CN102041272A

CN102041272A - 慢病毒介导的猪生长激素单质粒诱导表达系统

Info

Publication number: CN102041272A
Application number: CN 201010247916
Authority: CN
Inventors: 刘红林; 姜保春; 邹晓龙
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2010-08-06
Filing date: 2010-08-06
Publication date: 2011-05-04

Abstract

本发明公开了慢病毒介导的猪生长激素单质粒诱导表达系统，可用来制备转基因猪，属于基因工程领域。猪生长激素(pGH)具有刺激骨及软骨组织生长、调节蛋白质、脂类和糖类代谢的功能，能显著提高猪的生长速度、瘦肉率和饲料报酬，但以往的转生长激素基因动物G H在体内表达量和表达时间不受调控，结果导致很多生理性的疾病，得不偿失。本发明首先构建了强力霉素调控的pGH双质粒诱导表达系统，其次将双质粒改造为单质粒诱导表达系统，调控猪GH定时定量表达，在转基因动物中首次报道，其次将单质粒诱导表达系统中调控表达的DNA功能片段插入慢病毒载体，采用慢病毒介导该外源基因进入动物细胞，提高了转基因效率。mRNA分析表明该系统可以使猪的GH基因实现严密的诱导表达。

Description

慢病毒介导的猪生长激素单质粒诱导表达系统

技术领域

本发明构建了慢病毒介导的猪生长激素(pig growth hormone，pGH)单质粒诱导表达系统，属于基因工程领域，具体地讲该方法的的进一步应用可以为生产安全的，瘦肉节粮且生长速度可调控的转GH基因猪做好铺垫。

背景技术

(一)生长激素

生长激素(growth hormone)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的单链多肽激素，具有促进物质代谢与生长发育的作用，对机体各器官和组织均有影响，其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化，调节糖类、脂类和蛋白质三大物质代谢。

在个体生长发育过程中，生长激素是起关键作用的激素，幼年动物缺少GH，会出现生长停滞、身材矮小，在人类表现为侏儒症；成年动物体内的GH会随着年龄的增长而减少，其结果是机体逐渐衰老，成人GH缺乏症表现为皮肤菲薄、肌肉重量减轻、脂肪及总体重增加、骨质疏松、心肾功能降低、凝血机制异常、免疫功能和性功能低下，神经兴奋降低及精神抑郁等[1]。幼年动物GH分泌过多，表现为巨人症；成年动物GH分泌过多，由于骨骺闭合，长骨不再生长，而肢端短骨、面骨及其软骨组织则生长异常，以致出现手足粗大、鼻大、唇厚及内脏器官增大的肢端肥大症。GH的促生长作用主要是通过其诱导靶细胞产生生长素介质(somatomedin，SM)来实现的，SM的化学结构与胰岛素近似，又称胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)。IGF的作用是促进软骨生长，它通过促进钙、磷、钠、钾、硫等多种元素进入软骨组织，以及氨基酸进入软骨细胞，增强DNA、RNA和蛋白质的合成，促进软骨组织增殖和骨化，使长骨加长，也能刺激多种组织细胞有丝分裂。

自从1982年Palmiter等人获得快速生长的“超级小鼠”后，人们对生长激素的转移产生了极大的兴趣，目前已获得转GH基因猪、小鼠、兔、鱼等动物。有研究报道，Hammer等将人的生长激素基因导入猪、兔、绵羊后，分别得到三种动物的整合个体，猪和兔体内得到了表达；史瀛仙等将人生长激素和小鼠MT基因融合注入团头鲂和鲤鱼的受精卵，经检测表明hGH基因在受体鱼中得到整合、转录、翻译、表达，并且具有显著的促生长效应[2]。

将猪生长激素(pGH)转入猪、鼠、兔体内，发现得到的转基因猪、鼠和兔生长速度均有明显提高，且得到的转基因阳性猪可以将导入基因部分的遗传给后代，F1代猪亦表现出较好的生产性状。转猪生长激素(pGH)的金鱼，不仅pGH基因得到表达，而且可通过有性繁殖传递给后代。在转牛生长激素(bGH)基因注入小鼠受精卵，结果转入的GH基因对育成的转基因小鼠具有明显的促生长作用，GH基因的表达具有明显的组织特异性。将牛和羊的生长激素基因导入鲤鱼受精卵，获得转基因鲤鱼，实验证明外源基因可以遗传给后代，并对受体鱼有明显的促生长作用[3]。

