JPH10507933A

JPH10507933A - 可溶性で活性なｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼ

Info

Publication number: JPH10507933A
Application number: JP8534876A
Authority: JP
Inventors: ビマレンデュダスマハパトラ，; マイケルジー．マーレイ，; ラタラマナサン，; ナンシージェイ．バトキーウィッツ，
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 1995-05-12
Filing date: 1996-05-09
Publication date: 1998-08-04
Anticipated expiration: 2016-05-09
Also published as: MX9708678A; WO1996036702A2; AU5729196A; CA2220575A1; US5843752A; JP3091231B2; WO1996036702A3; CA2220575C; EP0826038A2

Abstract

(57)【要約】可溶化モチーフと融合したNS3プロテアーゼを含む可溶性HCV NS3プロテアーゼ。NS3プロテアーゼにより切断されない条件下でのNS3領域およびNS4領域の融合。細菌により発現された可溶性HCV NS3プロテアーゼ。細胞の総タンパク質の少なくとも１％が可溶性のHCV NS3プロテアーゼである宿主細胞。

Description

【発明の詳細な説明】可溶性で活性なＣ型肝炎ウイルスプロテアーゼ発明の背景Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）は、全世界の非Ａ非Ｂ型（NANB）肝炎、慢性肝臓疾患、および肝細胞ガン（HCC）の主要な病原体であると考えられる。ウイルス感染は、米国において90％を超える輸血関連の肝炎の原因であり、そして40歳を超える成人における優勢な型の肝炎である。ほぼ全ての感染は、慢性肝炎をもたらし、そしてほぼ20％は肝硬変を発症する。ウイルス粒子は、効率的なインビトロ複製系が無いため、および感染した肝臓組織または血液には非常に微量のHCV粒子しか存在しないために同定されない。しかし、ウイルスゲノムの分子クローン化が、感染したチンパンジーの血清からメッセンジャーRNA（mRNA）を単離し、次いで組換え方法論を用いてクローン化することにより達成された。［Grakoui A.らJ.Virol．67: 1385-1395(1993)］。現在、HCVは、約9400ヌクレオチドを含む正鎖RNAゲノムを含むことが知られている。この構成は、フラビウイルスおよびペスチウイルスの構成と同様である。HC Vのゲノムは、フラビウイルスおよびペスチウイルスのゲノムと同様に、約3000 アミノ酸の単一の大きなポリタンパク質をコードする。このポリタンパク質は、感染した細胞においてタンパク質分解を受けて成熟ウイルスタンパク質を形成する。ウイルスポリタンパク質の無細胞翻訳および細胞培養発現の研究は、HCVポリタンパク質が、細胞およびウイルスのプロテアーゼによりプロセシングされて推定の構造タンパク質および非構造（NS）タンパク質を産生することを確立した。少なくとも９つの成熟ウイルスタンパク質が、特異的なタンパク質分解によりポリタンパク質から産生される。切断産物の順番および名称は、以下の通りである：NH₂-Ｃ-E1-E2-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH（図１）。３つのアミノ末端の推定構造タンパク質であるＣ（キャプシド）、E1、およびE2（２つのエンベロープ糖タンパク質）は、宿主の小胞体（ER）のシグナルペプチダーゼにより切断されると考えられる。宿主の酵素はまた、NS2のアミノ末端の生成を担う。非構造タンパク質のタンパク質分解性プロセシングは、ウイルスのポリタンパク質内に含まれるウイルスプロテアーゼであるNS2-3およびNS3により行われる。NS 2-3プロテアーゼは、NS2とNS3との間の切断を触媒する。これはメタロプロテアーゼであり、そしてNS2およびNS3のプロテアーゼドメインの両方を必要とする。 NS3プロテアーゼは、ポリタンパク質の非構造部分の残りの切断を触媒する。NS3 タンパク質は、631アミノ酸残基を含み、そして２つの酵素ドメイン（アミノ酸残基１〜181内に含まれるプロテアーゼドメインおよび残りのタンパク質内に含まれるヘリカーゼATPaseドメイン）を含む。70kD NS3タンパク質が感染した細胞においてさらに切断されてプロテアーゼドメインをヘリカーゼドメインから分離するか否かについては知られていないが、細胞培養発現研究において切断は観察されない。 NS3プロテアーゼは、セリンクラスの酵素のメンバーである。これは、触媒トライアッド（triad）としてHis，Asp、およびSerを含み、Serは活性部位の残基である。Ser残基の変異は、基質NS3/4A、NS4A/4B、NS4B/5A、およびNS5A/5Bの切断をなくす。NS3とNS4Aとの間の切断は、分子内である一方、NS4A/4B、4B/5A、5 A/5B部位での切断はトランスで生じる。哺乳動物細胞における種々の形態のHCV NSポリタンパク質の一過性の発現を用いる実験は、これらの全ての切断の効率的なプロセシングのためにはNS3セリンプロテアーゼが必要であるが、十分ではないことを確立した。フラビウイルスと同様に、HCV NS3プロテアーゼはまた、これらの切断反応のいくつかを触媒するためにコファクターを必要とする。セリンプロテアーゼNS3に加えて、NS4Aタンパク質は、4B/5A部位での基質の切断に絶対的に必要とされ、そして5A/5B間、およびおそらく4A/4B間の基質の切断効率を増加させる。 HCV NS3プロテアーゼは、HCV複製に必要とされる非構造HCVタンパク質を切断するので、NS3プロテアーゼは、HCVウイルスに対する治療剤の開発のターゲットであり得る。HCV NS3タンパク質をコードする遺伝子は、米国特許第5,371,017号に開示されるようにクローン化されたが、このタンパク質は、可溶性で活性な形態では産生されていない。HCVプロテアーゼが治療剤を発見するためのスクリーニングにおけるターゲットとして有用である場合、プロテアーゼは、可溶性の活性な形態で産生されねばならない。従って、可溶性で活性な形態のHCVプロテアーゼが必要とされている。HCVプロテアーゼは、このプロテアーゼのインヒビターを検出するために、そして構造的研究に用いるために、大量に産生され、高スループット（high throughput）のスクリーニングに用いられ得る。発明の要旨本発明は、可溶性で活性なNS3プロテアーゼを提供することにより、この必要性を満たす。本発明の１つの実施態様において、可溶性のNS3プロテアーゼは、可溶化モチーフに融合されたHCVプロテアーゼを含む融合タンパク質内に含まれる。本発明はさらに、NS3プロテアーゼの触媒ドメイン、コファクターNS4Aのコファクタードメイン、および可溶化モチーフを含む可溶性の融合タンパク質を提供する。ここで、NS4Aコファクターは変異し、その結果、NS3プロテアーゼおよびN S4Aコファクターが、NS3プロテアーゼの触媒活性により切断されない。本発明はさらに、プロテアーゼに融合された３つ以上のヒスチジン残基を含む、ポリペプチドを有するHCV NS3プロテアーゼを提供する。これにより、プロテアーゼの迅速な精製が可能となる。本発明はさらに、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、および配列番号27からなる群より選択される、可溶性のHCV NS3プロテアーゼを提供する。本発明はさらに、本発明のHCVプロテアーゼをコードする、単離された核酸およびベクター、この核酸またはベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、核酸またはベクターが発現される条件下で培養する工程を含む、可溶性HCVプロテアーゼを作製する方法も請求の範囲に含まれる。本発明はさらに、可溶性HCV NS3プロテアーゼを発現し得る核酸またはベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。ここで、発現される可溶性HCV NS3プロテアーゼは、細胞により発現されるタンパク質全体の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、またはそれ以上である。発明の詳細な説明引用される全ての参考文献の教示は、それらの全体が参考として本明細書中に援用される。本発明は、可溶性形態におけるHCV NS3プロテアーゼの産生である。HCV NS3プロテアーゼは、プロテアーゼがその標的基質を切断するのを阻害する化合物を検出するためのスクリーニングに使用されるために、可溶性形態でなければならない。本発明者らは、可溶化モチーフを含むペプチドがNS3プロテアーゼのいずれか（好ましくはカルボキシル末端）に付着された場合、NS3プロテアーゼは容易に可溶性になることを見出した。 NS3プロテアーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列を、配列番号１に示す。本発明の前に、NS3プロテアーゼは、抽出および精製に十分な量で可溶性形態で細胞内で発現されなかった。さらに、可溶性HCV NS3プロテアーゼは細菌内で可溶性形態で産生され得なかった。細菌発現は大量のHCVプロテアーゼの発現の好ましい方法であるので、このことは重要である。本発明の可溶性HCV NS3プロテアーゼはいくつかの方法で産生され得る。可溶化モチーフをタンパク質に融合して、可溶性タンパク質を作製し得る。可溶化モチーフは、HCV NS3プロテアーゼに結合した任意の化学的部分であり、これにより、NS3プロテアーゼは緩衝化溶液中で可溶性になる。このような可溶化モチーフの例は、極性の側鎖を有するアミノ酸（好ましくは、正に荷電したアミノ酸）の鎖である。アミノ酸鎖は約４〜10アミノ酸残基長であるべきである。好ましいアミノ酸は、アルギニンおよびリジンである。可溶化モチーフの別の例は、両親媒性部分である。可溶化モチーフはNS3 プロテアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれにも融合され得る。カルボキシ末端に首尾良く融合されて可溶性NS3プロテアーゼを生成した配列は、- Arg-Lys-Lys-Lys-Arg-Arg-（配列番号２）である。