RPMI1640培养基、甲基纤维素溶液和所述转染细胞悬液，并分别在BFU-E组中加入EPO，在CFU-GM组中加入GM-CSF，在CFU-Meg组中加入TPO，分别混匀并培养14天；
S32，在显微镜下计数CFU-GM组、BFU-E组和CFU-Meg组的细胞集落数。
优选地，所述步骤S31，包括：
S311，在培养板中，设立CFU-GM组、BFU-E组和CFU-Meg组，每组3孔，其内容物及添加顺序如下：
CFU-GM组：依次加入75μL的终体积百分数15％的新生牛血清、50μL的终浓度30ng/mL的SCF、50μL的终浓度100IU/mL的IL-3、50μL的终浓度30IU/mL的EPO、100μL的RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素溶液；
BFU-E组：依次加入75μL的终体积百分数15％的新生牛血清、50μL的终浓度30ng/mL的SCF、50μL的终浓度100IU/mL的IL-3、50μL的终浓度10μg/mL的GM-CSF、100μL的RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素溶液；
CFU-Meg组：依次加入75μL的终体积百分数15％的新生牛血清、50μL的终浓度30ng/mL的SCF、50μL的终浓度100IU/mL的IL-3、50μL的终浓度50μg/mL的TPO、100μL的RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素溶液；
S312，将CFU-GM组、BFU-E组和CFU-Meg组的内容物进行混匀，并在每孔均加入50μL的所述转染细胞悬液，置于37℃、饱和湿度、5％CO2下培养14天。
上述，在本发明中，体外诱导健康人骨髓单个核细胞分化所需半固体培养基及细胞因子配制方法如下：
1、2.2％甲基纤维素溶液的配制：称取甲基纤维素粉剂2.2g，于120℃干烤、消毒2h后，加于煮沸的50.0mL DDW中，用磁力搅拌器搅拌2h，使之充分溶解。待降温至37℃左右，再加入RPMI 1640液50mL，并继续搅拌4h。置4℃过夜，使泡沫全部消失，呈透明发亮胶液态。分装后4℃保存。
2、EPO、IL-3、SCF、TPO、GM-CSF工作液配制：各取适量RPMI 1640加入EPO、IL-3、SCF、TPO、GM-CSF干粉剂中，依次配置成300IU/mL、1000IU/mL、300ng/mL、500ng/mL、100ng/mL的工作液，4℃保存备用。
优选地，所述步骤S32，包括：
在显微镜下分别计数各组的细胞集落数；其中，
所述CFU-GM组为大于40个细胞记为1个细胞集落；
所述BFU-E组为大于50个细胞记为1个细胞集落；
所述CFU-Meg组大于3个细胞记为1个细胞集落。
上述，在本发明中细胞放大观察设备为显微镜，具体的也可以为其他具有放大显示功能的设备。
上述，在本发明中，利用甲基纤维素半固体培养方法分析小干扰RNA作用后，对健康人骨髓单个核细胞体外分化和增殖能力的影响，以红细胞集落形成能力(BFU-E)、粒细胞巨噬细胞集落形成能力(CFU-GM)和巨核细胞集落形成能力(CFU-Meg)为代表，细胞因子应用EPO/GM-CSF/TPO和SCF、IL3。具体步骤如下：
1、种板：24孔培养板，每组3孔，分别用于培养红细胞集落、粒细胞巨噬细胞集落和巨核细胞集落(细胞数较多时设平行孔)。每孔0.5mL体系：依次加入75μL的新生牛血清(终体积百分数15％)、50μL的SCF(终浓度30ng/mL)、50μL的IL-3(终浓度100IU/mL)、50μL的EPO(终浓度30IU/mL)或TPO(终浓度50ng/mL)或GM-CSF(终浓度10ng/mL)、100μL的RPMI 1640培养基、125μL的甲基纤维素，混匀，尽量避免气泡；最后每孔加入50μL的细胞悬液(约1×105)，轻轻混匀后置于37℃、饱和湿度、5％CO2条件下常规培养；
2、计数：14d后在显微镜下计数各组CFU-GM(＞40个细胞为1个集落)、BFU-E(＞50个细胞为1个集落)、CFU-Meg(＞3个细胞为1个集落)的数量。
优选地，所述步骤S1，包括：
S11，取淋巴细胞分离液3-4mL加入离心管内，将稀释后的骨髓抗凝血标本混悬液置于所述淋巴细胞分离液上，离心分离；
S12，吸取中间层，再加入PBS吹打，离心弃上清，加入PBS至2mL，混匀，取其中0.02mL加入至含0.38mL的白细胞稀释液中，混匀并计数。
优选地，所述步骤S12中PBS的浓度为10mm。
上述，PBS即磷酸盐缓冲液，能够提供相对稳定的离子环境和pH缓冲能力，是生物学中经常使用的缓冲盐溶液，用于分子克隆及细胞培养等，pH为7.2-7.4，与人体血液等渗，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾。在本发明中，PBS使用浓度为1X即为10mm的PBS缓冲液。