目前通过基因重组技术成功合成了人生长激素(RhGH)，其结构与人的GH相似，具有促进物质代谢和组织细胞生长、发育、增殖、分化，调节免疫及代谢作用，目前已被广泛用于治疗慢性肝病、改善严重创伤、烧伤、慢性阻塞性肺病等疾病领域，在减肥、抗衰老、美容等领域也在迅速增长。

GH虽具有的促生长功能以及潜在的价值，但是转GH基因动物还存在诸多问题。难以控制转入基因在宿主基因组中的行为，以及存在的安全性问题都将是面临的考验。

(二)Tet-on诱导表达系统

GOSSEN等[56]建立的四环素表达调控系统，(Tet基因表达调控系统)，高效无毒，具有严密的开关功能。该系统基础表达水平低，诱导表达水平高；调控特异性高，宿主基因不受影响；诱导剂无相关毒性；适用范围广泛，可穿越胎盘屏障和分泌进乳汁，尤其适合转基因研究；存在剂量依赖性，可定时定量诱导表达。应用于大多数真核细胞的一般为双质粒调控的表达系统，即由调节质粒和反应质粒组成。其中，在四环素的衍生物强力霉素(Doxycycline，Dox)存在下，Tet-on基因表达系统可以诱导插入启动子下游的目的基因高效表达。目前认为，Tet-on基因表达系统是最为理想的真核生物基因诱导表达系统，随着人们对该系统的不断的研究和改造，该系统的功能和组成都得到了提高和优化，pTRE-Tight-BI质粒含有两个受同一TRE-mod调控的反向的迷你型CMV启动子，可同时诱导两个不同基因的表达。

(三)慢病毒

慢病毒是逆转录病毒科的一个属。按照目前国际病毒分类标准，逆转录病毒科分为7个属：α逆转录病毒属，β逆转录病毒属，γ反转录病毒属，δ反转录病毒属，ε反转录病毒属，慢病毒属，泡沫病毒属。其中的慢病毒属又分为5个组，包括牛慢病毒组、马慢病毒组、猫慢病毒组、羊慢病毒组和人类慢病毒组。我们在实验所采用的病毒载体是HIV-1来源的慢病毒，HIV在病毒“大家族”中的定位是逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组。

HIV-1的基因组由两条相同的正股RNA链在5′端通过部分碱基互补配对而成二聚体。病毒基因组全长约9.8kb，含有gag、pol、env 3个结构基因以及2个调节基因(tat反式激活因子、rev毒粒蛋白表达调节子)和4个辅助基因(nef负调控因子、vpr病毒r蛋白、vpu病毒u蛋白和vif毒粒感染性因子)^[7]。在病毒基因组的5′端和3′端各有相同的一段核苷酸序列，称为长末端重复序列(long terminal repeat，LTR)。慢病毒载体的构建原理是：将HIV-1基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和编码反式作用因子的序列进行分离，拆分在不同的质粒，使各质粒不能单独形成病毒颗粒，也不具备感染能力^[8]。慢病毒载体HIV慢病毒载体系统经历了三个发展阶段，既所谓的三代，本实验所采用的第三代慢病毒载体也就是所谓的四质粒系统，相比较而言，四质粒系统更增加了载体系统的安全性。

之所以选择慢病毒载体作为转基因的方法，是因为它有其它方法所没有的优势。在各种转基因方法中，逆转录病毒感染法的转基因效率是最高的，且为单拷贝随机整合。慢病毒的优势在于：其一：慢病毒载体既可以转染处于有丝分裂活跃期的细胞，又可以转染分裂缓慢及处于分裂终末期的细胞，包括造血干细胞，神经干细胞，处于分化终末的神经元，肝实质细胞等，这是通常使用的逆转录病毒所不具备的；其二：由慢病毒载体携带整合入宿主基因组的目的基因对转录沉默作用有较强的抵抗能力，在体外培养细胞实验和体内移植实验中，由慢病毒载体携带导入的目的基因可以在宿主细胞中得到长期而稳定的表达；其三：慢病毒载体可以兼容多个转录启动子，包括细胞特异性启动子和在基因组中普遍存在的管家基因的启动子；其四：经过改建后的慢病毒载体可以容纳约10kb左右的外源基因，因此大多数的cDNA都能被克隆入慢病毒载体^[9]。慢病毒载体的上述优点使其成为体内和体外基因转移的一种有效工具。

