CN1217751A - 副痘病毒载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及副痘病毒载体。特别是提供了含外源DNA的orf病毒载体。此外源DNA可编码期望表达的异源肽或多肽,或者可编码能够诱导免疫反应的一种抗原。表达抗原的能力使这些载体可以适用于疫苗。
Description
本发明涉及副痘病毒载体、它们的构建方法及其应用。
痘病毒是在被感染细胞的细胞质内进行复制的大DNA病毒。痘病毒家族中的一些种类已被用于表达外源基因。这些种类包括痘苗病毒和禽痘病毒。这些病毒能够递送疫苗抗原到一些种类的动物中。然而修饰过的痘苗病毒和禽痘病毒的应用有多种缺点。
痘苗病毒在哺乳动物中宿主范围广。因而具有很大的种间传染并引起从一种动物到另一种动物的疾病传播的风险。对于任何应用于环境中的载体这是一个明显的不利之处。
另一不利之处是已发现痘苗病毒尤其会引起人的发热反应和瘢痕，有时还会在被感染动物中引起严重疾病。
禽痘病毒具有更多变的宿主范围特异性，虽然它们在哺乳动物中通常不繁殖，但他们经常经历足以引起针对至少一些外源基因的免疫反应的流产性感染，只要这些外源基因整合到禽痘病毒基因组中并在合适的启动子控制下进行表达。
同样用痘苗病毒载体进行的初次感染也会引起针对载体的免疫反应，以致会限制用该载体以传递足够剂量抗原的后续感染能力。
在农业方面，畜牧生产的一个主要局限是寄生虫性疾病的控制。由于在畜养动物种群中畜用药抗性的产生和消费者日益反对在畜牧产品中使用化学制剂，需要一种疾病控制的替代方法。利用副痘病毒载体向宿主中递送抗原的廉价、安全、有效的疫苗的应用，可以作为一种解决这些问题的替代方法。
副痘病毒载体，尤其是orf病毒载体的概念总体上公开于Robinson,A.J.,和Lyttle,D.L(1992)“副痘病毒属：生物学及其作为重组疫苗的可能性”重组痘病毒(“Parapoxviruses:their biology andpotential as recombinant vaccines.”in Recombinant Poxviruses),Chapter9,306-317 M.Binns和G.Smith编CRC Press,(1992),BocaRaton。然而文献中并未指出适宜的基因插入位点或其使orf病毒可作为载体的编码序列。
因而本发明的一个目的是提供一种病毒载体，它能够克服上述列出的与现有痘病毒载体相关的缺点，或者其至少给公众提供一个有用的选择。
相应地，一方面，本发明提供了包括具有外源DNA的副痘病毒的副痘病毒载体。
副痘病毒优选为orf病毒。
符合要求的，外源DNA至少编码一种基因产物，这一产物最为有用的是能够引起免疫反应的一种抗原。
此外，外源DNA优选地还编码至少一种为生物效应器分子的基因产物，最有用的此产物为一种能作为免疫佐剂的细胞因子。
此外，外源DNA优选地还编码一段肽，该肽以与病毒自身蛋白组成杂合或嵌合蛋白的形式进行表达。
具有等效免疫活性的载体的片段或其变体也包括在本发明范围内。
期望外源DNA整合在病毒基因组的非必需区。
优选外源DNA受痘病毒启动子控制，且方便的是一种orf病毒启动子。
另一方面，本发明提供了一种用于制备副痘病毒载体、用于发明的方法中的可复制性转移载体包括以及用这些载体转化的宿主的方法。
另一方面，本发明包括一种疫苗，其包括与一种药学可接受的载体和一种可选的佐剂相结合的上述副痘病毒载体。
在另一方面，本发明涉及副痘病毒载体在真核细胞中制备异源多肽的应用，包括用副痘病毒载体感染细胞，且该多肽一旦表达就分离出来。
虽然将本发明如上进行了广泛的阐述，但是本领域的专业人员能理解本发明不局限于上述内容，还包括下面给出实施例的实施方案。特别是通过参考相关附图会更清楚地理解本发明的特定部分。
图1代表了orf病毒株NZ-2、NZ-7和NZ-10的基因组图谱，显示了限制性内切酶KpnⅠ的酶切位点。这些基因组是双链DNA分子并以水平线代表。每一基因组中与基因组末端相关的内切核酸酶切割位点的位置用垂直线代表。内切酶酶解产生的单个基因组片段用字母表中的字母命名。
图2代表了orf病毒株NZ-2基因组的KpnⅠE片段的一个区域的核苷酸序列。下加破折线的序列含有可能的插入位点。下加冒号的序列代表含有可能的插入位点的血管表皮生长因子样基因的部分。
图3代表图1中所示orf病毒株NZ-7基因组的KpnⅠD片段的一个区域的核苷酸序列。下加破折线序列代表外源基因的插入位点。下加冒号的序列代表包含可能的插入位点的血管表皮生长因子样基因的部分。
图4代表orf病毒株NZ-2的基因组图谱，显示了限制性内切酶HindⅢ的酶切位点。基因组是双链DNA分子并以水平线代表，基因组中与基因组末端相关的内切核酸酶切割位点的位置用垂直线代表。内切核酸酶酶解产生的单个基因组片段用字母表中的字母命名。图中显示了包含片段F的一部分、片段I和J的全部、片段E的一部分的区域，这些片段的序列已经确定。本图显示了编码推定的基因的开放阅读框架。编码推定的基因(H)I1L和(H)I2L的开放阅读框架含有可能的插入位点。另外rpo132与(H)I1L之间、(H)I1L与(H)I2L之间、(H)I2L与(H)E1L之间、(H)E1L与(H)E2L之间的基因间区域代表可能的插入位点。
图5代表了图4所示开放阅读框架的核苷酸序列。包含可能的插入位点的基因(H)I1L和(H)I2L下加冒号。基因间区域内可能的插入位点下加点线。推定的启动子序列以星号标明。
图6代表了orf病毒株NZ-2的基因组图谱，显示出限制性内切酶BamHⅠ的酶切位点。基因组是双链DNA分子并以水平线代表。基因组中与基因组末端相关的内切核酸酶切割位点的位置用垂直线代表。内切核酸酶酶解产生的单个基因组片段用字母表中的字母命名。本图显示了包含有已测定DNA序列的BamHⅠF片段和BamHⅠC的一部分的区域。编码DNA拓扑异构酶(F4R)以及推定的基因F1L、F2L、F3R和C1L的开放阅读框架以未填充的箭头表示。
图7代表了图6中所示orf病毒株NZ-2基因组中BamHⅠF片段和BamHⅠC片段的一部分的核苷酸序列。下加破折线的序列代表了可能的插入位点。推定的启动子序列PF1L、PF2L、PF3R及PC1R以星号标明。
图8代表了orf病毒株NZ-2的基因组图谱，显示出限制性内切酶BamHⅠ的酶切位点。基因组是双链DNA分子并以水平线代表，基因组中与基因组末端相关的内切核酸酶切割位点的位置用垂直线代表。内切核酸酶酶解产生的单个基因组片段用字母表中的字母代表。图中显示了包含有已测定DNA序列的BamHⅠH、BamHⅠE、BamHⅠG片段及BamHⅠB片段的一部分的区域。编码推定的基因的开放阅读框架用未填充箭头表示。图中还显示了缺失的包含开放阅读框架E2L,E3L及G1L的3.3千碱基对的位置。
图9代表了图8所示的orf病毒株NZ-2基因组中的片段BamHⅠE和片段BamHⅠG的核苷酸序列。在编码推定的基因E2L,E3L和G1L的区域中可能的插入位点用下加冒号标出。用点线标出了在基因间区域中可能的插入位点。推定的启动子序列用星号标明。在源自NY-2的一种突变株中则没有位于ITR连结与标出的缺失终点之间的区域。
图10代表来自orf病毒株NZ-2基因组中作为转录启动子的核苷酸序列。标明了早期和晚期启动子序列。对于每一序列左侧末端为5’末端。
图11质粒pSP-PFlac的构建步骤示意图。
图12质粒pSP-SFPgpt32的构建步骤示意图。
图13质粒pFS-gpt的构建步骤示意图。
图14质粒pVU-DL104与pVU-DL106的构建步骤示意图。
图15质粒ptov2与ptov3的构建步骤示意图。
图16质粒ptov6的构建步骤示意图。
图17质粒ptov8的构建步骤示意图。
图18质粒pVU-DL45W与pVU-DL45W1的构建步骤示意图。
图19质粒pVU-DL45Wlac与pVU-DL45Wllac的构建步骤示意图。
图20概括了重组orf病毒的产生方案。
图21A给出了引物zxs-1、zxs-2、zxs-3和zxs-4的核酸序列，这些引物用于产生转移载体pTvec50的orf病毒序列的扩增。
图21B给出了表示修饰过的基因间区域的核酸序列，这一区域在pTvec50中位于RNA聚合酶亚单位基因(rpo132)和(H)I1L之间，其中还显示了新产生的限制性内切酶ApoⅠ,NsiⅠ,NcoⅠ和EcoRⅠ的限制性位点。原始OV序列上zxs-3引物的引发位点用星号表示，新形成的转录终止信号(TTTTTAT)以粗体表示。
图22质粒pTvec1及pTvec-50的构建步骤示意图。
图23转移载体pTvec50lac-1和pTvec50lac-2的构建步骤示意图。
第一方面，本发明提供了含有包括外源DNA的副痘病毒的副痘病毒载体。优选地，副痘病毒是一种orf病毒。orf病毒的宿主范围相对较窄，通常限于绵羊、山羊、猴和人。窄宿主范围避免与以痘苗病毒为载体在环境中应用的相关缺点，特别的，可以限制种间传染。绝大多数动物和鸟仅仅经历一次orf病毒的流产性感染，但orf病毒仍可以递送免疫反应剂量的一些抗原。
相应地，较窄的宿主范围使orf病毒可以应用于通常抗orf病毒感染的动物以刺激一种免疫反应。orf病毒具体的也能递送抗原到鸟类中，该病毒在鸟类中不繁殖。
orf病毒的另一优点在于对人的毒性小于痘苗病毒。不同于痘苗病毒，orf病毒不会导致发热反应且其病斑治愈后不留瘢痕。理想化地，orf病毒失去原有的毒性因子。orf病毒综述于Robinson,A.J.和Balassu,T.C.(1981)，传染性多泡状突起皮炎(orf)(Contagiouspustular dermatitis(orf)),Vet Bull 51,771-761以及Robinson,A.J.和Lyttle,D.L(1992)，“副痘病毒属：生物学及其作为重组疫苗的可能性”重组痘病毒(“Parapoxviruses:their biology and potential asrecombinant vaccines.”in Recombinant Poxviruses),Chapter9,306-317 M.Binns和G.Smith编，CRC Press,(1992),Boca Raton.
