CN106244679B - miR-100抑制剂在降低癌症转移中的用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及miR‑100抑制剂在降低癌症转移中的用途。具体而言，涉及确定miR‑100表达水平的试剂在制备乳腺癌诊断试剂中的用途；以及miR‑100抑制剂或miR‑100拮抗剂在制备用于治疗乳腺癌的药物中的用途。在体内肿瘤相关巨噬细胞和体外诱导的M2型巨噬细胞中，miR‑100可以被肿瘤微环境诱导表达上调。在体内试验中，使用microRNA拮抗剂敲低小鼠乳腺肿瘤组织中miR‑100的表达，发现在肿瘤相关巨噬细胞中miR‑100下调的实验组中，虽然原位肿瘤生长没有统计性差异，但是肺转移结节的数量却明显下调，乳腺肿瘤转移受到抑制。

Description

miR-100抑制剂在降低癌症转移中的用途

技术领域

本申请涉及医学领域。具体而言，涉及microRNA在乳腺癌的诊断和治疗中的用途。

背景技术

人们越来越意识到，对于肿瘤的研究不能仅仅孤立的停留在肿瘤细胞上，而是应该将肿瘤与其所处的环境作为一个整体，即肿瘤微环境(Tumor Microenvironment,TME)。TME中的细胞主要有肿瘤细胞、纤维母细胞、脂肪细胞以及浸润的炎性细胞等，其中的炎性细胞主要包括侵润的免疫淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。TME中肿瘤细胞与其中的免疫细胞间的相互作用是肿瘤生长和侵润的重要促进因素(Gajewski,T.F.,H.Schreiber和Y.X.Fu,Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.NatureImmunology,2013.14(10):p.1014-1022)。

肿瘤相关巨噬细胞(Tumor Associated Macrophages,TAMs)是TME中十分重要的组成成分，占肿瘤微环境中所侵润的免疫细胞的30％-50％。在大多数人和小鼠的肿瘤组织中，机体的巨噬细胞由于受肿瘤细胞分泌的趋化因子(CSF-1,CCL2等)的吸引来到肿瘤组织并常驻其中。相比于传统的炎性巨噬细胞，TAMs并没有表现出肿瘤杀伤性，取而代之的是，TAMs在肿瘤发生发展以及转移过程中展现出了促肿瘤表型(Biswas,S.K.,P.Allavena和A.Mantovani,Tumor-associated macrophages:functional diversity,clinicalsignificance,and open questions.Seminars in Immunopathology,2013.35(5):p.585-600)。以TAM为代表的TME中免疫细胞，通过分泌细胞因子、趋化因子、酶等，协同肿瘤细胞一起维持肿瘤微环境的稳定，参与到肿瘤血管生成、肿瘤细胞侵袭转移、免疫抑制等多个肿瘤发展进程中的关键事件。探究清楚TME的复杂成分，分析肿瘤细胞与TME中巨噬细胞以及其他细胞的功能关联，将对人类治疗肿瘤有重大的推动作用，为临床治疗提供新的靶向和联合治疗手段。

在正常生理状态下，巨噬细胞被分为两种不同的表型，M1型和M2型。M1型巨噬细胞作为适应性免疫应答中的效应细胞，具有杀伤微生物和肿瘤细胞、分泌大量炎性因子等功能，而M2型巨噬细胞则具有限制炎症反应和适应性免疫应答、清除残留物、促进血管生成、参与组织重塑和修复等作用。它们的表型取决于它们所处的解剖位置(微环境)和机体的病理生理状况。在大多数人和小鼠的肿瘤组织中，巨噬细胞与肿瘤细胞的相互作用后，其表型和功能更接近M2型巨噬细胞。循环系统中的单核细胞受到肿瘤细胞分泌的趋化因子的吸引来到肿瘤组织中，并分化成为巨噬细胞常驻其中，在肿瘤细胞分泌的各种调控因子的作用下向M2表型分化，丧失了正常M1型巨噬细胞具有的抗炎及抗肿瘤的作用(Mantovani,A.,等人，The chemokine system in diverse forms of macrophage activation andpolarization.Trends Immunol,2004.25(12):p.677-86)。

