CN102031305A - 含有a型流感特异性启动子的重组细胞及其应用 - Google Patents

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本发明公开了含有A型流感特异性启动子的重组细胞及其应用。本发明所提供的重组细胞的应用为所述重组细胞在制备检测流感病毒的试剂盒中的应用、所述重组细胞在制备筛选抗流感病毒药物的试剂盒中的应用或所述重组细胞在筛选抗流感病毒药物中的应用。本发明所提供的含有A型流感特异性启动子的报告基因的重组细胞在感染流感病毒后可以通过检测报告基因的表达监测流感病毒的繁殖程度，同时可用于有效筛选抗流感病毒药物。

Description

含有A型流感特异性启动子的重组细胞及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中含有A型流感特异性启动子的重组细胞及其应用。
背景技术
流感病毒(influenza virus)基因组由8段分段的RNA组成，每一段病毒RNA和病毒的NP蛋白及聚合酶复合体(PA，PB1，PB2)组成病毒核蛋白复合体(vRNP)。每一段病毒RNA都包括编码区和两端的非编码区(UTR)组成，非编码区3’的12个碱基和5’端的13个碱基在八个片段中是高度保守的，这两段保守碱基部分互补，形成一个部分配对的结构，对于病毒的转录和复制都是必须的，称为流感病毒的启动子。
荧光酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4所示。
发明内容
本发明的一个目的是提供如下重组质粒在制备检测流感病毒的试剂盒中的应用；或，如下重组细胞在制备检测流感病毒的试剂盒中的应用：
所述重组质粒是在出发表达载体的多克隆位点间插入如下融合基因，得到的重组质粒；
所述融合基因，是由片段1、报告基因和片段2依次连接构成的融合基因；片段1的核苷酸序列为AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段2的核苷酸序列为AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT；
所述重组细胞，是向出发细胞中转入所述重组质粒，得到的重组细胞。
本发明的另一个目的是提供如下重组质粒在制备筛选抗流感病毒药物的试剂盒中的应用；或，如下重组细胞在制备筛选抗流感病毒药物的试剂盒中的应用：
所述重组质粒是在出发表达载体的多克隆位点间插入如下融合基因，得到的重组质粒；
所述融合基因，是由片段1、报告基因和片段2依次连接构成的融合基因；片段1的核苷酸序列为AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段2的核苷酸序列为AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT；
所述重组细胞，是向出发细胞中转入所述重组质粒，得到的重组细胞。
本发明的又一个目的是提供如下重组质粒在筛选抗流感病毒药物中的应用；或，如下重组细胞在筛选抗流感病毒药物中的应用：
所述重组质粒是在出发表达载体的多克隆位点间插入如下融合基因，得到的重组质粒；
所述融合基因，是由片段1、报告基因和片段2依次连接构成的融合基因；片段1的核苷酸序列为AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段2的核苷酸序列为AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT；
所述重组细胞，是向出发细胞中转入所述重组质粒，得到的重组细胞。
所述报告基因为荧光素酶编码基因；
所述出发表达载体为pRep4载体；
所述出发细胞为Hela细胞；
所述流感病毒为A/WSN/33流感病毒；
所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5′末端第14到1734位所示。
本发明的又一个目的是提供一种重组细胞。
本发明所提供的重组细胞，是向出发细胞中转入重组质粒，得到的重组细胞；所述重组质粒是在出发表达载体的多克隆位点间插入如下融合基因，得到的重组质粒；
所述融合基因，是由片段1、报告基因和片段2依次连接构成的融合基因；片段1的核苷酸序列为AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段2的核苷酸序列为AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
所述出发细胞为Hela细胞；
所述报告基因为荧光素酶编码基因；
所述出发表达载体为pRep4载体；
所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5′末端第14到1734位所示。
如下融合基因在制备检测流感病毒的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围：
