CN109750064A - 一种检测gata-3转录因子活性的报告基因载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学,具体的是一种检测GATA‑3转录因子活性的报告基因载体及其应用。报告基因载体含有GATA‑3和TATA‑box特异性顺式作用元件。本发明所设计的报告基因载体易于制备,表达的荧光素酶为外分泌型,无需细胞裂解液,检测过程操作简单,可有效转染真核动物细胞,包括鱼类和哺乳动物细胞系,重复性好,适用于体外研究GATA‑3转录因子在各种真核细胞中的生物学活性。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学,具体的是一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体及其应用。
背景技术
GATA-3是辅助性T细胞2(Th2)的标志性转录因子,属于六个GATA基因家族(GATA-1到GATA-6)中的一员,拥有保守的DNA绑定功能区,能够绑定染色体GATA位点,所以被称为GATA家族。辅助性T细胞通过表达的细胞因子之间的相互作用产生免疫应答,Th2细胞通常表达IL-4,IL-13和IL-5细胞因子,而这些细胞因子在Th1细胞亚群中不表达。GATA-3基因拥有N端的转录功能区域和两个锌指结构,分别是N-端锌指结构和C-端锌指结构,C-端锌指结构具有DNA结合的功能而N-端锌指结构是稳定这个结合及与其他锌指结构蛋白反应。在整个的GATA蛋白家族GATA-3C-端区域具有较高的保守性,在接近C-端的锌指结构附近有氨基酸序列YxKxHxxxRP,具有GATA-3与DNA的结合功能,包括转录活性的能力,诱导Th2细胞因子的表达,从而促进Th2细胞分化的基因重组。通常在T细胞受体接收到特异性刺激信号后,GATA-3的表达量升高,更多的GATA-3蛋白绑定到细胞因子基因群的调节区域包括IL-4、IL-13和IL-5,加速CD4+细胞向Th2分化。最近研究表明GATA-3不仅仅参与免疫系统中T细胞亚群的分化,而且控制着一些乳腺细胞的存活及记忆的功能,是乳腺癌的一个标志性的应答因子。在哺乳动物的研究中,GATA-3还行使有一些关于毛发,皮肤,脂肪及神经系统的发育功能。此外,GATA-3能够激活自身的基因,从而促进自身的表达,形成一种良性的循环,IL-4可以通过自分泌和旁分泌的方式激活STAT6,从而促进GATA-3的表达。
在免疫系统中,GATA-3在未分化的T细胞表达量很低,通过免疫蛋白印迹(Western-blot)及凝胶迁移实验(EMSA)无法检测到低丰度样本中的GATA-3蛋白。此外,GATA-3已经在多种动物中被鉴定出来,包括哺乳动物、鸟类、鱼类及无脊椎动物。但是GATA-3存在多个剪切体、部分剪切体拥有DNA绑定功能域,但是缺乏转录功能,通过免疫蛋白印迹(Western-blot)及凝胶迁移实验(EMSA)无法反映真正行使转录功能GATA-3。
发明内容
本发明目的在于提供一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体及其应用。
为实现上述目的,本发明采用技术方案为:
一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体,报告基因载体含有GATA-3和TATA-box特异性顺式作用元件。
所述报告基因载体中含有多个GATA-3特异性顺式作用元件串联组成,每个GATA-3特异性顺式作用元件两端分别加入gc和cct,其中,每个GATA-3特异性顺式作用元件由agataga核苷酸序列组成。
所述报告基因载体中,在荧光素酶表达的启动子区域含有4个GATA-3特异性顺式作用元件串联组成。
所述报告基因载体中在4个GATA-3串联形成的特异性顺式作用元件的3’端接入一个TATA-box元件。
其中,每个GATA-3作用元件为“agataga”,每个agataga两端分别加入gc和cct作为保护核苷酸,TATA-box顺式作用元件可以强化转录活性,使检测的灵敏度提高;同时该载体含有卡那霉素和新霉素抗性的基因,可以用于在细菌和细胞中筛选阳性克隆。
一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体的应用,所述报告基因载体在检测GATA-3转录因子活性中的应用。
所述报告基因载体在体外检测GATA-3转录因子在真核细胞中的生物学活性中的应用。
所述报告基因载体在指示经外界刺激物刺激后GATA-3表达中的应用。
本发明所具有的优点:
本发明报告基因载体易于制备,表达的荧光素酶为外分泌型,无需细胞裂解液,检测过程操作简单,可有效转染真核动物细胞,包括鱼类和哺乳动物细胞系,重复性好,可以排除不行使转录功能的GATA-3剪切体的干扰,适用于体外研究GATA-3转录因子在各种真核细胞中的生物学活性的。
附图说明
图1为本发明实施例提供的pLuc-GATA-3报告基因载体结构示意图,其中,荧光素酶启动子区域:46-167;荧光素酶表达区域:218-874;SV40polyA信号:1020-1035;1059-1064;f1复制起点:1127-182(互补);PKanr(卡那霉素基因启动子):1644-1672;PSV40e(SV40启动子):1756-1984;SV40复制起点:1923-2061;Tn5卡那霉素/新霉素抗性基因:2107-2901pUC复制起点:3486-4129。
图2为本发明实施例提供的pLuc-GATA-3载体纯化后凝胶电泳图;其中,1:为pLuc-GATA-3载体;M:核酸分子标准;右侧为分子标准条带大小。
