CN115927461A - 一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒及其构建方法和应用，属于报告质粒构建领域。该报告质粒包括功能目的片段，功能目的片段的中间为一段反向插入的报告基因，其侧翼序列为IAV基因片段,其两端的外侧为具有自剪切功能的核酶，功能目的片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明利用流感病毒感染诱导荧光成像与生物成像的报告质粒作为检测病毒复制的分子模型，可快速检测病毒复制。同时，该报告质粒还可用抗流感病毒药物筛选与流感疫苗中和抗体的中和滴度的评价。另外，该报告质粒的启动子为CMV，可克服种属差异性，可在广泛宿主体内表达。

Description

一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒及其构建方法和应用，属于报告质粒构建领域。

背景技术

eGFP，即增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein)，GFP，即绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein)。eGFP是GFP突变系，应用较多的是GFP的突变体：增强型绿色荧光蛋白(eGFP)(64位苯丙一亮)，发射出的荧光强度比GFP大6倍以上。

Gluc：是Gaussia萤光素酶，为萤光素酶的一种。

pcDNA3.1-puro(+)是由目前最常用的哺乳动物表达载体之一的PCDNA3.1(+)改造过来，载体使用CMV强启动子调控外源基因的表达。载体拷贝数很高，表达量也很高。无荧光标记，无tag标签。Amp+原核筛选抗性，puro+真核筛选抗性，可以利用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株。

目前常规检分离病毒与检测流感病毒复制的手段有噬斑试验，TCID₅₀检测等，然而这些方法对实验操作要求高，耗时长(常规需要3-4天)，判读结果存在一定的主观性。当前，主要采用报告病毒(示踪病毒)实现细胞成像或活体动物成像，来实现高效实时评价病毒增殖过程。这类报告病毒利用caspase识别位点或者猪捷申病毒的2A肽在流感病毒的NA、NS1或PB2等基因片段插入报告基因，构建可表达报告蛋白的重组病毒，感染宿主细胞或宿主动物后实现成像。但由于发光机制的局限，通常对病毒滴度要求较高，与自然病毒感染过程存在巨大差异；同时生物光源量子效率偏低，无法实现活体持续成像观察；此外，重组病毒基因组结构不稳定，与野生型表型存在生物学特征差异，复制能力与致病性也发生变化，报告基因也易丢失；尤其是，报告病毒策略意味着需要针对每种亚型流感病毒都需要构建新的示踪病毒。除了重组荧光示踪病毒策略外，还有把荧光集团或量子点标记到病毒表面的示踪方法。但传统直接标记方法缺乏特异性，并干扰病毒与宿主细胞的结合，影响病毒感染效率。利用宿主细胞膜磷脂交换实现包膜病毒的囊膜标记，进而利用磷脂衍生物实现病毒囊膜生物素化或炔基化，通过与链霉亲和素或者与叠氮基的相互作用，实现量子点或者荧光探针对活病毒的标记，但叠氮等基团的修饰效率受磷脂衍生物的代谢途径和代谢效率影响大，标记基团数量受限，对实验技术要求高。总之，当前流感病毒成像技术主要集中于获得可发出稳定的光化学信号的可视化示踪病毒，本质仍局限于对病毒改造范畴，在病毒使用兼容性、高灵敏性和易用性均存在诸多不足。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种针对流感病毒的报告质粒及其构建方法和应用，以克服上述问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒，包括功能目的片段，所述功能目的片段的中间为一段反向插入的报告基因，其侧翼序列为IAV基因片段,其两端的外侧为具有自剪切功能的核酶。

进一步，所述报告基因为eGFP或Gluc，其侧翼序列为A/WSN/1933(H1N1)的NP片段的5’NCR与3’NCR基因片段，其两端的外侧为具有自剪切功能的锤头型核酶HHRz和肝炎病毒核酶HDVRz以及相应的限制性内切酶酶切位点Nhe I和Not I序列，所述功能目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

其中，报告基因除了eGFP或Gluc外，还可以更换为其他的报告基因，如：荧光蛋白可以为绿色荧光蛋白、mCherry、RFP等红色荧光蛋白；萤光素酶可以为萤火虫萤光素酶(Fluc)、海肾萤光素酶(Rluc)、Gaussia萤光素酶(Gluc)等以及其他碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、葡糖醛酸糖苷酶(GUS)相关报告基因。

侧翼序列除了来自于A/WSN/1933(H1N1)的NP片段的5’NCR与3’NCR基因序列，同时还可来自于不同亚型IAV其他基因片段的基因序列，如：A/PR8/1934(H1N1)的M片段相应NCR序列、A/WSN/1933(H1N1)的PB2片段的NP的NCR序列。

核酶除上述锤头型核酶HHRz和肝炎病毒核酶HDVRz外，还可以是其他类似具有剪切功能的核酶，包括锤头型，发夹型，肝炎δ病毒核酶，VS核酶以及大分子核酶等。

进一步，所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的核苷酸序列如SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示。

本发明的有益效果是：本发明利用流感病毒感染诱导荧光成像的报告质粒作为检测病毒复制的分子模型，可快速检测病毒复制(最快在病毒感染8-10小时检测出病毒，病毒最低可在PFU＝10左右可检出，常规可在24小时判读结果)，报告基因表达在一定时间内与病毒复制的水平呈一定的线性关系；同时，该报告质粒还可用抗流感病毒药物筛选与流感疫苗的疗效评价。另外，该报告质粒的启动子为CMV，可克服种属差异性，可在广泛宿主体内表达。

同时，本发明无需改造病毒，即可实现病毒感染细胞后诱导特异荧光蛋白或萤光素酶表达，避免病毒重组改造为报告病毒后生物学特征发生不可预知改变的不足；同时，本发明适用于多种亚型流感病毒感染诱导，具有广谱性。本发明未来即可用于构建流感病毒感染体内外示踪，还可用于抗病毒药物筛选和快速评价研究。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

