CN106701806A - 评估中药和/或天然药物效能的系列转录因子报告基因系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了评估中药和/或天然药物效能的系列转录因子报告基因系统及其应用。本发明所提供的检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的成套载体，由N种报告基因表达载体组成，N种报告基因表达载体中每种报告基因表达载体均携带一种转录因子的顺式作用元件；N种报告基因表达载体间的区别仅在于所携带的转录因子的顺式作用元件不同；N种报告基因表达载体均为质粒a；N为大于等于2的一个自然数。本发明可用于定量检测中药及其他天然药物对于不同通路中的关键转录因子的影响，进而判断其对不同通路的影响，从分子水平的角度解释中药及其他天然药物的作用机制，为现有中药及其他天然药物的作用机制不明确、靶点多样性的问题提供解决方案。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术应用领域中评估中药和/或天然药物效能的系列转录因子报告基因系统及其应用。
背景技术
中医药是中华民族传统优秀文化的重要组成部分，历经几千年的传承与发展，已形成了其独特的理论体系及科学的思维方法，其确切的疗效早已被长期的临床实践所验证；另外，与中医药有着密切联系的天然药物在十八世纪以前一直在人类的疾病治疗中扮演主要角色，可以说是伴随着人类社会存在而存在的。随着现代医学及化学制药工业的迅速发展，西药以其起效快、作用机制明确等优点逐渐占据主流市场。而传统医药则大多数情况下成了人们在西医西药无法治疗情况下的“替补”。在传统医药与现代医药的这场较量中，拥有悠久历史及丰富资源的中药及其他天然药物并未保住其历史地位，这其中很重要的一条原因就是其起效成分、治病机理不明确，导致其难以被大部分人认可。因此，研究清楚中药及其他天然药物的起效成分、作用机制非常重要，是中药及天然药物现代化发展的重要必经环节。然而中药等自身成分的复杂性及其作用靶点的不确定性为其确切作用机制的研究带来了巨大困难，其研究进展一直很缓慢。
报告基因(Reporter gene)是一种编码易于被检测的蛋白质或酶的基因。该基因序列可以插入到基因表达调节序列(如启动子、增强子)之后形成嵌合基因，或与其他目的基因序列相连接形成融合蛋白的基因序列，进而通过检测该报告基因的表达来定性或定量测定目的基因的表达情况。常用的报告基因有氯霉素转乙酰酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶以及荧光蛋白等。转录因子(transcription factor)是一群能与基因5`端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。顺式作用元件是指与结构基因串联的特定DNA序列，是转录因子的结合位点，它们通过与转录因子结合而调控基因转录的精确起始和转录效率。
本申请的发明人刘长振等(郭志兰,车路阳,李晶哲,等.NF-κB荧光素酶报告基因系统的构建及验证.生物工程学报,2016,32(10):1465–1473)为了定量检测NF-κB的活化效果及筛选与NF-κB活化调控相关的药物，通过去除逆转录病毒载体pQCXIP原有的CMV启动子，并分别插入NF-κB增强子序列及荧光素酶NanoLuc报告基因序列，构建了一种新的含有NF-κB增强子序列和NanoLuc(NLuc)报告基因序列的表达载体pQCXIP-NF-κB-NLuc，但是pQCXIP-NF-κB-NLuc与pVSV-G病毒包装质粒侵染GP2-293细胞得到的病毒转染HeLa后，得到的稳定表达克隆较少。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是如何检测中药和/或天然药物的起效成分(有效成分或活性成分)和/或中药和/或天然药物的作用机制。
本发明中，天然药物是指动物、植物和矿物等自然界中存在的有药理活性的天然产物；中药是在中医药学理论指导下应用的,具有治疗和/或保健作用的药物，包括中药材、中药饮片、中药提取物和中成药。
为解决上述技术问题，本发明提供了检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的成套载体。
本发明所提供的检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的成套载体，由N种报告基因表达载体组成，所述N种报告基因表达载体中每种报告基因表达载体均携带一种转录因子的顺式作用元件；所述N种报告基因表达载体间的区别仅在于所携带的转录因子的顺式作用元件不同；所述N种报告基因表达载体均为质粒a；所述质粒a是将序列1的第4191-6364位核苷酸替换为名称为K的DNA片段得到的质粒；所述名称为K的DNA片段包括转录因子的顺式作用元件、TATAlike启动子、报告基因、序列1的第5237-5743位核苷酸所示的DNA和真核生物抗性筛选标记基因；
所述N为大于等于2的一个自然数。
上述成套载体中，所述名称为K的DNA片段具体可为F1、F2或F3：
F1、所述名称为K的DNA片段由转录因子的顺式作用元件、TATAlike启动子、报告基因、序列1的第5237-5743位核苷酸所示的DNA和真核生物抗性筛选标记基因连接而成；
F2、所述名称为K的DNA片段由转录因子的顺式作用元件、TATAlike启动子、报告基因、序列1的第5237-5743位核苷酸所示的DNA、真核生物抗性筛选标记基因和与所述报告基因相连的标签序列连接而成；
F3、所述名称为K的DNA片段还包括与所述报告基因相连的标签序列；所述标签序列编码标签蛋白。
上述成套载体中，序列1是由7183bp组成的环状质粒，是一种逆转录病毒表达载体，其名称为pIMP-NF-κB。pIMP-NF-κB携带NF-κB的顺式作用元件，序列1的第4191-4230位核苷酸为转录因子NF-κB的顺式作用元件；序列1的第4239-4299位核苷酸为TATAlike启动子，序列1的第4313-4909位核苷酸为报告基因NanoLuc，序列1的第5765-6364位核苷酸为真核生物抗性筛选标记基因嘌呤霉素抗性基因(puoR)。
上述成套载体中，为了使所述报告基因表达的报告蛋白质便于检测，所述名称为K的DNA片段还包括与所述报告基因相连的标签序列；所述标签序列编码标签蛋白。所述标签蛋白(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签蛋白可为Flag标签蛋白、His6标签蛋白、MBP标签蛋白、HA标签蛋白、myc标签蛋白、GST标签蛋白、SUMO标签蛋白。
Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽，其氨基酸序列为DYKDDDDK。His6标签蛋白是由六个组氨酸残基组成的多肽；可插入在目的蛋白的C末端或N末端。MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。
上述成套载体中，所述TATAlike启动子是位于转录起点上游，包含TATA盒保守序列TATA(A/T)A(A/T)，并且发挥类似经典TATA盒启动子功能，控制转录起始的准确性及频率的一段序列。
所述TATAlike启动子具体可为L1)、L2)或L3)的DNA片段：
L1)、核苷酸序列为序列1的第4239-4299位核苷酸；
L2)与序列1的第4239-4299位核苷酸具有75％或75％以上一致性，且具有启动子功能的DNA片段；
L3)在严格条件下与L1)或L2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。
上述成套载体中，所述转录因子可为所有可特异性结合其顺式作用元件并促进或抑制下游基因转录的转录因子，如NF-κB、SP1、STAT3、FOXO、AP1、ATFs、Nrf2&Nrf1、ATF6、CBF、PPAR、p53、CREB、AR、C/EBP、E2F、EGR1、ER、GATA、GR、HSF、HNF4、MTF1、TCF/LEF、GL1、HIF1、IRF1、KLF4、LXRa、Elk-1/SRF、MEF2、Myc/Max、Nanog、RBP-Jk、Oct4、Pax6、NFAT、Progesterone Receptor(PR)、Retinoic Acid Receptor(RAR)、Retinoid X Receptor(RXR)、Sox2、SMADs、VDR、AhR、STAT1/STAT1、STAT1/STAT2。
上述成套载体中，所述报告基因可为荧光素酶、氯霉素转乙酰酶、β-半乳糖苷酶或荧光蛋白。所述荧光素酶可为天然的或人工改造的荧光素酶，如NanoLuc(NLuc)。NanoLuc(NLuc)是一种人工改造的荧光素酶，其分子量小(19.1kDa，171个氨基酸)。所述NanoLuc是序列1的第4313-4909位核苷酸编码的蛋白质。
上述成套载体中，所述真核生物抗性筛选标记基因可为便于对转基因哺乳动物细胞进行筛选的基因，如嘌呤霉素抗性基因(puroR)。
上述成套载体中，所述转录因子的顺式作用元件位于所述报告基因的上游。
上述成套载体中，所述质粒a是一种转录因子报告基因载体，转录因子的顺式作用元件位于报告基因的上游，调控下游报告基因的表达，通过检测报告基因的表达则能定性或定量测定相应转录因子的表达情况。
上文中，所有所述名称为K的DNA片段中，在连接顺序上，所述TATAlike启动子位于所述转录因子的顺式作用元件的下游，所述报告基因位于所述TATAlike启动子的下游，序列1的第5237-5743位核苷酸所示的DNA位于所述报告基因的下游，所述真核生物抗性筛选标记基因位于序列1的第5237-5743位核苷酸所示的DNA的下游。
上述75％或75％以上一致性，可为80％、85％、90％、95％以上的一致性。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。这里使用的术语“一致性”包括与本发明的启动子核苷酸序列具有优选地75％或更高，更优选地85％或更高，甚至更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。