これは、NS3プロテアーゼのカルボキシル末端に融合されて、配列番号３、配列番号４、配列番号８、および配列番号27のポリペプチドを生成した。作製された親水性アミノ酸残基テイルを有する可溶性HCV NS3プロテアーゼの他の例は、配列番号９および配列番号10である。本発明の別の実施態様において、可溶化モチーフを有さない可溶性HCV NS3プロテアーゼ（例えば、配列番号１および配列番号７に示すプロテアーゼ）もまた作製され得る。好ましくは、NS3プロテアーゼは、ニッケル（Ni²⁺）でコーティングした樹脂におけるタンパク質の精製に用いるために、そのアミノ酸末端に融合されたヒスチジンタグを有する。配列番号５を参照のこと。この実施態様において、プロテアーゼは、E．coliのような細菌において、不溶性の凝集物または封入体として産生される。不溶性HCV NS3プロテアーゼは、最初に、細菌の均質化または超音波処理により、細菌から抽出される。次いで、細菌を含有する凝集物を、５M塩酸グアニジン（GuHCl）溶液で可溶化する。次いで、サイズ排除クロマトグラフィーにより（例えば、SEPHACRYL S-300サイズ排除ゲルカラムにこの溶液をアプライすることにより）、高分子量凝集物からNS3プロテアーゼを精製する。５Ｍ GuCl中のNS 3プロテアーゼを含有する画分をプールし、そしてジチオスレイトールおよびラウリルマルトシドを含有するリフォールディング緩衝液中の約0.1M GuClに希釈する。次いで、希釈した溶液を逆相クロマトグラフィーカラムにアプライし、そしてNS3プロテアーゼを含有するプールを回収する。次いで、プロテアーゼ画分のpHを段階的な様式で、約7.4に上昇させ、正確にリフォールディングされた可溶性の活性なNS3プロテアーゼを生成する。 HCV NS3プロテアーゼは、コファクターであるNS4Aタンパク質（配列番号６）が存在する場合、HCV非構造タンパク質の切断において、非常により効率的であることもまた見い出されている。従って、本発明はまた、NS4Aコファクタードメインタンパク質とNS3プロテアーゼとの融合、特に、NS3プロテアーゼとNS4Aコファクターとの融合を包含し、ここで、NS4Aは、NS3プロテアーゼおよびNS4AコファクターがNS3プロテアーゼによって切断されないように変異されている。NS3と NS4Aとが融合した構築物の例を、配列番号７、８、９、10、および27に示す。本発明のNS3プロテアーゼをコードするDNAは、既知の核酸配列［Ratnerら、Nu cleic Acids Res．13:5007(1985)］、およびMatteucciら［J Am．Chem．Soc．10 3:3185(1981)］のホスホルアミダイト固体支持法、またはYooら［J．Biol．Ch em．764:17078(1989)］の方法のような標準的な方法を用いる化学的合成によって調製され得る。Glick，Bernard R.およびPasternak，Molecular Biotechnolog y :55-63頁（ASM Press，Washington D.C．1994）も参照のこと。プロテアーゼをコードする遺伝子はまた、Grakoui，A.，Wychowski，C.，Lin，C.，Feinstone ，S．M.およびRice，C．M.，Ｃ型肝炎ウイルスポリタンパク質切断産物の発現および同定、J．Virol 67:1385-1395(1993)に開示されたプラスミドを用いて得ることができる。さらに、HCVプロテアーゼをコードする核酸を、（HCVウイルスに感染した患者から）単離し、増幅し、そしてクローン化し得る。さらに、HCVゲノムは、PCT WO 89/04669に開示されており、そしてAmerican Type Culture Col lection（(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD）からATCC受託番号40 394のもとで入手可能である。もちろん、遺伝コードの縮重のため、本明細書中で規定されるような成熟ヒト HCVプロテアーゼをコードし得る多くの機能的に等価な核酸配列が存在する。化学的合成、改変されたプライマーを用いるPCR、および部位特異的変異誘発のような公知の方法を用いて容易に調製され得るこのような機能的に等価な配列は、本発明の範囲内にある。種々の発現ベクターを用いて、HCV NS3プロテアーゼをコードするDNAを発現させ得る。原核生物細胞または真核生物細胞における組換えタンパク質の発現に用いられる組換えタンパク質の発現に用いられる従来のベクターが用いられ得る。好ましいベクターとしては、Okayamaら、Mol．Cell．Blo.、第３巻:280-289(198 3)；およびTakebeら、Mol．Cell．Blol.、第８巻:466-472(1988)に記載されたpc Dベクターが挙げられる。他のSV40ベースの哺乳動物発現ベクターとしては、Kau fmanら、Mol．Cell．Biol.、第２巻:1304-1319(1982)および米国特許第4,675,28 5号に開示されたベクターが挙げられる。これらのSV40ベースのベクターは、COS 7サル細胞（ATCC番号CRL 1651）、ならびにマウスＬ細胞およびCHO細胞のような他の哺乳動物細胞において特に有用である。標準的なトランスフェクション法を用いて、大量のポリペプチドを発現する真核生物細胞株を作製し得る。真核生物細胞株としては、哺乳動物細胞株、酵母細胞株、および昆虫細胞株が挙げられる。代表的な哺乳動物細胞株としては、COS- 7細胞、マウスＬ細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞が挙げられる。Sambrookら、前出、およびAusubelら、前出を参照のこと。本明細書中に用いられる用語「形質転換された細菌」は、遺伝子操作されて哺乳動物タンパク質を産生する細菌を意味する。このような遺伝子操作は、通常、細菌中への発現ベクターの導入を必要とする。発現ベクターは、細菌ゲノム中の遺伝子に関する自律的複製およびタンパク質発現が可能である。細菌発現の構築は、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が公知であるか、さもなければ利用可能であるならば、当該分野で周知である。例えば、DeBoer、米国特許第4,551,433号は、細菌発現ベクターにおいて使用するためのプロモーターを開示する；Goeddelら、米国特許第4,601,980号、およびRiggs、米国特許第4,431,7 39号は、E．coli発現系による哺乳動物タンパク質の産生を開示する；そしてRig gs、前出、Ferrettiら、Proc．Natl．Acad．Sci．83:599(1986)、Sproatら、Nuc leic Acid Research 13:2959(1985)、およびMullenbachら、J．Biol．Chem 261: 719(1986)は、細菌における発現のための合成遺伝子を構築する方法を開示する。多くの細菌発現ベクターが市販されており、そしてAmerican Type Culture Co llection(ATCC)，Rockville，Marylandから入手可能である。ベクターへのヒトHCVプロテアーゼをコードするDNAの挿入は、DNAおよびベクターの両方の末端が同じ制限部位を含む場合、容易に達成される。そうでない場合は、DNAおよび/またはベクターの末端を、制限エンドヌクレアーゼ切断によって生成された１本鎖DNA突出を削り取る（digest back）ことによって改変し、平滑末端を生成するか、または適切なDNAポリメラーゼを用いて１本鎖末端をフィルイン（fill in）することによって同じ結果を達成することが必要であり得る。あるいは、所望の任意の部位は、末端にヌクレオチド配列（リンカー）を連結することによって作製され得る。このようなリンカーは、所望の制限部位を規定する特定のオリゴヌクレオチド配列を含み得る。切断されたベクターおよびDNA フラグメントはまた、必要な場合、ホモポリマーテーリングによって改変され得る。多くのE．coli適合性発現ベクターを用いて、本発明の可溶性HCV NS3プロテアーゼを産生し得る。これらのベクターとしては、細菌性プロモーターまたはバクテリオファージプロモーター（例えば、Tac、Lac、Trp、Lac UV5、1P_r、および1 P_Lプロモーター）を含むベクターが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、選択されるベクターは、HCVプロテアーゼ発現速度の調節を可能にする発現制御配列を有する。その上、HCVプロテアーゼ産生は調節されて、宿主細胞に対する毒性を示し得る過剰産生を回避し得る。最も好ましいのは、５'から３' に（上流から下流に）Tacプロモーター、lac I^qリプレッサー遺伝子、および成熟ヒトHCVプロテアーゼをコードするDNAを含むベクターである。本発明の使用のために選択されるベクターはまた、分泌リーダー（例えば、ompAまたはプロテインＡのリーダー）を、これらのリーダーが翻訳後プロセシングの間に切断されて成熟HCVプロテアーゼを産生するか、またはリーダーが切断されない場合、このリーダーがプロテアーゼの酵素活性を干渉しない限り、コードし得る。融合ペプチドは、代表的には、組換え核酸法または合成ポリペプチド法のいずれかによって作製される。核酸操作および発現のための技術は、一般に、例えば、Sambrookら（1989）Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第２版）第１〜３巻、Cold Spring Harbor Laboratory；およびAusubelら（編）（1993）Curr ent Protocols in Molecular Biology，Greene and Wiley，NYに記載される。ポリペプチドの合成のための技術は、例えば、Merrifield（1963）J．Amer．Chem ．Soc．85:2149-2156；Merrifield（1986）Science 232:341-347；およびStewar tら(1984)、「Solid Phase Peptide Synthesis」（第２版）、Pierce Chemical Co.，Rockford，IL.；およびAthertonら（1989）Solid Phase Peptide Synthesi s: A Practical Approach，IRL Press，Oxford；およびGrant（1992）Synthetic Peptides: A User's Guide，W．