本发明还涉及一种所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的构建方法，将所述功能目的片段以含有相应报告基因的质粒DNA为模板，设计相关引物进行PCR扩增，通过酶切、连接等分子克隆技术将功能目的片段插入到pcDNA3.1-puro载体质粒上，由此构成流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒。

进一步，所述构建方法包括以下步骤：

(1)设计含有A/WSN/1933(H1N1)的NP片段的两端NCR(非编码区)、带有自剪切功能的核酶及中间开放阅读边框为eGFP或Gluc的功能目的片段，并加入酶切位点Nhe I和Not I序列；以pEGFP-N1或pTK-Gluc为模板，进行PCR扩增；

以pEGFP-N1为模板时，引物序列如下所示:

eGFP-F:ATAGCTAGCTGTTTCTACTCTGATGAGG；

eGFP-R:ATAGCGGCCGCTGGC；

以pTK-Gluc为模板时，引物序列如下所示:

Gluc-F:ATAGCTAGCCTGATGAGGCCGAAAGGCC；

Gluc-R:ATAGCGGCCGCTGGCTCTCCCTTAGCCATCC；

(2)胶回收纯化PCR产物；

(3)将胶回收纯化的PCR产物及pcDNA3.1-puro载体质粒分别用限制性内切酶NheI和Not I-HF进行双酶切，得到目的片段酶切产物和pcDNA3.1-puro载体酶切产物；

(4)将目的片段酶切产物和pcDNA3.1-puro载体酶切产物用T4连接酶连接；

(5)将连接产物加入到DH5α感受态细胞中进行转化；

(6)挑取单克隆菌落进行震荡扩大培养，并进行PCR鉴定，将阳性菌液进行扩大培养，进行质粒抽提并送测序鉴定，测序正确的即为所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒。

进一步，步骤(1)中，PCR反应体系如下：模板pEGFP-N1或pTK-Gluc 1μL，eGFP-F或Gluc-F引物2μL，eGFP-R或Gluc-R引物2μL，PCR Mix(BBI2×High Fidelity PCR MasterMix)25μL，加入无菌去离子水至50μL；PCR反应条件如下：95℃预变性1min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；降温至12℃结束反应。

进一步，步骤(1)和步骤(2)之间，还包括以下步骤：取50μL PCR扩增产物，加10μL上样缓冲液，混匀后点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，15V/cm电泳。

进一步，步骤(2)中，PCR产物采用凝胶回收试剂盒切胶回收，具体操作步骤按照该试剂盒说明书进行。其中，凝胶回收试剂盒具体可选用PureLink Quick Gel Extractionand PCR Purification Combo kit公司生产的凝胶回收试剂盒。

进一步，步骤(3)中，回收纯化的PCR产物的酶切体系为DNA 1μg，Nhe I 1μL，NotI—HF 1μL，酶切缓冲液5μL，加去离子水至50μL；pcDNA3.1-puro质粒的酶切体系为DNA500ng，NheI 1μL，Not I-HF 1μL，2.1buffer 5μL，加去离子水至50μL；反应体系于37℃消化2h，之后将消化后的反应体系全部经1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离，将功能目的片段采用凝胶回收试剂盒切胶回收。

进一步，步骤(4)中，连接体系为10×T4连接酶反应缓冲液2μL，pcDNA3.1-puro载体酶切产物4μL，目的片段酶切产物13μL，T4连接酶1μL。

进一步，步骤(5)具体为：无菌条件下取10μL连接产物加入到50μL DH5α感受态细胞中,混匀后静置冰浴30min，42℃热激60sec，立即置于冰上2-3min，加入950μL无抗性LB培养基，37℃孵育1h(孵育的方式可选用摇床震荡)，吸取100μL菌液涂板至氨苄青霉素抗性Amp+的LB培养基，37℃孵育12h；待长出菌落后，挑单菌落至1000μL的氨苄青霉素抗性Amp+的LB培养基中培养6-8h，用Taq PCR预混液，采用与步骤(1)一致的上下游引物进行菌液PCR鉴定，得到与目的条带一致大小的条带即为阳性菌液；其中阳性菌液PCR反应体系：Taq PCRMaster Mix 12.5μL，上下游引物各1μL，菌液2μL，补加无核酸酶水至25μL；PCR反应条件如下：预热94℃4min，1个循环，变性94℃30sec，退火58℃30sec，延伸72℃60sec；35个循环，延伸72℃10min，1个循环

进一步，步骤(6)具体为：将单克隆筛选阳性菌液10μL加入到含有8mL液体培养基的10mL菌管中，于37℃恒温摇床培养12-16h，之后进行去内毒素质粒提取，并送测序鉴定，测序正确的即为所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒，于-20℃保存备用。去内毒素质粒提取步骤可以按照Omega Bio-tek公司的Endo-free Plasmid Mini Kit II说明书进行。

进一步，所述送测序鉴定步骤具体为：取2μL菌液作为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像系统中拍照记录，经菌液PCR鉴定结果为阳性的菌液重新扩大培养并进行质粒抽提，抽提过后将质粒送测序，测序正确的即为所得质粒。

本发明还涉及一种稳定转染细胞系，为能长期表达所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒这一外源基因的细胞系。具体是由所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒通过脂质体转染的方式转染到MDCK细胞中,并通过相应浓度的嘌呤霉素加压筛选，并挑取单克隆扩大培养得到。

本发明还涉及一种所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的应用，用于流感病毒样品检测、药物筛选或评价流感抗体效价。

进一步，所述流感病毒样品检测的方法为：利用临床上分离的病毒原液感染提前24小时转染所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的细胞，通过病毒复制从而诱导荧光蛋白或萤光素酶表达，1-2天后，通过荧光镜下观察荧光蛋白的表达或取细胞裂解液与萤光素酶底物结合后在生物发光检测仪的检测下观察萤光素酶的表达，为病毒感染提供客观的判断。

进一步，所述药物筛选的方法为：将病毒原液转染提前24小时转染所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的细胞，在感染吸附1-2小时后，更换含有不同药物浓度的细胞培养基，1-2天后，观察荧光蛋白的表达情况或利用生物发光检测仪检测的萤光素酶的表达情况，来评价药物的作用效果。