上述成套载体中，所述质粒a具体可为pIMP-NF-κB或pIMP-X，所述pIMP-X为下述任一种质粒：pIMP-AP1(含有序列2所示的AP1的顺式作用元件)、pIMP-STAT3(含有序列3所示的STAT3的顺式作用元件)、pIMP-SP1(含有序列4所示的SP1的顺式作用元件)、pIMP-FOXO(含有序列5所示的FOXO的顺式作用元件)、pIMP-ATFs(含有序列6所示的ATFs的顺式作用元件)、pIMP-Nrf2&Nrf1(含有序列7所示的Nrf2&Nrf1的顺式作用元件)、pIMP-ATF6(含有序列8所示的ATF6的顺式作用元件)、pIMP-CBF(含有序列9所示的CBF的顺式作用元件)、pIMP-PPAR(含有序列10所示的PPAR的顺式作用元件)、pIMP-p53(含有序列11所示的p53的顺式作用元件)、pIMP-CREB(含有序列12所示的CREB的顺式作用元件)、pIMP-AR(含有序列13所示的AR的顺式作用元件)、pIMP-C/EBP(含有序列14所示的C/EBP的顺式作用元件)、pIMP-E2F(含有序列15所示的E2F的顺式作用元件)、pIMP-EGR1(含有序列16所示的EGR1的顺式作用元件)、pIMP-ER(含有序列17所示的ER的顺式作用元件)、pIMP-GATA(含有序列18所示的GATA的顺式作用元件)、pIMP-GR(含有序列19所示的GR的顺式作用元件)、pIMP-HSF(含有序列20所示的HSF的顺式作用元件)、pIMP-HNF4(含有序列21所示的HNF4的顺式作用元件)、pIMP-MTF1(含有序列22所示的MTF1的顺式作用元件)，pIMP-TCF/LEF(含有序列23所示的TCF/LEF的顺式作用元件)、pIMP-GL1(含有序列24所示的GL1的顺式作用元件)、pIMP-HIF1(含有序列25所示的HIF1的顺式作用元件)、pIMP-IRF1(含有序列26所示的IRF1的顺式作用元件)、pIMP-KLF4(含有序列27所示的KLF4的顺式作用元件)、pIMP-LXRa(含有序列28所示的LXRa的顺式作用元件)、pIMP-Elk-1/SRF(含有序列29所示的Elk-1/SRF的顺式作用元件)、pIMP-MEF2(含有序列30所示的MEF2的顺式作用元件)、pIMP-Myc/Max(含有序列31所示的Myc/Max的顺式作用元件)、pIMP-Nanog(含有序列32所示的Nanog的顺式作用元件)、pIMP-RBP-Jk(含有序列33所示的RBP-Jk的顺式作用元件)、pIMP-Oct4(含有序列34所示的Oct4的顺式作用元件)、pIMP-Pax6(含有序列35所示的Pax6的顺式作用元件)、pIMP-NFAT(含有序列36所示的NFAT的顺式作用元件)、pIMP-PR(含有序列37所示的ProgesteroneReceptor(PR)的顺式作用元件)、pIMP-RAR(含有序列38所示的Retinoic Acid Receptor(RAR)的顺式作用元件)、pIMP-RXR(含有序列39所示的Retinoid X Receptor(RXR)的顺式作用元件)、pIMP-Sox2(含有序列40所示的Sox2的顺式作用元件)、pIMP-SMADs(含有序列41所示的SMADs的顺式作用元件)、pIMP-VDR(含有序列42所示的VDR的顺式作用元件)、pIMP-AhR(含有序列43所示的AhR的顺式作用元件)、pIMP-STAT1/STAT1(含有序列44所示的STAT1/STAT1的顺式作用元件)、pIMP-STAT1/STAT1(含有序列45所示的STAT1/STAT2的顺式作用元件)。
所述pIMP-X是将序列1的第4191-4230位核苷酸所示的NF-κB的顺式作用元件替换为相应转录因子的顺式元件并保持序列1的其它核苷酸不变得到的质粒。所述pIMP-X与pIMP-NF-κB区别仅在于将pIMP-NF-κB中的NF-κB的顺式作用元件替换为相应转录因子的顺式作用元件。如pIMP-SP1是将序列1的第4191-4230位核苷酸所示的NF-κB的顺式作用元件替换为序列4所示的SP1的顺式作用元件，保持序列1的其它核苷酸不变得到的质粒；pIMP-STAT3是将序列1的第4191-4230位核苷酸所示的NF-κB的顺式作用元件替换为序列3所示的STAT3的顺式作用元件，保持序列1的其它核苷酸不变得到的质粒；所述pIMP-FOXO是将序列1的第4191-4230位核苷酸所示的NF-κB的顺式作用元件替换为序列5所示的FOXO的顺式作用元件，保持序列1的其它核苷酸不变得到的质粒；所述pIMP-AP1是将序列1的第4191-4230位核苷酸所示的NF-κB的顺式作用元件替换为序列2所示的AP1的顺式作用元件，保持序列1的其它核苷酸不变得到的质粒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统。
本发明所提供的检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统，为s1或s2：
s1、包括所述成套载体的病毒包装系统；
s2、由包括所述成套载体的病毒包装系统包装得到的病毒和所述病毒的宿主细胞组成的系统；
所述N为大于等于2的一个自然数。
上述检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统中，所述病毒包装系统可为逆转录病毒包装系统或慢病毒包装系统。
上述检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统中，所述病毒包装系统具体可由所述成套载体、病毒包装质粒和病毒包装细胞组成。
上述检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统中，所述病毒包装质粒可为pVSV-G，所述病毒包装细胞可为人胚肾上皮包装细胞GP2-293。
上述成套载体中的所述质粒a或骨架载体也属于本发明的保护范围，所述骨架载体是将所述质粒a中的所述转录因子的顺式作用元件缺失得到的DNA片段。
上述质粒a或骨架载体中，所述骨架载体具体可为缺失序列1的第4191-4230位核苷酸得到的DNA片段。
含有上述质粒a或骨架载体的重组细胞也属于本发明的保护范围。
下述P1-P4的应用也属于本发明的保护范围：
P1、上述成套载体、上述检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统、上述质粒a或骨架载体或上述重组细胞在制备检测中药和/或天然药物的活性成分(有效成分或起效成分)的产品中的应用；
P2、上述成套载体、上述检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统、上述质粒a或骨架载体或上述重组细胞在制备检测中药和/或天然药物的作用机制的产品中的应用；
P3、上述成套载体、上述检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统、上述质粒a或骨架载体或上述重组细胞在制备检测中药和/或天然药物对信号通路的调控作用的产品中的应用；
P4、上述成套载体、上述检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统、上述质粒a或骨架载体或上述重组细胞在制备检测中药和/或天然药物药效的产品中的应用。
下述检测N种转录因子活化状态的系统的应用也属于本发明的保护范围：所述N为大于等于2的一个自然数，所述应用为A1至A4中的任一种：
A1、检测N种转录因子活化状态的系统在制备检测中药和/或天然药物的活性成分的产品中的应用；
A2、检测N种转录因子活化状态的系统在制备检测中药和/或天然药物的作用机制的产品中的应用；
A3、检测N种转录因子活化状态的系统在制备检测中药和/或天然药物对信号通路的调控作用的产品中的应用；
A4、检测N种转录因子活化状态的系统在制备检测中药和/或天然药物药效的产品中的应用；
A1至A4中，所述N为大于等于2的一个自然数。
本发明中，所有N可为2至100的一个自然数，如N为2至45、3至45、4至45、5至45、5至100或10至100的一个自然数。
实验证明，将含有NF-κB的顺式作用元件的pQCXIP-NF-κB-NLuc的骨架载体(将pQCXIP-NF-κB-Nluc中的NF-κB的顺式作用元件去掉得到的载体)的嘌呤霉素抗性基因(puoR)替换成序列1的第5237-6364位核苷酸所示的DNA显著提高了逆转录病毒侵染的HeLa细胞中稳定表达克隆数目：pIMP-NF-κB逆转录病毒侵染的HeLa细胞中稳定表达克隆的数目是pQCXIP-NF-κB-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞中稳定表达克隆的数目的51.2倍；105个pQCXIP-SP1-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞中没有稳定表达克隆，而105个pIMP-SP1逆转录病毒侵染的HeLa细胞中有187个稳定表达克隆；pIMP-STAT3逆转录病毒侵染的HeLa细胞中稳定表达克隆的数目是pQCXIP-STAT3-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞中稳定表达克隆的数目的74.3倍；105个pQCXIP-FOXO-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞中没有稳定表达克隆，而105个pIMP-FOXO逆转录病毒侵染的HeLa细胞中有131个稳定表达克隆；pIMP-AP1逆转录病毒侵染的HeLa细胞中稳定表达克隆的数目是pQCXIP-AP1-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞中稳定表达克隆的数目的278倍(表1)。
本发明的质粒a、骨架载体、上述重组真核细胞、上述成套载体或上述检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统，可用于检测中药和/或天然药物对2至100个转录因子的影响。
本发明可用于定量检测中药及其他天然药物对于不同通路中的关键转录因子的影响，进而判断其对不同通路的影响，从分子水平的角度解释中药及其他天然药物的作用机制，为现有中药及其他天然药物的作用机制不明确、靶点多样性的问题提供解决方案。本发明可用于建立不同中药及其他天然药物对于不同信号通路作用效果的数据库。本发明可用于中药复方、中成药、中药注射剂及各种制剂形式中药的多通路作用效果检测。本发明在阐释中药及其他天然药物功效及作用机制方面能发挥其积极作用，为中药及其他天然药物的现代化发展提供理论依据。
