CN114794016B - 一种构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法 - Google Patents
一种构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，所述方法通过基因编辑技术将小鼠Lhpp基因敲除后构建成模型，所述模型为Lhpp基因敲除小鼠，所述Lhpp基因敲除是将小鼠通过双gRNA在Lhpp的基因两端进行切割后制备Lhpp敲除的小鼠。本发明在Lhpp基因敲除小鼠构建成功的基础上发现Lhpp基因敲除可以导致小鼠肠道菌群紊乱，最终导致小鼠抗肿瘤免疫能力减弱，并且通过多种方法证实Lhpp基因敲除小鼠会导致小鼠肠道上皮结构紊乱，定植细菌分布改变，最终影响了细胞毒性T细胞的肿瘤浸润，抑制机体的抗肿瘤免疫能力。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种Lhpp基因敲除小鼠用于构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力降低的模型。
背景技术
目前大多数的肿瘤临床治疗措施较为局限，放化疗作为一线治疗措施，在治疗过程中产生严重的副作用，且大多数患者最终会产生耐药，导致治疗无效。新兴的治疗方法，包括免疫疗法可使肿瘤患者部分获益。在临床上肿瘤患者一旦对免疫检查点抑制剂产生响应，效果通常可持续相当长时间，能较好的控制病情。尽管免疫检查点阻断疗法被应用于治疗多种肿瘤，但是临床上仅有20％左右的肿瘤患者能够对免疫疗法产生响应，部分在免疫治疗初期有效的患者最终也会发生免疫治疗耐药。
针对临床免疫治疗面临的挑战，大量的研究聚焦于寻找能够预测肿瘤免疫治疗响应率和有效率的指标，如肿瘤基因突变负荷(TMB)、微卫星不稳定(MSI)和错配修复基因缺陷 (dMMR)等。最近的研究开发了肿瘤免疫功能障碍和排斥(TIDE)评分系统，替代单一的生物标记物可有效预测免疫检查点抑制剂的治疗效果。另外的研究聚焦于发现新的免疫检查点分子，以提高临床治疗的有效率，如陈列平教授课题组构建人类基因高通量功能筛选系统 (TCAA)，在体外识别调节T细胞活性的细胞表面分子，发现Siglec-15可持续地抑制T 细胞活性，使用抗体封闭Siglec-15蛋白能够调节机体免疫细胞的激活水平。其他研究人员也证实肿瘤细胞表明的免疫检查点分子CD47能够与巨噬细胞表面的SIRP-α结合，激活巨噬细胞中酪氨酸磷酸化酶的活性，从而抑制肌球蛋白的聚集，向巨噬细胞释放“别吃我”信号，最终逃避免疫系统的识别和清除。
与此同时，另一类研究则聚焦于探索肿瘤对免疫治疗无应答及肿瘤对免疫治疗耐药的具体机制和应对措施。如研究发现肿瘤细胞可通过建立免疫抑制性肿瘤微环境，诱导T细胞功能异常，导致IFNγ+CD8+T细胞进入肿瘤组织之后不能识别并杀伤肿瘤细胞。此外，研究表明肿瘤能够通过多种复杂机制上调PD-L1等分子的水平，从而诱导T细胞凋亡，抑制抗肿瘤免疫。
健康成人的胃肠道中，大约含有1011–1012个细菌，与人体细胞数目接近，这些细菌统称为肠道微生物群或肠道菌群。随着测序技术的不断更新，人们对健康和患病状态下个体之间的细菌组成，肠道菌群和宿主个体之间的相互作用有了深入的了解。无菌动物的应用进一步证实肠道菌群可显著影响宿主的多种生物学行为，包括新陈代谢、器官发育、炎症、肿瘤和免疫反应等。宿主-肠道菌群相互作用可以形成对人体健康有益的“智能通讯系统”。肠道菌群的生物活性代谢物，如短链脂肪酸、共轭脂肪酸、胞外多糖和神经活性代谢物，如γ -氨基丁酸(GABA)和血清素，可为宿主带来健康益处。
肠道菌群移植与肿瘤免疫治疗协同提高免疫治疗应答率。将对免疫检查点抑制剂有响应的癌症患者的肠道菌群移植(FMT)到无菌小鼠体内能够提高PD-1抑制剂的抗肿瘤作用，而对免疫检查点抑制剂无反应患者的肠道菌群移植未产生显著影响。肿瘤免疫治疗发生耐药之后，使用肠道菌群移植能够逆转患者的耐药状态，从而提高免疫治疗效果。一项包含10名对抗PD-1治疗产生耐药的难治性转移性黑色素瘤患者的1期临床试验显示，患者进行FMT 后继续进行抗PD-1免疫治疗，最终观察到3名患者重新对抗PD-1免疫治疗产生响应，包括2例部分响应和1例完全响应。另外，与无菌小鼠相比，在SPF小鼠中定植的肠道菌群可提高肠道固有层中表达干扰素γ(IFNγ)的CD8+T细胞的数量。
总的来说，肿瘤是严重威胁人类健康的疾病。新兴的治疗方法，如免疫疗法等可使肿瘤患者部分获益，但是临床上仅有20％左右的癌症患者对免疫疗法产生响应，部分在免疫治疗初期有效的患者最终会产生耐药。然而目前关于肠道菌群失调与免疫抑制的实验动物模型构建具有较大的不确定性，并且不具有标准化生产的潜力，因此构建标准化的肠道菌群失调与免疫抑制的实验动物模型成为研究肿瘤免疫治疗响应率以及肿瘤免疫治疗耐药的重要工具。
发明内容
为解决上述问题，本发明的首要目的在于提供一种构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，该方法能够为肠道菌群及抗肿瘤研究提供一个稳定的并且可重复的模型和工具，加快探索肿瘤免疫治疗响应率低及肿瘤免疫治疗耐药的机制研究进程。
本发明的另一目的在于提供一种构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，该方法有助于明确肿瘤免疫抑制的相关分子机制，为临床改善肿瘤免疫治疗耐药提供新的策略和靶点，有助于通过联合使用多靶点药物有助于改善肿瘤免疫治疗患者的治疗效果。
本发明的再一目的在于提供一种构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，该方法能够阐明肠道菌群与肿瘤免疫治疗响应率低及肿瘤免疫治疗耐药的相关性和因果关系，能够有助于活菌药物的开发，丰富和扩展肿瘤的治疗药物，提升患者生存率。