进一步，所述评价流感抗体效价的方法为：利用病毒原液与不同浓度的流感抗体的混合物来感染提前24小时转染所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的细胞，1-2天后，观察荧光蛋白的表达情况或利用生物发光检测仪检测的萤光素酶的表达情况，来评价流感抗体的效价。

附图说明

图1为本发明的报告质粒进入宿主细胞的反应原理图；

图2为不同亚型的流感病毒核糖核蛋白复合体表达质粒(vRNP)与pcDNA3.1-puro-eGFP报告质粒共同转染293T细胞24小时后，报告基因表达情况在12、24、48小时倒置荧光显微镜下结果图；

图3为流感病毒A/CA/07/2009(H1N1)以不同PFU感染96孔板中提前转染pcDNA3.1-puro-eGFP报告质粒的细胞(细胞数＝10000/孔)24小时后，荧光蛋白表达情况在荧光显微镜下结果图；

图4为不同亚型的流感病毒核糖核蛋白复合体表达质粒以及与其空载体质粒与pcDNA3.1-puro-Gluc报告质粒共同转染293T细胞24小时后，报告基因表达情况结果图；

图5为不同亚型流感病毒以相同MOI＝0.5的剂量感染提前转染24小时的MDCK细胞后后，报告基因表达情况结果图；

图6为流感病毒A/CA/07/2009(H1N1)的核糖核蛋白复合体相关表达质粒(表达NP/PA/PB1/PB2流感蛋白)转染MDCK-eGFP稳定转染细胞株后，分别在24/48/72小时荧光蛋白表达情况结果图；

图7为将流感病毒H1N1/H5N1核糖核蛋白复合体表达质粒共同转染MDCK-Gluc稳定转染细胞株,24/48/72小时后，报告基因表达情况结果图；

图8为将流感病毒A/CA/07/2009(H1N1)病毒株以不同的感染复数感染MDCK-Gluc细胞,24小时后，报告基因表达情况结果图(同一感染复数的实验孔均设立三个单独实验孔；阴性对照为未感染病毒)；

图9为不同药物浓度抑制萤光素酶表达实例；

图10为流感中和抗体效价的评估实例。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明提供了一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒，包括功能目的片段，所述功能目的片段的中间为一段反向插入的报告基因，其侧翼序列为IAV基因片段,其两端的外侧为具有自剪切功能的核酶。

其中优选为，所述报告基因为eGFP或Gluc，其侧翼序列为A/WSN/1933(H1N1)的NP片段的5’NCR与3’NCR基因片段，其两端的外侧为具有自剪切功能的锤头型核酶HHRz和肝炎病毒核酶HDVRz以及相应的限制性内切酶酶切位点Nhe I和Not I序列，所述功能目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.1中，其依次含有酶切位点Nhe I(GCTAGC)、eGFP(TGTTTCTACTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTCCGTAAGGAGTCAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTACCGATGTCACTCAGTGAGTGATTATCTACCCTGTTTCTACTGGGTCGGCATGGCATCTCC)和酶切位点Not I(GCGGCCGC)，而eGFP包括HH Rz(CTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTCCGTAAGGAGTC)、5’-NCR(Ref.1)(AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT)、GFP(complement)(TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCAT)、3’-NCR(Ref.1)(ACCGATGTCACTCAGTGAGTGATTATCTACCCTGTTTCTACT)、HDVRz(GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGAGCCA)。

进一步，基于SEQ ID NO.1所述功能目的片段的所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.2中，其依次含有酶切位点Nhe I(GCTAGC)、HHRz(REF.1)(CTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTCCGTAAGGAGTC)、5’-NCR(AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT)、Gluc(COMPLEMENT)(TTACACGGCGATCTTTCCGCCCTTCTTGGCCTTTATGAGGATCTCTCTGATTTTTCTTGCGTCGAGTTTTCCGGTAAGACCTTTCGGTACTTCGTCCACAAACACAACTCCTCCGCGCAACTTTTTCGCGGTTGTTACTTGACTGGCGACGTAATCCACGATCTCTTTTTCCGTCATCGTCTTTCCGTGCTCCAAAACAACAACGGCGGCGGGAAGTTCACCGGCGTCATCGTCGGGAAGACCTGCGACACCTGCGTCGAAGATGTTGGGGTGTTGGAGCAAGATGGATTCCAATTCAGCGGGAGCCACCTGATAGCCTTTGTACTTAATCAGAGACTTCAGGCGGTCAACGATGAAGAAGTGTTCGTCTTCGTCCCAGTAAGCTATGTCTCCAGAATGTAGCCATCCATCCTTGTCAATCAAGGCGTTGGTCGCTTCCGGATTGTTTACATAACCGGACATAATCATAGGACCTCTCACACACAGTTCGCCTCTTTGATTAACGCCCAGCGTTTTCCCGGTATCCAGATCCACAACCTTCGCTTCAAAAAATGGAACAACTTTACCGACCGCGCCCGGTTTATCATCCCCCTCGGGTGTAATCAGAATAGCTGATGTAGTCTCAGTGAGCCCATATCCTTGCCTGATACCTGGCAGATGGAACCTCTTGGCAACCGCTTCCCCGACTTCCTTAGAGAGGGGAGCGCCACCAGAAGCAATTTCGTGTAAATTAGATAAATCGTATTTGTCAATCAGAGTGCTTTTGGCGAAGAAGGAGAATAGGGTTGGCACCAGCAGCGCACTTTGAATCTTGTAATCCTGAAGGCTCCTCAGAAACAGCTCTTCTTCAAATCTATACATTAAGACGACTCGAAATCCACATATCAAATATCCGAGTGTAGTAAACATTCCAAAACCGTGATGGAATGGAACAACACTTAAAATCGCAGTATCCGGAATGATTTGATTGCCAAAAATAGGATCTCTGGCATGCGAGAATCTCACGCAGGCAGTTCTATGAGGCAGAGCGACACCTTTAGGCAGACCAGTAGATCCAGAGGAGTTCATGATCAGTGCAATTGTCTTGTCCCTATCGAAGGACTCTGGCACAAAATCGTATTCATTAAAACCGGGAGGTAGATGAGATGTGACGAACGTGTACATCGACTGAAATCCCTGGTAATCCGTTTTAGAATCCATGATAATAATTTTTTGGATGATTGGGAGCTTTTTTTGCACGTTCAAAATTTTTTGCAACCCCTTTTTGGAAACGAACACCACGGTAGGCTGCGAAATGCCCATACTGTTGAGCAATTCACGTTCATTATAAATGTCGTTCGCGGGCGCAACTGCAACTCCGATAAATAACGCGCCCAACACCGGCATAAAGAATTGAAGAGAGTTTTCACTGCATACGACGATTCTGTGATTTGTATTCAGCCCATATCGTTTCATAGCTTCTGCCAACCGAACGGACATTTCGAAGTACTCAGCGTAAGTGATGTCCACCTCGATATGTGCATCTGTAAAAGCAATTGTTCCAGGAACCAGGGCGTATCTCTTCATAGCCTTATGCAGTTGCTCTCCAGCGGTTCCATCTTCCAGCGGATAGAATGGCGCCGGGCCTTTCTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCAT)、3’-NCR(REF.1)TTTACCGATGTCACTCAGTGAGTGATTATCTACCCTGTTTCTACT)、OPTIMIZED ANTIGENOMIC HDVRZ(REF.1)(GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGAGCCA)、NOT I(GCGGCCGC)。

