CN103695466A - 一种诱导动物体外细胞可逆永生化的载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导动物体外细胞可逆永生化的载体及其应用。本发明所提供的诱导动物体外细胞可逆永生化的载体含有大肠杆菌复制起始区、氨苄青霉素抗性基因，以及表达盒1和表达盒2；所述表达盒1从上游到下游依次包括如下元件：P_tight、hTERT、IVS、IRES、Hyg^r和SV40polyA；所述表达盒2从上游到下游依次包括如下元件：P_CMV、rtTA-Advanced和SV40polyA；所述表达盒1和所述表达盒2方向相反。实验证明，利用本发明所提供的环形载体，可实现对动物细胞寿命的可逆调节，提高体外细胞遗传操作的效率。本发明为动物遗传修饰或医学细胞治疗等应用提供安全的细胞材料具有重要意义。

Description

一种诱导动物体外细胞可逆永生化的载体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种诱导动物体外细胞可逆永生化的载体及其应用。

背景技术

体外培养的动物细胞在生物学研究、动物克隆和转基因以及细胞治疗上均有重要应用价值，但从动物体组织分离的原代细胞增殖代数有限，不利于体外长期培养，特别是不利于遗传修饰和组织工程等长期培养过程。通过表达一定的基因可以使原代培养的体细胞寿命延长，即获得永生化能力，其中人端粒酶催化亚基基因（hTERT）是常用的基因之一。已经证实，在细胞中表达人端粒酶催化亚基基因（hTERT）可以使细胞获得功能性的端粒酶，防止端粒缩短而使细胞寿命得以延长。

但是，永生化细胞或长寿细胞并不完全符合动物克隆或细胞治疗的要求，长期稳定表达这些“永生化”基因的细胞不能用于体细胞克隆或细胞治疗，因为克隆后易导致肿瘤发生或者胚胎发育停止。现有技术主要采用持续表达hTERT基因的方法延长细胞寿命，但一旦转入hTERT基因后无法关闭其表达，结果是细胞发生永生化或癌化。因此，在完成体外基因打靶等遗传修饰后，在进行核移植前必须使导入的“永生化”基因关闭，从而变成正常的细胞，才可能生产出克隆动物。因此，必须构建出细胞寿命可逆的细胞系。

发明内容

本发明的目的是提供一种诱导动物体外细胞可逆永生化的载体。

本发明所提供的诱导动物体外细胞可逆永生化的载体为环形载体（记为环形载体A）。

所述环形载体A，含有大肠杆菌复制起始区（Col E1ori）、氨苄青霉素抗性基因（Amp^r），以及表达盒1和表达盒2；所述表达盒1从上游到下游依次包括如下元件：P_tight、hTERT、IVS、IRES、Hyg^r、SV40polyA；所述表达盒2从上游到下游依次包括如下元件：P_CMV、rtTA-Advanced和SV40polyA。

在本发明中，所述表达盒1和所述表达盒2方向相反。

在所述环形载体A中，所述大肠杆菌复制起始区（Col E1ori）的序列具体可为序列表中序列1的第7611-8254位；所述氨苄青霉素抗性基因（Amp^r）的序列具体可为序列表中序列1的第6604-7466位。

在所述表达盒1中，所述P_tight由TRE_mod和P_minCMV△组成；所述TRE_mod的序列如序列表中序列1的第2-251位所示；所述P_minCMV△的序列如序列表中序列1的第257-316位所示；所述hTERT的序列如序列表中序列1的第373-3829位所示；所述IVS的序列如序列表中序列1的第3892-4177位所示；所述IRES的序列如序列表中序列1的第4223-4814位所示；所述Hyg^r的序列如序列表中序列1的第4838-5869位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列1的第6199-6399位所示。

在所述表达盒2中，所述P_CMV的序列如序列表中序列1的第10512-9921位所示；所述rtTA-Advanced的序列如序列表中序列1的第9823-9077位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列1的第9054-8621位所示。

进一步，所述表达盒1的核苷酸序列为序列表中序列1的第2-6399位；所述表达盒2的核苷酸序列为序列表中序列1的第10512-8621位。

更加具体的，所述环形载体A的核苷酸序列具体为序列表中序列1。

本发明的再一个目的是提供所述环形载体A的制备方法。

所述环形载体A的制备方法，具体可包括如下步骤：

（1）用XhoⅠ酶切pTet-On Advanced质粒，回收4.2kb片段（含有P_CMV、rtTA-Advanced和SV40polyA，以及Col E1ori和Amp^r）；用XhoⅠ酶切pTRE-Tight质粒，回收0.6kb片段（含有P_tight、MCS和SV40polyA）；将所述4.2kb片段与所述0.6kb片段反向连接，得到重组载体，记作pTet-On Tight；

（2）用XbaⅠ和NheⅠ酶切pIREShyg3质粒，回收2.3kb片段（含有IVS、IRES和Hyg^r）；用NheⅠ酶切所述pTet-On Tight，回收线性载体骨架片段，记为片段A；将所述2.3kb片段与所述片段A正向连接，得到重组载体，记作pTet-On IREShyg；

（3）用EcoRⅠ酶切pLPC-hTERT质粒，回收3.4kb片段（含有hTERT）；将所述3.4kb片段的末端补平，得到平齐末端片段；用Eco47Ⅲ酶切所述pTet-On IREShyg，回收线性载体骨架片段，记为片段B；将所述平齐末端片段与所述片段B正向连接，得到重组载体，记作pTet-On hTERT；所述pTet-On hTERT即为本发明所保护的所述环形载体A。

所述环形载体A（pTet-On hTERT）在诱导动物体外细胞可逆永生化中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种用于诱导动物体外细胞可逆永生化的组合物。

该组合物由所述环形载体A和强力霉素组成。

在本发明中，以上所有的所述动物体外细胞为动物体外原代细胞，具体可为绵羊胎儿成纤维细胞。

在本发明中，具体是通过如下实现对所述动物体外细胞（如绵羊胎儿成纤维细胞）的可逆永生化的：在四环素类似物—强力霉素（Doxycycline，Dox）存在的情况下，Dox与所述rtTA-Advanced元件表达的蛋白rtTA结合，作用于所述P_tight元件，从而所述P_minCMV△驱动目的基因（如所述hTERT）的表达，；在没有Dox的情况下，rtTA不能作用于所述P_tight元件，故目的基因（如所述hTERT）不能表达。因此通过添加或撤除Dox来对目的基因（如所述hTERT）实行可控表达。当所述hTERT表达时，所述动物体外细胞（如绵羊胎儿成纤维细胞）处于永生化开启状态；当所述hTERT不表达时，所述动物体外细胞（如绵羊胎儿成纤维细胞）处于永生化关闭状态