在肿瘤生长的初期，浸润在肿瘤组织的巨噬细胞大部分为M1型，具有高表达IL-12、低表达IL-10的表型，促进免疫应答，帮助机体清除肿瘤。随着肿瘤的发展，受到肿瘤微环境的多种刺激，也就是我们常说的肿瘤细胞“再教育”巨噬细胞的过程，M1型巨噬细胞逐渐转化为低表达IL-12、高表达IL-10的M2型巨噬细胞，M2型巨噬细胞成为了肿瘤组织中巨噬细胞的主要表型特征，此时巨噬细胞分泌的多种细胞因子可以抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤的生长和转移(Luo,Y.P.,等人，The role of proto-oncogene Fra-1in remodelingthe tumor microenvironment in support of breast tumor cell invasion andprogression.Oncogene,2010.29(5):p.662-673；Sica,A.和A.Mantovani,Macrophageplasticity and polarization:in vivo veritas.Journal of ClinicalInvestigation,2012.122(3):p.787-795)。很多临床和实验研究结果已经证明，巨噬细胞能够与肿瘤的发展和转移密切相关。肿瘤相关巨噬细胞的数量与不良的预后之间存在相关性，尤其是在乳腺癌、卵巢癌和子宫癌中。肿瘤相关巨噬细胞几乎参与了肿瘤发生发展的所有进程，通过清除肿瘤微环境的巨噬细胞或影响其表型，可以切断肿瘤恶性发展的重要供给，而肿瘤相关巨噬细胞也有望成为肿瘤治疗中一个重要的靶点。

microRNA是一类长度为19至25个核苷酸的非编码单链小分子RNA，通常在转录后水平调控基因表达。他们广泛的存在于各种生物体中，参与细胞的增殖、凋亡、分化、代谢以及个体发育和病毒感染等过程。随着分子生物学的进展，研究显示microRNA在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。microRNA既可作为抑癌基因下调癌基因的表达，也可作为癌基因抑制抑癌基因的活性；同时，microRNA还可调节肿瘤相关基因的表达，这些基因自身突变、缺失、易位及相互调控异常等还可导致相关基因异常表达(Gregory,R.I.和R.Shiekhattar,MicroRNA biogenesis and cancer.Cancer Res,2005.65(9):p.3509-12)。

许多研究报道证明microRNA在巨噬细胞生物学功能上的重要性，提示microRNA可引导巨噬细胞面对微环境信号刺激引起的反应，以及可以协助巨噬细胞表现出促肿瘤生长的表型，维持肿瘤微环境的稳定。

许多microRNA在巨噬细胞的表型和功能上表现出重要的调控作用。Toll样受体激活是巨噬细胞表型的一个重要表现，包括miR-155，miR-125a/b，miR-146a和miR-21在内的多个高度保守的microRNA可以在这个过程中表达上调。其中，被研究报道非常多的miR-155，受NF-κB信号通路的调控上调，促进TNF-α的表达，进一步表现出促进炎症反应的作用(O'Connell,R.M.,等人，MicroRNA-155is induced during the macrophageinflammatory response.Proc Natl Acad Sci U S A,2007.104(5):p.1604-9)；不仅如此，miR-155还可以通过靶向一些免疫抑制因子和M2型标志物的的表达，如SOCS1、BCL6和Arg1等(Nazari-Jahantigh,M.,等人，MicroRNA-155promotes atherosclerosis byrepressing Bcl6in macrophages.J Clin Invest,2012.122(11):p.4190-202)。