由片段1、报告基因和片段2依次连接构成的融合基因；片段1的核苷酸序列为AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段2的核苷酸序列为AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
如下融合基因在制备筛选抗流感病毒药物的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围：
由片段1、报告基因和片段2依次连接构成的融合基因；片段1的核苷酸序列为AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段2的核苷酸序列为AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
如下融合基因在筛选抗流感病毒药物中的应用也属于本发明的保护范围：
由片段1、报告基因和片段2依次连接构成的融合基因；片段1的核苷酸序列为AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段2的核苷酸序列为AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
所述报告基因为荧光素酶编码基因；
所述流感病毒为A/WSN/33流感病毒；
所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5′末端第14到1734位所示。
本发明所提供的含有A型流感特异性启动子的报告基因的重组细胞系在感染流感病毒后可以通过检测报告基因的表达监测流感病毒的繁殖程度，同时可用于有效筛选抗流感病毒药物。
附图说明
图1为pRep4-IAV-Luc质粒图谱。
图2为不同量病毒感染Hela-IAV-Luc细胞后测量荧光素酶活性结果。
图3为检测已知抗病毒药物利巴韦林(ribavirin)的抗病毒效果的结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
293T细胞(肾上皮细胞)购自ATCC，细胞系编号为：CRL-11268；
Hela细胞(子宫颈癌细胞)购自ATCC，细胞系编号为：CCL-2；
细胞培养基DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)：购自Gibco公司，含有10％的胎牛血清(PAA).；培养条件：37℃、5％CO2；
A/WSN/33流感病毒毒株(公众可从中国科学院微生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是Gabriele Neumann PNAS 1999Generation of influenza A virusesentirely from cloned cDNAs)；
转染试剂lipofectamine 2000：购自invitrogen公司；
荧光素酶活性测量试剂盒：购自promega公司；
三氮唑核苷病毒唑(利巴韦林)：购自Sigma公司；
潮霉素(Hygromycin)：购自Roche公司。
实施例1、构建含有A型流感特异性启动子的报告基因质粒及细胞系
一、构建含有A型流感特异性启动子的报告基因质粒及活性验证
1、构建含有A型流感特异性启动子的报告基因质粒
含有A型流感特异性启动子的报告基因质粒是通过如下步骤的方法制备得到的：
(1)以引物1和引物2组成的引物为引物对，以pGL3载体为模板，进行PCR扩增得到DNA片段，该DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
引物1(上游引物)：
ATACGTCTCGGGG
Figure BSA00000335113100041
ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG(序列表中序列1所示)；
引物2(下游引物)：
ATACGTCTCATATT
Figure BSA00000335113100043
TTA CA CGGCGA TCTTTCCGCCC(序列表中序列2所示)(以上上下游引物中下划线部分含有BsmBI酶切位点，框线部分为流感启动子序列，斜体部分为荧光素酶编码基因序列)。
(2)将步骤(1)得到的DNA片段经BsmBI酶切后，连接到经BsmBI酶切的pHH21载体(购自Promega公司)上，得到重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在pHH21载体的BsmBI酶切位点上插入了序列表中序列3自5′末端第14到1734位核苷酸序列，证明质粒构建正确，将该质粒命名为pHH21-IAV-Luc质粒。