[1]赵东峰，李汉超，王悦然，等.基因工程人生长激素及其应用研究进展[J].广州化工，2010，28(2)：44-49

[2]吴婷婷，史瀛仙，杨弘，等.人生长激素基因在团头鲂和鲤中的整合和表达[J].水产学报，1994

[3]郭时金，周春凤，张志亭，等.转生长激素基因动物研究概况[J].科研综述，2008，6(230)：8-9

[4]张雪梅，丁惠国.重组人生长激素在慢性肝脏疾病及改善营养代谢中的作用[J].Chinese General Practice.2010，13，(10)：328-331

[5]GOSSEN M，BUJARD H.Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters[J].Proc Natl Acad Sci USA，1992，89(12)：5547-5551

[6]GOSSEN M，FREUNDLIEB S，BENDER G，et al.Transcriptional activation by tetracycline in mammalian cells[J].Science，1995，268(5218)：1766-1769

[7]陆德源.医学微生物学[M].第4版，人民卫生出版社，1999：291-298.

[8]Bartosch B，Cosset FL.Strategies for retargeted gene delivery using vectors derived from lentiviruses[J].Curr Gene Ther 2004，4(4)：427-443.

[9]Lai Z，Brady R O.Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinant lentivirus vector[J].Neurosci Res，2002，67：363-371.

发明内容：

技术问题：

本发明的目的是构建慢病毒介导的的单质粒的pGH诱导表达系统，方便转基因细胞系的筛选和转基因动物的生产。慢病毒介导，提高转染效率。在强力霉素(Doxycycline/Dox，该系统调控表达的诱导剂)的诱导下，该系统在猪胎儿成纤维细胞中实现定时，定量的诱导表达，可为下一步生产安全的，生长速度可调控的，节粮瘦肉型转基因猪做好铺垫。

技术方案：

本发明首先构建了pGH双质粒诱导表达系统(pTet-on Advanced，pTRE-Tight-BI-GH)，其次将双质粒的pGH诱导表达系统改造为单质粒诱导表达系统pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced共4221bp，然后将pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced质粒的功能片段插入慢病毒载体，用于包装病毒pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced共8344bp。最后用病毒原液感染猪胎儿成纤维细胞，采用real-time PCR在转录水平检测了该系统的功能。

本发明所提供的慢病毒介导的pGH单质粒诱导表达系统，是由以下方法获得的：

1)pTRE-Tight-BI-GH表达质粒的构建

设计猪生长激素引物：

Primerl GTGGATCCCTCAGCTCACCGGC

Primer2CAACAGAGTCGACCAGCAACTAGAA

划线部分分别为上游引物和下游引物添加的BamH I和Sal I酶切位点；

以猪垂体总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，用高保真酶进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，98℃变性10s，57℃复性15s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃5min，4℃恒温，PCR产物为696bp；

将PCR扩增获得带有BamH I和Sal I位点的编码GH序列的PCR产物和pTRE-Tight-BI分别用BamH I和Sal I进行双酶切，再次电泳胶纯化回收，测定浓度，载体和插入片段按摩尔比1∶4混合于4℃，T4连接酶(购自TAKARA公司)16℃连接过夜，热激转化到DH5α大肠杆菌(购自TIANGEN公司)中37℃培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，得到含pTRE-Tight-BI-GH质粒的菌液；

2)pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced表达质粒的构建

设计rtTA-Advanced片段引物：

Primer3TGACCTCCATAGAAGACACC

Primer4ATGTCTAGATCTTTACTTAGTTACC

划线部分为下游引物添加的BglII酶切位点，在扩增产物中47bp处包含EcoR I的酶切位点，以浓度为1ng/μl pTet-onAdvanced质粒作为模板，扩增rtTA-Advanced片段，PCR产物为770bp；