此外，最近越来越多的报道证明了细胞外microRNA的存在。microRNA不仅仅在细胞内发挥重要的作用，也可以通过细胞传递到其他受体细胞中发挥功能。肿瘤相关巨噬细胞也是如此，有研究证明，LPS虽然可以诱导miR-223在巨噬细胞内的表达，但是miR-223却可以抑制巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1b等细胞因子，抑制炎性反应(Zhuang,G.,等人，A novelregulator of macrophage activation:miR-223in obesity-associated adiposetissue inflammation.Circulation,2012.125(23):p.2892-903)，同时，在乳腺肿瘤组织中，miR-223又可以被巨噬细胞通过外泌体包裹的形式分泌出来，进入肿瘤细胞当中，进一步通过抑制MEF2C的表达，引导β-catenin的入核，增强肿瘤细胞的侵袭能力(Yang,M.,等人，Microvesicles secreted by macrophages shuttle invasion-potentiatingmicroRNAs into breast cancer cells.Mol Cancer,2011.10:p.117)。

肿瘤微环境中很多细胞因子，包括TNF-α、IL-4、IL-10和TGF-β等，可以参与到巨噬细胞的表型调控，影响microRNA的表达，但是有关肿瘤微环境对肿瘤相关巨噬细胞中microRNA功能调控的报道却很少。肿瘤微环境中另外一个重要的特征，低氧环境，也可以诱导很多microRNA的表达，这些由低氧因素诱导的肿瘤相关巨噬细胞相关microRNA对于其细胞表型和功能的影响也需要进一步的研究。

发明内容

鉴于上述，根据本申请的一个实施方式，提供了确定miR-100表达水平的试剂在制备乳腺癌诊断试剂中的用途。

在具体的实施方式中，miR-100表达水平的确定是在核酸水平上进行的。

在具体的实施方式中，确定miR-100表达水平的试剂选自特异于miR-100的探针和特异于miR-100的引物。技术人员根据miR-100的核苷酸序列可以自行设计并合成适当的探针和引物。只要能够实现miR-100表达水平的确定，任何特异于miR-100的探针和引物均可使用，不限于具体的探针或引物。

在具体的实施方式中，miR-100是指miR-100的成熟体(文中也作，miR-100-5p)。在具体的实施方式中，miR-100的核苷酸序列是AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG(SEQ ID No.1)。miR-100的前体核苷酸序列在miRbase数据库中的登录号是MI0000692。鉴于该序列的高度保守性，小鼠和人类的成熟体序列是相同的。

乳腺癌有多种分类标准。在一些实施方式中，乳腺癌按照WHO建议的分类标准进行分类，例如http://wenku.baidu.com/view/d99232240066f5335a812153.html上公布的分类。

在另一些实施方式中，乳腺癌按照分子类型进行分类：Luminal A型、Luminal B型、H型、三阴性。在具体的实施方式中，本申请的技术方案适用于三阴性乳腺癌。

在另一些实施方式中，乳腺癌按照分期进行分类：I、II、III和IV期；优选IV期。

在另一些实施方式中，乳腺癌分为浸润型和非浸润型。在具体的实施方式中，本申请的技术方案适用于浸润型乳腺癌。

在另一些实施方式中，乳腺癌是转移性乳腺癌。

根据另一方面，本申请提供miR-100抑制剂(或miR-100拮抗剂)在制备用于治疗乳腺癌的药物中的用途。

根据又一方面，本申请提供miR-100抑制剂(或miR-100拮抗剂)在制备用于降低乳腺癌转移的药物中的用途。

在一些实施方式中，乳腺癌的转移选自：肝转移、脑转移、淋巴结转移、和肺转移；优选肺转移。

在一些实施方式中，所述miR-100抑制剂或miR-100拮抗剂是指miR-100的互补序列；优选miR-100成熟体的互补序列。

技术人员理解，本申请中所指的“互补序列”并不限于100％碱基互补的序列，当有个别碱基(例如，1至5个)不能和miR-100成熟体对应位置的碱基配对时，并不影响整个互补序列和miR-100成熟体的结合。miR-100成熟体仅有22个碱基，因此技术人员可以根据碱基互补原理和常规实验，来确定miR-100的可行互补序列。本申请中对miR-100的互补序列的具体序列并没有限制，只要能实现和miR-100或miR-100成熟体的结合即可。

