JPH02156896A - 日本脳炎ウイルスの非構成蛋白質の製造法 - Google Patents

日本脳炎ウイルスの非構成蛋白質の製造法

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JPH02156896A
JPH02156896A JP63311656A JP31165688A JPH02156896A JP H02156896 A JPH02156896 A JP H02156896A JP 63311656 A JP63311656 A JP 63311656A JP 31165688 A JP31165688 A JP 31165688A JP H02156896 A JPH02156896 A JP H02156896A
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JP
Japan
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japanese encephalitis
protein
encephalitis virus
virus
cdna
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Kotaro Yasui
保井 孝太郎
Michiko Miyamoto
道子 宮本
Takanori Sato
隆則 佐藤
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Zeon Corp
Tokyo Metropolitan Government
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TOKYO MET GOV SHINKEI KAGAKU SOGO KENKYUSHO
Tokyo Metropolitan Government
Nippon Zeon Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は組み換えバキュロウィルスを用いて日本脳炎ウ
ィルスの非構成蛋白質を効率よく製造する方法に関する
(従来の技術) 日本脳炎に対するワクチンとしては、従来、不活化日本
脳炎ウィルスを有効成分とするワクチンが用いられてお
り、健康なマウス脳内に日本脳炎ウィルス中山予研株を
接種し、発症したマウスから脳を無菌的に採取し、アル
コール・プロタミン法により精製、不活化して不活化日
本脳炎ウィルスワクチン原液を得ている(国立予防衛生
研究所学友会編「日本のワクチン」改訂2版、昭和52
年1月20日丸善株式会社発行)。
このようなワクチンの製造法においては、大量の日本脳
炎ウィルスそのものを取り扱うわけで。
ワクチン製造担当者にとっては危険性が極めて高い上、
製造コストも高かった。
ワクチンとしては、ウィルスそのものでなく、ウィルス
の抗原性を有する抗原蛋白質を用いる事も出来、組み換
えDNA技術によって反核細胞又は、真核細胞で抗原蛋
白質を作らせる事が検討されるようになった。
組み換えDNA技術によって原核細胞又は、真核細胞で
外来遺伝子を大量に発現させる方法としては−昆虫ウィ
ルスベクターを用いて昆虫細胞で外来遺伝子を発現させ
る方法が提案されている(特開昭60−37988号、
同61−5787号)。
しかしながら、トガウィルス科フラビウイルス属に属す
る日本脳炎ウィルスは、−本積RNAをゲノム(ウィル
スの遺伝情報を担う本体)とし、ウィルスの感染細胞内
においてモノジストロニックにゲノムから翻訳された一
本のポリペブタイドがコア蛋白質、マトリックス蛋白質
、表面抗原蛋白質(以下E蛋白質と称することがある)
、及び5種類の非構成蛋白質へとプロセッシング (−
本のポリペブタイドが細胞内のプロテアーゼで切所され
て各々の蛋白質ができる事をいう)されるという特徴を
もつため、日本脳炎ウィルス蛋白質をコードするc D
 N Aをバキュロウィルスに組み込んで発現させるこ
とは操作上困難である。バキュロウィルスに日本脳炎ウ
ィルス蛋白質をコードするc D N Aを組み込んで
発現させた例は、本発明者らが、E蛋白質について成功
した例があるのみであった(第36回日本ウィルス学会
演説抄録p、3091988)。
一方、日本脳炎ウィルスと同属のウィルスである黄熱病