将PCR扩增获得带有EcoR I和Bgl II位点的编码rtTA-Advanced序列的PCR产物和pTRE-Tight-BI-GH分别用EcoR I和Bgl II进行双酶切，再次电泳凝胶纯化回收，测定浓度，载体和插入片段按比例1∶3.5混合于4℃，T4连接酶(购自TAKARA公司)16℃连接过夜，热激转化到DH5α大肠杆菌(购自TIANGEN公司)中37℃培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，得到含pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced质粒的菌液；

3)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒的构建

设计pLenti骨架引物：

Primer5GCGACTTCCAGTTCAA

Primer6CTAGACTAGTCTCCACCTTCTTCTTCTAT

划线部分为下游引物添加的Spe I酶切位点，以浓度为1ng/μl pLenti6/V5-GW/lacZ质粒作为模板，扩增pLenti骨架，PCR产物为6549bp，在扩增产物中297bp处包含SacII的酶切位点；

设计TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段引物：

Primer7CTAGACTAGTCCTGACGTCGGCAGTGAAAA

Primer8TCCCCGCGGCGACCAGCAACTAGAAGGCA

划线部分分别为上游引物和下游引物添加的Spe I和SacII酶切位点，

以浓度为1ng/μl pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced质粒作为模板，扩增2109bp的TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段，将产物琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pMD-19载体(购自TAKARA公司)。将2109bp的TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced DNA功能片段PCR扩增产物进行TA克隆，pMD-19载体和插入片段按摩尔比1∶10混合于4℃，T4连接酶(购自TAKARA公司)16℃连接过夜，热激转化到DH5α大肠杆菌(购自TIANGEN公司)中37℃培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，得到含pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒的菌液；

将PCR扩增获得带有Spe I和SacII酶切位点的pLenti质粒骨架DNA和pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒分别用Spe I和Sac II进行双酶切，将产物琼脂糖电泳分离、切胶回收，测定浓度，按1∶3比例混合于4℃，T4连接酶(购自TAKARA公司)16℃连接过夜，热激转化到DH5α大肠杆菌(购自TIANGEN公司)中37℃培养过夜，利用PCR和Nru I酶切筛选鉴定阳性克隆，得到含pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒的菌液，

4)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒生产

(1)转染前一天，用1ml质量比0.25％胰酶消化293Ft细胞，按1∶4的比例传到4个T75cm²培养瓶中，加入10ml不含抗生素的293FT培养基，放入37℃含体积比5％CO₂培养箱进行培养；

(2)转染当天，待细胞达到体积比70-90％融合度时，移除培养液，加入6ml无抗生素的293FT培养基；

以一个T75cm²培养瓶用量为例制备DNA-脂质体转染复合物：在一个无菌的15ml离心管中，将9μg ViraPower^TM Packaging Mix及3.5μg pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒，共12μg DNA，加入到1.9ml 293FT无血清无双抗培养基中，轻轻混匀，待用；取另一无菌15ml离心管，将40μl的脂质体Lipofectamine^TM 2000加入1.9ml 293FT无血清无双抗培养基中，轻轻吹吸混匀，迅速与上一步的混合液混合，并轻轻混匀，室温孵育20分钟，以形成DNA-脂质体转染复合物；

(3)将转染复合物逐滴加入培养瓶中，并来回轻摇以混匀，37℃培养6～12小时后，换上10ml新的完全293FT无抗生素培养基；

(4)转染后72小时收集含病毒的上清到无菌有盖的15ml的尖底离心管内；

(5)4℃3000rpm离心15分钟，以去除细胞沉淀；

(6)取上清，用0.45μm滤器抽滤；

(7)抽滤过的病毒原液经4℃保存备用，即为所获得的慢病毒介导的pGH单质粒诱导表达系统pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒。

所述慢病毒介导的pGH单质粒诱导表达系统可以在调控生长激素表达方面的应用。其中TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段也可在调控生长激素GH基因表达方面的得到基因工程应用。

有益效果：

1、本发明首次公开了pGH双质粒诱导表达系统中pTRE-Tight-BI-GH质粒序列和构建过程。

2、本发明人首次公开pGH四环素单质粒诱导表达系统pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced序列及其构建过程。