本发明的还一个目的是提供另一种环形载体（记为环形载体B）。

本发明所提供的环形载体B，为所述环形载体A缺失所述hTERT后形成的环形载体。

所述环形载体B，含有大肠杆菌复制起始区、氨苄青霉素抗性基因，以及表达盒1和表达盒2；所述表达盒1从上游到下游依次包括如下元件：P_tight、IVS、IRES、Hyg^r和SV40polyA；所述表达盒2从上游到下游依次包括如下元件：P_CMV、rtTA-Advanced和SV40polyA；所述表达盒1和所述表达盒2方向相反。

在所述环形载体B中，所述大肠杆菌复制起始区的序列具体为序列表中序列1的第7611-8254位；所述氨苄青霉素抗性基因的序列具体为序列表中序列1的第6604-7466位；

在所述表达盒1中，所述P_tight由TRE_mod和P_minCMV△组成；所述TRE_mod的序列如序列表中序列1的第2-251位所示；所述P_minCMV△的序列如序列表中序列1的第257-316位所示；所述IVS的序列如序列表中序列1的第3892-4177位所示；所述IRES的序列如序列表中序列1的第4223-4814位所示；所述Hyg^r的序列如序列表中序列1的第4838-5869位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列1的第6199-6399位所示。

在所述表达盒2中，所述P_CMV的序列如序列表中序列1的第10512-9921位所示；所述rtTA-Advanced的序列如序列表中序列1的第9823-9077位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列1的第9054-8621位所示。

进一步，所述表达盒1的核苷酸序列为在序列表中序列1的第2-6399位的基础上缺失其中的第373-3829位核苷酸后所形成的序列；所述表达盒2的核苷酸序列为序列表中序列1的第10512-8621位。

更加具体的，所述环形载体B的核苷酸序列具体为序列表中序列1缺失第373-3829位核苷酸后所形成的序列。

本发明的又一个目的是提供以上所述环形载体B的制备方法。

本发明所提供的所述环形载体B的制备方法，具体可包括如下步骤：

（1）用XhoⅠ酶切pTet-On Advanced质粒，回收4.2kb片段（含有P_CMV、rtTA-Advanced和SV40polyA，以及Col E1ori和Amp^r）；用XhoⅠ酶切pTRE-Tight质粒，回收0.6kb片段（含有P_tight、MCS和SV40polyA）；将所述4.2kb片段与所述0.6kb片段反向连接，得到重组载体，记作pTet-On Tight；

（2）用XbaⅠ和NheⅠ酶切pIREShyg3质粒，回收2.3kb片段（含有IVS、IRES和Hyg^r）；用NheⅠ酶切所述pTet-On Tight，回收线性载体骨架片段，记为片段A；将所述2.3kb片段与所述片段A正向连接，得到重组载体，记作pTet-On IREShyg；所述pTet-On IREShyg即为本发明所保护的所述环形载体B。

所述环形载体B（pTet-On IREShyg）的如下应用也属于本发明的保护范围：在动物体外细胞中控制控制外源目的基因的表达。

本发明同时还提供了在动物体外细胞中，用于控制外源目的基因表达的组合物。

该组合物具体由所述的环形载体B和强力霉素组成。

在本发明中，以上所有的所述动物体外细胞为动物体外原代细胞，具体可为绵羊胎儿成纤维细胞。

在本发明中，所述外源目的基因需插入所述环形载体B（pTet-On IREShyg）的所述表达盒1中所述Hyg^r和所述SV40polyA之间的位置；所述外源目的基因具体可为人端粒酶基因(hTERT)，所述人端粒酶基因(hTERT)的序列具体如序列表中序列6所示。

在本发明中，具体是通过如下实现在所述动物体外细胞（如绵羊胎儿成纤维细胞）中控制所述外源目的基因的表达的：在四环素类似物—强力霉素（Doxycycline，Dox）存在的情况下，Dox与所述rtTA-Advanced元件表达的蛋白rtTA结合，作用于所述P_tight元件，从而所述P_minCMV△驱动所述外源目的基因（如所述hTERT）的表达，；在没有Dox的情况下，rtTA不能作用于所述P_tight元件，故所述外源目的基因（如所述hTERT）不能表达。因此通过添加或撤除Dox来对所述外源目的基因（如所述hTERT）实行可控表达。

另外，本发明还保护含有所述环形载体A或所述环形载体B的重组菌或重组细胞。

本发明创造性地把四环素（Tet-on）诱导表达系统的两个质粒组件构建在同一个质粒中，大大地方便了基因转染和筛选操作。将hTERT基因和一个用于药物筛选的抗性基因构建到质粒中，且抗药基因和hTERT通过一个核糖体嵌入位点（IRES）融合表达，通过添加Dox后可以诱导hTERT和抗药基因同时表达，既方便转染后的细胞筛选，又达到了诱导细胞长寿的目的。如撤除Dox，则关闭hTERT基因的表达，细胞寿命恢复正常。实验证明，利用本发明所提供的环形载体，可实现对动物细胞寿命的可逆调节，提高体外细胞遗传操作的效率。本发明为动物遗传修饰或医学细胞治疗等应用提供安全的细胞材料具有重要意义。

附图说明

图1为pTet-On Advanced质粒的图谱。

图2为pTRE-Tight质粒的图谱。

图3为pIREShyg3质粒的图谱。

图4为重组载体pTet-On hTERT的图谱。

图5为重组载体pTet-On hTERT的酶切鉴定。1：DNA MarkerⅢ2：质粒pTet-OnhTERT3：sspⅠ酶切重组质粒pTet-On hTERT4：MIUⅠ酶切重组质粒pTet-OnhTERT5：NcoⅠ酶切重组质粒pTet-On hTERT。

