CN107881214A - 一种检测脊肌萎缩症相关的基因突变的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测脊肌萎缩症相关的基因突变的方法。所述方法包括如下步骤:(1)用抑制无义介导的mRNA降解机制的药物或抑制无义介导的mRNA降解机制的shRNA处理来源于待测患者的细胞;(2)提取处理后的目标细胞中的总RNA;(3)测定SMN1转录本并分析目标突变。
Description
技术领域
本发明属于医药生物领域,具体而言,涉及一种检测脊肌萎缩症相关的基因突变的方法。
背景技术
脊肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是最常见的常染色体隐性遗传性神经肌肉病,发病率约为1/6000~1/10,000[1]。该病是由于运动神经元存活基因1(survivalmotor neuron,SMN1)纯合缺失或复合杂合突变(杂合缺失伴点突变)所致。基因诊断是SMA疾病临床确诊的主要依据。然而,目前SMA基因诊断主要针对SMN1基因纯合缺失患儿,仍有很大比例的点突变患儿尚未得到明确的基因诊断[2-5]。
SMN1基因全长27Kb,包含9个外显子(1,2a,2b,3~8),该基因存在与其高度同源的SMN2基因,前者为SMA疾病的致病基因,后者则为疾病表型的修饰基因[6-8]。上述两个基因在全部基因组上仅存在5个核苷酸差异位点,其中2个位点位于外显子区(E7和E8各一个)。在SMA的实际临床基因诊断过程中,鉴于两个基因高度同源,直接基于基因组水平进行扩增测序来明确点突变来源是SMN1或SMN2较为困难。目前,国内外大多数SMN1点突变基因诊断是基于cDNA水平,利用RT-克隆技术结合测序分析鉴别点突变是否发生于SMN1基因 [9-14]。
申请人近年来一直致力于SMN1基因点突变的研究,先后确定SMN1点突变15种,发现除了常见的错义突变和移码突变外,产生提前终止密码子(Premature terminationcodon,PTC) 的SMN1点突变也有6种,约占SMA点突变人群的70%(36/50),其中,p.Ser8Lysfs*23、 p.Leu228*为中国SMA的常见突变[5-8]。
而多项研究表明,含有PTC的转录产物,将导致翻译提前终止而产生无生物活性甚至毒害性截短蛋白。而无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)作用机制是机体内的一种翻译依赖性质控机制,可选择性地迅速降解含有PTC的mRNA(PTC+mRNA),避免产生对细胞正常生理功能有害的截短蛋白。
申请人发现相比错义突变(p.Arg2Gly),上述携带PTC的突变在RT-克隆实验中全长SMN1 基因mRNA转录本的阳性克隆比例极低,降低了点突变基因诊断效率,为临床基因确诊带来了很大困难,有必要对点突变的临床基因诊断策略进行优化。对携带上述突变的患儿外周血进行全长SMN1基因转录本的检测,结果提示其SMN1mRNA转录水平显著下降[10,13]。这提示我们,SMN1基因无义/移码突变极可能通过NMD机制下调含PTC的全长SMN1mRNA转录,进而引起含全长转录本的阳性克隆比例降低,这就是造成这类点突变基因诊断困难的根本原因。
Noensie和Diet最早将NMD应用于肿瘤研究,他们提出了一种新的研究策略,即通过抑制NMD来鉴定突变基因(gene identification by NMD inhibition,GINI),首先用药物或者siRNA来抑制NMD,然后通过微阵列技术比较基因表达状况的改变,表达上调的基因即可能为发生无义突变的抑癌基因[15]。这一研究策略也提示我们,在SMA无义/移码突变的基因诊断过程中,通过加入常用的抑制NMD机制的药物(如放线菌酮和嘌呤霉素)或使用RNAi的技术特异性的抑制相关NMD基因,可能会在一定程度上增加PTC+型mRNA的稳定性,提高含 PTC的全长SMN1转录本的表达,使得NMD相关突变的基因诊断中全长SMN1转录本阳性克隆比例上调,进而提高这类点突变基因诊断的效率,以达到优化SMN1点突变临床基因诊断策略的目的。