“包含外源DNA”一词在此表示整合入病毒基因组中的外源DNA。
优选地，orf病毒载体中的外源DNA是一种编码一种或多种基因产物的基因。基因产物可以是一种异源肽或多肽，但最合适的是能在所感染的宿主中引起免疫反应的一种或多种抗原。外源DNA也可以含有编码多种抗原的联合物的几种基因。在需要时，这种(些)抗原可以通过用合适的抑制剂、修饰剂、交联剂或/和变性剂处理，以提高其稳定性或免疫原性。
已有一些在医学及兽医学上具有重要意义并可能会整合进orf病毒的外源基因的实例，它们包括HIV被膜蛋白、单纯疱疹病毒糖蛋白、羊绦虫(Taenia ovis)抗原、细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)(棘球蚴囊)抗原、毛圆线虫(Trichostrongylus)以及胃肠寄生虫抗原例如血毛线虫(Haemonchus)、胃线虫(Ostertagia)抗原或其组合体，但不局限于此。
优选的抗原包括如WO94/22913公开的羊绦虫45W,16kd以及18kd抗原，在此引入作为参考。
在又一优选实施方案中，外源DNA还可以包含细胞因子基因或编码其他生物效应器分子的基因，这类基因与外源抗原性DNA结合后能改变或增强免疫反应。优选的细胞因子基因包括γ-干扰素和白介素包括IL-1、IL-2、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12以及最优选的或是单独的IL-1、IL-2和IL-12或是其组合。
在另一实施方案中，外源DNA还可以包含一种或多种报告基因和/或至少一种编码选择性标记的基因。
周知的报告基因中适用的实施例包括大肠杆菌β-半乳糖苷酶(lacz)、Photinus pyralis萤火虫荧光素酶(lux)、分泌性胎盘碱性磷酸酶(SEAP)及维多利亚水母(Aequorea victoria)绿色荧光蛋白(gfp)。
已知的适合用于本发明的选择性标记基因包括黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(xgpt)及新霉素磷酸转移酶(aphⅡ)。
在一特定的优选实施方案中，外源DNA包含与一种或多种生物效应器DNA分子联合使用的编码多种抗原的一些基因以增强免疫反应。在实际情况下编码的多种抗原个数通常为20或少于20，优选地为10或少于10。
此外，外源DNA优选地编码一段肽，该肽以与病毒自身蛋白组成杂合或嵌合蛋白的形式进行表达。
在本发明的这一实施方案中，外源DNA编码形成病毒蛋白的一部分的肽序列。病毒自身蛋白保持了它原有的性质，但还表现出由外源DNA编码的额外的抗原决定簇、酶学性质或受体结合功能。这样的嵌合蛋白可以被分泌或是形成病毒被膜或病毒衣壳的一部分。
本发明范围之内还包括具有等效免疫活性的本发明的载体的片段或变体。利用本领域已知的技术通过一个或多个氨基酸的插入、删除或替换可以制备这样的变体。(Sambrook,J.Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,分子克隆实验手册第二版(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)(Second Edition),Cold Spring Harbour Laboratory Press1989)。
如读者所理解，也期望外源基因整合到orf病毒基因组的非必需区。特别是基因必须插入不会干扰病毒复制的区域。
出乎意料的是，在orf病毒中没有找到在痘苗病毒中用作插入位点的非必需的胸苷激酶基因。因而有必要在orf病毒中确定替代的非必需区域的位点。
依据orf病毒DNA限制性酶切图谱可以确定非必需区位点。附图1显示了orf病毒株NZ-2,NZ-7和NZ-10的DNA图谱。
可能的插入位点包含于下列限制性片段之中：NZ-2株的KpnⅠE,NY-7株的KpnⅠD和NZ-10的KpnⅠD片段。可能的插入位点位于图8和图9所示的NZ-2株的BamHⅠE和BamHⅠG限制性片段。其它可能的插入位点已经确定，以基因间区域位于编码病毒基因的区域之间。另外的实施例见图4和5中(NY-2株的限制性片段HindⅢ F、J、I和E)以及图6和7中(NZ-2株的限制性片段BamHⅠF和C)所示。也包括在本发明的范围内的其它插入位点，例如orf病毒基因组DNA序列中的任何非必需基因或基因间区域。此外，一次也可以选择一个或多个插入位点。
目前有两种优选的插入位点。其中的第一种是位于RNA聚合酶亚单位基因(rpo132)和推定的基因(H)I1L的开放阅读框架之间的基因间区域(图4)。如图5所示，这一插入位点长度为90个核苷酸，从第11位延伸至第96位。
第二种优选的插入位点是位于基因E3L(图8)起点的NcoⅠ位点。如图9所示，这一插入位点长度为61个核苷酸，从第2226位延伸至2286位。
也可以理解的是，如果外源基因得以表达，它肯定受到能表达这一基因的转录启动子的控制。
关于痘病毒启动子的描述见Moss,B.(1990)，痘苗病毒转录调控(Regulation of vaccinia virus transcription.)生物化学年鉴( AnnuRev Biochem.)59,661-88，在此引入作为参考。如其所述，负责拷贝基因以产生mRNA的痘病毒RNA聚合酶复合体可以转录有痘病毒启动子引导的任何基因。
因此优选的使用的启动子是痘病毒启动子，特别是副痘病毒启动子。目前优选的启动子是一种orf病毒启动子。该orf病毒启动子可以是早期、中期或晚期启动子。核苷酸序列测定已确定了一系列包括早、中、晚期启动子的orf病毒转录启动子。图10显示了orf病毒启动子的早期和晚期启动子
优选的一种启动子是推定的基因E1L的早期启动子，该基因早先被描述为ORF-3，见Fraser,K.M.,Hill,D.F.,Mercer,A.A.和Robinson,A.J.(1990)，副痘病毒属orf病毒基因组反向末端重复的序列分析(Sequence analysis of the inverted terminal repetition in thegenome of the parapoxvirus,orf virus.)病毒学(Virology.)176,379-89以及Fleming,S.B.,Fraser,K.M.,Mercer,A.和Robinson,A.J.(1991)，位于orf病毒中早期基因侧翼的痘苗病毒样的早期转录控制序列(Vaccinia virus-like early transcriptional control sequences flankan early gene in the orf parapoxvirus.)基因(Gene),97,207-212.