图6为细胞克隆生长曲线。其中，1为细胞克隆h10的Dox⁺组细胞，2为细胞克隆h10的Dox^+-组细胞，3为细胞克隆h10的Dox^-组细胞。

图7为PCR检测细胞克隆中目的基因的整合情况。1：MarkerⅢ；2：载体pTeton-hTERT的阳性对照；3：绵羊胎儿成纤维细胞的阴性对照；4-9：pTet on-hTERT转染绵羊胎儿成纤维细胞后筛选获得的克隆h1，h2，h3，h4，h10，h11。

图8为RT-PCR检测细胞克隆中hTERT mRNA水平的表达。h1，h2，h3，h4，h10，h11分别表示pTet on-hTERT转染绵羊胎儿成纤维细胞后筛选获得的克隆1，2，3，4，10，11；“+”表示每个克隆的Dox⁺组细胞，“-”表示每个克隆的Dox^-组细胞；SFF为绵羊胎儿成纤维细胞的阴性对照；质粒代表载体pTet on-hTERT的阳性对照；293，Hela为两个阳性对照细胞。

图9为western blot检测细胞克隆中hTERT蛋白质水平的表达。h1，h2，h3，h4分别表示pTet on-hTERT转染绵羊胎儿成纤维细胞后筛选获得的克隆1，2，3，4；“+”表示每个克隆的Dox⁺组细胞，“+-”表示每个克隆的Dox^+-组细胞；SFF为绵羊胎儿成纤维细胞的阴性对照；Hela为阳性对照细胞。

图10为TRAP检测各细胞端粒酶活。h1，h2，h3，h4分别表示pTet on-hTERT转染绵羊胎儿成纤维细胞后筛选获得的克隆1，2，3，4；括号内的“+”表示每个克隆的Dox⁺组细胞，括号内的“-”表示每个克隆的Dox^-组细胞；SFF为绵羊胎儿成纤维细胞的阴性对照；Hela为阳性对照细胞；C为未加任何细胞提取液的空白对照组；M为MarkerⅢ。每组细胞分加热组和不加热组，“-”表示不加热的正常组，“+”表示85℃加热10min端粒酶灭活组。

图11为细胞衰老β-半乳糖苷酶染色。h10(+)-p89：pTet on-hTERT转染绵羊胎儿成纤维细胞后筛选获得的10号克隆的Dox⁺组细胞的第89代细胞；h10(-)-p49：10号克隆的Dox^-组细胞的第49代细胞。h10(+-)-p89：10号克隆的Dox^+-组细胞的第89代细胞。

图12为Hela细胞在软琼脂平板上的生长图。

图13为阳性细胞克隆的中期染色体标本。绵羊体细胞的染色体为27对54条，其中26对为常染色体，另一对为异染色体。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pTet-On Advanced质粒、pTRE-Tight质粒和pIREShyg3质粒：均购自美国Clontech公司。其中，pTet-On Advanced质粒的产品目录号为630930；pTRE-Tight质粒的产品目录号为631059；pIREShyg3质粒的产品目录号为631620。

pLPC-hTERT质粒：Clonetech公司，目录号#6299-1。

实施例1、Tet-on介导hTERT可诱导表达载体（pTet-On hTERT）的构建

本实施例构建四环素（Tet-on）介导人端粒酶基因(hTERT)可诱导表达载体pTet-OnhTERT。所用到的原始质粒为pTet-On Advanced质粒、pTRE-Tight质粒、pIREShyg3质粒和pLPC-hTERT。其中，pTet-On Advanced质粒的图谱如图1所示；pTRE-Tight质粒的图谱如图2所示，多克隆位点（MCS）处自上游到下游含有EcoR I和Nhe I的识别序列；pIREShyg3质粒的图谱如图3所示，多克隆位点（MCS）处有NheⅠ的识别序列。

一、重组载体pTet-On hTERT的构建

（1）用XhoⅠ酶切pTet-On Advanced质粒，回收4.2kb片段（含有如下元件P_CMV、rtTA-Advanced和SV40polyA，以及Col E1ori和Amp^r）；用XhoⅠ酶切pTRE-Tight质粒，回收0.6kb片段（含有P_tight、MCS和SV40polyA）；将所述4.2kb片段与所述0.6kb片段反向连接，得到重组载体，记作pTet-On Tight。

（2）用XbaⅠ和NheⅠ酶（XbaⅠ和NheⅠ酶为同尾酶）切pIREShyg3质粒，回收2.3kb片段（含有IVS、IRES和Hyg^r）；用NheⅠ酶切所述pTet-On Tight，回收线性载体骨架片段，记为片段A；将所述2.3kb片段与所述片段A正向连接，得到重组载体，记作pTet-On IREShyg。

（3）用EcoRⅠ酶切pLPC-hTERT质粒，回收3.4kb片段（只含hTERT，不含其它元件）；将所述3.4kb片段的末端补平，得到平齐末端片段；用Eco47Ⅲ（切割位点为平齐末端）酶切所述pTet-On IREShyg，回收线性载体骨架片段，记为片段B；将所述平齐末端片段与所述片段B正向连接，得到重组载体pTet-On hTERT。

重组载体pTet-On hTERT的质粒图谱如图4所示，重组载体pTet-On hTERT，含有大肠杆菌复制起始区（Col E1ori）、氨苄青霉素抗性基因（Amp^r），以及两个方向相反的表达盒（记为表达盒1和表达盒2）。所述表达盒1从上游到下游依次包括如下元件：P_tight（TRE_mod和P_minCMV△）、hTERT、IVS、IRES、Hyg^r、SV40polyA；所述表达盒2从上游到下游依次包括如下元件：P_CMV、rtTA-Advanced和SV40polyA。

二、重组载体pTet-On hTERT的鉴定

1、分子鉴定

如图5所示，用sspⅠ酶切重组质粒pTet-On hTERT，切开后为单片段，长度约10.6kb，为重组质粒pTet-On hTERT全长；用MIUⅠ酶切重组质粒pTet-On hTERT，切开后为两条片段，一片段长度约为9.7kb，另一片段约为900bp；用NcoⅠ三酶切重组质粒pTet-On hTERT，切开后为三条片段，片段长度分别约为4.9kb、3.1kb和2.6kb。酶切鉴定结果与序列分析结果一致，因此可以说重组质粒pTet-On hTERT经酶切鉴定是正确的。

