JPH0365191A - スフェロイジン単離ｄｎａおよび組み換え昆虫ポックスウィルス発現ベクター - Google Patents
スフェロイジン単離ｄｎａおよび組み換え昆虫ポックスウィルス発現ベクターInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産ＪＬ４．曵土凹り炊畳−
本発明は本質的にスフェロイジンをコードするＤＮＡ配
列からなる単離ＤＮＡ、および昆虫細胞もしくは昆虫の
幼虫の組織培養において選択された遺伝子またはその一
部を発現し得る組み換え昆虫ポックスウィルス（ｅｎｔ
ｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）発現ベクターに関するもので
ある。
列からなる単離ＤＮＡ、および昆虫細胞もしくは昆虫の
幼虫の組織培養において選択された遺伝子またはその一
部を発現し得る組み換え昆虫ポックスウィルス（ｅｎｔ
ｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）発現ベクターに関するもので
ある。
従」ｑ加護
バキュロウィルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）および昆
虫ポックスウィルスは、地理的に広い範囲に存在する多
数の昆虫種から単離されている昆虫ウィルスとして広く
知られている。最近、バキュロウィルスおよびポックス
ウィルスの両者のベクターが農業および医薬上重要な蛋
白質を発現する能力の故に広く知られてきている０例え
ば、バキュロウィルスベクターは、エイズのためのワク
チン候補物としてＦ′ＤＡから臨床的な評価の承認を得
るために、最初の組み換えＨＩＶエンベロープ蛋白質を
発現するために最初に用いられた。これらの昆虫ＤＮＡ
ウィルスベクターはを椎動物および昆虫系の両者におけ
る遺伝子および蛋白質機能の分子生物学、および調節を
理解するために寄与するものである。
虫ポックスウィルスは、地理的に広い範囲に存在する多
数の昆虫種から単離されている昆虫ウィルスとして広く
知られている。最近、バキュロウィルスおよびポックス
ウィルスの両者のベクターが農業および医薬上重要な蛋
白質を発現する能力の故に広く知られてきている０例え
ば、バキュロウィルスベクターは、エイズのためのワク
チン候補物としてＦ′ＤＡから臨床的な評価の承認を得
るために、最初の組み換えＨＩＶエンベロープ蛋白質を
発現するために最初に用いられた。これらの昆虫ＤＮＡ
ウィルスベクターはを椎動物および昆虫系の両者におけ
る遺伝子および蛋白質機能の分子生物学、および調節を
理解するために寄与するものである。
ポックスウィルスの研究、そして特にワクシニアウィル
ス、ポックスウィルスの群の原核型のものの使用が、多
くの生物学的および臨床的な応用に有用な真核生物のク
ローニングおよび発現ベクターへと導いた。１９８２年
に、Ｐａｎ１ｃａｌｉおよびＰａｏｌｅｔｔｉはプロシ
ージングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンス
（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）、
１９７９巻、４９２７−４９３１頁（１９８２年８月）
において、内生（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）のサブゲノム
要素をｉｎ ｖｉｖｏで組み換えにより感染後代（ｐｒ
ｏｇｅｎｙ）ワクシニアウィルス中に導入することがで
きることを報告している。ワクシニアウィルスＤＮＡ配
列を感染ワクシニアウィルス後代中に吸収させ得るとい
うことは外部からの異種遺伝子要素を同様の操作により
感染ワクシニアウィルス中に導入し得ることを示唆して
いる。その仮説を試験するために、Ｐａｎ１ｃａｌｉお
よびＰａｏｌｅｔｔｉはヘルペスウィルスチミジンキナ
ーゼ（ＴＫ）遺伝子を多数のワクシニアウィルス製剤中
に導入し、このヘルペスウィルス遺伝子を発現する組換
えワクシニアウィルスの純粋培養物を得た。
ス、ポックスウィルスの群の原核型のものの使用が、多
くの生物学的および臨床的な応用に有用な真核生物のク
ローニングおよび発現ベクターへと導いた。１９８２年
に、Ｐａｎ１ｃａｌｉおよびＰａｏｌｅｔｔｉはプロシ
ージングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンス
（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）、
１９７９巻、４９２７−４９３１頁（１９８２年８月）
において、内生（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）のサブゲノム
要素をｉｎ ｖｉｖｏで組み換えにより感染後代（ｐｒ
ｏｇｅｎｙ）ワクシニアウィルス中に導入することがで
きることを報告している。ワクシニアウィルスＤＮＡ配
列を感染ワクシニアウィルス後代中に吸収させ得るとい
うことは外部からの異種遺伝子要素を同様の操作により
感染ワクシニアウィルス中に導入し得ることを示唆して
いる。その仮説を試験するために、Ｐａｎ１ｃａｌｉお
よびＰａｏｌｅｔｔｉはヘルペスウィルスチミジンキナ
ーゼ（ＴＫ）遺伝子を多数のワクシニアウィルス製剤中
に導入し、このヘルペスウィルス遺伝子を発現する組換
えワクシニアウィルスの純粋培養物を得た。
同様に１９８２年に、 Ｍａｃｋｅｔｔらは、プロシー
ジングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンス（
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ｕ、
ｓ、Ａ−）＋ （１９８２年１２月）において、外部か
らの異種のＤＮＡをこのワクシニアウィルスゲノムの２
つの非本質的な領域中に導入した。得られたものの選別
は、野性型ワクシニアウィルスの内生ＴＫ遺伝子の阻害
もしくはＴＫ変異体への該ヘルペスウィルスＴＫ遺伝子
の添加により行われた。
ジングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンス（
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ｕ、
ｓ、Ａ−）＋ （１９８２年１２月）において、外部か
らの異種のＤＮＡをこのワクシニアウィルスゲノムの２
つの非本質的な領域中に導入した。得られたものの選別
は、野性型ワクシニアウィルスの内生ＴＫ遺伝子の阻害
もしくはＴＫ変異体への該ヘルペスウィルスＴＫ遺伝子
の添加により行われた。
１９８３年にＳｍ１ｔｈおよびＭｏ５ｓはジーン（Ｇｅ
ｎｅ）、２５（１９８３）、２１−２８頁において、ワ
クシニアウィルスが他の真核性ベクターに比べていくつ
かの利点をもっているように見えることを報告している
。最も特記すべきことは、このウィルス感染が、不完全
ＳＶ４０およびレトロウィルスベクターの場合と異なり
、外部異種遺伝子の導入および発現によっては損なわれ
ないということである。この著者等はまた。ワクシニア
は生のボックスワクチンとして作用するので、現在病原
的に重要な生物からの遺伝子を発現する組み換え体は医
療もしくは家畜病治療の目的のために用い得ると言って
いる。更にこのタイプの第一候補ワクチンは肝炎Ｂ型ウ
ィルス表面抗原を発現するとしても、この系の実用性は
数種の遺伝子を含有する多価の組み換えワクチンをつく
ることによって更に大きくなって＆Ｎ＜ことができるで
あろう。
ｎｅ）、２５（１９８３）、２１−２８頁において、ワ
クシニアウィルスが他の真核性ベクターに比べていくつ
かの利点をもっているように見えることを報告している
。最も特記すべきことは、このウィルス感染が、不完全
ＳＶ４０およびレトロウィルスベクターの場合と異なり
、外部異種遺伝子の導入および発現によっては損なわれ
ないということである。この著者等はまた。ワクシニア
は生のボックスワクチンとして作用するので、現在病原
的に重要な生物からの遺伝子を発現する組み換え体は医
療もしくは家畜病治療の目的のために用い得ると言って
いる。更にこのタイプの第一候補ワクチンは肝炎Ｂ型ウ
ィルス表面抗原を発現するとしても、この系の実用性は
数種の遺伝子を含有する多価の組み換えワクチンをつく
ることによって更に大きくなって＆Ｎ＜ことができるで
あろう。
更に加えて、Ｓｓ＋ｉｔｈおよびＭｏ５ｓはこのワクシ
ニアウィルスゲノムの大きさが、このウィルスが外部の
異種のＤＮＡに対して大きな容量を有してり）る可能性
を示唆していることを認識している。彼等はバクテリオ
ファージラムダＤＮＡから採られた２４．７ｋｂの長さ
のＤＮＡ断片をこのワクシニアウィルスゲノム中に導入
した。このようにして得られた組み換えウィルスは安定
で野性型ウィルスと区別のつかない感染性を保持した。
ニアウィルスゲノムの大きさが、このウィルスが外部の
異種のＤＮＡに対して大きな容量を有してり）る可能性
を示唆していることを認識している。彼等はバクテリオ
ファージラムダＤＮＡから採られた２４．７ｋｂの長さ
のＤＮＡ断片をこのワクシニアウィルスゲノム中に導入
した。このようにして得られた組み換えウィルスは安定
で野性型ウィルスと区別のつかない感染性を保持した。
Ｓｍ１ｔｈおよびＭｏ５ｓはまた。導入される大きさの
上限は分らないもののベクターとして存在するポックス
ウィルスの欠損変異体を使用することによって少なくと
も４０ｋｂの容量を広げることができるという知見を得
たにのとき、ワクシニアウィルスがこのような大量の外
部異種ＤＮＡを収容し得る唯一の記載された感染真核発
現ベクターであった。この事は、ヒトおよび動物におけ
る病気の予防のための生ワクチンとしてワクチン組み換
え体としての使用の可能性のために、非常に重要なこと
であった。また、多価ワクチンを製造し得る可能性もあ
った。
上限は分らないもののベクターとして存在するポックス
ウィルスの欠損変異体を使用することによって少なくと
も４０ｋｂの容量を広げることができるという知見を得
たにのとき、ワクシニアウィルスがこのような大量の外
部異種ＤＮＡを収容し得る唯一の記載された感染真核発
現ベクターであった。この事は、ヒトおよび動物におけ
る病気の予防のための生ワクチンとしてワクチン組み換
え体としての使用の可能性のために、非常に重要なこと
であった。また、多価ワクチンを製造し得る可能性もあ
った。
日が べき
このように同種の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）組み換えに
よりウィルスゲノムの非本質領域中に外部異種遺伝子を
導入することによりワクシニアウィルスは発現ベクター
として使用されそれが成功していた。しかしながら、こ
のウィルスの使用にはいくつかの欠点が伴われるもので
あった。第１は、ワクシニアは３７℃の最適温度で複製
するを推動物の発熱物質である。また組み換えワクシニ
アウィルス中で発現される外部異種の抗原はウィルスお
よび宿主の汚染から厳密に精製されなければならない。
よりウィルスゲノムの非本質領域中に外部異種遺伝子を
導入することによりワクシニアウィルスは発現ベクター
として使用されそれが成功していた。しかしながら、こ
のウィルスの使用にはいくつかの欠点が伴われるもので
あった。第１は、ワクシニアは３７℃の最適温度で複製
するを推動物の発熱物質である。また組み換えワクシニ
アウィルス中で発現される外部異種の抗原はウィルスお
よび宿主の汚染から厳密に精製されなければならない。
最後に、最も難かしい問題は、ワクシニア発現ベクター
には既知の強力なプロモーターがないために、多数の外
部異種蛋白質を製造することができないという事実にあ
る。
には既知の強力なプロモーターがないために、多数の外
部異種蛋白質を製造することができないという事実にあ
る。
バキュロウィルスベクターは昆虫細胞中での外部異種遺
伝子の発現のためにも使用されてきた。
伝子の発現のためにも使用されてきた。
より特定的には、オートグラファ カリフォルニ力核ポ
リへドロシスウィルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈｙｃａ Ｃ
ａ１ｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅ
ｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）の強力なポリへドリンプロ
モーターの調節の下での外部異種遺伝子の発現のための
転移ベクターが開発されてきた。
リへドロシスウィルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈｙｃａ Ｃ
