FR2640144A1 - Procede de production de proteines non structurales du virus de l'encephalite japonaise - Google Patents
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Abstract
Avec un Baculovirus recombinant dans lequel le cADN codant une protéine non structurale dérivée du virus de l'encéphalite japonaise est intégré dans le génome, dans la région non essentielle pour la prolifération du Baculovirus, sous le contrôle d'un promoteur, on infecte des cellules d'insectes telles que les cellules Sf9, dérivées de Spodoptera frugiperda, et les cellules infectées sont cultivées pour exprimer la protéine non structurale de l'encéphalite japonaise. Cette protéine non structurale est utile comme vaccin ou comme agent de diagnostic.
Description
-2640144
Procédé de production de protéines non-structurales du
virus de l'encephalite japonaise.
L'invention concerne un procédé de production efficace de protéines nonstructurales du virus de l'encephafite japonaise utilisant un Baculovirus recombinant. On a utilisé jusqu'ici comme vaccin de l'encephalite japonaise un vaccin contenant comme ingrédient efficace le virus de l'encephalite japonaise inactive. La solution mère du vaccin du virus de l'encephalite japonaise inactivé est produite en inoculant le virus de l'encephalite japonaise, souche Nal:ayama, trouvé à l'Institut National de Santé, dans l'encéphale de souris nouveau-nés; en recueillant les cerveaux de souris infestées, en purifiant par la méthode de la protamine à l'alcool et en inactivant ce virus ("Vaccine of Japan", 2ème édition révisée, publié par l'Association Alumini de l'Institut National de Santé (publié Janvier 20, 1977, par Maruzen Publishing
Co., Ltd.)).
Dans un tel procédé de production de vaccin, on doit manipuler le virus lui-même en de grandes quantités, cette manipulation étant extrêmement dangereuse pour les ouvriers produisant le vaccin, et
les coûts de production étaient également très élevés.
On peut également utiliser comme vaccin une protéine antigénique présentant une antigénicité virale et non le virus lui-même. Ainsi, on a fait des essais pour produire la protéine antigénique dans des cellules eucaryotes ou procaryotes, utilisant la technique d'ADN recombinant. Par ailleurs, on a proposé des procédés pour exprimer un gène exogène dans des cellules d'insectes en utilisant un vecteur viral d'insecte (demande de brevet japonais KOKAI - mis à l'inspection publique - nés 37988/1985 et 57887/1986). On a rappelé que la quantité de protéines exprimée par ces procédés était nettement supérieure à celle obtenue par d'autres systèmes
d'expression.
Cependant, le virus de l'encephalite japonaise appartenant au genre Flavivirus de Togaviridae est caractérisé par le fait que son génome est un ARN simple brin et par le fait qu'un seul long polypeptide traduit de façon monocistronique à partir du génome dans les cellules infectées par le virus subit un traitement (ce qui veut dire qu'un seul polypeptide est segmenté avec de la protéase dans les cellules pour former les protéines respectives en protéine de capside, protéine de membrane, protéine E et 5 sortes de protéines non-structurales. Un exemple réussi d'intégration de cADN codant les protéines du virus de l'encephalite japonaise dans Baculovirus a seulement été observé sur la protéine E obtenue par les inventeurs de la présente invention (Abstracts of The 36th Meeting in the
Virological Society, Japan, page 309, 1988).
En ce qui concerne le virus de la fièvre jaune ou le virus de la dengue qui est un virus appartenant au même genre que le virus de l'encephalite japonaise, et en ce qui concerne la prévention d'infections virales induites par l'administration de protéines codée par un gène viral, il existe des rapports sur la prévention d'infections virales par la protéine 1 non-structurale (appelée ci-après protéine NS1) (Journal of Immunology, , 2805-2809 (1985); Journal of General Virology, 68,
853-857 (1987)).
L'antigène E induit une immunité humorale, tandis qu'on pense que NS1 induit une immunité cellulaire, étant donné que NS1 a été observé sur la surface de cellules infectées. Ceci suggère aue le protéine NS1 pourrait être utilisée comme vaccin ou
agent de diagnostic d'un nouveau type.
Cependant, la protéine NS1 n'est pas une protéine structurale du virus de l'encephalite japonaise et ainsi il est nécessaire de l'isoler et de le purifier à partir des cellules infectées par le virus de l'encephalite japonaise. Pour cette raison, on pouvait s'attendre à ce que ceci comporte des dangers sérieux d'infection virale et que les coûts de production soient élevés. Compte tenu de l'état antérieur de la technique sus-mentionnée, on a fait des recherches extensives visant un procédé pour produire la protéine NS1 du virus de l'encephalite japonaise en de grandes quantités et on a trouvé comme résultat qu'en sélectionnant une région codant la protéine NS1 à partir de cADN préparé à partir de l'ARN du génome du virus de l'encephalite japonaise, et en liant (ligaturant) cette région codant la protéine NS1 avec un promoteur du Baculovirus et en intégrant le produit de ligature dans une région du génome nonessentielle pour la prolifération du Baculovirus, on pouvait exprimer dans les cellules d'insectes infectées de grandes quantités de protéine NS1 du virus de l'encephalite japonaise
utilisables comme vaccin ou comme agent de diagnostic.