2、测序分析

对所述重组载体pTet-On hTERT进行序列测定，结果显示：所述重组载体pTet-OnhTERT的全载体序列为序列表中序列1。

其中，第7611-8254位为大肠杆菌复制起始区（Col E1ori）的序列。

第6604-7466位为氨苄青霉素抗性基因（Amp^r）的序列。

第2-6399位为步骤一中所述的表达盒1。具体而言，第2-316位为P_tight的序列（第2-251位为TRE_mod的序列；第257-316位为P_minCMV△的序列）；第373-3829位为hTERT的序列；第3892-4177位为IVS的序列；第4223-4814位为IRES的序列；第4838-5869位为Hyg^r的序列；第6199-6399位为SV40polyA的序列。

第10512-8621位为步骤一中所述的表达盒2。具体而言，第10512-9921位为P_CMV的序列；第9823-9077位为rtTA-Advanced的序列；第9054-8621位为SV40polyA的序列。

实施例2、pTet on-hTERT介导绵羊胎儿成纤维细胞的可逆永生化

细胞培养液：DMEM/F12（Gibco公司产品，产品目录号为12500062）+10%（体积分数）胎牛血清

细胞消化液：称取NaCl8.0g，KCl0.4g，葡萄糖1.0g，NaHCO₃，0.35g，EDTA·四钠盐2.0g，胰酶2.5g，用milliQ H₂O定容至1L。过滤除菌，-20℃保存备用。

细胞冷冻液：DMEM/F12+20%（体积分数）胎牛血清+10%（体积分数）DMSO。

一、原代绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养

1.胎儿组织的采集及细胞分离：

通过手术采集发育70天小尾寒羊胎儿，剪取胎儿小块皮肤组织，放到无菌生理盐水中带回实验室，在超净工作台中在无菌操作条件下将组织用剪刀剪碎至1mm³大小，然后将组织碎块转移到含有0.25%（0.25g/100mL）胰蛋白酶的无钙、镁PBS溶液中，在37℃下孵育消化30-60分钟。加入血清终止消化，利用三层无菌纱布过滤消化的组织，收集含有细胞的滤液，转移到试管中，在1000r/min下离心10分钟。离心后弃上清，加入细胞培养液重悬细胞沉淀，并稀释细胞到约1×10⁷个细胞/毫升。将细胞接种到培养皿中，约12小时后可见大量细胞贴壁生长，之后每天观察细胞生长状态，每隔48小时换液一次。当细胞生长至80%汇合时进行传代。多次传代后原始细胞培养物中的成纤维细胞占主要优势，上皮细胞由于生长较慢被逐渐淘汰。成纤维细胞可通过常规显微镜下的形态判断。

2.细胞的传代

待细胞生长至80%汇合时，吸去细胞培养液，加入无钙、镁PBS溶液洗涤细胞2次，然后加入含有0.25%（0.25g/100mL）胰蛋白酶和0.02%（0.02g/100mL）EDTA的消化液消化细胞3-5分钟，待细胞变圆时，加37℃预热的培养液终止消化，吹打细胞使之彻底脱离培养皿底壁，并成单细胞，然后将细胞稀释至合适浓度，按照1:2或1:3比例接种到培养皿中。随后的传代方法与此相同。

3.细胞的冷冻保存

根据实验需要，可将不同传代次数的细胞进行冷冻保存以用于下一步研究。冷冻方法是：待细胞生长至80%汇合时，吸去细胞培养液，加入无钙镁PBS洗涤细胞2次，然后加入含有0.25%（0.25g/100mL）胰蛋白酶和0.02%（0.02g/100mL）EDTA的消化液消化细胞3-5分钟，待细胞变圆时，加37℃预热的培养液终止消化，吹打细胞使之彻底脱离培养皿底壁，并成单细胞，然后将细胞转移到15毫升离心管，在1000r/min下离心10分钟。离心后弃上清，加入细胞冷冻液重悬细胞沉淀，细胞浓度约为1×10⁷个细胞/毫升，转移到冻存管中，分别在4℃放置30分钟，-20℃放置2小时，-80℃过夜，然后转入液氮中长期保存。

二、细胞转染及单克隆培养

1、利用常规分子生物学方法大量提取和纯化实施例1构建的pTet on-hTERT质粒。

2、利用限制性内切酶sspⅠ线性化pTet on-hTERT质粒，酚仿抽提纯化，无水乙醇沉淀DNA，最后用超纯水或PBS溶液溶解DNA沉淀。

3、利用电转染方法将线性化pTet on-hTERT质粒转入步骤一获得的原代绵羊胎儿成纤维细胞细胞中。本实例中使用美国BTX公司生产的ECM830电穿孔仪进行转染，具体方法：当细胞生长至80%汇合时，用细胞消化液消化贴壁的细胞，离心收集细胞（方法同前“细胞的传代”）。将收集到的细胞放到电击杯中，每个电击杯中400μl电转染液（DMEM/F12），在每个电击杯中加入7.5μg线性化质粒，打开电穿孔仪，设置参数。将电击杯放置在电穿孔仪中的电击池中，电击2min后放于4℃冰箱中10min。10min后，将电击杯中的细胞转入1个60mm培养皿中，培养液终体积4ml，其中含10％FBS。次日，观察细胞生长状况。根据细胞数分到若干10cm皿中，尽量使细胞呈单细胞散开，并于含10％（体积分数）FBS的DMEM/F12完全培养液中加入Dox（终浓度1μg/ml）hygB（终浓度150μg/ml）进行筛选。每三天换一次筛选培养液，连续筛选10天左右，待未转染质粒的对照组细胞完全死亡后，即可分离细胞单克隆。

三、单细胞克隆挑选及传代

1、在体式显微镜下，将细胞消化液滴到单细胞克隆上，约1分钟后用玻璃吸管轻轻吹打，使细胞脱离，用玻璃吸管把悬浮的单细胞转移到48孔板中继续扩增培养。培养液为含有1μg/ml Dox，150μg/ml hygB，10％（体积分数）FBS的DMEM/F12。

2、当细胞长满48孔板，PBS洗一次，加胰酶消化1min，加入200μl含1μg/ml Dox，150μg/ml hygB，10％FBS的DMEM/F12的培养液吹打吸入0.5ml离心管中，吹打混匀后取一滴悬液用血球计数板计细胞数，剩余悬液可继续转入24孔板培养。