本发明的又一目的在于提供一种构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，该方法肠道菌群能够与机体相适应，调节多种生理过程，降低肿瘤治疗发生的副作用，提升患者的生存质量。但是目前的研究模型较为欠缺，急需扩展实验动物模型的范围和种类。解决该问题有助于加快肿瘤免疫治疗相关研究的速度，为肿瘤免疫治疗提供更加安全有效的策略和潜在药物。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下。
一种构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，所述方法通过基因编辑技术将小鼠Lhpp基因敲除后构建成模型，所述模型为Lhpp基因敲除小鼠，所述Lhpp基因敲除是将小鼠通过双gRNA在Lhpp的基因两端进行切割后制备Lhpp敲除的小鼠；获取所述小鼠的肠道组织或者在所述小鼠的皮下接种肿瘤细胞，对肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力进行研究。
所述Lhpp基因敲除小鼠包括有WT小鼠(Lhpp+/+)，杂合子小鼠(Lhpp+/-)及纯合子Lhpp-/-小鼠，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳对小鼠基因型进行鉴定，筛选出纯合子Lhpp-/-小鼠。使用PCR实验和琼脂糖凝胶电泳实验对WT小鼠(Lhpp+/+)，杂合子小鼠(Lhpp+/-)，纯合子小鼠(Lhpp-/-)的基因型进行鉴定。Lhpp+/+小鼠产物为496bp，Lhpp-/-小鼠产物为403bp，Lhpp+/-小鼠产生两个不同长度的产物。使用蛋白印迹实验检测Lhpp-/-小鼠的结肠，心脏，肝脏和肺组织中Lhpp的表达水平，表明Lhpp-/-小鼠构建成功。
获取Lhpp-/-小鼠和WT小鼠的肠道组织，待清除肠道内容物后，初步观察肠道组织的变化。
进一步通过HE染色观察小鼠肠道组织的形态学变化。获取WT和Lhpp-/-小鼠的肠道组织使用多聚甲醛固定，经过脱水、浸蜡等过程后，制备小鼠肠道组织石蜡块。切片经复水后行HE染色。在显微镜下观察小鼠肠道上皮形态学变化。统计每张切片的肠粘膜隐窝数目和肠道上皮厚度。
收集各组小鼠肠道组织，使用免疫组化方法检测黏蛋白Muc2表达，以观察肠道隐窝的形态。与对照组小鼠相比，Lhpp-/-小鼠肠道上皮中Muc2的表达的综合评分没有显著改变。此外肠道上皮形态发生较大的改变，表现为隐窝数目减少，长度显著变短。通过免疫组化染色观察小鼠肠道组织特异性蛋白的表达。如上所述制备小鼠肠道组织石蜡块和切片之后，采用免疫组化试剂盒检测肠道组织中Muc2、K14和Claudin1等蛋白的含量，初步检测小鼠肠道上皮形态改变的分子机制。
收集各组小鼠肠道组织进行蛋白质组学检测。Lhpp-/-小鼠肠道蛋白质含量发生显著变化。通过聚类分析各组样本的基因表达模式，通过进行KEGG注释分类，KEGG富集分析和GO富集分析，获得两组小鼠肠道组织中差异蛋白质(表)。随后使用PPI分析对差异蛋白质进行相互作用分析。
将小鼠置于高温高压灭菌处理的锡箔纸，收集小鼠的粪便，放入粪便菌群检测保存液中。提取细菌核酸样本，质检后进行16S测序。分析各组样本间肠道菌群分布的改变以及显著改变的差异细菌。具体地说，收集各组小鼠的粪便，进行16S测序，质检合格后分析各组小鼠的肠道菌群分布情况。生物信息分析显示有88类细菌仅存在于WT小鼠中，58类细菌仅存在于Lhpp-/-小鼠中。尽管两组细菌的微生物群落丰富度、多样性以及均匀度没有显著变化，但是相似性分析表明两组小鼠的肠道菌群分布发生显著变化。物种差异分析表明，在Lhpp-/-小鼠中，螺旋杆菌属(Turicibacter)、副苏特雷拉菌属(Parasutterella)和文肯菌属 (Rikenella)等细菌的丰度显著降低，而弯曲杆菌属(Campylobacteria)、鼠尾草菌属(Muribaculum)和产氧光合细菌属(Oxyphotobacteria)等细菌的丰度显著升高。另外分析了两组动物肠道菌群的物种之间的进化关系以及不同样本的物种分布丰度和最高分布样本。
进一步，构建Villin-Cre LhppLoxp/Loxp小鼠，如上所述对小鼠肠道组织进行HE染色和免疫组化检测Muc2等蛋白的含量。
通过蛋白印迹和qPCR等方法检测Lhpp敲除效率。获取WT和Lhpp-/-小鼠的肠道组织，使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA试剂提取组织蛋白；使用Trizol试剂提取小鼠组织蛋总RNA。通过蛋白电泳和qPCR等方法检测Lhpp的表达水平。
通过蛋白质组学检测Lhpp-/-小鼠肠道组织的基因表达谱并进行验证。收集小鼠肠道组织并提取蛋白质，进行蛋白组学检测。通过生物信息学分析差异表达的基因，并寻找Lhpp的下游通路。采用蛋白印迹实验对差异表达的基因进行验证。
收集各组小鼠新鲜的结肠组织，通过酶解法分离为单细胞后，采用荧光素耦连的抗体检测小鼠肠道内IFNγ+CD8+T细胞的比例。分析副苏特雷拉菌和IFNγ+CD8+T细胞比例，评估二者之间的关系。
收集WT小鼠的肠道粪便，通过过滤离心等步骤提取小鼠肠道菌群，将肠道菌群移植入 Lhpp-/-小鼠肠道内，7天后，如上所述检测小鼠肠道内IFNγ+CD8+T细胞的比例。分析副苏特雷拉菌和IFNγ+CD8+T细胞比例，评估二者的关系。
皮下移植瘤观察Lhpp敲除后肿瘤生长加速。在Lhpp-/-小鼠皮下接种1×106个肿瘤细胞，从第五天开始检测皮下肿瘤结节的长短径以观察肿瘤细胞体内生长速度。WT小鼠接种同等数量的肿瘤细胞作为对照组。当肿瘤组织生长至1.5cm时，处死所有的小鼠并剥离皮下肿瘤组织，测量肿瘤结节的体积进行统计分析。
进一步，观察Lhpp敲除后，肿瘤组织中IFNγ+CD8+T细胞浸润程度。获取各组小鼠皮下肿瘤组织，通过酶解法获取单细胞悬液，采用荧光素耦连的抗体共同孵育，通过流式细胞术检测IFN+CD8+T细胞的比例。