优选地，所述白细胞稀释液为2％冰醋酸。
上述，为本发明中对骨髓单个核细胞(BM-MNCs)的分离，具体方法如下：
1、取淋巴细胞分离液(Ficoll，密度1.077)3-4mL加入离心管内，将稀释后的抗凝血标本混悬液平铺于分离液之上，以水平离心机，1500rpm，离心15min。
2、吸取中间层转移至另一离心管内，再加入适量1X PBS，轻轻吹打，以1000rpm离心洗涤10min，弃上清，加入1X PBS至2.00mL，混匀，取其中0.02mL加入至含0.38mL的白细胞稀释液(2％冰醋酸)的小试管中，混匀后计数。用同样的方法继续洗涤两次。
优选地，所述步骤S2，包括：
S21，取骨髓单个核细胞与转染液混合；
S22，分别加入1-3μg针对目的基因设计的小干扰RNA和对照RNA，并设置对照组，通过转染仪进行转染，得到转染细胞液；
S23，取转染细胞液置于包含有胎牛血清、青霉素和链霉素的培养板中进行培养，得到转染细胞悬液。
优选地，所述步骤S23，包括：
S231，取转染细胞液置于5％CO2培养箱37℃预热后的含有体积分数为10％-15％的胎牛血清、100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的培养板中，中体积为2mL；
S232，将所述培养板放入培养箱8-12小时，得到转染培养液；
S233，取所述转染培养液离心10分钟去上清液，更换为含有10％或15％胎牛血清、100IU/mL青-链霉素的完全培养基继续培养，即得转染细胞悬液。
上述，在本发明中，具体通过如下方法进行转染操作：
1、按照Amaxa公司网页针对不同的细胞株推荐不同量的细胞数收集细胞，200g离心10min，完全去除上清。
2、用100μL NucleofectorTM Solution和Supplement混合液(二者比例9:2，即配即用)预热至室温用于悬浮细胞。
3、分别加入1-3μg siRNA/SC，用核转染专用的移液管混匀后加入核转杯，启动核酸转染仪细胞特异性程序，同时设置转染条件对照组(MOCK)。
4、程序完成后立刻用专用的移液管将转染后的细胞液，放置在经5％CO2培养箱37℃预热过的，含体积分数10％或15％胎牛血清、100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的12孔板中，终体积为2mL。
5、放入培养箱8-12h后，将各组细胞200g离心10min后去上清，更换为含有10％或15％胎牛血清、100IU/mL青-链霉素的完全培养基继续培养。
上述，在本发明中所采用的转染仪为NucleofectorTM核酸转染仪，是将传统地电穿孔技术和专用地转染试剂结合起来的产物，针对不同的细胞类型，采用一套最理想的转染试剂和转染程序，以达到最理想的转染效率。NucleofectorTM核酸转染仪特别适用于转染原代细胞和难以转染的细胞系，如T细胞及PC-12细胞系等。NucleofectorTM技术是独一无二的，因为它可以直接将DNA转染到细胞核内，因此实现了因受到细胞分裂限制而一直困扰人们的原代细胞的高效率转染。
优选地，所述步骤S22之前，还包括：
根据StealthTM RNAi的设计法则，在GenBank查找目的基因序列，并设计针对所述目的基因序列的小干扰RNA和与所述目的基因序列无同源性的对照RNA。
上述，为本发明在线设计在小干扰RNA和对照RNA的流程，具体为：
GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找目的基因序列，根据Invitrogen公司(www.invitrogen.com)提供的StealthTM RNAi设计法则，在线设计针对目的基因mRNA不同序列的siRNA。同时设计与目的基因序列无同源性的non-silencingscrambled control(SC)对照RNA。
为了便于理解本发明，下面结合实施例来进一步说明本发明的技术方案。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
实施例
本发明提供了一种证明核转染小干扰RNA安全性的方法，包括如下步骤：
S1，分离得到骨髓单个核细胞；
S11，取淋巴细胞分离液3-4mL加入离心管内，将稀释后的骨髓抗凝血标本混悬液置于所述淋巴细胞分离液上，离心分离；
S12，吸取中间层，再加入10mm的PBS吹打，离心弃上清，加入10mm的PBS至2mL，混匀，取其中0.02mL加入至含0.38mL的白细胞稀释液中，混匀并计数。
S2，将所述骨髓单个核细胞通过加入针对目的基因设计的小干扰RNA和对照RNA进行核转染，得到转染细胞悬液；
S21，取骨髓单个核细胞与转染液混合；
S22，根据StealthTM RNAi的设计法则，在GenBank查找目的基因序列，并设计针对所述目的基因序列的小干扰RNA和与所述目的基因序列无同源性的对照RNA。
