CN109750064A - 一种检测gata-3转录因子活性的报告基因载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学，具体的是一种检测GATA‑3转录因子活性的报告基因载体及其应用。报告基因载体含有GATA‑3和TATA‑box特异性顺式作用元件。本发明所设计的报告基因载体易于制备,表达的荧光素酶为外分泌型，无需细胞裂解液，检测过程操作简单，可有效转染真核动物细胞，包括鱼类和哺乳动物细胞系，重复性好，适用于体外研究GATA‑3转录因子在各种真核细胞中的生物学活性。

Description

一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学，具体的是一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体及其应用。

背景技术

GATA-3是辅助性T细胞2(Th2)的标志性转录因子，属于六个GATA基因家族(GATA-1到GATA-6)中的一员，拥有保守的DNA绑定功能区，能够绑定染色体GATA位点，所以被称为GATA家族。辅助性T细胞通过表达的细胞因子之间的相互作用产生免疫应答，Th2细胞通常表达IL-4，IL-13和IL-5细胞因子，而这些细胞因子在Th1细胞亚群中不表达。GATA-3基因拥有N端的转录功能区域和两个锌指结构，分别是N-端锌指结构和C-端锌指结构，C-端锌指结构具有DNA结合的功能而N-端锌指结构是稳定这个结合及与其他锌指结构蛋白反应。在整个的GATA蛋白家族GATA-3C-端区域具有较高的保守性，在接近C-端的锌指结构附近有氨基酸序列YxKxHxxxRP,具有GATA-3与DNA的结合功能，包括转录活性的能力，诱导Th2细胞因子的表达，从而促进Th2细胞分化的基因重组。通常在T细胞受体接收到特异性刺激信号后，GATA-3的表达量升高，更多的GATA-3蛋白绑定到细胞因子基因群的调节区域包括IL-4、IL-13和IL-5，加速CD4+细胞向Th2分化。最近研究表明GATA-3不仅仅参与免疫系统中T细胞亚群的分化，而且控制着一些乳腺细胞的存活及记忆的功能，是乳腺癌的一个标志性的应答因子。在哺乳动物的研究中，GATA-3还行使有一些关于毛发，皮肤，脂肪及神经系统的发育功能。此外，GATA-3能够激活自身的基因，从而促进自身的表达，形成一种良性的循环，IL-4可以通过自分泌和旁分泌的方式激活STAT6，从而促进GATA-3的表达。

在免疫系统中,GATA-3在未分化的T细胞表达量很低，通过免疫蛋白印迹(Western-blot)及凝胶迁移实验(EMSA)无法检测到低丰度样本中的GATA-3蛋白。此外，GATA-3已经在多种动物中被鉴定出来，包括哺乳动物、鸟类、鱼类及无脊椎动物。但是GATA-3存在多个剪切体、部分剪切体拥有DNA绑定功能域,但是缺乏转录功能，通过免疫蛋白印迹(Western-blot)及凝胶迁移实验(EMSA)无法反映真正行使转录功能GATA-3。

发明内容

本发明目的在于提供一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体，报告基因载体含有GATA-3和TATA-box特异性顺式作用元件。

所述报告基因载体中含有多个GATA-3特异性顺式作用元件串联组成，每个GATA-3特异性顺式作用元件两端分别加入gc和cct，其中，每个GATA-3特异性顺式作用元件由agataga核苷酸序列组成。

所述报告基因载体中，在荧光素酶表达的启动子区域含有4个GATA-3特异性顺式作用元件串联组成。

所述报告基因载体中在4个GATA-3串联形成的特异性顺式作用元件的3’端接入一个TATA-box元件。

其中，每个GATA-3作用元件为“agataga”，每个agataga两端分别加入gc和cct作为保护核苷酸，TATA-box顺式作用元件可以强化转录活性，使检测的灵敏度提高；同时该载体含有卡那霉素和新霉素抗性的基因，可以用于在细菌和细胞中筛选阳性克隆。

一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体的应用，所述报告基因载体在检测GATA-3转录因子活性中的应用。

所述报告基因载体在体外检测GATA-3转录因子在真核细胞中的生物学活性中的应用。

所述报告基因载体在指示经外界刺激物刺激后GATA-3表达中的应用。

本发明所具有的优点：

本发明报告基因载体易于制备,表达的荧光素酶为外分泌型，无需细胞裂解液，检测过程操作简单，可有效转染真核动物细胞，包括鱼类和哺乳动物细胞系，重复性好，可以排除不行使转录功能的GATA-3剪切体的干扰，适用于体外研究GATA-3转录因子在各种真核细胞中的生物学活性的。

附图说明

图1为本发明实施例提供的pLuc-GATA-3报告基因载体结构示意图，其中，荧光素酶启动子区域：46-167；荧光素酶表达区域：218-874；SV40polyA信号：1020-1035；1059-1064；f1复制起点：1127-182(互补)；PKanr(卡那霉素基因启动子)：1644-1672；PSV40e(SV40启动子)：1756-1984；SV40复制起点：1923-2061；Tn5卡那霉素/新霉素抗性基因：2107-2901pUC复制起点：3486-4129。