H．Freeman，NYに記載される。 NS4Aコファクターのようなより小さなペプチド、ならびにその基質である5A/5 Bおよび4B/5Aは、適切な方法（例えば、排他的固相合成、部分的固相法、フラグメント縮合、または古典的溶液合成）によって合成され得る。ポリペプチドは、好ましくは、Merrifield，J．Am．Chem．Soc．85:2149(1963)によって記載されるような固相ペプチド合成によって調製される。合成は、αアミノ末端が保護されているアミノ酸を用いて行われる。不安定な側鎖を有する三官能性アミノ酸もまた、適切な基で保護されて、ポリペプチドの組立ての間に、所望されない化学反応が生じるのを防止する。αアミノ保護基は選択的に除去され、アミノ末端で起こるその後の反応を可能にする。αアミノ保護基の除去のための条件は、側鎖保護基を除去しない。 α-アミノ保護基は、段階的なポリペプチド合成の分野で有用であることが知られる保護基である。これには、アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル）、アリール型保護基（例えば、ビオチニル）、芳香族ウレタン型保護基［例えば、ベンジルオキシカルボニル（Cbz）、置換ベンジルオキシカルボニル、および9-フルオレニルメチルオキシ-カルボニル（Fmoc）］、脂肪族ウレタン保護基［例えば、t-ブチルオキシカルボニル（tBoc）、イソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル］、およびアルキル型保護基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル）が含まれる。好ましい保護基は、tBocおよびFmocであり、従ってペプチドは、それぞれ、tBocおよびFmoc化学により合成されるといわれる。選択された側鎖保護基は、カップリングの間インタクトのままでなければならず、そしてアミノ末端の保護基の脱保護の間またはカップリング条件の間に除去されてはならない。側鎖保護基はまた、合成の完了の際に、完成されたポリペプチドを変化させない反応条件を用いて除去可能でなければならない。tBoc化学において、３官能性アミノ酸の側鎖保護基は、ほとんどがベンジルに基づく。Fmoc 化学において、これらはほとんどがtert-ブチルまたはトリチルに基づく。 tBoc化学において、好ましい側鎖保護基は、Argについてはトシル、Aspについてはシクロヘキシル、Cysについては4-メチルベンジル（およびアセトアミドメチル）、Glu、Ser、およびThrについてはベンジル、Hisについてはベンジルオキシメチル（およびジニトロフェニル）、Lysについては2-Cl-ベンジルオキシカルボニル、Trpについてはホルミル、およびTyrについては2-ブロモベンジルである。Fmoc化学において、好ましい側鎖保護基は、Argについては2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル（Pmc）または2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル（Pbf）、Asn、Cys、Gln、およびHisについてはトリチル、Asp、Glu、Ser、Thr、およびTyrについてはtert-ブチル、LysおよびTrpについてはtBocである。ホスホペプチドの合成のために、リン酸基の直接または組み立て後の取り込みのいずれかが用いられる。直接取り込みストラテジーにおいて、Ser、Thr、またはTyr上のリン酸基は、Fmoc化学においてはメチル、ベンジル、もしくはtert-ブチルにより、またはtBoc化学においてはメチル、ベンジル、もしくはフェニルにより保護され得る。リン酸保護を伴わないホスホチロシンの直接取り込みもまた、Fmoc化学において用いられ得る。組み立て後取り込みストラテジーにおいて、 Ser、Thr、またはTyrの保護されていない水酸基は、ジ-tert-ブチル-、ジベンジル-、またはジメチル-N,N'-ジイソプロピルホスホルアミダイトを用いて固相上で誘導体化され、次いでtert-ブチルヒドロペルオキシドにより酸化された。固相合成は、通常、α-アミノ保護された（側鎖保護された）アミノ酸を適切な固体支持体にカップリングすることにより、カルボキシル末端から行われる。付着がクロロメチル樹脂、クロロトリチル（chlortrityl）樹脂、またはヒドロキシメチル樹脂に対して行われる場合にエステル結合が形成され、そして得られるポリペプチドは、Ｃ末端に遊離のカルボキシル基を有する。あるいは、ベンズヒドリルアミン樹脂またはp-メチルベンズヒドリルアミン樹脂のようなアミド樹脂（tBoc化学について）およびRinkアミド樹脂またはPAL樹脂（Fmoc化学について）が用いられる場合、アミド結合が形成され、そして得られるポリペプチドはＣ末端にカルボキシアミド（carboxamide）基を有する。ポリスチレンもしくはポリアミドに基づくか、またはポリエチレングリコールでグラフト化されるか、ハンドルまたはリンカーを有するかまたは有しないか、付着した第１のアミノ酸を有するか有しないかによらず、これらの樹脂は市販され、そしてこれらの調製物は、Stewartら(1984)，「Solid Phase Peptide Synthesis」（第２版），Pier ce Chemical Co.,Rockford，IL.；およびBayerおよびRapp（1986）Chem.Pept.Pr ot.3,3；およびAthertonら（1989）Solid Phase Peptide Systhesis: A Practic al Approach，IRL Press，Oxfordに記載されている。必要であれば側鎖およびα-アミノ基で保護されるＣ末端アミノ酸は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIPC DI）、およびカルボニルジイミダゾール（CDI）を含む、種々の活性化剤を用いてヒドロキシルメチル樹脂に付着される。これは、そのセシウムテトラメチルアンモニウム塩の形態で、あるいはトリエチルアミン（TEA）またはジイソプロピルエチルアミン（DIEA）の存在下で、クロロメチル樹脂またはクロロトリチル樹脂に直接付着され得る。アミド樹脂への第１のアミノ酸の付着は、カップリング反応中のアミド結合の形成と同様である。樹脂支持体への付着の後、α-アミノ保護基は、保護化学（例えば、tBoc、Fmo c）に依存して種々の試薬を用いて除去される。Fmocの除去程度は、300〜320nm でまたは電導度セルによりモニターされ得る。α-アミノ保護基の除去後、残りの保護アミノ酸を、所望の配列を得るために必要とされる順序で段階的にカップリングする。種々の活性化剤が、カップリング反応のために用いられ得る。活性化剤は、DC C、DIPCDI、2-クロロ-1,3-ジメチルイミジウムヘキサフルオロホスフェート（CI P）、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-(ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（BOP）およびそのピロリジンアナログ（PyBOP）、ブロモ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（PyBro P）、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）、およびそのテトラフルオロボレートアナログ（ TBTU）またはそのピロリジンアナログ（HBPyU）、0-(7-アザベンゾトリアゾール -1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフエート（HATU ）、およびそのテトラフルオロボレートアナログ（TATU）またはピロリジンアナログ（HAPyU）を含む。カップリング反応に用いられる最も一般的な触媒添加物は、4-ジメチルアミノピリジン（DMAP）、3-ヒドロキシ-3,4,-ジヒドロ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン（HODhbt）、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOB t）、および1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール（HOAt）を含む。それぞれの保護アミノ酸は過剰（＞2.0当量）で用いられ、そしてカップリングは通常、N -メチルピロリドン（NMP）中、またはDMF、CH₂Cl₂もしくはそれらの混合物中で行われる。カップリング反応の完了程度は、Kaiserら，Anal．Biochem．34: 595 (1970)により記載されるように、それぞれの段階で、例えば、ニンヒドリン反応によりモニターされ得る。不完全なカップリングが見出される場合、カップリング反応は延長され、そして繰り返され、そしてカオトロピック塩が添加され得る。カップリング反応は、ABIモデル430A、431A、および433Aペプチド合成機のような市販の機器を用いて自動的に行われ得る。所望のポリペプチドの完全な組み立ての後、ポリペプチド樹脂を、適切なスカベンジャー（scavenger）を有する試薬を用いて切断する。Fmocペプチドは、通常、切断され、そしてスカベンジャー（例えば、H₂O、エタンジチオール、フェノール、およびチオアニソール）を有するTFAにより脱保護される。tBocペプチドは、通常、切断され、そして液体HFを用いて-5〜０℃で１〜２時間脱保護され、これは樹脂からポリペプチドを切断し、そしてほとんどの側鎖保護基を除去する。アニソール、ジメチルスルフィド、およびp-チオクレゾールのようなスカベンジャーは、通常、切断中に形成される陽イオンがポリペプチド中に存在するアミノ酸残基をアルキル化およびアシル化することを防ぐために液体HFとともに用いられる。Trpのホルミル基およびHisのジニトロフェニル基を、それぞれ、HF切断の前にDMF中のピペリジンおよびチオフェノールにより除去する必要がある。C ysのアセトアミドメチル基は、酢酸水銀(II)により、またはヨウ素、タリウム(I II)トリフルオロ酢酸、もしくはテトラフルオロボレート銀（これは同時に、システインをシスチンに酸化する）により除去され得る。tBocペプチド切断および脱保護に用いられる他の強力な酸は、トリフルオロメタンスルホン酸（TFMSA）およびトリメチルシリルトリフルオロ酢酸（TMSOTf）を含む。