晚期启动子优选PF1L和PF3R。关于这些启动子的相对强度和时序表达的初步研究表明PF3R是一种早-晚期启动子，因而目前优选的是表达编码抗原性多肽的克隆基因的启动子。PF1L是一种强的晚期启动子，目前是表达β-半乳糖苷酶报告基因的优选启动子。启动子及其控制的基因的方向可以按需要进行安排。也可以使用启动子的组合。
另一方面，本发明包括适于制备本发明的修饰过的orf病毒载体的可复制性转移载体。可复制性转移载体可以按本领域熟知的技术构建(Sambrook,J.Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,分子克隆实验手册第二版(Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Second Edition)),Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989.)或者从本领域中可得的克隆载体中筛选。
克隆载体可以依据所用的宿主进行选择。适用的载体通常具有以下特点：
(ⅰ)自我复制的能力；
(ⅱ)拥有针对任一特定限制性内切酶的单一靶点；以及
(ⅲ)期望的携带具有易于筛选的标记例如抗生素抗性的基因。
具有上述特点的两种主要类型的载体是质粒和细菌病毒(噬细菌体或噬菌体)。本发明优选采用质粒载体。质粒载体包含orf病毒基因组的非必需区，受一个或多个orf病毒启动子控制的一种或多种外源基因，以及细菌质粒DNA的片段。此载体可以是线性DNA分子，但优选为环状。
构建修饰的orf病毒时，如能用一种方便、快速的分析方法区分修饰和未修饰的病毒将十分有利。这样的分析包括可测量的颜色改变，抗生素抗性等等。为了达到快速分析的目的，病毒载体最好还包括至少一种报告基因如lacz以及/或至少一种选择性标记基因如x-gpt。
在一个优选的实施方案中，黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(x-gpt)和β-半乳糖苷酶基因被插入到质粒载体中，并受合适的orf病毒转录启动子控制。插入基因的方向对于确定转染后能否获得重组体也很重要。图14显示了pVU-DL101和pVU-DL102中方向不同的x-gpt基因。
另一方面，本发明提供了制备一种修饰过的orf病毒载体的方法。该方法包括将上述质粒克隆载体转入由orf病毒感染的所选的宿主细胞。合适的转染方法为本领域所熟知，例如磷酸钙介导的转染，见Graham,F.L.和Van der Eb,A.J.(1973)，人类腺病毒5型DNA传染力分析的一种新方法(A new technique for the assay of infectivity ofhuman adenovirus type 5 DNA.)病毒学(Virology),52,456-467中所述。其它的方法包括电穿孔法、显微注射法、脂质体或球形体介导的转移法，但不局限于此。优选地，采用脂质体介导的转染法。关于此方法见Felgner,P.L.,Gadek,T.R.,Holm,M.,Roman,R.,Chan,H.W.,Wenz,M.,Northrop,J.P.,Ringold,G.M.和Danielsen,M.(1987)，脂质体转染：一种高效、脂质体介导的DNA转染方法(Lipofection:ahighly efficient,lipid-mediated DNA-transfection procedure.)美国国家科学院学报(Proc Nati Acad Sci)USA,84,7413-7417。
一旦用克隆载体转化所选的宿主就可以产生重组体或修饰过的orf病毒载体。修饰过的病毒可以用如上述的快速方法检测。对于优选的载体，在便于选择的X-gal平板上出现蓝色表型的菌落就可以检测到β-半乳糖苷酶基因的存在。一经选择，可以用常规方法从培养物中分离这些载体，例如冻融抽提法。必要时可用传统方法进行纯化。图20显示了产生修饰过的orf病毒的策略。
转化的宿主细胞也构成本发明的一部分。许多宿主细胞为本领域所熟知，包括细菌、昆虫、植物和动物细胞。宿主细胞优选地为真核细胞。尤其期望是哺乳动物宿主细胞。本发明优选的宿主细胞是初级牛睾丸细胞或初级羊睾丸细胞(羔羊睾丸细胞)。
可以理解的是，在本发明的又一方面，上述方案也可以用于制备异源多肽以及抗原。
另一方面，本发明包括一种疫苗制品，其含有修饰过的orf病毒，此病毒含有与药学可接受的稀释剂或载体以及可选性的佐剂相结合的外源抗原性DNA或具有等效免疫活性的片段或变体。本领域专业人员所熟知的佐剂合适的实例包括皂苷、弗氏佐剂、油包水乳剂、甘油、山梨糖醇、葡聚糖及其它。一般来说，佐剂只用于非活性病毒疫苗制品。
另一方面，本发明包括一种疫苗制品，其含有修饰过的orf病毒，此病毒含有与编码细胞因子基因或与编码能改变或增强现有免疫反应的其它生物效应器分子的基因的外源DNA相结合的外源抗原性DNA。
疫苗可以制成任何方便的、生理学可接受的剂型。天花疫苗制备技术已公开于Kaplan,Br.Med Bull.25,131-135(1969)。
最合适的，疫苗制成用于肠道外给药的剂型。在此所用的“肠道外”一词指的是静脉内、肌内、皮内及皮下注射。
此外疫苗还可以制成口服给药剂型。
其它的治疗剂也可与该疫苗合用。
必要时，疫苗可在特定时期内多次使用，以最大限度地产生应答外源抗原的抗体。
将外源基因插入orf病毒中的其它方法也被加以考虑。可能的方法是，可以利用能切开orf病毒DNA一次的限制性内切酶。通过体外诱变之后进行连接的方法可以将切割位点除去。如果切点位于必需基因内部，可以设计诱变以使此基因功能不受影响。这可以通过将全部或部分位于限制性内切酶切割位点的密码子的一个碱基替换成另一个碱基，从而使新的密码子编码同一氨基酸但由于该替换除去了针对这一特定限制性内切酶切割的位点的方法来实现。而后通过诱变可以在任意非必需基因内部产生这一酶切位点。这一酶切位点就可以作为外源基因插入的位点。外源基因的插入可以通过如下操作在细胞外进行：从DNA切点末端除去磷酸以防止重新产生未打断的orf病毒DNA，在连接反应中，将有磷酸化末端的外源基因加入orf病毒DNA，然后将得到的连接混合物转染入接受orf病毒的细胞。为回收此病毒，用一种细胞不接受的痘病毒感染该细胞，例如鸡痘病毒和初级牛睾丸细胞。
提供了非局限性的实施例。实施例1---合适的细胞培养系统的选择
本申请所述方法中所培养的细胞来源于年龄从1天到3个月之间的小牛。由熟悉此操作的兽医在不麻醉情况下将睾丸从动物的阴囊中取出，睾丸取出时保持其壁膜的完整以使培养的细胞无菌。该组织置于冰上送往实验室。而后从睾丸中取出睾丸组织，用本领域人员熟悉的无菌操作将其打散成单个细胞以及小的细胞聚合物，并在有培养液的适宜的培养容器中培养。实施例2---插入位点的确定
不同orf病毒分离株的DNA已利用限制性内切酶法绘制出物理图谱。这些图谱显示该病毒有很多不同的株，虽然这些株在表型上不一定有区别，但可以通过限制性内切酶产生的片段的大小和次序区分它们。从这些数据说明，两株在基因组右侧末端的限制性内切酶KpnⅠ片段上两株之间的大小有差别(Robinson,A.J.,Barns,G.,Fraser,K.,Carpenter,E.和Mercer,A.A.(1987)orf病毒基因组的保守性与可变性(Conservation and variation in orf virus genomes.)病毒学(Virology)157,13-23.)。这两株分别命名为NZ-2,NZ-7，两个片段分别命名为KpnⅠE和KpnⅠD。NZ-7包含有两片段中较大的一条。大小的差别约1千碱基对。另一株称为NZ-10的片段具有一个KpnⅠD片段，该片段大小介于NZ-2和NZ-7中相应片段之间，但在基因组中位于相同的相关位置(见图1)。这种差异表明这一区域的全部或部分序列是非必需的且在这一片段中可以找到插入外源DNA的位点。而后将上述区域进行测序并确定了可能的插入位点(图2及图3)。
另一可能的插入位点在进行株间DNA/DNA杂交时得以确定(例如NZ-2与NZ-7之间)，测得一段长度超过2.75千碱基对的非同源区，它距基因组右侧末端约30千碱基对(Robinson,A.J.,Barns,G.,Fraser,K.,Carpenter,E.和Mercer,A.A.(1987),orf病毒基因组的保守性与可变性(Conservation and variation in orf virus genomes.)病毒学(Virology.)157,13-23以及Naase,M.,Nicholson,B.H.,Fraser,K.M.,Mercer,A.A.,和Robinson,A.J.(1991)，表现出与痘苗病毒融合蛋白基因有同源性的orf病毒序列，(An orf virus sequence showinghomology to the fusion protein gene of vaccinia virus)普通病毒学杂志(J.Gen Virol.)72,1177-1181.)(见图4)。此后将这一区域全部测序并确定了两个基因，HI1L与HI2L，它们都包含可能的插入位点(图5)。