进一步，验证肠道菌群移植减弱Lhpp-/-小鼠体内肿瘤的生长速度。在各组小鼠皮下接种肿瘤细胞前或接种后，将WT小鼠的肠道菌群移植进入Lhpp-/-小鼠中，随后继续观察小鼠皮下肿瘤生长情况。小鼠分组如下：WT组；WT+FMT组；Lhpp-/-小鼠组；Lhpp-/-小鼠+FMT组。
验证肠道特异性Lhpp敲除促进肿瘤细胞增殖。获取③中各组小鼠皮下肿瘤组织，通过酶解法获取单细胞悬液。随后与荧光素耦连的抗体共同孵育，通过流式细胞术检测IFN+
CD8+T细胞的比例。
在小鼠皮下接种肿瘤细胞前或者接种后，将WT小鼠的肠道菌群移植入Villin-CreLhppLoxp/Loxp小鼠中，随后观察小鼠皮下肿瘤生长情况。小鼠分组如下：WT组；WT+FMT 组；Villin-Cre LhppLoxp/Loxp小鼠组；Villin-Cre LhppLoxp/Loxp小鼠+FMT组。
获取各组小鼠的粪便样本和血液样本后，使用犬尿酸ELISA检测试剂盒检测样本中犬尿酸含量。与对照组小鼠样本相比，在Lhpp-/-小鼠粪便和血清样本中，犬尿酸含量显著升高。将犬尿酸的含量与副苏特雷拉菌丰度进行相关性分析，证实二者呈现负相关。
通过gRNA在Lhpp的2号外显子两端分别插入LoxP位点，获取纯合子之后 (LhppLoxP /LoxP)，随后与Vill-Cre小鼠杂交，诱导两个LoxP位点中间的片段丢失，构建 Villin-CreLhppLoxP/LoxP小鼠。WT小鼠(LhppWT/WT)，杂合子小鼠(LhppWT/LoxP)，纯合子小鼠(LhppLoxP/LoxP)的基因型不同。使用引物对小鼠基因型进行PCR检测，LhppWT/WT小鼠产物为274bp，Lhpp-/-小鼠产物为354bp，LhppWT/LoxP小鼠产生两个不同长度的产物。小鼠杂交前鉴定结果表明小鼠基因型为LhppLoxP/LoxP纯合子，Vill-Cre阳性，两者进行杂交可获得肠道上皮特异性的Lhpp敲除小鼠。杂交完成后，通过对肠道组织的DNA进行PCR检测，产物为217bp，初步表明成功构建Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠。进一步通过蛋白印迹结果证实，小鼠的结肠组织中Lhpp表达缺失，其他组织如心脏，肝脏和肺组织中Lhpp仍然表达，证实Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠构建成功。
检测WT小鼠和Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠各组样本中犬尿酸含量。与对照组小鼠样本相比，在肠道特异性Lhpp敲除小鼠粪便和血清样本中，犬尿酸含量显著升高。
本发明所述构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，在WT小鼠和Lhpp-/-小鼠皮下分别接种小鼠肺癌Lewis肿瘤细胞，小鼠肝癌Hepa 1-6细胞和小鼠结直肠癌MC38细胞。随后观察三种小鼠肿瘤细胞在各组小鼠皮下生长的速度，使用游标卡尺动态监测皮下肿瘤结节的长径和短径。3种不同器官来源的肿瘤细胞在Lhpp-/-小鼠中的生长速度均显著提高。
收集小鼠皮下肿瘤组织，通过酶解法单细胞悬液。采用荧光素耦连的抗体检测肿瘤组织中IFNγ+CD8+T细胞的比例，在CD3阳性的细胞群中进行分析。与WT小鼠相比，接种至Lhpp-/-小鼠皮下的肿瘤组织中，IFNγ+CD8+T细胞的比例显著降低。使用流式细胞术检测Lhpp-/-小鼠骨髓细胞总数目，发现两组小鼠并没有显著差异。进一步检测结果显示Lhpp-/-小鼠骨髓中单核细胞、T细胞、B细胞和造血干细胞等数目与WT小鼠无显著差异。
收集Lhpp-/-小鼠的结肠组织，经酶解法制备单细胞悬液，采用荧光素耦连的抗体检测组织中IFNγ+CD8+T细胞的比例。Lhpp-/-小鼠结肠组织中，IFNγ+CD8+T细胞的比例显著降低。
在Lhpp-/-小鼠皮下接种肿瘤细胞前一周，将WT小鼠肠道菌群移植入Lhpp-/-小鼠肠道内，隔日移植，总共移植3次。同样处理的WT小鼠作为对照。接种肿瘤细胞后，继续如上实施肠道菌群移植，观察皮下肿瘤的生长情况。与WT小鼠相比，WT小鼠+FMT组的肿瘤生长速度没有显著差异；Lhpp-/-小鼠中的肿瘤生长速度显著加快。与Lhpp-/-小鼠相比，Lhpp-/-小鼠+FMT组的肿瘤生长速度显著降低。
在WT小鼠和Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠皮下分别接种小鼠肺癌Lewis肿瘤细胞后，观察到小鼠的肿瘤细胞在Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠中的生长速度显著提高。对各组小鼠皮下肿瘤的生长曲线数据进行均一化之后，发现尽管Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠皮下肿瘤的增殖速度显著高于对照组小鼠，但是与Lhpp-/-小鼠相比，其皮下肿瘤生长速度减弱。这可能是因为小鼠全身性敲除Lhpp基因后机体其他方面的功能可能受到影响，比如血管生成、成纤维细胞的活性和巨噬细胞的极化等。进一步检测证实在Villin-CreLhppLoxP /LoxP小鼠肠道组织和皮下肿瘤组织中的IFNγ+CD8+T细胞的比例显著降低。
本发明所实现的构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法。该方法构建的模型可重复性较高，能够标准化规模化产生。该方法的建立具有下列优点：
(1)有助于加快探索肿瘤免疫治疗响应率低及肿瘤免疫治疗耐药的机制研究进程。
(2)有助于通过联合使用多靶点药物有助于改善肿瘤免疫治疗患者的治疗效果，提升患者的生存质量，促进群众卫生健康水平的发展。
(3)有助于活菌药物的开发，丰富和扩展肿瘤的治疗药物，提升患者整体的生存率。
(4)有助于加快肿瘤免疫治疗相关研究的速度，为肿瘤免疫治疗提供更加安全有效的策略和潜在药物。
附图说明
图1是本发明Lhpp基因敲除小鼠构建流程示意图。
图2是本发明Lhpp基因敲除小鼠基因型鉴定图。
图3是本发明Lhpp基因敲除小鼠蛋白印迹鉴定图。