3、本发明人首次公开了携带有慢病毒介导的pGH四环素单质粒诱导表达系统pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced序列及其构建过程。

4、本发明人将pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液感染猪胎儿成纤维细胞系，通过real-time PCR方法在转录水平证明了：该系统可以严密，定时，定量的调控pGH的表达，有望用于安全，节粮瘦肉型转基因猪生产。

附图说明

图1：pGH双质粒系统中pTet-on Advanced质粒图谱。

图2：pGH双质粒系统中pTRE-Tight-BI-GH质粒图谱。

图3：pGH四环素单质粒诱导表达系统pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced质粒图谱。

图4：慢病毒介导pGH四环素单质粒诱导表达系统pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒图谱。

图5：PCR扩增2109bTRE-GH-rtTA-Advanced功能片段琼脂糖电泳图。

图6：Spe I和Sac II对pLenti骨架和pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced酶切后琼脂糖电泳图。1、6249bp pLenti骨架酶切产物2、pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced酶切产物，较短的条带为2099bp TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段。

图7：pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced酶切鉴定图。Nru I酶切该质粒后获得1840bp、2162bp和4342bp三条验证性条带。

图8：pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液转染猪胎儿成纤维细胞后，Real-time PCR产物电泳图。

图9：pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液转染猪胎儿成纤维细胞后，GH受调控表达量化图。

具体实施方式

(一)猪生长激素(growth hormone)DNA序列的克隆

1)猪垂体总RNA的提取

取杜洛克猪脑垂体组织0.3g：首先加入1ml Trizol试剂，吹打均匀，将匀浆室温放置5min；加入200μl氯仿，剧烈震荡混匀30s，冰上静置3min；12000rpm，4℃离心15min；将上清液小心转移到新的1.5ml离心管中(取400μl)，加入预冷的等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15min。12000rpm，4℃离心15min；小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。用70％乙醇(DEPC处理的水配制)洗涤1次，加入700μl乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。8000rpm，室温离心10min。吸去上清，真空离心干燥3～5分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉。沉淀用10μl DEPC-H₂O溶解。如发现沉淀难溶，68℃处理10min。RNA检测：测定样品在260nm和280nm的吸光值按1OD＝40μg/ml RNA计算RNA的产量；OD260/世OD280在1.8-2.0进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，确定RNA的完整性和污染情况。

2)表达片段的PCR扩增

利用猪GH的cDNA序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因数据库中检索到Sus scrofa(pig)growth hormone CDS AY536527.1，设计一对引物，扩增猪生长激素DNA序列。以猪脑垂体组织总RNA反转录获得的cDNA为模板扩增出GH的cDNA序列。猪生长激素引物：

PrimerlGTGGATCCCTCAGCTCACCGGC

Primer2CAACAGAGTCGACCAGCAACTAGAA

划线部分分别为上游引物和下游引物添加的BamH I和Sal I酶切位点。

以步骤1)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，用高保真酶(Prime Star HS DNA polymerase购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，98℃变性10s，57℃复性15s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃5min，4℃恒温。PCR产物为696bp。琼脂糖电泳分离、切胶回收用于重组质粒的构建。

(二)重组测序质粒的构建和鉴定

1)pTRE-Tight-BI-GH表达质粒的构建

将PCR扩增获得带有BamH I和Sal I位点的编码GH序列的PCR产物和pTRE-Tight-BI(购自Clonetech公司)分别用BamH I和Sal I(BamH I和Sal I购自NEWENGLANDBiolabs)进行双酶切，再次电泳胶纯化回收，测定浓度，按比例混合于4℃，16℃连接过夜。热激转化到DH5α大肠杆菌(购自TIANGEN公司)中37℃培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，得到含pTRE-Tight-GH质粒的菌液。

2)pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced表达质粒的构建

以浓度为(1ng/μl)pTet-on Advanced质粒(购自Clonetech公司)作为模板，扩增rtTA-Advanced片段，rtTA-Advanced片段引物：