图3为本发明实施例提供的CHSE-214细胞转染pTag-RFP载体观察转染效率图;其中,转染后48小时,多聚甲醛固定DAPI衬染后荧光显微镜下观察,转染效率约5.34%。其中,图片A红色为转染成功并表达红色荧光蛋白的细胞;图片B蓝色为DAPI衬染细胞核(指示所有细胞);图片C为图片A和B的重合图。
图4为本发明实施例提供的鱼类GATA-3蛋白对pLuc-GATA-3的调控效果图,其中,大西洋鲑(Atlantic salmon)或大西洋鳕鱼(Antlanticcod)GATA-3表达载体分别与pLuc-GATA-3报告基因载体共转染到CHSE-214细胞后48小时,取上清培养液化学发光方法检测荧光素酶表达情况,Mock:未转染细胞组;Control:pTagRFP-N与pLuc-GATA-3共转染组;Salmon GATA-3:大西洋鲑GATA-3表达载体与pLuc-GATA-3共转染组;Cod GATA-3:大西洋鳕鱼GATA-3与pLuc-GATA-3共转染组。
图5为本发明实施例提供的PMA刺激对pLuc-GATA-3的调控效果图;其中,pLuc-GATA-3报告基因载体转染到CHSE-214细胞后48小时,取上清培养液化学发光方法检测荧光素酶表达情况,Mock:未转染细胞组;Control:pLuc-GATA-3转染组;PMA:pLuc-GATA-3转染后佛波酯刺激组。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步解释说明。
实施例1
报告基因载体的构建
1)DNA单链的合成。
分别经由Sigma公司合成含有4个GATA-3特异性顺式作用元件(agataaga)及TATA-box的核苷酸序列(TATATAA)正反双链(元件指示参见图1),序列两端含有HindIII和SacII的酶切位点。
正链(序列1):
AGCTGCAGATAAGACCTGCAGATAAGACCTGCAGATAAGACCTGCAGATAAGACCTAGATCTAGACTCTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGAATTCCAGCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAAAGC
反链(序列2):
TTTTACCAACAGTACCGGAATGCCAAGCTGGAATTCGAGCTTCCATTATATACCCTCTAGAGTCTAGATCTAGGTCTTATCTGCAGGTCTTATCTGCAGGTCTTATCTGCAGGTC
2)通过退火程序形成DNA双链:
利用ThermoFisher公司PCR反应缓冲液F-501以及上述获得序列配制退火反应体系(F-501:10μl;序列1:10nM;序列2:10nM;使用双蒸水将体系补足到100μl)反应程序:95℃5分钟,80℃5分钟,75℃5分钟,65℃5分钟,60℃5分钟,55℃5分钟,50℃5分钟,45℃5分钟,40℃5分钟,35℃5分钟,30℃分钟。形成双链后,4℃暂时存放等待下一步实验。
3)载体酶切及连接
将带有Metridia荧光素酶的报告基因载体(pMet-Luc)进行HindIII和SacII双酶切,(酶切体系参照NEB公司相关产品说明),酶切结束后,通过琼脂糖凝胶电泳,切胶回收纯化酶切产物。与上述退火形成的DNA双链定向连接(连接体系10μl:DNA双链3μl,酶切质粒1μl,DNA连接酶1μl,16℃过夜),将上述元件插入到荧光素酶表达基因游的启动区域。连接产物转化到Top10感受态大肠杆菌(Invitrogen公司),涂布于含有50μg/ml卡那霉素的固体LB平板,37℃孵育过夜。
而后以引物1(序列:CACGATGTCGATGTTGGGG)和引物2(序列:
AGCTAAGATAAATGCAAG),通过菌落PCR进行筛选阳性菌落(PCR体系:10×PCR反应液1μl,10ng/μl的上下游引物各0.5μl,菌落做模板,加水至10μl;PCR反应程序:95℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃10s,30个循环)。将阳性菌落转入含卡那霉素的液体LB培养基,37℃振荡培养箱培养箱中200r/min培养过夜,Qiagen抽试剂盒提取质粒,获得纯化pLuc-GATA-3载体(参见图1),1%琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提情况(参见图2),Nano-drop检测质粒浓度,将质粒送专业测序公司进行测序验证,插入片段与原设计序列完全一致,即获得重组的pLuc-GATA-3报告基因载体。
实施例2
利用pLuc-GATA-3报告基因载体通过共转染技术检测GATA-3蛋白的活性。
鲑鱼胚胎细胞系(CHSE-214)接种到细胞培养瓶(Nunc)中,用含有青霉素(60μgml-1)和链霉素(100μg ml-1),1%非必须氨基酸(NEAA,Gibco)和10%胎牛血清(FCS)的L-15(Invitrogen公司)细胞培养液培养细胞。细胞在20℃培养箱中培养一个星期后,细胞用10ml磷酸缓冲液(PBS)洗涤2次,加入1.5ml(1.25%)胰蛋白酶,消化约5分钟后,细胞用L-15培养液(含8%FCS,1%NEAA)重悬后计数。细胞分成4组,每组转染6个重复。