第三种可能的插入位点位于基因组的中央，该处在命名为NZ-41株的BamH1 G片段与已测的其它株的对等区域之间具有100碱基对的大小差别(Robinson,A.J.,Barns,G.,Fraser,K.,Carpenter,E.和Mercer,A.A.(1987),orf病毒基因组的保守性与可变性)Conservation and variation in orf Virus genomes.(病毒学)Virology.157,13-23.)。NZ-2株基因组中对等区域(即片段BamHⅠF)的核苷酸序列已测定，也确定了两个可能的插入位点。(图6及图7)
第四，已发现在细胞培养中病毒繁殖几代后NZ-2株的orf病毒基因组发生自发重排。重排导致右侧末端的长16千碱基对的DNA添加到左侧末端，而左侧末端缺失了3.3千碱基对的DNA。orf病毒的一个转座-缺失变体的基因组分析发现一个3.3千碱基对的非必需DNA区域(Fleming,S.B.,Lyttle,D.L.,Sullivan,J.T.,Mercer,A.A.和Robinson,A.J.(1995)J.Gen.Virol.76,2969-2978)。用Sanger方法已推定了组成允许产生缺失的基因组的区域的核苷酸序列，并且已确定了其中包含的三个基因。这些基因分别对应于E2L，以前称为ORF-1(Fraser,K.M.,Hill,D.F.,Mercer,A.A.和Robinson,A.J.(1990)，副痘病毒属orf病毒基因组反向末端重复的序列分析(Sequence analysisof the inverted terminal repetition in the genome of theparapoxvirus,orf virus.)病毒学(Virology.)176,379-89.),E3L,以前称为ORF-PP(Mercer,A.A.,Fraser,K.M.,Stockwell,P.A.和Robinson,A.J.(1989).副痘病毒属orf病毒中逆转录病毒假性蛋白酶的同源物(A homologue of retroviral pseudoproteases in theparapoxvirus,orf virus.)病毒学(Virology.)172,665-668.)以及G1L(Sullivan,J.T.,Fraser,K.,Fleming,S.B.,Robinson,A.J.和Mercer,A.A.(1995).编码锚蛋白样重复序列的orf病毒基因的序列及转录分析(Sequence and transcriptional analysis of an orf virusgene encoding ankyrin-like repeat sequnce.)病毒基因(VirusGenes.)9,277-282.)。这一区域(图8)是基因插入的另一可能位点。(见图9)。实施例3---orf病毒启动子的确定
orf病毒基因组的所选区域的核苷酸序列的确定使一批orf病毒转录启动子得以确定，首先是依据它们与其它痘病毒转录启动子的相似性，后来是依据功能分析。
图10显示了orf病毒的早期与晚期启动子。已证明早期启动子E1L(ORF-3)在细胞周期早期产生mRNA(Fleming,S.B.,Fraser,K.M.,Mercer,A.和Robinson,A.J.(1991)。位于orf副痘病毒早期基因侧翼的痘苗病毒样早期转录控制序列(Vaccinia virus-like earlytranscriptional control sequences flank an early gene in the orfparapoxvirus.)基因(Gene.)97,207-212)，由于与一种痘苗病毒晚期启动子相似因而推断晚期启动子F1L为一种晚期启动子。orf病毒晚期启动子在瞬时检定中有功能。这些检定已被加以阐述，如(Cochran,M.A.,Mackett,M.和Moss,B.(1985)，依赖于痘苗病毒转录因子和DNA控制序列的真核细胞瞬时表达系统(Eukaryotictransient expression system dependent on transcription factors andregulatory DNA sequences of vaccinia virus.)美国国家科学院学报(Proc Nati Acad Sci USA.),82,19-23)。第三类启动子F3R(被确定为一种早-晚期启动子)也在瞬时检定中有功能。质粒pSP-PFlac的构建在实施例6中加以叙述，并在图11中进行了图示，它包括orf病毒晚期启动子F1L和大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacz)，以使β-半乳糖苷酶基因受orf病毒晚期启动子控制。(A)在瞬时检定中启动子活性的评价
为证明在瞬时检定中启动子具有活性，在使细胞聚集并适于细胞培养液发挥作用的表面积25cm2的塑料瓶中，牛睾丸细胞铺成单层，用orf病毒按大约每个细胞10个噬斑形成单位的感染复数来感染这些细胞。感染后2小时，将包含与待测启动子相连的lacz基因的质粒用脂质体介导转染技术转入感染orf病毒的牛睾丸细胞，如(Felgner,P.L.,Gadek,T.R.,Holm,M.,Roman,R.,Chan,H.W.,Wenz,M.,Northrop,J.P.,Ringold,G.M.和Danielsen,M.(1987)，脂质体转染：一种高效、脂质体介导的DNA转染方法(Lipofection:a highly efficient,lipid-mediated DNA-transfection procedure.)美国国家科学院学报(ProcNati Acad Sci USA.)84,7413-7417中所述，且如实施例B中所述。感染后48小时，将35μl浓度为2％w/v的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷酶(X-gal)水溶液加入到1ml含1％琼脂糖的细胞培养液中，将其覆盖于除去液体培养基后的细胞上，以在室温下形成凝胶(温度范围15～25℃)。24小时后探查在细胞中以及受影响的细胞上层胶中蓝色的产生。所产生的蓝色强于以同样方法处理但其所含质粒包括不受转录启动子控制的β-半乳糖苷酶基因的细胞中所见，这表明所检测启动子是有活性的。
在所测启动子功能的另一方面，进行了瞬时感染的牛睾丸细胞中β-半乳糖苷酶活性的定量测定。在含有24个直径1.5cm孔的多孔塑料组织培养板上，细胞铺成单层生长。单个孔按感染复数为10进行orf病毒的感染，感染后2小时，包含有与β-半乳糖苷酶基因相连的启动子的质粒构建体采用如上述脂质体介导转染技术转入受感染的细胞。通过刮入体积1ml的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，离心收集细胞，以PBS洗并悬浮于200μl体积的PBS中。重复三次冷冻、融化以破碎细胞，离心后保留上清用以测定酶活。β-半乳糖苷酶的检测可以在96孔板上方便地进行。0.1ml反应混合物包括下列成分：100mM磷酸钠，pH7.3,1mM MgCl2,50mMβ-巯基乙醇，终浓度为1.3mg/ml的邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)以及每份10-20μl的细胞裂解液。反应混合物在37℃温育1小时，加入等体积的1M NaCO3以终止反应。用微孔板测定仪在420nm测量每孔的吸光值。吸光值与原提取物中β-半乳糖苷酶活性的高低成比例，由此得以确定表达的时间以及每一启动子构建体的相对强度。实施例4---适合于外源基因插入orf病毒基因组的载体质粒的构建
所选择的非必需DNA是orf病毒的重组突变体中被删除的区域且此区域相关的核苷酸序列见Fraser,K.M.,Hill,D.F.,Mercer,A.A.和Robinson,A.J.(1990)副痘病毒属orf病毒基因组中反向末端重复的序列分析(Sequence analysis of the inverted terminal repetition in thegenome of the parapoxvirus,orf virus.)病毒学(Virology.)176,379-389以及Sullivan,J.T.,Fraser,K.,Fleming,S.B.,Robinson,A.J.和Mercer,A.A.(1995)编码锚蛋白样重复序列的orf病毒基因的序列及转录分析(Sequence and transcriptional analysis of an orf virusgene encoding ankyrin-like repeat sequnce.)病毒基因(VirusGenes)9,277-282且示于图8。所用的orf病毒启动子是早期启动子E1L，见Fraser,K.M.,Hill,D.F.,Mercer,A.A.和Robinson,A.J.(1990)副痘病毒属orf病毒基因组反向末端重复的序列分析(Sequenceanalysis of the inverted terminal repetition in the genome of theparapoxvirus,orf virus.)病毒学(Virology)176,379-389以及Fleming,S.B.,Fraser,K.M.,Mercer,A.