本发明拟在前期研究基础上,以SMN1基因常见突变p.Ser8Lysfs*23和p.Leu228*为研究对象,利用NMD药物抑制试验和NMD关键因子(UPF1)敲减实验明确其SMN1mRNA降解是否通过NMD调控所致;同时,将抑制NMD机制的药物应用于此类SMA点突变患儿的临床基因诊断中,观察其对SMA点突变诊断效率的影响,进而优化SMN1基因点突变的基因诊断策略。
发明内容
本发明首先提供一种SMN1基因突变的检测方法,所述方法包括如下步骤:
(1)用抑制无义介导的mRNA降解机制(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)的药物,或用抑制无义介导的mRNA降解机制(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)的干扰RNA处理来源于待测患者的细胞;
(2)提取处理后的目标细胞中的总RNA;
(3)测定SMN1转录本并分析目标突变。
所述的细胞为来自于脊肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)患者的淋巴细胞系、皮肤成纤维细胞系或原代培养的细胞;
所述的NMD机制为UPF1基因(Up-frameshift protein 1)调控的NMD机制;
所述的抑制NMD机制的药物为放线菌酮或嘌呤霉素;
所述的干扰RNA优选为shRNA,其序列如SEQ ID NO.1所示
SEQ ID NO.1:5’-CTA CCA GTA CCA GAA CAT A-3’;
所述的SMN1基因突变包括但不限于如下p.Ser8Lysfs*23、p.Glu14*、p.Gln15*、p.Val19Glyfs*21、p.Leu228*、p.Ile249Tyrfs*16、p.Tyr272Trpfs*35、p.Gly279Glufs*5等无义突变或移码突变。
步骤(1)所述的用抑制NMD机制的药物处理目标细胞的步骤为:
向细胞悬液中加入放线菌酮至终浓度20~500μg/ml(优选为50~150μg/ml,最优选为 150μg/ml),或向细胞悬液中加入嘌呤霉素至终浓度20~500μg/ml(优选为100~400μg/ml,最优选为200μg/ml),继续培养;优选的,所述的继续培养的时间为2~20小时,最优选的,培养时间为5~10小时。
步骤(1)所述的用抑制无义介导的mRNA降解机制(nonsense-mediated mRNAdecay, NMD)的干扰RNA处理来源于待测患者的细胞为:用表达shRNA的RNAi慢病毒载体转染目标细胞,抑制NMD,
所述的用表达shRNA的RNAi慢病毒载体转染目标细胞的步骤为:
1)制备UPF1基因RNAi慢病毒载体;
2)将其加入至患者皮肤成纤维细胞(终浓度为50MOI),孵育24小时后更换新鲜培养基并检测转导效率;
优选的,所述的慢病毒载体为表达序列如SEQ ID NO.1所示的shRNA的慢病毒载体pGV248。
步骤(3)所述的测定SMN1转录本并分析目标突变的方法包括但不限于:用Real-time PCR 方法对目标突变进行检测、用一代测序法(sanger法)对目标突变进行检测。
所述的Real-time PCR方法测定SMN1转录本并分析目标突变的步骤为:
1)标准质粒构建:合成正常对照的样品的cDNA第一链:用SMN1引物对扩增SMN1,用GAPDH引物对扩增GAPDH基因;扩增后的产物克隆入pGEM-T载体中,测序验证克隆子中插入的基因序列;
所述SMN1引物对序列为:
SEQ ID No.2(SMN1F):5’-ACCCGCGGGTTTGCTATG-3’;
SEQ ID No.3(SMN1R):5’-CTACAACACCCTTCTCACAG-3’
2)提取上述2种质粒,测定质粒浓度,根据质粒的碱基数推算质粒的拷贝数,并将标准质稀释成103~108制备标准曲线;
3)定量分析:利用SMN1特异性MGB探针和特异性引物对;以3’磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) 基因为内参进行扩增,扩增总体积为20μl,其中包含:
2×GoldStar TaqMan Mixture、
20ng的cDNA、
4pmol引物和4pmol的探针,
用7500Real-Time PCR仪进行检测,扩增循环条件为:95℃变性10分钟,95℃15秒,60℃1分钟,40个循环。
所述的SMN1特异性MGB探针的序列为:
SEQ ID No.4:5’FAM-ATG GGTTTCAGAA-MGB-NFQ 3’
所述的SMN1特异性引物的序列为:
SEQ ID No.5(SMN upstream):5’TGGTACATGAGTG GCTATCATACTG 3’;
SEQ ID No.6(SMN downstream):5’GTGAGCACC TTCCTTCTTTTT 3’)。
本发明还涉及一种用所述的方法制备的检测SMN1基因突变的检测试剂盒,其包含:
(1)抑制NMD机制的药物或干扰RNA;
(2)mRNA提取试剂及反转录试剂;
(3)检测目标突变所需的引物、探针和必要的试剂。
所述的目标细胞为来自于脊肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)患者的淋巴细胞系、成纤维细胞系或原代培养的细胞;
所述的抑制NMD机制为UPF1基因介导的NMD机制;
所述的抑制NMD机制的药物为放线菌酮或嘌呤霉素;
所述的干扰RNA优选为shRNA,其序列如SEQ ID NO.1所示
所述的SMN1基因突变包括但不限于如下突变:
p.Ser8Lysfs*23、p.Glu14*、p.Gln15*、p.Val19Glyfs*21、p.Leu228*、p.Ile249Tyrfs*16、 p.Tyr272Trpfs*35、p.Gly279Glufs*5等无义突变或移码突变。
所述的试剂盒还包含说明书,所述的说明书记载了所述SMN1基因突变的检测方法。
附图说明
图1、患者和对照组的淋巴细胞系和原代皮肤成纤维细胞中SMN1转录水平和蛋白表达水平;图1a,1c和1e:与正常对照1(2个SMN1拷贝数)和非NMD突变对照(c.830A>G)相比,患者1和患者2的淋巴细胞系中的SMN1转录水平和蛋白表达水平显著降低;图1b,1d 和1f:与正常对照2(2个SMN1拷贝数),患者2皮肤成纤维细胞中SMN1转录水平和蛋白表达水平显著降低。
图2、嘌呤霉素和放线菌酮处理5.5和10小时后,淋巴细胞系和成纤维细胞的活性测定结果;
图3、嘌呤霉素和放线菌酮对携带c.22dupA(p.Ser8lysfs*23)突变的2名SMA患者淋巴系细胞(Lym)和成纤维细胞(Fib)中fl-SMN1mRNA转录表达的影响;图3a-c:放线菌酮处理患者1和患者2的淋巴细胞系(Lym)和成纤维细胞(Fib)后,其SMN1转录水平相比正常对照(2个SMN1拷贝数)和非NMD突变对照(c.830A>G)均有显著升高:图3d-f:嘌呤霉素处理患者1和患者2的淋巴细胞系(Lym)和成纤维细胞(Fib)后,其SMN1转录水平相比正常对照(2个SMN1拷贝数)和非NMD突变对照(c.830A>G)均有显著升高。
图4、shRNA-UPF1/阴性对照在成纤维细胞内的感染结果:细胞产生荧光信号则表明转染成功,目标shRNA成功表达;图4a:shRNA-UPF1在成纤维细胞内的感染结果;图4b:shRNA- 阴性对照在成纤维细胞内的感染结果。
图5、慢病毒介导的shRNA-UPF1敲低实验对SMN1基因转录表达的影响,图5a:用特异性shRNA-UPF1分别处理患者2和正常对照2的成纤维细胞,两例细胞内SC35 1.7kb的转录表达均有显著提高,患者2的SMN1基因转录表达显著高于正常对照2(p<0.001);图5b:Western印迹分析提示,与经shRNA-阴性对照处理相比,患者2和正常对照2的成纤维细胞经shRNA-UPF1处理后,其UPF1蛋白表达水平分别下降77.5%and 85.7%,SMN蛋白分别增加1.35倍和1.4倍。
图6、放线菌酮和嘌呤霉素对p.Ser8Lysfs*23和p.Leu228*突变患者PBMCs细胞内SC35 和SMN1基因转录表达的影响,图6a:CHX:放线菌酮药物处理;图6b:PUR:嘌呤霉素药物处理
