JPH07184648A

JPH07184648A - Ｈｃｖプロテイナーゼ活性物質、その製造法並びに同プロテイナーゼおよび同プロテイナーゼ阻害剤のアッセイ法

Info

Publication number: JPH07184648A
Application number: JP5018854A
Authority: JP
Inventors: Kunitada Shimotoono; 邦忠下遠野; Makoto Hijikata; 誠土方; Noriyuki Kato; 宣之加藤; Yuuko Ootsuyama; 祐子大津山; Hiroshi Nibuya; 博丹生谷; Nobuko Kakiuchi; 信子垣内; Yasumasa Komoda; 泰正菰田; Yasutsugu Motoi; 康嗣許斐; Yasunori Tanji; 保典丹治; Yuji Hirowatari; 祐史広渡
Original assignee: SOUYAKU GIJUTSU KENKYUSHO KK; Sumitomo Metal Industries Ltd
Current assignee: SOUYAKU GIJUTSU KENKYUSHO KK; Nippon Steel Corp
Priority date: 1992-02-07
Filing date: 1993-02-05
Publication date: 1995-07-25

Abstract

(57)【要約】【目的】Ｃ型ウイルス性肝炎治療薬の開発のため、
（１）ウイルス蛋白分解酵素を大量生成する方法を確立
し、（２）その機能を検討し、活性あるウイルス蛋白分
解酵素を得、さらに（３）該酵素を用いて、該酵素およ
び該酵素の阻害剤のアッセイ法を開発することを目的と
する。【構成】非Ａ型非Ｂ型肝炎患者の血漿より調製したＲ
ＮＡを基にｃＤＮＡを調製し、これらのうち、８９８−
１２３３番目または９９２−１９０７番目のアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ断片がＨＣＶプロテイナーゼ活性
を有することを見いだし、該ＨＣＶプロテイナーゼをコ
ードする遺伝子をクローニングした。これを用い、ＨＣ
Ｖプロテイナーゼ物質を発現させた。さらに、上記ＨＣ
ＶプロテイナーゼによるＨＣＶウイルス蛋白の切断部位
を特定した。【効果】新規なＨＣＶプロテイナーゼ物質を大量に生
産することができ、これによって抗ＨＣＶ剤として有用
なプロテイナーゼ阻害剤を有効に検出することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗ＨＣＶ剤として有用と
考えられるＨＣＶプロテイナーゼ阻害物を検出するため
に有用なＨＣＶプロテイナーゼを大量に提供することに
関するものである。また同ＨＣＶプロテイナーゼの製造
法、並びに同プロテイナーゼおよび同プロテイナーゼ阻
害剤のアッセイ法にも関する。

【０００２】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は大部分の輸
血後非Ａ非Ｂ型肝炎の原因ウイルスと考えられており
［Ｑ．−Ｌ．Ｃｈｏｏ，ｅｔａｌ．，サインエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２４４，３５９，（１９８９），
Ｇ．Ｑｕｏ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，３
６２，（１９８９）］、近年、その遺伝子がｃＤＮＡと
してクローニングされ、その構造のほぼ全容が明らかに
されている。日本型ＨＣＶゲノムは約９４００ヌクレオ
チドの＋鎖の一本鎖ＲＮＡからなり、３０１０アミノ酸
をコードする９０３０ヌクレオチドのタンパク質読み枠
（ＯＲＦ：ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，オ
ープンリーディングフレーム）が存在している［Ｎ．Ｋ
ａｔｏ，ｅｔａｌ．，プロシージングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエス
エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ），８７，９５２４，（１９９０）］。ＨＣＶの塩基
配列とアミノ酸配列を別紙配列表（配列番号：２２）に
示す。しかしながら、現在ウイルス粒子の精製が困難で
あり、ウイルスを産生する培養細胞が得られていないこ
となどからウイルス粒子やウイルスタンパク質の実体は
まだ明らかになっていない。ＯＲＦのアミノ酸配列の相
同性や遺伝子の構造などから、ＨＣＶはフラビウイルス
やペスチウイルスと比較的近縁であることが示されてい
る［Ｎ．Ｋａｔｏ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，９５２４，（１
９９０）］が、これら近縁ウイルスの各種ウイルスタン
パク質は、ＨＣＶと同様に一つの巨大なＯＲＦにコード
され、翻訳時あるいは翻訳後に細胞性のプロテイナーゼ
であるウイルス自身のプロテイナーゼによって切断、プ
ロセスされて産生されることが知られている。これらの
ウイルスは共通してそのＯＲＦアミノ末端側にウイルス
粒子を構成するウイルス構造タンパク質、そのカルボキ
シル末端（Ｃ末端）側に非構造タンパク質がコードされ
ていると考えられている。本発明者らは既に、ＨＣＶ−
ＯＲＦのアミノ末端（Ｎ末端）側にはウイルスコアタン
パク質と考えられるｐ２２とウイルス外被タンパク質と
考えられる２つの糖タンパク質ｇｐ３５，ｇｐ７０がＮ
末端側から順にコードされ、各々翻訳と共役して細胞小
胞体に存在するシグナルペプチダーゼによって切断され
産生されることを無細胞転写翻訳実験系を用いて示して
いる［Ｍ．Ｈｉｊｉｋａｔａ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５５４７，
（１９９１）］。ＨＣＶ−ＯＲＦ非構造タンパク質領域
にはコンピューターによるアミノ酸配列の相同性解析か
ら他の近縁ウイルス同様にキモトリプシン様セリンプロ
テイナーゼとの相同配列が認められ、ＨＣＶ非構造タン
パク質の切断、産生に必要なＨＣＶプロテイナーゼの存
在が示唆されている［Ｎ．Ｋａｔｏ，ｅｔａｌ．，フェ
ブス・レターズ（ＦＥＢＳＬｅｔｔ．），２８０，３
２５，（１９９１）］。