进一步，基于SEQ ID NO.2所述功能目的片段的所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

其中，其依次含有Sequecencing CMV-5F(GACAATTGCATGAAGAATCT)、Mlu I(ACGCGT)、CMV promoter(GTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTC)、CMV-F sequencing primer(CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG)、T7 promoter(TAATACGACTCACTATAGGG)、Nhe I(GCTAGC)、HHRz(TGTTTCTACTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTCCGTAAGGAGTC)、5’-NCR(AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT)、Gluc(complement)(TTAGTCACCACCGGCCCCCTTGATCTTGTCCACCTGGCCCTGGATCTTGCTGGCAAAGGTCGCACAGCGTTGCGGCAGCCACTTCTTGAGCAGGTCAGAACACTGCACGTTGGCAAGCCCTTTGAGGCAGCCAGTTGTGCAGTCCACACACAGATCGACCTGTGCGATGAACTGCTCCATGGGCTCCAAGTCCTTGAACCCAGGAATCTCAGGAATGTCGACGATCGCCTCGCCTATGCCGCCCTGTGCGGACTCTTTGTCGCCTTCGTAGGTGTGGCAGCGTCCTGGGATGAACTTCTTCATCTTGGGCGTGCACTTGATGTGGGACAGGCAGATCAGACAGCCCCTGGTGCAGCCAGCTTTCCGGGCATTGGCTTCCATCTCTTTGAGCACCTCCAGCGGCAGCTTCTTGCCGGGCAACTTCCCGCGGTCAGCATCGAGATCCGTGGTCGCGAAGTTGCTGGCCACGGCCACGATGTTGAAGTCTTCGTTGTTCTCGGTGGGCTTGGCCTCGGCCACAGCGATGCAGATCAGGGCAAACAGAACTTTGACTCCCAT)、3’-NCR(GGTACCGATGTCACTCAGTGAGTGATTATCTACCCTGTTTCTACT)、HdvRz(GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGAGCCA)、Not I(GCGGCCGC)、BGH primer(CCTCGACTGTGCCTTCTA)、BGHPoly A(CGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG)、SV40(1..272,complement)(CTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGC)、StuI(AGGCCT)、SV40(5172..5243,complement)(CGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCT)、puro from px459 v2.0(ATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGAGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGA)、M13R(complement)(GGTCATAGCTGTTTCCTG)、Bsa I(2)(GAGACC)、Amp+(TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCAT)。

进一步，pcDNA3.1-puro载体质粒由pcDNA3.1进行puro抗性基因改造而成，利用酶切、连接的分子克隆手段将该抗性基因插入pcDNA3.1载体上，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还涉及一种所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的构建方法，将所述功能目的片段用含有相应报告基因的质粒DNA为模板，设计相应引物进行PCR扩增，然后通过酶切、连接等分子克隆技术将功能目的片段插入到pcDNA3.1-puro载体质粒上，由此构成流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒。

进一步，所述构建方法包括以下步骤：

(1)设计含有A/WSN/H1N1的NP片段的两端NCR(非编码区)、带有自剪切功能的核酶及中间开放阅读边框为eGFP或Gluc的功能目的片段，并加入酶切位点Nhe I和Not I；以pEGFP-N1或pTK-Gluc为模板，进行PCR扩增；

以pEGFP-N1为模板时，引物序列如下所示:

eGFP-F:ATAGCTAGCTGTTTCTACTCTGATGAGG(SEQ ID NO.6所示)；

eGFP-R:ATAGCGGCCGCTGGC(SEQ ID NO.7所示)；

以pTK-Gluc为模板时，引物序列如下所示:

Gluc-F:ATAGCTAGCCTGATGAGGCCGAAAGGCC；(SEQ ID NO.8所示)

Gluc-R:ATAGCGGCCGCTGGCTCTCCCTTAGCCATCC；(SEQ ID NO.9所示)

其中酶切位点分别为GCTAGC和GCGGCC，酶切位点前的碱基(ATA)为保护碱基，正向引物酶切位点为Nhe I，反向引物的酶切位点为Not I

(2)胶回收纯化PCR产物；

(3)将胶回收纯化的PCR产物及pcDNA3.1-puro载体质粒分别用限制性内切酶NheI和Not I-HF进行双酶切，得到目的片段酶切产物和pcDNA3.1-puro载体酶切产物；