图4是本发明免疫组化法检测黏蛋白Muc2表达示意图。
图5是本发明Lhpp-/-小鼠肠道上皮形态发生显著改变示意图。
图6是本发明Lhpp-/-小鼠肠道上皮中Muc2的表达的综合评分图。
图7是本发明Lhpp-/-小鼠肠道多种蛋白质含量发生显著变化示意图。
图8是本发明通过聚类分析各组样本的蛋白质表达模式示意图。
图9是本发明对差异蛋白进行KEGG富集分析图。
图10是本发明对差异蛋白进行通路富集分析图。
图11是本发明对差异蛋白进行GO富集分析图。
图12是本发明使用PPI分析对差异蛋白质进行相互作用分析图。
图13是本发明各组小鼠粪便进行16S测序核酸质检情况示意图。
图14是本发明生物信息分析WT小鼠和Lhpp-/-小鼠粪便中丰度显著改变的细菌示意图。
图15是本发明两组动物肠道粪便样本中细菌的微生物群落丰富度、多样性以及均匀度分析示意图。
图16是本发明两组动物肠道粪便样本中细菌的ANOSIM相似性分析图。
图17是本发明两组动物肠道粪便样本中细菌的PCA相似性分析图。
图18是本发明两组动物肠道粪便样本中细菌的PCoA相似性分析图。
图19是本发明两组动物肠道粪便样本中细菌的NMDS相似性分析图。
图20是本发明两组动物肠道粪便样本中差异细菌物种列表图。
图21是本发明两组动物肠道粪便样本中菌群物种之间的进化关系示意图。
图22是本发明预测两组动物肠道粪便样本中的代谢通路图。
图23是本发明两组动物肠道粪便样本中犬尿酸含量示意图。
图24是本发明两组动物肠道粪便样本中犬尿酸的含量与副苏特雷拉菌丰度的相关性分析图。
图25是本发明Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠的构建示意图。
图26是本发明LhppLoxP/LoxP小鼠和Cre基因型小鼠PCR进行鉴定示意图。
图27是本发明LhppLoxP/LoxP小鼠纯合子小鼠筛选鉴定示意图。
图28是本发明Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠的PCR产物鉴定示意图。
图29是本发明Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠的蛋白印迹鉴定示意图。
图30是本发明WT小鼠和Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠粪便样本中犬尿酸含量检测示意图。
图31是本发明小鼠肺癌Lewis肿瘤细胞在WT小鼠和Lhpp-/-小鼠皮下的生长速度检测示意图。
图32是本发明小鼠肝癌Hepa 1-6细胞在WT小鼠和Lhpp-/-小鼠皮下的生长速度检测示意图。
图33是本发明小鼠结直肠癌MC38细胞在WT小鼠和Lhpp-/-小鼠皮下的生长速度检测示意图。
图34是本发明流式细胞术检测WT小鼠和Lhpp-/-小鼠皮下肿瘤组织中IFNγ+CD8+T细胞的比例示意图。
图35是本发明流式细胞术检测WT小鼠和Lhpp-/-小鼠骨髓细胞总数目示意图。
图36是本发明流式细胞术检测WT小鼠和Lhpp-/-小鼠骨髓中单核细胞、T细胞、B细胞和造血干细胞等数目示意图。
图37是本发明流式细胞术检测WT小鼠和Lhpp-/-小鼠结肠组织中IFNγ+CD8+T细胞的比例的代表性图。
图38是本发明流式细胞术检测WT小鼠和Lhpp-/-小鼠结肠组织中IFNγ+CD8+T细胞的比例的统计结果示意图。
图39是本发明各组小鼠皮下肿瘤的生长曲线示意图。
图40是本发明各组小鼠皮下肿瘤的代表性图。
图41是本发明各组小鼠皮下肿瘤结节的体积统计结果示意图。
图42是本发明小鼠肺癌Lewis肿瘤细胞在WT小鼠和Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠皮下生长速度统计结果示意图。
图43是本发明各组小鼠皮下肿瘤生长曲线数据的均一化结果示意图。
图44是本发明各组小鼠皮下肿瘤体积数据的均一化结果示意图。
图45是本发明流式细胞术检测WT小鼠和Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠肠道组织中的IFNγ+CD8+T细胞的比例示意图。
图46是本发明流式细胞术检测WT小鼠和Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠皮下肿瘤组织中的IFNγ+CD8+T细胞的比例示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所实现的构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，所述方法通过基因编辑技术将小鼠Lhpp基因敲除后构建成模型，所述模型为Lhpp基因敲除小鼠，所述Lhpp基因敲除是将小鼠通过双gRNA在Lhpp的基因两端进行切割后制备Lhpp敲除的小鼠；获取所述小鼠的肠道组织或者在所述小鼠的皮下接种肿瘤细胞，对肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力进行研究。
所述Lhpp基因敲除小鼠包括有WT小鼠(Lhpp+/+)，杂合子小鼠(Lhpp+/-)及纯合子Lhpp-/-小鼠，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳对小鼠基因型进行鉴定，筛选出纯合子Lhpp-/-小鼠。使用PCR实验和琼脂糖凝胶电泳实验对WT小鼠(Lhpp+/+)，杂合子小鼠(Lhpp+/-)，纯合子小鼠(Lhpp-/-)的基因型进行鉴定。Lhpp+/+小鼠产物为496bp，Lhpp-/-小鼠产物为403bp，Lhpp+/-小鼠产生两个不同长度的产物。使用蛋白印迹实验检测Lhpp-/-小鼠的结肠，心脏，肝脏和肺组织中Lhpp的表达水平，表明Lhpp-/-小鼠构建成功。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
优点1：本发明首先开发了一种构建小鼠肠道菌群分布紊乱模型的方法。