Primer3TGACCTCCATAGAAGACACC

Primer4ATGTCTAGATCTTTACTTAGTTACC

划线部分为下游引物添加的BglII酶切位点，在扩增产物中47bp处包含EcoR I的酶切位点。扩增rtTA-Advanced片段，用高保真酶(Prime Star HS DNA polymerase购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，98℃变性10s，57℃复性15s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃5min，4℃恒温。PCR产物为770bp。

将PCR扩增获得带有EcoR I和Bgl II位点的编码rtTA-Advanced序列的PCR产物和pTRE-Tight-BI-GH分别用EcoR I和Bgl II(EcoR I和Bgl II购自NEW ENGLAND Biolabs)进行双酶切，再次电泳凝胶纯化回收，测定浓度，载体和插入片段按1∶5比例混合于4℃，T4连接酶(购自TAKARA公司)16℃连接过夜。热激转化到DH5α大肠杆菌(购自TIANGEN公司)中37℃培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，得到含pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced质粒的菌液。

3)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒的构建

以浓度为1ng/μlpLenti6/V5-GW/lacZ质粒(购自invitrogen公司)作为模板，扩增pLenti骨架，pLenti骨架引物：

Primer5GCGACTTCCAGTTCAA

Primer6CTAGACTAGTCTCCACCTTCTTCTTCTAT

划线部分为下游引物添加的Spe I酶切位点，在扩增产物中297bp处包含SacII的酶切位点。扩增pLenti骨架，用高保真酶(Prime Star HS DNA polymerase购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，98℃变性10s，54℃复性15s，72℃延伸6min，30个循环后，72℃10min，4℃恒温。PCR产物为6549bp。

以浓度为1ng/μl pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced质粒作为模板，扩增TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段，TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段引物：

Primer7CTAGACTAGTCCTGACGTCGGCAGTGAAAA

Primer8TCCCCGCGGCGACCAGGAACTAGAAGGCA

划线部分分别为上游引物和下游引物添加的Spe I和SacII酶切位点。

扩增获得的2109bp TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段，用LA Taq(TaKaRa LA Taq购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸2min，30个循环后，72℃7min，4℃恒温。PCR产物为2109bp。将产物琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pMD-19载体(购自Takara公司)。如果两个连接产物均为PCR产物则很难实现连接，又考虑将pLenti骨架连入T载体较困难，所以将2109bp的TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段进行TA克隆得到pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒的菌液(操作方法见TAKARA公司

19-T Vector说明书)。

将PCR扩增获得带有Spe I和Sac II酶切位点的pLenti骨架和pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒分别用Spe I和Sac II(Spe I和Sac II购自NEWNGLAND Biolabs)进行双酶切，再次电泳胶纯化回收，测定浓度，按比例混合于4℃，16℃连接过夜。热激转化到DH5α大肠杆菌(购自TIANGEN公司)中37℃培养过夜，利用PCR和Nru I酶切筛选鉴定阳性克隆，得到含pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒的菌液。

(三)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒生产

1)转染前一天，用1ml 0.25％胰酶消化293Ft细胞(购自Invitrogen公司)，按1∶4的比例传到4个T75cm²培养瓶中，加入约10ml 293FT培养基(不含抗生素)，放入37℃含5％CO₂培养箱进行培养。

2)转染当天，待细胞达到70-90％融合度时，移除培养液，加入6ml 293FT培养基(无抗生素)。

准备DNA-脂质体转染复合物(以一个T75cm²培养瓶用量为例)：

A：在一个无菌的15ml离心管中，将9μg ViraPower^TM Packaging Mix(Invitrogen)及3.5μgpLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒，共12μg DNA，加入到1.9ml 293FT无血清无双抗培养基中，轻轻混匀，待用。

B：取另一无菌15ml离心管，将40μl的脂质体Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen)加入1.9ml293FT无血清无双抗培养基中，轻轻吹吸混匀。迅速与A步的混合液混合，并轻轻混匀。