L'invention a pour objet un procédé de production de protéine NS1 du virus de l'encephalite japonaise gui comprend l'infection de la cellule d'insecte avec un Baculovirus recombinant hébergeant cADN codant la protéine NS1 du virus de l'encephalite japonaise dans une région du génome non-essentielle à la prolifération du Faculovirus, la culture de la cellule d'insecte et la récupération de la protéine NS1 exprimée
du virus de l'encephalite japonaise.
La figure 1 représente la procédure de la présente invention. La figure 2 indique la procédure pour le clonage de cADN du virus de l'encephalite japonaise. La figure 3 indique une relation de position des sites d'enzymes de restriction dans cADN. La figure 4 montre la séquence de bases, et la séquence d'acides aminés correspondante, de cADN contenant une région codant la protéine NS1. Les figures 5 à 7 montrent les procédures pour construire le premier vecteur recombinant pAcYMS2. La figure 8 montre les procédures pour construire le second vecteur recombinant pAcYMJNS1
contenant cADN codant la protéine NS1.
On peut, selon la présente invention, utiliser n'importe quel virus pour la production du virus
recombinant pourvu qu'il soit classé comme Baculovirus.
Comme exemples, on peut citer Autographa californica, ÀTrichoplusia ni, Rachiplusia ou, Galleria mellonella, Bombyx mori, etc. Parmi ces virus, on préfère Autographa californica (appelé ci-après AcNPV). Ces virus ont été largement étudiés et on peut en obtenir des échantillons de nombreuses sources incluant la Station d'Essais Agriculturale du Texas et le Service Extension de A & M Université du Texas, U.S.A. Par ailleurs, on peut préparer cADN codant la protéine d'enveloppe du virus de l'encephalite japonaise en utilisant la souche Nakayama sus-indiquée qu'on peut trouver à l'Institut National de Santé, la souche JaOAr (Arboviruses Research Unit of Yale College, Connecticut, U.S.A.), ou la souche Sagayama (gue l'on trouve dans le
même collège).
Par exemple, le cADN codant la protéine NS1, qui est préparé à partir de la souche Sagayama décrite ci-dessus, comporte 1236 paires de bases au total comme indiqué sur la figure 4. Selon la présente invention, cADN peut également être modifié (notamment sa séquence de bases est remplacée, insérée ou supprimée) dans un intervalle qui a substantiellement la même fonction que dans cADN sus-indiqué. Bien entendu, cADN peut également être modifié à un tel degré que sa séquence d'acides aminés soit modifiée, dans la mesure o sa fonction
reste sensiblement la même.
Lors de la production du virus recombinant, on construit d'abord un premier vecteur recombinant comportant une région d'ADN qui est nonessentielle à la prolifération du Baculovirus. Dans ce cas, il est requis qu'un activateur (promoteur) fonctionnant dans le Baculovirus soit présent dans la région ci-dessus décrite. Il est en outre préféré d'insérer un linker synthétique contenant une séquence de coupure par une enzyme de restriction appropriée en aval de l'activateur. La région d'ADN qui n'est pas essentielle à la prolifération, telle qu'utilisée ici, se réfère à une région telle qu'un gène de polyhedrine de Baculovirus (L.K. Miller, et al., Science, 219, 715-721 (1983)) ou similaire, n'affecte pas substantiellement la prolifération du virus, même lorsque la région subit une
mutation par insertion de ADN exogène.
A noter pour référence que la polyhedrine est une protéine ayant un poids moléculaire d'environ 29 000 daltons, et son gène est présent sur le fragment EcoR I-I du génome d'AcNPV (G.E. Smith, et al., J. Virol., , 215225 (1983)). La séquence d'ADN du gène de polyhedrine a été rapportée par G.E. Smrith, et al.,
(Virology, 131, 561-565 (1983)).
On peut utiliser tout activateur en tant qu'activateur fonctionnant dans Baculovirus, qu'il soit d'origine synthétique ou naturelle, pourvu qu'il puisse fonctionner efficacement comme activateur dans le système de transcription du Baculovirus. Comme exemple spécifique, on peut citer un activateur du gène de polyhedrine du Baculovirus, un activateur d'un gène du polypeptide 10K de Baculovirus, etc. La production du premier vecteur recombinant peut être réalisée de façon classique (par exemrle selon les demandes de brevet japonais KOFAI (mises à l'Inspection Publique) n s 37988/1985 et 5787/1986, etc.)). Par exemple, la procédure s'effectue de la façon suivante. On isole du Baculovirus AcKPV le fragment
d'ADN portant le gène de polyhedrine et l'on purifie.
Ensuite, la digestion avec l'endonucléase de restriction EcoR I donne un fragment EcoR I-I de 7,3 kb contenant le gène de polyhedrine et d'autres fragments appropriés. Le fragment EcoR I-I est cloné à un plasmide de clonage approprié, au site EcoR I. Dans ce système, l'activateur du gène de
polyhedrine est présent dans la région non-essentielle.
Cet activateur fonctionne de façon efficace également
dans le second vecteur recombinant.
En vue d'augmenter le taux d'expression, on préfère utiliser un vecteur qui a un site d'enzyme de restriction, immédiatement après l'activateur et la région non-traduite 5' du gène de polyhedrine, et suivi par la région non-traduite 3' du gène de polyhedrine, mais dans lequel manque la séquence codant
le gène de polyhédrine.