图2为本发明实施例提供的pLuc-GATA-3载体纯化后凝胶电泳图；其中，1：为pLuc-GATA-3载体；M：核酸分子标准；右侧为分子标准条带大小。

图3为本发明实施例提供的CHSE-214细胞转染pTag-RFP载体观察转染效率图；其中，转染后48小时，多聚甲醛固定DAPI衬染后荧光显微镜下观察，转染效率约5.34％。其中，图片A红色为转染成功并表达红色荧光蛋白的细胞；图片B蓝色为DAPI衬染细胞核(指示所有细胞)；图片C为图片A和B的重合图。

图4为本发明实施例提供的鱼类GATA-3蛋白对pLuc-GATA-3的调控效果图，其中，大西洋鲑(Atlantic salmon)或大西洋鳕鱼(Antlanticcod)GATA-3表达载体分别与pLuc-GATA-3报告基因载体共转染到CHSE-214细胞后48小时，取上清培养液化学发光方法检测荧光素酶表达情况，Mock：未转染细胞组；Control：pTagRFP-N与pLuc-GATA-3共转染组；Salmon GATA-3：大西洋鲑GATA-3表达载体与pLuc-GATA-3共转染组；Cod GATA-3：大西洋鳕鱼GATA-3与pLuc-GATA-3共转染组。

图5为本发明实施例提供的PMA刺激对pLuc-GATA-3的调控效果图；其中，pLuc-GATA-3报告基因载体转染到CHSE-214细胞后48小时，取上清培养液化学发光方法检测荧光素酶表达情况，Mock：未转染细胞组；Control：pLuc-GATA-3转染组；PMA：pLuc-GATA-3转染后佛波酯刺激组。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步解释说明。

实施例1

报告基因载体的构建

1)DNA单链的合成。

分别经由Sigma公司合成含有4个GATA-3特异性顺式作用元件(agataaga)及TATA-box的核苷酸序列(TATATAA)正反双链(元件指示参见图1)，序列两端含有HindIII和SacII的酶切位点。

正链(序列1):

AGCTGCAGATAAGACCTGCAGATAAGACCTGCAGATAAGACCTGCAGATAAGACCTAGATCTAGACTCTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGAATTCCAGCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAAAGC

反链(序列2):

TTTTACCAACAGTACCGGAATGCCAAGCTGGAATTCGAGCTTCCATTATATACCCTCTAGAGTCTAGATCTAGGTCTTATCTGCAGGTCTTATCTGCAGGTCTTATCTGCAGGTC

2)通过退火程序形成DNA双链：

利用ThermoFisher公司PCR反应缓冲液F-501以及上述获得序列配制退火反应体系(F-501：10μl；序列1：10nM；序列2：10nM；使用双蒸水将体系补足到100μl)反应程序:95℃5分钟，80℃5分钟，75℃5分钟，65℃5分钟，60℃5分钟，55℃5分钟，50℃5分钟，45℃5分钟，40℃5分钟，35℃5分钟，30℃分钟。形成双链后，4℃暂时存放等待下一步实验。

3)载体酶切及连接

将带有Metridia荧光素酶的报告基因载体(pMet-Luc)进行HindIII和SacII双酶切,(酶切体系参照NEB公司相关产品说明)，酶切结束后，通过琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化酶切产物。与上述退火形成的DNA双链定向连接(连接体系10μl：DNA双链3μl，酶切质粒1μl，DNA连接酶1μl，16℃过夜)，将上述元件插入到荧光素酶表达基因游的启动区域。连接产物转化到Top10感受态大肠杆菌(Invitrogen公司)，涂布于含有50μg/ml卡那霉素的固体LB平板，37℃孵育过夜。

而后以引物1(序列:CACGATGTCGATGTTGGGG)和引物2(序列:

AGCTAAGATAAATGCAAG),通过菌落PCR进行筛选阳性菌落(PCR体系：10×PCR反应液1μl，10ng/μl的上下游引物各0.5μl，菌落做模板，加水至10μl；PCR反应程序：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃10s，30个循环)。将阳性菌落转入含卡那霉素的液体LB培养基，37℃振荡培养箱培养箱中200r/min培养过夜，Qiagen抽试剂盒提取质粒，获得纯化pLuc-GATA-3载体(参见图1)，1％琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提情况(参见图2),Nano-drop检测质粒浓度,将质粒送专业测序公司进行测序验证,插入片段与原设计序列完全一致，即获得重组的pLuc-GATA-3报告基因载体。

实施例2

利用pLuc-GATA-3报告基因载体通过共转染技术检测GATA-3蛋白的活性。

鲑鱼胚胎细胞系(CHSE-214)接种到细胞培养瓶(Nunc)中，用含有青霉素(60μgml^-1)和链霉素(100μg ml^-1),1％非必须氨基酸(NEAA,Gibco)和10％胎牛血清(FCS)的L-15(Invitrogen公司)细胞培养液培养细胞。细胞在20℃培养箱中培养一个星期后，细胞用10ml磷酸缓冲液(PBS)洗涤2次,加入1.5ml(1.25％)胰蛋白酶，消化约5分钟后，细胞用L-15培养液(含8％FCS,1％NEAA)重悬后计数。细胞分成4组，每组转染6个重复。