【０００３】一方、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１５５７５に
おいてｈＳＯＤとＨＣＶの一部分との融合蛋白を切断す
る物質が開示されているが、このものはプロテイナーゼ
の上流側（確かな位置は不明）を切断するセリンプロテ
アーゼと推定されている。しかしながら、上記の非構造
タンパク質領域のプロセッシング様式が充分に解明され
ているとは言えず、またこのプロテイナーゼ活性を持つ
タンパク質分子の検出も研究の緒についたところであ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本邦に於ける非Ａ非Ｂ
型肝炎はそのほとんどがＨＣＶの感染に因るものである
ことが判明した。Ｃ型ウイルス肝炎は年間約５０〜６０
万人の発症をみ、しかも高率で慢性化して慢性肝炎に、
さらに高率で肝硬変、肝癌に移行する。Ｃ型ウイルス性
肝炎の治療にはインターフェロンが最も有効であった
が、その治癒率は約３０％と低く、かつ慢性肝炎では治
癒率は著しく低下する。また、インターフェロンを大量
に長期投与するための白血球減少、悪寒、食欲不振等の
副作用も無視できない。そこで新たなより効果の高い薬
剤が求められている。ウイルスプロテイナーゼはウイル
スタンパク質の産生に必須である為、ウイルスの増殖に
必要不可欠である。またその基質特異性は一般に高い
為、このウイルスプロテイナーゼ活性に対する阻害物質
は副作用の少ない有効な抗ウイルス剤となる可能性が期
待される。そのような抗ウイルス剤を提供するために
は、該阻害物質の検索のために必要なＨＣＶプロテイナ
ーゼ活性物質の大量提供が必要であり、本発明はそのた
めの（１）新規なＨＣＶプロテイナーゼ活性物質の同
定、単離、更にはそれを用いたＨＣＶプロテイナーゼー
の発現、並びに（２）該ＨＣＶプロテイナーゼ活性物質
を用いる、同プロテイナーゼおよび同プロテイナーゼ阻
害剤のアッセイ法の開発を課題とするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するべく鋭意研究の結果、ＨＣＶプロテイナーゼ
活性物質をコードする新規な遺伝子を得、これを用い、
ＨＣＶプロテイナーゼ活性物質を発現させることに成功
した。

【０００６】また、ＨＣＶプロテイナーゼ活性物質によ
って切断されるＣ型肝炎ウイルスの切断個所のいくつか
を特定することにも成功した。更に、ＨＣＶプロテイナ
ーゼ活性測定系を構築し、その測定系を用いた同プロテ
イナーゼの阻害剤のスクリーニング法を開発して本発明
を完成するに至った。