On a rapporté qu'un tel vecteur est approprié pour produire un Baculovirus recombinant, exprimant des protéines à un taux extrêmement élevé (Matsuura et al.,
J. gen. Virol., 68, 1233-1250 (1987)).
Comme indiqué précédemment, les protéines du virus de l'encephalite japonaise sont synthétisées de façon monocistronique et on procède ensuite à la séparation en protéine d'enveloppe, etc. Par conséquent, lorsqu'on insère cADN pour le génome entier du virus, il n'est pas nécessaire d'insérer artificiellement un codon d'initiation de traduction et un codon de terminaison de traduction. Ceci s'applique également lorsque cADN à insérer contient à sa partie amont une séquence (par exemple ATG) capable d'agir comme codon d'initiation de traduction, en plus de la région codant la protéine NS1. Lorsque seul cADN codant la protéine NS1 est intégré ci-dessus, il est nécessaire d'intégrer un linker synthétique ayant un codon d'initiation de traduction, un codon de terminaison de traduction et des sites d'enzymes de restriction entre les deux codons, dans le site d'enzyme de restriction, en aval de l'activateur. Le cADN à insérer peut également être un cADN contenant une région codant pour toute protéine additionnelle, pourvu cu'il contienne la région codant la protéine NS1. Dans Flavivirus, il y a des régions codant une çrotéine d'enveloppe (appelée ci-après E protéine), une protéine de membrane (appelée ci-après M-protéine), une protéine de prémembrane (appelée ci-après preM protéine) et une protéine de capside (appelée ci-après C protéine). Ces régions sont
présentes en amont de la région codant la protéine NS1.
Selon la présente invention, on peut également utiliser un virus dans lequel tout ou partie des cADN codant ces protéines peut être lié au cADI codant la proétine NS1,
l'amont de ce dernier.
Les exemples spécifiques du vecteur utilisé englobent des plasmides, tels que pBR322, pER325, pBR327, pBR328, pUC7, pUC8, pUC9, pUCl9 et similaire; les phages tels que le phage -A-, le phage M13 et similaires; les cosmides, tels que pBC79 (Gene, 11, 291, 1980), etc. Selon la présente invention, on insère ensuite la région codant la protéine NS1 du virus de l'encephalite japonaise, en aval de l'activateur du premier vecteur recombinant, construisant ainsi un second vecteur recombinant. Le procédé pour l'insertion peut également être réalisé de façon classique (par exemple selon la demande de brevet sus-indiquée), par exemple un fragment de cADN dérivé du virus -de l'encephalite japonaise, peut être inséré dans le site d'enzyme de restriction fourni artificiellement en aval
du premier vecteur.
A la suite de la construction de ces premier et second vecteurs recombinants, on peut utiliser le système Escherichia coli qui est aisément utilisé dans les manipulations génétigues. Les vecteurs plasmides à utiliser ne- sont pas particulièrement limités, pourvu
qu'ils conviennent pour le but recherché.
Selon la présente invention, on mélange l'ADN du génome du Balculovirus avec le second vecteur recombinant et on transfecte le mélange à des cellules d'insecte pour provoquer une recombinaison par homologie entre l'ADN vecteur et l'ADN du génome du virus,
construisant ainsi le Baculovirus recombinant.
On peut utiliser comme culture de cellules d'insectes n'importe quelles cellules, dans la mesure o le Baculovirus peut y croître. Comme exemple spécifique, on peut citer la cellule Sf9 dérivée de Spodoptera
frugiperda, et des cellules similaires.
Les conditions d'incubation ne sont pas particulièrement limitées, pourvu que les cellules prolifèrent. Dans le cas o l'on utilise par exemple la souche Sf9, cette souche peut être cultivée à 28 C dans
le milieu TC-100.
La. construction du Baculovirus recombinant peut être mise en oeuvre de façon classique. Les procédures peuvent être réalisées, par exemple, de façon similaire aux exemples de la demande de brevet japonais KOKAI (mise à l'inspection Publique) n 37988/1985. Selon cette procédure, le second vecteur recombinant et l'ADN du génome du Baculovirus sont transfectés à des cellules d'insecte et le fluide surnageant contenant le Baculovirus recombinant est récupéré. Les fluides contenant les Faculovirus recombinants sont soumis à l'essai standard sur plaque à la polyhedrineAcNPV, décrit par L.E. Borgman et al., (J. Virol., 19, 820-832, 1976). On sélectionne, comme plaques de virus de candidats de virus recombinant, des plaques qui ne forment pas des occlusions de virus. Un virus est récupéré à partir de la plaque. Comme méthode pour sélectionner le virus hébergeant le fragment d'ADN codant la protéine E du virus de l'encephalite japonaise à partir de ces candidats, on peut utiliser une hybridation sur plaque à l'aide d'une sonde d'ADN; selon un autre mode de réalisation, on peut utiliser un immuno-essai employant un anti-sérum ou un anticorps monoclonal. Avec le Baculovirus recombinant ainsi pufirié, on infecte des cellules d'insectes susceptibles d'être infectées. On cultive les cellules d'insectes dans des conditions de croissance appropriées, d'une façon classique. Après une période d'incubation appropriée, les cellules sont réunies et on les soumet à la sonication (rupture par ultrasons) pour préparer un extrait. La protéine exprimée est récupérée de l'extrait
d'une façon appropriée.