和Robinson,A.J.(1991)位于orf病毒早期基因侧翼的类似痘苗病毒的早期转录控制序列(Vacciniavirus-like early transcriptional control sequences flank an early genein the orf parapoxvirus.)基因(Gene.)97,207-212中所述和一种晚期启动子F1L(Fleming,S.B.,Blok,J.,Fraser,K.M.,Mercer,A.A.和Robinson,A.A.(1993)痘苗病毒和orf病毒之间的基因结构及排列的保守性(Conservation of gene structure and arrangement betweenvaccinia virus and orf virus.)病毒学(Virology.)195,175-184.)如图10所示。所选择用以证实产生突变orf病毒过程的外源基因一种是大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因，其优点是蛋白产物表达时可用颜色反应检测(Miller,J.H.(1972).“分子遗传学实验”(“Experiments inMolecular Genetics.”)Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,New York.Moss,B.(1990)痘病毒及其复制“Poxviridaeand their Replication”in Virology,Fieldss等编，第二版Raven Press,New York,2079-2111)；和另一种基因是大肠杆菌鸟苷磷酸核糖转移酶基因(x-gpt)，其表达时可用于从非突变病毒中筛选突变株(Mulligan,R.C.和Berg,P.(1980).哺乳动物细胞中细菌基因的表达(Expression of a bacterial gene in mammalian cells.)科学(Science.)209,1422-1427)。下面是载体质粒构建的描述，图11-13以示意图形式概括了构建过程。(A)在大肠杆菌lacZ基因前部克隆orf病毒晚期启动子
构建orf病毒突变体时，最好能用方便且迅速的方法从未突变病毒中区分突变病毒。通过将编码β-半乳糖苷酶的大肠杆菌基因插入到载体质粒中并受orf病毒转录启动子调控提供了这种方法。通过测定名为BamHⅠF的orf病毒DNA的一个片段的核苷酸序列，确定了晚期orf病毒启动子(Fleming,S.B.,Blok,J.,Fraser,K.M.,Mercer,A.A.和Robinson,A.A.(1993).痘苗病毒和orf病毒之间的基因结构及排列的保守性(Conservation of gene structure and arrangement betweenvaccinia virus and orf virus.)病毒学(Virology.)195,175-184)。此构建过程所用的启动子F1L的序列见图10。从已述的命名为pVU-6的质粒中(Mercer,A.A.,Fraser,K.M.,Barns,G.,和Robinson,A.J.(1987).orf病毒DNA的结构与克隆(The structure and cloning of orfvirus DNA.)病毒学(Virology)157,1-12)可以获取足够量的构建所需的晚期启动子。质粒pVU-6包含有克隆进质粒pUC-8中的orfNZ-2的BamHⅠF片段(Viera,J.和Messing,J.(1982).(puc质粒：一种用于插入突变及用合成通用引物进行测序的M13mp7衍生系统)Thepuc plasmids,an M13mp7 derived system for insertion mutagenesisand sequencing with synthetic universal primers.(基因)Gene.19,259-268.)，以AvaⅠ酶消化质粒pVU-6从orf病毒NZ-2的BamHⅠF片段中删去总长2.62kb的DNA。AvaⅠ可酶切pUC-8多接头中的SamⅠ位点以及BamHⅠE中6个内部AvaⅠ位点。保留在载体片段上的AvaⅠ位点用Klenow DNA聚合酶末端补平并重新连接后，得到质粒pVU-Av6。用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切pVU-Av6后释放出包含orf病毒晚期启动子的725bp的片段。此片段克隆进含“无头的”lacz基因的pMLB1034中(Weinstock,G.M.,Berman,M.L.和Silhavy,T.J.(1983).“基因扩增中与β-半乳糖苷酶的嵌合遗传及其分析”原核与真核细胞中克隆基因的表达(“Chimeric genetics with β-galactosidase in geneamplification and analysis.”in Expression of Cloned Genes inProcaryotic and Eucaryotic Cells),T.S.Papas编，Elsevier,New York,27-64)。此克隆将orf病毒晚期启动子置于lacz之前，并提供给它一个ATG起始密码子以使β-半乳糖苷酶得以合成。这一克隆步骤所得的菌落在利于所需克隆的筛选的X-gal平板上呈现蓝色表型。通过下述克隆步骤可将插入pMLB-1034的lacz下游的单一BalⅠ位点转变为EcoRⅠ位点。用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切质粒pNEO(Beck,E.,Ludwig,A.,Aurswald,EA.,Reiss,B.和Schaller,H(1982)，来自转座子Tn5的新霉素磷酸转移酶的核苷酸序列及确切定位(Nucleotide sequence andexact location of the neomycin phosphotransferase from transposonTn5.)基因(Gene)19,327-336释放出Tn5氨基糖苷3’磷酸转移酶基因。限制位点用Klenow DNA聚合酶补平后，将片段连接入经BalⅠ酶切的pMLB-PF质粒中。涂布于卡那霉素培养基上筛选重组子。根据克隆的氨基糖苷3’磷酸转移酶Ⅱ基因(aphⅡ)的方向在原BalⅠ位点产生EcoRⅠ或BamHⅠ位点。BalⅠ通常不能有效地酶切DNA，但此方法能筛选经BalⅠ酶切并已接受插入的质粒，经常按所需方式对此方法进行修改。用EcoRⅠ酶切质粒pMLB-PFneo，将含有PF-lacZ融合子的4059bp的EcoRⅠ片段克隆进pSP-70(Melton,D.A.,P.A.,K.,Rebagliati,M.R.,Maniatis,T.,Zinn,K.和Green,M.R.(1984)从包含噬菌体SP6启动子的质粒中的具有生物活性的RNA和RNA杂交探针高效体外合成(Efficient in vitro synthesis of biologically active RNAand RNA hybridization probes from plasmids containingbacteriophage SP6 promoter)核酸研完(Nucleic Acids Res.)12,7035-7056)的EcoRⅠ位点，得到了图11所示的命名为pSP-Pnac的质粒。(B)在大肠杆菌X-GPT基因前部克隆orf病毒早期启动子
构建突变的orf病毒时，需要一种从非突变体以及突变体和非突变体的混合物中筛选突变体的方法，其他人曾用过的一种方法是利用大肠杆菌鸟苷磷酸核糖转移酶基因。当该基因在真核细胞中表达时产生了对代谢抑制剂霉酚酸的抗性。将这一基因转入载体质粒并受早期启动子控制的方法见Falkner,F.G.,和Moss,B.(1988)，大肠杆菌gpt基因提供了筛选痘苗病毒开放阅读框架表达载体的主要方法(Escherichia coligpt gene provides dorninant selection for vaccinia virus open readingframe expression vectors.)病毒学杂志(J Virol)62,1849-54以及Boyle,D.B.和Coupar,B.E.(1988)做为禽用疫苗载体的重组鸡痘病毒的构建(Construction of recombinant fowlpox viruses as vectors forpoultry vaccines.)病毒学研究(Virus Res.)10,343-56中的描述。一种命名为pVU-5的质粒提供了早期orf病毒启动子。质粒pVU-5包含有克隆进pUC-8中的orf病毒NZ-2 BamHⅠE片段，这一质粒的构建见Mercer,A.A.,Fraser,K.M.,Barns,G.,和Robinson,A.J.(1987)orf病毒DNA的结构与克隆(The structure and cloning of orf virusDNA.)病毒学(Virology.)157,1-12中的描述。