该方法通过基因编辑技术将小鼠Lhpp基因敲除后构建成模型，Lhpp基因敲除小鼠是通过基因编辑技术将小鼠Lhpp基因敲除后构建而成。使用蛋白印迹实验检测Lhpp-/-小鼠的结肠，心脏，肝脏和肺组织中Lhpp的表达水平，表明Lhpp-/-小鼠构建成功。该方法技术成熟，可重复性较高，能够标准化规模化产生该实验动物模型。
收集各组小鼠肠道组织，使用免疫组化方法检测黏蛋白Muc2表达，以观察肠道隐窝的形态。与对照组小鼠相比，Lhpp-/-小鼠肠道上皮中Muc2的表达的综合评分没有显著改变。此外肠道上皮形态发生较大的改变，表现为隐窝数目减少，长度显著变短。该方法技术成熟，可重复性较高，能够标准化规模化产生该实验动物模型。
收集各组小鼠的粪便，进行16S测序，质检合格后分析各组小鼠的肠道菌群分布情况。生物信息分析显示有88类细菌仅存在于WT小鼠中，58类细菌仅存在于Lhpp-/-小鼠中。物种差异分析表明，在Lhpp-/-小鼠中，螺旋杆菌属(Turicibacter)、副苏特雷拉菌属(Parasutterella) 和文肯菌属(Rikenella)等细菌的丰度显著降低，而弯曲杆菌属(Campylobacteria)、鼠尾草菌属(Muribaculum)和产氧光合细菌属(Oxyphotobacteria)等细菌的丰度显著升高。该方法技术成熟，可重复性较高，能够标准化规模化产生该实验动物模型。
获取各组小鼠的粪便样本和血液样本后，使用犬尿酸ELISA检测试剂盒检测样本中犬尿酸含量。与对照组小鼠样本相比，在Lhpp-/-小鼠粪便和血清样本中，犬尿酸含量显著升高。将犬尿酸的含量与副苏特雷拉菌丰度进行相关性分析，证实二者呈现负相关。该方法可重复性较高，能够标准化规模化产生该实验动物模型。
通过gRNA在Lhpp的2号外显子两端分别插入LoxP位点，获取纯合子之后(LhppLoxP /LoxP)，随后与Vill-Cre小鼠杂交，诱导两个LoxP位点中间的片段丢失，构建Villin-CreLhppLoxP/LoxP小鼠。杂交完成后，通过蛋白印迹结果证实，小鼠的结肠组织中Lhpp表达缺失，其他组织如心脏，肝脏和肺组织中Lhpp仍然表达，证实Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠构建成功。该方法技术成熟，可重复性较高，能够标准化规模化产生该实验动物模型。
检测WT小鼠和Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠各组样本中犬尿酸含量。与对照组小鼠样本相比，在肠道特异性Lhpp敲除小鼠粪便和血清样本中，犬尿酸含量显著升高。该方法技术成熟，可重复性较高，能够标准化规模化产生该实验动物模型。
这些结果显示本发明可重复性较高，能够标准化规模化产生等优势。该模型的建立带来的好处是：
(1)有助于加快探索肠道菌群分布紊乱的机制研究。
(2)有助于通过联合使用多种制剂改善肠道菌群的分布，构建药物筛选平台，促进群众卫生健康水平的发展。
(3)有助于活菌药物的开发，丰富和扩展肠道菌群的应用潜力。
(4)有助于加快探索肠道菌群在机体各种疾病中的作用研究。
优点2：
本发明第二个目的是开发了一种构建小鼠抗肿瘤免疫能力失调模型的方法。
在WT小鼠和Lhpp-/-小鼠皮下分别接种小鼠肺癌Lewis肿瘤细胞，小鼠肝癌Hepa 1-6细胞和小鼠结直肠癌MC38细胞，结果证实3种不同器官来源的肿瘤细胞在Lhpp-/-小鼠中的生长速度均显著提高。该方法技术成熟，可重复性较高，能够标准化规模化产生该实验动物模型。
收集小鼠皮下肿瘤组织，通过酶解法单细胞悬液。采用荧光素耦连的抗体检测肿瘤组织中IFNγ+CD8+T细胞的比例，在CD3阳性的细胞群中进行分析。与WT小鼠相比，接种至Lhpp-/-小鼠皮下的肿瘤组织中，IFNγ+CD8+T细胞的比例显著降低。使用流式细胞术检测Lhpp-/-小鼠骨髓细胞总数目，发现两组小鼠并没有显著差异。进一步检测结果显示Lhpp-/-小鼠骨髓中单核细胞、T细胞、B细胞和造血干细胞等数目与WT小鼠无显著差异。该方法技术成熟，可重复性较高，能够标准化规模化产生该实验动物模型。
收集Lhpp-/-小鼠的结肠组织，经酶解法制备单细胞悬液，采用荧光素耦连的抗体检测组织中IFNγ+CD8+T细胞的比例。Lhpp-/-小鼠结肠组织中，IFNγ+CD8+T细胞的比例显著降低。该方法技术成熟，可重复性较高，能够标准化规模化产生该实验动物模型。
在Lhpp-/-小鼠皮下接种肿瘤细胞前一周，将WT小鼠肠道菌群移植入Lhpp-/-小鼠肠道内，隔日移植，总共移植3次。同样处理的WT小鼠作为对照。接种肿瘤细胞后，继续如上实施肠道菌群移植，观察皮下肿瘤的生长情况。与WT小鼠相比，WT小鼠+FMT组的肿瘤生长速度没有显著差异；Lhpp-/-小鼠中的肿瘤生长速度显著加快。与Lhpp-/-小鼠相比，Lhpp-/-小鼠+FMT 组的肿瘤生长速度显著降低。该方法技术成熟，可重复性较高，能够标准化规模化产生该实验动物模型。
在WT小鼠和Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠皮下分别接种小鼠肺癌Lewis肿瘤细胞后，观察到小鼠的肿瘤细胞在Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠中的生长速度显著提高。对各组小鼠皮下肿瘤的生长曲线数据进行均一化之后，发现尽管Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠皮下肿瘤的增殖速度显著高于对照组小鼠，但是与Lhpp-/-小鼠相比，其皮下肿瘤生长速度减弱。这可能是因为小鼠全身性敲除Lhpp基因后机体其他方面的功能可能受到影响，比如血管生成、成纤维细胞的活性和巨噬细胞的极化等。进一步检测证实在Villin-Cre LhppLoxP /LoxP小鼠肠道组织和皮下肿瘤组织中的IFNγ+CD8+T细胞的比例显著降低。该方法技术成熟，可重复性较高，能够标准化规模化产生该实验动物模型。