ａ１ｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅ
ｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）の強力なポリへドリンプロ
モーターの調節の下での外部異種遺伝子の発現のための
転移ベクターが開発されてきた。
オートグラファ カリフォルニカ核ポリへドロシスウィ
ルス（Ａ ｃ Ｎ Ｐ Ｖ ）はバクロビリダニ（ｂａ
ｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）族の原核性ウィルスである。
ルス（Ａ ｃ Ｎ Ｐ Ｖ ）はバクロビリダニ（ｂａ
ｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）族の原核性ウィルスである。
このウィルスは広汎な宿主範囲を有し、多数種の鱗翅類
（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）昆虫に感染する。ＡｃＮ
ＰＶ感染の間、２つの型のウィルス子孫がつくられる。
（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）昆虫に感染する。ＡｃＮ
ＰＶ感染の間、２つの型のウィルス子孫がつくられる。
第１の型は、感染された宿主中でのエンドサイト−シス
（食作用）もしくは融合によるウィルスのまき散らしの
原因であるような細胞外ウィルス粒子（ＥＣＶ）から戊
っている。ウィルス後代の第２の型は閉塞ウィルス粒子
（ｏｃｃｌｕｄｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ
ＯＶ ）からなっている。これらの○Ｖ粗粒子蛋白様
（ρｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ）ウィルス閉塞中に埋れ
でいる。この閉塞基質を形成する主たる構造蛋白質は２
９，０００ダルトンの分子量を有するポリヘトリン蛋白
質である。
（食作用）もしくは融合によるウィルスのまき散らしの
原因であるような細胞外ウィルス粒子（ＥＣＶ）から戊
っている。ウィルス後代の第２の型は閉塞ウィルス粒子
（ｏｃｃｌｕｄｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ
ＯＶ ）からなっている。これらの○Ｖ粗粒子蛋白様
（ρｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ）ウィルス閉塞中に埋れ
でいる。この閉塞基質を形成する主たる構造蛋白質は２
９，０００ダルトンの分子量を有するポリヘトリン蛋白
質である。
これらのウィルス閉塞体は天然のウィルスのライフサイ
クルの重要な部分であり、１つの宿主から他の宿主への
ウィルスの伝達手段を提供するものである。それらはヴ
イリオン（ｖｉｒｉｏｎ）に外部環境要因に対抗する成
る程度の保護を提供するものであり、これがなければ上
記の外部環境要因によって細胞外ウィルス粒子はもっと
早く不活性化されているであろう。この閉塞体は昆虫の
腸のアルカリ性環境中で溶解し、ウィルスを放出して該
ウィルスはこの腸内組織の細胞中に侵入、増殖するので
ある。
クルの重要な部分であり、１つの宿主から他の宿主への
ウィルスの伝達手段を提供するものである。それらはヴ
イリオン（ｖｉｒｉｏｎ）に外部環境要因に対抗する成
る程度の保護を提供するものであり、これがなければ上
記の外部環境要因によって細胞外ウィルス粒子はもっと
早く不活性化されているであろう。この閉塞体は昆虫の
腸のアルカリ性環境中で溶解し、ウィルスを放出して該
ウィルスはこの腸内組織の細胞中に侵入、増殖するので
ある。
ＡｃＮＰＶはこのウィルスをクローン化された真核遺伝
子のための発現ベクターとして理想的に適合させるよう
ないくつかの性質を持っている。
子のための発現ベクターとして理想的に適合させるよう
ないくつかの性質を持っている。
このウィルスの閉塞はウィルスの成長にとって絶対に必
須といったものではないので、このポリヘトリン遺伝子
は外部異種ＤＮＡが挿入され得るＡｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ
の非本質的領域を提供する。また、このポリヘトリン遺
伝子は、細胞外ウィルスが製造されそして宿主遺伝子お
よびほとんどのウィルス遺伝子がなくなった（ｔｕｒｎ
ｏｆｆ）後、感染における遅い時期の転写を命令する
ような非常に強力なプロモーターを提供するのである。
須といったものではないので、このポリヘトリン遺伝子
は外部異種ＤＮＡが挿入され得るＡｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ
の非本質的領域を提供する。また、このポリヘトリン遺
伝子は、細胞外ウィルスが製造されそして宿主遺伝子お
よびほとんどのウィルス遺伝子がなくなった（ｔｕｒｎ
ｏｆｆ）後、感染における遅い時期の転写を命令する
ような非常に強力なプロモーターを提供するのである。
この遺伝子はまた、視覚的に形質転換ウィルスを選択し
得る遺伝子マーカーを提供する。
得る遺伝子マーカーを提供する。
ＡｃＮＰＶの性質を利用して、多くの種類の真核性およ
び原核性遺伝子が昆虫細胞中でバキュロウィルスベクタ
ーを用いてうまく発現されてきた。
び原核性遺伝子が昆虫細胞中でバキュロウィルスベクタ
ーを用いてうまく発現されてきた。
例えば、Ｓｍ１ｔｈらはモレキュラーアンドセルラーバ
イオロジー（Ｍｏ１． ａｎｄ Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ）、 ３巻、１２号（１９８３年１２月） 、
２１５５−２１６５頁において、ＡｃＮＰＶを発現ベク
ターとして用い感染細胞媒体中で生物学的に活性なヒト
βインターフェロンを効率よく分泌させている。
イオロジー（Ｍｏ１． ａｎｄ Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ）、 ３巻、１２号（１９８３年１２月） 、
２１５５−２１６５頁において、ＡｃＮＰＶを発現ベク
ターとして用い感染細胞媒体中で生物学的に活性なヒト
βインターフェロンを効率よく分泌させている。
またＰｅｎｎｏｃｋらもモレキュラーアンドセルラーバ
イオロジー（Ｍｏ１． ａｎｄ Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ）、 ４巻、３号（１９８４年３月） 、 ３９
９−４０６頁において、ポリヘトリン遺伝子部位に挿入
された９、２ｋｂのプラスミドを安定して増殖させると
いうことで、ＡｃＮＰＶが組み換えＤＮＡベクターとし
てうまく使用され得たことを示している。彼らはまたイ
ーコリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ遺伝子
を含有するプラスミドを構築したが、彼らが示唆してい
るように、この組み換えウィルスは、β−ガラクトシダ
ーゼ指示薬たる５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
イル−β−Ｄ−ガラクトピラノサイト（Ｘ−ガル）を含
有する準固体重層媒体の下で青いプラークとして容易に
選別されるものである。
イオロジー（Ｍｏ１． ａｎｄ Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ）、 ４巻、３号（１９８４年３月） 、 ３９
９−４０６頁において、ポリヘトリン遺伝子部位に挿入
された９、２ｋｂのプラスミドを安定して増殖させると
いうことで、ＡｃＮＰＶが組み換えＤＮＡベクターとし
てうまく使用され得たことを示している。彼らはまたイ
ーコリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ遺伝子
を含有するプラスミドを構築したが、彼らが示唆してい
るように、この組み換えウィルスは、β−ガラクトシダ
ーゼ指示薬たる５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
イル−β−Ｄ−ガラクトピラノサイト（Ｘ−ガル）を含
有する準固体重層媒体の下で青いプラークとして容易に
選別されるものである。
しかしながら、同一のベクター中に挿入された異なった
遺伝子の発現レベルはしばしば異なるものであり、この
外部異種遺伝子に先行するリーダー配列の長さおよび性
質にそれは関係していると考えられている。更に加えて
、与えられた外部異種遺伝子を持っている異なった組み
換え杆状ウィルスは、しばしばこの外部異種遺伝子を種
々の異なったレベルで発現するであろう、また、発現ベ
クター中に置かれる遺伝子の大きさに関する問題も起き
る可能性があり、このような場合にはポリヒドリン部位
において大きな遺伝子もしくは多くの遺伝子の挿入およ
びそれに続く発現を阻止するおそれがある。
遺伝子の発現レベルはしばしば異なるものであり、この
外部異種遺伝子に先行するリーダー配列の長さおよび性
質にそれは関係していると考えられている。更に加えて
、与えられた外部異種遺伝子を持っている異なった組み
換え杆状ウィルスは、しばしばこの外部異種遺伝子を種
々の異なったレベルで発現するであろう、また、発現ベ
クター中に置かれる遺伝子の大きさに関する問題も起き
る可能性があり、このような場合にはポリヒドリン部位
において大きな遺伝子もしくは多くの遺伝子の挿入およ
びそれに続く発現を阻止するおそれがある。
即ち、ポックスウィルスおよびバキュロウィルスの両者
から最近構築された組み換え発現ベクターは次に示すよ
うな欠点を有するものである。ポックスウィルス発現系
はしばしば強力なプロモーターを欠いており、十分な発
現を得るためには非常に過酷な条件を要求する。バキュ
ロウィルス発現系については、挿入部位の大きさが、大
きな遺伝子もしくは多くの遺伝子の挿入についての問題
を生ぜしめるおそれがある。
から最近構築された組み換え発現ベクターは次に示すよ
うな欠点を有するものである。ポックスウィルス発現系
はしばしば強力なプロモーターを欠いており、十分な発
現を得るためには非常に過酷な条件を要求する。バキュ
ロウィルス発現系については、挿入部位の大きさが、大
きな遺伝子もしくは多くの遺伝子の挿入についての問題
を生ぜしめるおそれがある。
したがって昆虫ウィルス発現ベクターの開発には強力な
プロモーターを決定することが必要であり、また大きな
遺伝子断片を導入および発現するための容量が必要とさ
れるのである。
プロモーターを決定することが必要であり、また大きな
遺伝子断片を導入および発現するための容量が必要とさ
れるのである。
を するための
本発明によれば、本質的にスフェロイジン（ｓｐｈｅｒ
ｏｉｄｉｎ）をコードするＤＮＡ配列からなる単離ＤＮ
Ａを提供するものである。このＤＮＡ配列はコリストネ
ウラ ビニニス及びアムサクタ ムーレイのスフェロイ
ジン遺伝子をコードするものが好ましい。
ｏｉｄｉｎ）をコードするＤＮＡ配列からなる単離ＤＮ
Ａを提供するものである。このＤＮＡ配列はコリストネ
ウラ ビニニス及びアムサクタ ムーレイのスフェロイ
ジン遺伝子をコードするものが好ましい。
また、昆虫細胞又は昆虫の幼虫の組織培養中において、
選択された遺伝子又はその一部を発現可能な組み換え昆
虫ポックスウィルス発現ベクターを提供する。これらの
発現ベクターは、少なくとも１つの選択された遺伝子又
はその一部を含有する昆虫ポックスウィルスゲノムから
なり、その選択された遺伝子又はその一部が昆虫ポック
スウィルスプロモーター又はそれ自身のプロモーターの
調節下にある。
選択された遺伝子又はその一部を発現可能な組み換え昆
虫ポックスウィルス発現ベクターを提供する。これらの
発現ベクターは、少なくとも１つの選択された遺伝子又
はその一部を含有する昆虫ポックスウィルスゲノムから
なり、その選択された遺伝子又はその一部が昆虫ポック
スウィルスプロモーター又はそれ自身のプロモーターの
調節下にある。
昆虫ポックスウィルス（ＥＰＶｓ）はポックスウィルス
族の１つである。それはを推動物のポックスウィルスに
形態学的に類似しており、そのサイズとしては約２００
キロ塩基対（ｋｂ）の大きくて直線状の二本鎖ＤＮＡゲ
ノムを有している。それらの自然の宿主としては昆虫の
幼虫があり、摂取されたときこれらのｖｉｒｉｏｎは、
昆虫の腸内のアルカリ環境によって閉塞体から放出され
る。現在までＥ Ｐ Ｖ ｓは４つの異なった次元の昆
虫、ｌＡ翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、甲虫類（Ｃ
ｏ１ｅｏｐｔｅｒａ）、双翅類（Ｄｉｐｔｅｒａ）、お