3、当细胞长满24孔板，再继续转入12孔板培养，再35mm皿，至60mm皿记为p₀代，每次扩增都要用血球计数板进行细胞计数。

4、传到p₀的细胞长满后传代培养，消化离心后根据细胞沉淀多少加入3-5mlDMEM/F12细胞培养液悬浮，取一滴悬液计数，分别取一定数目的细胞加入到两个60mm皿中，其中一皿为含1μg/mlDox，10％FBS的DMEM/F12培养液，记为Dox⁺组，即Dox诱导组；一皿为含10％FBS的DMEM/F12培养液，记为Dox^-组，即Dox非诱导组。

5、细胞长到汇合度70-80％时分别进行细胞计数传代。

四、细胞鉴定

pTet on-hTERT转染绵羊胎儿成纤维细胞后筛选获得了共29个克隆，其中9个克隆扩增到了60mm皿中，而其中6个克隆经过连续传代后存活下来，分别为1，2，3，4，10，11号克隆，分别记为克隆h1，h2，h3，h4，h10，h11。

每个细胞克隆又分为Dox⁺组（即Dox诱导组）和Dox^-组（即Dox非诱导组）。Dox⁺组细胞分别记为h1(+)，h2(+)，h3(+)，h4(+)，h10(+)，h11(+)；Dox^-组细胞分别记为h1(-)，h2(-)，h3(-)，h4(-)，h10(-)，h11(-)。

Dox⁺组细胞连续传代培养一定时间后撤销Dox，验证细胞寿命能否恢复正常。

Dox⁺组细胞和Dox-组细胞连续传代培养一段时间后，Dox⁺组细胞依然旺盛生长（见图6中所示的细胞克隆生长曲线h10(+)），Dox^-组细胞出现增殖缓慢（见图6中所示的细胞克隆生长曲线h10(-)），细胞体积变大、形状扁平且经β-半乳糖苷酶染色后染为蓝色，呈现衰老迹象。由此说明Dox⁺组细胞在Dox诱导下，细胞寿命延长。

此时，将Dox⁺组细胞再分为两组，一组继续加Dox诱导（仍记为Dox⁺组），一组撤销Dox加入成为Dox非诱导组（记为Dox^+-组），Dox^+-组细胞分别记为h1(+-)，h2(+-)，h3(+-)，h4(+-)，h10(+-)，h11(+-)。

Dox⁺组、Dox^-组和Dox^+-组细胞分别传代培养，绘制生长曲线以及进行细胞衰老β-半乳糖苷酶染色等检测验证Dox^+-组细胞能否与Dox^-组细胞一样经过一段时间连续培养后逐渐衰老。

1、各组细胞生长曲线的绘制

根据PD=㏑M-㏑N+PD0，计算每一代细胞的细胞群体倍增数（populationdoubling，PD）数，式中，N表示每代细胞的初始细胞数，M表示每代细胞该传代时的细胞数，PD0表示细胞初始的Population Doublings（群体倍增数）。以时间（克隆培养天数）做为横坐标，细胞PD数做为纵坐标绘制生长曲线。

结果显示，6个克隆的生长趋势类似，下面以h10（即10号克隆)为例加以说明。图6为阳性细胞克隆h10的3组细胞的生长曲线。图6细胞生长曲线表明，pTeton-hTERT转染绵羊胎儿成纤维细胞后筛选获得的阳性克隆h10的Dox⁺组细胞的生长速度明显快Dox^-组细胞的生长速度，且Dox⁺组细胞一直呈指数生长，而Dox^-组细胞呈S型增长，Dox^-组细胞培养到150天左右的时候进入生长停滞、细胞衰老死亡阶段。从细胞生长曲线上还可以看出，由Dox⁺组细胞撤销Dox后分出的Dox^+-组细胞，随着传代培养经过一段时间后生长速度变慢，最后也逐渐进入生长停滞、细胞衰老死亡阶段。所以此图说明在Dox诱导下，细胞寿命延长；撤销Dox后，细胞寿命能否恢复正常。

2、hTERT基因整合鉴定

利用常规方法提取每个克隆的基因组DNA，电泳检测DNA完整性及浓度，-20℃保存备用。利用下述方法进行PCR扩增鉴定hTERT基因整合情况。同时以绵羊胎儿成纤维细胞（SFF）作为阴性对照细胞。

1）引物设计

为了检测载体pTet-On hTERT在绵羊胎儿成纤维细胞基因组中的整合情况，设计了一对跨P_tight启动子和hTERT基因的引物，如下：

引物1：5’-CGTCAGATCGCCTGGAGAAT-3’（序列1的306-325位）；

引物2：5’-ACAGAAACCACGGTCACTCG-3’（序列1的1175-1194位的反向互补序列）

2）PCR扩增体系

PCR扩增的反应体系如下：模板（基因组DNA）10-500ng，2×Taqmix12.5μl，引物1（10pmol/μl）1.0μl，引物2（10pmol/μl）1.0μl，ddH₂O补至25μl。其中，2×Taqmix为博迈德公司产品，其产品目录号为PC0903

PCR扩增的反应程序如下：95℃变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保温。

3）鉴定结果

如图7所示，经基因组DNA PCR检测显示，pTet on-hTERT转染绵羊胎儿成纤维细胞后筛选获得的克隆h1，h2，h3，h4，h10，h11都为转基因阳性克隆。

3、利用RT-PCR鉴定hTERT mRNA的表达

利用常规方法提取细胞总RNA，对hTERT进行RT-PCR表达鉴定。同时以293细胞和Hela细胞作为两个阳性对照细胞，以绵羊胎儿成纤维细胞（SFF）作为阴性对照细胞。

1）mRNA反转录

采用RT-PCR Kit（购自Promega，产品目录号：K1005S）进行。具体如下：在冰浴离心管里面加入模板RNA6.0μl，上下游引物（试剂盒自带）各1.0μL，DEPC水7μl，混合离心5sec。70℃水浴5min，冰浴5min。加入5×反应液5μl，RNase抑制剂0.6μL，dNTP(10mM)1.0μl，DEPC水2.4μl，M-MLV1.0μl，混匀。42℃保温1h，72℃15min，-20℃保存。

2）RT-PCR扩增

反应体系如下：模板cDNA1.0μl，2×Taqmix12.5μl，引物3（10pmol/μl)1.0μl，引物4（10pmol/μl)1.0μl，ddH₂O补至25μl。其中，2×Taqmix为博迈德公司产品，其产品目录号为PC0903。

