JPH02156896A - 日本脳炎ウイルスの非構成蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組み換えバキュロウィルスを用いて日本脳炎ウ
ィルスの非構成蛋白質を効率よく製造する方法に関する
。

（従来の技術） 日本脳炎に対するワクチンとしては、従来、不活化日本
脳炎ウィルスを有効成分とするワクチンが用いられてお
り、健康なマウス脳内に日本脳炎ウィルス中山予研株を
接種し、発症したマウスから脳を無菌的に採取し、アル
コール・プロタミン法により精製、不活化して不活化日
本脳炎ウィルスワクチン原液を得ている（国立予防衛生
研究所学友会編「日本のワクチン」改訂２版、昭和５２
年１月２０日丸善株式会社発行）。

このようなワクチンの製造法においては、大量の日本脳
炎ウィルスそのものを取り扱うわけで。

ワクチン製造担当者にとっては危険性が極めて高い上、
製造コストも高かった。

ワクチンとしては、ウィルスそのものでなく、ウィルス
の抗原性を有する抗原蛋白質を用いる事も出来、組み換
えＤＮＡ技術によって反核細胞又は、真核細胞で抗原蛋
白質を作らせる事が検討されるようになった。

組み換えＤＮＡ技術によって原核細胞又は、真核細胞で
外来遺伝子を大量に発現させる方法としては−昆虫ウィ
ルスベクターを用いて昆虫細胞で外来遺伝子を発現させ
る方法が提案されている（特開昭６０−３７９８８号、
同６１−５７８７号）。

しかしながら、トガウィルス科フラビウイルス属に属す
る日本脳炎ウィルスは、−本積ＲＮＡをゲノム（ウィル
スの遺伝情報を担う本体）とし、ウィルスの感染細胞内
においてモノジストロニックにゲノムから翻訳された一
本のポリペブタイドがコア蛋白質、マトリックス蛋白質
、表面抗原蛋白質（以下Ｅ蛋白質と称することがある）
、及び５種類の非構成蛋白質へとプロセッシング　（−
本のポリペブタイドが細胞内のプロテアーゼで切所され
て各々の蛋白質ができる事をいう）されるという特徴を
もつため、日本脳炎ウィルス蛋白質をコードするｃ　Ｄ
　Ｎ　Ａをバキュロウィルスに組み込んで発現させるこ
とは操作上困難である。バキュロウィルスに日本脳炎ウ
ィルス蛋白質をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを組み込んで
発現させた例は、本発明者らが、Ｅ蛋白質について成功
した例があるのみであった（第３６回日本ウィルス学会
演説抄録ｐ、３０９１９８８）。

一方、日本脳炎ウィルスと同属のウィルスである黄熱病
ウィルスやデングウィルスにおいては、ウィルス遺伝子
にコードされた蛋白質の投与によるウィルス感染防御に
ついては、非構成蛋白質−１（以下ＮＳＩと称すること
がある）の投与による感染防御の報告（Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｉｍｍｖｎｏｌｏｇｙ　１３５゜２８０５−２
８０９（１９８５）；　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎ
ｅｒａｌ　Ｖｉｒｌｏｇｙ部、　　８５３−８５７（１
９８７））がある。

Ｅ抗原が体液性免疫を誘起するのに対し＋　　ＮＳ１は
感染細胞の表面に認められることから細胞性免疫を誘起
すると考えられる。このことは、ＮＳ１蛋白質を用いる
ことが新しいタイプのワクチンあるいは診所薬としての
可能性を持つ事を示唆している。

しかしながらＮ５ＩＩｔ白質は、日本脳炎ウィルスの構
成蛋白質ではないため日本脳炎ウィルスの感染細胞から
分離・精製する必要があり、ウィルス感染の危険性とと
もに製造コストも高くつくことが予想された。

（発明が解決しようとする課題） そこで本発明者らは、かかる従来技術の下で、日本脳炎
ウィルスの非構成蛋白質を大量に製造する方法の開発を
目指して鋭意検討を進めた結果、日本脳炎ウィルスのゲ
ノムＲＮＡを鋳型とし調製したｃ　Ｄ　Ｎ　Ａより非構
成蛋白質をコードする領域を選択し、バキュロウィルス
のプロモーターに連結し、バキュロウィルスの増殖に非
必須なゲノム領域に組み込めば、感染昆虫細胞において
ワクチンや診断試薬として利用可能な日本脳炎ウィルス
の非構成蛋白質が大量に発現することを見い出し、この
知見に基づいて本発明を完成するに至った。

（課題を解決するための手段） かくして本発明によれば、日本脳炎ウィルスの非構成蛋
白質をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａをバキュロウィルスの
増殖に非必須なゲノム領域に組み込んだ組み換えバキュ
ロウィルスを昆虫細胞に感染させ、該昆虫細胞を培養し
、発現した日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質を回収する
方法が提供される。