附图说明
图1为受NF-κB调控的稳定表达细胞系，受SP1调控的稳定表达细胞系，受STAT3调控的稳定表达细胞系，受FOXO调控的稳定表达细胞系和受AP1调控的稳定表达细胞系在相应通路刺激物(TNFα、PMA、IL-6、Wortmannin、PMA)刺激下的荧光素酶表达变化结果。
图2为淫羊藿苷对实施例1获得的受NF-κB调控的稳定表达细胞系、受SP1调控的稳定表达细胞系、受STAT3调控的稳定表达细胞系、受FOXO调控的稳定表达细胞系和受AP1调控的稳定表达细胞系中荧光素酶表达的影响。
图3为雷公藤红素对实施例1获得的受NF-κB调控的稳定表达细胞系、受SP1调控的稳定表达细胞系、受STAT3调控的稳定表达细胞系、受FOXO调控的稳定表达细胞系和受AP1调控的稳定表达细胞系中荧光素酶表达的影响。
图2和图3中，NF-κB表示受NF-κB调控的稳定表达细胞系，SP1表示受SP1调控的稳定表达细胞系，STAT3表示受STAT3调控的稳定表达细胞系，FOXO表示受FOXO调控的稳定表达细胞系，AP1表示受AP1调控的稳定表达细胞系；图2和图3中，control分别表示受0μg/mL淫羊藿苷溶液刺激的细胞系和受0ng/mL雷公藤红素溶液刺激的细胞系。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、含有转录因子顺式作用元件的报告基因载体
1、含有转录因子顺式作用元件的报告基因载体的结构
本步骤提供了10种含有转录因子的顺式作用元件的报告基因载体。其中，本发明所保护的含有转录因子的顺式作用元件的报告基因载体有5种，分别是含有NF-κB的顺式作用元件的报告基因载体pIMP-NF-κB、含有SP1的顺式作用元件的报告基因载体pIMP-SP1、含有STAT3的顺式作用元件的报告基因载体pIMP-STAT3、含有FOXO的顺式作用元件的报告基因载体pIMP-FOXO和含有AP1的顺式作用元件的报告基因载体pIMP-AP1。另外5种含有转录因子顺式作用元件的报告基因载体分别是pIMP-NF-κB的对照质粒pQCXIP-NF-κB-Nluc，pIMP-SP1的对照质粒pQCXIP-SP1-Nluc，pIMP-STAT3的对照质粒pQCXIP-STAT3-Nluc，pIMP-FOXO的对照质粒pQCXIP-FOXO-Nluc，pIMP-AP1的对照质粒pQCXIP-AP1-Nluc。
pIMP-NF-κB与pQCXIP-NF-κB-NLuc(郭志兰,车路阳,李晶哲,等.NF-κB荧光素酶报告基因系统的构建及验证.生物工程学报,2016,32(10):1465–1473)的区别仅在于将pQCXIP-NF-κB-Nluc的嘌呤霉素抗性基因puro(R)替换成序列1的第5237-6364位核苷酸所示的DNA。
pIMP-NF-κB是由7183bp组成的环状质粒，是一种逆转录病毒表达载体，其核苷酸序列为序列1。pIMP-NF-κB携带NF-κB的顺式作用元件，序列1的第4191-4230位核苷酸为转录因子NF-κB的顺式作用元件；序列1的第4239-4299位核苷酸为TATAlike启动子，序列1的第4313-4909位核苷酸为报告基因NanoLuc，序列1的第5765-6364位核苷酸为真核生物抗性筛选标记基因嘌呤霉素抗性基因puro(variant)。
pIMP-SP1是将序列1的第4191-4230位核苷酸(NF-κB的顺式作用元件)替换为序列4(SP1的顺式作用元件)，保持序列1的其它核苷酸不变得到的质粒。pIMP-SP1与pIMP-NF-κB的区别仅在于将pIMP-NF-κB中的NF-κB的顺式作用元件替换为SP1的顺式作用元件。
pIMP-STAT3是将序列1的第4191-4230位核苷酸(NF-κB的顺式作用元件)替换为序列3(STAT3的顺式作用元件)，保持序列1的其它核苷酸不变得到的质粒。IMP-STAT3与pIMP-NF-κB的区别仅在于将pIMP-NF-κB中的NF-κB的顺式作用元件替换为STAT3的顺式作用元件。
pIMP-FOXO是将序列1的第4191-4230位核苷酸(NF-κB的顺式作用元件)替换为序列5(FOXO的顺式作用元件)，保持序列1的其它核苷酸不变得到的质粒。pIMP-FOXO与pIMP-NF-κB的区别仅在于将pIMP-NF-κB中的NF-κB的顺式作用元件替换为FOXO的顺式作用元件。
pIMP-AP1是将序列1的第4191-4230位核苷酸(NF-κB的顺式作用元件)替换为序列2(AP1的顺式作用元件)，保持序列1的其它核苷酸不变得到的质粒。pIMP-AP1与pIMP-NF-κB的区别仅在于将pIMP-NF-κB中的NF-κB的顺式作用元件替换为AP1的顺式作用元件。
将pQCXIP-NF-κB-NLuc(郭志兰,车路阳,李晶哲,等.NF-κB荧光素酶报告基因系统的构建及验证.生物工程学报,2016,32(10):1465–1473)中的NF-κB的顺式作用元件去掉得到的载体称为pQCXIP-NF-κB-Nluc的骨架载体。
将pQCXIP-NF-κB-Nluc中的NF-κB的顺式作用元件替换为序列4所示的SP1的顺式作用元件，并保持pQCXIP-NF-κB-Nluc的其他序列不变，得到质粒pQCXIP-SP1-Nluc。
将pQCXIP-NF-κB-Nluc中的NF-κB的顺式作用元件替换为序列3所示的STAT3的顺式作用元件，并保持pQCXIP-NF-κB-Nluc的其他序列不变，得到质粒pQCXIP-STAT3-Nluc。
将pQCXIP-NF-κB-Nluc中的NF-κB的顺式作用元件替换为序列5所示的FOXO的顺式作用元件，并保持pQCXIP-NF-κB-Nluc的其他序列不变，得到质粒pQCXIP-FOXO-Nluc。
将pQCXIP-NF-κB-Nluc中的NF-κB的顺式作用元件替换为序列2所示的AP1的顺式作用元件，并保持pQCXIP-NF-κB-Nluc的其他序列不变，得到质粒pQCXIP-AP1-Nluc。
将pQCXIP-NF-κB-Nluc作为pIMP-NF-κB的对照质粒，将pQCXIP-SP1-Nluc作为pIMP-SP1的对照质粒，将pQCXIP-STAT3-Nluc作为pIMP-STAT3的对照质粒，将pQCXIP-FOXO-Nluc作为pIMP-FOXO的对照质粒，将pQCXIP-AP1-Nluc作为pIMP-AP1的对照质粒。
2、含有转录因子顺式作用元件的报告基因载体对稳定表达单克隆获得效率的影响
2.1、系列转录因子报告基因逆转录病毒的制备：
人胚肾上皮包装细胞GP2-293用含10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5％CO2条件下培养、传代。步骤1的10种含有转录因子的顺式作用元件的报告基因载体中的一种含有转录因子的顺式作用元件的报告基因载体与pVSV-G病毒包装质粒(郭志兰,车路阳,李晶哲,等.NF-κB荧光素酶报告基因系统的构建及验证.生物工程学报,2016,32(10):1465–1473)利用Lipofectamine 2000转染试剂按操作说明共转染入GP2-293细胞，其中质粒与Lipofectamine 2000质量体积比在预实验后选用转染效果较好的1∶2。转染5h后培养基更换成新鲜DMEM+10％FBS完全培养基继续培养，48h后收集含病毒上清，经0.45μm滤膜过滤，分装。得到10种逆转录病毒。将由pIMP-NF-κB与pVSV-G共转染获得的病毒称为pIMP-NF-κB逆转录病毒，将由pQCXIP-NF-κB-Nluc与pVSV-G共转染获得的病毒称为pQCXIP-NF-κB-Nluc逆转录病毒，将由pIMP-SP1与pVSV-G共转染获得的病毒称为pIMP-SP1逆转录病毒,将由pQCXIP-SP1-Nluc与pVSV-G共转染获得的病毒称为pQCXIP-SP1-Nluc逆转录病毒,将由pIMP-STAT3与pVSV-G共转染获得的病毒称为pIMP-STAT3逆转录病毒,将由pQCXIP-STAT3-Nluc与pVSV-G共转染获得的病毒称为pQCXIP-STAT3-Nluc逆转录病毒,将由pIMP-FOXO与pVSV-G共转染获得的病毒称为pIMP-FOXO逆转录病毒,将由pQCXIP-FOXO-Nluc与pVSV-G共转染获得的病毒称为pQCXIP-FOXO-Nluc逆转录病毒,将由pIMP-AP1与pVSV-G共转染获得的病毒称为pIMP-AP1逆转录病毒,将由pQCXIP-AP1-Nluc与pVSV-G共转染获得的病毒称为pQCXIP-AP1-Nluc逆转录病毒。
2.2、病毒侵染
人宫颈癌细胞HeLa以2×105个/孔接种于6孔板中，在DMEM+10％FBS培养基，37℃、5％CO2条件下培养。24h后，将2.1上述制备的10种逆转录病毒上清中的一种逆转录病毒上清1mL与2mL新鲜完全培养基及polybrene(8μg/mL)加至HeLa细胞，并于32℃、1 800×g水平离心机中离心90min，37℃静置5h，再更换成新鲜DMEM+10％FBS培养基继续培养，得到10种逆转录病毒侵染的HeLa细胞：pIMP-NF-κB逆转录病毒侵染的HeLa细胞，pQCXIP-NF-κB-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞，pIMP-SP1逆转录病毒侵染的HeLa细胞，pQCXIP-SP1-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞，pIMP-STAT3逆转录病毒侵染的HeLa细胞，pQCXIP-STAT3-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞，pIMP-FOXO逆转录病毒侵染的HeLa细胞，pQCXIP-FOXO-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞，pIMP-AP1逆转录病毒侵染的HeLa细胞，pQCXIP-AP1-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞。
2.3、稳定表达单克隆的筛选