这些结果显示本发明可重复性较高，能够标准化规模化产生等优势。该模型的建立带来的好处是：
(1)有助于加快探索肿瘤免疫治疗响应率低及肿瘤免疫治疗耐药的机制研究进程。
(2)有助于通过联合使用多靶点药物有助于改善肿瘤免疫治疗患者的治疗效果，提升患者的生存质量，促进群众卫生健康水平的发展。
(3)有助于活菌药物的开发，丰富和扩展肿瘤的治疗药物，提升患者整体的5年生存率。
(4)有助于加快肿瘤免疫治疗相关研究的速度，为肿瘤免疫治疗提供更加安全有效的策略和潜在药物。
本发明的实验结果，结合附图说明如下：
图1为Lhpp基因敲除小鼠构建流程示意图。其中，所述Lhpp基因敲除小鼠是通过基因编辑技术将小鼠Lhpp基因敲除后构建而成。通过双gRNA在Lhpp的基因两端进行切割后制备 Lhpp敲除的小鼠。
图2为Lhpp基因敲除小鼠基因型鉴定。使用PCR实验和琼脂糖凝胶电泳实验对WT小鼠(Lhpp+/+)，杂合子小鼠(Lhpp+/-)，纯合子小鼠(Lhpp-/-)的基因型进行鉴定。Lhpp+/+小鼠产物为496bp，Lhpp-/-小鼠产物为403bp，Lhpp+/-小鼠产生两个不同长度的产物。
图3为Lhpp基因敲除小鼠蛋白印迹鉴定。使用蛋白印迹实验检测Lhpp-/-小鼠的结肠，心脏，肝脏和肺组织中Lhpp的表达水平，表明Lhpp-/-小鼠构建成功。
图4为免疫组化法检测黏蛋白Muc2表达。收集各组小鼠肠道组织，使用免疫组化方法检测黏蛋白Muc2表达，以观察肠道隐窝的形态。结果证实Muc2表达无显著差异，但是代表性图片结果表明肠道隐窝数目减少，长度显著变短。
图5为Lhpp-/-小鼠肠道上皮形态发生显著改变。肠道上皮厚度和肠道隐窝数目统计结果表明，Lhpp-/-小鼠隐窝数目减少，长度显著变短。
图6为Lhpp-/-小鼠肠道上皮中Muc2的表达的综合评分。与对照组小鼠相比，Lhpp-/-小鼠肠道上皮中Muc2的表达的综合评分没有显著改变。
图7为Lhpp-/-小鼠肠道多种蛋白质含量发生显著变化。收集各组小鼠肠道组织进行蛋白质组学检测。Lhpp-/-小鼠肠道蛋白质含量发生显著变化，其中上调978个蛋白，下调173个蛋白，图7中丰度变化显著的蛋白质列表如表1所示。
表1：丰度变化显著的蛋白质列表
图8为通过聚类分析各组样本的蛋白质表达模式。通过聚类分析各组样本的基因表达模式，通过进行KEGG注释分类。表明对照组样本与Lhpp-/-小鼠样本具有不同的蛋白分度。
图9为对差异蛋白进行KEGG富集分析。KEGG富集分析表明对照组样本与Lhpp-/-小鼠样本中差异蛋白主要集中在NOD样受体信号通路，Toll样受体信号通路和MAPK信号通路等。
图10是对差异蛋白进行通路富集分析。使用气泡图对差异蛋白进行通路富集分析同样证实NOD样受体信号通路，Toll样受体信号通路和MAPK信号通路等具有相关性。
图11是对差异蛋白进行GO富集分析。GO富集分析表明对照组样本与Lhpp-/-小鼠样本中差异蛋白主要与蛋白结合，细胞因子激活和炎症反应等生物学过程相关。
图12是使用PPI分析对差异蛋白质进行相互作用分析。使用PPI分析对差异蛋白质进行相互作用分析，证实差异基因之间具有相互作用，其中核心蛋白有P53，Cxcr4和Stat3等，都是与细胞死亡与炎症反应相关的核心蛋白质。
图13是各组小鼠粪便进行16S测序核酸质检情况。收集各组小鼠的粪便，进行16S测序。获取粪便细菌核酸之后，进行质检合格后分析各组小鼠的肠道菌群分布情况。结果表明我们所获取的核酸质量符合要求，能够进行下一步测序。
图14是生物信息分析WT小鼠和Lhpp-/-小鼠粪便中丰度显著改变的细菌。进行16S测序之后，通过生物信息学比对和分析证实，有88类细菌仅存在于WT小鼠中，58类细菌仅存在于Lhpp-/-小鼠中。两组小鼠共同拥有332种细菌。这些结果初步说明两组小鼠具有不同的肠道菌群。
图15是两组动物肠道粪便样本中细菌的微生物群落丰富度、多样性以及均匀度分析。进行16S测序之后，通过生物信息学比对和分析证实，两组细菌的微生物群落丰富度、多样性以及均匀度没有显著变化，这些结果初步说明从上述维度进行评估无法证实两组小鼠的肠道菌群具有差异。
图16是两组动物肠道粪便样本中细菌的ANOSIM相似性分析。进行16S测序之后，通过生物信息学比对和分析证实，ANOSIM相似性分析表明两组小鼠的肠道菌群分布发生显著变化。说明从上述维度进行评估能够证实两组小鼠的肠道菌群具有差异。
图17是两组动物肠道粪便样本中细菌的PCA相似性分析。
进行16S测序之后，通过生物信息学比对和分析证实，PCA相似性分析表明两组小鼠的肠道菌群分布发生显著变化。说明从上述维度进行评估能够证实两组小鼠的肠道菌群具有差异。
图18是两组动物肠道粪便样本中细菌的PCoA相似性分析。
进行16S测序之后，通过生物信息学比对和分析证实，PCoA相似性分析表明两组小鼠的肠道菌群分布发生显著变化。说明从上述维度进行评估能够证实两组小鼠的肠道菌群具有差异。
图19是两组动物肠道粪便样本中细菌的NMDS相似性分析。
进行16S测序之后，通过生物信息学比对和分析证实，NMDS相似性分析表明两组小鼠的肠道菌群分布发生显著变化。说明从上述维度进行评估能够证实两组小鼠的肠道菌群具有差异。
图20是两组动物肠道粪便样本中差异细菌物种列表。物种差异分析表明，在Lhpp-/-小鼠中，螺旋杆菌属(Turicibacter)、副苏特雷拉菌属(Parasutterella)和文肯菌属(Rikenella) 等细菌的丰度显著降低，而弯曲杆菌属(Campylobacteria)、鼠尾草菌属(Muribaculum) 和产氧光合细菌属(Oxyphotobacteria)等细菌的丰度显著升高。
图21表示两组动物肠道粪便样本中菌群物种之间的进化关系。进行16S测序之后，通过生物信息学比对和分析两组动物肠道菌群的物种之间的进化关系。
图22表示预测两组动物肠道粪便样本中的代谢通路。进行16S测序之后，通过生物信息学预测代谢通路COG的结果，证实两组小鼠样本的代谢通路具有显著差异。