Les cellules d'insectes utilisées pour l'incubation ne sont pas particulièrement limitées, à condition que le Baculovirus puisse pousser sur ces
cellules. On préfère particulièrement la cellule Sf9.
Les cellules Sf9 peuvent être cultivées dans les conditions généralement connues (voir J. Gen. Virol, 36, 361-364 (1977)). On peut déterminer facilement les conditions de culture appropriées par des essais préliminaires; cependant, il est préférable de cultiver dans un milieu contenant 10% de sérum de foetus de veau, à 28 C. Les méthodes de récupération de la protéine exprimées à partir des cellules ne sont pas particulièrement limitées, à condition qu'elles soient réalisées par des procédés classiques utilisés pour la purification biochimique. Cependant, on préfère la chromatographie d'affinité utilisant des anticorps contre la protéine non-structurale du virus de
l'encephalite japonaise.
La figure 1 représente un mode de réalisation
de la présente invention.
Selon la présente invention, on obtient ainsi un Baculovirus recombinant, dans lequel cADN codant la protéine NS1, dérivée du virus de l'encephalite japonaise, est intégré dans la région du génome non- essentielle à la prolifération du Baculovirus, sous le contrôle du promoteur. On infecte les cellules d'insectes avec le virus recombinant et on cultive ces cellules infestées, obtenant ainsi la protéine NS1 du virus de l'encephalite japonaise. Cette protéine NS1 est
utile comme vaccin ou agent de diagnostic.
L'invention est illustrée plus en détail par
es exeamples illustratifs et non limitatifs ci-après.
EXEMPLE 1
Production de cADN codant la protéine NS1 du
virus de l'encephalite japonaise.
(1) Extraction de 1'ARN du génome du virus de l'encephalite japonaise: On infecte avec la souche Sagayama du virus de l'encephalite japonaise, des cellules C6/36 provenant de moustiques (J. Gen. Virol., 40, 531-544 (1978) ). Après la prolifération des virus, on mélange le surnageant de culture avec du polyéthylèneglycol. On centrifuge le mélange pour purifier les virus de l'encephalite japonaise. Après extraction au phénol des virus purifiés, on ajoute de l'éthanol à l'extrait pour provoquer la précipitation et on isole ainsi l'ARN
génomique (environ 11 Kbp).
(2) Clonage de cADN du virus de l'encephalite japonaise (cf. Fig.2): En utilisant la poly(A) polymérase (Takara Shuzo Co., Itd.), on ajoute poly(A) à l'ARK du génome du virus, préparé sous (1), et ceci est utilisé comme matrice: on fait agir 4 types (A, G, C, T) de triphosphate de désoxyribonucléoside et de la transcriptase inverse, en utilisant comme amorce l'oligo dT pour synthétiser le premier brin de cADN. Ensuite, on construit du cADN à deux brins en utilisant RNase H d'E. coli et 4 types (A, G, C, T) de triphosphate de désoxyribonucléoside et ADN polymérase de E. coli (Molecular Cloning Cold Spring Harbor Lab., (1982L7, pages 211246), et une chaîne dC a été ajoutée en utilisant de la transférase terminale. Par ailleurs, après digestion du plasmide pUC9 (fabriqué par Pharmacia Fine Chemicals) avec l'enzyme de restriction Pst I, une chaîne dG a été ajoutée au produit de la digestion, à l'aide de transférase terminale. Le produit obtenu par l'addition de la chaîne dG a été mélangé avec cADN décrit ci-dessus. Le mélange a été soumis à la ligature pour cyclisation. Le plasmide recombinant a été transfecté dans la cellule compétente HB101 de E. coli pour obtenir un transformant. Un plasmide a été retiré du transformant et on a comparé la longueur de l'insert de cADN sur gel d'agarose. En ce qui concerne l'insert de cADN le plus long, on a analysé une séquence à l'extrémité 5' (Gene, 19, p.269 (1982)). Fn se basant sur les résultats de l'analyse des séquences, on a de nouveau construit un cADS par la méthode décrite ci-dessus, en utilisant comme amorce l'oligonucléotide synthétique 20-mère (5'-dATTCCGTACCATGCAGTCCA-3') et comme matrice l'ARN du génome du virus. cADN a été lié avec le plasmide pUC9 pour obtenir un certain nombre de transformants. Parmi les transformants obtenus, on a sélectionné par la méthode ci-dessus décrite, un transformant contenant un plasmide recombinant portant
cADN codant la protéine NS1 désirée.
En ce qui concerne une méthode pour construire le clone de cADN du virus de l'encephalite japonaise, un exemple de cette construction utilisant la souche JaOArs 982 du virus de l'encephalite japonaise de façon
similaire est décrit dans Gene, 48, p. 195-201 (1986).