本発明において組み換えウィルスの作製に供されるウィ
ルスはバキュロウィルスに分類されるウィルスであれば
いかなるものでもよく、例えばオートグラファ・カルフ
オルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃ
ａ　）、トリコブルシア・二（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉ
ａ　ｎｉ　）、ラキブルシア・オウ（Ｒａｃｈｉｐｌｕ
ｓｉａ　ｏｕ）、ガレリア・メロネラ（Ｇａｌｌｅｒｉ
ａ　ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ　）、あるいはボンビックス
・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）などが例示される。

これらのウィルスの中でもオートグラファ・カリフオル
ニカ（以下、Ａ　ｃ　Ｎ　Ｐ　Ｖと略す）が好適である
。これらのウィルスは従来から広く研究されてきたもの
であり、そのサンプルは米国コネチカット州のエール大
学アーボヴイラスリサーチユニットをはじめ多くの入手
源から得ることができる。

また、日本脳炎ウィルスの表面抗原蛋白質をコードする
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、例えば前記中山予研株やＪａＯＡｒ
株（米国コネチカット州のエール大学アーボヴイラスリ
サーチユニット）、Ｓａｇａｙａｍａ株（同所）を用い
て調整することができる。

例えば上記Ｓａｇａｙａｍａ株から調整されたＮＳ１蛋
白質をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは第４図に示すごとき
全部で１２３６塩基対から構成されているが、本発明に
おいては上記ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａと実質的に同一の機能を有
する範囲において、修飾されたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ（即ち、
塩基配列が置換、挿入、欠失したもの）であってもよい
。もちろん、実質的に同一の機能を有するかぎり、アミ
ノ酸配列が異なる程度に修飾されたものであってもよい
。

組み換えウィルスの作製に当たっては、まずバキュロウ
ィルスの増殖に非必須なりＮＡ領域を組み込んだ第一の
組み換えベクターが作製される。

この場合、前記領域にバキュロウィルス内で機能するプ
ロモーターを存在させることが必要であり、さらにプロ
モーターの下流に適当な制限酵素明晰配列を有する合成
リンカ−を挿入することが好ましい。

ここで言う増殖に非必須なりＮＡ領域とは、例えばバキ
ュロウィルスのポリヘトリン遺伝子（Ｌ。

Ｋ、ミラーら、サイエンス２１９巻１９８３年頁７１５
〜７２１）など、外来性ＤＮＡの挿入による変異を受番
すでも実質上ウィルスの増殖に影響を及ぼさない領域を
言う。

因みにポリヘトリンは、およそ２９，０００ダルトンの
分子量の蛋白質であり、Ａ　ｃ　Ｎ　Ｐ　ＶゲノムのＥ
　ｃ　ｏ　ＲＩ　−Ｉ断片上にその遺伝子が存在するこ
とが示されており（Ｇ、Ｅ、スミスら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ
。

４５巻、１９８３年、頁２１５−２２５）、ポリヘトリ
ン遺伝子のＤＮＡ配列はＧ、Ｅ、スミスらの論文（Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ１３１巻、　　１９８３年、頁５６１−５
６５）に示されている。

また、バキュロウィルス内で機能するプロモーターとは
、合成、天然を問わずバキュロウィルスが保有する転写
の系でプロモーターとして有効に機能しえるものならい
かなる塩基配列のものでも良く、その具体例としては、
例えばバキュロウィルスのポリベトリンをコードする遺
伝子のプロモーター、ＩＯＫポリペプチドをコードする
バキュロウィルス遺伝子のプロモーターなどが例示され
る。

第一の組み換えベクターの作製は常法（例えば特開昭６
０−３７９８８号、同６１＝５７８７号など）に従って
行うことができ、例えば次のようにして行われる。ポリ
ヘトリン遺伝子を有するＤＮＡをバキュロウィルスＡ　
ｃ　Ｎ　Ｐ　Ｖから単離し、精製する。次いでＥｃｏＲ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化すると、ポリヘトリン
遺伝子を含む７．３ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｉ断片及びその他
の適当な断片を生成する。上記ＥｃｏＲＩ　−１断片を
、その後適当なりローニックプラスミドのＥｃｏＲ１部
位にクローン化する。

この系の場合にはポリヘトリン遺伝子のプロモーターが
非必須領域内に存在しており、このプロモーターが第二
の組み換えベクターにおいても有効に機能する。

また発現量を増加させるためには、ポリヘトリン遺伝子
プロモーターとポリヘトリン遺伝子の５′非翻訳領域の
直後にＩＩＩ限酵素切断配列を付加し、ポリヘトリンの
ｍ造遺伝子配列を完全に欠失させ、ポリヘトリンの３′
非翻訳領域が続いているベクターを用いることが好まし
い。このようなベクターは、外来遺伝子の発現量が極め
て高くなる事が示されている（松浦ら　Ｊ、　ｇｅｎ、
　Ｖｉｒｏｌ、　６８巻　１９８７年、　頁１２３３−
１２５０）　。