图23：两组动物肠道粪便样本中犬尿酸含量。获取各组小鼠的粪便样本和血液样本后，使用犬尿酸ELISA检测试剂盒检测样本中犬尿酸含量。与对照组小鼠样本相比，在Lhpp-/-小鼠粪便和血清样本中，犬尿酸含量显著升高。
图24为两组动物肠道粪便样本中犬尿酸的含量与副苏特雷拉菌丰度的相关性分析。使用犬尿酸ELISA检测试剂盒检测粪便和血液样本中犬尿酸含量后，将犬尿酸的含量与副苏特雷拉菌丰度进行相关性分析，证实无论是粪便还是血液样本中犬尿酸的含量都与副苏特雷拉菌丰度呈现负相关。
图25是Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠的构建示意图。图中，通过gRNA在Lhpp的2号外显子两端分别插入LoxP位点，获取纯合子之后(LhppLoxP/LoxP)，随后与Vill-Cre小鼠杂交，诱导两个LoxP位点中间的片段丢失，构建Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠。
图26是LhppLoxP/LoxP小鼠和Cre基因型小鼠PCR进行鉴定图。WT小鼠(LhppWT/WT)，杂合子小鼠(LhppWT/LoxP)，纯合子小鼠(LhppLoxP/LoxP)的基因型不同。使用引物对小鼠基因型进行PCR检测，LhppWT/WT小鼠产物为274bp，Lhpp-/-小鼠产物为354bp，LhppWT/LoxP小鼠产生两个不同长度的产物。Cre基因型同样使用PCR进行鉴定。
图27是LhppLoxP/LoxP小鼠纯合子小鼠筛选鉴定图。小鼠杂交前鉴定结果表明小鼠基因型为 LhppLoxP/LoxP纯合子，Vill-Cre阳性，两者进行杂交可获得肠道上皮特异性的Lhpp敲除小鼠。
图28是Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠的PCR产物鉴定。杂交完成后，通过对肠道组织的DNA 进行PCR检测，产物为217bp，初步表明成功构建Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠。
图29为Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠的蛋白印迹鉴定图。通过蛋白印迹结果证实，小鼠的结肠组织中Lhpp表达缺失，其他组织如心脏，肝脏和肺组织中Lhpp仍然表达，证实Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠构建成功。
图30为WT小鼠和Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠粪便样本中犬尿酸含量检测。
检测WT小鼠和Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠各组样本中犬尿酸含量。与对照组小鼠样本相比，在肠道特异性Lhpp敲除小鼠粪便和血清样本中，犬尿酸含量显著升高。
图31为小鼠肺癌Lewis肿瘤细胞在WT小鼠和Lhpp-/-小鼠皮下的生长速度检测。
在WT小鼠和Lhpp-/-小鼠皮下接种小鼠肺癌Lewis肿瘤细胞。随后观察小鼠肿瘤细胞在各组小鼠皮下生长的速度，使用游标卡尺动态监测皮下肿瘤结节的长径和短径。肿瘤细胞在Lhpp-/-小鼠中的生长速度均显著提高。
图32为小鼠肝癌Hepa 1-6细胞在WT小鼠和Lhpp-/-小鼠皮下的生长速度检测。
在WT小鼠和Lhpp-/-小鼠皮下接种小鼠肝癌Hepa 1-6细胞。随后观察小鼠肿瘤细胞在各组小鼠皮下生长的速度，使用游标卡尺动态监测皮下肿瘤结节的长径和短径。肿瘤细胞在 Lhpp-/-小鼠中的生长速度均显著提高。
图33是小鼠结直肠癌MC38细胞在WT小鼠和Lhpp-/-小鼠皮下的生长速度检测。
在WT小鼠和Lhpp-/-小鼠皮下接种小鼠结直肠癌MC38细胞。随后观察小鼠肿瘤细胞在各组小鼠皮下生长的速度，使用游标卡尺动态监测皮下肿瘤结节的长径和短径。肿瘤细胞在 Lhpp-/-小鼠中的生长速度均显著提高。
图34为流式细胞术检测WT小鼠和Lhpp-/-小鼠皮下肿瘤组织中IFNγ+CD8+T细胞的比例。
收集小鼠皮下肿瘤组织，通过酶解法单细胞悬液。采用荧光素耦连的抗体检测肿瘤组织中IFNγ+CD8+T细胞的比例，在CD3阳性的细胞群中进行分析。与WT小鼠相比，接种至Lhpp-/-小鼠皮下的肿瘤组织中，IFNγ+CD8+T细胞的比例显著降低。
图35为流式细胞术检测WT小鼠和Lhpp-/-小鼠骨髓细胞总数目。使用流式细胞术检测 Lhpp-/-小鼠骨髓细胞总数目，发现两组小鼠并没有显著差异。
图36为流式细胞术检测WT小鼠和Lhpp-/-小鼠骨髓中单核细胞、T细胞、B细胞和造血干细胞等数目。
进一步检测结果显示Lhpp-/-小鼠骨髓中单核细胞、T细胞、B细胞和造血干细胞等数目与 WT小鼠无显著差异。
图37为流式细胞术检测WT小鼠和Lhpp-/-小鼠结肠组织中IFNγ+CD8+T细胞的比例的代表性图片。
收集Lhpp-/-小鼠的结肠组织，经酶解法制备单细胞悬液，采用荧光素耦连的抗体检测组织中IFNγ+CD8+T细胞的比例，流式细胞术的代表性图片。
图38为流式细胞术检测WT小鼠和Lhpp-/-小鼠结肠组织中IFNγ+CD8+T细胞的比例的统计结果。
Lhpp-/-小鼠结肠组织中，IFNγ+CD8+T细胞的比例显著降低。
图39是各组小鼠皮下肿瘤的生长曲线。
在Lhpp-/-小鼠皮下接种肿瘤细胞前一周，将WT小鼠肠道菌群移植入Lhpp-/-小鼠肠道内，隔日移植，总共移植3次。同样处理的WT小鼠作为对照。接种肿瘤细胞后，继续如上实施肠道菌群移植，观察皮下肿瘤的生长情况。与WT小鼠相比，WT小鼠+FMT组的肿瘤生长速度没有显著差异；Lhpp-/-小鼠中的肿瘤生长速度显著加快。与Lhpp-/-小鼠相比，Lhpp-/-小鼠+FMT 组的肿瘤生长速度显著降低。
图40是各组小鼠皮下肿瘤的代表性图片。