引物3：5’-CGGCCGATTGTGAACATG-3’（序列1的第2272-2289位）；

引物4：5’-AGGAAGACGTCGAAGAGG-3’（序列1的第2793-2810位的反向互补序列）。

反应条件为：95℃变性5min；95℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸40sec，31个循环；72℃延伸10min；4℃保温。

以GAPDH作为内参，其扩增引物为引物5和引物6。

引物5：5’-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3’；

引物6：5’-TCCTTGGAGGCCATGTAGGCCAT-3’。

3）RT-PCR鉴定结果

如图8所示，RT-PCR检测结果表明在Dox诱导下各阳性细胞克隆表达hTERT基因的mRNA，而在不加Dox诱导下除3号克隆有本底表达外，其它各阳性克隆的Dox^-组细胞几乎检测不到hTERT基因mRNA水平的表达。由此说明Dox可有效的调控外源基因hTERT mRNA水平的表达的表达。

4、利用western blot鉴定hTERT蛋白表达

1）实验操作步骤：

（1）蛋白样品制备：用细胞裂解液抽提蛋白，并测蛋白浓度；

（2）配制10％SDS-PAGE，凝固后，取20μl蛋白样品上样，100V电泳；

（3）电泳后，将蛋白转移至经甲醇平衡好的PVDF膜上，转膜条件为湿法转膜，转膜液为Tris-Gly转膜液，200mA转膜3h；

（4）转膜结束后，TBST配制5％（5g/100mL）脱脂奶粉封闭液，室温封闭2h；

（5）Telomerase抗体（Anti-Telomerase reverse transcriptaseantibody，购自Abcam公司，产品目录号为ab32020，兔源）以1:2000稀释于封闭液中，4℃孵育过夜；

（6）一抗孵育完后，用TBST室温下在摇床上洗膜4次，每次10min；

（7）HRP标记的二抗（Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP)，购自Abcam公司，产品目录号为ab6721，羊源）1:2000稀释于封闭液中，室温孵育1h；

（8）二抗孵育完后，用TBST室温下在摇床上洗4次，每次10min；

（9）HRP-ECL发光：发光液A和B（购自普利莱基因技术有限公司产品目录号为P1010）等体积混合，加于膜上孵育3-5min，将膜固定于暗盒中，盖上胶片曝光，显影，定影。

同时以Hela细胞作为阳性对照细胞，以绵羊胎儿成纤维细胞（SFF）作为阴性对照细胞。

以β-actin作为内参，其一抗为Anti-beta Actin antibody，购自Abcam公司，产品目录号为ab8226，鼠源；二抗为Rabbit Anti-Mouse IgG H&L(HRP)购自Abcam公司，产品目录号为ab6728，兔源。

2）鉴定结果

如图9所示，在各阳性细胞克隆的Dox⁺组细胞经western blot检测都有明显的目的条带，而在撤销Dox后的Dox^+-组细胞经western blot检测目的条带基本消失或明显减弱；阳性对照Hela细胞有明显的目的条带，未转染重组质粒pTet-On hTERT的绵羊胎儿成纤维细胞（SFF）没有相应的条带。因此说明Dox能诱导外源基因hTERT蛋白质水平的表达，并且撤销Dox后外源基因hTERT基本不表达，所以进一步说明Dox可有效的调控外源基因hTERT的表达。

5、TRAP银染法定量分析细胞端粒酶活性

1）细胞样品的准备

（1）细胞计数：取出孵育中的细胞，消化处理，然后用红血球计数板计数；

（2）转移1×10⁵细胞到一个新的Ep管中；

（3）4℃低温离心10min，转速3000g；

（4）小心吸去上清，用新鲜的PBS重悬细胞，离心洗涤，此后，细胞可以保存在-80℃；

（5）取预冷的细胞裂解液（1×CHAPS Lysis Buffer包含在

TelomeraseDetection Kit内

Telomerase Detection Kit：购自Millipore，产品目录号为S7710）200μl，加入细胞中，轻轻吸打三次混匀，然后置冰上孵育30min；

（6）4℃低温离心20min，转速16000g；

（7）小心取出上清，转移至新的Ep管中，为了保证上清中不含有杂质，最好不超过175μl；

（8）立即开始TRAP实验，如果下一步实验没有准备好，就用液氮迅速冷冻细胞提取物，然后转移-80℃保存。

2）TRAP-银染法检测端粒酶活性

（1）TRAP-PCR反应体系

细胞提取物（以上步骤1）（7）中所得上清，10-750ng/μl）2.0μl，10×TRAP ReactionBuffer5.0μl，50×dNTP Mix1.0μl，TS Primer1.0μl，TRAP primer Mix1.0μl，TagRolymerase（5units/μl）0.4μl，ddH₂O补至50μl。其中，Taq DNA Rolymerase购自NEB，产品目录号为M0267V，其它试剂均来自试剂盒

Telomerase Detection Kit：购自Millipore，产品目录号为S7710。

取各细胞提取物各5μl，85℃加热10min，取2μl，加入其它TRAP-PCR反应成分（同上）作为加热失活对照。

（2）TRAP-PCR反应程序

30℃引物延长反应30min，1个循环；94℃端粒酶失活反应5min，1个循环；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸60s，31个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保温1h。

（3）PAGE电泳检测

12％聚丙烯酰胺凝胶的配制：29％丙烯酰胺加1％N，N’-亚甲双烯胺4ml；双蒸水3.93ml，5×TBE2ml；10％过硫酸铵70μl，总体积10ml。

电泳：电泳上样缓冲液为（溴酚蓝+二甲苯胺）6×buffer；点样量为50μl；电泳液为0.5×TBE；电压为100V。

（4）银染

溶液与缓冲液：

3％乙酸（v/v）：3ml乙酸，加入97ml双蒸水混匀；

0.7％硝酸（v/v）：1ml65％浓硝酸，加入99ml双蒸水混匀；

10％乙醇（v/v）：10ml无水乙醇，加入90ml双蒸水混匀；

显影液：2.29g无水碳酸钠，加入90ml双蒸水充分溶解，双蒸水定容至100ml混匀；

0.2％硝酸银溶液（m/v）：0.2g硝酸银，加入90ml双蒸水分溶解，双蒸水定容至100ml。混匀，室温下避光保存。

实验操作：

（a）电泳完毕后，将凝胶和玻璃板一起放入染色盘中，千万不可碰到凝胶的表面；

（b）蒸馏水漂洗两次，凝胶自动脱离玻璃板，这时小心取出玻璃板；

（c）在10％乙醇溶液中进行凝胶固定，在摇床上轻微震荡10min，吸除10％乙醇并重复一次；

（d）吸出乙醇溶液，加入0.7％硝酸溶液至刚好覆盖凝胶，在摇床上轻微震荡6min，洗除硝酸溶液，并用蒸馏水漂洗两次；

（e）加入0.2％硝酸银溶液，至刚好覆盖凝胶表面，在摇床上轻微震荡30min，用蒸馏水漂洗三次凝胶及染色板，每次1min；

（f）在100ml显影液中加入125μl的甲醛溶液，将上述显影液/甲醛溶液加入染色盘中，在非直射光线下（利用锡箔纸盖住染色盘即可），轻微震荡，当溶液变为黄色，条带和背景的信噪比达到最大时，立即加入等体积的3％乙酸溶液终止反应，轻微震荡5min；