ウィルスやデングウィルスにおいては、ウィルス遺伝子
にコードされた蛋白質の投与によるウィルス感染防御に
ついては、非構成蛋白質−1(以下NSIと称すること
がある)の投与による感染防御の報告(Journal
 of Immvnology 135゜2805−2
809(1985); Journal of Gen
eral Virlogy部、  853−857(1
987))がある。
E抗原が体液性免疫を誘起するのに対し+  NS1は
感染細胞の表面に認められることから細胞性免疫を誘起
すると考えられる。このことは、NS1蛋白質を用いる
ことが新しいタイプのワクチンあるいは診所薬としての
可能性を持つ事を示唆している。
しかしながらN5IIt白質は、日本脳炎ウィルスの構
成蛋白質ではないため日本脳炎ウィルスの感染細胞から
分離・精製する必要があり、ウィルス感染の危険性とと
もに製造コストも高くつくことが予想された。
(発明が解決しようとする課題) そこで本発明者らは、かかる従来技術の下で、日本脳炎
ウィルスの非構成蛋白質を大量に製造する方法の開発を
目指して鋭意検討を進めた結果、日本脳炎ウィルスのゲ
ノムRNAを鋳型とし調製したc D N Aより非構
成蛋白質をコードする領域を選択し、バキュロウィルス
のプロモーターに連結し、バキュロウィルスの増殖に非
必須なゲノム領域に組み込めば、感染昆虫細胞において
ワクチンや診断試薬として利用可能な日本脳炎ウィルス
の非構成蛋白質が大量に発現することを見い出し、この
知見に基づいて本発明を完成するに至った。
(課題を解決するための手段) かくして本発明によれば、日本脳炎ウィルスの非構成蛋
白質をコードするc D N Aをバキュロウィルスの
増殖に非必須なゲノム領域に組み込んだ組み換えバキュ
ロウィルスを昆虫細胞に感染させ、該昆虫細胞を培養し
、発現した日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質を回収する
方法が提供される。
本発明において組み換えウィルスの作製に供されるウィ
ルスはバキュロウィルスに分類されるウィルスであれば
いかなるものでもよく、例えばオートグラファ・カルフ
オルニカ(Autographacalifornic
a )、トリコブルシア・二(Trichoplusi
a ni )、ラキブルシア・オウ(Rachiplu
sia ou)、ガレリア・メロネラ(Galleri
a mellonella )、あるいはボンビックス
・モリ(Bombyx mori)などが例示される。
これらのウィルスの中でもオートグラファ・カリフオル
ニカ(以下、A c N P Vと略す)が好適である
。これらのウィルスは従来から広く研究されてきたもの
であり、そのサンプルは米国コネチカット州のエール大
学アーボヴイラスリサーチユニットをはじめ多くの入手
源から得ることができる。
また、日本脳炎ウィルスの表面抗原蛋白質をコードする
c D N Aは、例えば前記中山予研株やJaOAr
株(米国コネチカット州のエール大学アーボヴイラスリ
サーチユニット)、Sagayama株(同所)を用い
て調整することができる。
例えば上記Sagayama株から調整されたNS1蛋
白質をコードするc D N Aは第4図に示すごとき
全部で1236塩基対から構成されているが、本発明に
おいては上記c D N Aと実質的に同一の機能を有
する範囲において、修飾されたc D N A(即ち、
塩基配列が置換、挿入、欠失したもの)であってもよい
。もちろん、実質的に同一の機能を有するかぎり、アミ
ノ酸配列が異なる程度に修飾されたものであってもよい
組み換えウィルスの作製に当たっては、まずバキュロウ
ィルスの増殖に非必須なりNA領域を組み込んだ第一の
組み換えベクターが作製される。
この場合、前記領域にバキュロウィルス内で機能するプ
ロモーターを存在させることが必要であり、さらにプロ
モーターの下流に適当な制限酵素明晰配列を有する合成
リンカ−を挿入することが好ましい。
ここで言う増殖に非必須なりNA領域とは、例えばバキ
ュロウィルスのポリヘトリン遺伝子(L。
K、ミラーら、サイエンス219巻1983年頁715
〜721)など、外来性DNAの挿入による変異を受番
すでも実質上ウィルスの増殖に影響を及ぼさない領域を
言う。
因みにポリヘトリンは、およそ29,000ダルトンの