組換えDNA方法論はまた、ポリペプチドを調製するために用いられ得る。公知の遺伝コード（所望であれば、特定の宿主生物におけるより効率的な発現のために好ましい公知のコドンで組み立てられる）は、所望のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成するために用いられ得る。Matteucciら，J.Am.Chem .Soc．103: 3185(1981)のホスホルアミダイト固体支持方法または他の公知の方法は、このような合成に用いられ得る。得られるオリゴヌクレオチドは、適切なベクター中に挿入され得、そして適合する宿主生物中で発現され得る。本発明のポリペプチドは、HPLC、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、向流分配、または他の周知の方法を用いて精製され得る。本発明の好ましい実施態様において、NS3融合タンパク質はまた、以下に例示するようにNi⁺ カラムを用いる精製を容易にするヒスチジンタグを含む。 NS3プロテアーゼ、NS4コファクター、およびペプチド基質（4B/5Aまたは5A/5B のいずれか）を用いて、高スループットアッセイを開発し得る。これらを用いて、プロテアーゼのタンパク質分解活性を阻害する化合物についてスクリーニングし得る。化合物がNS3プロテアーゼによるウイルス基質の切断を阻害するか否かを決定するための技術を開発することによって、これは行われる。このような合成基質の例としては配列番号16、17、18、19、20、および21が挙げられる。基質が切断されない場合、ウイルスは複製し得ない。このような高スループットアッセイの１つの例には、シンチレーション近接アッセイ（scintillation proximit y assay）（SPA）がある。SPA技術は、シンチラント（scintillant）でコートしたビーズの使用を包含する。ビーズには、可逆的様式でリガンドまたは酵素と相互作用する受容体分子（例えば、抗体、レセプターまたは酵素基質）が結合する。典型的なプロテアーゼアッセイのために、基質ペプチドは、一方の末端でビオチン化され、そして他方の末端は、¹²⁵Ｉまたは³Ｈのような低エネルギーエミッターで放射性標識される。次いで標識した基質を、酵素とともにインキュベートする。次いで、アビジンをコートしたSPAビーズを添加し、ビオチンに結合させる。基質のペプチドがプロテアーゼによって切断されると、放射性エミッター（ radioactive emitter）は、シンチラントビーズの近傍にはもはや存在せず、そして光の放出は生じない。プロテアーゼのインヒビターは、基質をインタクトな (intact)ままにし、そしてインヒビターの存在下で生じて得られる光の放出によって同定され得る。別のタイプのプロテアーゼアッセイは、表面プラズモン共鳴（SPR）現象を利用する。表面プラズモン共鳴技術を利用する新規の高スループット酵素アッセイは、首尾良く開発されている。このアッセイおよび専用のBIAcore^TM装置を用いて、少なくとも1000サンプル／週を、96ウエルプレートフォーマットにおいて、酵素活性または酵素活性に対するサンプルの阻害効果のいずれかについてスクリーニングし得る。この方法論は、任意の酵素−基質反応に容易に適用し得る。SP Aアッセイに対する本アッセイの利点は、本アッセイが放射性標識ペプチド基質を必要としないことである。以下の実施例は、本発明を制限するのではなく、本発明を例示するために含まれる。実施例１ HCV NS3 プロテアーゼの産生Ａ．プラスミド構築。いくつかのプラスミドを、HCVプロテアーゼをE.coliで発現するために、標準的な組換えDNA技術(Sambrook，FritschおよびManiatis)を用いて設計および構築した（図２〜７）。全てのHCVの特定の配列は、親プラスミドpBRTM/HCV 1-3011 に由来した(Grakouiら、1993)。プロテアーゼのＮ末端の183アミノ酸バージョンを発現するために、停止コドンを、合成オリゴヌクレオチドを用いてHCVゲノムに挿入した（図３）。Ｎ末端246アミノ酸残基を発現するために設計されたプラスミドを、Ｃ末端の天然のNcol制限部位により作製した。 (i)プラスミドpBJ1015の構築（図２）完全なHCVゲノムを含むプラスミドpBRTM/HCV 1-3011(Grakoui Aら、J.Virol． 67:1385-1395)を、制限酵素ScaIおよびHpaIで消化し、そして7138bp(塩基対)DNA フラグメントを単離し、そしてpSP72(Promega)のSmaI部位にクローン化してプラスミドpRJ201を作製した。プラスミドpRJ201をMscIで消化して2106bpのMscIフラグメントを単離し、そしてプラスミドpBD7のSmaI部位にクローン化した。得られたプラスミドpMBM48をKasIおよびNcoIで消化し、そしてクレノウポリメラーゼでの平滑末端化後の734bpのDNAフラグメントを単離して、NcoI消化し、クレノウポリメラーゼ処理したpTrcHIS B配列発現プラスミド(Invitrogen)にクローン化した。この連結により、HCV配列の５'末端部位にNcoI部位および３'末端部位にNsi I部位が再生された。次いで、プラスミドpTHB HCV NS3をNcoIおよびNsiIで消化し、そしてクレノウポリメラーゼおよびT4 DNAポリメラーゼで処理し、平滑末端化した738bpのDNAフラグメントを生成した。このフラグメントを単離し、そして AspI切断、クレノウポリメラーゼ処理した発現プラスミドpQE30(HIV)にクローン化した。得られたプラスミドpBJ 1015は、HCV NS3(246アミノ酸)プロテアーゼを発現する。 (ii)アミノ酸183の後ろに停止コドンを有するプラスミドpTS 56-9の構築（図３）プラスミドpTHB HCV NS3をNcoIで消化し、クレノウポリメラーゼで処理し、次いでBstYIで消化した；そしてHCV配列を含むDNAフラグメントを単離し、そしてS maIおよびBglII消化したpSP72にクローン化した。次いで、得られたプラスミドp TS 49-27をBglIIおよびHpaIで消化し、そして２本鎖オリゴヌクレオチド： GA TCA CCG GTC TAG ATCT T GGC CAG ATC TAGA（配列番号11）を連結し、pTS56-9を作製した。従って、停止コドンは、NS3タンパク質のプロテアーゼ触媒ドメインをコードするDNAの末端に直接配置された。これは、HCVプロテアーゼがNS3タンパク質のヘリカーゼドメインから独立して発現されることを可能にした。 (iii)NS3 183のカルボキシ末端で正に荷電したアミノ酸のペプチドと融合されたプラスミドpJB 1006の構築（図４）。プラスミドpTS 56-9をSphIおよびBglIIで消化し、そしてHCV配列を含むDNAフラグメントを単離し、そしてSphI、BglII切断pSP72にクローン化した。得られたプラスミドpJB 1002を、AgeIおよびHpaIで消化し、２本鎖オリゴヌクレオチド、 CCG GTC CGG AAG AAA AAG AGA CGC TAG C AG GCC TTC TTT TTC TCT GCG ATC G（配列番号12）を連結してpJB 1006 を構築した。これにより親水性可溶化モチーフがNS3プロテアーゼに融合された。 (iv)E.coliにおいてHis-NS3(183)-HTを発現するプラスミドpBJ 1022の構築（図５）プラスミドpJB 1006をNgoMIおよびNheIで消化し、216bpのDNAフラグメントを単離し、そしてNgoMI、NheI切断pBJ 1015にクローン化してプラスミドpBJ 1019 を構築した。プラスミドpBJ 1019をNarIおよびPvuIIで消化し、そしてNarIフラグメントの５'末端をフィルインするためにクレノウポリメラーゼで処理した。発現プラスミドpQE31(Invitrogen)をBamHIで消化し、クレノウポリメラーゼで平滑末端化した。717bpのNarI-PvuII DNAフラグメントを単離し、そして発現プラスミドpQE31(Invitrogen)の2787bpのBamHI/クレノウ化-MscI(BalI)フラグメントに連結した。E.coliへの形質転換後に得られた組換えプラスミドpBJ 1022は、いずれのHIVプロテアーゼ切断部位配列も含まないHis NS3(2-183)-HTを発現する。このプラスミドはまた、CAT（クロラムフエニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子内に大きな欠失を含む。 (v)プラスミドpNB(-V)182-Δ4AHTの構築（図６）プラスミドpMBM 48をEagIおよびXhoIで消化し、クレノウポリメラーゼで処理し、320bpのDNAフラグメントを単離し、そしてBamHI切断、平滑末端化pSP 72にクローン化してプラスミドpJB 1004を構築した。320bpのフラグメントは、NS3(6 31)のカルボキシ末端から７つのアミノ酸、全てのNS4A、およびNS4Bのアミノ末端から46のアミノ酸をコードする。組換えプラスミドpJB 1004をEagIおよびCel2 で消化し、クレノウポリメラーゼで平滑末端化した。220bpのDNAフラグメントを単離し、そして連結の前にBamHIで消化し、クレノウポリメラーゼで平滑末端化した発現プラスミドpQE30にクローン化した。得られたプラスミドpJB 1011をNgo MIおよびHindIIIで消化し、そして２本鎖オリゴヌクレオチド、に連結し、プラスミドpNB 4A HTを構築した。プラスミドpNB 4AHTをMslIおよびX baIで消化した。1218bpのDNAフラグメントを単離し、そしてpBJ 1019のAgeI切断クレノウポリメラーゼ処理したXbaI切断ベクターDNAにクローン化した。この連結により、NS3における183番目のアミノ酸残基バリンがグリシン残基に置換され、そして接合部でNS4Aのアミノ末端の３つのアミノ酸残基の欠失が起こる。NS3( 18 2アミノ酸)-G-NS4A(4-54アミノ酸)を含む組換えプラスミドpNB182Δ4A HTは、NS 3/NS4A切断部位配列を接合部で含まず、そしてNS3の自己触媒活性により切断されない。最後に、プラスミドpNB182Δ4A HT（配列番号８）をStuIおよびNheIで消化し、803bpのDNAフラグメントを単離し、そしてStuIおよびNheI切断プラスミドpBJ 1022にクローン化した。