在具体的实施方式中，所述miR-100抑制剂或miR-100拮抗剂还可以是经过修饰的miR-100的互补序列。在一个实施方式中，miR-100抑制剂或miR-100拮抗剂是胆固醇修饰的miR-100的互补序列。在一个实施方式中，miR-100抑制剂或miR-100拮抗剂是Antagomir。在另一些实施方式中，miR-100抑制剂或miR-100拮抗剂是Sponge或Tud方法中描述的。Sponge或Tud两个方法描述的是质粒法：把microRNA的互补序列连接到质粒上表达出来，然后通过质粒的表达来抑制microRNA。

附图说明

图1A和图1B：肿瘤相关巨噬细胞磁珠分选结果，细胞纯度流式细胞术验证。

图2：半定量PCR检测体外肿瘤上清条件培养和肿瘤细胞共培养诱导的巨噬细胞中，M2型表型分子Arg1的表达。

图3：qPCR检测候选microRNA在肿瘤细胞共培养诱导的巨噬细胞中的表达；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.005。

图4：qPCR检测候选microRNA在肿瘤上清条件培养的巨噬细胞中的表达；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.005。

图5A：RAW264.7细胞转染miR-100模拟物24小时后，qPCR检测六个巨噬细胞M2型表型标记物mRNA的表达。对照组：向细胞转染一段无意序列作为对照；miR-100组：转染miR-100模拟物。

图5B：小鼠腹腔巨噬细胞转染miR-100模拟物24小时后，qPCR检测六个巨噬细胞M2型表型标记物mRNA的表达。对照组：向细胞转染一段无意序列作为对照；miR-100组：转染miR-100模拟物。

图6A：腹腔巨噬细胞转染miR-100模拟物24小时后，流式细胞术检测CD206和F4/80双阳性细胞群比例。对照组：向细胞转染一段无意序列作为对照；miR-100组：转染miR-100模拟物。

图6B：将miR-100抑制剂转染到腹腔巨噬细胞后，再使用4T1肿瘤细胞上清处理细胞24小时，qPCR检测miR-100的表达。

图6C：qPCR检测样品中CD206mRNA的表达；*P＜0.05，**P＜0.01。

图7：实验组和对照组小鼠体重变化情况。

图8：qPCR检测两组小鼠肿瘤组织中的肿瘤相关巨噬细胞miR-100表达水平；***P＜0.005。

图9A：活体成像仪器检测实验组和对照组小鼠在接种肿瘤28天后的原位肿瘤发展情况。

图9B：实验组和对照组小鼠的原位肿瘤组织重量比对；n＝5。

图9C：实验组和对照组小鼠在肿瘤发展过程中的原位肿瘤体积比对；n＝5。

图10A：实验组和对照组小鼠在处死后，肺部重量与体重比值的比较。

图10B：实验组和对照组小鼠肺部组织HE染色情况。

图10C：实验组和对照组小鼠的肺部肿瘤转移结节数比对；n＝5，*P＜0.05；**P＜0.01。

具体实施方式

实施例1：乳腺肿瘤小鼠模型的构建

一、实验动物

乳腺肿瘤模型小鼠实验采用BALB/c雌鼠，通过中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心购买。所有实验用小鼠均在SPF级动物房饲养、接种，动物房温度控制在19-24℃，湿度维持50％-60％，12小时明暗交替。小鼠饲料、垫料均经高温消毒处理，饮水经高温高压灭菌处理。实验过程中，及时观察小鼠的状态，垫料每周换两次，饲料和饮水每日补充。