分子量の蛋白質であり、A c N P VゲノムのE
 c o RI −I断片上にその遺伝子が存在するこ
とが示されており(G、E、スミスら、J、Virol
45巻、1983年、頁215−225)、ポリヘトリ
ン遺伝子のDNA配列はG、E、スミスらの論文(Vi
rology131巻、  1983年、頁561−5
65)に示されている。
また、バキュロウィルス内で機能するプロモーターとは
、合成、天然を問わずバキュロウィルスが保有する転写
の系でプロモーターとして有効に機能しえるものならい
かなる塩基配列のものでも良く、その具体例としては、
例えばバキュロウィルスのポリベトリンをコードする遺
伝子のプロモーター、IOKポリペプチドをコードする
バキュロウィルス遺伝子のプロモーターなどが例示され
る。
第一の組み換えベクターの作製は常法(例えば特開昭6
0−37988号、同61=5787号など)に従って
行うことができ、例えば次のようにして行われる。ポリ
ヘトリン遺伝子を有するDNAをバキュロウィルスA 
c N P Vから単離し、精製する。次いでEcoR
I制限エンドヌクレアーゼで消化すると、ポリヘトリン
遺伝子を含む7.3kbEcoRI−I断片及びその他
の適当な断片を生成する。上記EcoRI −1断片を
、その後適当なりローニックプラスミドのEcoR1部
位にクローン化する。
この系の場合にはポリヘトリン遺伝子のプロモーターが
非必須領域内に存在しており、このプロモーターが第二
の組み換えベクターにおいても有効に機能する。
また発現量を増加させるためには、ポリヘトリン遺伝子
プロモーターとポリヘトリン遺伝子の5′非翻訳領域の
直後にIII限酵素切断配列を付加し、ポリヘトリンの
m造遺伝子配列を完全に欠失させ、ポリヘトリンの3′
非翻訳領域が続いているベクターを用いることが好まし
い。このようなベクターは、外来遺伝子の発現量が極め
て高くなる事が示されている(松浦ら J、 gen、
 Virol、 68巻 1987年、 頁1233−
1250) 。
ところで日本脳炎ウィルスの蛋白質は先に述べたように
モノジストロニックに合成された後、プロセッシングさ
れて表面抗原蛋白質、非構成蛋白質等にわかれる。従フ
て、全ウィルスゲノムに対するc D N Aを挿入す
れば人為的に翻訳開始コドン及び翻訳終止コドンを挿入
する必要はない。また挿入するc D N Aが非構成
蛋白質をコードする領域に加え、その上流に翻訳開始コ
ドンになりうる配列(例えばATG)を有する場合にも
同様である。
しかし非構成蛋白質をコードするc D N Aのみを
赳み込もうとするときはプロモーターの下流に存在する
制限酵素切断点を利用し、翻訳開始コドン、制限酵素切
断配列を有する合成リンカ−を組み込むことが必要であ
る。
挿入するc D N Aは非構成蛋白質をコードする領
域を含むものであればその他に他の蛋白質をコードする
領域を含むものであってもよい。フラビウイルス属に属
するウィルスについては非構成蛋白質をコードする領域
の上流にE蛋白質、マトリックス蛋白質(以下M蛋白質
と称する)、プレマトリックス蛋白質(以下PreM蛋
白質と称する)、コア蛋白質 (以下C蛋白質と称する
)をコードする領域が存在しているが、本発明において
はこれらの蛋白質をコードするc D N Aの全部又
は−部が非構成蛋白質をコードするc D N Aの上
流に結合したものを用いてもよい。
用いられるベクターの具体例としては、例えばpBR3
22、pBR325、pBR327、pBR328、p
Uc7、pUc8、pUc9、pUc19などのごとき
プラスミド、λファージ、M13ファージなどのごとき
ファージ、pHC79(ジーン、■、 291.198
0年)などのごときコスミドが例示される。
本発明においては、次いで、第一の組み換えベクターの
プロモーターの下流に日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質
をコードする領域を挿入して第二の組み換えベクターが
作製される。挿入方法もまた常法(例えば前記各公報参
照)に従えば良く、例えば第一のベクターのプロモータ
ーの下流にある人為的に付与された制限酵素切断点を利
用して日本脳炎ウィルス由来のc D N A断片を挿
入すれば良い。
これら第−及び第二の組み換えベクターの構築に当たっ