分别加入1-3μg针对目的基因设计的小干扰RNA和对照RNA，并设置对照组，通过转染仪进行转染，得到转染细胞液；
S23，取转染细胞液置于包含有胎牛血清、青霉素和链霉素的培养板中进行培养，得到转染细胞悬液。
S231，取转染细胞液置于5％CO2培养箱37℃预热后的含有体积分数为10％-15％的胎牛血清、100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的培养板中，中体积为2mL；
S232，将所述培养板放入培养箱8-12小时，得到转染培养液；
S233，取所述转染培养液离心10分钟去上清液，更换为含有10％或15％胎牛血清、100IU/mL青-链霉素的完全培养基继续培养，即得转染细胞悬液。
S3，利用甲基纤维素半固体培养法分析小干扰RNA作用后对健康人骨髓单个核细胞体外分化和增值能力的影响，以证明转染小干扰RNA安全性。
S31，在培养板中设立证明红细胞集落形成能力的BFU-E组、证明粒细胞巨噬细胞集落形成能力的CFU-GM组和证明巨核细胞集落形成能力的CFU-Meg组，在各组中均加入胎牛血清、干细胞因子、SCF、IL-3、RPMI1640培养基、甲基纤维素溶液和所述转染细胞悬液，并分别在BFU-E组中加入EPO，在CFU-GM组中加入GM-CSF，在CFU-Meg组中加入TPO，分别混匀并培养14天；
S311，在培养板中，设立CFU-GM组、BFU-E组和CFU-Meg组，每组3孔，其内容物及添加顺序如下：
CFU-GM组：依次加入75μL的终体积百分数15％的新生牛血清、50μL的终浓度30ng/mL的SCF、50μL的终浓度100IU/mL的IL-3、50μL的终浓度30IU/mL的EPO、100μL的RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素溶液；
BFU-E组：依次加入75μL的终体积百分数15％的新生牛血清、50μL的终浓度30ng/mL的SCF、50μL的终浓度100IU/mL的IL-3、50μL的终浓度10μg/mL的GM-CSF、100μL的RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素溶液；
CFU-Meg组：依次加入75μL的终体积百分数15％的新生牛血清、50μL的终浓度30ng/mL的SCF、50μL的终浓度100IU/mL的IL-3、50μL的终浓度50μg/mL的TPO、100μL的RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素溶液；
S312，将CFU-GM组、BFU-E组和CFU-Meg组的内容物进行混匀，并在每孔均加入50μL的所述转染细胞悬液，置于37℃、饱和湿度、5％CO2下培养14天。
S32，在显微镜下计数CFU-GM组、BFU-E组和CFU-Meg组的细胞集落数。
所述步骤S32，包括：
在显微镜下分别计数各组的细胞集落数；其中，
所述CFU-GM组为大于40个细胞记为1个细胞集落；
所述BFU-E组为大于50个细胞记为1个细胞集落；
所述CFU-Meg组大于3个细胞记为1个细胞集落。
实施例实验结果：
在本实施例中，利用上述证明核转染小干扰RNA安全性的方法进行对健康人骨髓单个核细胞体外BFU-E、CFU-GM和CFU-Meg形成情况分析，流程图如图3所示，具体结果如图1、2所示，小干扰RNA在经过如上述所述方法进行转染和种板后14天，健康人骨髓单个核细胞体外BFU-E、CFU-GM、CFU-Meg的形成与MOCK对照组比较，计数各组集落数，经统计学分析，无统计学差异(P>0.05)，证明小干扰RNA转染后对健康人骨髓单个核细胞体外增殖、分化无影响。
此外，通过荧光实时定量PCR检测转染小干扰RNA前后目的基因在3例健康人骨髓单个核细胞中的表达，若3例健康人骨髓单个核细胞中的目的基因在转染前后基因表达量无明显变化，也证实了小干扰RNA转染的安全性。

Claims (10)

1.一种证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，分离得到骨髓单个核细胞；
S2，将所述骨髓单个核细胞通过加入针对目的基因设计的小干扰RNA和对照RNA进行核转染，得到转染细胞悬液；
S3，利用甲基纤维素半固体培养法分析小干扰RNA作用后对健康人骨髓单个核细胞体外分化和增值能力的影响，以证明转染小干扰RNA安全性。
2.如权利要求1所述证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，所述步骤S3，包括：
S31，在培养板中设立证明红细胞集落形成能力的BFU-E组、证明粒细胞巨噬细胞集落形成能力的CFU-GM组和证明巨核细胞集落形成能力的CFU-Meg组，在各组中均加入胎牛血清、干细胞因子、SCF、IL-3、RPMI1640培养基、甲基纤维素溶液和所述转染细胞悬液，并分别在BFU-E组中加入EPO，在CFU-GM组中加入GM-CSF，在CFU-Meg组中加入TPO，分别混匀并培养14天；