二、模型建立方法

本实施例采用小鼠4T1细胞系建立肿瘤模型，ATCC数据库描述该模型代表浸润性三阴性乳腺癌，并且具有自发转移性。

1.接种细胞前一天，给小鼠打耳标，并将小鼠右侧第四对乳腺周围的被毛脱去，暴露乳腺皮层。

2.接种前一天，将Matrigel放置于4℃过夜缓慢融化。接种细胞当天，消化贴壁细胞，此时细胞密度达到70％左右，用无菌PBS将细胞重悬并计数，调整细胞密度为1×10⁶个/mL，将该细胞悬液与Matrigel按1:1的体积比混匀，吸入一毫升注射器内备用。

3.接种肿瘤细胞(小鼠乳腺癌4T1细胞系)，以远端进针的方式将100μL注射混合液(上一步)注射到小鼠第四乳腺脂肪垫。

4.接种后持续观察小鼠的肿瘤生长情况。待肿瘤长出后，每周两次测量肿瘤的大小和测量小鼠体重，并及时记录。

三、相关巨噬细胞TAM的磁珠分选

1.断颈处死小鼠，用游标卡尺量瘤体直径，并记录。

2.小鼠外周用75％酒精浸润后，同冰盒移至超净台，取瘤体，称重记录。

3.同时取脾脏，置于15mL离心管(内含PBS 2mL)备用。

4.在60mm培养皿中剪磨肿瘤组织5-8分钟，注意冰上操作。

5.将0.005g胶原酶I溶于15mL T细胞缓冲液(PBS中加入0.5％的BSA，终浓度2mM的EDTA，调节PH至7.2，过0.22μm滤膜除菌)，将剪碎的组织至于其中消化，消化在37℃摇床内进行，速度为190rpm，30分钟。

6.将消化得到的组织液过40μm无菌滤网，将流出液在4℃条件下离心5分钟，转速为400g。

7.弃掉上清，用5mL T细胞缓冲液(含有DNA酶)重悬，37℃孵育15分钟后离心，条件与上一步相同。

8.弃掉上清，用5mL ACK溶液重悬，室温静置5分钟，裂解红细胞，加10mL T细胞缓冲液终止裂解，同样条件再次离心。

9.弃掉上清，使用500μL MACS缓冲液(向无菌HBSS中加入10％的胎牛血清，调节PH至7.2，过0.22μm滤膜除菌)重悬，过滤网(MACSPre-separation Filters),滤网先使用500μL MACS缓冲液润洗，样本加入后再加2-3次500μL MACS缓冲液冲洗。

10.对得到的细胞悬液计数，在4℃条件下离心10分钟，转速为400g。

11.使用一定量的MACS缓冲液重悬细胞，细胞浓度为每90μL1×10⁷个细胞。

12.每90μL细胞悬液加入10μL的CD11b磁珠，4℃避光孵育15分钟。

13.放置磁珠分选设备，预先使用3mL MACS缓冲液润洗LS柱(购自美天旎公司)。然后加入上一步孵育好的细胞样品，待流出液流出珠子后，连续三次使用3mL MACS缓冲液冲洗柱子，收集流出液，此为未标记细胞。

14.取下柱子，置于15mL离心管上，加入5mL MACS缓冲液，快速冲下细胞。

15.离心，重悬后做流式细胞分析和培养。

四、结果

将Balb/C六到八周龄雌鼠放入SPF级动物房培养，适应环境一周之后准备接种乳腺肿瘤。培养小鼠乳腺癌4T1细胞系至对数生长期，消化成单个细胞状态，计数1*10⁶个重悬于100微升的PBS中(一只小鼠接种量)，在无菌条件下接种到小鼠的第四对乳腺脂肪垫上。饲养过程中观察小鼠身体状态及肿瘤生长情况，接种一周后可以明显看到乳腺成瘤。接种三周后，瘤体直径达到10mm左右，且小鼠生长状态良好，处死小鼠取出肿瘤组织。

将肿瘤组织依次经过剪碎、消化、裂红细胞及滤网过滤后，使用美天旎公司免疫磁珠(CD11b标记)进行细胞分选，得到的分选细胞可以进行培养、FACS检测和RNA提取等后续实验。