ては遺伝子の操作の容易な大腸菌の系を用いれば良く、
使用するプラスミドベクターも目的に相応しいものであ
る限り特に限定されるものではない。
本発明においては、次に、バキュロウィルスのゲノムD
NAと第二の組換えベクターを混合したのち、昆虫培養
細胞に移入し、ベクターDNAとウィルスゲノムDNA
の間に相同組み換えを起こさせ、組み換えバキュロウィ
ルスを構築する。
ここで用いられる昆虫培養細胞はバキュロウィルスが増
殖可能なものであればよく、その具体例として、例えば
スボドプテラ・フルギペルダ(5podopt、era
 furu(iperda )などが例示される。
組み換えバキュロウィルスの構築に当たっては。
常法に従えば良く、例えば特開昭60−37988号の
実施例の記述に準じて゛以下のごとき手順に従って実施
できる。即ち第二の組み換えベクターとバキュロウィル
スDNAをトランスフェクションし、得られる組み換え
バキュロウィルスを含むウィルス集団を回収し、それを
り、  E。
ボルフマンら(J、 Virol、 19巻、1976
年、頁820−832)に記載されている標準的A c
 N P Vポリへドリンプラークアツセイにかけ、発
達したプラーク群のうちから封入体を生成しないプラー
クを組み換えウィルス候補株として選択し、そのプラー
クからウィルスを採取する。これら候補株の内から日本
脳炎ウィルスのE蛋白質をコードするDNAl1片が組
み込まれたウィルスを選択する方法は、該DNAをプロ
ーブとするハイブリダイゼーション法を利用してプラー
クを純化するか、あるいは1日本脳炎ウィルスに対する
抗血清又はモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイ
を利用すればよい。
こうして純化した組み換えバキュロウィルスを感染しや
すい昆虫細胞に感染させ、常法に従って適当な生育条件
下で培養させ、適当な培養時間後、該細胞を集めて破砕
し、抽出液を作る。この抽出液から発現蛋白質を適当な
方法で回収する。
培養に使用する昆虫細胞はバキュロウィルスが増殖可能
なものであれば特に制限されないが、とくにスポドプテ
ラ・フルギペルダが好ましい。
また適当な培養条件は予備実験により容易に決定できる
が、具体的には10%ウシ胎児血清を含む培地で、28
℃で培養することが望ましい。細胞からの発現蛋白質の
回収は常法の生化学的な精製方法であれば、特に限定さ
れないが、日本脳炎ウィルスに対する抗体を使ったアフ
イニテイクロマトの方法が好ましい。
以上、本発明について説明したが1本発明の一実施態様
の概略を図示すると第一図に示すとおりである。
かくして本発明によれば、バキュロウィルスの増殖に非
必須なゲノム領域に日本脳炎ウィルス由来の非構成蛋白
質をコードするc D N Aがプロモーターの制御下
に組み込まれた組み換えバキュロウィルスが得られ、こ
の組み換えウィルスを昆虫細胞に感染させて、該感染細
胞を培養することにより日本脳炎ウィルスの非構成蛋白
質を得ることができる。この非構成蛋白質はワクチンや
診断試薬として有用である。
(実施例) 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
爽立勇J 日本脳炎ウィルス非構成蛋白質をコードするc D N
 Aの作製 (1)日本脳炎ライフレスからのRNAゲノムの抽出蚊
由来株化細胞C6/ 36 (J、Gen、 Viro
l。
40 531−544(1978))に日本脳炎ウィル
スSagayama株を感染させ、ウィルスを増殖させ
た後、培養上清とポリエチレングリコールとを混合し遠
心分離により日本脳炎ウィルスを精製した。ウィルスゲ
ノムRNA (約11kbP)は精製ウィルスからフェ
ノール抽出後、エタノールを加えて沈澱させ分離した。
(2)日本脳炎ウィルスのc D N Aのクローニン
グ(第2y!I参照) (1)で調整したウィルスゲノムRNAに、ポリ(A)
ポリメラーゼ(宝酒造)を使って、ポリ(A)を付加し
、それを鋳型とし、オリゴdTをプライマーに用いて、
4種(A、  G、  C,T)のデオキシリボヌクレ
オシド三リン酸と、逆転写酵素を働かせて、ファースト
ストランドc D N Aを合成した。次に大腸菌RN
aseHと、4種(A、  G、  C,T)のデオキ
シリボヌクレオシド三リン酸と大腸菌DNAポリメラー
ゼを使って二本鎖c D N Aを作製しくMo1ec