(4)将目的片段酶切产物和pcDNA3.1-puro载体酶切产物用T4连接酶连接；

(5)将连接产物加入到DH5α感受态细胞中进行转化；

(6)挑取单克隆菌落进行震荡扩大培养，并进行PCR鉴定，将阳性菌液进行扩大培养，进行质粒抽提并送测序鉴定，测序正确的即为所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒。

进一步，步骤(1)中，PCR反应体系如下：模板pEGFP-N1或pTK-Gluc 1μL，eGFP-F或Gluc-F引物2μL，eGFP-R或Gluc-R引物2μL，PCR Mix(BBI2×High Fidelity PCR MasterMix)25μL，加入无菌去离子水至50μL；PCR反应条件如下：95℃预变性1min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；降温至12℃结束反应。

进一步，步骤(1)和步骤(2)之间，还包括以下步骤：取50μL PCR扩增产物，加10μL上样缓冲液，混匀后点样于1.5％的琼脂糖凝胶(重量分数，以下涉及琼脂糖凝胶的表意相同)上，以50μL DNA标准分子量DL 2000Marker作为参照，15V/cm电泳，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察结果并拍照保存。

进一步，步骤(2)中，PCR产物采用凝胶回收试剂盒切胶回收，具体操作步骤按照该试剂盒说明书进行。其中，凝胶回收试剂盒具体可选用PureLink Quick Gel Extractionand PCR Purification Combo kit公司生产的凝胶回收试剂盒。

进一步，步骤(3)中，回收纯化的PCR产物的酶切体系为DNA 1μg，Nhe I 1μL，Not I1μL，酶切缓冲液5μL，加去离子水至50μL；pcDNA3.1-puro质粒的酶切体系为DNA 500ng，NheI 1μL，Not I-HF 1μL，2.1 buffer 5μL，加去离子水至50μL；反应体系于37℃消化2h，之后将消化后的反应体系全部经1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离，将功能目的片段采用凝胶回收试剂盒切胶回收。

进一步，步骤(4)中，连接体系为10×T4连接酶反应缓冲液2μL，pcDNA3.1-puro载体酶切产物4μL，目的片段酶切产物13μL，T4连接酶1μL。

进一步，步骤(5)具体为：无菌条件下取10μL连接产物加入到50μL DH5α感受态细胞中,混匀后静置冰浴30min，42℃热激60sec，立即置于冰上2-3min，加入950μL无抗性LB培养基，37℃孵育1h(孵育的方式可选用摇床震荡)，吸取100μL菌液涂板至氨苄青霉素抗性Amp+的LB培养基，37℃孵育12h；待长出单个菌落后，挑菌落至1000μL的氨苄青霉素抗性Amp+的LB培养基中培养6-8h，用Taq PCR预混液，采用与步骤(1)一致的上下游引物进行菌液PCR鉴定，得到与目的条带一致大小的条带即为阳性菌液阳性菌液；其中阳性菌液PCR反应体系：Taq PCR Master Mix 12.5μL，上下游引物各1μL，菌液2μL，补加无核酸酶水至25μL；PCR反应条件如下：预热94℃4min，1个循环，变性94℃30sec，退火58℃30sec，延伸72℃60sec，35个循环，延伸72℃10min，1个循环1kb/min。

进一步，步骤(6)具体为：将单克隆筛选阳性菌液10μL加入到含有8mL液体培养基的10mL菌管中，于37℃恒温摇床培养12-16h，之后进行去内毒素质粒提取，并送测序鉴定，测序正确的即为所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒，-20℃保存备用。去内毒素质粒提取步骤可以按照Omega Bio-tek公司的Endo-free Plasmid Mini Kit II说明书进行。

进一步，所述送测序鉴定步骤具体为：取2μL菌液作为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像系统中拍照记录，经菌液PCR鉴定结果为阳性的菌液重新扩大培养并进行质粒抽提，抽提过后将质粒送测序，测序正确的即为所得质粒。

本发明还涉及一种稳定转染细胞系，为能长期表达所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒这一外源基因的细胞系。具体是由所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒通过脂质体转染的方式转染到MDCK细胞中,并通过相应浓度的嘌呤霉素加压筛选，并挑取其中单克隆细胞，并扩大培养得到。

发明的报告质粒进入宿主细胞的反应原理为：如图1所示，当重组报告质粒进入宿主细胞内，宿主细胞的聚合酶与CMV启动子结合，启动重组报告质粒的转录出一段含有5’Cap和3’polyA尾的类似流感片段的mRNA转录本，然后由锤头状核酶发生自剪切作用把两端的帽子和尾巴去掉，形成一段裸露的、含有流感病毒基因片段的NCR和反向报告基因(eGFP/Gluc)的负链RNA,当流感病毒进入细胞后，由流感病毒聚合酶(由流感病毒蛋白PB1、PB2、PA组成)识别流感病毒的NCR，最后由负链的互补链翻译表达出eGFP/Gluc。

本发明的流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒功能验证实验如下：

实施例1：pcDNA3.1-puro-eGFP报告质粒

(一)将报告质粒pcDNA3.1-puro-eGFP与流感病毒vRNP的表达质粒共转染实验：

(1)提前一天准备293T细胞，完全培养基稀释准备好的293T细胞以100μL/孔铺于96孔板，每孔细胞计数约为1.0×10⁴，并放于37℃、5％CO₂(体积分数，以下涉及CO₂的表意相同)细胞培养箱中培养过夜。

(2)待96孔板细胞长满至80％-90％，将上清培养基吸弃，更换新的无血清完全培养基，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中待用。

(3)将各个转染质粒提前稀释为100ng/uL，使用Lipofectamine3000转染试剂盒将相应流感病毒的NP/PA/PB1/PB2的表达质粒与报告质粒转染至293T细胞中。转染体系如下：

脂质体：

DNA:

质粒	100ng
		P3000	0.2μl
Opti-MEM	3.8μl
		总计	5μl

将上述体系分别静置5min后，混合后再静置15min，加入10μL DNA-脂质体复合物/孔至293T细胞中，5％CO₂、37℃孵育箱中培养。实验过程设立阴性细胞对照。