よび直翅類（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）に感染することが
示されてきた。核多角体病ウィルス（ＮＰＶｓ）、顆粒
病ウィルス（ＧＶｓ）、および細胞質多角体病ウィルス
（ＣＰＶｓ）と共に。
族の１つである。それはを推動物のポックスウィルスに
形態学的に類似しており、そのサイズとしては約２００
キロ塩基対（ｋｂ）の大きくて直線状の二本鎖ＤＮＡゲ
ノムを有している。それらの自然の宿主としては昆虫の
幼虫があり、摂取されたときこれらのｖｉｒｉｏｎは、
昆虫の腸内のアルカリ環境によって閉塞体から放出され
る。現在までＥ Ｐ Ｖ ｓは４つの異なった次元の昆
虫、ｌＡ翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、甲虫類（Ｃ
ｏ１ｅｏｐｔｅｒａ）、双翅類（Ｄｉｐｔｅｒａ）、お
よび直翅類（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）に感染することが
示されてきた。核多角体病ウィルス（ＮＰＶｓ）、顆粒
病ウィルス（ＧＶｓ）、および細胞質多角体病ウィルス
（ＣＰＶｓ）と共に。
ＥＰＶｓは閉塞昆虫ウィルスのグループに属する。
このグループのヴイリオンはスフェロイジンという名の
主たる基質蛋白質からなっている蛋白様閉塞体中に秩序
なく埋め込まれている。
主たる基質蛋白質からなっている蛋白様閉塞体中に秩序
なく埋め込まれている。
本発明により、従来技術文献中で遭遇したいくつかの問
題点が、宿主−ベクター系でのウィルス発現ベクターを
製造するために、昆虫ポックスウィルスゲノム内でのプ
ロモーターと共に昆虫ポックスウィルスを提供すること
によって克服されている。より特定すれば、本発明は昆
虫細胞又は昆虫の幼虫の組織培養中において、選択され
た遺伝子を非常な高レベルで発現可能な組み換えウィル
ス発現ベクターを製造するための、昆虫ポックスウィル
スであるコリストネウラ ビニニス及びアムサクタ ム
ーレイの使用、およびそれらの結合スフェロイジンプロ
モーターの使用に関するものである。また、非常に大き
なゲノムサイズの昆虫ポックスウィルスが大きな外部異
種ＤＮＡ断片の挿入を可能にし、それによって多くの遺
伝子の同時導入を可能にするものである。本発明はまた
選択されたポリペプチドを合成する方法に関する。
題点が、宿主−ベクター系でのウィルス発現ベクターを
製造するために、昆虫ポックスウィルスゲノム内でのプ
ロモーターと共に昆虫ポックスウィルスを提供すること
によって克服されている。より特定すれば、本発明は昆
虫細胞又は昆虫の幼虫の組織培養中において、選択され
た遺伝子を非常な高レベルで発現可能な組み換えウィル
ス発現ベクターを製造するための、昆虫ポックスウィル
スであるコリストネウラ ビニニス及びアムサクタ ム
ーレイの使用、およびそれらの結合スフェロイジンプロ
モーターの使用に関するものである。また、非常に大き
なゲノムサイズの昆虫ポックスウィルスが大きな外部異
種ＤＮＡ断片の挿入を可能にし、それによって多くの遺
伝子の同時導入を可能にするものである。本発明はまた
選択されたポリペプチドを合成する方法に関する。
この方法は組み換え昆虫ポックスウィルス発現ベクター
を用いて感受性のある宿主細胞に感染させることを包含
する。この発現ベクターは該ポリペプチドまたはその一
部をコードする少なくとも１つの遺伝子を含有する昆虫
ポックスウィルスゲノムである。この選択された遺伝子
またはその一部は、昆虫ポックスウィルス遺伝子のプロ
モーター又はそれ自身のプロモーターの転写調節下にあ
る。
を用いて感受性のある宿主細胞に感染させることを包含
する。この発現ベクターは該ポリペプチドまたはその一
部をコードする少なくとも１つの遺伝子を含有する昆虫
ポックスウィルスゲノムである。この選択された遺伝子
またはその一部は、昆虫ポックスウィルス遺伝子のプロ
モーター又はそれ自身のプロモーターの転写調節下にあ
る。
この宿主細胞は成長し目的とする生成物が回収される。
また本発明の範囲内に、昆虫ポックスウィルスＤＮＡ部
分を用いるウィルス転移ベクター、組み換えウィルス転
移ベクターおよび組み換えウィルス発現ベクターの製造
方法が含まれる。得られた組み換えウィルス発現ベクタ
ーは昆虫細胞又は昆虫の幼虫の組織培養中において、単
一の選択遺伝子もしくは多数の遺伝子の発現を可能にす
るであろう。
分を用いるウィルス転移ベクター、組み換えウィルス転
移ベクターおよび組み換えウィルス発現ベクターの製造
方法が含まれる。得られた組み換えウィルス発現ベクタ
ーは昆虫細胞又は昆虫の幼虫の組織培養中において、単
一の選択遺伝子もしくは多数の遺伝子の発現を可能にす
るであろう。
本発明はまた、害虫抑制剤としての組み換え昆虫ポック
スウィルスの使用に関する。昆虫細胞に対して有害な物
質を製造し望ましくない害虫の増殖の抑制を助けるため
に、昆虫細胞に対して有害な物質をコードする遺伝子が
本発明の組み換えプラスミド中に挿入される。これは昆
虫に汚染された地域に、農業的にまた森林的に受容し得
る担体と混合した目的とする組み換え昆虫ポックスウィ
ルスを散布することによって行われる。
スウィルスの使用に関する。昆虫細胞に対して有害な物
質を製造し望ましくない害虫の増殖の抑制を助けるため
に、昆虫細胞に対して有害な物質をコードする遺伝子が
本発明の組み換えプラスミド中に挿入される。これは昆
虫に汚染された地域に、農業的にまた森林的に受容し得
る担体と混合した目的とする組み換え昆虫ポックスウィ
ルスを散布することによって行われる。
また本発明の範囲内に、遺伝子操作された昆虫ポックス
ウィルスワクチンの使用によるヒトもしくは宿主動物の
免疫方法がある。この方法はヒトもしくは動物に免疫応
答を導入することにより昆虫ポックスウィルスに感受性
のヒトもしくは宿主動物を免疫することを包含する。こ
の免疫応答は、ヒトもしくは動物に、組み換えにより昆
虫ポックスウィルスゲノムの非本質的領域内にこの昆虫
ポックスウィルスには天然では生じないＤＮＡを持つよ
うに合成的に改質された昆虫ポックスウィルスを播種す
ることにより導入される。この通常は生じないＤＮＡ部
分は、接種されたヒトもしくは動物に目的とする免疫応
答を引き起こす抗原をコードする部分の中から選ばれる
。
ウィルスワクチンの使用によるヒトもしくは宿主動物の
免疫方法がある。この方法はヒトもしくは動物に免疫応
答を導入することにより昆虫ポックスウィルスに感受性
のヒトもしくは宿主動物を免疫することを包含する。こ
の免疫応答は、ヒトもしくは動物に、組み換えにより昆
虫ポックスウィルスゲノムの非本質的領域内にこの昆虫
ポックスウィルスには天然では生じないＤＮＡを持つよ
うに合成的に改質された昆虫ポックスウィルスを播種す
ることにより導入される。この通常は生じないＤＮＡ部
分は、接種されたヒトもしくは動物に目的とする免疫応
答を引き起こす抗原をコードする部分の中から選ばれる
。
本発明は以下の記載により更に詳しく説明される。
本発明は本質的にスフェロイジンをコードするＤＮＡ配
列からなる単離ＤＮＡ、昆虫細胞又は昆虫の幼虫の組織
培養中において、選択された遺伝子又はその一部を発現
可能な組み換え昆虫ポックスウィルス発現ベクターに関
する。これらの発現ベクターは昆虫ポックスウィルスプ
ロモーターを含有することが好ましく、特にスフェロイ
ジンプロモーターを有することが好ましい。本発明のこ
の組み換え発現ベクターの農業的、森林的および医薬的
に重要な蛋白質の発現という能力は、非常に強力なプロ
モーターを使用できることと大きな非本質的遺伝子を削
除しそれによって外部異種遺伝子の挿入のために利用し
得る空間をつくり出す可能性とによって達成されるもの
である。
列からなる単離ＤＮＡ、昆虫細胞又は昆虫の幼虫の組織
培養中において、選択された遺伝子又はその一部を発現
可能な組み換え昆虫ポックスウィルス発現ベクターに関
する。これらの発現ベクターは昆虫ポックスウィルスプ
ロモーターを含有することが好ましく、特にスフェロイ
ジンプロモーターを有することが好ましい。本発明のこ
の組み換え発現ベクターの農業的、森林的および医薬的
に重要な蛋白質の発現という能力は、非常に強力なプロ
モーターを使用できることと大きな非本質的遺伝子を削
除しそれによって外部異種遺伝子の挿入のために利用し
得る空間をつくり出す可能性とによって達成されるもの
である。
昆虫ポックスウィルス（ＥＰＶ）はメロンロンタ メロ
ンロンタ（Ｍｅｌｏｎｌｏｎｔｈａ ｎ＋ｅｌｏｎｌｏ
ｎｔｈａ） Ｅ ＰＶ（サブジーナスＡ）、コリストネ
ウラ ビニニス（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｂｉｅ
ｎｎｉｓ） Ｅ Ｐ Ｖ （Ｃｂ Ｅ Ｐ Ｖ）及びア
ムサクタ ムーレイ（Ａｍｓａｃｔａ ｍｏｏｒｅｉ）
Ｅ ＰＶ（サブジーナスＢ）、およびキロモナス（Ｃｈ
ｉｒｏｍｏｎｕｓ） Ｅ Ｐ Ｖ （サブジーナスＣ）
で表わされる３つの可能性のある亜族を包含する。
ンロンタ（Ｍｅｌｏｎｌｏｎｔｈａ ｎ＋ｅｌｏｎｌｏ
ｎｔｈａ） Ｅ ＰＶ（サブジーナスＡ）、コリストネ
ウラ ビニニス（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｂｉｅ
ｎｎｉｓ） Ｅ Ｐ Ｖ （Ｃｂ Ｅ Ｐ Ｖ）及びア
ムサクタ ムーレイ（Ａｍｓａｃｔａ ｍｏｏｒｅｉ）
Ｅ ＰＶ（サブジーナスＢ）、およびキロモナス（Ｃｈ
ｉｒｏｍｏｎｕｓ） Ｅ Ｐ Ｖ （サブジーナスＣ）
で表わされる３つの可能性のある亜族を包含する。
ＥＰＶｓの区別のための特徴の１つとしては感染された
昆虫の幼虫もしくは組織培養中における複製サイクルの
終末での蛋白質基質におけるそれらの閉塞である。この
蛋白質基質は主としてスフェロイジンと呼ばれる単一ポ
リペプチドからなっている。スフェロイジンは感染サイ
クルの後期に多量に発現され、このものは単一遺伝子の
生成物である。
昆虫の幼虫もしくは組織培養中における複製サイクルの
終末での蛋白質基質におけるそれらの閉塞である。この
蛋白質基質は主としてスフェロイジンと呼ばれる単一ポ
リペプチドからなっている。スフェロイジンは感染サイ
クルの後期に多量に発現され、このものは単一遺伝子の
生成物である。
核多角体病ウィルスにおけるスフェロイジンとの同等物
であるポリヘトリンと比較して、ＤＮＡもしくは蛋白質
レベルでの重要な同一性はスフェロイジンおよびポリヘ
トリンの間では見られなかった。しかしながら、いくつ
かの構造的および機能的類似性はこの２つの蛋白質の間
に存在した。
であるポリヘトリンと比較して、ＤＮＡもしくは蛋白質
レベルでの重要な同一性はスフェロイジンおよびポリヘ
トリンの間では見られなかった。しかしながら、いくつ
かの構造的および機能的類似性はこの２つの蛋白質の間
に存在した。
したがって、両蛋白質は溶液中で既に凝集している。ま
た両蛋白質はその個々の閉塞体の主要成分であり、両者
ともアルカリ条件に感受性であり、その結果感染性ヴイ
リオンを放出するものである。
た両蛋白質はその個々の閉塞体の主要成分であり、両者
ともアルカリ条件に感受性であり、その結果感染性ヴイ
リオンを放出するものである。
しかしながら先に述べたように、昆虫ポックスウィルス
の大きなゲノムサイズ同様強力なスフェロイジンプロモ
ーターを利用し得ることが、大きな外部異種ＤＮＡ部分
の挿入および発現を可能とし、多数の遺伝子を同時に導
入することを可能としているのである。
の大きなゲノムサイズ同様強力なスフェロイジンプロモ
ーターを利用し得ることが、大きな外部異種ＤＮＡ部分
の挿入および発現を可能とし、多数の遺伝子を同時に導
入することを可能としているのである。
Ｅ Ｐ Ｖ ｓのヴイリオンは、１５０−４７０ ｎｒ
ａ長さで１６５−３００ ｎｍ巾の範囲のサイズの卵型
もしくはレンガ状であるａ Ｅ Ｐ Ｖ ｓ ヴイリ
オンはこのウィルスゲノムを含有する電子密度の大なる
核を取り囲んでいる折りたたまれた桑の実様外部膜で、
このものは直線二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であ
る膜を有している。このＤＮＡは２２５−３３３キロ塩
基のサイズを有している。
ａ長さで１６５−３００ ｎｍ巾の範囲のサイズの卵型
もしくはレンガ状であるａ Ｅ Ｐ Ｖ ｓ ヴイリ
オンはこのウィルスゲノムを含有する電子密度の大なる
核を取り囲んでいる折りたたまれた桑の実様外部膜で、
このものは直線二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であ
る膜を有している。このＤＮＡは２２５−３３３キロ塩
基のサイズを有している。
もう１つのＥ Ｐ Ｖ ｓを区別する特徴は、感受性宿