ular Cloning、Co1d Spring 
Harbor Lab、 (1982)  p、211
〜248)、ターミナルトランスフェラーゼでdC鎖を
付加した。一方、プラスミドpUc9 (ファルマシア
製)を制限酵素Pst Iで消化後、ターミナルトラン
スフェラーゼでdG蒙を付加し、これと、前記c D 
NAを混合し、ライゲーション反応を行ない環状化した
。この組換えプラスミドを大腸菌HBIOI=ンピテン
トセルに導入し、形質転換菌を得た。
形質転換菌からプラスミドをとり出し、インサートc 
D N Aの長ぎをアガロースゲルで比較し、もつとも
長いインサートc D N Aについて5′側の゛配列
分析(Gene 19  P、269(1982))を
おこなった。
その配列分析の結果より、20−marの合成オリゴヌ
クレオチド(5’ −dATTCCGTACCATGC
AGTCCA−3’)  をプライマーとし、ウィルス
ゲノムRNAを鋳型にして、再度上記の方法でc D 
N Aを作成し、プラスミドpUc9にライゲーション
し、多数の形質転換菌を得た。得られた形質転換菌の中
から目的の表面抗原蛋白質をカードするc D N A
を含む組換えプラスミドを含む形質転換菌を以下に述べ
る方法で選択した。
尚、日本脳炎ウィルスのc D N Aクローンの作成
方法については、日本脳炎ウィルスJaOArs982
株を使い、同様な方法で作成した例がGene 48p
、195−201(1986))に記載されている。
(3)日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードするc
 D N A (4118,1137)を含む組み換え
プラスミドpJE4118、PJE1137のスクリー
ング(第2図及び第3図参照) (2)で得られた形質転換菌を寒天プレートで生育させ
、ニトロセルロースフィルターにレプリカする。レプリ
カしたブイルターを0. 2%NP−40(界面活性剤
、牛丼化学)でゆるやかに洗浄した後、抗JE血清でイ
ムノスクリーニングしたところ、弱いながらもポジティ
ブに反応する形質転換菌を1株得て、その株が保有する
プラスミドをpJE4118とした。次いでプラスミド
pJE4118を常法(Molecular Clon
ing p、75−95(前述))に従い調整し、制限
酵素PstIでpUc9に挿入されたCDNAを切り出
し、これをDNAプローブとして、(2)で得た各種形
質転換菌をコロニーハイブリダイゼーション法(Mol
ecular Cloningp、382387(前記
))によってスクリーニングし、 pJE4118のイ
ンサートc D N A (411g)と重なりあうc
 D NAをもつプラスミドを選び出した。そうやって
選び出した2つのcDNA (220,1137)  
をプラスミドより回収し、制限酵素でその位置関係を決
定した(第3図参照)ところ、c D N A (2−
20)はc D N A (4118)の5′末端と部
分的に重なり合っていることが、c D N A (1
137)はc D N A(4118)の31末端と部
分的に重なり合っていることが判明した。
(4)非構成蛋白質をコードするc D N Aの塩基
配列の解明(第4図参照)。
組み換えたプラスミドpJE4118、 pJE2−2
0、pJE1137を制限酵素、 Pst、Iで切断し
、それぞれ約2.5kbp、約1.0kbp、約0−9
kbpのDNA断片を得た。これらの断片についてM1
3ファージを用いるメッシングらの方法(ジーン、川、
p、269(1982) ;サイエンス241 P、1
205(1981))  により配列分析を行った。
その結果、c D N A (2−20)  とc D
 N A(4118)が重なり合う部分のc D N 
A配列は第4図中の第一496番アミノ酸の第3コドン
から第一385番アミノ酸までの334塩基であること
が判明した。
またc D N A (4118)とc D N A 
(1137)が重なり合う部分のc D N A配列は
、第4図中の第121番アミノ酸の第3コドンから第3
32番アミノ酸の第2コドンまでの633塩基であるこ
とが判明した。
この塩基配列から推定されるアミノ酸配列と、すでに公
知(Science 229729−733(1985
))である黄熱病ウィルス(日本脳炎ウィルスと同居近