FACS检测分选细胞纯度和活细胞比例可以看到，TAM和脾脏巨噬细胞(SpleenMacrophages，SM)的细胞纯度和活细胞比例都在百分之九十以上(图1A和图1B)。CD11b阳性群代表细胞纯度，7AAD阴性群代表活细胞比例，证明细胞分选成功。

实施例2：肿瘤相关巨噬细胞的转录组和microRNA测序及联合分析

将实施例1得到的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和脾脏巨噬细胞(SM)提取RNA后，进行RNA质检，质检合格后安排测序，选取的测序平台为illumina Hiseq2500。

microRNA每样品测序数据量为20M(表1)，转录组mRNA每样品测序数据量为10G。对于microRNA和转录组得到的测序数据，分别计算读取上每个位置碱基测序质量的平均质量，以及计算每条读取的平均质量值，并统计相应质量值的读取数，通过累计分布曲线看数据的平均质量分布，得到质量分布图。

microRNA的q30％(测序质量值30以上的碱基占的百分比)符合预期，转录组测序读取序列用tophat软件与小鼠的基因组参照序列进行比对，总体匹配率较高在90％左右，达到分析标准。

表1.microRNA测序产生数据量

根据比对结果计算基因的表达量，转录组基因表达量用FPKM(fragment perkilobase of transcript per million fragments mapped)值表示。对于microRNA测序产生的原始数据进行去除低质量接头的序列后，得到高质量的数据(包括每个样品得到的原始读取数目和高质量读取数目)，然后对文库中的高质量读长序列进行统计去重复，重复序列保留一条并统计其重复次数，并将去重复后的长度在18-30范围内的读长序列与小鼠miRbase的数据库进行比对，得到microRNA的表达谱。数据库比对和序列分类结果显示，60％测到的高质量读取都是microRNA(表2)，数据库比对不到的读取我们用于去做未知microRNA的预测，共得到72个新的候选microRNA基因。

表2.数据库microRNA比对、分类

为了更准确的预测两种细胞中差异microRNA的靶基因，我们选取了三个microRNA的靶基因预测软件或数据库：miRanda、TargetScan和PITA。然后以筛选出来的差异mRNA和差异miRNA预测得到的靶基因取交集，得到550个基因的上调和301个基因的下调。

将两组组间筛选出的差异基因基于KEGG数据库进行通路(pathway)注释，得到基因参与的所有通路术语(Pathway Term)，采用超几何分布检验计算每个通路的显著性水平，从而筛选出差异基因富集的显著性通路术语，其中P-值小于0.05。共得到60个显著性上调的通路术语和37个显著下调的通路术语，分别取两组数据的富集程度排名前八位的。其中我们发现，选取的通路术语基本都集中于炎症通路、免疫通路和代谢通路，说明两种细胞在这方面确实有很大的异同。

肿瘤相关巨噬细胞相比于传统意义上的巨噬细胞，最大的特点就是免疫抑制，因此我们推测，一些在肿瘤相关巨噬细胞中高表达的microRNA很有可能通过作用于其对应的靶基因，下调一些促炎性因子的蛋白水平表达，进而抑制细胞本身的炎症通路。

在肿瘤相关巨噬细胞中TPM(transcripts per million)超过5000的高丰度microRNA数量仅占所有已知microRNA数量总和的1.6％，但其测序得到读取数总和占所有已知microRNA测序读取数总和的78.8％，说明肿瘤相关巨噬细胞中只有一小部分高丰富表达的microRNA占据了细胞内microRNA的主体。

这些数据在一定程度上说明，对于巨噬细胞这样具有典型免疫功能的细胞，一定会有一群功能性相关的高表达microRNA，它们通过靶向抑制的靶基因表达，形成一个复杂的调控网络，在巨噬细胞的表型和功能调控过程中发挥非常重要的作用。我们在肿瘤相关巨噬细胞中挑选表达量高于脾脏巨噬细胞的且TPM超过5000的microRNA，测序信息列在表3，并计划进行进一步的研究。