24、48小时倒置荧光显微镜下观察，结果如图2所示(图中白点为绿色荧光)。

图2为不同亚型的流感病毒核糖核蛋白复合体表达质粒(vRNP)与报告质粒pcDNA3.1-puro-eGFP共同转染293T细胞24小时后，报告基因表达情况；阴性对照为报告质粒与质粒空载体pHW2000共同转染，结果未见荧光；同时荧光蛋白的表达随着时间的累加有一定表达量的增加(荧光蛋白的表达与时间和vRNP的量有一定的线性关系)。流感病毒的vRNP复合体的表达质粒均以pHW2000为载体构建，从而证明流感病毒核糖核蛋白复合体(由流感病毒NP/PA/PB1/PB2四蛋白构成)是流感病毒复制与转录的基本功能单位，并且随着流感病毒核糖核蛋白复合体在体内复制表达的增多，进而诱导荧光蛋白表达的增多，从而证明该报告质粒荧光蛋白的表达受流感病毒核糖核蛋白复合体的诱导，并与时间以及流感病毒核糖核蛋白复合体的量有一定的线性关系。

(二)将不同感染复数的流感病毒分离上清液感染提前24小时转染报告质粒的细胞。实验步骤如下：

1)提前一天准备293T细胞，完全培养基稀释准备好的293T细胞以100μL/孔铺于96孔板，每孔细胞计数约为1.0×10⁴，并放于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养过夜。

(2)待96孔板细胞长满至80％-90％，将上清培养基吸弃，更换新的无血清完全培养基，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中待用。

(3)使用Lipofectamine 3000转染试剂盒将报告质粒pcDNA3.1-puro-eGFP转染至293T细胞中。转染体系如下：

脂质体：

DNA：

质粒	100ng
		P3000	0.2μl
Opti-MEM	3.8μl
		总计	5μl

将上述体系分别静置5min后，混合后再静置15min，加入10μL DNA-脂质体复合物/孔至293T细胞中，5％CO₂、37℃孵育箱中培养24小时。

(4)配置为含0.5ug/mL的TPCK胰酶的Opti-MEM低血清培养基。

(5)稀释病毒感染浓度：将60uL的病毒原液与540uL病毒无血清维持培养基混合，将病毒原液稀释10倍；并照此稀释直至pfu＝100；

(6)将96孔板的细胞板旧的培养基遗弃，将pfu＝1×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²/ml(MOI＝1/0.1/0.01/0.001)病毒液分别感染细胞(细胞数为10000/孔)，并维持病毒吸附细胞1小时，中间每隔15分钟轻轻摇晃1次；

(7)1小时过后，将细胞孔的病毒液遗弃，并用PBS缓冲液冲洗细胞2次，之后更换含0.5ug/mL的TPCK胰酶的Opti-MEM低血清培养基；并在24小时后观察荧光蛋白表达情况，结果如图3所示(图中白点为绿色荧光)。

图3为流感病毒A/CA/07/2009(H1N1)以不同PFU感染96孔板中提前转染报告质粒的细胞(细胞数＝10000/孔)24-48小时后，荧光蛋白表达情况；mock为未感染流感病毒。实验结果可以观察到：不同滴度的流感病毒感染诱导的荧光蛋白表达的量不一样，在一定范围内，感染的病毒滴度越高，荧光蛋白的表达量也会增加；同时在病毒较低的情况下(PFU＝10)，该报告质粒也能检测到，证明该报告质粒的灵敏性。

实施例2：pcDNA3.1-puro-Gluc报告质粒

(一)将报告质粒pcDNA3.1-puro-Gluc与流感病毒vRNP构成质粒共转染：

(1)提前一天准备293T细胞，完全培养基稀释准备好的293T细胞以100μL/孔铺于96孔板，每孔细胞计数约为1.0×10⁴，并放于37℃、5％CO₂(体积分数，以下涉及CO₂的表意相同)细胞培养箱中培养过夜。

(2)待96孔板细胞长满至80％-90％，将上清培养基吸弃，更换新的无血清完全培养基，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中待用。

(3)将各个转染质粒提前稀释为100ng/uL，使用Lipofectamine3000转染试剂盒将相应流感病毒的NP/PA/PB1/PB2的表达质粒与报告质粒转染至293T细胞中。转染体系如下：

脂质体：

DNA:

质粒	100ng(各20ng)
		P3000	0.2μl
Opti-MEM	3.8μl
		总计	5μl

将上述体系分别静置5min后，混合后再静置15min，加入10μL DNA-脂质体复合物/孔至293T细胞中，5％CO₂、37℃孵育箱中培养。实验过程设立阴性细胞对照。

不同亚型的流感病毒核糖核蛋白复合体的表达质粒以及与其空载体质粒与报告质粒共同转染293T细胞24小时后，报告基因表达情况(同一亚型流感病毒感染细胞均设置三个复孔)如图4所示，结果为不同亚型的甲流的核糖核蛋白复合体均能诱导报告基因萤光素酶的表达。

不同亚型流感病毒上清以相同MOI＝0.5的剂量感染提前转染24小时的MDCK细胞后后，报告基因表达情况(同一亚型流感病毒感染细胞均设置三个复孔)如图5所示，结果为不同亚型的甲流病毒活毒均能诱导报告基因萤光素酶的表达。

实施例3：稳传细胞系MDCK-eGFP

将生长状态良好的犬肾上皮细胞(MDCK)稀释至细胞1×10⁵个/mL，接种于六孔板中，每孔含10％(体积分数，下同)胎牛血清的培养基体积为2mL，待六孔板中细胞汇合度为80％～90％时，弃去孔中培养基，更换无血清培养基，并加入新鲜配制的脂质体转染体系(lipofectamin3000转染试剂盒)，其中脂质体5μL，转染DNA 2500ng，充分混匀，6-8小时后更换含10％胎牛血清的培养基2mL，置37℃5％CO₂培养箱中培养，48小时后更换含10％胎牛血清的培养基，并加入嘌呤霉素，使其最终浓度为2.5ug/mL。放入37℃5％CO₂培养箱中培养，每隔2d更换一次含2.5ug/mL嘌呤霉素、10％胎牛血清的培养基，持续筛选14天，将存活的细胞消化后计数，取120个细胞转至96孔板中继续培养，10d后挑取单克隆，消化后转入24孔板中37℃5％CO₂培养箱中进行进一步扩大培养，待视野下细胞比例达到90％以上时，接种于T75细胞培养瓶中进一步培养。将每个克隆与流感病毒核糖核蛋白的表达质粒(PB2、PB1、PA、NP)共同转染，筛选荧光蛋白高表达的单克隆细胞，扩增后冻存。