(3) Sélection des plasmides recombinants pJE4118 et pJE1137 contenant cADN (4118) et cADN (1137) codant la protéine NS1 du virus de l'encephalite japonaise (cf. Figs 2 et 3): Les transformants obtenus sous (2) ont été cultivés sur une plaque d'agar et repliques sur un filtre de nitrocellulose. Après lavage modéré du filtre repliqué, avec NP-40 à à 0, 2% (agent de surface, Nakarai Kagaku), le filtre a été soumis à l'immunosélection utilisant du sérum anti-JE. On a obtenu un transformant capable de réagir positivement, bien que la réactivité ait été faible. Un plasmide du transformant a été appelé pJE4118. Ensuite, le plasmide pJE4118 a été préparé de façon classique (Molecular Cloning, p. 75-95, Esupra7 et cADN (4118) inséré dans le plasmide pUC9 a été excisé avec l'enzyme de restriction Pst I. Avec ce cADN comme sonde d'ADN, les différents transformants obtenus sous (2) ont été soumis à la sélection par la méthode d'hybridation de colonie (Molecular Cloning, p. 382-387 Csupra7). Les plasmides portant cADN en chevauchement avec cADN (4118) inséré de pJE4118 ont été sélectionnés. cADN (2-20) et cADN (1137) ainsi sélectionnés ont été récupérés du plasmide et leur rapport positionnel a été déterminé avec des enzymes de restriction (cf. Fig.3). Il a été ainsi rendu clair que cADN (2-20) recouvrait partiellement l'extrémité Nterminale de cADN (4118), et cADN (1137) recouvrait
partiellement l'extrémité C-terminale de cADN (4118).
(4) Analyse de la séquence de bases de cADN codant la protéine NS1 (cf. Fig.4): Les plasmides recombinants pJE411e, pJE2-20 et pJE1137 ont été coupés avec l'enzyme de restriction Pst I pour donner des fragments de ADN respectivement d'environ 2,5 Kb, environ 1,0 Kb et environ 0,9 Kb. En ce qui concerne ces fragments, leurs séquences ont été analysées par la méthode de Messing et al., utiIisant le phage M13 (Gene, 19, p. 269 (1982) ; Science, 241, p.
1205 (1981)).
Comme résultat, on a noté que la séquence de cADN, dans les parties o cADN (2-20) et cADN (4118) se chevauchaient, était constituée des 334 bases à partir du troisième codon de l'acide aminé -496ème jusqu'au 385ème, sur la Fig.4. Dans la séquence cADN des portions o cADN (1137) et cADN (4118) se chevauchaient, il y avait 633 bases, à partir du troisième codon du 121ème acide aminé jusqu'au second codon du 332ème acide aminé, sur la Fig.4. En se basant sur la comparaison de la séquence d'acides aminés attendue à partir de cette séquence de bases avec la séquence d'acides aminés de la protéine NSI du virus de la fièvre jaune (apparenté à et appartenant au mnme genre que le virus de l'encephalite japonaise) déjà connue (Science, 229, 726-733 (1985)), on a déduit que la protéine NS1 du virus de l'encephalite japonaise correspond aux acides aminés du
+1er au 412ème représentés sur la Fig.4.
De la même façon, on a déduit que la protéine
E du virus de l'encephalite japonaise comprend les -
acides aminés du -500ème au -1er, la protéine M comprend les acides aminés du -575 au -501ème et la protéine preM comprend les acides aminés du -667 au -576ème comme - indiqué sur'la Fig.4. En outre, on a déduit oue l'amont de la protéine preM code une partie de la protéine C du
virus de l'encephalite japonaise.
(5) Construction de cADN codant la protéine NS1 du virus de l'encephalite japonaise (cf. Figs 3 et 4): Dans cADN (4118), on enlève les bases codant les 5 acides aminés N-terminaux de la protéine E. Ainsi, cADN (2-20) épissé a été joint avec cADN (4118) au site Aat II pour obtenir cADN (203) couvrant toute la région de la protéine E. Dans cADN (4118) et cADN (203) , on a supprimé les bases codant les 80 acides aminés C-terminaux de la protéine NS1. Ainsi, cADN (1137) épissé a été joint au cADN (203) au site Acc III pour obtenir cADN (203) couvrant toute la région de la
protéine NS1.
Ensuite, cADN (2037) a été traité avec Sac I pour récupérer environ 1,9 Kb de l'extrémité C-terminale du fragment cADN (JNS1). Ce fragment contient une partie de la région codant la protéine E et la protéine NS2a, en plus de la région codant la protéine NS1.
EXEMPLE 2
Production du premier vecteur recombinant pAcYMS2 intégrant la région d'ADN non-essentielle pour la prolifération du Baculovirus (cf. Figs. 5 à 7): (1) Production du plasmide pAcRP61 o l'extrémité 3'-terminale du gène de polyhedrine est supprimée (cf.
Fig. 5).
En vue de constituer le premier vecteur recombinant, le fragment d'ADN contenant le gène de polyhedrine de AcNPV (souche sauvage) a été cloné dans le plasmide pUC8 au site EcoR I. Le ADN de AcNPV a été purifié par extraction hors du virus suivie d'une centrifugation équilibrée dans du chlorure de césium à gradient de densité, comme expliqué par G.E. Smith et M.D. Summers (Virology, 89, 517-527, 1978). Ensuite, cet ADN a été complètement digéré avec l'enzyme de restriction EcoR I. Après que 7,3 Rb du fragment EcoR I-I ont été récupérés sur gel d'agarose, le fragment a été cloné dans pUC8 au site EcoR I pour préparer pAcEcoR I-I. Ce plasmide recombinant pAcEcoR I-I possède trois sites de reconnaissance BamH I (cf. Fig.5). L'un est dans le gène de polyhédrine, un autre est loin en aval du gène de polyhédrine et le dernier est dans le polylinker de pUC8. Ces deux derniers sites de reconnaissance EamH I ont été retirés du pAcEcoR I- I
d'une façon similaire à la méthode décrite par G.E.