縁)の非構成蛋白質のアミノ酸配列の比較から、日本脳
炎ウィルスのNSI蛋白質は第4図中に示す+1番目か
ら第412番目のアミノ酸までであると判断された。
同様に、日本脳炎ウィルスのE蛋白質は第4図に示す第
一500番目から第一1番目のアミノ酸まで、またM蛋
白質は第4図に示す第一575番目から第一501番目
のアミノ酸まで、またPreM蛋白質は第一667番目
から第一576番目までと判断された。さらに、Pre
M蛋白質の5′側は日本脳炎ウィルスのC蛋白質の一部
をコードしていると判断された。
(5)日本脳炎ウィルスNSI蛋白質をコードするc 
D N Aの作製(第3図及び第4図参照)。
c D NA (4118)はE蛋白質のN末端の5ア
ミノ酸が欠けている。そこでcDNA (2−20) 
 を用いて、 Aatllサイトの位置でつな゛ぎ合わ
せて。
E蛋白質を完全にカバーするc D N A (203
)  を作製した。またc D N A (4118)
はNSI蛋白質のC末端の80アミノ酸が欠けている。
そこでcDNA (1137)を用いて^CC■CC上
の位置でつなぎ合わせてNSI蛋白質を完全にカバーす
るcDNA (2037)を作製した。
次いでc D N A (2037)をSac Iで処
理した3′末端側約1.9kbpのc D N A断片
はNSI蛋白質をコードする領域に加えてE蛋白質及び
N S 2 C蛋白質をコードする領域を含んでいる。
炎庭舅ユ バキュロウィルスの増殖に非必須なりNA領域を組み込
んだ第一の組み換えベクターpAcYMs2の作製(第
5〜7図参照) (1)ポリヘトリン遺伝子の3′末端を欠失させたプラ
スミドpAcRP61の作製(第5図参照)第一の組み
換えベクターを構成するために、まずAcNPV(野生
株)のポリヘトリン遺伝子を含むDNA断片をプラスミ
ドpUc8のEcoRI部位にクローン化した。AcN
PVのDNAはG、  E。
スミス及びM−D、  サマーズ(Virology 
 89巻1978年 頁517−527)により説明さ
れているように、ウィルスから抽出し、塩化セシウム密
度勾配における平衡遠心分離により精製した。次ぎにこ
のDNAを制限酵素EcoRIにより完全消化した。
7.3kbpのEeoRI −I断片をアガロースゲル
により回収後、pUc8のEcoRI部位にクローン化
してpAcEcoRI −Iを作製した。この組換えプ
ラスミドpAcEcoRI −1は3個のBamH認識
部位を有する(第5図参照)。1つは、ポリヘトリン遺
伝子中に、1つはEcoRI −I断片中にポリヘトリ
ン遺伝子のはるか下流に、及び1つはpUc8のポリリ
ンカー中におけるものである。
後者2つのBamHI認識部位は、G、  E、  ス
ミスら(Molecular and Ce1lula
r Biology  3巻1983年21561−2
165)が記載している方法に準じてpA’cEcoR
I −Iから除去せしめ、pAclolを作成した。
次にpAclolをポリヘトリン遺伝子中にあるKpn
 I部位で切断し、0.5単位のBa131エキソヌク
レアーゼで末端から欠失させていき、その後E。
coli  DNAポリメラーゼ([lenow所片)
を用いて末端を修復した。プラスミドDNAを精製し、
ホスホリル化BamHIリンカ−(s’−pc G G
 A T CCG−3’ )  0.5μ8を100縛
反応混合物中に10単位のT4DNAリガーゼと共に添
加した。室温で乏間接インキュベーション後、DNAを
精製した。
次いで、DNAペレットを100dの反応液中で再びB
amHIで消化させた。消化DNAを0.7%アガロー
スゲル電気泳動後回覗し、精製した。DNAをT4DN
Aリガーゼを用いてライゲーション後、大腸菌JMIO
9細胞を形質転換(アンピシリン耐性)させた。数個の
形質転換株からプラスミドを調製し、各々からEcoR
VとHinf Iで切り出される断片をメッシングらの
方法(ジーン 19巻 1982 p、269)により
配列分析を行った。この中の一つが115図に示すよう
にポリヘトリン遺伝子の翻訳停止コドンの下流13番目
の塩基まで欠失しているものである事が判明し、これを
pAcRP61と命名した(第5図)。
(2)ポリヘトリン遺伝子を欠失させたプラスミドpA
cE1の作製(第6図参照) pAcEcoRI −IをBamHIで切断し、 0.