得られたプラスミドpNB(-V)182-Δ4A HTは、NS3 配列のアミノ末端からのHIV配列の欠失およびCAT遺伝子における欠失を含む（配列番号27）。 (vi)プラスミドpT5 His HIV-NS3の構築（図７）プラスミドpTS56-9をBglIIで消化し、そして５'末端をフィルインするためにクレノウポリメラーゼで処理した。次いで、プラスミドをNgoMIで消化し、そしてNS3配列を含む平滑末端化BglII/NgoMIフラグメントを単離し、そしてSglI、クレノウ処理NgmMI切断、およびSalIクレノウ処理したpBJ 1015に連結した。得られたプラスミドをpT5His HIV 183と名付ける。実施例２可溶化モチーフを有するHCV NS3プロテアーゼの精製 His182HT （配列番号４）およびHis(-V)182Δ4AHT（配列番号８）の精製組換えプラスミドpBJ 1022およびpNB(-V)182Δ4Aを使用して、製造者により推奨される方法に従って、lacリプレッサーを過剰発現するE.coli M15株[pREP4](Q iagen)の異なる培養物を形質転換した。組換えプラスミドを有するM15[pREP4]細菌を、20g/Lのバクトトリプトン、10g/Lのバクト酵母抽出物、５g/LのNaClを含み、100μg/mlアンピシリンおよび25μg/mlカナマイシンを補充したブロス内で一晩増殖させた。培養物をO.D.600が0.1より低くなるように希釈し、次いで30℃ でO.D.600が0.6〜0.8になるまで増殖した。この後、IPTGを１mMの最終濃度で添加した。誘導から２〜３時間後、細胞をペレット化により採集し、そして細胞ペレットを100mM Tris(pH7.5)で洗浄した。細胞溶解物を以下のように調製した：ペレット化発酵ブロスのml等量物のそれぞれに、１mg/mlのリゾチームを有する5 0μlの超音波処理緩衝液(50mMリン酸ナトリウム(pH7.8)、0.3M NaCl)を添加した；細胞懸濁物を30分間氷上に置いた。次いで、懸濁物に最終濃度0.2％Tween-20 、10mMジチオトレイトール(DTT)を添加し、細胞破壊が完了するまで超音波処理した。不溶性物質をマイクロ遠心分離器で15分間、12,000×gでペレット化し、可溶性部分を別のチューブに取り出し、次いで、可溶性溶解物に最終濃度10％のグリセロールを添加した。プラスミドを発現する細胞由来の可溶性溶解物は、予想される分子量の強力な免疫反応性バンドを生じる。DTTの代わりに10mMβ-メルカプトエタノール(BME)を用いて、Ni²⁺カラム精製のために調製された可溶性溶解物を調製した。溶解物を-80℃で保存した。Ni²⁺- ニトロシル酢酸(NTA)アガロース(QIAGEN)を用いた精製次いで、タンパク質をNTAアガロースカラムに抽出した溶解物を入れることにより精製した。NTAアガロースカラムクロマトグラフィーを使用した。なぜなら、プロテアーゼのＮ末端に融合されたヒスチジンタグは、容易にニッケルカラムに結合するからである。このことは、可溶性プロテアーゼを迅速に精製するための効果的なアフィニティクロマトグラフィー技術をもたらす。カラムクロマトグラフィーをバッチモードで行った。Ni²⁺NTA樹脂（３ml)を、50mlの緩衝液Ａ（10 ％グリセロール、0.2％Tween20、10mM BMEを含む50mMリン酸ナトリウム(pH7.8) ）で２回洗浄した。250mlの発酵物から得られた溶解物(12.5ml)を、4℃で１時間、樹脂と共にインキュベートした。素通りを遠心分離により回収した。樹脂を1. 0×４cmカラムに充填し、そしてベースラインに達するまで緩衝液Ａで洗浄した。次いで、結合タンパク質を、緩衝液Ａ中の20mlのイミダゾール勾配（０〜0.5M ）で溶出した。溶出画分を、SDS-PAGEおよびHis-HIV 183に対するウサギポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析により評価した。回収された可溶性で活性なHCVプロテアーゼの量は、Bradfordアッセイ（米国特許第4,023,933号）により測定されるように、細胞により発現される全タンパク質の約５％に等しかった。POROS 金属キレートアフィニティカラムを用いた精製タンパク質を精製するための別の方法において、タンパク質を含む溶解物を、 POROS金属キレートアフィニティカラムに適用した。パーフュージョンクロマトグラフィーを、Ni²⁺で予め負荷したPOROS MC金属キレートカラム(4.6×50mm、1. 7ml)で行った。サンプルを10ml/分でアプライし、そしてカラムを緩衝液Ａで洗浄した。カラムを、25mMのイミダゾールを含む緩衝液Ａの10カラム容量で段階的に(step)溶出した。カラムを、緩衝液Ａ中の25カラム容量の25〜250mMイミダゾール勾配でさらに溶出した。全ての溶出画分を、SDS-PAGEおよびウサギポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析により評価した。回収された可溶性で活性なHCVの量は、Bradfordアッセイにより測定されるように、細胞により発現される全タンパク質の約５％に等しかった。実施例３ 5A/5B および4B/5A基質のペプチド合成ペプチド5A/5Bおよび4B/5A基質（配列番号16、18、19、20、および21）を、Fm oc化学を用いてABI431A型ペプチド合成器で合成した。製造者が推奨するFastMoc^TM 活性化ストラテジー(HBTU/HOBt)を、4Aアクチベーターペプチドの合成のために使用した。より強力なアクチベーターであるHATUを、添加剤HOAtの存在下、または非存在下で使用して、予め負荷したWang樹脂で5A/5B基質ペプチドをアセンブリした。ペプチドを樹脂から切断し、そして標準的なTFA切断プロトコルにより脱保護した。ペプチドを逆相HPLCで精製し、そして質量分析により確認した。実施例４合成5A/5Bペプチド基質を用いたHPLCアッセイ HCV NS3プロテアーゼのタンパク質分解活性を試験するために、DTEDVVCC SMSY TWTGK（配列番号16）および可溶性HCV NS3（配列番号27）を、アッセイ緩衝液に共に入れた。アッセイ緩衝液は、15％グリセロール、10mM DTT、0.2％Tween20、および200mM NaClを含む50mMリン酸ナトリウム(pH7.8)であった。配列番号27のプロテアーゼ活性は、２つの副産物ペプチド、すなわち5Aおよび5Bに基質を切断した。基質および２つの副産物ペプチドを、300Åの孔サイズおよび５μmの粒子サイズを有する逆相HPLCカラム(Dynamax、4.6×250mm)で分離した。カラムを、１分あたり１mlの流速で0.1％TFA（溶媒Ａ）を用いて平衡化した。基質および産物のペプチドの標品をＡで平衡化したカラムにアプライした。溶出を、アセトニトリルグラジエント（溶媒Ｂ＝Ａ中の100％アセトニトリル）を用いて行った。２つのグラジエント（50分間、５％〜70％Ｂ、続いて10分間、70％〜100％Ｂ）を溶出のために使用した。別の実験において、部分的に精製した配列番号27またはベクターコントロールを、30℃で３、７および24時間、100μMの基質と共にインキュベートした。反応混合物を、0.01％までのTFAの添加により停止し、そして逆相HPLCカラムにアプライした。各流出(run)からの画分を、質量分析および配列決定により評価した。実施例５インビトロ翻訳アッセイによるNS3プロテアーゼ活性の分析トランスでHCV NS3プロテアーゼ活性を検出するために、本発明者らは、無細胞翻訳系において、NS5A/5B切断部位を含む40kDタンパク質を発現させ、そしてこれをこの酵素の基質として使用した。基質タンパク質は、HCV NS3プロテアーゼによる切断の際に、見かけの分子量が12.5kD(NS 5A')および27kD(NS 5B')である２つのタンパク質生成物を生成する。基質5A/5BをコードするプラスミドpTS102を、EcoR Iを用いる消化により線状化し、そしてT7 RNAポリメラーゼを使用してインビトロで転写した。RNAを、製造者(Promega)のプロトコルに従い、ウサギ網状赤血球溶解物において、³⁵Ｓメチオニンの存在下で翻訳させてHCV特異的タンパク質を産生した。10mM Tris(pH 7.5)、１mM DTT、0.5mM EDTA、および10％グリセロールを含む20μlの総反応混合物中に、２〜８μlの³⁵Ｓメチオニン標識の翻訳された5A/5B基質を配置した。 10μlのHCV NS3プロテアーゼを、可溶化緩衝液(50mM リン酸Na(pH 7.8)、0.3M N aCl、0.2％ Tween 20、10mM DTTまたはBME、10％グリセロール)中に添加することによって反応を開始し、そしてこの反応物を30℃で特定の時間インキュベートした。等容量の２×Laemmliサンプル緩衝液(Enprotech Inc.)を添加し、そして100 ℃で３分間加熱することによって反応を停止した。反応生成物を、SDS PAGE電気泳動により分離し、ゲルを固定し、乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーに供した。インビトロで翻訳された基質を使用して、プラスミドpBJ1022およびpNB(-V)18 2Δ4A(配列番号４および27)を有するE.coliにより発現されたHCV NS3プロテアーゼをアッセイした。30℃でインキュベートされた２時間のアッセイにおいて、３、６、および10μlのpBJ1022粗可溶性溶解物は、5A/5B基質を用量反応性の様式で切断し得、期待された切断生成物：5A(12.5kD)および5B(27kD)(SDS PAGE分析により示されるように)を生じた。対応するベクターコントロール溶解物は、バックグランドを越えるいかなる切断活性をも示さなかった。pNB182Δ4A由来の粗可溶性溶解物は、このアッセイにおいて、よりずっと活性であった。わずか30分間のインキュベーションの後、ほんの0.125μl程度の細胞溶解物を用いて5Aおよび5B切断生成物を検出した。溶解物の量の増加により切断は増加し、１μlで最大に達した。本発明者らは、NS3プロテアーゼ活性のさらなる特徴付けのために、インビトロ翻訳アッセイにおいて、pNB182Δ4AのNS3プロテアーゼ活性の時間経過研究を行った。30℃にて、翻訳された5A/5B基質、および20μlの反応容量あたり１μl のpNB182Δ4A可溶性溶解物を含む反応物中で、5Aおよび5B切断生成物は、１分で出現し始め、そして2.5、５、10、および20分で時間と共に増加した。