具体实施方式
实施例1、建立永生淋巴细胞株(Immortalized B lymphoblastoid cells)和皮肤成纤维(dermal fibroblast cells)细胞株:
永生淋巴细胞株建系方法:
(1)取p.Ser8Lysfs*23和p.Leu228*点突变患儿以及单拷贝携带者各5mL肝素抗凝血,室温放置24h;
(2)加入2mL无血清1640培养液,混匀,沿管壁小心加在4mL淋巴细胞分离液上;
(3)2500r/min离心30min,将白细胞层轻轻吸出后移入另一试管中;
(4)加入10mL无血清1640培养液洗涤3次,然后将洗涤后的白细胞用2mL RPMI1640完全培养基重悬;
(5)加入1.3mL EBV悬液和0.4mL环胞霉素A(CySA,Sigma),充分混匀后等量移入2个10mL培养瓶内,置于37℃、5%CO2培养箱培养;
(6)培养7天左右镜下观察,此后每周两次半量换液;约2周后转瓶,继续培养、换液和传代;
(7)至细胞数达到(4~6)X109/ml时,转化后的细胞在倒置显微镜下观察,可见细胞体积增大,呈球状,胞质丰富,呈明显的团状或簇状增生,标志转化成功。在完成染色体核型分析未见异常后可收集细胞进行冻存,完成建株。
1.2、建立成纤维皮肤细胞株(dermal fibroblast cells)
成纤维皮肤细胞株建系方法:
(1)在无菌条件下切取患者腹部表皮,大小约2cm×3cm,将其置于含有双抗(青霉素和链霉素,100U/L)的PBS中反复漂洗,去除皮下脂肪和结蹄组织等;
(2)将其剪成1mm2的小块置于25cm2培养瓶内,加入含有10%胎牛血清以及双抗的DMEM 培养液(Dulbacco’s modification eagle medium,DMEM)3ml,37℃置于5%CO2的细胞培养箱中培养,每周换液2次。
待其长满培养瓶后用0.25%胰酶进行消化传代即可。
建立了5名受检者的6种细胞系(表1)。
使用SALSA MLPA Kit(P021-A2;RC-Holland,Amsterdam,the Netherlands),对构建成功的细胞系的SMN1和SMN2拷贝数进行检测,结果显示,6个细胞系SMN1和SMN2的拷贝数与其外周血中的拷贝数一致。在SMN基因的Sanger测序后,我们确认了来自2个SMA患者的3个细胞系中存在SMN突变体(c.22dupA和c.830A>G)。所有6个细胞系中并未检测到其他新SMN基因突变体。我们的研究结果表明,与非NMD突变阴性对照(c.830A>G)个体和正常对照相比,携带c.22dupA突变的两名患者,其3个细胞系的fl-SMN1转录表达水平显著降低(p=0.000-0.004)(图1a和1b)。同时,与正常对照相比,c.22dupA患者的SMN 蛋白表达水平也显著降低(图1c-1f)。
表1、6种细胞系对应的患者的遗传学信息和临床资料
备注:NA:不适用;E1:外显子1;PTC:提前终止密码子。
实施例2、放线菌酮和嘌呤霉素处理淋巴细胞株和成纤维细胞株
5%CO2,37℃条件下,EBV转化的淋巴细胞系和成纤维细胞分别在含有胎牛血清、双抗(青霉素和链霉素)的1640培养基和DMEM培养基中培养24小时。在1.5ml细胞悬液中分别加入放线菌酮和嘌呤霉素至终浓度为50~150μg/ml和100~400ug/ml,继续培养5.5个小时和 10个小时。首先利用CCK-8试剂盒分别测定了放线菌酮和嘌呤霉素在三种药物浓度下对淋巴细胞系和成纤维细胞的活性影响,同时也分析了两种药物对细胞内SMN1转录水平的影响。
用嘌呤霉素(Sigma,最终浓度为100,200和400ug/ml的3种终浓度)处理5.5小时和10小时,或放线菌酮(Sigma,最终浓度为50,100和150ug/ml)处理5.5小时和10小时,两种细胞的活性均能保持在50%以上(图2)。
与阴性对照相比,用嘌呤霉素(Sigma,最终浓度为100,200和400ug/ml的3种终浓度)处理5.5小时和10小时,或放线菌酮(Sigma,最终浓度为50,100和150ug/ml)处理5.5小时和10小时,会导致SMN1的3个无义变体细胞系中的转录水平显著增加(图3)。