（g）吸除混合液，10％乙醇溶液洗涤凝胶，吸除乙醇溶液，将凝胶在新换的10％乙醇溶液中浸泡2min；

（h）吸除乙醇溶液，用蒸馏水漂洗凝胶两次；

（i）用滤纸轻轻吸干凝胶表面水分，拍照保存。

3）TRAP-银染法检测端粒酶活性鉴定结果

Trap-银染法检测细胞克隆h1，h2，h3，h4的Dox⁺组和Dox^-组的端粒酶活性水平，并以未加任何细胞提取液组作为空白对照（排除阳性组PCR污染），以未转染的绵羊胎儿成纤维细胞作为阴性对照，以Hela细胞作为阳性对照。图10中下面一条为36bp的内参对照（本实验所用的

Telomerase Detection Kit，在此试剂盒TRAP primerMix试剂中包含有一Control Template TSK1，在加有Taq DNA Rolymerase反应体系中能以K1primer（也包含在TRAP primer Mix中）和TS primer

Detection Kit中试剂）分别作为上下游引物进行PCR反应，扩增出36bp的内参，排除由于DNA Rolymerase抑制剂造成的假阴性，正常情况下每个反应体系中都能扩出36bp的内参）。从图可以看出相对于空白对照来说，阴性对照和Dox^-组都没有明显的trap产物，而Dox⁺组条带数目及条带亮度有所增加，即端粒酶活性水平有所增加，但亮度与阳性Hela细胞相当。85℃处理Dox⁺组的细胞裂解物使其中的端粒酶失活后，其trap产物在泳道中的条带消失，从而确定了这种Trap-银染法的可靠性。

6、细胞衰老β-半乳糖苷酶染色

细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒（Senescenceβ-Galactosidase Staining Kit）是一种基于衰老时SA-β-Gal（senescence-associatedβ-galactosidase）活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的试剂盒。在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组织的衰老情况。本试剂盒可以用于培养细胞的衰老检测，也可以用于组织切片的衰老检测。

碧云天生产的细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒，以X-Gal为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物。从而在光学显微镜下很容易观察到变成蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞或组织。

1）实验操作步骤（参考碧云天细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒）：

a.对于6孔板中培养的细胞，吸除细胞培养液，用PBS洗涤1次，加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟。对于其它类型的培养板，固定液及后续溶液的用量参照此比例进行操作。

b.吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3分钟。

c.吸除PBS，每孔加入1毫升染色工作液。使用聚丙烯（polypropylene）容器，不能使用聚苯乙烯（polystyrene）容器配制染色工作液。染色工作液的配制方法如下表1。

表1染色工作液的配制方法

β-半乳糖苷酶染色液A	10μl
		β-半乳糖苷酶染色液B	10μl
β-半乳糖苷酶染色液C	930μl
		X-Gal溶液	50μl

d.37℃孵育过夜，可以用保鲜膜封住6孔板防止蒸发。注意：37℃孵育不能在二氧化碳培养箱中进行。

e.普通光学显微镜下观察。如不能及时观察，可以去除染色工作液，加入2毫升PBS，4℃可以保存数天；或者加上封片液封片后，4℃可以保存较长时间。

2）β-半乳糖苷酶染色鉴定结果

分别检测了pTet on-hTERT转染绵羊胎儿成纤维细胞后筛选获得的1，2，3，4，10，11号共6个克隆的Dox⁺，Dox^-，Dox^+-3组细胞的衰老情况，6个克隆的着色情况类似，下面以10号克隆为例加以说明：

如图11所示pTet on-hTERT转染绵羊胎儿成纤维细胞后筛选获得的10号克隆的Dox⁺组细胞传到89代时细胞形态正常，经β-半乳糖苷酶染色后基本没有着色，说明该组细胞还并未出现衰老迹象；Dox^-组细胞的第49代细胞几乎所有的细胞形态都异常，细胞体积变大、形状扁平，并且经β-半乳糖苷酶染色后几乎所有的细胞都被染为深蓝色，说明该组细胞在没有Dox诱导下随着不断的传代培养进入了衰老阶段；Dox^+-组细胞的第89代细胞，大多数体积变大、形状扁平，并且经β-半乳糖苷酶染色后许多细胞被染为蓝色，说明在撤销Dox后随着继续传代培养细胞又进入衰老阶段。

7、软琼脂培养克隆形成试验

1）实验操作步骤：

(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%（体积分数）胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×10⁶细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。

(2)用蒸馏水分别制备出1.2%（1.2g/100ml）和0.7%（0.7g/100ml）两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。

(3)按1:1（体积比）比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基（含有2×抗生素和20%的小牛血清）混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中（10cm平皿加7～10mL），冷却凝固，可作底层琼脂置CO₂温箱中备用。

(4)按1:1（体积比）比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃5%CO₂温箱中培养14天。

2）软琼脂培养克隆形成鉴定结果

A.实验分组

阳性对照组：Hela细胞；

阴性对照组：未转染的绵羊胎儿成纤维细胞（SFF）；

空白对照组：未加细胞；

实验组：pTet on-hTERT转染绵羊胎儿成纤维细胞后筛选获得的1，2，3，4，10，11号克隆的Dox⁺组细胞且分别为传代到p72，p81，p77，p77，p25，p23的细胞。

实验对照组：pTet on-hTERT转染绵羊胎儿成纤维细胞后筛选获得的1，2，3，4，10，11号克隆的Dox^-组细胞且分别为传代到p22，p21，p27，p27，p21，p22的细胞。