Smith et al. (Molecular and Cellular Biology,- 3,
2640 1 44
p. 2156-2165, 1983) pour produire pAc10o1.
Ensuite, on a coupé pAc101 au site Kpn I présent dans le gène de polyhédrine et on en a éliminé séauentiellement l'extrémité en utilisant 0,5 unité d'exonuclease Bat 31. Ensuite, on a réparé les extrémités en utilisant l'ADN polymerase de E. coli (fragment de Klenow). L'ADN de plasmide a été purifié et 0,5/pg de linker BamH I phosphorylé (5'pCGGATCCG-3') a été ajouté à 100 ul de mélange réactionnel, ensemble avec 10 unités d'ADIN ligase de T4. Après incubation à la température ambiante pendant 2 heures, l'ADN a été purifié. Ensuite, l'ADI a été de nouveau digéré avec BamE I dans 100 /ul de solution réactionnelle. L'ADN digéré a été soumis à une électrophorèse sur gel
d'agarose à 0,7% et ensuite récupéré pour être purifié.
Après ligature du ADI avec l'ADN ligase de T4, les cellules E. coli JM109 ont été transformées par le ADN lié (résistance à l'ampicilline). On a préparé des plasmides à partir de plusieurs transformants. En ce gui concerne les fragments excisés des plasmides respectifs avec EcoR V et Hinf I, on a réalisé l'analyse des séquences par la méthode de Messing et al. (Gene, 19, p. 269, 1982). On a noté que dans l'un d'eux, les bases avaient été supprimées jusqu'à la 13ème à l'aval du codon de-fin de traduction du gène de polyhédrine, comme indiqué sur la Fig. 5. Le plasmide a été appelé pAcRP61
(figure 5).
(2) Production du plasmide pAcE1 o le gène de
polyhédrine a été supprimé (cf. Fig. 6).
pAcEcoR I-I a été coupé avec BamH I, et on en a supprimé séquentiellement l'extrémité, en utilisant 0,5 unité d'exonuclease Bal 31. Ensuite, ses extrémités ont été réparées en utilisant l'ADR polymérase de E. coli (fragment de Klenow). L'ADN de plasmide a été purifié et le linker BamH I phosphorylé susmentionné a été ajouté au mélange réactionnel ensemble avec l'ADN ligase de T4. Après incubation à température ambiante pendant 2 heures, l'ADN a été purifié. Ensuite, l'ADN a été de nouveau digéré avecBamH I dans 100 pul de solution réactionnelle. Le ADN digéré a été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose à 0,7% et ensuite récupéré en vue de purification. Après ligature de l'ADN avec l'ADN ligase de T4, les cellules E. coli JM109 ont été transformées par le ADN lié (résistance à l'ampicilline). On a préparé des plasmides à partir de plusieurs transformants. En ce qui concerne les fragments excisés des plasmides respectifs avec EcoR V et BamE I, on a réalisé l'analyse des séquences. Parmi un certain nombre de plasmides, un plasmide contenant le fragment supprimé jusqu'à T du codon d'initiation de traduction (ATG) du gène de polyhédrine a été
sélectionné. Le plasmide a été nommé pAcE1 (figure 6).
(3) Production du premier vecteur recombinant du
plasmide pAcYMSI (cf. Fig. 7).
pAcRP61 préalablement obtenu a été coupé avec Xho I et BamH I. Le fragment plus long, indiqué avec des flèches à la figure 7, a été soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 0,7% et ensuite recueilli. Par ailleurs, pAcE1 a été coupé avec Xho I et BamH I. Le fragment plus court, indiqué avec des flèches sur la figure 7, a été soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 0,7% et ensuite recueilli. Ces deux fragments ont été liés avec l'ADN ligase de T4. Le plasmide ainsi obtenu a été appelé pAcYM1. Ensuite, pAcYM1 a été coupé avec EamH I, et on a inséré dans ce site un linker synthétique (5'-pGATCCATGCCCGGGCATG-3') de BamE I-codon d'initiation-Sma I-EamH I. Le plasmide ainsi produit a été appelé pAcYMS2 (cf. Fig. 7). Ce pAcYMS2 contient dans le fragment EcoR I-I, successivement, le promoteur polyhédrine, la région 5' non-traduite du gène de polyhédrine, le site d'enzyme de restriction BamH I-codon d'initiation-Sma I-BamH I et la région 3' non-traduite du gêne de polyhédrine.
EXEMPLE 3
Production du second vecteur recombinant comportant cADN codant la protéine NIS1 du virus de
l'encephalite japonaise (cf. Fig. 8).
Après la réparation des extrémités avec l'ADN polymerase de E. coli (fragment de Klenow), cADN (JNS1) obtenu à l'exemple 1, (5) a été lié à pAcYMS2, coupé avec l'enzyme de restriction Sma I, avec l'ADN ligase de T4. Ensuite, JM109 a été transformé. Les plasmides
ont été purifiés à partir de différents transformants.