已描述了pVU-5中原命名为ORF-3的推定基因的一种早期启动子E1L，见Fraser,K.M.,Hill,D,F.,Mercer,A.A.和Robinson,A.J.(1990)，副痘病毒属orf病毒基因组反向末端重复的序列分析(Sequence analysis of the invertedterminal repetition in the genome of the parapoxvirus,orf virus.)病毒学(Virology.)176,379-89以及Fleming,S.B.,Fraser,K.M.,Mercer,A.和Robinson,A.J.(1991)，位于orf病毒早期基因侧翼的痘苗病毒样的早期转录控制序列(Vaccinia virus-like early transcriptionalcontrol sequences flank an early gene in the orf parapoxvirus.)基因(Gene.)97,207-212；本申请所述方法正是用这一早期启动子构建orf病毒突变体。从pVU-5中切下一段如图12所示的长503bp、富含A+T的AluⅠ片段，并将其克隆进多功能质粒载体pTZ18R的HincⅡ位点得到pSFAlu-6，见于Mead,D.A.,Szczesna-Skorupa,E.,和Kemper,B.(1986)单链DNA“蓝色”T7启动子质粒：用于克隆和蛋白质工程的一类多功能串联启动子系统(Single-stranded DNA“blue”T7 promoter plasmids:a versatile tandem promoter system forcloning and protein engineering.)蛋白质工程(Protein Eng.)1,67-74中所述。用DdeⅠ酶切pSFAlu-6，而后用Klenow DNA聚合酶补平片段，再用HindⅢ酶切这些片段，所得的一段长467bp的HindⅢ-DdeⅠ片段连接到预先经BglⅡ酶切、补平及用HindⅢ再次酶切的pSP-70上。所得的质粒pSP-SFP保留了克隆操作步骤中重新形成的BglⅡ位点。用BamHⅠ和BglⅡ酶切包含大肠杆菌x-gpt基因的质粒pSV-gpt2(Mulligan,R.C.和Berg,P.(1981)，表达编码黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的大肠杆菌基因的动物细胞的筛选.(Selection foranimal cells that express the Escherichia coli gene coding forxanthine-guanine phosphoribosyl transferase.)美国国家科学院学报(Proc Nati Acad Sci USA.)78,2072-2076.)。所得的x-gpt基因为一1788bp的片段，将其克隆进pSP-SFP的BglⅡ位点。orf病毒片段与x-gpt基因融合后得到pSP-SFPgpt32。以SmaⅠ和SphⅠ酶切质粒pVU-5。包含早期启动子E1L(其序列见图10)的长150bp的SmaⅠ-SphⅠ片段克隆进pTZ18R的SmaⅠ和SphⅠ位点之间得到质粒pFS-1。以SphⅠ酶切质粒pFS-1并用T4DNA聚合酶温育处理。用EcoRⅠ和BamHⅠ处理质粒pNEO释放出aphⅡ基因。其EcoRⅠ和BamHⅠ位点用KlenowDNA聚合酶补平后将该片段连接入pFS-1。所得的质粒pFS-neo3包含有位于EcoRⅠ和BamHⅠ位点之间的aphⅡ基因，BamHⅠ位于该基因和早期orf病毒启动子之间。这一操作的结果是早期启动子远端的SphⅠ位点变成了BamHⅠ位点。aphⅡ基因与早期启动子呈“头对头”方向排列且可以用EcoRⅠ酶切将其除去。下一步，以PvuⅡ酶切oSP-sSFPgpt32。aphⅡ-早期启动子构建体以EcoRⅠ从pFSneo3酶切下来，用Klenow DNA聚合酶补平，并连到质粒pSP-sSFPgpt32的PvuⅡ位点。筛选包含有与503bp的AluⅠ片段方向相同的早期启动子的质粒名为pFSneo-SFPgpt。以BamHⅠ和BglⅡ酶切质粒pFSneo-SFPgpt。此步除去了核苷酸a与b之间的序列(图13)和作为BamHⅠ-BglⅡ片段的aphⅡ基因。载体片段进行琼脂糖凝胶电泳后用粉末玻璃奶方法进行纯化如(Vogelstein,B.和Gillespie,D.(1979)琼脂糖中DNA的制备与分析纯化(Preparation and analytical purification of DNA fromagarose.)美国国家科学院学报(Proc Nati Acad Sci USA.)76,615-619)中所述，连接游离BamHⅠ和BglⅡ切点末端使早期启动子与x-gpt基因相连。如步骤4、5、6和7(图13)中所述操作的净结果是将pSP-SFPgpt32中核苷酸a与b之间的序列用FS启动子替换形成pFS-gpt。实施例5----orf病毒基因组中非必需区域的确定以及将此位点插入质粒
从横跨orf病毒基因组ITR连结的4.47kbBamHⅠE片段的序列中发现了一种可能编码159个氨基酸的肽的基因。它被称为E3L(ORF-PP)，与一种逆转录病毒中的开放阅读框架有同源性(Mercer,A.A.,Fraser,K.M.,Stockwell,P.A.和Robinson,A.J.(1989)副痘病毒属orf病毒中逆转录病毒假性蛋白酶的同源物(A homologue of retroviralpseudoproteases in the parapoxvirus,orf virus.)病毒学(Virology.)172,665-668.)，与大肠杆菌dUTPase也有同源性(McGeoch,D.J.,(1990)蛋白序列比较表明痘病毒和特定逆转录病毒编码的“假性蛋白酶”属于脱氧尿苷三磷酸酶家族(Protein sequence comparisonsshow that the‘pseudoproteases’encoded by poxviruses and certainretroviruses belong to the deoxyuridine triphosphatase family.)核酸研究(Nucleic Acids Res.)18,4105-4110.)。从实验室中分离到一种不含E3L基因的orf病毒自发突变体，这是由于发生了复杂的重排现象，其涉及BamHⅠE片段的部分缺失以及在该处的基因组相对末端的DNA片段的复制。因而E3L基因为非必需的且被选为外源DNA插入的靶点，并用来表明orf病毒可以耐受外源基因的插入。从pVU-5中切除掉一段包含单一NZ-2 BamHⅠ E区域的2587bp的SmaⅠ-BamHⅠ片段(图14)，并将其克隆进经PvuⅡ和BglⅡ酶切的pSP-70中。所得的质粒pVU-DL100包含有位于E3L基因编码序列和它的启动子之间的单一NcoⅠ位点。实施例6----大肠杆菌X-GPT与LacZ基因构建体插入到pVU-DL100中以产生载体质粒
质粒pVU-DL100以NcoⅠ酶切并用Klenow DNA聚合酶补平末端，用EcoRⅠ和DraⅠ从pFSP-gpt中切下E3L-gpt构建体，用KlenowDNA聚合酶补平末端并在NcoⅠ位点连接入pVU-DL100。插入片段末端补平的EcoRⅠ位点与质粒末端补平的NcoⅠ位点相连接产生了一个位于早期启动子上游的EcoRⅠ位点。得到了两个方向的插入，即带有与假性蛋白酶基因方向相反的x-gpt基因的pVU-DL101和带有与假性蛋白酶基因方向相同的x-gpt基因的pVU-DL102。以EcoRⅠ从pSP-PFlac中切下F1L-lac构建体，将其克隆在pVU-DL101和pVU-DL102的EcoRⅠ位点。克隆后得到4种具有不同方向的插入片段的质粒，但只有两种衍生自pVU-DL101的pVU-DL104和衍生自pVU-DL102的pVU-DL106是包含E3L-gpt和F1L-lac呈“背对背”方向的质粒，用于转染试验。实施例7----构建表达T.ovis 45W抗原的嵌合基因
来自orf病毒NZ-7的VEGF样基因中有一64bp的片段(Lyttle,D.L.,Fraser,K.M.,Fleming,S.B.,Mercer,A.A.和Robinson,A.J.(1993)痘病毒属orf病毒编码的血管表皮生长因子的同源物(Homologs of vascular endothelial growth factor are encodedby the poxvirus orf virus)病毒学杂志(J Virol.)68,84-92.),它包含有5个3’末端终止密码子、翻译终止密码TAA以及一个痘病毒转录终止序列5TNT，用能提供位于扩增片段两侧的BglⅡ和NcoⅠ限制性位点的一对寡核苷酸引物来扩增这一片段。以BglⅡ和NcoⅠ酶切扩增片段并连接到经BglⅡ和NcoⅠ酶切过的载体pSL301上(Brosius,J.(1989)克隆及表达载体的超级接头(Superlinkers incloning and expression vectors.)脱氧核糖核酸(DNA)8,759-777)形成质粒ptov1。以PCR方法扩增含有aphⅡ基因和orf病毒F1L及F3R启动子的一个DNA片段，PCR所用的特殊引物在扩增片段的一个末端引入MluⅠ位点，在另一末端引入NsiⅠ和EcoRⅠ位点。扩增产物的一部分以MluⅠ和EcoRⅠ酶切后连接到经MluⅠ和EcoRⅠ酶切过的ptov1上，得到质粒ptov2。另一部分以MluⅠ和NsiⅠ酶切后连接到ptov1上形成质粒ptov3。这些构建步骤示于图15。