主の感染の間ウィルスの２つの形態をつくるその二相、
性の複製サイクルである。１つの形はスフェロイジン基
質の中に閉塞されるようなものであり、１つの宿主から
別の宿主へのウィルスの転送の原因となるものである。
主の感染の間ウィルスの２つの形態をつくるその二相、
性の複製サイクルである。１つの形はスフェロイジン基
質の中に閉塞されるようなものであり、１つの宿主から
別の宿主へのウィルスの転送の原因となるものである。
閉塞はヴイリオンに対して厳しい外部環境要因に対して
のある程度の保護を与えるものである。このウィルスの
第２の形態は非閉塞体であって、感染された宿主の中で
のウィルスが広まることの原因である。閉塞はウィルス
の成長には要求されないので、このスフェロイジン遺伝
子は非本質的なものと考えられ、それを中断して外部異
種遺伝子の挿入のための部位として使用することができ
る。
のある程度の保護を与えるものである。このウィルスの
第２の形態は非閉塞体であって、感染された宿主の中で
のウィルスが広まることの原因である。閉塞はウィルス
の成長には要求されないので、このスフェロイジン遺伝
子は非本質的なものと考えられ、それを中断して外部異
種遺伝子の挿入のための部位として使用することができ
る。
薬学的に、工業的にそして害虫抑制のための応用におい
て重要な異種遺伝子は、スフェロイジン遺伝子プロモー
ターの調節の下ＥＰＶゲノム中に遺伝子的操作で入れる
ことができる。ウィルス複製サイクルの終末において、
成熟ヴイリオンを有する多数の閉塞体が製造される。例
えば１０＠以上のｒｆ１１ａ体がコリストネウラ ビニ
ニスに感染した１つのトウヒ芽嬬虫幼虫（Ｓｐｒｕｃｅ
ｂｕｄｗｏｒｍ １ａｒｖａ）の中に存在する。
て重要な異種遺伝子は、スフェロイジン遺伝子プロモー
ターの調節の下ＥＰＶゲノム中に遺伝子的操作で入れる
ことができる。ウィルス複製サイクルの終末において、
成熟ヴイリオンを有する多数の閉塞体が製造される。例
えば１０＠以上のｒｆ１１ａ体がコリストネウラ ビニ
ニスに感染した１つのトウヒ芽嬬虫幼虫（Ｓｐｒｕｃｅ
ｂｕｄｗｏｒｍ １ａｒｖａ）の中に存在する。
このスフェロイジン蛋白質は閉塞体基質の主要成分であ
り、１つの遺伝子によってコードされている。したがっ
て、このスフェロイジン遺伝子は感染の遅い時期に活性
である非常に強力なプロモーターの調節の下にあり、こ
れがＥＰＶゲノム中に工学的に挿入された異種遺伝子の
高いレベルでの発現を可能とするのである。
り、１つの遺伝子によってコードされている。したがっ
て、このスフェロイジン遺伝子は感染の遅い時期に活性
である非常に強力なプロモーターの調節の下にあり、こ
れがＥＰＶゲノム中に工学的に挿入された異種遺伝子の
高いレベルでの発現を可能とするのである。
この構造遺伝子およびスフェロイジンのプロモーターは
本発明に関連して使用される好ましいＤＮＡ配列である
ので、このウィルススフェロイジン遺伝子を精製しその
配列を解明することが必要であった。
本発明に関連して使用される好ましいＤＮＡ配列である
ので、このウィルススフェロイジン遺伝子を精製しその
配列を解明することが必要であった。
このスフェロイジン蛋白質はポリアクリルアミドゲル電
気泳動によってほとんど単一なまでに精製された。この
ゲル精製されたスフェロイジン蛋白質のＮ−末端アミノ
酸配列は当業界でよく知られた技術を用いて決定された
。このアミノ酸配列に相当するＤＮＡオリゴヌクレオチ
ドは化学的に合成され、スフェロイジン遺伝子を明示す
るためのプローブとして使用された。
気泳動によってほとんど単一なまでに精製された。この
ゲル精製されたスフェロイジン蛋白質のＮ−末端アミノ
酸配列は当業界でよく知られた技術を用いて決定された
。このアミノ酸配列に相当するＤＮＡオリゴヌクレオチ
ドは化学的に合成され、スフェロイジン遺伝子を明示す
るためのプローブとして使用された。
このオリゴヌクレオチドはサザンプロット分析に使用さ
れ、ＥＰＶゲノムＤＮＡの制限消化によって得られたＤ
ＮＡ断片にハイブリダイズされた。
れ、ＥＰＶゲノムＤＮＡの制限消化によって得られたＤ
ＮＡ断片にハイブリダイズされた。
４．５ｋｂのＸｂ ａ Ｉ−Ｘｂ ａ Ｉコリストネウ
ラビエニスゲノムＤＮＡ断片がこのスフェロイジン遺伝
子を含有することが見出された。この４．５ｋｂの挿入
片を含有するプラスミドのサブクローニングが、２．３
ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ断片内にスフェロイジン遺
伝子を同定することを可能にした。このＤＮＡ断片はＤ
ＮＡ配列解析に付され、スフェロイジン遺伝子の調節配
列のコーディングおよび側面（ｆｌａｎｋｉｎｇ）が決
定された。
ラビエニスゲノムＤＮＡ断片がこのスフェロイジン遺伝
子を含有することが見出された。この４．５ｋｂの挿入
片を含有するプラスミドのサブクローニングが、２．３
ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ断片内にスフェロイジン遺
伝子を同定することを可能にした。このＤＮＡ断片はＤ
ＮＡ配列解析に付され、スフェロイジン遺伝子の調節配
列のコーディングおよび側面（ｆｌａｎｋｉｎｇ）が決
定された。
このスフェロイジン遺伝子が配列決定されたら。
後述の方法によりプロモーターの下流に外部異種の遺伝
子を挿入することにより外部異種遺伝子を発現するため
に、スフェロイジンプロモーターを使用することができ
る。例えば、ＣｂＥＰＶスフェロイジン５′側面配列は
、ワクシニア系のような系中において機能的なプロモー
ターであると考えられている。実際に、予備試験データ
はこの５′スフ工ロイジン遺伝子側面配列が、ワクシニ
アウィルスゲノム中に導入されたときレートワクシニア
プロモーターとして機能し得ることを示していた。この
ＩＩ祭によれば、ポックスウィルス後期遺伝子転写機構
はこのクラスのウィルスの展開（昆虫から哺乳動物へ）
の間、高度に保護されていることが示唆されている。
子を挿入することにより外部異種遺伝子を発現するため
に、スフェロイジンプロモーターを使用することができ
る。例えば、ＣｂＥＰＶスフェロイジン５′側面配列は
、ワクシニア系のような系中において機能的なプロモー
ターであると考えられている。実際に、予備試験データ
はこの５′スフ工ロイジン遺伝子側面配列が、ワクシニ
アウィルスゲノム中に導入されたときレートワクシニア
プロモーターとして機能し得ることを示していた。この
ＩＩ祭によれば、ポックスウィルス後期遺伝子転写機構
はこのクラスのウィルスの展開（昆虫から哺乳動物へ）
の間、高度に保護されていることが示唆されている。
一般的に言って、本発明は、このプロモーターを含有す
るＤＮＡ断片を得るために、この遺伝子のプロモーター
を含有する昆虫ポックスウィルスまたはその一部を包含
する昆虫ポックスウィルスＤＮＡを先ず切り出すことに
よって実行に移されるであろう。好ましくは、コリスト
ネウラ ビニニスのような適当な昆虫ポックスウィルス
のスフェロイジン遺伝子および側面ＤＮＡ配列を含有す
るＤＮＡが単離される。目的とするＤＮＡが次いで適当
な制限酵素によって切断される。これによってＤＮＡ断
片がつくられ、その内のいくつかがスフェロイジンプロ
モーターおよびスフェロイジンプロモーターまたはその
一部をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含有す
る。
るＤＮＡ断片を得るために、この遺伝子のプロモーター
を含有する昆虫ポックスウィルスまたはその一部を包含
する昆虫ポックスウィルスＤＮＡを先ず切り出すことに
よって実行に移されるであろう。好ましくは、コリスト
ネウラ ビニニスのような適当な昆虫ポックスウィルス
のスフェロイジン遺伝子および側面ＤＮＡ配列を含有す
るＤＮＡが単離される。目的とするＤＮＡが次いで適当
な制限酵素によって切断される。これによってＤＮＡ断
片がつくられ、その内のいくつかがスフェロイジンプロ
モーターおよびスフェロイジンプロモーターまたはその
一部をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含有す
る。
目的とするＤＮＡ断片が得られたら、このものは９次の
ようなプラスミドから選択され得る好適なりローニング
ベヒクル中に挿入される：アンピシリンもしくはテトラ
サイクリン耐性遺伝子のような選択可能マーカーを含有
するｐｕｃプラスミドもしくは関連プラスミドである。
ようなプラスミドから選択され得る好適なりローニング
ベヒクル中に挿入される：アンピシリンもしくはテトラ
サイクリン耐性遺伝子のような選択可能マーカーを含有
するｐｕｃプラスミドもしくは関連プラスミドである。
このようにして得られた転移ベクターは、選択された遺
伝子またはその一部をクローニングするために利用し得
る部位と共にスフヱロイジンプロモーターを、この選択
された遺伝子が該スフェロイジンプロモーターの転写調
節下にあるように含有する好適なりローニングベヒクル
を包含するであろう。この好ましい転移ベクターはスフ
ェロイジン蛋白質またはその一部をコードするＤＮＡ配
列をも包含することができる。この昆虫ポックスウィル
ス配列は挿入部のいずれかの側に約５００から５０００
ｂｐの範囲にあることができるが、重要な機能を果たし
ているのである。それらは外部異種遺伝子を昆虫ポック
スウィルスゲノム上の相応する配列へと指示するために
使用されるであろう。
伝子またはその一部をクローニングするために利用し得
る部位と共にスフヱロイジンプロモーターを、この選択
された遺伝子が該スフェロイジンプロモーターの転写調
節下にあるように含有する好適なりローニングベヒクル
を包含するであろう。この好ましい転移ベクターはスフ
ェロイジン蛋白質またはその一部をコードするＤＮＡ配
列をも包含することができる。この昆虫ポックスウィル
ス配列は挿入部のいずれかの側に約５００から５０００
ｂｐの範囲にあることができるが、重要な機能を果たし
ているのである。それらは外部異種遺伝子を昆虫ポック
スウィルスゲノム上の相応する配列へと指示するために
使用されるであろう。
転移ベクターが調製されたら、次に組み換え転移ベクタ
ーが、関心のある外部異種遺伝子またはその一部を上述
の転移ベクターの利用し得るクローニング部位中に導入
することにより、′！Ｓ築される。有用な遺伝子は１つ
でも複数でも本発明の転移ベクター中にクローンするこ
とができ、昆虫ポックスウィルスプロモーター配列と連
結される。
ーが、関心のある外部異種遺伝子またはその一部を上述
の転移ベクターの利用し得るクローニング部位中に導入
することにより、′！Ｓ築される。有用な遺伝子は１つ
でも複数でも本発明の転移ベクター中にクローンするこ
とができ、昆虫ポックスウィルスプロモーター配列と連
結される。
組み換えウィルスを得るために、組織培養昆虫細胞に低
投与量昆虫ポックスウィルスをまず感染させる。ヴイリ
オンが宿主細胞に吸着しその中に入った後、外部異種遺
伝子の挿入された組み換え転移プラスミドが、プラスミ
ドＤＮＡのカルシウムリン酸沈殿製剤を利用するかまた
は電気泳動のいずれかによる標準的な転移操作により感
染細胞中に導入される。
投与量昆虫ポックスウィルスをまず感染させる。ヴイリ
オンが宿主細胞に吸着しその中に入った後、外部異種遺
伝子の挿入された組み換え転移プラスミドが、プラスミ
ドＤＮＡのカルシウムリン酸沈殿製剤を利用するかまた
は電気泳動のいずれかによる標準的な転移操作により感
染細胞中に導入される。
感染細胞の細胞質中のヴイリオンの被覆を除いた後そし
てウィルスＤＮＡ複製の後、この昆虫ポックスウィルス
ゲノムは組み換えプラスミドＤＮＡに非常に近くなって
くる。このプラスミド上およびウィルスゲノム上の相当
する昆虫ボックス配列はイン ビボ組み換え法により対
をつくるであろう。これが終了したとき、このウィルス
ゲノムは外部異種遺伝子をそれ自身のＤＮＡ中に導入す
るであろう。このことが生じた後、組み換えＤＮＡ分子
の複製は続けられ、次いで新規組み換えウィルスの成熟
化が生じる。
てウィルスＤＮＡ複製の後、この昆虫ポックスウィルス
ゲノムは組み換えプラスミドＤＮＡに非常に近くなって
くる。このプラスミド上およびウィルスゲノム上の相当
する昆虫ボックス配列はイン ビボ組み換え法により対
をつくるであろう。これが終了したとき、このウィルス
ゲノムは外部異種遺伝子をそれ自身のＤＮＡ中に導入す
るであろう。このことが生じた後、組み換えＤＮＡ分子
の複製は続けられ、次いで新規組み換えウィルスの成熟
化が生じる。
該組み換えウィルスの選別を促進するために、細菌β−
ガラクトシダーゼ遺伝子が昆虫ポックスウィルスプロモ
ーターの調節の下にある発現プラスミドベクター中に導
入される。このウィルスゲノム中に合体されると、β−