Le plasmide dans lequel cADN (JNS1) décrite ci-dessus a été intégré au site Sma I du pAcYMS2 dans la direction positive tlorsque la direction de traduction de cADN est la même que la direction de transcription du promoteur polyhédrine, elle est appelée direction positive) est choisi sur la base des résultats des modèles de coupure par différentes enzymes de restriction. Le second
vecteur recombinant ainsi obtenu a été appelé pAcYMJNSI.
EXEMPLE 4
Construction du Baculovirus recombinant.
D'une façon similaire au procédé décrit dans la monographie de F.L. Graham et al. (Virology, 52, p. 456-467, 1973), on a mélangé 1/ug d'ADN de génome de AcNPV avec 1 à 10 ug de pAcYMJ3. Ce mélange a été dilué
avec du tampon HEPES (N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-
éthanesulfonate) (pE 7,0) contenant 15/ug/ml de ADN de thymus de veau, à 950/ul. Tout en agitant le mélange, on a ajouté goutte à goutte 50 ml de CaCl2 2,5 M pour former un précipité, à la température ambiante pendant 30 minutes. Le ADN précipité, 1 ml, a été ajouté aux cellules Sf9 qui ont été cultivées à 28 C dans 2 ml de milieu TC-100 (obtenu en dissolvant dans l'eau pure, 0,55 g de L-arginine, 0,35 g d'acide L-aspartique, 0,35 g de L-asparagine, 0,225 g de L-alanine, 0,60 g d'acide L-glutamique, 0, 60 g de L-glutamine, 0,65 g de L-glycine, 3,4 g de L-histidine, 0,05 g de L-isoleucine, 0,63 g de monochlorhydrate de L-lysine, 0,05 g de
L-méthionine, 0,35 g de L-Froline, 0,15 g de L-Ehényl-
alanine, 0,55 g de L-sérine, 0,15 g de L-thréonine, 0,10 g de L-valine, 0, 075 g de L-leucine, 0,02 g de
L-cystéine, 0,05 g de L-tyrosine, 0,10 g de L-trypto-
phane, 2,6 g de bouillon de Bacto-tryptose, 2,5 g de KCl, 1,3 g de CaCl2. 2H20, 2,3 g de MgCl2.6H20, 2,8 g de MgSO4.7H20, 1,0 g de glucose, 1,1 g de NaH2PO4.2H20, 0,35 g de NaHCO3, 0,02 mng de chlorhydrate de thiamine, 0,11 mg de pantothénate de calcium, 0,02 mg de
chlorhydrate de pyridoxine, 0,02 mg d'acide p-amino-
benzoïque, 0,02 mg d'acide folique, 0,02 mg d'acide nicotinique, 0,02 mg d'isoinositol, 0,01 mg de cyanocobalamine, 0,02 mg de riboflavine et 0,01 mg de biotine, en ajustant à 900 ml, pH 6,2 et en stérilisant à travers un filtre, puis en ajoutant 100 ml de sérum-de foetus de veau) placés dans une plaque de culture de ml. La monocouche de cellules a été lavée avec le milieu 4 heures plus tard et on y a ajouté 2 ml d'un milieu contenant 10% de sérum de foetus de veau, puis on a incubé pendant 3 jours. Ensuite, le milieu a été recueilli avec une pipette stérile. Dans ce milieu, étaient mélangés des AcNPV recombinant et non recombinant. Afin d'isoler du mélange AcNPV recombinant, le milieu recueilli a été dilué de façon appropriée et on a infecté avec la dilution les cellules Sf9 cultivées en monocouche pour former des plaques. La plaque dans laquelle il n'y a pas eu d'occlusion de virus a été choisie et le virus a été recueilli de la plaque. Le virus a été mis en suspension dans PBS. Une partie de la suspension a été utilisée pour faire des taches sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon en vue d'une hybridation sur filtre et une autre partie a servi à infecter de nouveau des cellules Sf9 en vue de la
prolifération du virus.
Après que le traitement avec NaOH O,5N pendant minutes et avec le tampon Tris-chlorhydrate 1M pendant 5 minutes a été répété trois fois, la membrane tachée a été traitée avec taCl 1,5M et avec le tampon Trischlorhydrate O,5M pendant 5 minutes. La membrane traitée a été saturée avec SSC double (SSC simple: NaCl 0,15M, citrate de sodium O,015M), puis soumise à la chaleur à 80C pendant 2 heures. Ensuite, on a réalisé le traitement avec SET (4 fois) (NaCl O,6M, Tris-Cl O,08M, 4 mM EDTA (pH 7,8) )-Denhardt (10 fois)-O,1% SDS à 68"C pendant 2 heures. On a ensuite hybridé de l'ADN
de sperme de saumon, modifié par 4-fois SET-Denhardt 10-
fois-O, 1% SDS-0,1% Na4P207-50/ug/ml, et le cADN de la protéine NS1 du virus de l'encephalite japonaise marqué avec 32p, par translation de coupure, à 68"C pendant 14 heures, Après lavage, la membrane a été placée sur un film pour rayons X qui a été soumis à l'autoradiographie et on a choisi sur le film une tache exposée. La solution de virus correspondant à la tache exposée a été diluée à nouveau de façon appropriée et avec la dilution, on a infecté des cellules Sf9 pour développer des plaques. Les plaques développées ont été traitées comme ci-dessus et la procédure de purification a été répétée jusqu'à ce que les plaques développées soient toutes positives en hybridation sur filtre. Le virus ainsi obtenu était le Paculovirus recombinant désiré et on l'a appelé AcJNS1.