【０００７】なお、現在ＨＣＶには異なった遺伝子型が
いくつか存在し、各遺伝子型間にはそれぞれ約１０％か
ら３０％ほどの塩基配列の相違が存在することがわかっ
ている。本発明においては、日本で最も主要な遺伝子型
である日本型ＨＣＶ（ＨＣＶ−Ｊ）（Ｋａｔｏら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８
７：９５２４−９５２８，１９９０）を用いて実験し、
この塩基配列をもとに記載する。

【０００８】すなわち、本発明者等は非Ａ非Ｂ型肝炎患
者の血漿より調製したＲＮＡを基にＨＣＶのｃＤＮＡを
調製し、このｃＤＮＡを切断して種々のＤＮＡ断片を
得、これらのＨＣＶプロテイナーゼ活性について検討し
たところ、これらの内、ＨＣＶ−ＯＲＦ上８９８−１２
３３番目（配列番号：１）または９９２−１９０７番目
（配列番号：２）の新規なアミノ酸配列もしくはその一
部をコードする新規な配列のＤＮＡ断片がＨＣＶプロテ
イナーゼ活性を有するための最小単位であることを見出
した。上記２つのＤＮＡ断片のうち、前者は、最終ウイ
ルス産物としてのプロテイナーゼの上流を切断するもの
であり、このものは前記公知のＷＯ９１／１５５７５が
セリンプロテイナーゼと推定されていたのに対して、セ
リンプロテイナーゼとは異なるプロテイナーゼであり、
また後者は、最終ウイルス産物としてのプロテイナーゼ
の下流を切断するセリンプロテイナーゼを含む。このよ
うなものは本発明で初めて見出されたものである。

【０００９】すなわち、本発明は（１）ＨＣＶプロテイナーゼの上流部位の切断能を有
し、アミノ酸配列（配列番号：１）もしくはその一部を含有するプロテイ
ナーゼ、（２）ＨＣＶプロテイナーゼの下流部位の切断能を有
し、アミノ酸配列（配列番号：２）もしくはその一部を含有するプロテイ
ナーゼ、（３）（配列番号：１）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡも
しくはその一部を含有するＤＮＡ配列、（４）（配列番号：２）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡも
しくはその一部を含有するＤＮＡ配列、（５）（配列番号：３）もしくはその一部を含有する上記
（３）記載のＤＮＡ配列、（６）（配列番号：４）もしくはその一部を含有する上記
（４）記載のＤＮＡ配列、（７）上記（３）、（４）、（５）または（６）記載の
ＤＮＡ配列を含むベクター、（８）上記（７）記載のベクターで形質転換した形質転
換体、（９）上記（８）記載の形質転換体を培養することから
なる、上記（１）もしくは（２）記載のプロテイナーゼ
の製造法、（１０）（１）または（２）記載のプロテイナーゼを用
いて、Ｃ型肝炎ウイルス蛋白の切断反応の進行を検出す
ることからなる、Ｃ型肝炎ウイルスプロテイナーゼ活性
のアッセイ法において、（i）該精製したＣ型肝炎ウ
イルスプロテイナーゼと、Ｃ型肝炎ウイルスプロテイナ
ーゼによって切断されるアミノ酸配列を含む基質ポリペ
プチドとを試験管内で反応させる系、あるいは（ii）
大腸菌、動物培養細胞、昆虫細胞、またはウサギ網状赤
血球溶血液を用いる無細胞翻訳系で、Ｃ型肝炎ウイルス
プロテイナーゼと基質蛋白質とを同時に発現させ、細胞
内または無細胞翻訳系内でプロテイナーゼと基質を反応
させる系、を用いる上記アッセイ法、および（１１）（１）または（２）記載のプロテイナーゼを用
いて、反応系に試験化合物を添加し、Ｃ型肝炎ウイルス
蛋白の切断反応の進行を、試験化合物添加のものと添加
しないものとで比較することからなる、Ｃ型肝炎ウイル
スプロテイナーゼ阻害剤のアッセイ法において、（i）
該精製したＣ型肝炎ウイルスプロテイナーゼと、Ｃ型
肝炎ウイルスプロテイナーゼによって切断されるアミノ
酸配列を含む基質ポリペプチドとを試験管内で反応させ
る系、あるいは（ii）大腸菌、動物培養細胞、昆虫細
胞、またはウサギ網状赤血球溶血液を用いる無細胞翻訳
系で、Ｃ型肝炎ウイルスプロテイナーゼと基質蛋白質と
を同時に発現させ、細胞内または無細胞翻訳系内でプロ
テイナーゼと基質を反応させる系、を用いる上記アッセ
イ法、に関するものである。