B.软琼脂培养克隆形成实验结果及分析：

图12为接种第14天把平皿放置在显微镜下观察到的Hela细胞形成的细胞克隆团，而其它组细胞包括阴性对照组、空白对照组、实验对照组和实验组细胞都没有细胞克隆团形成。说明转染有hTERT基因并且经过连续传代培养获得的寿命延长的细胞没有出现恶性转化。

8、染色体核型分析

1）细胞染色体染色实验操作步骤

(1)取35mm培养皿培养的指数生长期细胞，加20μl（10μg/ml）秋水仙素，使其终浓度为0.1μg/ml，作用6-10h。

(2)低渗：收集细胞于15ml，离心管中，1000rpm离心7min，弃上清，用0.075M KCl溶液在37℃水浴低渗30min。

(3)预固定：再加入等体积4℃预冷的固定液（冰醋酸：甲醇=1:3体积比）混匀，1000rpm离心5min，弃上清；

(4)固定：加入上述固定液5ml并轻轻悬浮细胞，4℃固定40-60min，或者过夜均可。

(5)制片：1000rpm离心5min，弃上清，再用100μl上述固定液重悬细胞，取30μl细胞悬液。

(6)滴于-20℃的载玻片上，并立即用酒精灯烤干。

(7)染色：用吉姆萨母液：PBS（pH7.2)=1:9（体积比），染色10min后，用自来水冲洗掉染液，空气中自然干燥。

(8)镜检：在1000倍油镜下，对伸展完好的中期染色体相计数。

(9)对典型的中期染色体拍照，进行组型分析。

2）染色体核型分析结果

分别制备了Tet on-hTERT转染绵羊胎儿成纤维细胞后筛选获得的1，2，3，4，10，11号克隆的Dox⁺组细胞分别传代到p72，p81，p77，p78，p30，p28的6组细胞的中期染色体标本；6组细胞的中期染色体标本与绵样体细胞中期染色体标本一样为27对54条染色体，如图13所示。染色体倍性分析表明Tet on-hTERT转染绵羊胎儿成纤维细胞获得的阳性细胞克隆在Dox诱导下寿命延长后细胞染色体倍性并没有发生显著变化。

Claims (10)

1.环形载体A，含有大肠杆菌复制起始区、氨苄青霉素抗性基因，以及表达盒1和表达盒2，其特征在于：所述表达盒1从上游到下游依次包括如下元件：P_tight、hTERT、IVS、IRES、Hyg^r和SV40polyA；所述表达盒2从上游到下游依次包括如下元件：P_CMV、rtTA-Advanced和SV40polyA。

2.根据权利要求1所述的环形载体A，其特征在于：所述大肠杆菌复制起始区的序列为序列表中序列1的第7611-8254位；所述氨苄青霉素抗性基因的序列为序列表中序列1的第6604-7466位；和/或

在所述表达盒1中，所述P_tight由TRE_mod和P_minCMV△组成；所述TRE_mod的序列如序列表中序列1的第2-251位所示；所述P_minCMV△的序列如序列表中序列1的第257-316位所示；所述hTERT的序列如序列表中序列1的第373-3829位所示；所述IVS的序列如序列表中序列1的第3892-4177位所示；所述IRES的序列如序列表中序列1的第4223-4814位所示；所述Hygr的序列如序列表中序列1的第4838-5869位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列1的第6199-6399位所示；和/或

在所述表达盒2中，所述P_CMV的序列如序列表中序列1的第10512-9921位所示；所述rtTA-Advanced的序列如序列表中序列1的第9823-9077位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列1的第9054-8621位所示。

3.根据权利要求1或2所述的环形载体A，其特征在于：所述表达盒1的核苷酸序列为序列表中序列1的第2-6399位；和/或

所述表达盒2的核苷酸序列为序列表中序列1的第10512-8621位。

4.根据权利要求1-3中任一所述的环形载体A，其特征在于：所述环形载体A的核苷酸序列为序列表中序列1。

5.权利要求1-4中任一所述的环形载体A的制备方法，包括如下步骤：

（1）用XhoⅠ酶切pTet-On Advanced质粒，回收4.2kb片段；用XhoⅠ酶切pTRE-Tight质粒，回收0.6kb片段；将所述4.2kb片段与所述0.6kb片段反向连接，得到重组载体，记作pTet-On Tight；

（2）用XbaⅠ和NheⅠ酶切pIREShyg3质粒，回收2.3kb片段；用NheⅠ酶切所述pTet-On Tight，回收线性载体骨架片段，记为片段A；将所述2.3kb片段与所述片段A正向连接，得到重组载体，记作pTet-On IREShyg；

（3）用EcoRⅠ酶切pLPC-hTERT质粒，回收3.4kb片段；将所述3.4kb片段的末端补平，得到平齐末端片段；用Eco47Ⅲ酶切所述pTet-On IREShyg，回收线性载体骨架片段，记为片段B；将所述平齐末端片段与所述片段B正向连接，得到重组载体，记作pTet-On hTERT；所述pTet-On hTERT即为权利要求1-4中任一所述的环形载体A。

6.权利要求1-4中任一所述的环形载体A在诱导动物体外细胞可逆永生化中的应用。

7.用于诱导动物体外细胞可逆永生化的组合物，由权利要求1-4中任一所述的环形载体A和强力霉素组成。

8.环形载体B，为权利要求1-4中任一所述的环形载体A缺失权利要求1-4中任一所述的hTERT后形成的环形载体。

9.权利要求8所述的环形载体B的制备方法，包括如下步骤：

（1）用XhoⅠ酶切pTet-On Advanced质粒，回收4.2kb片段；用XhoⅠ酶切pTRE-Tight质粒，回收0.6kb片段；将所述4.2kb片段与所述0.6kb片段反向连接，得到重组载体，记作pTet-On Tight；

（2）用XbaⅠ和NheⅠ酶切pIREShyg3质粒，回收2.3kb片段；用NheⅠ酶切所述pTet-On Tight，回收线性载体骨架片段，记为片段A；将所述2.3kb片段与所述片段A正向连接，得到重组载体，记作pTet-On IREShyg；所述pTet-On IREShyg即为权利要求8所述的环形载体B。

10.在动物体外细胞中，用于控制外源目的基因表达的组合物，由权利要求8所述的环形载体B和强力霉素组成。

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