每组细胞转染方法如下:将2x105个上述获得的细胞与300ng pTagRFP-N、大西洋鲑GATA-3蛋白表达载体pAs-GATA-3或大西洋鲑pAc-GATA-3蛋白表达载体pGATA-3分别与50ng上述获得的pLuc-GATA-3-报告基因载体和20ng pSEAP2-control(Clontech)对照报告基因载体连接,而后分别转染到CHSE-214细胞中(Neon Transfection System 10μl转染试剂盒Invitrogen)。转染后的CHSE-214细胞接种到含有L-15细胞培养液(8%FCS,1%NEAA)的24孔板中,细胞浓度保持在2x105细胞/孔,未转染细胞作为空白对照。此外,设计pTagRFP-N载体转染CHSE-214细胞,统计转染效率。12小时候后,弃旧培养液,细胞用PBS洗涤一次,然后加入新鲜的L-15培养液(含8%FCS,1%NEAA)。48h后,将转染pTagRFP-N载体的细胞用4%的多聚甲醛固定,DAPI衬染细胞核,倒置荧光显微镜下观察拍照(参见图3)。同时收集共转染细胞组的培养液,分别检测其中的荧光素酶和磷酸酶的活性,进而通过荧光素酶和磷酸酶的比值(Luc/Seap)计算荧光素酶的相对表达量,指示细胞中GATA-3蛋白含量及其活性。(参见图4)。
由图3可见通过转染荧光标签蛋白载体(pTagRFP-N),检测细胞的转染效率约为5.34%。由图4可见利用磷酸酶作为内参,矫正转染效率产生的误差后,在所有的pLuc-GATA-3载体转染的细胞中,48小时后,荧光素酶的相对表达量都显著的高于空白对照的细胞组(P<0.05),大西洋鲑和大西洋鳕GATA-3表达载体共转染后均可提高荧光素酶的表达且差异显著(P<0.05)。该两种鱼类的GATA-3蛋白表达载体在调控pLuc-GATA-3报告基因载体没有明显差异(P<0.05)。以上结果说明,pLuc-GATA-3报告基因载体可以特异性的检测GATA-3的转录活性。
实施例3
PMA刺激对pLuc-GATA-3报告基因载体表达的影响:
按实施例2中的转染方法,将pLuc-GATA-3报告基因载体和pSEAP-control报告基因载体转染到CHSE-214细胞中,接种于24孔细胞培养板中,试验设置空白组(未转染载体)、转染后未刺激组和转染后刺激组,12小时后弃细胞培养液,用PBS洗涤细胞一次,加入新鲜L-15培养基(含8%FCS,1%NEAA),转染后刺激组在每孔中加入50ng的PMA(佛波酯)进行刺激(参见图5),由图5可见PMA刺激48小时后,荧光素酶的表达量明显升高,根据已有报道,PMA可以激活T细胞,促使CD4+T细胞向辅助性T细胞II型(Th2cells,GATA-3为标志性转录因子)分化。进而可以说明本发明所得pLuc-GATA-3报告基因载体可以应用于指示经刺激物刺激后GATA-3表达情况。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 129
<212> DNA
<213> 大西洋鲑鱼(Salmo salar)
<400> 1
agctgcagat aagacctgca gataagacct gcagataaga cctgcagata agacctagat 60
ctagactcta gagggtatat aatggaagct cgaattccag cttggcattc cggtactgtt 120
ggtaaaagc 129
<210> 2
<211> 115
<212> DNA
<213> 大西洋鲑鱼(Salmo salar)
<400> 2
ttttaccaac agtaccggaa tgccaagctg gaattcgagc ttccattata taccctctag 60
agtctagatc taggtcttat ctgcaggtct tatctgcagg tcttatctgc aggtc 115
Claims (7)
1.一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体,其特征在于:报告基因载体含有GATA-3和TATA-box特异性顺式作用元件。
2.按权利要求1所述的检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体,其特征在于:所述报告基因载体中含有多个GATA-3特异性顺式作用元件串联组成,每个GATA-3特异性顺式作用元件两端分别加入gc和cct,其中,每个GATA-3特异性顺式作用元件由agataga核苷酸序列组成。
3.按权利要求2所述的检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体,其特征在于:所述报告基因载体中含有4个GATA-3特异性顺式作用元件串联组成。
4.按权利要求1-3任意一项所述的检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体,其特征在于:所述报告基因载体中在4个GATA-3串联形成的特异性顺式作用元件的3’端接入一个TATA-box元件。
5.一种权利要求1所述的检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体的应用,其特征在于:所述报告基因载体在检测GATA-3转录因子活性中的应用。
6.按权利要求5所述的检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体的应用,其特征在于:所述报告基因载体在体外检测GATA-3转录因子在真核细胞中的生物学活性中的应用。
7.按权利要求5所述的检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体的应用,其特征在于:所述报告基因载体在指示经外界刺激物刺激后GATA-3表达中的应用。
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