流感病毒vRNP表达质粒诱导单克隆筛选细胞的荧光蛋白表达情况如下：

脂质体：

Lipofectamine 3000	0.3μl
		Opti-MEM	4.7μl
总计	5μl

DNA:

质粒	100ng
		P3000	0.2μl
Opti-MEM	2.8μl
		总计	5μl

图6为流感病毒A/CA/07/2009(H1N1)的核糖核蛋白复合体相关质粒(表达NP/PA/PB1/PB2流感蛋白)转染MDCK-eGFP稳传细胞后，分别在24/48/72小时荧光蛋白表达情况。

实施例3：稳传细胞系MDCK-Gluc

将生长状态良好的犬肾上皮细胞(MDCK)稀释至细胞1×10⁵个/mL，接种于六孔板中，每孔含10％胎牛血清的培养基体积为2mL，待六孔板中细胞汇合度为80％～90％时，弃去孔中培养基，更换无血清培养基，并加入新鲜配制的脂质体转染体系(lipofectamin3000转染试剂盒)，其中脂质体5μL，转染DNA 2500ng，充分混匀，6-8小时后更换含10％胎牛血清的培养基2mL，置37℃5％CO₂培养箱中培养，48小时后更换含10％胎牛血清的培养基，并加入嘌呤霉素，使其最终浓度为2.5ug/mL。放入37℃5％CO₂培养箱中培养，每隔2d更换一次含2.5ug/mL嘌呤霉素、10％胎牛血清的培养基，持续筛选14天，将存活的细胞消化后计数，取120个细胞转至96孔板中继续培养，10d后挑取单克隆，消化后转入24孔板中37℃5％CO₂培养箱中进行进一步扩大培养，待视野下细胞比例达到90％以上时，接种于T75细胞培养瓶中进一步培养。将每个克隆与流感病毒核糖核蛋白的相应表达质粒(PB2、PB1、PA、NP)共同转染，筛选萤光素酶高表达的单克隆细胞，扩增后冻存。

流感病毒vRNP质粒诱导单克隆筛选细胞的荧光蛋白表达情况如下：

脂质体：

Lipofectamine 3000	0.3μl
		Opti-MEM	4.7μl
总计	5μl

DNA:

图7为将流感病毒H1N1/H5N1核糖核蛋白复合体的表达质粒共同转染MDCK-Gluc细胞,24/48/72小时后，报告基因表达情况；

图8为将流感病毒A/CA/07/2009(H1N1)病毒株以不同的感染复数感染MDCK-Gluc细胞,24小时后，报告基因表达情况；(同一感染复数的实验孔均设立三个单独实验孔；阴性对照为未感染病毒)。

本发明还涉及一种所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的应用，用于流感病毒样品检测、药物筛选或评价流感抗体效价。

进一步，目前临床上通过采鼻、咽拭子的的流感病毒待检样品，通过低温保存送回至实验室，通过常规病毒分离操作将临床样本接种到犬肾上皮细胞(对流感病毒感染较敏感)或鸡胚中扩大培养，通过3-4天，甚至一周的培养，通过观察细胞病变或进一步提取病毒核酸进行实时荧光定量PCR来检测样品中有无病毒感染，这无疑存在一定的主观判断以及需要相对多的人力。

而本发明的所述流感病毒样品检测的方法为：利用临床上分离的病毒原液感染提前24小时转染所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的细胞(如对流感病毒感染较敏感的狗肾上皮细胞以及转染效率较高的293T细胞)，通过病毒复制从而诱导荧光蛋白或萤光素酶表达，1-2天后，通过荧光镜下观察荧光蛋白的表达与否(eGFP)或取细胞裂解液与萤光素酶底物结合后在生物发光检测仪的检测下观察萤光素酶的表达与否(Gluc)，为病毒感染提供客观的判断(通过与阴性组对照萤光素酶有四倍以上的增长既可以可判断为有病毒的感染)以及减少一定的操作人力。

进一步，所述药物筛选的方法为：将病毒原液转染提前24小时转染所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的细胞，在感染吸附1-2小时后，更换含有不同药物(该药物的作用靶点为流感病毒聚合酶)浓度的细胞培养基，1-2天后，观察荧光蛋白的表达情况(eGFP)或利用生物发光检测仪检测的萤光素酶的表达情况(Gluc)，主要是通过与未加药的实验组对比观察荧光蛋白的表达有无变化来评价药物的作用效果，一般荧光蛋白表达的量越少，从而证明药物作用的效果越好(例如图9，不同药物浓度抑制萤光素酶表达实例)。

进一步，所述评价流感抗体效价的方法为：利用病毒原液与不同浓度的流感抗体的混合物来感染提前24小时转染所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的细胞，1-2天后，观察荧光蛋白的表达情况(eGFP)或利用生物发光检测仪检测的萤光素酶的表达情况(Gluc)，来评价流感抗体的效价。一般荧光蛋白/萤光素酶表达的量越少，从而证明抗体中和效价越好(例如图10，流感中和抗体效价的评估实例)。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒，其特征在于，包括功能目的片段，所述功能目的片段的中间为一段反向插入的报告基因，其侧翼序列为IAV基因的片段,其两端的外侧为具有自剪切功能的核酶。