实验重复三次，每次实验方法如下：病毒侵染48h后，分别向105个步骤2.2的10种逆转录病毒侵染的HeLa细胞中加入3μg/mL嘌呤霉素(Puromycin)进行筛选。24h后将嘌呤霉素浓度降低到1μg/mL维持抗性。4d后，将存活细胞计数并按1个细胞/孔分配至96孔板中。两周后，将其中的单克隆细胞株继续放大培养。统计每105个逆转录病毒侵染的HeLa细胞中嘌呤霉素抗性细胞(稳定表达克隆)数目。
结果如表1所示，表明在含有NF-κB的顺式作用元件的pQCXIP-NF-κB-NLuc的骨架载体(将pQCXIP-NF-κB-Nluc中的NF-κB的顺式作用元件去掉得到的载体)的嘌呤霉素抗性基因puro(variant)和NanoLuc基因之间加入序列1的第5237-5743位核苷酸所示的DNA显著提高了逆转录病毒侵染的HeLa细胞中嘌呤霉素抗性细胞(稳定表达克隆)数目：pIMP-NF-κB逆转录病毒侵染的HeLa细胞中稳定表达克隆的数目是pQCXIP-NF-κB-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞中稳定表达克隆的数目的51.2倍；105个pQCXIP-SP1-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞中没有稳定表达克隆，而105个pIMP-SP1逆转录病毒侵染的HeLa细胞中有187个稳定表达克隆；pIMP-STAT3逆转录病毒侵染的HeLa细胞中稳定表达克隆的数目是pQCXIP-STAT3-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞中稳定表达克隆的数目的74.3倍；105个pQCXIP-FOXO-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞中没有稳定表达克隆，而105个pIMP-FOXO逆转录病毒侵染的HeLa细胞中有131个稳定表达克隆；pIMP-AP1逆转录病毒侵染的HeLa细胞中稳定表达克隆的数目是pQCXIP-AP1-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞中稳定表达克隆的数目的278倍。
将pIMP-NF-κB逆转录病毒侵染的HeLa细胞中的稳定表达克隆命名为受NF-κB调控的稳定表达细胞系，将pIMP-SP1逆转录病毒侵染的HeLa细胞中的稳定表达克隆命名为受SP1调控的稳定表达细胞系，将pIMP-STAT3逆转录病毒侵染的HeLa细胞中的稳定表达克隆命名为受STAT3调控的稳定表达细胞系，将pIMP-FOXO逆转录病毒侵染的HeLa细胞中的稳定表达克隆命名为受FOXO调控的稳定表达细胞系，将pIMP-AP1逆转录病毒侵染的HeLa细胞中的稳定表达克隆命名为受AP1调控的稳定表达细胞系。这五种稳定表达细胞系为受转录因子调控的稳定表达细胞系。
由于pQCXIP-NF-κB-NLuc的骨架载体的嘌呤霉素抗性基因受多克隆位点上游调控序列的影响，阳性细胞筛选效率很低。将含有NF-κB的顺式作用元件的pQCXIP-NF-κB-NLuc的骨架载体(将pQCXIP-NF-κB-Nluc中的NF-κB的顺式作用元件去掉得到的载体)的嘌呤霉素抗性基因(puoR)替换成序列1的第5237-6364位核苷酸所示的DNA,大大提升阳性细胞的筛选效率,从而使得在利用pQCXIP-NF-κB-NLuc的骨架载体构建逆转录病毒侵染细胞这一技术方案中，原来难于或无法构建获得的阳性细胞可以被大量获得，充分保障了后续转录因子报告基因细胞系的筛选和优化。
表1. 105个逆转录病毒侵染的HeLa细胞中的稳定表达克隆数目
| 逆转录病毒侵染的HeLa细胞 | 稳定表达克隆数目(个/105个) |
| pIMP-NF-κB逆转录病毒侵染的HeLa细胞 | 256 |
| pQCXIP-NF-κB-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞 | 5 |
| pIMP-SP1逆转录病毒侵染的HeLa细胞 | 187 |
| pQCXIP-SP1-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞 | 0 |
| pIMP-STAT3逆转录病毒侵染的HeLa细胞 | 223 |
| pQCXIP-STAT3-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞 | 3 |
| pIMP-FOXO逆转录病毒侵染的HeLa细胞 | 131 |
| pQCXIP-FOXO-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞 | 0 |
| pIMP-AP1逆转录病毒侵染的HeLa细胞 | 278 |
| pQCXIP-AP1-Nluc逆转录病毒侵染的HeLa细胞 | 1 |
3、稳定表达细胞系的有效性验证
将步骤2获得的受NF-κB调控的稳定表达细胞系，受SP1调控的稳定表达细胞系，受STAT3调控的稳定表达细胞系，受FOXO调控的稳定表达细胞系和受AP1调控的稳定表达细胞系分别进行细胞计数，以2×104个/孔加入96孔板中，在DMEM+10％FBS培养基中37℃、5％CO2条件下培养。24h后加入相应信号通路的刺激物，设定空白及低、高浓度梯度组，每组设5个复孔。其中，受NF-κB调控的稳定表达细胞系中加入NF-κB信号通路的刺激物肿瘤坏死因子TNF-α，浓度分别为0、5和10ng/mL；受SP1调控的稳定表达细胞系中加入SP1信号通路的刺激物PMA(佛波酯)，浓度分别为0、5和10ng/mL；受STAT3调控的稳定表达细胞系中加入STAT3信号通路的刺激物IL-6(白细胞介素-6)，浓度分别为0、5和10ng/mL；受FOXO调控的稳定表达细胞系中加入FOXO信号通路的刺激物wortmannin(渥曼青霉素,PI3K抑制剂)，浓度分别为0、2和4nM；受AP1调控的稳定表达细胞系中加入AP1信号通路的刺激物PMA，浓度分别为0、5和10ng/mL。
加药24h后，取培养基上清，加入3μmol/L荧光素酶底物腔肠素(Coelenterazine)溶液(溶剂为0.01M的PBST缓冲液(0.01M PBS+0.03％(V/V)Triton X-100，pH为7.4))，使用化学发光仪检测荧光素酶的发光值，比较加刺激物组与空白组之间的差异。
在获得受转录因子调控的稳定表达细胞系后，通过检测各细胞系对相应通路刺激物的反应验证细胞系的有效性。结果表明，所构建的受转录因子调控的稳定表达细胞系对相应通路的刺激物有较灵敏的反应，由上清中表达的荧光素酶可判断出，其中，TNFα、PMA、IL-6、PMA能相应地促进转录因子NFκB、SP1、STAT3、AP1的表达或活化，Wortmannin能抑制转录因子FOXO的表达或活化，以上5种细胞系经刺激后的荧光素酶表达量与空白组相比均具有明显差异(图1)。该结果表明所构建的受NF-κB调控的稳定表达细胞系，受SP1调控的稳定表达细胞系，受STAT3调控的稳定表达细胞系，受FOXO调控的稳定表达细胞系和受AP1调控的稳定表达细胞系可进一步用于药物对各通路影响的检测。
实施例2、利用受转录因子调控的稳定表达细胞系对中药单体进行效能评估
将实施例1获得的受NF-κB调控的稳定表达细胞系、受SP1调控的稳定表达细胞系、受STAT3调控的稳定表达细胞系、受FOXO调控的稳定表达细胞系和受AP1调控的稳定表达细胞系分别以2×104个/孔密度接种至96孔板中,在DMEM+10％FBS培养基中37℃、5％CO2条件下培养。24小时后中药单体淫羊藿苷溶液(浓度分别为0、0.2、1、5μg/mL，溶剂为水)和雷公藤红素(浓度分别为0、25、125、625ng/mL，溶剂为水)刺激细胞，每组5个复孔，刺激24小时后，取细胞培养基上清25ul添加含有荧光素酶底物腔肠素溶液(溶剂为0.01M的PBST缓冲液，pH为7.4)，混匀，于化学发光仪中检测发光值。加药刺激后的细胞还需进行细胞活力的检测，以消除药物对细胞促增殖、抑增殖、杀伤等带来的报告基因表达产物的影响。具体操作为：弃去旧培养基，每孔加100μL新鲜配制的含10％CCK8的培养基，于37℃、5％CO2条件下培养1-4h，于450nm波长下检测吸光值。将检测的发光值除以相应的细胞活力(空白组活力设为1)作为最终药物刺激后的结果，与空白组比较，从而得到淫羊藿苷和雷公藤红素对不同通路的影响。其中，空白组为0μg/mL淫羊藿苷溶液刺激的细胞系和0ng/mL雷公藤红素溶液刺激的细胞系。
利用5种稳定表达转录因子报告基因系统对淫羊藿苷和雷公藤红素两位单体药物进行多通路影响的效能检测。结果表明，淫羊藿苷溶液在0.2-5μg/mL、雷公藤红素溶液在25-625ng/mL范围内对实施例1获得的受NF-κB调控的稳定表达细胞系、受SP1调控的稳定表达细胞系、受STAT3调控的稳定表达细胞系、受FOXO调控的稳定表达细胞系和受AP1调控的稳定表达细胞系没有细胞毒性，其细胞活力与空白组相比均没有显著差异(P>0.05)。这5种稳定表达细胞系受0.2μg/mL、1μg/mL和5μg/mL的淫羊藿苷溶液刺激的细胞活力均是受0μg/mL淫羊藿苷溶液刺激的细胞活力的0.9-1.0倍；这5种稳定表达细胞系受25ng/mL、125ng/mL和625ng/mL的雷公藤红素溶液刺激的细胞活力均是受0ng/mL雷公藤红素溶液刺激的细胞活力的0.9-1.0倍，。
淫羊藿苷对NF-κB、STAT3通路有抑制作用，其他3个相应通路无明显影响；雷公藤红素对NF-κB通路有显著的抑制作用，对AP1的抑制作用也较明显，对其他3个通路无明显影响(图2和图3)。以上结果表明，通过构建的受NF-κB调控的稳定表达细胞系、受SP1调控的稳定表达细胞系、受STAT3调控的稳定表达细胞系、受FOXO调控的稳定表达细胞系和受AP1调控的稳定表达细胞系可检测中药单体或天然药物单体等对系列信号通路的影响，快速确定该药物单体对何种信号通路活化有影响，对何种信号通路影响不大或没有影响，进而为该药物单体的效能评估和分子作用机制研究提供实验数据。
<110> 中国中医科学院医学实验中心
<120> 评估中药和/或天然药物效能的系列转录因子报告基因系统及其应用
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7183
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 1
gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta 60
gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat 120
gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac 180
tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga 240
ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg 300
cctaggcttt tgcaaaaagc ttactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg 360
agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 420
aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 480
gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 540
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 600
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 660
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 720
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 780
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 840
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 900
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 960
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 1020
tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 1080
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 1140
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 1200
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 1260
attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 1320
agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 1380
atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 1440
cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 1500
ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 1560
agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt 1620
tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt 1680
gctgcaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc 1740
caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc 1800
ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca 1860
gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag 1920
tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg 1980
tcaacacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa 2040
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ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa 2400
aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctt caagaattag cttggccatt gcatacgttg 2460
tatccatatc ataatatgta catttatatt ggctcatgtc caacattacc gccatgttga 2520
cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca 2580
tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac 2640
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ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa 2760
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gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg 2940
tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg 3000
caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg 3060
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cccctcactc ggcgcgccag tcttccgata gactgcgtcg cccgggtacc cgtattccca 3180
ataaagcctc ttgctgtttg catccgaatc gtggtctcgc tgttccttgg gagggtctcc 3240
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gccgcaaccc tgggagacgt cccagggact ttgggggccg tttttgtggc ccgacctgag 3540
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actggaaaga tgtcgagcgg atcgctcaca accagtcggt agatgtcaag aagagacgtt 3840
gggttacctt ctgctctgca gaatggccaa cctttaacgt cggatggccg cgagacggca 3900
cctttaaccg agacctcatc acccaggtta agatcaaggt cttttcacct ggcccgcatg 3960
gacacccaga ccaggtcccc tacatcgtga cctgggaagc cttggctttt gacccccctc 4020
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ctctccccct tgaacctcct cgttcgaccc cgcctcgatc ctccctttat ccagccctca 4140
ctccttctct aggcgccgga attgaagatc tgggggatcg atccctcgag gggaatttcc 4200
gggaatttcc gggaatttcc gggaatttcc ttaattaaag actctagagg gtatataatg 4260
gagaaatctg cactcgacgg tagcgcggga ccggcatcca ccggtcgcca ccatgaactc 4320
cttctccaca agcgccttcg gtccagttgc cttctccctg ggcctgctcc tggtgttgcc 4380
tgctgccttc cctgccccag tcttcacact cgaagatttc gttggggact ggcgacagac 4440
agccggctac aacctggacc aagtccttga acagggaggt gtgtccagtt tgtttcagaa 4500
tctcggggtg tccgtaactc cgatccaaag gattgtcctg agcggtgaaa atgggctgaa 4560
gatcgacatc catgtcatca tcccgtatga aggtctgagc ggcgaccaaa tgggccagat 4620
cgaaaaaatt tttaaggtgg tgtaccctgt ggatgatcat cactttaagg tgatcctgca 4680
ctatggcaca ctggtaatcg acggggttac gccgaacatg atcgactatt tcggacggcc 4740
gtatgaaggc atcgccgtgt tcgacggcaa aaagatcact gtaacaggga ccctgtggaa 4800
cggcaacaaa attatcgacg agcgcctgat caaccccgac ggctccctgc tgttccgagt 4860
aaccatcaac ggagtgaccg gctggcggct gtgcgaacgc attctggcga cgcgtgccgg 4920