以限制性内切酶BamHⅠ和BglⅡ酶解质粒ptov2除去aphⅡ基因，纯化此载体片段并重新连接其游离末端得到质粒ptov5。以限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切质粒pGEX 45W(Johnson,K.S.,Harrison,G.B.L.,Lightowlers,M.W.,O＇Hoy,K.L.,Cougle,W.G.,Dempster,R.P.,Lawrence,S.B.,Vinton,J.G.,Heath,D.D.,和Rickard,M.D.(1989)利用特定重组抗原的抗羊囊尾蚴病的疫苗接种(Vaccination against ovine cysticercosis using a defined recombinantantigen)自然(Nature)338,585-587)切下编码Taenia ovis 45W抗原片段的DNA序列，并将其连接到经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切过的ptov5上形成质粒ptov6。结果将编码45W抗原片段的DNA序列置于orf病毒PF3R启动子控制之下，并给它提供了翻译和转录终止序列。这些步骤示于图16。
扩增了一段来自于orf病毒NZ-7中编码推定的分泌性先导序列的VEGF样基因5’端的73bp片段，扩增用的特殊引物将一个新起始密码，一个PstⅠ和一个EcoRⅠ限制性位点引入扩增DNA片段中。以PstⅠ和EcoRⅠ酶解扩增片段并克隆进经NsiⅠ和EcoRⅠ酶切过的ptov3中得到质粒ptov4。以BamHⅠ酶解质粒ptov4切去aphⅡ基因后，经琼脂糖凝胶电泳纯化然后重新连接形成ptov7。用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶解质粒pGEX 45W切得编码45W抗原片段的DNA序列，将其连接到经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切过的ptov7上，得到ptov8。结果将45W抗原片段置于orf病毒PF3R启动子控制之下，还提供了ptov6中的3’翻译和转录终止子以及5’蛋白分泌性先导序列。以上步骤示于图17。
以EcoRⅠ酶切质粒pVU-DL101，并与包含一个BamHⅠ和一个NcoⅠ限制性位点的寡核苷酸接头相连，得到质粒pVU-DL101L4。以BamHⅠ和NcoⅠ酶解此质粒，使之允许来自于ptov6和ptov8的两种嵌合45W基因都能插入。所得的质粒称之为pVU-dl45W(来自于ptov6)和pVU-dl45Wl(来自于ptov8)。上述步骤示于图18。
以BamHⅠ和BglⅡ酶解图11中所示的pSP PFlac的衍生质粒pVUsp-PF2lac，切下一种无启动子的lacz基因。在pVUSP-PF2lac质粒中，F1L启动子片段已被截短至100bp并在lacz基因远端引入一个BglⅡ限制性位点。凝胶纯化lacz片段并连接到pVU-DL45W和pVU-DL45Wl的单一BamHⅠ位点。结果将lacz基因置于F1L启动子控制之下并完成了用于将T.ovis 45W基因导入orf病毒基因组的转移载体的构建。以上步骤示于图19。
将包含BamHⅠ和NocⅠ限制性位点的相同的寡核苷酸接头连接到质粒pVU-DL102。此质粒包含与pVU-DL101中的同一基因克隆方向相反的x-gpt基因(图14)。随后进行了如pUV-DL101类似的克隆步骤，所得的转移载体命名为pVU-DL45W6lac和pVU-DL45W8lac。他们包含有与pVU-DL45Wlac和pVU-DL45Wllac相同的序列，但区别在于整个插入区域的方向与图19所示质粒中的方向相反。实施例8----转染方案
初级牛睾丸细胞(BT)在补加有乳清蛋白水解物(5g/l)和5％胎牛血清的Eagle’s基本培养基(MEM,Sigma Cat No.M0643)上呈单层生长。用于筛选表达x-gpt的orf病毒转化子的培养液包含霉酚酸25μg/ml，黄嘌呤250μg/ml，次黄嘌呤15μg/ml，氨基喋呤1μg/ml，胸苷5μg/ml和2％的胎牛血清。选择性培养基中省去了乳清蛋白水解物并用非必需氨基酸替换。(MEM非必需氨基酸混合物，Sigma Cat.No.M2025)
BT细胞在合适的细胞培养皿中呈单层生长。感染之前24小时，将细胞生长培养液替换为含有霉酚酸的选择性培养液。以orf病毒株NZ-2感染细胞(感染复数0.05-0.1)吸收病毒1小时，细胞单层用opti-MEM无血清培养基(Life Technologies Inc,Gaithersburg,MD美国)洗两遍以除去残存胎牛血清并晾干。每瓶加入1.0ml含有10μl Lipofectin试剂(Life Technologies Inc,Gaithersburg,MD美国)的opti-MEM以及约2.0μg按供应商指令稀释的质粒DNA，温育过夜。过夜吸收后，加入5ml含2％胎牛血清的选择性培养基，继续温育直至感染约3-5天后观察到致细胞病变效应(CPE)为止。
从瓶中刮出细胞单层，进行低速离心沉淀于离心管底部，以磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗并重悬于PBS中。将BT细胞接入合适的组织培养皿中使之生长成单层。按常规用直径60mm的聚苯乙烯培养皿，每皿接种1.5×106细胞并在CO2中温育，保持pH值为7.2左右。除去培养液并加入0.5ml以PBS适当稀释的orf病毒，37℃温育1小时。隔15分钟晃动培养皿以使液体分布均匀。最后除去接种液，加入含1％琼脂糖的生长培养基。5天后(通常可观察到噬斑的时间)，皿中加入含X-gal的1％琼脂糖上层，再温育12小时使呈现颜色。挑出单个噬斑重悬于PBS中，接入已种入2×105细胞的部分晾干的细胞培养皿中使之如上述生长汇成单层。每孔加1ml培养液，持续37℃温育直至观察到完全的致细胞病变反应。细胞培养皿每次融化后都保存于-20℃直至其结冰。细胞裂解物用来作为进一步噬斑纯化的病毒来源，以及用于杂变的病毒DNA的来源。从BT细胞胞浆提取物中制备病毒DNA的方法见Moyer,R.W.和Graves,R.L.(1981)细胞质正痘病毒DNA复制的机理.(The mechanism of cytoplasmic orthopoxvirus DNA replication.)细胞(Cell.)27,391-401。用限制性内切酶酶切分离的DNA以确证外源基因的插入。通常，第一次噬斑纯化步骤不能去掉所有的野生型病毒，需要进行多步噬斑纯化以得到突变病毒的纯培养物。大量的病毒培养液于150cm2的组织培养瓶中培养，按照Robinson,A.J.,Ellis,G.和Balassu,T.(1982)orf病毒基因组：从绵羊伤口中分离到的病毒DNA的限制性内切酶分析(The genome of orf virus:restrictionendonuclease analysis of viral DNA isolated from lesions of orf insheep.)病毒学文献(Arch Virol.)71,43-55的方法纯化病毒。从纯化病毒体中提取DNA，其方法按照Ballassu,T.C和Robinson,A,J(1987)牛睾丸细胞中orf病毒的复制：病毒DNA，多肽和传染性病毒复制的动力学以及病毒颗粒多肽的分析(Orfvirus replication in bovine testscells:kinetics of viral DNA,polypeptide,and infectious virusproduction and analysis of virion polypeptides.)病毒学文献(ArchVirol)97,267-281。实施例9----orf病毒修饰的鉴定