C：室温孵育20分钟，以形成DNA-脂质体转染复合物。

3)将转染复合物逐滴加入培养瓶中，并来回轻摇以混匀。37℃培养6～12小时后，换上10ml新的完全培养基(无抗生素)。

4)转染后72小时收集含病毒的上清到无菌有盖的15ml的尖底离心管内。此期注意实验安全。

5)4℃3000rpm离心15分钟，以去除细胞沉淀。

6)取上清，用0.45μm滤器(Millipore)小心地抽滤，不要产生气泡。

7)抽滤过的病毒原液经4℃保存备用。

(四)猪胎儿成纤维细胞系的获得

1)材料的获取在超净台中取出约克夏母猪子宫内的30日龄胎儿(不要破坏羊膜)放入含有200IU/mL青霉素和200μg/mL链霉素的PBS液中，漂洗2～3遍，用镊子夹起胎儿，用灭菌眼科剪剪破羊膜使胎儿流出，放入含100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的PBS液中，剪去头、尾、四肢并去除内脏，剩余组织在无菌的培养皿中用眼科剪剪切成1mm³左右的小块。

2)原代的培养向培养皿中加入3mL含0.25％胰蛋白酶和0.04％EDTA的消化液，置于4℃冰箱。冷消化3～4h，吸掉上层胰酶液，剩余胰酶液刚刚没过组织块。然后39℃培养箱继续进行消化60min，此时加入2mL的含体积比20％胎牛血清的DMEM培养液终止消化，并用剪口吸头反复轻轻吹打松散组织，当其顺利通过吸管口时，示消化合适。后加入1mL39℃预温的DMEM/F-12培养液(DMEM/F-12培养液含体积比20％胎牛血清，2mmol/L谷氨酸胺，100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，吹打均匀后，用培养液调整细胞密度至5×10⁵～1×10⁶个细胞/mL。置于39℃，5％CO2培养箱中培养。48～72h后观察，发现贴壁后更换一半或全部培养液，此后每两天更换一次培养液。

3)传代当细胞原代培养8～9天生长至体积比90％汇合时，吸出培养液，用PBS冲洗1～2遍，加入1ml的0.25％胰蛋白酶消化液于39℃消化约2～3min，最好不超过5min。在显微镜下观察，待大部分细胞变圆时，立即加入2ml DMEM/F-12培养液(DMEM培养液含体积比20％胎牛血清)终止消化，轻轻吸打，制成细胞悬液，1000rpm离心5min后弃上清，接种于其他培养瓶中继续培养。原皿中贴壁较紧的上皮细胞和未消化的成纤维细胞可继续培养，获得可以传代的猪胎儿成纤维细胞系。

4)冻存细胞铺满瓶底后，消化、收集细胞，离心(1200rpm，5min)，小心吸除上清液，加入4℃预冷的细胞冻存液重悬细胞，使细胞密度达到1～3×10⁶个细胞/mL，转入细胞冻存管中，做好标记，放入冻存盒，将冻存盒置于-70℃过夜，，第2d取出冻存管放入液氮罐中。

(五)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液感染猪胎儿成纤维细胞后，Dox诱导GH在猪胎儿成纤维细胞中表达鉴定

复苏冻存的猪胎儿成纤维细胞于6孔细胞培养板中，待细胞生长至体积比70％汇合时，对细胞进行不同处理，每个处理设三个重复。

第一组为pLenti-GFP病毒原液处理组：待细胞生长至体积比70％汇合时将细胞培养液换成1mlpLenti-GFP病毒原液，待病毒侵染12个小时后，更换新鲜的DMEM/F-12培养液(DMEM/F-12培养液含体积比20％胎牛血清，2mmol/L谷氨酸胺，100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素)；

第二组为pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液处理组：待细胞生长至体积比70％汇合时将细胞培养液换成1ml pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液，待病毒侵染12个小时后，更换新鲜的DMEM/F-12培养液；

第三组为pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液加Dox(购自Sigma公司)处理组：待细胞生长至体积比70％汇合时将细胞培养液换成1ml pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液，待病毒侵染12个小时后，更换新鲜的DMEM/F-12诱导培养液(DMEM/F-12培养液含1000ng/mlDox体积比20％胎牛血清，2mmol/L谷氨酸胺，100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素)。

提取各组细胞RNA，并收集细胞培养液。Real-timePCR结果显示，GH基因在胎儿成纤维细胞内表达受Dox调控，第二组GH表达量是第一组的12.98倍，而第三组GH表达量是第一组的130.28倍。表明该真核表达系统受Dox严密调控。