(3)将pHH21-IAV-Luc质粒以NheI和PciI内切酶(Takara)酶切，回收酶切片段，以Klenow酶(购自Takara公司)补平末端后连入PvuII内切酶消化的pRep4质粒(购自Invitrogen公司)，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在pRep4中正确插入了序列表中序列3自5′末端第14到1734位核苷酸序列，其中，序列表中序列3自5′末端第14-58位和第1712位-1734位为流感启动子序列；序列表中序列3自5′末端第59位-1711位为荧光素酶编码基因序列。将得到的重组质粒命名为pRep4-IAV-Luc(图1)。
2、含有A型流感特异性启动子的报告基因质粒的活性验证
为验证该质粒的活性，将该质粒用转染试剂lipofectamine 2000转染293T细胞，用细胞培养基DMEM培养细胞，然后分别感染或不感染A/WSN/33病毒(MOI＝1)，12h后测量荧光素酶活性，通过luminometer仪(Promega)读取荧光素酶酶活，结果未感染病毒组只有本底活性，而感染病毒组的酶活性高达数百万，这说明该质粒转染进入细胞后，可以在RNA聚合酶I的作用下转录形成包含流感病毒启动子及荧光酶的类病毒RNA片段，在有病毒感染的情况下，病毒的聚合酶就可以启动荧光酶报告基因的转录而显示报告基因活性，该报告基因活性就反应了流感病毒在细胞里面的复制情况。
二、构建含有A型流感特异性启动子的报告基因的细胞系
1、pRep4-IAV-Luc质粒转染Hela细胞
pRep4-IAV-Luc质粒扩增后，测量质粒浓度，转染20μg质粒至10cm培养皿中的Hela细胞。同时，用同样的方法用空质粒pRep4转染Hela细胞，用细胞培养基DMEM培养细胞。
2、筛选稳定表达流感特异启动子报告基因的细胞
转染36h之后，更换新鲜培养基，并加入200μg/ml的潮霉素进行筛选，每隔2-3天换新鲜培养基，同时维持潮霉素的筛选压力，三周后获得稳定表达流感特异启动子报告基因的细胞系，命名为Hela-IAV-Luc。同时获得转空质粒对照细胞系。
3、Hela-IAV-Luc细胞的增殖
在获得Hela-IAV-Luc细胞系后，增殖细胞时潮霉素浓度减半，改为100μg/ml潮霉素，并进行细胞的冻存。
4、Hela-IAV-Luc细胞的鉴定
将Hela-IAV-Luc细胞传代至12孔板中，过夜培养后，吸弃培养基，以PBS溶液洗涤后，不接种或接种A/WSN/33病毒(MOI＝2)，12h后测量荧光酶活性，在不接种病毒时，只能检测到本底的酶活性，而在接种病毒后酶活性高达数百万以上；转空质粒对照细胞系只能检测到本底的酶活性。此结果说明所得到的Hela-IAV-Luc细胞系能够反应流感病毒在细胞中的转录活性。
实施例2、含有A型流感特异性启动子的报告基因质粒及细胞系的应用
1、病毒粒子数量与荧光素酶活性线性关系区间确认
在96孔板中每孔接种15000个Hela-IAV-Luc细胞，15小时后分别感染不同数量的流感病毒(A/WSN/33流感病毒毒株)，感染12小时后通过Steady-Glo Luciferase检测试剂盒在glomax仪(promega公司)读取每孔中荧光素酶发光量(荧光素酶发光量与样品中荧光素酶活性成正比)，实验设三次重复，结果取平均值，得到的结果如图2和表1所示。在病毒数量和细胞数量比例(MOI)低于40时，荧光素酶发光量与MO1两者之间就是正对应关系，MOI低于5时，两者之间是线性关系(y＝32873x+62007，R2＝0.984)。在应用96孔板检测每孔接种15000个细胞数时，能检测到的病毒粒子数可达9375个。
MOI＝病毒粒子个数与细胞个数的比值。
表1
  MOI   荧光素酶发光量
  0.625   75531
  1.25   103923
  2.5   155242
  5   221517
  10   242115
  20   273161
  40   314717
  80   267314
2、检测已知抗病毒药物利巴韦林(ribavirin)的抗病毒效果
由上述步骤1得出，当MOI值低于5时，最适合筛选抗流感药物，当有药物能够抑制流感病毒，荧光素酶发光量很明显的降低。
Hela-IAV-Luc细胞接种14h后分别进行三种处理：未感染病毒，感染A/WSN/33流感病毒(MOI＝2)，感染A/WSN/33流感病毒(MOI＝2)的同时加入10ng/μl利巴韦林，12h后测量荧光素酶发光量，所得结果如图3所示，在没有流感病毒感染的情况下(图3中A)，几乎检测不到荧光素酶发光量，而在流感病毒感染后(图3中B)，荧光素酶发光量极大地提高，而再加入一种抗病毒药物利巴韦林后(图3中C)，荧光素酶发光量处于到非常低的水平。这说明Hela-IAV-Luc细胞适用于抗流感病毒药物的筛选。
Figure ISA00000335113300031
Figure ISA00000335113300041
Figure ISA00000335113300051
Figure ISA00000335113300061