S32，在显微镜下计数CFU-GM组、BFU-E组和CFU-Meg组的细胞集落数。
3.如权利要求2所述证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，所述步骤S31，包括：
S311，在培养板中，设立CFU-GM组、BFU-E组和CFU-Meg组，每组3孔，其内容物及添加顺序如下：
BFU-E组：依次加入75μL的终体积百分数15％的新生牛血清、50μL的终浓度30ng/mL的SCF、50μL的终浓度100IU/mL的IL-3、50μL的终浓度30IU/mL的EPO、100μL的RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素溶液；
CFU-GM组：依次加入75μL的终体积百分数15％的新生牛血清、50μL的终浓度30ng/mL的SCF、50μL的终浓度100IU/mL的IL-3、50μL的终浓度10μg/mL的GM-CSF、100μL的RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素溶液；
CFU-Meg组：依次加入75μL的终体积百分数15％的新生牛血清、50μL的终浓度30ng/mL的SCF、50μL的终浓度100IU/mL的IL-3、50μL的终浓度50μg/mL的TPO、100μL的RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素溶液；
S312，将CFU-GM组、BFU-E组和CFU-Meg组的内容物进行混匀，并在每孔均加入50μL的所述转染细胞悬液，置于37℃、饱和湿度、5％CO2下培养14天。
4.如权利要求2所述证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，所述步骤S32，包括：
在显微镜下分别计数各组的细胞集落数；其中，
所述CFU-GM组为大于40个细胞记为1个细胞集落；
所述BFU-E组为大于50个细胞记为1个细胞集落；
所述CFU-Meg组大于3个细胞记为1个细胞集落。
5.如权利要求1所述证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，所述步骤S1，包括：
S11，取淋巴细胞分离液3-4mL加入离心管内，将稀释后的骨髓抗凝血标本混悬液置于所述淋巴细胞分离液上，离心分离；
S12，吸取中间层，再加入PBS吹打，离心弃上清，加入PBS至2mL，混匀，取其中0.02mL加入至含0.38mL的白细胞稀释液中，混匀并计数。
6.如权利要求5所述证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，所述步骤S12中PBS的浓度为10mm。
7.如权利与要求5所述证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，所述白细胞稀释液为2％冰醋酸。
8.如权利要求1所述证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，所述步骤S2，包括：
S21，取骨髓单个核细胞与转染液混合；
S22，分别加入1-3μg针对目的基因设计的小干扰RNA和对照RNA，并设置对照组，通过转染仪进行转染，得到转染细胞液；
S23，取转染细胞液置于包含有胎牛血清、青霉素和链霉素的培养板中进行培养，得到转染细胞悬液。
9.如权利要求8所述证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，所述步骤S23，包括：
S231，取转染细胞液置于5％CO2培养箱37℃预热后的含有体积分数为10％-15％的胎牛血清、100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的培养板中，中体积为2mL；
S232，将所述培养板放入培养箱8-12小时，得到转染培养液；
S233，取所述转染培养液离心10分钟去上清液，更换为含有10％或15％胎牛血清、100IU/mL青-链霉素的完全培养基继续培养，即得转染细胞悬液。
10.如权利要求1所述证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，所述步骤S22之前，还包括：
根据StealthTM RNAi的设计法则，在GenBank查找目的基因序列，并设计针对所述目的基因序列的小干扰RNA和与所述目的基因序列无同源性的对照RNA。
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