在Lhpp-/-小鼠皮下接种肿瘤细胞前一周，将WT小鼠肠道菌群移植入Lhpp-/-小鼠肠道内，隔日移植，总共移植3次。同样处理的WT小鼠作为对照。接种肿瘤细胞后，继续如上实施肠道菌群移植，观察皮下肿瘤的生长情况。与WT小鼠相比，WT小鼠+FMT组的肿瘤生长速度没有显著差异；Lhpp-/-小鼠中的肿瘤生长速度显著加快。与Lhpp-/-小鼠相比，Lhpp-/-小鼠+FMT 组的肿瘤生长速度显著降低。
图41是各组小鼠皮下肿瘤结节的体积统计结果。
在Lhpp-/-小鼠皮下接种肿瘤细胞前一周，将WT小鼠肠道菌群移植入Lhpp-/-小鼠肠道内，隔日移植，总共移植3次。同样处理的WT小鼠作为对照。接种肿瘤细胞后，继续如上实施肠道菌群移植，观察皮下肿瘤的生长情况。与WT小鼠相比，WT小鼠+FMT组的肿瘤生长速度没有显著差异；Lhpp-/-小鼠中的肿瘤生长速度显著加快。与Lhpp-/-小鼠相比，Lhpp-/-小鼠+FMT 组的肿瘤生长速度显著降低。
图42是小鼠肺癌Lewis肿瘤细胞在WT小鼠和Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠皮下生长速度统计结果。
在WT小鼠和Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠皮下分别接种小鼠肺癌Lewis肿瘤细胞后，观察到小鼠的肿瘤细胞在Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠中的生长速度显著提高。
图43是各组小鼠皮下肿瘤生长曲线数据的均一化结果。
对各组小鼠皮下肿瘤的生长曲线数据进行均一化之后，发现尽管Villin-CreLhppLoxP/LoxP小鼠皮下肿瘤的增殖速度显著高于对照组小鼠，但是与Lhpp-/-小鼠相比，其皮下肿瘤生长速度减弱。这可能是因为小鼠全身性敲除Lhpp基因后机体其他方面的功能可能受到影响，比如血管生成、成纤维细胞的活性和巨噬细胞的极化等。
图44是各组小鼠皮下肿瘤体积数据的均一化结果。
对各组小鼠皮下肿瘤的体积数据进行均一化之后，发现尽管Villin-Cre LhppLoxP /LoxP小鼠皮下肿瘤体积显著高于对照组小鼠，但是与Lhpp-/-小鼠相比，其皮下肿瘤体积较低。
图45：流式细胞术检测WT小鼠和Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠肠道组织中的IFNγ+CD8+ T细胞的比例。
进一步检测证实在Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠肠道组织中的IFNγ+CD8+T细胞的比例显著降低。
图46：流式细胞术检测WT小鼠和Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠皮下肿瘤组织中的IFNγ +CD8+T细胞的比例。
进一步检测证实在Villin-Cre LhppLoxP/LoxP小鼠皮下肿瘤组织中的IFNγ+CD8+T细胞的比例显著降低。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，其特征在于所述肿瘤为肺癌、肝癌或结肠癌，所述方法通过基因编辑技术将小鼠Lhpp基因敲除后构建成模型，所述模型为Lhpp基因敲除小鼠，所述Lhpp基因敲除是将小鼠通过双gRNA在Lhpp的基因两端进行切割后制备Lhpp敲除的小鼠。
2.如权利要求1所述的构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，其特征在于通过在小鼠中敲除Lhpp基因，构建肠道上皮结构紊乱模型。
3.如权利要求1所述的构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，其特征在于通过在小鼠中敲除Lhpp基因，构建肠道上皮厚度降低和隐窝数目减少模型。
4.如权利要求1所述的构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，其特征在于通过在小鼠中敲除Lhpp基因，构建肠道菌群紊乱模型，包括ANOSIM相似性，PCA相似性，PCoA相似性和NMDS相似性维度进行评估表现出肠道菌群紊乱。
5.如权利要求1所述的构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，其特征在于通过在小鼠中敲除Lhpp基因，构建肠道螺旋杆菌属(Turicibacter)、副苏特雷拉菌属(Parasutterella)和文肯菌属(Rikenella)细菌的丰度显著降低，而弯曲杆菌属(Campylobacteria)、鼠尾草菌属(Muribaculum)和产氧光合细菌属(Oxyphotobacteria)细菌的丰度显著升高的肠道菌群紊乱模型。
6.如权利要求1所述的构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，其特征在于通过在小鼠中敲除Lhpp基因，构建在CD3阳性的细胞群中IFNγ+CD8+T细胞比例降低的动物模型。
7.如权利要求1所述的构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，其特征在于通过在小鼠中敲除Lhpp基因，构建肠道内容物犬尿酸代谢物含量升高的动物模型。
8.如权利要求1所述的构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，其特征在于通过在小鼠中敲除Lhpp基因，构建血清中犬尿酸代谢物含量升高的动物模型。
9.如权利要求1所述的构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，其特征在于通过在小鼠中敲除Lhpp基因，构建副苏特雷拉菌丰度与犬尿酸含量显著相关的动物模型。
10.如权利要求1所述的构建肠道菌群分布紊乱和抗肿瘤免疫能力失调模型的方法，其特征在于通过在小鼠中敲除Lhpp基因，小鼠骨髓中，T细胞，B细胞，造血干细胞的比例未发生改变。
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