ところで日本脳炎ウィルスの蛋白質は先に述べたように
モノジストロニックに合成された後、プロセッシングさ
れて表面抗原蛋白質、非構成蛋白質等にわかれる。従フ
て、全ウィルスゲノムに対するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを挿入す
れば人為的に翻訳開始コドン及び翻訳終止コドンを挿入
する必要はない。また挿入するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａが非構成
蛋白質をコードする領域に加え、その上流に翻訳開始コ
ドンになりうる配列（例えばＡＴＧ）を有する場合にも
同様である。

しかし非構成蛋白質をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのみを
赳み込もうとするときはプロモーターの下流に存在する
制限酵素切断点を利用し、翻訳開始コドン、制限酵素切
断配列を有する合成リンカ−を組み込むことが必要であ
る。

挿入するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは非構成蛋白質をコードする領
域を含むものであればその他に他の蛋白質をコードする
領域を含むものであってもよい。フラビウイルス属に属
するウィルスについては非構成蛋白質をコードする領域
の上流にＥ蛋白質、マトリックス蛋白質（以下Ｍ蛋白質
と称する）、プレマトリックス蛋白質（以下ＰｒｅＭ蛋
白質と称する）、コア蛋白質　（以下Ｃ蛋白質と称する
）をコードする領域が存在しているが、本発明において
はこれらの蛋白質をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの全部又
は−部が非構成蛋白質をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの上
流に結合したものを用いてもよい。

用いられるベクターの具体例としては、例えばｐＢＲ３
２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐ
Ｕｃ７、ｐＵｃ８、ｐＵｃ９、ｐＵｃ１９などのごとき
プラスミド、λファージ、Ｍ１３ファージなどのごとき
ファージ、ｐＨＣ７９（ジーン、■、　２９１．１９８
０年）などのごときコスミドが例示される。

本発明においては、次いで、第一の組み換えベクターの
プロモーターの下流に日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質
をコードする領域を挿入して第二の組み換えベクターが
作製される。挿入方法もまた常法（例えば前記各公報参
照）に従えば良く、例えば第一のベクターのプロモータ
ーの下流にある人為的に付与された制限酵素切断点を利
用して日本脳炎ウィルス由来のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を挿
入すれば良い。

これら第−及び第二の組み換えベクターの構築に当たっ
ては遺伝子の操作の容易な大腸菌の系を用いれば良く、
使用するプラスミドベクターも目的に相応しいものであ
る限り特に限定されるものではない。

本発明においては、次に、バキュロウィルスのゲノムＤ
ＮＡと第二の組換えベクターを混合したのち、昆虫培養
細胞に移入し、ベクターＤＮＡとウィルスゲノムＤＮＡ
の間に相同組み換えを起こさせ、組み換えバキュロウィ
ルスを構築する。

ここで用いられる昆虫培養細胞はバキュロウィルスが増
殖可能なものであればよく、その具体例として、例えば
スボドプテラ・フルギペルダ（５ｐｏｄｏｐｔ、ｅｒａ
　ｆｕｒｕ（ｉｐｅｒｄａ　）などが例示される。

組み換えバキュロウィルスの構築に当たっては。

常法に従えば良く、例えば特開昭６０−３７９８８号の
実施例の記述に準じて゛以下のごとき手順に従って実施
できる。即ち第二の組み換えベクターとバキュロウィル
スＤＮＡをトランスフェクションし、得られる組み換え
バキュロウィルスを含むウィルス集団を回収し、それを
り、　　Ｅ。

ボルフマンら（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　１９巻、１９７６
年、頁８２０−８３２）に記載されている標準的Ａ　ｃ
　Ｎ　Ｐ　Ｖポリへドリンプラークアツセイにかけ、発
達したプラーク群のうちから封入体を生成しないプラー
クを組み換えウィルス候補株として選択し、そのプラー
クからウィルスを採取する。これら候補株の内から日本
脳炎ウィルスのＥ蛋白質をコードするＤＮＡｌ１片が組
み込まれたウィルスを選択する方法は、該ＤＮＡをプロ
ーブとするハイブリダイゼーション法を利用してプラー
クを純化するか、あるいは１日本脳炎ウィルスに対する
抗血清又はモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイ
を利用すればよい。

こうして純化した組み換えバキュロウィルスを感染しや
すい昆虫細胞に感染させ、常法に従って適当な生育条件
下で培養させ、適当な培養時間後、該細胞を集めて破砕
し、抽出液を作る。この抽出液から発現蛋白質を適当な
方法で回収する。

培養に使用する昆虫細胞はバキュロウィルスが増殖可能
なものであれば特に制限されないが、とくにスポドプテ
ラ・フルギペルダが好ましい。

また適当な培養条件は予備実験により容易に決定できる
が、具体的には１０％ウシ胎児血清を含む培地で、２８
℃で培養することが望ましい。細胞からの発現蛋白質の
回収は常法の生化学的な精製方法であれば、特に限定さ
れないが、日本脳炎ウィルスに対する抗体を使ったアフ
イニテイクロマトの方法が好ましい。