ガラクトシダーゼはその基質Ｘ−ガルの存在下青色を示
すであろう。
ガラクトシダーゼ遺伝子が昆虫ポックスウィルスプロモ
ーターの調節の下にある発現プラスミドベクター中に導
入される。このウィルスゲノム中に合体されると、β−
ガラクトシダーゼはその基質Ｘ−ガルの存在下青色を示
すであろう。
青く見えるウィルスプラークは、目的とする外部異種遺
伝子を含有する組み換えウィルスを表わしている。目的
とする蛋白質を含有する組み換えウィルスは次いで精製
され組織培養細胞もしくは昆虫の幼虫を感染させるため
に用いられ、この細胞もしくは幼虫から外部異種蛋白質
を直接精製することができる。
伝子を含有する組み換えウィルスを表わしている。目的
とする蛋白質を含有する組み換えウィルスは次いで精製
され組織培養細胞もしくは昆虫の幼虫を感染させるため
に用いられ、この細胞もしくは幼虫から外部異種蛋白質
を直接精製することができる。
昆虫ポックスウィルス発現ベクターのための有用なマー
カー系であることとは別に、このマーカーは麻疹ウィル
スのＦおよびＨ蛋白質の高レベルでの発現に用いられ成
功していた杆状ウィルスプラスミドの構造に用いられた
。この組み換えプラスミドにβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子を有はることは、それらがＸ−ガルの存在下で青いプ
ラークとして見えることから組み換えウィルスの確認を
容易にするものである。
カー系であることとは別に、このマーカーは麻疹ウィル
スのＦおよびＨ蛋白質の高レベルでの発現に用いられ成
功していた杆状ウィルスプラスミドの構造に用いられた
。この組み換えプラスミドにβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子を有はることは、それらがＸ−ガルの存在下で青いプ
ラークとして見えることから組み換えウィルスの確認を
容易にするものである。
本発明の組み換え昆虫ポックスウィルス発現ベクターは
害虫抑制の応用にもまた用いることができる。これは昆
虫ポックスウィルスゲノムの非本質的領域内に、好まし
くない昆虫に有害な物質をコードする１もしくはそれ以
上のＤＮＡ配列を包含することにより達成される。この
ような物質としては、例えばバチルススリンギエンシス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）デ
ルタエンドトキシン、昆虫神経ホルモンもしくはその類
似体がある。このようにして得られた組み換え昆虫ポッ
クスウィルスは有害物質を製造し、農業的に許容し得る
担体と共に用いられたとき、コリストネウラ種のような
望ましくない昆虫の増殖を抑制するための効率的な手段
を提供するものである。
害虫抑制の応用にもまた用いることができる。これは昆
虫ポックスウィルスゲノムの非本質的領域内に、好まし
くない昆虫に有害な物質をコードする１もしくはそれ以
上のＤＮＡ配列を包含することにより達成される。この
ような物質としては、例えばバチルススリンギエンシス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）デ
ルタエンドトキシン、昆虫神経ホルモンもしくはその類
似体がある。このようにして得られた組み換え昆虫ポッ
クスウィルスは有害物質を製造し、農業的に許容し得る
担体と共に用いられたとき、コリストネウラ種のような
望ましくない昆虫の増殖を抑制するための効率的な手段
を提供するものである。
本発明の組み換え昆虫ポックスウィルス発現ベクターは
また。遺伝子操作された昆虫ポックスウィルスワクチン
を製造するためにも用いることができる。これは、昆虫
ポックスウィルスゲノムの非本質的領域内に、接種され
た宿主中に目的とする免疫応答を導入することができる
抗原をコードするＤＮＡ断片を挿入することにより達成
される。
また。遺伝子操作された昆虫ポックスウィルスワクチン
を製造するためにも用いることができる。これは、昆虫
ポックスウィルスゲノムの非本質的領域内に、接種され
た宿主中に目的とする免疫応答を導入することができる
抗原をコードするＤＮＡ断片を挿入することにより達成
される。
これは宿主に、昆虫ポックスウィルスゲノムの非本質的
領域内に接種された動物に目的とする免疫応答を導入す
ることができる抗原をコードするＤＮＡ断片を持たせる
組み換えにより合成的に改質された生もしくは弱毒昆虫
ポックスウィルスワクチンを接種することにより、ヒト
もしくは宿主動物を免疫する方法の発展へと導いている
。
領域内に接種された動物に目的とする免疫応答を導入す
ることができる抗原をコードするＤＮＡ断片を持たせる
組み換えにより合成的に改質された生もしくは弱毒昆虫
ポックスウィルスワクチンを接種することにより、ヒト
もしくは宿主動物を免疫する方法の発展へと導いている
。
また一方１本発明の組み換え昆虫ポックスウィルスは、
目的とする外部異種蛋白質を発現するために用いること
ができ、この蛋白質はＭｉ織培養細胞または昆虫幼虫か
ら精製することができる。これらの蛋白質は次いでヒト
および動物の病気に対する免疫応答および保護を引き出
すワクチン（免疫原）として使用することができる。
目的とする外部異種蛋白質を発現するために用いること
ができ、この蛋白質はＭｉ織培養細胞または昆虫幼虫か
ら精製することができる。これらの蛋白質は次いでヒト
および動物の病気に対する免疫応答および保護を引き出
すワクチン（免疫原）として使用することができる。
失見旌
次の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発
明の範囲を限定するものではない。
明の範囲を限定するものではない。
Ｘ隨鮭よ
ＣｂＥＰＶスフェロイジン蛋白質の配列解析ａ）ＣｂＥ
ＰＶヴイリオン び 塞 の 製ＣｂＥＰＶをコリスト
ネウラ フミフェラナ（Ｃｈｏｒｉｓｒｏｎｅｕｒａ
ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）幼虫中で増殖した。ＣｂＥＰＶ
閉塞体及びヴイリオンを、 Ｂｉｌｉｍｏｒｉａ及びＡ
ｒ１ｆによってヴイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） ９
６．５９６−６０３（１９７９，）に既に記載されてい
るように精製した。
ＰＶヴイリオン び 塞 の 製ＣｂＥＰＶをコリスト
ネウラ フミフェラナ（Ｃｈｏｒｉｓｒｏｎｅｕｒａ
ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）幼虫中で増殖した。ＣｂＥＰＶ
閉塞体及びヴイリオンを、 Ｂｉｌｉｍｏｒｉａ及びＡ
ｒ１ｆによってヴイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） ９
６．５９６−６０３（１９７９，）に既に記載されてい
るように精製した。
スフェロイジン蛋白質を精製するため、ＣｂＥｐｖ閉塞
体を電気泳動試料バッファ（７ｍＭ トＩＪスーＨＣ
ｌ、ｐＨ７，４，１％ＳＤＳ、１０％グリセロール、１
％β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、及び０．０
５％ブロムフェノールブルー）中に懸濁し、室温で１５
分間インキュベートした。
体を電気泳動試料バッファ（７ｍＭ トＩＪスーＨＣ
ｌ、ｐＨ７，４，１％ＳＤＳ、１０％グリセロール、１
％β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、及び０．０
５％ブロムフェノールブルー）中に懸濁し、室温で１５
分間インキュベートした。
次いでこの蛋白質試料を１０分間沸騰し、Ｌａｅａｕ＋
＋１ｉによってネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ２２７．
６８０−６８５（１９７０）に記載されているように、
ｌＯ％ソジウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）−ポリ
アクリルアミドゲル中で電気泳動した。、電気泳動は５
０Ｖで１２から１６時間行なわれた。
＋１ｉによってネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ２２７．
６８０−６８５（１９７０）に記載されているように、
ｌＯ％ソジウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）−ポリ
アクリルアミドゲル中で電気泳動した。、電気泳動は５
０Ｖで１２から１６時間行なわれた。
スフェロイジンの単量体（５０ＫＤａ）型をクマシーブ
ルー染色により場所を確認し、切り出し、そしてエルト
ラップ（Ｅｌｕｔｒａｐ）装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
＆ ５ｃｈｎｅｌｌ）中で電気溶出した。電気溶出（
ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）に先立って、このゲル
切片を溶出バッファ（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８，８，０，１％５ＤＳ）中、室温で３０分間平衡化
した。スフェロイジンの電気溶出をその溶出バッファ中
、６０Ｖで１６から２４時間行なった。このスフェロイ
ジン蛋白質をその膜間に回収し、トリクロロ酢酸（ＴＣ
Ａ）で沈殿させ、アセトンで洗浄し、真空中で乾燥した
。このペレットを０．５％水酸化アンモニウム中に再懸
濁し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄ
ｅｌ ４７０Ａガス相分析器を用いてＥｄ■ａｎ分解に
より蛋白質の配列決定を行った。
ルー染色により場所を確認し、切り出し、そしてエルト
ラップ（Ｅｌｕｔｒａｐ）装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
＆ ５ｃｈｎｅｌｌ）中で電気溶出した。電気溶出（
ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）に先立って、このゲル
切片を溶出バッファ（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８，８，０，１％５ＤＳ）中、室温で３０分間平衡化
した。スフェロイジンの電気溶出をその溶出バッファ中
、６０Ｖで１６から２４時間行なった。このスフェロイ
ジン蛋白質をその膜間に回収し、トリクロロ酢酸（ＴＣ
Ａ）で沈殿させ、アセトンで洗浄し、真空中で乾燥した
。このペレットを０．５％水酸化アンモニウム中に再懸
濁し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄ
ｅｌ ４７０Ａガス相分析器を用いてＥｄ■ａｎ分解に
より蛋白質の配列決定を行った。
見かけの分子量１００及び５０ＫＤａを有する２つの主
要スフェロイジン蛋白質種を第１図Ａのレーン２に示す
ように検出することができた（第１図Ａのレーン１は蛋
白質分子量マーカーを示す）。数個の微少蛋白質も存在
していた。それらの殆んどは精製されたＣｂＥＰＶヴイ
リオンと結合して見出され、したがってウィルス構造蛋
白質であると推定された。先の報告は、ＥＰＶスフェロ
イジンがＢｉｌｉｍｏｒｉａ及びＡｒ１ｆによってヴイ
ロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） ９６．５９６−６０３
（１９７９）中に記載されているように、１００ＫＤａ
の分子量を有する蛋白質であることを示唆していた。し
かしながら、本発明の反応条件下では、 １００と５０
ＫＤａスフ工ロイジン蛋白質種の割合がβ−ＭＥ濃度を
単に変えることによって変化させることができる一方、
全部の蛋白質のパターンにおいて他の変化はＲｆＡされ
なかったことが機械的に認められた。これら２つの蛋白
質種の間の関係を確立するために、それらを部分ＳＡ
Ｖ８プロテアーゼペプチド消化に付した。これらの消化
は、Ｃ１Ｂｙｅｌａｎｄらにより、ジャーナルオブバイ
オロジカルケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅａ
ｐ、）２５２、１１０２−１１０６（１９７７）中に既
に記載されているようにして行なった。このＣｂＥＰＶ
スフェロイジン蛋白質の単量体（５０ＫＤａ）及び二量
体（１００ＫＤａ）型をゲル精製し、クマシーブルー染
色により場所を確認し、そして切り出した。これら２つ
の蛋白質種を含有するゲル切片を２０％５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲルのウェル中に導入し、ＳＡ Ｖ８プロ
テアーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｎ＋
） １ ／Ａ ｇ含有電気泳動試料バソファーをその上
に重ねて入れた。
要スフェロイジン蛋白質種を第１図Ａのレーン２に示す
ように検出することができた（第１図Ａのレーン１は蛋
白質分子量マーカーを示す）。数個の微少蛋白質も存在
していた。それらの殆んどは精製されたＣｂＥＰＶヴイ
リオンと結合して見出され、したがってウィルス構造蛋
白質であると推定された。先の報告は、ＥＰＶスフェロ
イジンがＢｉｌｉｍｏｒｉａ及びＡｒ１ｆによってヴイ
ロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） ９６．５９６−６０３
（１９７９）中に記載されているように、１００ＫＤａ
の分子量を有する蛋白質であることを示唆していた。し
かしながら、本発明の反応条件下では、 １００と５０
ＫＤａスフ工ロイジン蛋白質種の割合がβ−ＭＥ濃度を
単に変えることによって変化させることができる一方、
全部の蛋白質のパターンにおいて他の変化はＲｆＡされ
なかったことが機械的に認められた。これら２つの蛋白
質種の間の関係を確立するために、それらを部分ＳＡ
Ｖ８プロテアーゼペプチド消化に付した。これらの消化
は、Ｃ１Ｂｙｅｌａｎｄらにより、ジャーナルオブバイ
オロジカルケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅａ
ｐ、）２５２、１１０２−１１０６（１９７７）中に既
に記載されているようにして行なった。このＣｂＥＰＶ
スフェロイジン蛋白質の単量体（５０ＫＤａ）及び二量
体（１００ＫＤａ）型をゲル精製し、クマシーブルー染
色により場所を確認し、そして切り出した。これら２つ
の蛋白質種を含有するゲル切片を２０％５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲルのウェル中に導入し、ＳＡ Ｖ８プロ
テアーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｎ＋
） １ ／Ａ ｇ含有電気泳動試料バソファーをその上
に重ねて入れた。
電気泳動を、そのブロムフェノールブルー染料がその積
み重ねているゲル中に中途まで進んだ時、２０分間停止
してｖ８プロテアーゼ消化を起こすことを可能にした。
み重ねているゲル中に中途まで進んだ時、２０分間停止
してｖ８プロテアーゼ消化を起こすことを可能にした。
電気泳動はそのブロムフェノールブルー染料がそのゲル
の底に到達するまで続けられた。Ｖ８プロテアーゼ−消
化ペプチドをＢｉ。
の底に到達するまで続けられた。Ｖ８プロテアーゼ−消
化ペプチドをＢｉ。
Ｒａｄ銀染色キットを用いた銀染色により視覚化した。
結果を第１図Ｂに示す。
この１００−（第１図Ｂ、レーン２）及び５Ｏ−ＫＤａ
（第１図Ｂ、レーン３）蛋白質種はその同じｖ８プロ
テアーゼペプチド型を明瞭に分けた（レーン１は蛋白質
分子量マーカーを示す）。更に同様の実験がトリプシン
プロテアーゼを用いて行なわれた時、これら２つの蛋白
質の部分トリプシン分解ペプチド型が又、同様であった
。それらの各分子量と共に、これらのａｍはその１００
−ＫＤａの蛋白質種が５Ｏ−ＫＤａスフェロイジン蛋白
質の二量体形であることを示唆した。還元剤がＥＰＶ閉
塞体マトリックスの凝集をほどくために必須のものであ
り、このマトリックス構造上の分子間ジスルフィド結合
の重要性に関係していることは既にＭｃＣａｒｔｈｙら
によりヴイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） ５９．５９
−６９（１９７４）に報告されている。ＥＰＶ閉塞体の
形成及び構造中のジスルフィド結合の重要性を研究する
ため、ＣｂＥＰＶ閉塞体を種々の量のβ−ＭＥを含有す
る電気泳動試料バッファー中に溶解し、次いで１０％５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、クマシ
ーブルー染色により視覚化した。結果を第２図に示す。
（第１図Ｂ、レーン３）蛋白質種はその同じｖ８プロ
テアーゼペプチド型を明瞭に分けた（レーン１は蛋白質
分子量マーカーを示す）。更に同様の実験がトリプシン
プロテアーゼを用いて行なわれた時、これら２つの蛋白
質の部分トリプシン分解ペプチド型が又、同様であった
。それらの各分子量と共に、これらのａｍはその１００
−ＫＤａの蛋白質種が５Ｏ−ＫＤａスフェロイジン蛋白
質の二量体形であることを示唆した。還元剤がＥＰＶ閉
塞体マトリックスの凝集をほどくために必須のものであ
り、このマトリックス構造上の分子間ジスルフィド結合
の重要性に関係していることは既にＭｃＣａｒｔｈｙら
によりヴイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） ５９．５９
−６９（１９７４）に報告されている。ＥＰＶ閉塞体の
形成及び構造中のジスルフィド結合の重要性を研究する
ため、ＣｂＥＰＶ閉塞体を種々の量のβ−ＭＥを含有す
る電気泳動試料バッファー中に溶解し、次いで１０％５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、クマシ
ーブルー染色により視覚化した。結果を第２図に示す。
β−ＭＥの不存在において、残留する全てのマトリック
ス蛋白質は第２図のレーン２に見られるように凝集し、
そして試料ウィルス中に残った。β−ＭＥ濃度が増すに
つれて（レーン３；０．１％β−ＭＥ、レーン４；０．
３％β−ＭＥ及びレーン５；０．５％β−Ｍ Ｅ ）
１００−ＫＤａスフェロイジンニ量体及び５Ｏ−ＫＤａ
単量体（レーン１は蛋白質分子量マーカーを示す）が漸
進的に現われた。
ス蛋白質は第２図のレーン２に見られるように凝集し、
そして試料ウィルス中に残った。β−ＭＥ濃度が増すに
つれて（レーン３；０．１％β−ＭＥ、レーン４；０．
３％β−ＭＥ及びレーン５；０．５％β−Ｍ Ｅ ）
１００−ＫＤａスフェロイジンニ量体及び５Ｏ−ＫＤａ
単量体（レーン１は蛋白質分子量マーカーを示す）が漸
進的に現われた。
この１００−ＫＤａ二量体から５Ｏ−ＫＤａ単量体への
転換はその還元剤の高濃度でｗＡ察された。この結果は
、還元剤が閉塞体を溶解するために必要であるという先
のｌｌＩ察が正しいことを確認するものであり、それは
又５Ｏ−ＫＤａスフェロイジン単量体蛋白質の三量化お
よび重合過程におけるジスルフィド結合の重要性を示し
た。ジチオスレイトールのような他の還元剤も又この閉
塞体マトリックスを可溶化することができるものである
。
転換はその還元剤の高濃度でｗＡ察された。この結果は
、還元剤が閉塞体を溶解するために必要であるという先
のｌｌＩ察が正しいことを確認するものであり、それは
又５Ｏ−ＫＤａスフェロイジン単量体蛋白質の三量化お
よび重合過程におけるジスルフィド結合の重要性を示し
た。ジチオスレイトールのような他の還元剤も又この閉
塞体マトリックスを可溶化することができるものである
。
失見鮭主
ＣｂＥＰＶスフェロイジン遺伝子の配列解析５０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，８，０，５％ＳＤＳ、６％
シュークＣＩ−Ｘ （Ｗ／Ｖ）及び２ Ｂ／ｍｌプロテ
ナーゼＫ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）を含有する２−ｍ１容量中にほぼ１０”Ｃｂ Ｅ Ｐ
Ｖを懸濁することによって、ＣｂＥＰＶゲノムＤＮＡ
を精製した。
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，８，０，５％ＳＤＳ、６％
シュークＣＩ−Ｘ （Ｗ／Ｖ）及び２ Ｂ／ｍｌプロテ
ナーゼＫ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）を含有する２−ｍ１容量中にほぼ１０”Ｃｂ Ｅ Ｐ
Ｖを懸濁することによって、ＣｂＥＰＶゲノムＤＮＡ
を精製した。
この混合物を６５℃で一晩インキユベートした。２つの
相をゆっくりと混合しながら、フェノール−クロロホル
ムでＤＮＡを３回抽出した。ウイルスＤＮＡを次いでＤ
ＮＡａ：殿させ、脱イオン水中に懸濁した。
相をゆっくりと混合しながら、フェノール−クロロホル
ムでＤＮＡを３回抽出した。ウイルスＤＮＡを次いでＤ
ＮＡａ：殿させ、脱イオン水中に懸濁した。
精製されたウィルスＤＮＡをＨｉｎｄＩ［Ｉ、ＥｃｏＲ
Ｉ又はＸｂａｌで消化することによりＣｂＥＰｖゲノム
ライブラリを構築し、各酵素で消化されたｐｔＪｃ１９
ベクター中にクローン化した。
Ｉ又はＸｂａｌで消化することによりＣｂＥＰｖゲノム
ライブラリを構築し、各酵素で消化されたｐｔＪｃ１９
ベクター中にクローン化した。
このスフェロイジン遺伝子を同定するため、５Ｏ−ＫＤ
ａスフェロイジンプロテインの末端の配列解析を行なっ
た。この電気泳動的に精製された５Ｏ−ＫＤａ蛋白質種
に加えて、Ｂ１１１ｎ＋ｏｒｉａ及びＡｒ１ｆによって
ヴイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） ９６．５９６−６
０３（１９７９）中に既に記載されているようにして、
ＳＤＳ、β−ＭＥ及び８Ｍ尿素を含有するバッファー中
に溶解された精製されたＣｂＥＰＶ閉塞体についてもＮ
−末端蛋白質配列解析を行なった。この条件下で、この
アルカリ性プロテアーゼは不活性化されていることが報
告されている。精製された閉塞体からのスフェロイジン
蛋白質の直接の蛋白質配列解析が可能であった。という
のは、スフェロイジンが存在する断然最も豊富な蛋白質
種であるからである。この精製された５Ｏ−ＫＤａ蛋白
質種及び可溶化された閉塞体の両者は全く同一であった
。３０アミノ酸配列が得られ、ペプチド配列Ｔｙｒ、Ｍ
ｅｔ。
ａスフェロイジンプロテインの末端の配列解析を行なっ
た。この電気泳動的に精製された５Ｏ−ＫＤａ蛋白質種
に加えて、Ｂ１１１ｎ＋ｏｒｉａ及びＡｒ１ｆによって
ヴイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） ９６．５９６−６
０３（１９７９）中に既に記載されているようにして、
ＳＤＳ、β−ＭＥ及び８Ｍ尿素を含有するバッファー中
に溶解された精製されたＣｂＥＰＶ閉塞体についてもＮ
−末端蛋白質配列解析を行なった。この条件下で、この
アルカリ性プロテアーゼは不活性化されていることが報
告されている。精製された閉塞体からのスフェロイジン
蛋白質の直接の蛋白質配列解析が可能であった。という
のは、スフェロイジンが存在する断然最も豊富な蛋白質
種であるからである。この精製された５Ｏ−ＫＤａ蛋白
質種及び可溶化された閉塞体の両者は全く同一であった
。３０アミノ酸配列が得られ、ペプチド配列Ｔｙｒ、Ｍ
ｅｔ。
Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅに相当する退縮された
オリゴヌクレオチド ＴＡＸＡＴＧＡＣＮＴＴＸＣＣＮ
ＡＴ （ここでＸはＴ又はＣのいずれかであり、Ｎは４
つのヌクレオチドのいずれか１つである）をアプライド
バイオシステムズモデル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｎ＋ｓ Ｍｏｄｅｌ）３ｇＯＡ ＤＮＡ合成機
中で合成したａ Ｘ ｂ ａ Ｉで消化されたＣｂＥＰ
ＶゲノムＤＮＡが０．８％アガロースゲル中で電気泳動
されニトロセルローズ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆
５ｃｈｎｅｌｌ）に移された。このオリゴヌクレオチド
はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）及びＣ’ｆ
”Ｐｌ ＡＴＰ （Ａｍｅｒｓｈａｍ、 ３０００
Ｃｉ／ｇａｏｌ）で末端Ｓ識され、Ｘｂａｌ−消化Ｃｂ
ＥＰＶゲノムＤＮＡ上のスフェロイジン遺伝子の場所を
示すためのサザンプロット分析におけるプローブとして
用いた。ハイブリダイゼーションが６ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ
（９０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび９００ｍＭ塩化ナ
トリウム）および１００μｇ ／ ｍ ｌの酵母ｔＲＮ
Ａ中で室温下、−晩行われた。ＺＸＳＳＣ中で室温で洗
浄が行われた。
オリゴヌクレオチド ＴＡＸＡＴＧＡＣＮＴＴＸＣＣＮ
ＡＴ （ここでＸはＴ又はＣのいずれかであり、Ｎは４
つのヌクレオチドのいずれか１つである）をアプライド