本発明者らは、pBJ1022およびpNB182Δ4Aの粗細胞溶解物を使用して、HCV NS3 プロテアーゼ活性を示し得たので、本発明者らは、これらの調製物から、細菌プロテアーゼを除去しようと努力して、発現されたタンパク質を少なくとも部分的に精製することを欲した。この目的のために、Ni²⁺結合リガンドを使用するアフィニティーカラムクロマトグラフィーが効果的であることを見出した。これは、発現されたタンパク質のアミノ末端でのヒスチジンタグを結合させ、続いてイミダゾール溶出により結合したタンパク質を遊離させる。Ni-NTAカラムにおいてpN B182Δ4Aの精製から得られたイミダゾール溶出画分を、インビトロ翻訳アッセイにおいて、活性について試験した。得られた画分はすべて、翻訳された5A/5B基質を切断し、期待される5Aおよび5B生成物を生じ得た。バックグランドの細菌プロテアーゼ活性はこれらの溶出画分において検出されなかった。上記のように、POROS Ni²⁺キレート樹脂およびパーフュージョンクロマトグラフィーを使用するNi²⁺キレートクロマトグラフィーの別法により、pBJ1022を精製した。NS3 183に対する抗体との免疫反応性についてポジティブであったイミダゾール溶出画分を、インビトロ翻訳アッセイによりHCVプロテアーゼ活性について試験した。HCVプロテアーゼに関するこのアッセイにおける活性の検出を最適化するために、反応物に、NS3プロテアーゼによる5A/5B部位での切断を増強することが示されているNS4Aコファクターに由来する短縮型ペプチドを補充した。コファクターを、NS4A(HCV-BK株)のアミノ酸22〜54を含む合成ペプチドとして最終濃度１μMで供給した。試験したすべての画分は、この翻訳アッセイにおいて活性であった。実施例６ 4A ペプチドによる増強 NS4Aは、哺乳動物細胞(NS3、NS4A、および下流の切断部位を含む種々のHCV非構造ポリタンパク質を、一過性に同時発現する)において、NS5A/5B部位でのNS3 セリンプロテアーゼ活性を増強し得る。本発明者らは、NS3プロテアーゼの供給源としての部分的に精製したE.coliで発現されたpBJ1022、およびNS4Aの種々の短縮物を含む合成ペプチドを使用して、十分に規定された無細胞生化学アッセイにおいて、この増強活性を研究した。本発明者らの最初の実験において、本発明者らは、酵素としてのpBJ1022の粗細胞溶解物、およびNS4A合成ペプチドであるアミノ酸22からアミノ酸54までの短縮型の33merであるカルボキシ末端をインビトロ翻訳切断反応に使用した。NS4AのＣ末端33アミノ酸ペプチドは、NS3触媒ドメインの活性を、0.01μMペプチドから1.0μMペプチドまで、用量依存的な様式で増強し、40kDの翻訳された5A/5B基質から期待された生成物、5A(12.5kD)および5B(27kD)を生じ得た。4Aペプチドなしでは、プロテアーゼ単独による比較的低い切断活性が、30分間の短いインキュベーション時間で観察された。4Aペプチドはそれ自体、またはベクタープラスミドを有する細胞から生成された粗溶解物との組合せで、基質を切断しなかった。 NS4Aの増強活性をさらに特徴付けるために、NS4A配列に対してさらなる短縮物を作製した。短縮型ペプチドを、Ni²⁺キレートカラムで精製したpBJ1022(NS3触媒ドメイン)を使用するインビトロ翻訳アッセイにおいて、その活性について評価した。本発明者らは、Ｃ末端33アミノ酸ペプチドに加えて、アミノ酸19〜36由来のNS4A配列を含む18アミノ酸ペプチドが、NS3媒介性切断活性を増強し得ることを観察した。他のペプチド(Ｎ末端21アミノ酸、ならびにカルボキシル末端部由来の２つのより短い短縮物である22merおよび15merを含む)は、いかなる効果をも有さないことが見出された。また、18アミノ酸の異種ペプチドもまた、増強活性を有さなかった。考察本明細書に記載の実験により、細菌が発現するHCVプロテアーゼは、トランス生化学アッセイにおいて、i)HCVポリタンパク質、およびii)合成ペプチド基質の切断を触媒することが明らかに示される。NS3触媒ドメインのプロセシング活性は、NS4Aおよびその誘導体により増強される。NS3触媒ドメインおよびNS4Aを含む融合タンパク質の活性は、NS3触媒ドメインのみの活性に対してかなり勝っている。 NS3プロテアーゼの触媒ドメインの疎水性分析は、このタンパク質が非常に疎水性であり、そしてまたこれは７つのシステイン残基を含むことを示す。疎水性を中和するため、従って溶解性を改善するために、本発明者らは、６つの正に荷電したアミノ酸残基を可溶化モチーフとして付加した。可溶化モチーフの付加は、酵素活性に影響を及ぼすことなく、溶解性を改善するようである。本発明者らはまた、日本型(Japanese)BK株由来のHCV NS4Aが、5A/5B部位でのH CV-HNS3媒介性切断を増強することを示している。このことは、認識の必須要素がHCVの種々の株間で保存され得ることを示唆する。上記の実験結果から、ヒスチジン融合NS3触媒ドメインのカルボキシ末端部における親水性テイル(可溶化モチーフ/誘水性(water attracting)構造)の付着により、E.coliにおける可溶性タンパク質の発現が改善されたことが明らかである。これらの実験において、６残基の正に荷電したアミノ酸が、タンパク質のカルボキシ末端部に付着される。可溶化モチーフの別の例は、HCV NS3プロテアーゼに融合されている両親媒性ヘリックステイル(荷電したアミノ酸および疎水性のアミノ酸残基を有し、荷電面および疎水性面の両方を形成するペプチド)である。このような融合タンパク質のカルボキシ末端における両親媒性ヘリックスの付加は、プロテアーゼの酵素活性に影響を及ぼすことなく、溶解性の改善を達成するための別の方法である。これらの実験に使用された親水性テイルは、６つのアミノ酸からなる。親水性アミノ酸の配列および長さは、可溶性タンパク質の最適な発現を達成するために変化され得る。従って、可溶化モチーフのサイズおよび荷電残基の性質は、E.co liにおける可溶性NS3の発現をもたらし得る。これらの誘水性構造/モチーフが、NS3触媒ドメインおよびNS3(触媒ドメイン)- 4A融合タンパク質の両端または一端(アミノ末端またはカルボキシ末端)に位置すること、あるいはこれをそのドメインおよび融合タンパク質内へ挿入することは、その活性に影響を及ぼすことなくタンパク質の溶解性を改善し得る。トリプシンスーパーファミリーのメンバー、およびフラビウイルスの他のメンバーのプロテアーゼに対する配列相同性に基づいて、NS3のアミノ末端181アミノ酸がHCV NS3プロテアーゼの触媒ドメインであることが予想される。最近、触媒ドメインのアミノ末端からの10アミノ酸の欠失およびカルボキシ末端からの２アミノ酸の欠失を含む169アミノ酸のタンパク質が完全な酵素活性を保持することもまた示されている。本発明者らが開発したモデルにより、アミノ末端からの26 アミノ酸の欠失およびカルボキシル末端からの２アミノ酸の欠失を含む154アミノ酸のタンパク質は、5A/5B基質に対する完全な酵素活性を保持することが予想される。 NS3プロテアーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列の解析は、このタンパク質が、凝集を引き起こし得る７つのシステイン残基(奇数)を含むことを示す。１つのシステイン残基(このタンパク質分子の表面に位置し、かつその活性には関与しない)の変異は、プロテアーゼ活性に影響を及ぼすことなくこのタンパク質の溶解性を改善し得る。無細胞生化学アッセイを使用して、本発明者らは、HCV NS4Aタンパク質の18アミノ酸を含む合成ペプチドが、NS3の触媒ドメインにより媒介されるNS5A/5B部位での切断を増強するに十分であることを示した。実施例７不溶性HCV NS3プロテアーゼのリフォールディング本実施例は、HCV NS3プロテアーゼのリフォールディングの新規のプロセスを記載する。HCV NS3プロテアーゼは、E．coli封入体ペレット由来の可溶化のモチーフを有さない。この手順を用いて、活性アッセイおよび構造研究のために精製された酵素を生成し得る。E.coli 封入体ペレット由来のHis-HIV 183の抽出および精製 HisHIV183のプラスミドを有するE.coli細胞を用いて、市販供給源により推奨される方法に従って、E.coli M15[pREP4]株(Qiagen)（これは、lacリプレッサーを過剰発現する）の培養物を形質転換した。組換えプラスミドを有するM15[pREP 4]細菌を、100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/mlのカナマイシンを補充した2 0-10-5ブロス中で一晩増殖させた。培養物をO.D.600が0.1になるように希釈し、次いでO.D.600が0.6〜0.8になるまで37℃で増殖させた後、１mMの最終濃度になるようにIPTGを添加した。誘導の２〜３時間後、細胞をペレット化することにより回収し、細胞ペレットを100mM Tris(pH 7.5)で洗浄し、そして遠心分離によりペレット化した。細胞ペレットを、ペレットの各gm湿重量あたり10mlの0.1M Tri s-HCl、５mM EDTA(pH8.0)(緩衝液Ａ)中に再懸濁した。Dounceホモジナイザーを用いてペレットをホモジナイズし、そして再懸濁した。懸濁液を20,000×gで30 分間、４℃で遠心分離することにより明澄化した。このペレットを以下の５つの緩衝液で連続的に洗浄した。１．緩衝液Ａ２．1.0M塩化ナトリウム(NaCl)含有緩衝液Ａ３．1.0％Triton X-100含有緩衝液Ａ４．緩衝液Ａ５．1.0MグアニジンHCl(GuHCl)含有緩衝液Ａ洗浄したペレットを５M GuHCl、１％βメルカプトエタノールを含有する緩衝液Ａ（ペレットgm湿重量あたり３ml）で、Dounceホモジナイザーを用いて可溶化し、100,000×gで30分間、４℃で遠心分離した。高分子量凝集物からの変性HisH IV183の精製を、SEPHACRYL S-300ゲル濾過カラム上でのサイズ排除により達成した。特に、5.0M GuHClのE.coli抽出物の8mlサンプルを、流速1.0ml/分で、160ml P harmacia S-300カラム(1.6×100 cm)にアプライした。カラム緩衝液は、5.0M Gu HCl、0.1M Tris-HCl(pH8.0)、および5.0mM EDTAを含んでいた。画分サイズは5.0 mlであった。適切な画分を、SDS-PAGEの結果ならびにProBlotへ転写されたタンパク質のＮ末端配列分析に基づいてプールした。