以上、本発明について説明したが１本発明の一実施態様
の概略を図示すると第一図に示すとおりである。

かくして本発明によれば、バキュロウィルスの増殖に非
必須なゲノム領域に日本脳炎ウィルス由来の非構成蛋白
質をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａがプロモーターの制御下
に組み込まれた組み換えバキュロウィルスが得られ、こ
の組み換えウィルスを昆虫細胞に感染させて、該感染細
胞を培養することにより日本脳炎ウィルスの非構成蛋白
質を得ることができる。この非構成蛋白質はワクチンや
診断試薬として有用である。

（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

爽立勇Ｊ 日本脳炎ウィルス非構成蛋白質をコードするｃ　Ｄ　Ｎ
　Ａの作製 （１）日本脳炎ライフレスからのＲＮＡゲノムの抽出蚊
由来株化細胞Ｃ６／　３６　（Ｊ、Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏ
ｌ。

４０　５３１−５４４（１９７８））に日本脳炎ウィル
スＳａｇａｙａｍａ株を感染させ、ウィルスを増殖させ
た後、培養上清とポリエチレングリコールとを混合し遠
心分離により日本脳炎ウィルスを精製した。ウィルスゲ
ノムＲＮＡ　（約１１ｋｂＰ）は精製ウィルスからフェ
ノール抽出後、エタノールを加えて沈澱させ分離した。

（２）日本脳炎ウィルスのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのクローニン
グ（第２ｙ！Ｉ参照） （１）で調整したウィルスゲノムＲＮＡに、ポリ（Ａ）
ポリメラーゼ（宝酒造）を使って、ポリ（Ａ）を付加し
、それを鋳型とし、オリゴｄＴをプライマーに用いて、
４種（Ａ、　　Ｇ、　　Ｃ，Ｔ）のデオキシリボヌクレ
オシド三リン酸と、逆転写酵素を働かせて、ファースト
ストランドｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを合成した。次に大腸菌ＲＮ
ａｓｅＨと、４種（Ａ、　　Ｇ、　　Ｃ，Ｔ）のデオキ
シリボヌクレオシド三リン酸と大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼを使って二本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを作製しくＭｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、　（１９８２）　　ｐ、２１１
〜２４８）、ターミナルトランスフェラーゼでｄＣ鎖を
付加した。一方、プラスミドｐＵｃ９　（ファルマシア
製）を制限酵素Ｐｓｔ　Ｉで消化後、ターミナルトラン
スフェラーゼでｄＧ蒙を付加し、これと、前記ｃ　Ｄ　
ＮＡを混合し、ライゲーション反応を行ない環状化した
。この組換えプラスミドを大腸菌ＨＢＩＯＩ＝ンピテン
トセルに導入し、形質転換菌を得た。

形質転換菌からプラスミドをとり出し、インサートｃ　
Ｄ　Ｎ　Ａの長ぎをアガロースゲルで比較し、もつとも
長いインサートｃ　Ｄ　Ｎ　Ａについて５′側の゛配列
分析（Ｇｅｎｅ　１９　　Ｐ、２６９（１９８２））を
おこなった。

その配列分析の結果より、２０−ｍａｒの合成オリゴヌ
クレオチド（５’　−ｄＡＴＴＣＣＧＴＡＣＣＡＴＧＣ
ＡＧＴＣＣＡ−３’）　　をプライマーとし、ウィルス
ゲノムＲＮＡを鋳型にして、再度上記の方法でｃ　Ｄ　
Ｎ　Ａを作成し、プラスミドｐＵｃ９にライゲーション
し、多数の形質転換菌を得た。得られた形質転換菌の中
から目的の表面抗原蛋白質をカードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ
を含む組換えプラスミドを含む形質転換菌を以下に述べ
る方法で選択した。

尚、日本脳炎ウィルスのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンの作成
方法については、日本脳炎ウィルスＪａＯＡｒｓ９８２
株を使い、同様な方法で作成した例がＧｅｎｅ　４８ｐ
、１９５−２０１（１９８６））に記載されている。