tgccggtcat catcatcatc atcactaaac gcgttaaggc cgcgactcta gagtcggggc 4980
ggccggccgc ttcgagcaga catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact 5040
agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta 5100
accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag 5160
gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa atgtggtaaa 5220
atcgataagg gaattcttgg ggttgcgcct tttccaaggc agccctgggt ttgcgcaggg 5280
acgcggctgc tctgggcgtg gttccgggaa acgcagcggc gccgaccctg ggtctcgcac 5340
attcttcacg tccgttcgca gcgtcacccg gatcttcgcc gctacccttg tgggcccccc 5400
ggcgacgctt cctgctccgc ccctaagtcg ggaaggttcc ttgcggttcg cggcgtgccg 5460
gacgtgacaa acggaagccg cacgtctcac tagtaccctc gcagacggac agcgccaggg 5520
agcaatggca gcgcgccgac cgcgatgggc tgtggccaat agcggctgct cagcagggcg 5580
cgccgagagc agcggccggg aaggggcggt gcgggaggcg gggtgtgggg cggtagtgtg 5640
ggccctgttc ctgcccgcgc ggtgttccgc attctgcaag cctccggagc gcacgtcggc 5700
agtcggctcc ctcgttgacc gaatcaccga cctctctccc cagggggatc caccggagct 5760
taccatgacc gagtacaagc ccacggtgcg cctcgccacc cgcgacgacg tccccagggc 5820
cgtacgcacc ctcgccgccg cgttcgccga ctaccccgcc acgcgccaca ccgtcgatcc 5880
ggaccgccac atcgagcggg tcaccgagct gcaagaactc ttcctcacgc gcgtcgggct 5940
cgacatcggc aaggtgtggg tcgcggacga cggcgccgcg gtggcggtct ggaccacgcc 6000
ggagagcgtc gaagcggggg cggtgttcgc cgagatcggc ccgcgcatgg ccgagttgag 6060
cggttcccgg ctggccgcgc agcaacagat ggaaggcctc ctggcgccgc accggcccaa 6120
ggagcccgcg tggttcctgg ccaccgtcgg cgtctcgccc gaccaccagg gcaagggtct 6180
gggcagcgcc gtcgtgctcc ccggagtgga ggcggccgag cgcgccgggg tgcccgcctt 6240
cctggagacc tccgcgcccc gcaacctccc cttctacgag cggctcggct tcaccgtcac 6300
cgccgacgtc gaggtgcccg aaggaccgcg cacctggtgc atgacccgca agcccggtgc 6360
ctgagatatc agtggtccag gctctagttt tgactcaaca atatcaccag ctgaagccta 6420
tagagtacga gccatagata aaataaaaga ttttatttag tctccagaaa aaggggggaa 6480
tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat 6540
ggaaaaatac ataactgaga atagagaagt tcagatcaag gtcaggaaca gatggaacag 6600
ggtcgaccct agagaaccat cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct 6660
gtgccttatt tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctc 6720
cccgagctca ataaaagagc ccacaacccc tcactcgggg cgccagtcct ccgattgact 6780
gagtcgcccg ggtacccgtg tatccaataa accctcttgc agttgcatcc gacttgtggt 6840
ctcgctgttc cttgggaggg tctcctctga gtgattgact acccgtcagc gggggtcttt 6900
catttggggg ctcgtccggg atcgggagac ccctgcccag ggaccaccga cccaccaccg 6960
ggaggtaagc tggctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc 7020
agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc 7080
agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg 7140
atagcggagt gtagatccgg ctgtggaatg tgtgtcagtt agg 7183
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 2
tgagtcagtg agtcagtgag tcagtgagtc ag 32
<210> 3
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 3
gtcgacattt cccgtaaatc gtcgagtcga catttcccgt aaatcgtcga gtcgacattt 60
cccgtaaatc gtcgagtcga catttcccgt aaatcgtcga gtcgacattt cccgtaaatc 120
gtcgagtcga catttcccgt aaatcgtcga gtcgacattt cccgtaaatc gtcgagtcga 180
catttcccgt aaatcgtcga gtcgacattt cccgtaaatc gtcgagtcga catttcccgt 240
aaatcgtcga 250
<210> 4
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 4
ggggcggggc ggggcggggc ggggaggggc gggaggccgg ccggggaggg gcgggaggcc 60
ggccggggcg gggcggggcg gggc 84
<210> 5
<211> 208
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 5
gatcaagtaa acaactatgt aaacaagatc aagtaaacaa ctatgtaaac aagatcaagt 60
aaacaactat gtaaacaaga tcaagtaaac aactatgtaa acaagatcaa gtaaacaact 120
atgtaaacaa gatcaagtaa acaactatgt aaacaagatc aagtaaacaa ctatgtaaac 180
aagatcaagt aaacaactat gtaaacaa 208
<210> 6
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 6
aacattgcat catccccgca acattgcatc atccccgcaa cattgcatca tccccgcaac 60
attgcatcat ccccgcaaca ttgcatcatc cccgcaacat tgcatcatcc ccgcaacatt 120
gcatcatccc cgcaacattg catcatcccc gcaacattgc atcatccccg caacattgca 180
tcatccccgc aacattgcat catccccgca acattgcatc atccccgc 228
<210> 7
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 7
tcacagtgac tcagcaaaat ttcacagtga ctcagcaaaa tttcacagtg actcagcaaa 60
atttcacagt gactcagcaa aatttcacag tgactcagca aaatttcaca gtgactcagc 120
aaaatttcac agtgactcag caaaatttca cagtgactca gcaaaatttc acagtgactc 180
agcaaaattt cacagtgact cagcaaaatt tcacagtgac tcagcaaaat ttcacagtga 240
ctcagcaaaa tt 252
<210> 8
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 8
atcgagacag gtgctgacgt ggcattcatc gagacaggtg ctgacgtggc attcatcgag 60
acaggtgctg acgtggcatt catcgagaca ggtgctgacg tggcattcat cgagacaggt 120