对于患者1、患者2的淋巴细胞系以及患儿2的成纤维细胞系,放线菌酮和嘌呤霉素给药后的SMN1转录水平倍数均有增加:放线菌酮处理后的SMN1转录水平增加的倍数为2.5± 0.4~8.3±0.1、1.9±0.2~5.0±0.7以及2.2±0.1~4.9±0.2(图3a-3c)。对于上述细胞系,嘌呤霉素处理后SMN1转录水平增加的倍数为:5.5±0.2~19.5±4.0、3.1±0.3~9.9±1.8以及1.5±0.2~6.5±0.5(图3d-3f)。
同时,我们检测到NMD机制启动的阳性对照基因SC35 1.7kb的转录水平变化。在我们的研究中,放线菌酮处理的成淋巴母细胞细胞系的SC35 1.7kb转录水平增加的倍数范围为5.3 ±0.5~10.3±1.4。嘌呤霉素处理的成淋巴母细胞细胞系的SC35 1.7kb转录水平增加的倍数范围为4.3±0.4~15.4±1.7(表2)。
表2.嘌呤霉素和放线菌酮药物处理后SC35 1.7kb转录水平增加情况
实施例3、突变淋巴细胞株NMD关键因子UPF1敲减实验:
(1)在进行慢病毒载体感染实验前一天,成纤维细胞以1×105密度接种于六孔板中。
(2)用50MOI终浓度的慢病毒载体pGV248-shUPF1(转入的shRNA的序列如SEQ IDNO.1 所示)或pGV248-阴性对照慢病毒载体(转入的对照shRNA的序列如SEQ ID NO.7所示)感染成纤维细胞。
SEQ ID NO.1:5’-CTA CCA GTA CCA GAA CAT A-3’;
SEQ ID NO.7:5’-TTC TCC GAA CGT GTC ACG T-3’。
(3)转染24小时后,更换新鲜的细胞培养基。
(4)72小时后,收获细胞提取RNA。
所有实验重复三次,结果提示慢病毒载体(pGV248-shUPF1或pGV248-阴性对照)对成纤维细胞的感染效率超过80%(图4)。
在用pGV248-shUPF1感染患者2和正常对照2的成纤维细胞后,SMN1转录水平分别提升 4.0±0.2倍和1.1±0.1倍(图5a)。与正常对照相比,shRNA-UPF1导致患者2细胞内SMN1 转录水平的提升更为显著(p<0.001)。对于NMD阳性基因SC35 1.7kb而言,患者2和正常对照2细胞的转录水平均有显著提升,增加倍数分别为6.5±0.8和10.1±0.3(图5a)。因此,慢病毒介导的shRNA-UPF1基因敲低实验结果进一步加强了含c.22dupA突变的SMN1转录物易受NMD降解的结论。
与shRNA-阴性对照相比,shRNA-UPF1导致患者2和正常对照2成纤维细胞内UPF1蛋白水平的特异性下将,分别降低了77.5%和85.7%(图5b)。同时,fl-SMN蛋白的倍数增加为1.35和1.4。
实施例4、抑制NMD机制后,对SMA点突变进行临床基因诊断
1、外周血单核细胞(PBMCs)的制备和培养:
使用BD公司的单个核细胞准备管(BD CPTTM真空采集管),采集p.Ser8Lysfs*23和p.Leu228*点突变患者外周血各5-10mL,按说明书要求分离制备PBMCs。
2、放线菌酮和嘌呤霉素处理PBMCs:将5×105/ml的PBMCs细胞密度接种于六孔板中,加入含10%FBS和1%青链霉素的RPMI 1640,同时加入放线菌酮(100μg/ml)和嘌呤霉素(200μg/ml),培养细胞5.5小时。
3、Real-time PCR测定SMN1转录水平:提取药物处理组和未处理组PBMCs总RNA,以1μg提取的总RNA为模板,利用随机引物、M-MLV(invitrogen,美国)进行逆转录,合成 cDNA第一链;随后利用绝对定量Real-time PCR技术测定SMN1转录水平,比较两种药物对 PBMCs处理组和非处理组的SMN1mRNA转录水平的影响。
4、RT-克隆实验:以逆转录合成的cDNA第一链为模板,应用SMN引物对:扩增进行SMN cDNA,PCR产物经电泳分离切胶纯化后克隆pCRII TOPO(TA)(Promega,美国),转化DH5α感受态细胞,根据SMN1基因与SMN2基因的外显子7的差异位点,应用限制性片段长度多态性(RFLP)技术筛选SMN1阳性克隆,比较NMD机制抑制前后SMN1阳性克隆子所占的比例;