（３）日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードするｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａ　（４１１８，１１３７）を含む組み換え
プラスミドｐＪＥ４１１８、ＰＪＥ１１３７のスクリー
ング（第２図及び第３図参照） （２）で得られた形質転換菌を寒天プレートで生育させ
、ニトロセルロースフィルターにレプリカする。レプリ
カしたブイルターを０．　２％ＮＰ−４０（界面活性剤
、牛丼化学）でゆるやかに洗浄した後、抗ＪＥ血清でイ
ムノスクリーニングしたところ、弱いながらもポジティ
ブに反応する形質転換菌を１株得て、その株が保有する
プラスミドをｐＪＥ４１１８とした。次いでプラスミド
ｐＪＥ４１１８を常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ　ｐ、７５−９５（前述））に従い調整し、制限
酵素ＰｓｔＩでｐＵｃ９に挿入されたＣＤＮＡを切り出
し、これをＤＮＡプローブとして、（２）で得た各種形
質転換菌をコロニーハイブリダイゼーション法（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇｐ、３８２３８７（前記
））によってスクリーニングし、　ｐＪＥ４１１８のイ
ンサートｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（４１１ｇ）と重なりあうｃ
　Ｄ　ＮＡをもつプラスミドを選び出した。そうやって
選び出した２つのｃＤＮＡ　（２２０，１１３７）　　
をプラスミドより回収し、制限酵素でその位置関係を決
定した（第３図参照）ところ、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（２−
２０）はｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（４１１８）の５′末端と部
分的に重なり合っていることが、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（１
１３７）はｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ（４１１８）の３１末端と部
分的に重なり合っていることが判明した。

（４）非構成蛋白質をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの塩基
配列の解明（第４図参照）。

組み換えたプラスミドｐＪＥ４１１８、　ｐＪＥ２−２
０、ｐＪＥ１１３７を制限酵素、　Ｐｓｔ、Ｉで切断し
、それぞれ約２．５ｋｂｐ、約１．０ｋｂｐ、約０−９
ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これらの断片についてＭ１
３ファージを用いるメッシングらの方法（ジーン、川、
ｐ、２６９（１９８２）　；サイエンス２４１　Ｐ、１
２０５（１９８１））　　により配列分析を行った。

その結果、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（２−２０）　　とｃ　Ｄ
　Ｎ　Ａ（４１１８）が重なり合う部分のｃ　Ｄ　Ｎ　
Ａ配列は第４図中の第一４９６番アミノ酸の第３コドン
から第一３８５番アミノ酸までの３３４塩基であること
が判明した。

またｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（４１１８）とｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　
（１１３７）が重なり合う部分のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列は
、第４図中の第１２１番アミノ酸の第３コドンから第３
３２番アミノ酸の第２コドンまでの６３３塩基であるこ
とが判明した。

この塩基配列から推定されるアミノ酸配列と、すでに公
知（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９７２９−７３３（１９８５
））である黄熱病ウィルス（日本脳炎ウィルスと同居近
縁）の非構成蛋白質のアミノ酸配列の比較から、日本脳
炎ウィルスのＮＳＩ蛋白質は第４図中に示す＋１番目か
ら第４１２番目のアミノ酸までであると判断された。

同様に、日本脳炎ウィルスのＥ蛋白質は第４図に示す第
一５００番目から第一１番目のアミノ酸まで、またＭ蛋
白質は第４図に示す第一５７５番目から第一５０１番目
のアミノ酸まで、またＰｒｅＭ蛋白質は第一６６７番目
から第一５７６番目までと判断された。さらに、Ｐｒｅ
Ｍ蛋白質の５′側は日本脳炎ウィルスのＣ蛋白質の一部
をコードしていると判断された。

（５）日本脳炎ウィルスＮＳＩ蛋白質をコードするｃ　
Ｄ　Ｎ　Ａの作製（第３図及び第４図参照）。

ｃ　Ｄ　ＮＡ　（４１１８）はＥ蛋白質のＮ末端の５ア
ミノ酸が欠けている。そこでｃＤＮＡ　（２−２０）　
　を用いて、　Ａａｔｌｌサイトの位置でつな゛ぎ合わ
せて。

Ｅ蛋白質を完全にカバーするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（２０３
）　　を作製した。またｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（４１１８）
はＮＳＩ蛋白質のＣ末端の８０アミノ酸が欠けている。

そこでｃＤＮＡ　（１１３７）を用いて＾ＣＣ■ＣＣ上
の位置でつなぎ合わせてＮＳＩ蛋白質を完全にカバーす
るｃＤＮＡ　（２０３７）を作製した。

次いでｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（２０３７）をＳａｃ　Ｉで処
理した３′末端側約１．９ｋｂｐのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片
はＮＳＩ蛋白質をコードする領域に加えてＥ蛋白質及び
Ｎ　Ｓ　２　Ｃ蛋白質をコードする領域を含んでいる。

炎庭舅ユ バキュロウィルスの増殖に非必須なりＮＡ領域を組み込
んだ第一の組み換えベクターｐＡｃＹＭｓ２の作製（第
５〜７図参照） （１）ポリヘトリン遺伝子の３′末端を欠失させたプラ
スミドｐＡｃＲＰ６１の作製（第５図参照）第一の組み
換えベクターを構成するために、まずＡｃＮＰＶ（野生
株）のポリヘトリン遺伝子を含むＤＮＡ断片をプラスミ
ドｐＵｃ８のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。ＡｃＮ
ＰＶのＤＮＡはＧ、　　Ｅ。