表3.在肿瘤相关巨噬细胞中高表达且TPM大于5000的micro RNA列表

对于上一步筛选出的候选microRNA，它们都具有以下共同特点：

1)在肿瘤相关巨噬细胞表达水平高；2)在TAM和SM中差异水平比较大；3)有关肿瘤相关巨噬细胞的报道较少或者没有报道。

实施例3.miR-100在肿瘤相关巨噬细胞中高表达

接下来在体外进行肿瘤上清培养和肿瘤细胞共培养两种不同的诱导方法：

肿瘤上清培养试验组：收集4T1肿瘤细胞的培养上清液，按照1:2的比例与新鲜培养基混合，作为条件培养基，用于培养RAW264.7细胞。肿瘤细胞共培养实验组：将RAW264.7细胞与4T1细胞共培养，使用transwell小室。对照组：仅小鼠单核细胞RAW264.7。

两种方法诱导小鼠单核细胞RAW264.7细胞，使之具有肿瘤相关巨噬细胞的表型。RT-PCR检测两种诱导细胞中，Arg1的表达都明显上调(图2)。对候选的八个TAM中高表达microRNA在两种诱导细胞中再次进行qPCR验证(图3、图4)。根据验证结果，大部分候选microRNA在体外诱导的肿瘤相关巨噬细胞中都出现上调的表达趋势，其中miR-100的上调最为明显和稳定。

综合以上结果，认定miR-100呈现TAM相关的高表达趋势，其有可能对巨噬细胞表型和功能有重要的调控作用，因此选择miR-100作为后续研究对象。

实施例4.miR-100促进巨噬细胞向M2型极化并维持TAM表型

经公司订购合成了miR-100的模拟物(与miR-100成熟体一致的合成RNA，商品名为mimic，购自广州锐博生物公司)，将其分别转染到体外小鼠单核细胞系RAW264.7和原代腹腔巨噬细胞中，qPCR验证实验过表达miR-100成功，同时检测两种细胞中几个巨噬细胞M2型表型基因的表达。图5A和5B显示，Arg1、Fizz1、Ym1、IL-6、IL-10和CD206这六个M2型表型标记物的mRNA水平均有不同程度的上调，说明miR-100有促进巨噬细胞向M2型分化的作用趋势。

CD206是肿瘤相关巨噬细胞的重要标志物，其在肿瘤组织内的表达和肿瘤的发展有很明确的相关性。为了探究miR-100在体内细胞中是否可以通过影响CD206的表达维持肿瘤相关巨噬细胞的表型，分离了小鼠腹腔原代巨噬细胞。

在腹腔巨噬细胞转染miR-100模拟物后，流式细胞术检测CD206阳性细胞群的比例变化。结果显示，过表达miR-100后，CD206和F4/80双阳性细胞群比例显著上调近一倍(图6A)。与此同时，使用4T1肿瘤细胞上清液处理腹腔巨噬细胞，使之具有肿瘤相关巨噬细胞的表型，CD206mRNA表达明显上调，当使用miR-100抑制剂(与miR-100成熟体反向互补，商品名为microRNAinhibitor，购自广州锐博生物公司)转染腹腔巨噬细胞中敲低了miR-100的表达后(图6B)，CD206被4T1肿瘤细胞上清液的上调趋势被明显缓解(图6C)。以上结果证实，miR-100可以促进巨噬细胞向M2型分化，并维持肿瘤相关巨噬细胞表型。