HCV- プロテアーゼの界面活性剤に補助されるリフォールディングタンパク質を、43mm Amicon YM10膜を用いて限外濾過することにより、５M Gu HCl、0.1M Tris-HCl(pH8.0)、1.0mM EDTA、1.0％βメルカプトエタノール中で1. 0mg/mlまで濃縮した。次いで、これを50倍希釈してリフォールディング緩衝液(1 00 mM リン酸ナトリウム(pH8.0)、10mM DTL 0.1%ラウリルマルトシド)中で0.1M GuHClとし、そして混合物を氷上で少なくとも１時間インキュベートした。リフォールディング緩衝液中の500μgのタンパク質を含有する25mlのサンプルを、Pr o-RPC HR 3/5逆相クロマトグラフィーカラムにアプライした。アプライしたサンプルは、25mlのリフォールディング緩衝液中に500μgのタンパク質を含んでいた。次いでカラムに、99.9％H₂O＋0.1％トリフルロ酢酸(TFA)を含む溶液Ｂをアプライした。10ml容量の溶液Ｃ（10％H₂O、90％アセトニトリル(AcN)＋0.1% TFA）を、流速0.5ml/分および0.5mlの画分サイズで溶液Ｂ中に０〜60％勾配でカラムにアプライした。この画分を、A214;2.0吸収ユニットフルスケール(AUFS)でモニターした。タンパク質（ピーク１に対応する）を含有する画分を段階的な透析による再生のためにプールした。この画分をまず0.1％TFAを含有する25％グリセロール中で、一晩４℃で透析した；次いで、0.01％TFAを含有する25％グリセロール中で４ ℃で一晩透析した；次いで0.001％TFAを含有する25％グリセロール中で3.0時間透析した；次いで、50mM NaPO₄(pH6.0)、10mM ジチオトレイトール(DTT)を含有する25％グリセロール中で４℃で３時間透析した。次いでこのタンパク質を、50 mM NaPO₄(pH7.0)、0.15M NaCl、10mM DTTを含有する25％グリセロール中で４℃ で3.0時間透析した；次いで最後に、50mM NaPO₄(pH7.8)、0.3M NaCl、10mM DTT 、0.2％Tween 20を含有する25％グリセロール中で透析した。これにより、精製された、リフォールディングされた、可溶性の、活性なHCV NS3プロテアーゼが得られた。タンパク質の遠UV円偏光二色性(CD)分析を用いて、酸変性状態から中性pHにおける折りたたみ状態までのリフォールディングをモニターした。タンパク質の回収をUVスキャンおよびSDS-PAGE分析によりモニターした。結果： His-HIV183 の界面活性剤に補助されるリフォールディング HisHIV183をE.coli封入体ペレットから定量的に抽出した。抽出の様々な段階におけるSDS-PAGE分析は、連続的な洗浄が、混入しているタンパク質の有意の量を除去するために必須であるということを示す。HisHIV183を、５M GuHClの存在下で洗浄した封入体ペレットから抽出した。５M GuHCl抽出物をSEPHACRYL S-300 カラムにアプライし、そして適切な画分をSDS-PAGE分析に基づいてプールした。最初の10個の残基のアミノ酸配列を確認した。リフォールディングは、DTT、ラウリルマルトシド、およびグリセロールの存在下で、４℃で、非常に低いタンパク質の濃度において行った。希釈したタンパク質をPro-RPC逆相カラムで濃縮した。２つのピークをUVおよびタンパク質プロフィールに基づいて得た。ピーク１のみが段階的透析後に可溶性タンパク質を生じた。遠UV CDスペクトル分析を用いて、酸性pHでの変性状態から中性pHでの折りたたみ状態へのリフォールディングをモニターした。pH7.4において、タンパク質は有意な量の２次構造（βシートタンパク質の構造と一致する）を示すことが見出された。低pHでは、CDスペクトルは、タンパク質が200nmで最小モル楕円率を有する完全なランダムコイルであることを示した。220nmの肩の値に対する2 00nmのこの最小値の比は約４：１である。この比は２次構造形成が中性pHで起こる場合に減少した。透析の各段階でのUVスキャンは、タンパク質回収率がpH7.4まででは90％より大きく、そしてタンパク質凝集物に起因する光散乱効果が存在しなかったことを示した。SDS-PAGE分析はまた、リフォールディングの間、pH7.0まではタンパク質の損失がないということを示した。タンパク質の沈殿が、透析の最後の段階で生じ、そして可溶性タンパク質を遠心分離により明澄化した。全体のタンパク質回収率は約0.10％であった。リフォールディングされたタンパク質は、4Aペプチドの存在下でインビトロ翻訳された5A/5B基質を用いるトランス-切断アッセイにおいて活性であることが見出された。実施例８インビトロ翻訳アッセイによるリフォールディングされた NS3 プロテアーゼ活性の分析トランスでHCV NS3プロテアーゼ活性を検出するために、本発明者らは、無細胞翻訳系において、NS5A/5B切断部位を含む40kDタンパク質を発現させ、そしてこれをこの酵素の基質として使用した。基質タンパク質は、HCV NS3プロテアーゼによる切断の際に、見かけの分子量が12.5kD(NS 5A')および27kD(NS 5B')である２つのタンパク質生成物を生成する。基質5A/5BをコードするプラスミドpTS102を、EcoR Iを用いる消化により線状化し、そしてT7 RNAポリメラーゼを使用してインビトロで転写した。RNAを、製造者(Promega)のプロトコルに従い、ウサギ網状赤血球溶解物において、³⁵Ｓメチオニンの存在下で翻訳させてHCV特異的タンパク質を産生した。10mM Tris(pH7 .5)、１mM DTT、0.5mM EDTA、および10％グリセロールを含む20μlの総反応混合物中に、２〜８μlの³⁵Ｓメチオニン標識の翻訳された5A/5B基質を配置した。10 μlのHCV NS3プロテアーゼ(配列番号５)を、ほぼ等モル量(２μM)のカルボキシ末端33merコファクターNS4A(配列番号29)とともに、可溶化緩衝液(50mM リン酸N a(pH 7.8)、0.3M NaCl、0.2％ Tween 20、10mM DTTまたはBME、10％グリセロール)中に添加することによって反応を開始し、そしてこの反応物を30℃で約１時間インキュベートした。等容量の２×Laemmliサンプル緩衝液(Enprotech Inc.) を添加し、そして100℃で３分間加熱することによって反応を停止した。反応生成物を、SDS PAGE電気泳動により分離し、ゲルを固定し、乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーに供した。このアッセイは、用量反応性の様式で5A/5B基質を切断し、期待される切断生成物：5A(12.5kD)および5B(27kD)(SDS PAGE分析により示されるように)を生成し得た。5A/5B基質からの切断された5Aおよび5Bポリペプチドの生成は、可溶性で活性のリフォールディングされたHCVプロテアーゼが、確かに、実施例７のプロセスにより生成されたことの証拠である。実施例９表面プラズモン共鳴アッセイ本実施例は、表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、化合物がHCVプロテアーゼインヒビターとして有用であり得るかどうかを決定するための方法を例示する。図8Aおよび8Bはその技術を例示する。 BIAcore^TMは、生物特異的相互作用分析(Biospecific Inteeraction Analysis) のための処理ユニットである。この処理ユニットは、光学的検出システムと、オートサンプラーおよび微量流体力学システムとを統合する。BIAcore^TMは、生体分子間の相互作用をモニターするために、表面プラズモンの共鳴という光学的現象を用いる。SPRは、薄い金属フィルムの表面上での入射光子と電子との間の共鳴現象である。共鳴は厳密に規定された角度の入射光で生じる。この角度（共鳴角と呼ばれる）において、エネルギーは金属フィルム内で電子に転移し、その結果反射光の強度が減少する。SPR応答は、センサーチップ表面の極近くの屈折率の変化に依存する。そしてこれは表面に結合した分析物の質量に比例する。BIAcor eは共鳴ユニット(RU)の相対的なスケールにより共鳴角を連続的に測定し、そしてRUが時間の関数としてプロットされる、センサーグラム(sensorgram)でSPRシグナルとして共鳴角を示す。さらに、BIAcore^TMは、連続流体技術を用いる。ある相互作用体は、生体分子の相互作用に親水性の環境を提供する非架橋型のカルボキシルメチル化されたデキストランを含むセンサーチップ上に不可逆的に固定される。他の相互作用体を含有する溶液を、センサーチップ表面上に連続的に流す。溶液からの分子が固定されたリガンドに結合するので、共鳴角は変化し、シグナルが装置により記録される。この方法論において、酵素的反応は、現在入手可能な任意の高スループットアッセイについて従来的に行われるように、BIAcoreの外側で（すなわち、反応チューブまたは96ウェル組織培養プレート中で）行われる。SPRは、反応が停止した後に酵素の存在または非存在の溶液中に残存するインタクトな基質の量を決定するための検出手段としてのみ用いられる。酵素の添加前のインタクトな基質の量を測定するために、センサーチップ上の基質を捕獲する手段を確立しなければならなかった。さらに、BIAcore上での高スループットアッセイの要件を満たすために、基質は、分析完了後、連続的に表面から取り除かれる必要があった。これは、同じ表面が連続的な反応に用いられるために必要である。これらの２つの要件を達成するために、ホスホチロシンを基質の一方の末端に合成的に結合した。このホスホチロシンは、市販の抗ホスホチロシンモノクローナル抗体が入手できることにより選択した。この抗体は、標準的なアミンカップリング化学によりセンサーチップに共有結合される。永久的にチップに結合する抗ホスホチロシン抗体は、可逆的な様式でホスホチロシン含有基質を捕獲するために使用される。抗体-ホスホチロシン相互作用を最終的に用いて、種々の試薬（すなわち２M MgCl₂）での表面の再生により、所望される場合、ペプチド基質を捕獲および放出する。抗体表面へのインタクトなペプチドの導入は、装置によって検出される大きな質量を生じる。ペプチド切断の程度を追跡するために、ペプチド基質と酵素との混合物を所望の時間インキュベートし、次いで停止する。切断されたペプチドおよびインタクトなペプチドを含有するこの混合物の再生された抗体の表面への導入は、インタクトなペプチドのみを含有するサンプルについて検出される質量よりも低い質量値をもたらす。