所述的SMN引物的序列为:
SEQ ID NO.8:5’-ACCCGCGGGTTTGCTATG-3’;
SEQ ID NO.9:5’-CTACAACACCCTTCTCACAG-3’。
结果如图6显示,
p.Leu228*点突变患者的PBMCs经过放线菌酮和嘌呤霉素药物处理5.5小时后,SC35基因和SMN1基因分别增加约2.6和2.3倍;
p.Ser8Lysfs*23突变患者的PBMCs经过放线菌酮和嘌呤霉素药物处理5.5小时后,SC35 基因和SMN1基因分别增加4.9和2.2倍。
同样,RT-克隆实验也表明,与药物未处理细胞相比,放线菌酮和嘌呤霉素药物处理均会使两种突变PBMCs细胞内的SMN1阳性克隆比例提高。
最后需要说明的是,以上实施例仅帮助本领域技术人员理解本发明的实质,不用作对本发明保护范围的限定。
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序列表
<110> 首都儿科研究所
<120> 一种检测脊肌萎缩症相关的基因突变的方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 1
ctaccagtac cagaacata 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 2
acccgcgggt ttgctatg 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 3
ctacaacacc cttctcacag 20
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 4
atgggtttca gaa 13
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 5
tggtacatga gtggctatca tactg 25
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 6
gtgagcacct tccttctttt t 21
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 7
ttctccgaac gtgtcacg 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 8
acccgcgggt ttgctatg 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 9
ctacaacacc cttctcacag 20
Claims (10)
1.一种脊肌萎缩症患者SMN1基因突变的检测方法,所述方法包括如下步骤:
(1)用抑制无义介导的mRNA降解机制的药物或抑制无义介导的mRNA降解机制的干扰RNA处理来源于待测患者的细胞;
(2)提取处理后的目标细胞中的总RNA;
(3)测定SMN1转录本并分析目标突变。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的细胞为来自于脊肌萎缩症患者的淋巴细胞系、皮肤成纤维细胞系或原代培养的细胞。
3.所述的无义介导的mRNA降解机制为UPF1基因调控的无义介导的mRNA降解机制;
所述的药物为放线菌酮或嘌呤霉素;
所述的干扰RNA为shRNA,优选的,所述shRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述SMN1基因突变包括但不限于如下突变:p.Ser8Lysfs*23、p.Glu14*、p.Gln15*、p.Val19Glyfs*21、p.Leu228*、p.Ile249Tyrfs*16、p.Tyr272Trpfs*35、p.Gly279Glufs*5等无义突变或移码突变。