猪生长激素定量引物：

Primer9GTTCCTCAGCAGGGTCTT

Primer10CCCGCAGGTATGTCTCA

内参基因HPRT引物：

Primer11CTGGCAAAACAATGCAAACCT

Primer12AAGCTTGCAACCTTGACCATCT

Claims

1.慢病毒介导的猪生长激素pGH单质粒诱导表达系统，是由以下方法获得的：

1)pTRE-Tight-BI-GH表达质粒的构建

设计猪生长激素引物：

PrimerlGTGGATCCCTCAGCTCACCGGC

Primer2CAACAGAGTCGACCAGCAACTAGAA

将PCR扩增获得带有BamH I和Sal I位点的编码GH序列的PCR产物和pTRE-Tight-BI分别用BamH I和Sal I进行双酶切，再次电泳胶纯化回收，测定浓度，质粒和插入片段按摩尔比1∶3混合于4℃，T4连接酶16℃连接过夜，热激转化到DH5α大肠杆菌中37℃培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，得到含pTRE-Tight-BI-GH质粒的菌液；

2)pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced表达质粒的构建

设计rtTA-Advanced片段引物：

Primer3TGACCTCCATAGAAGACACC

Primer4ATGTCTAGATCTTTACTTAGTTACC

划线部分为下游引物添加的Bgl II酶切位点，在扩增产物中47bp处包含EcoR I的酶切位点，以浓度为1ng/μl pTet-onAdvanced质粒作为模板，扩增rtTA-Advanced片段，PCR产物为770bp；

将PCR扩增获得带有EcoR I和Bgl II位点的编码rtTA-Advanced序列的PCR产物和pTRE-Tight-BI-GH分别用EcoR I和Bgl II进行双酶切，再次电泳凝胶纯化回收，测定浓度，质粒和插入片段按摩尔比1∶3.5混合于4℃，T4连接酶(购自TAKARA公司)16℃连接过夜，热激转化到DH5α大肠杆菌中37℃培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，得到含pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced质粒的菌液；

3)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒的构建

设计pLenti骨架引物：

Primer5GCGACTTCCAGTTCAA

Primer6CTAGACTAGTCTGCACCTTGTTCTTCTAT

设计TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段引物：

Primer7CTAGACTAGTCCTGACGTCGGCAGTGAAAA

Primer8TCCCCGCGGCGACCAGCAACTAGAAGGCA

以浓度为1ng/μl pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced质粒作为模板，扩增2109bp的TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段，将产物琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pMD-19载体，热激转化到DH5α大肠杆菌中37℃培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，得到含pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advan ced质粒的菌液；

将PCR扩增获得带有Spe I和SacII酶切位点的pLenti质粒骨架DNA和pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒分别用Spe I和Sac II进行双酶切，将产物琼脂糖电泳分离、切胶回收，测定浓度，按1∶3比例混合于4℃，T4连接酶16℃连接过夜，热激转化到DH5α大肠杆菌中37℃培养过夜，利用PCR和Nru I酶切筛选鉴定阳性克隆，得到含pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒的菌液；

4)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒生产

以一个T75cm²培养瓶用量为例制备DNA一脂质体转染复合物：在一个无菌的15ml离心管中，将9μg ViraPower^TM Packaging Mix及3.5μg pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒，共12μgDNA，加入到1.9ml 293FT无血清无双抗培养基中，轻轻混匀，待用；取另一无菌15ml离心管，将40μl的脂质体Lipofectamine^TM 2000加入1.9ml 293FT无血清无双抗培养基中，轻轻吹吸混匀，迅速与上一步的混合液混合，并轻轻混匀，室温孵育20分钟，以形成DNA-脂质体转染复合物；

(5)4℃3000rpm离心15分钟，以去除细胞沉淀；取上清，用0.45μm滤器抽滤；抽滤过的病毒原液经4℃保存备用，即为所获得的慢病毒介导的pGH单质粒诱导表达系统pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒。

2.权利要求1所述慢病毒介导的猪生长激素pGH单质粒诱导表达系统在调控生长激素GH基因表达方面的应用。

3.权利要求1所述TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段在调控生长激素GH基因表达方面的基因工程应用。