バイオシステムズモデル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｎ＋ｓ Ｍｏｄｅｌ）３ｇＯＡ ＤＮＡ合成機
中で合成したａ Ｘ ｂ ａ Ｉで消化されたＣｂＥＰ
ＶゲノムＤＮＡが０．８％アガロースゲル中で電気泳動
されニトロセルローズ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆
５ｃｈｎｅｌｌ）に移された。このオリゴヌクレオチド
はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）及びＣ’ｆ
”Ｐｌ ＡＴＰ （Ａｍｅｒｓｈａｍ、 ３０００
Ｃｉ／ｇａｏｌ）で末端Ｓ識され、Ｘｂａｌ−消化Ｃｂ
ＥＰＶゲノムＤＮＡ上のスフェロイジン遺伝子の場所を
示すためのサザンプロット分析におけるプローブとして
用いた。ハイブリダイゼーションが６ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ
（９０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび９００ｍＭ塩化ナ
トリウム）および１００μｇ ／ ｍ ｌの酵母ｔＲＮ
Ａ中で室温下、−晩行われた。ＺＸＳＳＣ中で室温で洗
浄が行われた。
４．５ｋｂのＸｂａＩ−Ｘｂａｌ断片が上記オリゴヌク
レオチドにハイブリダイズしていることが見出された。
レオチドにハイブリダイズしていることが見出された。
この４．５ｋｂ挿入物を含有しているプラスミドのサブ
クローニングが、２．３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断
片内におけるスフェロイジン遺伝子の同定を可能にした
。このＤＮＡ断片のＤＮＡ配列解析が、合成オリゴヌク
レオチドプライマー（ａ −” Ｐ ） ｄ Ａ Ｔ
Ｐ （Ａ＋ｍｅｒｓｈａｍ、 ３０００Ｃｉ／ｍＭｏ１
）およびファルマシアからのＴ７ＤＮＡポリメラーゼ配
列キットを使用して二本鎖プラスミドＤＮＡ上で行なわ
れた。スフェロイジン遺伝子をコードするオープンリー
ディングフレームのＤＮＡ配列を第３図に示す、この図
において、ＣｂＥＰＶスフェロイジン遺伝子および両側
の配列が示されている。Ｎ−末端におけるシグナルペプ
チドは四角で囲まれており、また２つの可能性のあるＮ
−グリコジル化部位にはアンダーラインが引かれている
。
クローニングが、２．３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断
片内におけるスフェロイジン遺伝子の同定を可能にした
。このＤＮＡ断片のＤＮＡ配列解析が、合成オリゴヌク
レオチドプライマー（ａ −” Ｐ ） ｄ Ａ Ｔ
Ｐ （Ａ＋ｍｅｒｓｈａｍ、 ３０００Ｃｉ／ｍＭｏ１
）およびファルマシアからのＴ７ＤＮＡポリメラーゼ配
列キットを使用して二本鎖プラスミドＤＮＡ上で行なわ
れた。スフェロイジン遺伝子をコードするオープンリー
ディングフレームのＤＮＡ配列を第３図に示す、この図
において、ＣｂＥＰＶスフェロイジン遺伝子および両側
の配列が示されている。Ｎ−末端におけるシグナルペプ
チドは四角で囲まれており、また２つの可能性のあるＮ
−グリコジル化部位にはアンダーラインが引かれている
。
ｃ）ＣｂＥＰＶスフェロイジン′ のＣｂＥＰＶスフ
ェロイジン遺伝子は長さが１０２３ヌクレオチドで、３
８．５ｋＤａの予測される分子量を有す蛋白質をコード
する。成熟スフェロイジンは５０ｋＤａの見かけ分子量
を有し、これはその予測される分子量よりもかなり大で
ある。この不一致は翻訳後の改質に超因し得る。Ｅ Ｐ
Ｖ ｓは他の天然痘ウィルス同様細胞質ウィルである
ので、切断がｍＲＮＡ形成中に巻き込まれて起きること
はありそうにない、そしてこのゲノムＤＮＡ配列はｍＲ
ＮＡ配列と一致することが期待される。天然痘ウィルス
遺伝子の典型的なものであるスフェロイジン遺伝子は非
常にＡＴに富んでいる（６７％）。このものは酸性であ
り、５．７１の予測ＰＨを有している。このＤＮＡ配列
から推論される蛋白質配列は、最初の２０個のＮ−末端
アミノ酸が成熟スフェロイジン蛋白質では存在していな
いことを除けば。
ェロイジン遺伝子は長さが１０２３ヌクレオチドで、３
８．５ｋＤａの予測される分子量を有す蛋白質をコード
する。成熟スフェロイジンは５０ｋＤａの見かけ分子量
を有し、これはその予測される分子量よりもかなり大で
ある。この不一致は翻訳後の改質に超因し得る。Ｅ Ｐ
Ｖ ｓは他の天然痘ウィルス同様細胞質ウィルである
ので、切断がｍＲＮＡ形成中に巻き込まれて起きること
はありそうにない、そしてこのゲノムＤＮＡ配列はｍＲ
ＮＡ配列と一致することが期待される。天然痘ウィルス
遺伝子の典型的なものであるスフェロイジン遺伝子は非
常にＡＴに富んでいる（６７％）。このものは酸性であ
り、５．７１の予測ＰＨを有している。このＤＮＡ配列
から推論される蛋白質配列は、最初の２０個のＮ−末端
アミノ酸が成熟スフェロイジン蛋白質では存在していな
いことを除けば。
精製スフェロイジン蛋白質の蛋白質配列解析により得ら
れるＮ−末端蛋白質配列と一致している。
れるＮ−末端蛋白質配列と一致している。
これらの２０個のアミノ酸は、Ｈｅ１ｊｎｅによってヌ
クレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅｓ、） １４．４６８３−４６９０（１９８
６）に示されている、２つのより極性の領域が側面に付
いている高度に疎水性の領域を有するいわゆる（ｃｏｎ
ｓｅｎｓｕｓ）シグナルペプチド配列とよく似ているこ
とが分った。
クレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅｓ、） １４．４６８３−４６９０（１９８
６）に示されている、２つのより極性の領域が側面に付
いている高度に疎水性の領域を有するいわゆる（ｃｏｎ
ｓｅｎｓｕｓ）シグナルペプチド配列とよく似ているこ
とが分った。
このシグナルペプチド様配列の存在はＣｂＥＰＶスフェ
ロイジンが分泌蛋白質である可能性を示唆している。し
かしながら現在のところは、ＣｂＥＰＶのための効率的
な組織培養系がないために、ＣｂＥＰＶスフェロイジン
蛋白質が本当に分泌されているかどうか決定することが
できない。
ロイジンが分泌蛋白質である可能性を示唆している。し
かしながら現在のところは、ＣｂＥＰＶのための効率的
な組織培養系がないために、ＣｂＥＰＶスフェロイジン
蛋白質が本当に分泌されているかどうか決定することが
できない。
成熟スフェロイジン蛋白質の予測分子量は３６ｋＤａ（
２０のＮ−末アミノ酸が除去されている）であり、ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル中でのその５０ｋＤａという
分子量よりかなり小さい、このような不一致は該蛋白質
の翻訳後の改質によるということができる。事実、２つ
の可能性のあるＮ−グリコジル化部位がスフェロイジン
蛋白質分子上に存在する（第３図）。リン酸化、スルフ
ェート化およびアセチル化のような他の一般的な改質が
、この観察される分子量の増加に寄与していることがあ
り得る。
２０のＮ−末アミノ酸が除去されている）であり、ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル中でのその５０ｋＤａという
分子量よりかなり小さい、このような不一致は該蛋白質
の翻訳後の改質によるということができる。事実、２つ
の可能性のあるＮ−グリコジル化部位がスフェロイジン
蛋白質分子上に存在する（第３図）。リン酸化、スルフ
ェート化およびアセチル化のような他の一般的な改質が
、この観察される分子量の増加に寄与していることがあ
り得る。
スフェロイジン蛋白質を更に理解するために、コンピュ
ーター分析が行なわれた。スフェロイジンの水治療法（
ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）プロットが、 Ｐｕ５ｔｅｌｌ
配列分析プログラムを用いて得られた。結果を第４図に
示す。該蛋白質のＮ−末端におけるシグナルペプチド配
列領域中に突出した疎水性領域が存在する。逆に、該ス
フェロイジンのＣ−末端は主として親水性である。
ーター分析が行なわれた。スフェロイジンの水治療法（
ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）プロットが、 Ｐｕ５ｔｅｌｌ
配列分析プログラムを用いて得られた。結果を第４図に
示す。該蛋白質のＮ−末端におけるシグナルペプチド配
列領域中に突出した疎水性領域が存在する。逆に、該ス
フェロイジンのＣ−末端は主として親水性である。
プロット構造プログラムのＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ予測
がスフェロイジンの二次構造を予測するために採用され
た。結果を第５図に示す、この疎水性Ｎ一端末は膜結合
性のようであり、アラニン（２０）残基においてプロテ
アーゼにより切断されるとき成熟スフェロイジン分子を
形成する。スフェロイジン蛋白質における９つのシステ
ィン残基のうち、２つは分子内ジスルフィド結合（３４
および５４残基）を形成する可能性があり、一方他の７
つは分子間ジスルフィド結合形成に参加し得るものであ
る。
がスフェロイジンの二次構造を予測するために採用され
た。結果を第５図に示す、この疎水性Ｎ一端末は膜結合
性のようであり、アラニン（２０）残基においてプロテ
アーゼにより切断されるとき成熟スフェロイジン分子を
形成する。スフェロイジン蛋白質における９つのシステ
ィン残基のうち、２つは分子内ジスルフィド結合（３４
および５４残基）を形成する可能性があり、一方他の７
つは分子間ジスルフィド結合形成に参加し得るものであ
る。
第５図はまた２つの潜在的なＮ−グリコジル化部位の位
置を示している。鋭い鋸歯波および鈍い鋸歯波のコイル
を有するサイン波βシートで、螺旋が示されている。
置を示している。鋭い鋸歯波および鈍い鋸歯波のコイル
を有するサイン波βシートで、螺旋が示されている。
ワクシニア後期遺伝子が共通のＴＡＡＡＴＧを有し、そ
の際３′ＡＴＧトリヌクレオチドは翻訳開始コドンを表
わすことが報告されている（Ｈａｎｇｇｉ ら、エンボ
ジャーナル（Ｅｎ＋ｂｏ、 Ｊ、）互、 １０７１−１
０７６（１９８６）ＨＲｏｓｅｌら、ジャーナルオブヴ
イロロジー（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、） ６０．４３６−４
４９） 、ワクシニアレート遺伝子の転写はこのＴＡＡ
ＡＴＧヘキサヌクレオチド配列内で始まることが示され
た。ｃｂＥＰＶスフェロイジン遺伝子の５′側面配列と
ワクシニアＰ４ｂとの間における同一性が第６図に示さ
れている。ＡＴＧ開始コドンおよびＣｂＥＰＶスフェロ
イジン遺伝子の上流領域およびワクシニアレート遺伝子
を含む配列（２５ヌクレオチド）が示されている。一致
しないヌクレオチドは星印で表わされており、ＡＴＧ翻
訳開始コドンはアンダーラインが引かれている。ＣｂＥ
ＰＶスフェロイジン通伝子を試験した結果、ＡＴＧ翻訳
開始コドン部位における同様の配列ＴＡＡＴＧの存在が
明らかにされた。ＣｂＥＰＶスフェロイジン遺伝子の５
′側面配列と既知のワクシニアレート遺伝子とを比較す
ると、ＣｂＥＰＶスフェロイジン遺伝子とワクシニア主
核蛋白質前郭体遺伝子Ｐ４ｂとの間に著しい類似性が観
察された。示されている２５ヌクレオチドの内１９ヌク
レオチドが両遺伝子に共通しており、この領域内での７
６％の同一性を表わしている（第６図）。両配列はデオ
キシアデノシン残基に非常に富んでいる（スフェロイジ
ンでは７２％、Ｐ４ｂでは５６％）。ＡＴＧ翻訳開始コ
ドンのすぐ上流の領域における２つの遺伝子の間の実質
的な同一性、そしてＣｏｃｈｒａｎらのジャーナルオブ
ヴイロロジー（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、） ５３、３Ｏ−３
７ＨＨａｎｇｉｉら、エンボジャーナル（Ｅｍｂｏ。
の際３′ＡＴＧトリヌクレオチドは翻訳開始コドンを表
わすことが報告されている（Ｈａｎｇｇｉ ら、エンボ
ジャーナル（Ｅｎ＋ｂｏ、 Ｊ、）互、 １０７１−１
０７６（１９８６）ＨＲｏｓｅｌら、ジャーナルオブヴ
イロロジー（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、） ６０．４３６−４
４９） 、ワクシニアレート遺伝子の転写はこのＴＡＡ
ＡＴＧヘキサヌクレオチド配列内で始まることが示され
た。ｃｂＥＰＶスフェロイジン遺伝子の５′側面配列と
ワクシニアＰ４ｂとの間における同一性が第６図に示さ
れている。ＡＴＧ開始コドンおよびＣｂＥＰＶスフェロ