スミス及びＭ−Ｄ、　　サマーズ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　
　８９巻１９７８年　頁５１７−５２７）により説明さ
れているように、ウィルスから抽出し、塩化セシウム密
度勾配における平衡遠心分離により精製した。次ぎにこ
のＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩにより完全消化した。

７．３ｋｂｐのＥｅｏＲＩ　−Ｉ断片をアガロースゲル
により回収後、ｐＵｃ８のＥｃｏＲＩ部位にクローン化
してｐＡｃＥｃｏＲＩ　−Ｉを作製した。この組換えプ
ラスミドｐＡｃＥｃｏＲＩ　−１は３個のＢａｍＨ認識
部位を有する（第５図参照）。１つは、ポリヘトリン遺
伝子中に、１つはＥｃｏＲＩ　−Ｉ断片中にポリヘトリ
ン遺伝子のはるか下流に、及び１つはｐＵｃ８のポリリ
ンカー中におけるものである。

後者２つのＢａｍＨＩ認識部位は、Ｇ、　　Ｅ、　　ス
ミスら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａ
ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　３巻１９８３年２１５６１−２
１６５）が記載している方法に準じてｐＡ’ｃＥｃｏＲ
Ｉ　−Ｉから除去せしめ、ｐＡｃｌｏｌを作成した。

次にｐＡｃｌｏｌをポリヘトリン遺伝子中にあるＫｐｎ
　Ｉ部位で切断し、０．５単位のＢａ１３１エキソヌク
レアーゼで末端から欠失させていき、その後Ｅ。

ｃｏｌｉ　　ＤＮＡポリメラーゼ（［ｌｅｎｏｗ所片）
を用いて末端を修復した。プラスミドＤＮＡを精製し、
ホスホリル化ＢａｍＨＩリンカ−（ｓ’−ｐｃ　Ｇ　Ｇ
　Ａ　Ｔ　ＣＣＧ−３’　）　　０．５μ８を１００縛
反応混合物中に１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼと共に添
加した。室温で乏間接インキュベーション後、ＤＮＡを
精製した。

次いで、ＤＮＡペレットを１００ｄの反応液中で再びＢ
ａｍＨＩで消化させた。消化ＤＮＡを０．７％アガロー
スゲル電気泳動後回覗し、精製した。ＤＮＡをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いてライゲーション後、大腸菌ＪＭＩＯ
９細胞を形質転換（アンピシリン耐性）させた。数個の
形質転換株からプラスミドを調製し、各々からＥｃｏＲ
ＶとＨｉｎｆ　Ｉで切り出される断片をメッシングらの
方法（ジーン　１９巻　１９８２　ｐ、２６９）により
配列分析を行った。この中の一つが１１５図に示すよう
にポリヘトリン遺伝子の翻訳停止コドンの下流１３番目
の塩基まで欠失しているものである事が判明し、これを
ｐＡｃＲＰ６１と命名した（第５図）。

（２）ポリヘトリン遺伝子を欠失させたプラスミドｐＡ
ｃＥ１の作製（第６図参照） ｐＡｃＥｃｏＲＩ　−ＩをＢａｍＨＩで切断し、　０．
５単位のＢａ１３１エキソヌクレアーゼで末端から欠失
させ、その後Ｅ、　ｃｏｌｉ　　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラー
ゼ（Ｋｌｅｎｏｗ所片）を用いて末端を修復した。

プラスミドＤＮＡを精製し、前述のホスホリル化Ｂａｎ
）ＩＩリンカ−をＴ４ＤＮＡリガーゼと共に反応液に添
加した。室温で２時間インキュベーション後、ＤＮＡを
精製した。次いでＤＮＡペレットを１００縛の反応液中
で再びＢａｍＨＩで消化させた。

消化ＤＮＡを０．７％アガロースゲル電気泳動後回収し
、精製した。

ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーシゴン後
、大腸菌ＪＭ１０９細胞を形質転換させた。

数個−の転換株からプラスミドを調製し、各々からＥｃ
ｏＲＶとＢａｍＨＩで切り出さ九る断片を配列分析した
。多数のプラスミドのなかからポリヘトリン遺伝子の翻
訳開始コドン（ＡＴＧ）のＴまでが欠失している断片を
含むプラスミドを選択し、これをｐＡｃＥｌと命名した
（第６図参照）。

（３）第一の組み換えベクターρＡｃＹＭＳ１の作製（
第７図参照） 先のｐＡｃＲＰ６１をＸｈｏ　ＩとＢａｍＨＩで切断し
、第７図において矢印で示した長い方の断片を０．７％
アガロースゲル電気泳動後回収した。一方、　ｐＡｃＥ
ｌをＸｈｏ　ＩとＢａｍＨＩで切断し、第７図において
矢印で示した短い方の断片を０．７％アガロースゲル電
気泳動後回収した。それら２つの断片をＴ４ＤＮＡライ
スゲースによって接続して得たプラスミドをｐＡｃＹＭ
ｌと命名した。次にｐＡｃＹＭｌをＢａｍＨＩで切断し
、そこにＢａｍＨＩ−翻訳開始コトン−５ｍａＩ　−Ｂ
ａｍＨＩの合成リンカ−（５’−ＰＧＡＴＣＣＡＴＧＣ
ＣＣＧＧＧＣＡＴＧ−３’　）を挿入して作成したプラ
スミドをｐＡｃＹ阿Ｓ２と命名した（１！７図参照）。