5.根据权利要求1至4任一所述的方法,其特征在于,
步骤(1)所述的用抑制无义介导的mRNA降解机制的药物处理目标细胞的步骤为:向细胞悬液中加入放线菌酮,或向细胞悬液中加入嘌呤霉素,继续培养;
步骤(1)所述的用抑制无义介导的mRNA降解机制(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)的干扰RNA处理来源于待测患者的细胞为:用表达shRNA的RNAi慢病毒载体转染目标细胞,抑制NMD。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,加入放线菌酮的浓度为20~500μg/ml,优选为50~150μg/ml;加入嘌呤霉素的浓度为20~500μg/ml,优选为100~400μg/ml;培养时间为2~20小时,优选为5~10小时。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的用表达shRNA的RNAi慢病毒载体转染目标细胞的步骤为:
1)制备UPF1基因RNAi慢病毒载体;
2)将其加入至患者皮肤成纤维细胞(终浓度为50MOI),孵育24小时后更换新鲜培养基并检测转导效率;
优选的,所述的慢病毒载体为表达序列如SEQ ID NO.1所示的shRNA的慢病毒载体pGV248。
8.根据权利要求1至4任一所述的方法,其特征在于,
步骤(3)所述的测定SMN1转录本并分析目标突变的方法包括但不限于:
1)用Real-time PCR方法对目标突变进行检测;
或2)用一代sanger测序法对目标突变进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述的用Real-time PCR方法测定SMN1转录本并分析目标突变的步骤为:
1)标准质粒构建:合成正常对照的样品的cDNA第一链:用SMN1引物对扩增SMN1,用GAPDH引物对扩增GAPDH基因;扩增后的产物克隆入pGEM-T载体中,测序验证克隆子中插入的基因序列;
所述SMN1引物对序列为:
SEQ ID No.2、SEQ ID No.3;
2)提取上述2种质粒,测定质粒浓度,根据质粒的碱基数推算质粒的拷贝数,并将标准质稀释成103~108,制备标准曲线;
3)定量分析:利用SMN1特异性MGB探针和特异性引物对;以GAPDH基因为内参进行扩增,扩增总体积为20μl,其中包含:
2×GoldStar TaqMan Mixture、
20ng的cDNA、
4pmol引物和4pmol的探针,
用7500Real-Time PCR仪进行检测,扩增循环条件为:95℃变性10分钟,95℃15秒,60℃1分钟,40个循环。
所述的SMN1特异性MGB探针的序列为SEQ ID No.4;
所述的SMN1特异性引物对的序列为:SEQ ID No.5、SEQ ID No.6。
10.本发明还涉及一种使用权利要求1-9任一所述的方法制备的检测脊肌萎缩症患者SMN1基因突变的检测试剂盒,其包含:
(1)抑制无义介导的mRNA降解机制的药物或shRNA;
(2)mRNA提取试剂及反转录试剂;
(3)检测目标突变所需的引物、探针和必要的试剂。
所述的抑制无义介导的mRNA降解机制的的药物为放线菌酮或嘌呤霉素;
所述的抑制无义介导的mRNA降解机制的shRNA的序列如SEQ ID NO.1;
所述的SMN1基因突变包括但不限于如下突变:
p.Ser8Lysfs*23、p.Glu14*、p.Gln15*、p.Val19Glyfs*21、p.Leu228*、p.Ile249Tyrfs*16、p.Tyr272Trpfs*35、p.Gly279Glufs*5等无义突变或移码突变。
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CN102041272A (zh) * | 2010-08-06 | 2011-05-04 | 南京农业大学 | 慢病毒介导的猪生长激素单质粒诱导表达系统 |
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