gctgacgtgg cattcatcga gacaggtgct gacgtggcat tcatcgagac aggtgctgac 180
gtggcattca tcgagacagg tgctgacgtg gcattcatcg agacaggtgc tgacgtggca 240
ttcatcgaga caggtgctga cgtggcattc 270
<210> 9
<211> 290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 9
ccttcaccaa tcggcggcct ccacgacggc cttcaccaat cggcggcctc cacgacggcc 60
ttcaccaatc ggcggcctcc acgacggcct tcaccaatcg gcggcctcca cgacggcctt 120
caccaatcgg cggcctccac gacggccttc accaatcggc ggcctccacg acggccttca 180
ccaatcggcg gcctccacga cggccttcac caatcggcgg cctccacgac ggccttcacc 240
aatcggcggc ctccacgacg gccttcacca atcggcggcc tccacgacgg 290
<210> 10
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 10
tcgacagggg accaggacaa aggtcacgtt cgggactcga caggggacca ggacaaaggt 60
cacgttcggg actcgacagg ggaccaggac aaaggtcacg ttcgggactc gacaggggac 120
caggacaaag gtcacgttcg ggactcgaca ggggaccagg acaaaggtca cgttcgggac 180
tcgacagggg accaggacaa aggtcacgtt cgggactcga caggggacca ggacaaaggt 240
cacgttcggg actcgacagg ggaccaggac aaaggtcacg ttcgggactc gacaggggac 300
caggacaaag gtcacgttcg ggactcgaca ggggaccagg acaaaggtca cgttcgggac 360
<210> 11
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 11
tgcctggact tgcctggtgc ctggacttgc ctggagacat gtccagacat gtccgaacat 60
gtcccaacat gttgttgcct ggacttgcct ggagacatgt ccagacatgt ccgaacatgt 120
cccaacatgt tgttgcctgg acttgcctgg agacatgtcc agacatgtcc gaacatgtcc 180
caacatgttg ttgcctggac ttgcctggag acatgtccag acatgtccga acatgtccca 240
acatgttgtt gcctggactt gcctggtgcc tggacttgcc tggtgcctgg acttgcctgg 300
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 12
tgacgtcatg acgtcatgac gtcatgacgt catgacgtca 40
<210> 13
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 13
tggaggaaca tattgtattt atttggagga acatattgta tttatttgga ggaacatatt 60
gtatttattt ggaggaacat attgtattta tttggaggaa catattgtat ttatt 115
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 14
attgcgcaat attgcgcaat attgcgcaat attgcgcaat attgcgcaat 50
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 15
tttcgcggga aatttcgcgg gaaatttcgc gggaaatttc gcgggaaatt tcgcgggaaa 60
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 16
cgcccccgcg cgcccccgcg cgcccccgcg cgcccccgcg cgcccccgcg 50
<210> 17
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 17
gtcaggtcac agtgacctga tgtcaggtca cagtgacctg atgtcaggtc acagtgacct 60
gatgtcaggt cacagtgacc tgatgtcagg tcacagtgac ctgat 105
<210> 18
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 18
ggcattctct atctgattgt tggcattctc tatctgattg ttggcattct ctatctgatt 60
gttggcattc tctatctgat tgttggcatt ctctatctga ttgtt 105
<210> 19
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 19
ggtacatttt gttctggtac attttgttct ggtacatttt gttctggtac attttgttct 60
ggtacatttt gttct 75
<210> 20
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 20
gaacgttccc gaagaacgtt cccgaagaac gttcccgaag aacgttcccg aagaacgttc 60
ccgaa 65
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 21
ggcaaaggtc atggcaaagg tcatggcaaa ggtcatggca aaggtcatgg caaaggtcat 60
<210> 22
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 22
gagctctgca ctccgcccga gctctgcact ccgcccgagc tctgcactcc gcccgagctc 60
tgcactccgc ccgagctctg cactccgccc 90
<210> 23
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 23
agatcaaagg gggtaagatc aaagggggta tcaagcagat caaagggggt aagatcaaag 60
ggggta 66
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 24
gaccacccac gaccacccac gaccacccac gaccacccac gaccacccac 50
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 25
tacgtgctta cgtgcttacg tgcttacgtg cttacgtgct 40
<210> 26
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 26
ggaagcgaaa atgaaattga ctggaagcga aaatgaaatt gactggaagc gaaaatgaaa 60
ttgactggaa gcgaaaatga aattgactgg aagcgaaaat gaaattgact 110
<210> 27
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 27
agggtgtggc cagggtgtgg ccagggtgtg gccagggtgt ggccagggtg tggcc 55
<210> 28
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 28
tgaatgacca gcagtaacct cagctgaatg accagcagta acctcagctg aatgaccagc 60
agtaacctca gctgaatgac cagcagtaac ctcagctgaa tgaccagcag taacctcagc 120
<210> 29
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 29
ggatgtccat attaggagga tgtccatatt aggaggatgt ccatattagg aggatgtcca 60
tattaggagg atgtccatat tagga 85
<210> 30
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 30
ctagcgctct aaaaataacc ctctagcgct ctaaaaataa ccctctagcg ctctaaaaat 60
aaccctctag cgctctaaaa ataaccctct agcgctctaa aaataaccct 110
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 31
cacgtgcacg tgcacgtgca cgtgcacgtg 30