こうして作成したｐＡｃＹ阿Ｓ２はＥｃｏＲＩ　−Ｉ断
片中にポリへドリンプロモーター、ポリヘトリン遺伝子
の５′非翻訳領域、ＢａｍＨＩ−翻訳コトン−３ｍａＩ
　−ＢａｍＨＩ認識部位、ポリヘトリン遺伝子の３′非
翻訳領域が続いていることになる。

莢厳舅洛 日本脳炎ウィルスのＮ５１ｆｆｉ白質をコードするｃ　
Ｄ　Ｎ　Ａを挿入した第二の組み換えベクターの作製（
第８図参照）６ 実施例１の（５）で得たｃＤＮＡ　（ＪＮＳ　１）をＥ
、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ断片
）で末端を修復後、制限酵素Ｓｍａ　Ｉで切断したｐＡ
ｃＹＭｓ２とＴ４ＤＮＡリガーゼを使って接続後ＪＭ１
０９を形質転換する。数個の形質転換株より、プラスミ
ドを精製し、　ｐＡｃＹＭｓ２のＳｍａ　Ｉ部位に、前
記ｃＤＮＡ　（ＪＮＳｌ）が正方向（ポリへドリンプロ
モーターの転写方向と同方向にｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの翻訳方
向が向いている場合を正方向という）に挿入されている
プラスミドを適当な制限酵素を用いた明晰パターンの結
果より選択する。こうして得た第２の組み換えベクター
をｐＡｃＹＭＪＮｓｌと命名した。

実１１汁Ａ。

組み換えバキュロウィルスの作出 Ｆ、　　Ｌ、　　グラハムらの論文（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
　　５２巻１９７３年　４５６−４６７頁）に記載され
ている方法に準じ、Ａ　ｃ　Ｎ　Ｐ　ＶのゲノムＤＮＡ
１ｕｇを１〜１０ａ３のｐＡｃＹＭＪｌと混合し、１５
ｐｇ／−の仔牛胸腺ＤＮＡを含む、１−ＨＥＰＥＳ　（
Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタ
ンスルホンＷ１）緩衝液（ｐＦ１７．０）で９５ＯＡに
した。混合物をスター子で攪拌しなから５０艷の２．５
Ｍ　Ｃａα２を滴下し、沈澱を室温で３０分間形成させ
た。１艷の沈澱したＤＮＡを昆虫細胞Ｓ、フルギペルダ
に６０＋ｄ培養プレート内の２艷の培地内において添加
した。４時間後、細胞単相を培地で洗浄し、１０％ウシ
胎児血清を含む２−の培地を加えて、３日間インキュベ
ートした。その後、培地を滅菌ピペットで集めるが、こ
の培地中には組み換え及び非組み換えＡ　ｃ　Ｎ　Ｐ　
Ｖが混じっている。これら混合集団より、組み換えＡ　
ｃ　Ｎ　Ｐ　Ｖを単離するため、集めた培地を適当に希
釈し、単層培養したＳ、フルギペルダに感染させ、プラ
ークを形成せしめた。ウィルス封入体を形成しないプラ
ークを選び、そのプラークからウィルスを回収しこれを
ＰＢＳに懸濁し、一部はドツトハイブリダイゼーション
をするため、ナイロン又はニトロセルロースメンブレン
にスポットし、一部は、再びＳ、フルギペルダに感染さ
せ、ウィルスを増やした。

スポットしたメンブレンは０．５Ｎ　　ＮａＯＨで１０
分間、ＬＭ）リス塩酸緩衝液で５分の処理を３回繰り返
した後、１．５Ｍ　Ｎａα０．５Ｍ）リス塩酸緩衝液で
５分処理した。２倍ＳＳＣ（１倍ＳＳＣは、０．１５Ｍ
　Ｎａ１ＪＬ０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）で飽和
させ、８０’Ｃ。