2.根据权利要求1所述一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒，其特征在于，所述报告基因为eGFP或Gluc，其侧翼序列为A/WSN/1933(H1N1)的NP片段的5’NCR与3’NCR基因片段，其两端的外侧为具有剪切功能的锤头型核酶HHRz和肝炎病毒核酶HDVRz以及相应的限制性内切酶的酶切位点Nhe I和Not I序列，所述功能目的片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒，其特征在于，所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

4.一种如权利要求1-3任一项所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的构建方法，其特征在于，将所述功能目的片段用限制性内切酶从模板上切下，连接到pcDNA3.1-puro载体质粒上，由此构成流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒，即pcDNA3.1-puro-eGFP/pcDNA3.1-puro-Gluc。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)设计含有A/WSN/1933(H1N1)的NP片段的两端NCR、带有自剪切功能的核酶及中间开放阅读边框为eGFP或Gluc的功能目的片段，并加入酶切位点Nhe I和Not I；以pEGFP-N1或pTK-Gluc为模板，进行PCR扩增；

以pEGFP-N1为模板时，引物序列如下所示:

eGFP-F:ATAGCTAGCTGTTTCTACTCTGATGAGG；

eGFP-R:ATAGCGGCCGCTGGC；

以pTK-Gluc为模板时，引物序列如下所示:

Gluc-F:ATAGCTAGCCTGATGAGGCCGAAAGGCC；

Gluc-R:ATAGCGGCCGCTGGCTCTCCCTTAGCCATCC；

(2)胶回收纯化PCR产物；

(3)将胶回收纯化的PCR产物及pcDNA3.1-puro载体质粒分别用限制性内切酶Nhe I和Not I-HF进行双酶切，得到目的片段酶切产物和pcDNA3.1-puro载体酶切产物；

(4)将目的片段酶切产物和pcDNA3.1-puro载体酶切产物用T4连接酶连接；

(5)将连接产物加入DH5α感受态细胞中，进行转化；

(6)挑取单克隆菌落摇床中震荡，扩大培养，并进行PCR鉴定，将阳性菌液进行扩大培养，进行质粒抽提并送测序鉴定，测序正确的即为所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR反应体系如下：模板pEGFP-N1或pTK-Gluc1μL，eGFP-F或Gluc-F引物2μL，eGFP-R或Gluc-R引物2μL，PCR Mix 25μL，加入无菌去离子水至50μL；PCR反应条件如下：95℃预变性1min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；降温至12℃结束反应；

步骤(1)和步骤(2)之间，还包括以下步骤：取50μL PCR扩增产物，加10μL上样缓冲液，混匀后点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，15V/cm电泳；

步骤(2)中，PCR产物采用凝胶回收试剂盒切胶回收，具体操作步骤按照该试剂盒说明书进行；

步骤(3)中，回收纯化的PCR产物的酶切体系为DNA 1μg，Nhe I1μL，Not I-HF1μL，2.1buffer 5μL，加去离子水至50μL；pcDNA3.1-puro质粒的酶切体系为DNA500ng，Nhe I1μL，Not I-HF1μL，酶切缓冲液5μL，加去离子水至50μL；反应体系于37℃消化2h，之后将消化后的反应体系全部经1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离，将功能目的片段采用凝胶回收试剂盒切胶回收；

步骤(4)中，连接体系为10×T4连接酶反应缓冲液2μL，pcDNA3.1-puro载体酶切产物4μL，目的片段酶切产物13μL，T4连接酶1μL。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)具体为：取10μL连接产物加入到50μL DH5α感受态细胞中,混匀后静置冰浴30min，42℃热激60sec，立即置于冰上2-3min，加入950μL无抗性LB培养基，37℃孵育1h，吸取100μL菌液涂板至氨苄青霉素抗性LB培养基，37℃孵育12h；待长出菌落后，挑单菌落至1000μL的氨苄青霉素抗性LB培养基中培养6-8h，用Taq PCR预混液，采用与步骤(1)一致的上下游引物进行菌液PCR鉴定，得到目的条带大小一致的条带即为阳性菌液；阳性菌液PCR反应体系：Taq PCR Master Mix 12.5μL，上下游引物各1μL，菌液2μL，补加无核酸酶水至25μL；PCR反应条件如下：预热94℃4min，1个循环，变性94℃30sec，退火58℃30sec，延伸72℃60sec；35个循环，延伸72℃10min，1个循环1kb/min；

步骤(6)具体为：将单克隆筛选阳性菌液10μL加入到含有8mL液体培养基的10mL菌管中，于37℃恒温摇床培养12-16h，之后进行去内毒素质粒提取，并送测序鉴定，测序正确的即为所述基于流感病毒诱导报告基因表达的流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒，于-20℃保存备用；

所述送测序鉴定步骤具体为：取2μL菌液作为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像系统中拍照记录，经菌液PCR鉴定结果为阳性的菌液重新扩大培养并进行质粒抽提，抽提过后将质粒送测序，测序正确的即为所得质粒。

8.一种稳定转染细胞系，其特征在于，为能长期表达如权利要求1或2所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒这一外源基因的细胞系。

9.一种如权利要求1或2所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的应用，其特征在于，用于流感病毒样品检测、药物筛选或评价流感抗体效价。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述流感病毒样品检测的方法为：利用临床上分离的病毒原液感染提前24小时转染所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的细胞，通过病毒复制从而诱导荧光蛋白或萤光素酶表达，1-2天后，通过荧光镜下观察荧光蛋白的表达或取细胞上清与萤光素酶底物结合后在生物发光检测仪的检测下观察萤光素酶的表达，为病毒感染提供客观的判断；所述药物筛选的方法为：将病毒原液转染提前24小时转染所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的细胞，在感染吸附1-2小时后，更换含有不同药物浓度的细胞培养基，1-2天后，观察荧光蛋白的表达情况或利用生物发光检测仪检测的萤光素酶的表达情况，来评价药物的作用效果；所述评价流感抗体效价的方法为：利用病毒原液与不同浓度的流感抗体的混合物来感染提前24小时转染所述流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒的细胞，1-2天后，观察荧光蛋白的表达情况或利用生物发光检测仪检测的萤光素酶的表达情况，来评价流感抗体的效价。

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