次いで、この２つの値の差を用いて酵素による切断後に残存しているインタクトなペプチドの正確な量を計算する。質量の減少は多くの大きな基質を用いて追跡され得るが、小さい質量の典型的な合成ペプチド基質（10〜20アミノ酸、１〜３ダルトン）のために、質量の差、従ってインタクトなペプチドと切断されたペプチドとの間の差は装置のシグナル対ノイズ比において非常に小さい。この低い感度を回避するために、本発明者らは、このペプチドのＮ末端にビオチンを結合した。チップの抗体表面へのタグ化したペプチドの注入の前に、ストレプトアビジンを添加し、そしてストレプトアビジンでペプチドをタグ化することによって、ストレプトアビジンの存在に起因するシグナルがより高くなる。このアプローチを用いて、ストレプトアビジンでタグ化されたＮ末端の半分を欠失する切断されたペプチドは、さらにより低いシグナルを生じる。 HCVプロテアーゼの5A-5Bペプチド基質であるDTEDVVACSMSYTWTGK（配列番号18 ）を、Ｃ末端でさらなるホスホチロシンを、そしてＮ末端でビオチンを用いて合成した。次いでこのビオチンをストレプトアビジンでタグ化した。抗ホスホチロシンモノクローナル抗体である4G10(Upstate Biotechnology Inc.，Lake Placid ，New York)をセンサーチップに結合した。HCVプロテアーゼの非存在下で、インタクトな、ストレプトアビジンでタグ化したビオチン化ホスホチロシンペプチドは、抗ホスホチロシンモノクローナル抗体(Mab)とのその相互作用より大きなシグナル（大きな質量ユニット／大きなシグナル）を生じた。ホスホチロシンビオチン化ペプチドのプロテアーゼ触媒の加水分解を96ウェルプレート中で行った。反応を等容量の水銀安息香酸(mercuribenzoate)で停止した。タグ化したストレプトアビジンを欠失している切断されたペプチド（より小さい質量）は、応答ユニットの喪失を生じる（より低いシグナル）。抗体表面は２M MgCl₂で繰り返し再生され得るので、この方法を用いて、多数の化合物をそれらの阻害活性について試験し得る。抗ホスホチロシンMabのセンサーチップへの結合のための手順抗ホスホチロシンMabを、以下の様式に従ってセンサーチップのカルボキシメチル化されたデキストラン表面へ結合する。結合手順を通して使用する流速は、５μl／分である。最初に、表面をNHS/EDC(N-ヒドロキシスクシンイミド／N-ジメチルアミノプロリル(dimethllaminopropyl)-N'-エチルカルボジイミド-HCl)35 μlの注入で活性化する。続いて、10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH＝4.0)の中のMa b 4G10(50μg/ml)の40mlを注入する。次いで、すべての残存している活性化されたエステルを、35μlの１M エタノールアミンの注入によりブロックする。これらの状態は、約7,500応答ユニット(420μM)の抗体の固定をもたらす。ペプチドの結合およびMab 4G10表面の再生 BIAcore分析を通じて使用する流速は、５μl／分である。ストレプトアビジンタグ化ペプチド（２μMのペプチド濃度、９μMのストレプトアビジン結合部位濃度）を含有する４μlの注入を行う。（応答ユニットで）抗体表面に結合したストレプトアビジンタグ化ペプチドの量を、注入が完了した30秒後に測定する。センサーチップ表面の再生 Mab 4G10表面の再生を、各ペプチド注入の後、２M MgCl₂の４μlのパルスを用いて達成する。500回までの表面再生はなお、タグ化ペプチドの100％の結合を示した。ペプチドおよびストレプトアビジンの光学濃度の決定光学的ペプチド濃度を決定するために、標準曲線を、過剰なストレプトアビジンの存在下で種々の量のペプチド（０〜10μM）を用いて作製した。直線範囲内の値（２μM）を、標準アッセイ条件について選択した。ペプチドを完全にタグ化するために必要なストレプトアビジンの量を、2.5μM のペプチド濃度を用いて、そしてストレプトアビジンの量を滴定することにより決定した（結合部位のμM）。すべてのペプチドは、３μMよりも高い濃度（ペプチド濃度に対しておよそ等量）のストレプトアビジンを用いた場合に完全にタグ化されたことが示された。９μMのストレプトアビジン濃度（4.5倍過剰）を標準アッセイ条件について選択した。HCV プロテアーゼに対する記載された方法論の適用Ｃ末端にホスホチロシン、およびＮ末端にビオチンを有するHCVプロテアーゼの5A/5Bペプチド基質である、DTEDVVACSMSYTWTGK（配列番号18）を合成する。抗ホスホチロシンモノクローナル抗体である4G10をセンサーチップに結合した。 HCVプロテアーゼの非存在下で、インタクトな、ストレプトアビジンでタグ化したビオチン化ホスホチロシンペプチドは、その抗ホスホチロシンモノクローナル抗体との相互作用により大きなシグナル（大きい質量ユニット／大きな応答ユニット）を生じる。ホスホチロシンビオチン化ペプチドのプロテアーゼ触媒の加水分解を96ウェルプレート中で行った。反応を水銀安息香酸を含む等容量の停止緩衝液を用いて停止した。ストレプトアビジンを、ビオチンに結合するペプチドをタグ化するために添加した。タグ化したストレプトアビジンを欠失している切断されたペプチド（より大きい質量）は、応答ユニットの喪失をもたらす。抗体表面は２M MgCl₂で繰り返し再生され得るので、この方法を用いて、多数の化合物をそれらの阻害活性について試験し得る。 HCVプロテアーゼによるペプチド切断活性を、BIAcoreに基づく方法論を用いて時間依存的な様式でモニターし得る。濃縮した酵素およびBIAcore基質であるビオチン -DTEDVVAC SMSYTWTGK-pY（配列番号17）を用いることにより、BIAcoreに基づくHCVアッセイを用いて、１時間以内に50％の基質切断が達成される。酵素の量、２時間以内での50％の切断に到達するために必要とされるHis-NS3(183)Δ 4AHT、高スループットアッセイの開発のために所望される時間のスケールに基づいて、本発明者らは、His-NS3(183)Δ4AHT構築物の１リットルの発酵が、BIAcor eにおける少なくとも100回の反応を行うために十分なプロテアーゼを生じると判断する。BIAcore に基づくHCVアッセイのためび標準的な操作手順反応緩衝液（50mM HEPES(pH 7.4)、20％グリセロール、150mM NaCl、１mM EDT A、0.1％Tween-20、1mM DTT）を希釈剤として用いて、反応物を96ウェル組織培養プレート中で調製する。最終反応容量は100μlである。ペプチドの最終濃度が 10μMになるように、ペプチドのみを含有するサンプル（ビオチン-DTEDVVAC SMS YTWTGKpY）を、10μlの100μMペプチドストック（反応緩衝液中で調製した）の9 0μlの反応緩衝液への添加により調製する。ペプチドおよび酵素の最終濃度がそれぞれ10μMおよび0.1μMになるように、ペプチドおよび酵素を含有するサンプルを、10μlの100μMペプチドストックおよび10μlの1.7mg／mlの部分的に精製されたHis-NS3(183)-Δ4A-HTストック（両方とも反応緩衝液中で調製した）の、 80μlの反応緩衝液への添加により調製する。この反応を特定の時間30℃で保ち、次いで停止させる。停止は、反応混合物の20μlのアリコートを、等容量のPMB 停止緩衝液（50mM HEPES(pH 7.8)、150mM NaCl、5mM P-ヒドロキシ水銀安息香酸、および13mM EDTA）を含有する新しい組織培養プレートに移すことにより達成する。センサー表面上への注入のための停止した反応混合物を調製するために、30μ lのPMB BIAcore緩衝液（50mM HEPES(pH 7.4)、1M NaCl）および30μlのストレプトアビジン(水中で0.5mg/ml)を、最終容量が100μlになるように、40μlの停止した反応混合物に添加する。この工程で、サンプルの注入の前に、すべてのペプチドをストレプトアビジンでタグ化する。最後に、４μlのこのサンプルを、切断されたペプチドに対してインタクトなペプチドを決定するために抗ホスホチロシンの表面に注入する。BIAcoreサンプル中のペプチドおよびストレプトアビジンの最終濃度は、それぞれ、２μMおよび９μMである。実験条件；基質： DTTを含まない反応緩衝液中のビオチン-DTEDVVAC SMSYTWTGK-pY （配列番号19）濃度： 170μM（粗ペプチド、重量に基づく）酵素： 10μlの濃縮された1.7mg/mlのHis-NS3(183)-Δ4A-HT 反応容量： 100μl反応緩衝液： 50mM HEPES(pH 7.8) 20％グリセロール 150mM NaCl １mM EDTA １mM DTT 0.1％Tween-20温度： 30℃停止： p-ヒドロキシ水銀安息香酸

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ラマナサン，ラタアメリカ合衆国ニュージャージー 07052，ウエストオレンジ，バレーウェイ 32 (72)発明者バトキーウィッツ，ナンシージェイ. アメリカ合衆国ニュージャージー 07060，プレインフィールド，オークレーン 1000

Claims

【特許請求の範囲】１．可溶性のHCV NS3プロテアーゼであって、不溶性で組換えにより産生されたH CV NS3プロテアーゼ凝集物から、 (a)HCV NS3プロテアーゼの不溶性の凝集物を、該凝集物を産生する細菌から抽出する工程； (b)該HCV NS3プロテアーゼの凝集物を、変性試薬を含有する緩衝液中で可溶化する工程； (c)工程(b)からの該可溶化したHCV NS3プロテアーゼを、還元剤を含有する緩衝液中に配置する工程であって、該緩衝液が酸性pHを有する工程； (d)該変性剤を、該緩衝液が酸性pHを維持する条件下で該緩衝液から除去する工程；および (e)該HCV NS3プロテアーゼを含有する該緩衝液のpHを段階的な様式で、約７〜８のpHまで上昇させて、適切にリフォールディングした可溶性で活性なHCV NS3 プロテアーゼを産生する工程、を包含するプロセスにより産生される、HCV NS3プロテアーゼ。２．HCV NS3プロテアーゼであって、HCV NS4Aコファクターに融合したHCV NS3プロテアーゼを有し、ここで、該コファクターはHCV NS3プロテアーゼによる切断を防ぐために１つ以上のアミノ酸残基の欠失または置換により改変されている、 HCV NS3プロテアーゼ。３．前記プロテアーゼに融合した可溶化モチーフをさらに有する、請求項２に記載のHCV NS3プロテアーゼ。