イジン遺伝子の上流領域およびワクシニアレート遺伝子
を含む配列（２５ヌクレオチド）が示されている。一致
しないヌクレオチドは星印で表わされており、ＡＴＧ翻
訳開始コドンはアンダーラインが引かれている。ＣｂＥ
ＰＶスフェロイジン通伝子を試験した結果、ＡＴＧ翻訳
開始コドン部位における同様の配列ＴＡＡＴＧの存在が
明らかにされた。ＣｂＥＰＶスフェロイジン遺伝子の５
′側面配列と既知のワクシニアレート遺伝子とを比較す
ると、ＣｂＥＰＶスフェロイジン遺伝子とワクシニア主
核蛋白質前郭体遺伝子Ｐ４ｂとの間に著しい類似性が観
察された。示されている２５ヌクレオチドの内１９ヌク
レオチドが両遺伝子に共通しており、この領域内での７
６％の同一性を表わしている（第６図）。両配列はデオ
キシアデノシン残基に非常に富んでいる（スフェロイジ
ンでは７２％、Ｐ４ｂでは５６％）。ＡＴＧ翻訳開始コ
ドンのすぐ上流の領域における２つの遺伝子の間の実質
的な同一性、そしてＣｏｃｈｒａｎらのジャーナルオブ
ヴイロロジー（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、） ５３、３Ｏ−３
７ＨＨａｎｇｉｉら、エンボジャーナル（Ｅｍｂｏ。
Ｊ、） ５．１０７１−１０７６（１９８６）に記載さ
れているようにワクシニアレート遺伝子におけるＡＴＧ
コドンへの短い長さの５′配列（約３０ヌクレオチド）
がワクシニアレートプロモーターとして十分機能したと
いう先の報告により、このＣｂＥＰＶスフェロイジン５
′側面配列はこのワクシニア系における機能的プロモー
ターと考えられた。実際のところ、予備データはこの５
′スフ工ロイジン遺伝子５′側面配列はワクシニアウィ
ルスゲノム中に導入されたときレートワクシニアプロモ
ーターとして機能することができるのである。
れているようにワクシニアレート遺伝子におけるＡＴＧ
コドンへの短い長さの５′配列（約３０ヌクレオチド）
がワクシニアレートプロモーターとして十分機能したと
いう先の報告により、このＣｂＥＰＶスフェロイジン５
′側面配列はこのワクシニア系における機能的プロモー
ターと考えられた。実際のところ、予備データはこの５
′スフ工ロイジン遺伝子５′側面配列はワクシニアウィ
ルスゲノム中に導入されたときレートワクシニアプロモ
ーターとして機能することができるのである。
第１図Ａは精製されたＣｂＥＰＶ閉塞体の電気泳動ゲル
を表わしたものである。 第１図ＢはＣｂＥＰＶスフェロイジン単量体および二量
体蛋白質種のＳＡ Ｖ８プロテアーゼ消化を表わしたも
のである。 第２図はＣｂＥＰＶ閉塞体の形成および構造におけるジ
スルフィド結合の係わりを表わすものである。 第３図はＣｂＥＰＶスフェロイジン遺伝子のＤＮＡ配列
を表わす。 第４図はＣｂＥＰＶスフェロイジンの水治療法プロット
を表わす。 第５図はＣｂＥＰＶスフェロイジンの推測された二次構
造を表わす。 第６図はＣｂＥＰＶスフェロイジン遺伝子の５′側面配
列とワクシニアレート遺伝子との間の比較図である。
を表わしたものである。 第１図ＢはＣｂＥＰＶスフェロイジン単量体および二量
体蛋白質種のＳＡ Ｖ８プロテアーゼ消化を表わしたも
のである。 第２図はＣｂＥＰＶ閉塞体の形成および構造におけるジ
スルフィド結合の係わりを表わすものである。 第３図はＣｂＥＰＶスフェロイジン遺伝子のＤＮＡ配列
を表わす。 第４図はＣｂＥＰＶスフェロイジンの水治療法プロット
を表わす。 第５図はＣｂＥＰＶスフェロイジンの推測された二次構
造を表わす。 第６図はＣｂＥＰＶスフェロイジン遺伝子の５′側面配
列とワクシニアレート遺伝子との間の比較図である。
Claims (27)
- （１）本質的にスフェロイジンをコードするＤＮＡ配列
からなる単離ＤＮＡ。 - （２）スフェロイジンをコードするＤＮＡ配列が昆虫ポ
ックスウィルススフェロイジンＤＮＡ配列である請求項
１記載の単離ＤＮＡ。 - （３）昆虫ポックスウィルスがコリストネウラ ビエニ
ス（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｂｉｅｎｎｉｓ）及
びアムサクタムーレイ（Ａｍｓａｃｔａ ｍｏｏｒｅｉ
）から選択されるものである請求項２記載の単離ＤＮＡ
。 - （４）本質的に第３図に示されたＤＮＡ配列からなる単
離ＤＮＡ。 - （５）発現ベクターが少なくとも１つの選択された遺伝
子又はその一部を含有する昆虫ポックスウィルスゲノム
であり、その選択された遺伝子又はその一部が昆虫ポッ
クスウィルスプロモーター又はそれ自身のプロモーター
の転写調節の下にある、昆虫細胞又は昆虫の幼虫の組織
培養中において、選択された遺伝子又はその一部を発現
することが可能な組み換え昆虫ポックスウィルス発現ベ
クタ。 - （６）昆虫ポックスウィルスプロモーターがスフェロイ
ジンプロモーターである、請求項５記載の組み換え昆虫
ポックスウィルス発現ベクター。 - （７）昆虫ポックスウィルス遺伝子及び選択された遺伝
子又はその一部が上記昆虫ポックスウィルスのプロモー
ター又はそれ自身のプロモーターの転写調節下にあるよ
うな上記昆虫ポックスウィルス遺伝子に結合した少なく
とも１つの選択された遺伝子又はその一部を含有するＤ
ＮＡ配列を有するクローニングベヒクルを含有するもの
である、選択された遺伝子又はその一部を昆虫ポックス
ウィルスゲノム中に導入可能な組み換え転移ベクター。 - （８）昆虫ポックスウィルスプロモーターがスフェロイ
ジンプロモーターである、請求項７記載の組み換え昆虫
ポックスウィルス転移ベクター。 - （９）昆虫ポックスウィルスベクターが昆虫ポックスウ
ィルスプロモーター遺伝子及び選択された遺伝子又はそ
の一部をクローニングするための少なくとも１つの利用
し得る部位を含有し、上記利用し得るクローニング部位
はその選択された遺伝子又はその一部が上記利用し得る
クローニング部位中に挿入されたとき、昆虫ポックスウ
ィルスプロモーターの転写調節下にあるように位置して
いるものである昆虫ポックスウィルスの遺伝子操作のた
めの中間ベヒクルとして利用可能な昆虫ポックスウィル
ス転移ベクター。 - （１０）昆虫ポックスウィルスプロモーターがスフェロ
イジンプロモーターである、請求項９記載の昆虫ポック
スウィルス転移ベクター。 - （１１）下記の工程を含有する昆虫細胞又は昆虫の幼虫
の組織培養中において選択された遺伝子又はその一部を
発現する能力を有する組み換え昆虫ポックスウィルス発
現ベクターの製造方法： ａ）昆虫ポックスウィルス遺伝子又はその一部を含有す
るＤＮＡ断片を製造するために昆虫ポックスウィルスＤ
ＮＡを切断する工程、 ｂ）上記ＤＮＡ断片をクローニングベヒクル中に挿入し
、その後、選択された遺伝子又はその一部が昆虫ポック
スウィルス遺伝子のプロモーター又はそれ自身のプロモ
ーターの転写調節下にあるように改質されたクローニン
グベヒクル中に少なくとも１つの選択された遺伝子又は
その一部を挿入することにより組み換え転移ベクターを
調製する工程。 ｃ）同種の組み換えにより、上記組み換え転移ベクター
を昆虫ポックスウィルスＤＮＡと接触させる工程、及び ｄ）目的とする組み換え昆虫ポックスウィルス発現ベク
ターを単離及び回収する工程。 - （１２）選択された遺伝子又はその一部が昆虫ポックス
ウィルス遺伝子の少なくとも一部の代りにそのクローニ
ングベヒクル中に挿入されている請求項１１記載の方法
。 - （１３）昆虫ポックスウィルス遺伝子がスフェロイジン
プロモーターを含むスフェロイジン遺伝子又はその一部
である請求項１１記載の方法。 - （１４）選択された遺伝子又はその一部がスフェロイジ
ンの合成をコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部の代
りにそのクローニングベヒクル中に挿入されている請求
項１３記載の方法。 - （１５）昆虫ポックスウィルスがコリストネウラ ビエ
ニス（Ｃｈｏｒｉｓｔｎｅｕｒａ ｂｉｅｎｎｉｓ）又
はアムサクタムーレイ（Ａｍｓａｃｔａ ｍｏｏｒｅｉ
）である請求項１１記載の方法。 - （１６）下記の工程を含有する昆虫ポックスウィルスゲ
ノム中に導入された少なくとも１つの選択された遺伝子
又はその一部を有する組み換え転移ベクターの再生（ｒ
ｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）方法： ａ）昆虫ポックスウィルス遺伝子又はその一部を含有す
るＤＮＡ断片を製造するために昆虫ポックスウィルスＤ
ＮＡを切断する工程、 ｂ）昆虫ポックスウィルス遺伝子転移ベクターを製造す
るように、上記ＤＮＡ断片をクローニングベヒクル中に
挿入する工程、及び ｃ）選択された遺伝子又はその一部が上記昆虫ポックス
ウィルスプロモーター又はそれ自身のプロモーターの転
写調節下にあるように、少なくとも１つの選択された遺
伝子又はその一部を上記昆虫ポックスウィルス遺伝子転
移ベクター中に挿入する工程。 - （１７）選択された遺伝子又はその一部が昆虫ポックス
ウィルス遺伝子の少なくとも一部の代りにクローニング
ベヒクル中に挿入されている請求項１６記載の方法。 - （１８）昆虫ポックスウィルス遺伝子がスフェロイジン
プロモーターを包含するスフェロイジン遺伝子又はその
一部である請求項１６記載の方法。 - （１９）選択された遺伝子又はその一部がスフェロイジ
ンの合成をコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部の代
りにそのクローニングベヒクル中に挿入されている請求
項１８記載の方法。 - （２０）杆状体ウィルスがコリストネウラビエニス又は
アムサクタムーレイである請求項１６記載の方法。 - （２１）下記の工程を含有する、昆虫ポックスウィルス
ＤＮＡの遺伝子操作のための中間ベヒクルとして利用さ
れるべき能力を有する昆虫ポックスウィルス転移ベクタ
ーの製造方法： ａ）少なくとも１つのプロモーターを含有するＤＮＡ断
片を製造するために昆虫ポックスウィルスＤＮＡを切断
する工程、 ｂ）選択された遺伝子又はその一部をクローニングする
ために少なくとも１つの利用できる部位を有する改質さ
れたクローニングベヒクルを製造するようにクローニン
グベヒクル中に上記のＤＮＡ断片を挿入する工程であっ
て、上記利用できるクローニング部位が、上記選択され
た遺伝子又はその一部が上記利用できるクローニング部
位中に挿入された時上記プロモーターの転写調節下にあ
るように位置しているものである工程、 - （２２）昆虫ポックスウィルス遺伝子がスフェロイジン
プロモーターを包含するスフェロイジン遺伝子又はその
一部である請求項２１記載の方法。 - （２３）組み換え昆虫ポックスウィルス発現ベクターを
感受性宿主細胞に感染させ、その際、発現ベクターが少
なくとも１つのポリペプチドまたはその一部をコードす
る遺伝子を含有する昆虫ポックスウィルスゲノムであり
、選択された遺伝子又はその一部が昆虫ポックスウィル
スプロモーター又はそれ自身のプロモーターの転写調節
下にあるような状態で、上記宿主細胞を生長させ、そし
て目的とする生成物を回収することを包含する、選択さ
れたポリペプチドを合成する方法。 - （２４）昆虫ポックスウィルスプロモーターがスフェロ
イジンプロモーターである請求項２３記載の方法。 - （２５）昆虫に有害な物質をコードするＤＮＡをそのゲ
ノムの非本質的領域内に含むように遺伝子的に改質され
、農業的に受容し得る担体と混合した形の組み換え昆虫
ポックスウィルスを、害虫におそわれた地域に適用し、
昆虫におそわれた地域において害昆虫の増殖を抑制する
方法。 - （２６）昆虫ポックスウィルスゲノムの非本質的領域内
に、接種された動物内に目的とする免疫学的応答を導入
する抗原をコードするＤＮＡ断片を持つように組み換え
によって合成的に改質された生もしくは弱毒昆虫ポック
スウィルスワクチンを、ヒトもしくは宿主動物に播種す
ることを包含するヒトもしくは宿主動物の免疫方法。 - （２７）ヒトもしくは宿主動物に、免疫原をコードする
遺伝子を昆虫ポックスウィルスプロモーターの転移調節
下にあるような形で含有する組み換え昆虫ポックスウィ
ルス発現ベクターで、予め感染された組織培養細胞もし
くは昆虫幼虫によって製造された精製免疫原を播種する
ことを包含する、ヒトもしくは宿主動物の免疫方法。
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-
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- 1990-05-09 EP EP19900401228 patent/EP0397560A3/en not_active Withdrawn
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