Figure ISA00000335113300071

Claims (10)

1.如下重组质粒在制备检测流感病毒的试剂盒中的应用；或，如下重组细胞在制备检测流感病毒的试剂盒中的应用：
所述重组质粒是在出发表达载体的多克隆位点间插入如下融合基因，得到的重组质粒；
所述融合基因，是由片段1、报告基因和片段2依次连接构成的融合基因；片段1的核苷酸序列为AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段2的核苷酸序列为AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT；
所述重组细胞，是向出发细胞中转入所述重组质粒，得到的重组细胞。
2.如下重组质粒在制备筛选抗流感病毒药物的试剂盒中的应用；或，如下重组细胞在制备筛选抗流感病毒药物的试剂盒中的应用：
所述重组质粒是在出发表达载体的多克隆位点间插入如下融合基因，得到的重组质粒；
所述融合基因，是由片段1、报告基因和片段2依次连接构成的融合基因；片段1的核苷酸序列为AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段2的核苷酸序列为AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT；
所述重组细胞，是向出发细胞中转入所述重组质粒，得到的重组细胞。
3.如下重组质粒在筛选抗流感病毒药物中的应用；或，如下重组细胞在筛选抗流感病毒药物中的应用：
所述重组质粒是在出发表达载体的多克隆位点间插入如下融合基因，得到的重组质粒；
所述融合基因，是由片段1、报告基因和片段2依次连接构成的融合基因；片段1的核苷酸序列为AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段2的核苷酸序列为AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT；
所述重组细胞，是向出发细胞中转入所述重组质粒，得到的重组细胞。
4.根据1-3中任一所述的应用，其特征在于：
所述报告基因为荧光素酶编码基因；
所述出发表达载体为pRep4载体；
所述出发细胞为Hela细胞；
所述流感病毒为A/WSN/33流感病毒；
所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5′末端第14到1734位所示。
5.一种重组细胞，是向出发细胞中转入重组质粒，得到的重组细胞；所述重组质粒是在出发表达载体的多克隆位点间插入如下融合基因，得到的重组质粒；
所述融合基因，是由片段1、报告基因和片段2依次连接构成的融合基因；片段1的核苷酸序列为AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段2的核苷酸序列为AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于：
所述出发细胞为Hela细胞；
所述报告基因为荧光素酶编码基因；
所述出发表达载体为pRep4载体；
所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5′末端第14到1734位所示。
7.如下融合基因在制备检测流感病毒的试剂盒中的应用：
由片段1、报告基因和片段2依次连接构成的融合基因；片段1的核苷酸序列为AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段2的核苷酸序列为AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
8.如下融合基因在制备筛选抗流感病毒药物的试剂盒中的应用：
由片段1、报告基因和片段2依次连接构成的融合基因；片段1的核苷酸序列为AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段2的核苷酸序列为AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
9.如下融合基因在筛选抗流感病毒药物中的应用：
由片段1、报告基因和片段2依次连接构成的融合基因；片段1的核苷酸序列为AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段2的核苷酸序列为AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
10.根据7-9中任一所述的应用，其特征在于：
所述报告基因为荧光素酶编码基因；
所述流感病毒为A/WSN/33流感病毒；
所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5′末端第14到1734位所示。
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