为检测转染和噬斑纯化后得到的病毒是否被修饰为携带插入的基因，从感染的细胞中提取DNA并用本领域人员周知的杂交方法检测，例如Merchlinsky,M.和Moss,B.(1989)痘苗病毒DNA多联体连结的分开需要晚期基因的表达(Resolution of vaccinia virus DNAconcatemer junctions requires late-gene expression.)病毒学杂志(JVirol.)63,1595-1603。制备用于这些检测的突变orf病毒DNA时，将每份为100μl的悬浮于PBS中的orf病毒感染的BT细胞约12000g离心30分钟。细胞沉淀重悬于50xl含0.15M NaCl,20mM Tris,10mMEDTA,pH8.0的溶液中。每份样品加入250μl含20mM Tris,10mMEDTA以及含适当浓度蛋白酶(如0.5mg/ml蛋白酶K)的0.75％SDS的溶液，37℃温育3小时。用等体积酚∶氯仿(1∶1)抽提后用乙醇沉淀。离心后将乙醇沉淀的DNA重溶于50μl TE中。各步骤中收集的产物与特异性x-gpt探针进行杂交。用pVU-DL106转染时，早至第一步的感染后2小时可得到阳性结果。另一种用于检测重组病毒中异源DNA标记的方法是用PCR扩增DNA序列，所用引物是专一用于扩增外源DNA序列的。其他的转染可能需要进一步的方法来检测重组病毒。用质粒pVU-DL106转染2小时，接种3天后以途径3可检测到CPE，且用DNA-DNA杂交确定含x-gpt基因的突变病毒。利用发色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的半乳糖苷酶活性定性分析被用来检测含β-半乳糖苷酶基因的突变orf病毒。实施例10----适合于外源基因插入到对应于正痘病毒ATI区域的orf病毒基因组中区域的载体质粒的构建
RNA聚合酶亚单位基因rpo132和推定基因(H)I1L之间的基因间区域被确定为外源DNA插入的合适的靶位点。此区域长为90个核苷酸并位于两个聚合的转录元件之间，其中的rpo132是一种必需基因。含有一段1.6kb序列的质粒PB-23ΔSal被用做PCR克隆反应的模板，此序列延伸到图5所示序列的第1位上游未测序区，终止于178位的PstⅠ位点。从中扩增一段1.0kb的序列，利用了引物zxs-1：GATCCCGCTCGAGAACTTCAA(正向)
其与含有XhoⅠ限制性位点的PB-23ΔSal中的序列互补，和引物zxs-2：
GTCAGATCTATGCATAAAAATTTCGCATCAGTCGAGATA(反向)
其引入一个BglⅡ,一个NsiⅠ及一个ApoⅠ限制性位点。用1％琼脂糖凝胶电泳纯化此扩增片段并用限制性内切酶XhoⅠ及BglⅡ酶切。纯化的片段连接到质粒pSP-70相应的XhoⅠ和BglⅡ位点，得到质粒pTvec1。这一克隆步骤也将一个痘病毒转录终止信号(5TNT)引入载体。
扩增另一含有位于第66位和1069位(图5)核苷酸之间序列的片段，利用了引物zxs-3:GACATGCATCAGTGCCATGGAATTCTCGCGACTTTCTAGC(正向)
其引入NsiⅠ、NcoⅠ及EcoRⅠ限制性位点，和引物zxs-4:
GACGGATCCGTATAATGGAAAGATTC(反向)
其引入一个BamHⅠ位点。以限制性内切酶BamHⅠ和NsiⅠ酶切扩增片段，并用与第一个片段相同的方法进行纯化。将纯化片段克隆进已由NsiⅠ和BglⅡ酶切过的pTvec1中。所得的质粒pTvec50包含有一系列的限制性位点及一个可用于进一步克隆步骤的转录终止信号。这些限制性位点是：ApoⅠ,NsiⅠ,NcoⅠ和EcoRⅠ。引物、限制性位点及修饰过的基因间区域的序列示于图20A和20B。涉及ptvec50构建的步骤示于图21。
用EcoRⅠ从质粒pVUsp-PF2lac中切下受orf病毒晚期启动子PF1L控制的lacz基因。片段经凝胶纯化并连入pTvec50的EcoRⅠ位点。回收含有两种可能方向的lacz基因的重组质粒，分别命名为pTvec50lac-1和pTvec50lac-2。构建pTvec50lac-1和pTvec50lac-2所包括的克隆步骤示于图22。至此完成了用于将外源基因lacz导入图5所示rpo132和(H)I1L开放阅读框架之间区域的转移载体的构建。
在此实施例中xgpt基因不包括在转移载体中，因而通过在霉酚酸存在下的生长来筛选表达xgpt的重组orf病毒的方法不适用。利用lacz的表达作为筛选重组病毒的初步方法用来确认含有ATI区域的插入的重组子。采用了下面实施例8所述方法的变通方法。
初级牛睾丸细胞(BT)在补加有乳清蛋白水解物(5g/l)和5％胎牛血清的Eagle’s基本培养基(MEM；Sigma Cat No.M0643)上呈单层生长。感染之前除去细胞生长培养液，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)快速洗细胞以除去残存血清。以orf病毒株NZ-2感染细胞(感染复数0.05-0.1)并吸收病毒1小时。细胞单层用opti-MEM无血清培养基(Life Technologies Inc,Gaithersburg,MD美国)洗两遍以除去未吸收的病毒及残存胎牛血清，晾干。每瓶中加入1.0ml含有10μl Lipofectin试剂(Life Technologies Inc,Gaithersburg,MD U.S.A)的opti-MEM，以及约2.0μg按供应商指示稀释的质粒DNA，温育过夜。过夜吸收后，加入5ml含2％胎牛血清的选择性培养基，温育直至感染约3-5天后观察到致细胞病变效应(CPE)为止。
从瓶中刮出细胞单层，进行低速离心沉淀于离心管底部，以PBS洗并重悬于PBS中。重悬细胞冻融3次且经过及短暂的超声处理。测定收集的培养物的病毒滴度，以计算得到的使每皿产生约2000病毒噬斑的稀释度加入物料到BT细胞的新鲜培养皿中。加入足够量的基质以筛选50000个噬斑(25皿)。感染的单层细胞在1％的琼脂糖上层下生长，培养5天后(可观察到噬斑时)，皿中加入含x-gal的1％琼脂糖上层，再温育12小时使呈现颜色。此阶段中，挑出每一显色的噬斑并用实施例8所述方法处理。可以用重复若干次的平板培养和挑选单个显色噬斑直至获得lacz阳性病毒的纯培养的方法进一步纯化重组病毒。
依据本发明，提供了一种副痘病毒载体，尤其是包含外源DNA的一种orf病毒。此外源DNA可以编码一种能够引起免疫反应的抗原或者可编码期望表达的异源多肽。
为此本发明的载体尤其适用于异源多肽和抗原的表达。表达抗原的能力使这些载体尤其适用于疫苗。
orf病毒载体有很多优于痘苗病毒的优点。与痘苗病毒相比，orf病毒具有相对窄的宿主范围。这就减小了与痘苗病毒相关的种间感染和疾病扩散的风险。另一优点是orf病毒对人的毒性小于痘苗病毒，减少了发热反应和损伤的危险。
可以理解的是，上述说明仅以实施例的方式给出，而且本发明只由所附权利要求的范围来限定。参考文献
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Claims (25)
1．一种包含具有外源DNA的副痘病毒的副痘病毒载体。
2．如权利要求1所要求的一种载体，其中副痘病毒为orf病毒。
3．如权利要求1或2所要求的一种载体，其中外源DNA编码至少一种基因产物。
4．如权利要求3所要求的一种载体，其中编码的一种基因产物是一种能引起免疫反应的抗原。
5．如权利要求4所要求的一种载体，其中的抗原选自HIV被膜蛋白、单纯疱疹病毒糖蛋白、羊绦虫、细粒棘球绦虫(棘球蚴囊)抗原、毛圆线虫抗原、血毛线虫抗原、胃线虫抗原及其组合。
6．如权利要求5所要求的一种载体，其中抗原是选自羊绦虫45W,16kd,18kd抗原及其组合的一种羊绦虫抗原。
7．如权利要求3到6中任意一项所要求的一种载体，其中外源DNA还编码至少一种为生物效应器分子的产物。
8．如权利要求7所要求的一种载体，其中生物效应器分子选自γ-干扰素、IL-1、IL-2、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12及其组合。
9．如权利要求8所要求的一种载体，其中生物效应器分子选自IL-1、IL-2、IL-12及其组合。
10．如权利要求3到9中任意一项所要求的一种载体，其中外源DNA还编码至少一种以与病毒自身蛋白组成杂合或嵌合蛋白形式表达的肽成份。
11．如权利要求1到10中任意一项所要求的一种载体，其中外源DNA整合到病毒基因组的一个或多个非必需区中。
12．如权利要求11所要求的一种载体，其中非必需区选自附图2,3,5和7中所确认的非必需区中。
13．如权利要求11或12所要求的一种载体，其中非必需区从图5中序列的第11位至第16位核酸或者从图9中序列的第2226至第2286位核酸。
14．如权利要求1到13中任意一项所要求的一种载体，其中外源DNA受痘病毒启动子的控制。
15．如权利要求14所要求的一种载体，其中痘病毒启动子是orf病毒启动子。
16．如权利要求15所要求的一种载体，其中orf病毒启动子选自如图10所示的E1L、F1L和F3L。
17．如权利要求3到16中任意一项所要求的一种载体，其中外源DNA还编码一种报告基因。
18．如权利要求3到17中任意一项所要求的一种载体，其中外源DNA还编码一种选择性标记。
19．与如权利要求4到18中任意一项所要求的一种载体的具有等效免疫活性的一个片段或其变体。
20．一种疫苗，其包含如权利要求1到18中任意一项病毒载体，或者如权利要求19所要求的片段或其变体。
21．如权利要求20所要求的一种疫苗，其还包含药学可接受的载体和/或佐剂。
22．一种整合了如权利要求1到18中任意一项所要求的载体的宿主细胞。
23．如权利要求22所要求的一种宿主细胞，其为真核细胞。
24．如权利要求22或23所要求的一种宿主细胞，其为牛睾丸细胞或羊睾丸细胞。
25．一种制备重组副痘病毒载体的方法，其包括将权利要求1到18中任意一项所要求的载体转染进感染orf病毒的所选宿主细胞；筛选重组病毒以及选择性地纯化筛选到的病毒。
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