EXEMPLE 5
Production de la protéine NS1 du virus de l'encephalite japonaise par Baculovirus recombinant: On a fait croître des cellules Sf9 en monocouches pour atteindre une densité de 5 x 106/ml. Le milieu de culture a été éliminé et on a ajouté un milieu contenant 5 p.f.u./cellule de AcJlS1 pour provoquer l'infection à 23 C. Après l'infection, les cellules ont été cultivées pendant 2 jours pour exprimer la protéine NS1 du virus de l'encephalite japonaise dans les cellules infectées. L'expression de la protéine a été confirmée par le procédé dit "estern blotting" (Bernet, W.K., Analyt. Biochem., 112, p. 195-203, 1981)) avec un immuno-sérum de lapin contre le virus de l'encephalite japonaise. Les résultats montrent que les cellules infectées par AcJNSI produisaient une protéine ayant un poids moléculaire d'environ 48000 daltons. Le poids moléculaire de 48000 daltons est le même que celui présumé à partir de la séquence d'acides aminés de la protéine NS1 du virus de l'encephalite japonaise (figure 4). Malgré le fait qu'une partie du gène E et une partie du gène NS2a étaient contenues en plus du gène NS1 dans le cADN (JNS1) intégré dans le génome de AcJNS1, la protéine de 48000 daltons a été exprimée. On peut présumer de ce fait que la protéine exprimée dans les cellules infectées est soumise à un traitement similaire à celui que subit la protéine NS1 du virus de l'encephalite japonaise pour devenir la protéine NS1 de 48000 daltons. La protéine NS1 exprimée dans les cellules infectées par AcJNSl réagit avec l'antisérum du virus de l'encephalite japonaise et ainsi il est clair que la protéine NS1 exprimée présente un caractère antigénique. Par conséquent, elle peut être utilisée comme vaccin ou comme agent de diagnostic. La quantité de protéines NS1 produite dans les cellules infectées peut être déterminée par le procédé dit "Western blotting", même s'il s'agit de l'extrait de seulement cellules infectées. Il est ainsi clair que la protéine NS1 est produite à un niveau considérable. A la place de AcJNS1, on a infecté d'une façon similaire, avec un Baculovirus sauvage, des cellules Sf9 pour examiner les protéines dans les cellules. Cependant, on
n'a pas détecté de protéines réactives avec l'antisérum.
Claims (5)
1. Procédé de production d'une protéine non-
structurale du virus de l'encephalite japonaise, caractérisé par le fait qu'il comprend l'infection de cellules d'insectes avec un Baculovirus recombinant dans lequel on a intégré au moins une partie de cADN codant la protéine non-structurale du virus de l'encephalite japonaise dans une région du génome non essentielle pour la prolifération du Baculovirus, la culture de ces cellules d'insectes et la récupération de la protéine nonstructurale exprimée du virus de l'encephalite japonaise.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que tout ou partie de cADN codant la protéine non-structurale est celui codant la protéine nonstructurale 1 du virus de l'encephalite japonaise.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que tout ou partie de cADN codant la protéine non-structurale 1 est celui codant la protéine nonstructurale 2 du virus de l'encephalite japonaise.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que le cADN codant la protéine non-structurale du virus de l'encephalite japonaise code la séquence d'acides aminés indiquée NS1 à la figure 4 ou un polypeptide ayant sensiblement la même fonction
que la séquence d'acides aminés.
5. Procédé de production de protéines non-
structurales du virus de l'encephalite japonaise, caractérisé par le fait qu'il comrrend l'infection des cellules d'insectes avec le Baculovirus recombinant dans lequel est intégré le cADN codant la protéine d'enveloppe du virus de l'encéphalite japonaise ou une partie de celui-là contenant l'extrémité 3'-terminale, le cADN codant la protéine non- structurale 1 du virus de l'encephalite japonaise, le cADN codant la protéine non-structurale 2 du virus de l'encephalite japonaise ou le cADN contenant l'extrémité 5'-terminale de celui-là, une partie duquel continue de l'extrémité 5'-terminale à
l'extrémité 3'-terminale, dans la région du génome non-
essentielle à la prolifération du Baculovirus, la culture de ces cellules d'insectes et la récupération de la protéine non-structurale exprimée du virus de
l'encephalite japonaise.
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|---|---|---|---|
| JP63311656A JPH02156896A (ja) | 1988-12-09 | 1988-12-09 | 日本脳炎ウイルスの非構成蛋白質の製造法 |
Publications (1)
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| FR2640144A1 true FR2640144A1 (fr) | 1990-06-15 |
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| FR8916280A Withdrawn FR2640144A1 (fr) | 1988-12-09 | 1989-12-08 | Procede de production de proteines non structurales du virus de l'encephalite japonaise |
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|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (2)
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|---|
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| VIROLOGY, vol. 161, 1987, pages 497-510, Academic Press, Inc.; H. SUMIYOSHI et al.: "Complete nucleotide sequence of the Japanese encephalitis virus genome RNA" * |
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