5単位のBa131エキソヌクレアーゼで末端から欠失
させ、その後E、 coli  D N Aポリメラー
ゼ(Klenow所片)を用いて末端を修復した。
プラスミドDNAを精製し、前述のホスホリル化Ban
)IIリンカ−をT4DNAリガーゼと共に反応液に添
加した。室温で2時間インキュベーション後、DNAを
精製した。次いでDNAペレットを100縛の反応液中
で再びBamHIで消化させた。
消化DNAを0.7%アガロースゲル電気泳動後回収し
、精製した。
DNAをT4DNAリガーゼを用いてライゲーシゴン後
、大腸菌JM109細胞を形質転換させた。
数個−の転換株からプラスミドを調製し、各々からEc
oRVとBamHIで切り出さ九る断片を配列分析した
。多数のプラスミドのなかからポリヘトリン遺伝子の翻
訳開始コドン(ATG)のTまでが欠失している断片を
含むプラスミドを選択し、これをpAcElと命名した
(第6図参照)。
(3)第一の組み換えベクターρAcYMS1の作製(
第7図参照) 先のpAcRP61をXho IとBamHIで切断し
、第7図において矢印で示した長い方の断片を0.7%
アガロースゲル電気泳動後回収した。一方、 pAcE
lをXho IとBamHIで切断し、第7図において
矢印で示した短い方の断片を0.7%アガロースゲル電
気泳動後回収した。それら2つの断片をT4DNAライ
スゲースによって接続して得たプラスミドをpAcYM
lと命名した。次にpAcYMlをBamHIで切断し
、そこにBamHI−翻訳開始コトン−5maI −B
amHIの合成リンカ−(5’−PGATCCATGC
CCGGGCATG−3’ )を挿入して作成したプラ
スミドをpAcY阿S2と命名した(1!7図参照)。
こうして作成したpAcY阿S2はEcoRI −I断
片中にポリへドリンプロモーター、ポリヘトリン遺伝子
の5′非翻訳領域、BamHI−翻訳コトン−3maI
 −BamHI認識部位、ポリヘトリン遺伝子の3′非
翻訳領域が続いていることになる。
莢厳舅洛 日本脳炎ウィルスのN51ffi白質をコードするc 
D N Aを挿入した第二の組み換えベクターの作製(
第8図参照)6 実施例1の(5)で得たcDNA (JNS 1)をE
、 coli DNAポリメラーゼ(Klenow断片
)で末端を修復後、制限酵素Sma Iで切断したpA
cYMs2とT4DNAリガーゼを使って接続後JM1
09を形質転換する。数個の形質転換株より、プラスミ
ドを精製し、 pAcYMs2のSma I部位に、前
記cDNA (JNSl)が正方向(ポリへドリンプロ
モーターの転写方向と同方向にc D N Aの翻訳方
向が向いている場合を正方向という)に挿入されている
プラスミドを適当な制限酵素を用いた明晰パターンの結
果より選択する。こうして得た第2の組み換えベクター
をpAcYMJNslと命名した。
実11汁A。
組み換えバキュロウィルスの作出 F、  L、  グラハムらの論文(Virology
  52巻1973年 456−467頁)に記載され
ている方法に準じ、A c N P VのゲノムDNA
1ugを1〜10a3のpAcYMJlと混合し、15
pg/−の仔牛胸腺DNAを含む、1−HEPES (
N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−2−エタ
ンスルホンW1)緩衝液(pF17.0)で95OAに
した。混合物をスター子で攪拌しなから50艷の2.5
M Caα2を滴下し、沈澱を室温で30分間形成させ
た。1艷の沈澱したDNAを昆虫細胞S、フルギペルダ
に60+d培養プレート内の2艷の培地内において添加
した。4時間後、細胞単相を培地で洗浄し、10%ウシ
胎児血清を含む2−の培地を加えて、3日間インキュベ
ートした。その後、培地を滅菌ピペットで集めるが、こ
の培地中には組み換え及び非組み換えA c N P 
Vが混じっている。これら混合集団より、組み換えA 
c N P Vを単離するため、集めた培地を適当に希
釈し、単層培養したS、フルギペルダに感染させ、プラ
ークを形成せしめた。ウィルス封入体を形成しないプラ
ークを選び、そのプラークからウィルスを回収しこれを
PBSに懸濁し、一部はドツトハイブリダイゼーション
をするため、ナイロン又はニトロセルロースメンブレン
にスポットし、一部は、再びS、フルギペルダに感染さ
せ、ウィルスを増やした。
スポットしたメンブレンは0.5N  NaOHで10
分間、LM)リス塩酸緩衝液で5分の処理を3回繰り返
した後、1.5M Naα0.5M)リス塩酸緩衝液で
5分処理した。2倍SSC(1倍SSCは、0.15M
 Na1JL0.015Mクエン酸ナトリウム)で飽和
させ、80’C。
2時間焼き付けた。4倍SET (1倍SETは。
0.6M  Na0L  O,08M T r i s
 −CJL  4mM E DTA(pH7,8) )
 −10倍Denhardt、 −0,1%SDSで6
8℃、2時間処理した。4倍5ET−10倍Denha
rdt−0,1%5DS−0,1%Naa P2O7−