每组细胞转染方法如下：将2x10⁵个上述获得的细胞与300ng pTagRFP-N、大西洋鲑GATA-3蛋白表达载体pAs-GATA-3或大西洋鲑pAc-GATA-3蛋白表达载体pGATA-3分别与50ng上述获得的pLuc-GATA-3-报告基因载体和20ng pSEAP2-control(Clontech)对照报告基因载体连接，而后分别转染到CHSE-214细胞中(Neon Transfection System 10μl转染试剂盒Invitrogen)。转染后的CHSE-214细胞接种到含有L-15细胞培养液(8％FCS,1％NEAA)的24孔板中，细胞浓度保持在2x10⁵细胞/孔，未转染细胞作为空白对照。此外，设计pTagRFP-N载体转染CHSE-214细胞，统计转染效率。12小时候后，弃旧培养液，细胞用PBS洗涤一次，然后加入新鲜的L-15培养液(含8％FCS,1％NEAA)。48h后，将转染pTagRFP-N载体的细胞用4％的多聚甲醛固定，DAPI衬染细胞核，倒置荧光显微镜下观察拍照(参见图3)。同时收集共转染细胞组的培养液，分别检测其中的荧光素酶和磷酸酶的活性，进而通过荧光素酶和磷酸酶的比值(Luc/Seap)计算荧光素酶的相对表达量，指示细胞中GATA-3蛋白含量及其活性。(参见图4)。

由图3可见通过转染荧光标签蛋白载体(pTagRFP-N)，检测细胞的转染效率约为5.34％。由图4可见利用磷酸酶作为内参，矫正转染效率产生的误差后，在所有的pLuc-GATA-3载体转染的细胞中，48小时后，荧光素酶的相对表达量都显著的高于空白对照的细胞组(P<0.05)，大西洋鲑和大西洋鳕GATA-3表达载体共转染后均可提高荧光素酶的表达且差异显著(P<0.05)。该两种鱼类的GATA-3蛋白表达载体在调控pLuc-GATA-3报告基因载体没有明显差异(P<0.05)。以上结果说明，pLuc-GATA-3报告基因载体可以特异性的检测GATA-3的转录活性。

实施例3

PMA刺激对pLuc-GATA-3报告基因载体表达的影响：

按实施例2中的转染方法，将pLuc-GATA-3报告基因载体和pSEAP-control报告基因载体转染到CHSE-214细胞中，接种于24孔细胞培养板中，试验设置空白组(未转染载体)、转染后未刺激组和转染后刺激组，12小时后弃细胞培养液，用PBS洗涤细胞一次，加入新鲜L-15培养基(含8％FCS,1％NEAA)，转染后刺激组在每孔中加入50ng的PMA(佛波酯)进行刺激(参见图5)，由图5可见PMA刺激48小时后，荧光素酶的表达量明显升高，根据已有报道，PMA可以激活T细胞，促使CD4+T细胞向辅助性T细胞II型(Th2cells，GATA-3为标志性转录因子)分化。进而可以说明本发明所得pLuc-GATA-3报告基因载体可以应用于指示经刺激物刺激后GATA-3表达情况。

序列表

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 129

<212> DNA

<213> 大西洋鲑鱼(Salmo salar)

<400> 1

agctgcagat aagacctgca gataagacct gcagataaga cctgcagata agacctagat 60

ctagactcta gagggtatat aatggaagct cgaattccag cttggcattc cggtactgtt 120

ggtaaaagc 129

<210> 2

<211> 115

<212> DNA

<213> 大西洋鲑鱼(Salmo salar)

<400> 2

ttttaccaac agtaccggaa tgccaagctg gaattcgagc ttccattata taccctctag 60

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Claims (7)

1.一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体，其特征在于：报告基因载体含有GATA-3和TATA-box特异性顺式作用元件。

2.按权利要求1所述的检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体，其特征在于：所述报告基因载体中含有多个GATA-3特异性顺式作用元件串联组成，每个GATA-3特异性顺式作用元件两端分别加入gc和cct，其中，每个GATA-3特异性顺式作用元件由agataga核苷酸序列组成。

3.按权利要求2所述的检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体，其特征在于：所述报告基因载体中含有4个GATA-3特异性顺式作用元件串联组成。

4.按权利要求1-3任意一项所述的检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体，其特征在于：所述报告基因载体中在4个GATA-3串联形成的特异性顺式作用元件的3’端接入一个TATA-box元件。

5.一种权利要求1所述的检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体的应用，其特征在于：所述报告基因载体在检测GATA-3转录因子活性中的应用。

6.按权利要求5所述的检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体的应用，其特征在于：所述报告基因载体在体外检测GATA-3转录因子在真核细胞中的生物学活性中的应用。

7.按权利要求5所述的检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体的应用，其特征在于：所述报告基因载体在指示经外界刺激物刺激后GATA-3表达中的应用。