<210> 32
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 32
acccttcgcc gattaagtac ttaaaccctt cgccgattaa gtacttaaac ccttcgccga 60
ttaagtactt aaacccttcg ccgattaagt acttaaaccc ttcgccgatt aagtacttaa 120
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 33
cgtgggaacg tgggaacgtg ggaacgtggg aacgtgggaa 40
<210> 34
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 34
atgcaaataa atgcaaataa atgcaaataa atgcaaataa atgcaaataa 50
<210> 35
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 35
gattttcacg cttgagttca cgattttcac gcttgagttc acgattttca cgcttgagtt 60
cacgattttc acgcttgagt tcacgatttt cacgcttgag ttcac 105
<210> 36
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 36
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 120
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 150
<210> 37
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 37
gggacatggt gttctgggac atggtgttct gggacatggt gttctgggac atggtgttct 60
gggacatggt gttct 75
<210> 38
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 38
aggtcaccag gaggtcaagg tcaccaggag gtcaaggtca ccaggaggtc aaggtcacca 60
ggaggtcaag gtcaccagga ggtca 85
<210> 39
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 39
aggtcacagg tcacaggtca caggtcacag gtcac 35
<210> 40
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 40
aacaaagagt aacaaagagt aacaaagagt aacaaagagt aacaaagagt 50
<210> 41
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 41
agccagacaa gccagacaag ccagacaagc cagacaagcc agaca 45
<210> 42
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 42
gatccacaag gttcacgagg ttcacgtccg gatccacaag gttcacgagg ttcacgtccg 60
gatccacaag gttcacgagg ttcacgtccg gatccacaag gttcacgagg ttcacgtccg 120
gatccacaag gttcacgagg ttcacgtccg 150
<210> 43
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 43
tgagttctca cgctagcaga ttgagttctc acgctagcag attgagttct cacgctagca 60
gattgagttc tcacgctagc agattgagtt ctcacgctag cagat 105
<210> 44
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 44
agtttcatat tactctaaat cagtttcata ttactctaaa tcagtttcat attactctaa 60
atcagtttca tattactcta aatcagtttc atattactct aaatc 105
<210> 45
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 45
tagtttcact ttccctagtt tcactttccc tagtttcact ttccctagtt tcactttccc 60
tagtttcact ttccc 75
Claims (10)
1.检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的成套载体，由N种报告基因表达载体组成，所述N种报告基因表达载体中每种报告基因表达载体均携带一种转录因子的顺式作用元件；所述N种报告基因表达载体间的区别仅在于所携带的转录因子的顺式作用元件不同；所述N种报告基因表达载体均为质粒a；所述质粒a是将序列1的第4191-6364位核苷酸替换为名称为K的DNA片段得到的质粒；所述名称为K的DNA片段包括转录因子的顺式作用元件、TATAlike启动子、报告基因、序列1的第5237-5743位核苷酸所示的DNA和真核生物抗性筛选标记基因；
所述N为大于等于2的一个自然数。
2.根据权利要求1所述的成套载体，其特征在于：所述名称为K的DNA片段为F1、F2或F3：
F1、所述名称为K的DNA片段由转录因子的顺式作用元件、TATAlike启动子、报告基因、序列1的第5237-5743位核苷酸所示的DNA和真核生物抗性筛选标记基因连接而成；
F2、所述名称为K的DNA片段由转录因子的顺式作用元件、TATAlike启动子、报告基因、序列1的第5237-5743位核苷酸所示的DNA、真核生物抗性筛选标记基因和与所述报告基因相连的标签序列连接而成；所述标签序列编码标签蛋白；
F3、所述名称为K的DNA片段还包括与所述报告基因相连的标签序列；所述标签序列编码标签蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的成套载体，其特征在于：所述TATAlike启动子为L1)、L2)或L3)的DNA片段：
L1)、核苷酸序列为序列1的第4239-4299位核苷酸；
L2)与序列1的第4239-4299位核苷酸具有75％或75％以上一致性，且具有启动子功能的DNA片段；
L3)在严格条件下与L1)或L2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。
4.检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统，为s1或s2：
s1、包括权利要求1-3中任一所述的成套载体的病毒包装系统；
s2、由包括所述成套载体的病毒包装系统包装得到的病毒和所述病毒的宿主细胞组成的系统；
所述N为大于等于2的一个自然数。
5.根据权利要求1-3中任一所述的成套载体或权利要求4所述的检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统，其特征在于：所述N为2至100的一个自然数。
6.权利要求1-3中任一所述的成套载体中的所述质粒a或骨架载体，所述骨架载体是将所述质粒a中的所述转录因子的顺式作用元件缺失得到的DNA片段。
7.根据权利要求6所述的质粒a或骨架载体，其特征在于：所述骨架载体是缺失序列1的第4191-4230位核苷酸得到的DNA片段。
8.含有权利要求6或7所述的质粒a或骨架载体的重组细胞。
9.下述任一种应用：
P1、权利要求1-3和5中任一所述的成套载体、权利要求4或5所述的检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统、权利要求6或7所述的质粒a或骨架载体或权利要求8所述的重组细胞在制备检测中药和/或天然药物的活性成分的产品中的应用；
P2、权利要求1-3和5中任一所述的成套载体、权利要求4或5所述的检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统、权利要求6或7所述的质粒a或骨架载体或权利要求8所述的重组细胞在制备检测中药和/或天然药物的作用机制的产品中的应用；
P3、权利要求1-3和5中任一所述的成套载体、权利要求4或5所述的检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统、权利要求6或7所述的质粒a或骨架载体或权利要求8所述的重组细胞在制备检测中药和/或天然药物对信号通路的调控作用的产品中的应用；
P4、权利要求1-3和5中任一所述的成套载体、权利要求4或5所述的检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统、权利要求6或7所述的质粒a或骨架载体或权利要求8所述的重组细胞在制备检测中药和/或天然药物药效的产品中的应用。
10.检测N种转录因子活化状态的系统的应用，所述N为大于等于2的一个自然数，所述应用为A1至A4中的任一种：
A1、检测N种转录因子活化状态的系统在制备检测中药和/或天然药物的活性成分的产品中的应用；
A2、检测N种转录因子活化状态的系统在制备检测中药和/或天然药物的作用机制的产品中的应用；
A3、检测N种转录因子活化状态的系统在制备检测中药和/或天然药物对信号通路的调控作用的产品中的应用；
A4、检测N种转录因子活化状态的系统在制备检测中药和/或天然药物药效的产品中的应用；
A1至A4中，所述N为大于等于2的一个自然数。
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