实施例5.敲低miR-100可以明显抑制小鼠乳腺肿瘤的肺转移

一、敲低miR-100的水平

首先构建小鼠的乳腺肿瘤模型，向小鼠乳腺接种酶标记的4T1肿瘤细胞。接种肿瘤细胞7天后，可以明显观测到乳腺部位的肿瘤形成，大概瘤径为2毫米，同时开始在瘤内注射miR-100antagomir(miR-100拮抗剂)(由胆固醇修饰的一段竞争性抑制miR-100的RNA序列。miR-100antagomir是胆固醇修饰的miR-100inhibitor，可以稳定在体内转染细胞，购自广州锐博生物公司)，可以在体内高效进入肿瘤组织内的细胞，无需借助转染试剂等辅助方法，大大降低了动物实验的外源毒性。

对照组小鼠注射阴性对照序列；从接种肿瘤细胞第七天开始，每周两次向瘤内注射miR-100antagomir，注射剂量根据肿瘤体积情况递增，由最开始的每只5nM逐渐增加到每只15nM，并在每个时间点记录小鼠重量和肿瘤长、短直径；在肿瘤接种28天时，进行肿瘤活体成像，判断肿瘤发展以及比较肿瘤转移灶情况，随后处死小鼠，进行一系列指标检测。

在接种肿瘤前，依据体重情况将所有小鼠均一配分到两个组中，保证组间无客观差异。在实验过程中，比较了两组小鼠的体重变化情况，两组小鼠之间并无明显体重差异，证明小鼠的身体整体体征基本相同(图7)。在处死小鼠后，使用免疫磁珠分选出肿瘤组织中的肿瘤相关巨噬细胞，通过qPCR检测miR-100的表达后，证明miR-100的敲低成功(图8)。

二、明显抑制乳腺癌肺转移，但不影响原位肿瘤生长

在接种肿瘤28天后，对两组小鼠进行了活体成像观察，接种的肿瘤细胞是荧光素酶标记的，将其底物(根据体重换算剂量)注射到小鼠腹腔内。小鼠在气体麻醉环境下十分钟后，进行活体信号采集。

图9A显示，两组小鼠的原位肿瘤大小及信号强度上并没有明显差异。处死小鼠后，我们取下原位肿瘤组织，进行称重，实验组小鼠的原位肿瘤重量虽然略低于对照组，但是并无显著性差异(图9B)。同时，我们将连续测量几个时间点的小鼠瘤径进行肿瘤体积换算后，重新比对两组的数据，也没有发现明显的区别(图9C)。以上数据说明，实验组小鼠在敲低miR-100后，乳腺原位肿瘤的生长情况并未有明显的改善。

继续查看实验组和对照组小鼠的肿瘤肺转移情况。如图10A，分别取下两组小鼠的肺组织进行称重，然后与每只小鼠的体重相除得到比值，发现实验组小鼠的肺部重量与体重比值低于对照组。

同时，对肺组织进行苏木素伊红染色(图10B)和计数肺部组织表面肿瘤转移结节数(图10C)后，确认实验组小鼠的乳腺肿瘤肺部转移情况明显减少，肺组织表面结节数降低明显。此结果说明，实验组小鼠在敲低miR-100后，乳腺肿瘤肺转移受到抑制。

小结：

通过对比肿瘤相关巨噬细胞和脾脏巨噬细胞的转录组测序和microRNA测序结果，发现两种细胞有较大转录信息差异。其中，miR-100无论在体内还是体外诱导的肿瘤相关巨噬细胞，都具有较高的表达，并且miR-100在体外可以促进巨噬细胞的M2型极化。

在小鼠乳腺肿瘤模型中，敲低肿瘤相关巨噬细胞中的miR-100表达可以抑制肿瘤相关巨噬细胞的表型，减少其分泌到肿瘤微环境中的IL-1ra，虽然不显著影响肿瘤的原位生长，但可以有效的抑制乳腺肿瘤的肺转移。

Claims (3)

1.miR-100-5p的互补序列在制备药物中的用途，其中：

所述药物用于降低乳腺癌的转移，

所述转移选自：肝转移、脑转移、淋巴结转移和肺转移。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述miR-100-5p的互补序列是胆固醇修饰的miR-100-5p的互补序列。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述miR-100-5p的互补序列是miR-100antagomir。