２時間焼き付けた。４倍ＳＥＴ　（１倍ＳＥＴは。

０．６Ｍ　　Ｎａ０Ｌ　　Ｏ，０８Ｍ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ
　−ＣＪＬ　　４ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ（ｐＨ７，８）　）
　−１０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ、　−０，１％ＳＤＳで６
８℃、２時間処理した。４倍５ＥＴ−１０倍Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ−０，１％５ＤＳ−０，１％Ｎａａ　Ｐ２Ｏ７−
５０ｐｇ／−変形サケ精子ＤＮＡとニックトランスレー
ションによって３２ｐで標識した日本脳炎ウィルスのＮ
ＳＩ蛋白質のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを入れて６８℃、１４時間
ハイブリダイゼーションした。洗浄後、メンブレンとＸ
線フィルムを重ね、オートラジオグラフィーを行い、フ
ィルムが黒化するスポットを選択した。黒化したスポッ
トに対応するウィルス液を、再度、適当に希釈してＳ、
フルギペルダに感染させ、プラークを出現させた。出現
するプラークについて上記と同様な操作を行い、出現す
るプラークが全て、ドツトハイブリダイゼーションで黒
化するまで純化の操作をくり返した。こうして得られた
ウィルスは目的の組み換えバキュロウィルスであり、Ａ
　ｃ　Ｊ　Ｎ　Ｓ　１と命名した。

火遊ｄ１旦 組み換えバキュロウィルスによる日本脳炎ウィルスの非
構成蛋白質の製造 Ｓ、フルギペルダの細胞を単層において５ｘｉｏａ細胞
／−の密度まで生育させ、生育培地を除去し、細胞当り
５　ｐ、ｆ、ｕ、のＡ　ｃ　Ｊ　Ｎ　Ｓ　１を含む培地
を加えて２３℃で感染させた。感染後２日間細胞を培養
し、感染細胞内において日本脳炎ウィルスのＮＳ１蛋白
質を発現させた。発現蛋白質の確認は日本脳炎ウィルス
に対する抗血清を用いたウェスタンプロット法（バーネ
ット、Ｗ、　Ｎ、　Ａｎａｌｙｔ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１１２巻（１９８１）　１９５−
２０３　）で行った。

その結果Ａ　ｃ　Ｊ　Ｎ　Ｓ　１の感染細胞は、分子量
約４８０００ダルトンの蛋白質を産生じていることが判
明した。　４８０００ダルトンという分子量は、日本脳
炎ウィルスのＮＳＩ蛋白質のアミノ酸配列（第４図）か
ら推定される分子量と同一である。

Ａ　ｃ　Ｊ　Ｎ　Ｓ　１に挿入されているｃ　Ｄ　Ｎ　
Ａ（ＪＮＳＩ）はＮＳＩ以外にＥ蛋白質及びＮ　Ｓ　２
　ａの一部を含んでいたにも拘らず４８０００ダダルト
ンの蛋白質が発現しているということは、感染細胞で発
現した蛋白質が日本脳炎ウィルス本来のＮＳ１蛋白質と
同様なプロセスを受けて、４８０００ダルトンのＮＳ１
蛋白質になったと容易に推察される。このＡ　ｃ　Ｊ　
Ｎ　Ｓ　１の感染細胞で発現させたＮ５１１ｆ白質は、
日本脳炎ウィルスに対する抗血清と反応するので、抗原
性を有していることは明かであり、従ってワクチン、診
断試薬となり得るものである。感染細胞におけるＮＳＩ
蛋白質の生産量は、わずか１００感染細胞からの抽出液
であってもウェスタンプロット法で検出できることから
相当なレベルのＮＳＩ蛋白質が作られていることが判る
。尚、Ａ　ｃ　Ｊ　Ｎ　Ｓ　１のかわりに野生型バキュ
ロウィルスを同様にＳ、フルギペルダの細胞に感染させ
て、細胞内の蛋白質を調べたが、抗血清と反応する蛋白
質は認められなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の操作手順、第２図は日本脳炎ウィルス
のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのクローニング手順、第３図はｃ　Ｄ
　Ｎ　Ａの制限酵素サイトの位置関係、第４図はＮＳＩ
蛋白質をコードする領域を含むｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの塩基配
列及びアミノ酸配列、第５図〜第７図は第一の組み換え
ベクターｐＡｃＹにＳ２の構築手順、第８図はＮＳＩ蛋
白質をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含む第二の組み換え
ベクターｐＡｃＹＭＪＮｓ１の構築手順をそれぞれ示す
。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）バキユロウィルスの増殖に非必須なゲノム領域に
   、日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードするｃＤＮ
   Ａの全部又は一部を組み込んだ組み換えバキユロウィル
   スを昆虫細胞に感染させ、該昆虫細胞を培養し、発現し
   た日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質を回収することを特
   徴とする日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質の製造法。
2. （２）非構成蛋白質をコードするｃＤＮＡの全部又は一
   部が日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質−１である請求項
   （１）記載の製造法。
3. （３）非構成蛋白質−１をコードするｃＤＮＡの全部又
   は一部が日本脳炎ウィルスの表面抗原蛋白質及び非構成
   蛋白質−２をコードするｃＤＮＡの全部又は一部ととも
   に組み込まれている請求項（２）記載の製造法。
4. （４）日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードするｃ
   ＤＮＡが第４図にＮＳ１として示すアミノ酸配列又はそ
   れと実質的に同一機能を有するポリペプチドをコードす
   るものである請求項（１）〜（２）記載の製造法。