50pg/−変形サケ精子DNAとニックトランスレー
ションによって32pで標識した日本脳炎ウィルスのN
SI蛋白質のc D N Aを入れて68℃、14時間
ハイブリダイゼーションした。洗浄後、メンブレンとX
線フィルムを重ね、オートラジオグラフィーを行い、フ
ィルムが黒化するスポットを選択した。黒化したスポッ
トに対応するウィルス液を、再度、適当に希釈してS、
フルギペルダに感染させ、プラークを出現させた。出現
するプラークについて上記と同様な操作を行い、出現す
るプラークが全て、ドツトハイブリダイゼーションで黒
化するまで純化の操作をくり返した。こうして得られた
ウィルスは目的の組み換えバキュロウィルスであり、A
 c J N S 1と命名した。
火遊d1旦 組み換えバキュロウィルスによる日本脳炎ウィルスの非
構成蛋白質の製造 S、フルギペルダの細胞を単層において5xioa細胞
/−の密度まで生育させ、生育培地を除去し、細胞当り
5 p、f、u、のA c J N S 1を含む培地
を加えて23℃で感染させた。感染後2日間細胞を培養
し、感染細胞内において日本脳炎ウィルスのNS1蛋白
質を発現させた。発現蛋白質の確認は日本脳炎ウィルス
に対する抗血清を用いたウェスタンプロット法(バーネ
ット、W、 N、 Analyt。
Biochem、  112巻(1981) 195−
203 )で行った。
その結果A c J N S 1の感染細胞は、分子量
約48000ダルトンの蛋白質を産生じていることが判
明した。 48000ダルトンという分子量は、日本脳
炎ウィルスのNSI蛋白質のアミノ酸配列(第4図)か
ら推定される分子量と同一である。
A c J N S 1に挿入されているc D N 
A(JNSI)はNSI以外にE蛋白質及びN S 2
 aの一部を含んでいたにも拘らず48000ダダルト
ンの蛋白質が発現しているということは、感染細胞で発
現した蛋白質が日本脳炎ウィルス本来のNS1蛋白質と
同様なプロセスを受けて、48000ダルトンのNS1
蛋白質になったと容易に推察される。このA c J 
N S 1の感染細胞で発現させたN511f白質は、
日本脳炎ウィルスに対する抗血清と反応するので、抗原
性を有していることは明かであり、従ってワクチン、診
断試薬となり得るものである。感染細胞におけるNSI
蛋白質の生産量は、わずか100感染細胞からの抽出液
であってもウェスタンプロット法で検出できることから
相当なレベルのNSI蛋白質が作られていることが判る
。尚、A c J N S 1のかわりに野生型バキュ
ロウィルスを同様にS、フルギペルダの細胞に感染させ
て、細胞内の蛋白質を調べたが、抗血清と反応する蛋白
質は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の操作手順、第2図は日本脳炎ウィルス
のc D N Aのクローニング手順、第3図はc D
 N Aの制限酵素サイトの位置関係、第4図はNSI
蛋白質をコードする領域を含むc D N Aの塩基配
列及びアミノ酸配列、第5図〜第7図は第一の組み換え
ベクターpAcYにS2の構築手順、第8図はNSI蛋
白質をコードするc D N Aを含む第二の組み換え
ベクターpAcYMJNs1の構築手順をそれぞれ示す

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)バキユロウィルスの増殖に非必須なゲノム領域に
    、日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードするcDN
    Aの全部又は一部を組み込んだ組み換えバキユロウィル
    スを昆虫細胞に感染させ、該昆虫細胞を培養し、発現し
    た日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質を回収することを特
    徴とする日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質の製造法。
  2. (2)非構成蛋白質をコードするcDNAの全部又は一
    部が日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質−1である請求項
    (1)記載の製造法。
  3. (3)非構成蛋白質−1をコードするcDNAの全部又
    は一部が日本脳炎ウィルスの表面抗原蛋白質及び非構成
    蛋白質−2をコードするcDNAの全部又は一部ととも
    に組み込まれている請求項(2)記載の製造法。
  4. (4)日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードするc
    DNAが第4図にNS1として示すアミノ酸配列又はそ
    れと実質的に同一機能を有するポリペプチドをコードす
    るものである請求項(1)〜(2)記載の製造法。
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