【００１０】本発明におけるＨＣＶプロテイナーゼ活性
物質をコードする遺伝子は、上記の８９８−１２３３番
目（配列番号：１）または９９２−１９０７番目（配列
番号：２）アミノ酸配列をコードするものがその最小単
位として挙げられるが、この他、配列番号１に関するも
のとして７２２−１９０７番目、７２２−１６４７番
目、７２２−１４６６番目、７２２−１３２５番目、７
２２−１２３３番目、８９８−１９０７番目、８９８−
１３２５番目のアミノ酸配列をコードするものが、また
配列番号２に関するものとしては７２２−１９０７番
目、８９８−１９０７番目、９９２−１９０７番目のア
ミノ酸配列をコードするものが挙げられる。しかしなが
ら、本発明においては上記遺伝子と実質的に同一の機能
を有する範囲において塩基配列が置換、挿入、あるいは
欠失したものでもよい。

【００１１】本発明におけるＨＣＶプロテイナーゼ活性
物質をコードする遺伝子は、以下の方法で得ることがで
きる。

【００１２】非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血漿よりＲＮＡを調
製し、Ｎ．Ｋａｔｏ，ｅｔａｌ．，プロシージングス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ），８７，９５２４，（１９９０）の方法
によりｃＤＮＡを調製する。これらのうち、必要な遺伝
子断片を結合し、８９８−１２３３番目または９９２−
１９０７番目のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ断片を得ることができる。ＤＮＡ断片の結
合には、重複する領域の中で共通して存在する制限酵素
部位を利用する方法（結合方法１）、あるいは適切な制
限酵素部位がない場合はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）法により、結合可能な重複ＤＮＡ断片を合成し、こ
れを介して制限酵素部位で結合させる方法（結合方法
２）等を利用できる。また、公知の配列を基に、８９８
−１２３３番目または９９２−１９０７番目を含むアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を合成することによ
り、得ることができる。

【００１３】ＨＣＶプロテイナーゼは上記遺伝子を用
い、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞、ウサギ網状赤血球溶
血液等で発現させることができる。

【００１４】大腸菌でのプロテイナーゼの産生に用いる
プラスミドベクターとしては、ｐＴＺ１８、ｐＴＺ１
９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＫＳ、ＳＫ、ｐＨＳＧ３９８、ｐＲＳＥＴ、ｐＧＥＸ−
２Ｔ、ｐＲＩＴ２Ｔなどが挙げられる。発現したプロテ
イナーゼの安定性を増し、精製が容易に行えるように、
プロテイナーゼのアミノ酸末端側にマルトースバインデ
ィングプロテイン（ＭＢＰ）との融合した状態で発現す
るｐＭＡＬ−ｃなどが好ましい。発現に用いる大腸菌株
としてはＨＢ１０１、ＴＢ１、ＪＭ１０５などを用いる
ことができるが、組換えプラスミドの変異が起こりにく
いｒｅｃＡ^-の菌株ＪＭ１０９が好ましい。

【００１５】ウサギ網状赤血球溶血液を用いた無細胞翻
訳系ではベクタープラスミドとしてＴ７ＲＮＡポリメ
ラーゼの強力なプロモーターをもつｐＴＺ１８Ｒなどが
好ましい。

【００１６】動物培養細胞で発現する場合には、強力な
プロモーターであるサイトメガロウイルスのプロモータ
ーとエンハンサーにＨＣＶプロテイナーゼ遺伝子をつな
ぎ、下流にＳＶ４０ポリアデニレーションシグナルをつ
なぐことで高レベルで安定な発現ができる。発現ベクタ
ーには、ｐＳＶ２−ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ、ｐ９１
０２３（Ｂ）、ＣＤＭ８、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６、Ｂ
ＣＭＧＳＮｅｏなどを用いることができる。作成した組
換えプラスミドを動物細胞に導入する方法としては、リ
ン酸カルシウム法、Ｃｈｅｎ−Ｏｋａｙａｍａ法、ＤＥ
ＡＥデキストラン法などを用いることができる。使用で
きる動物細胞としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａなど
を含む。

【００１７】昆虫培養細胞でプロテイナーゼを発現する
場合には、バキュロウイルスベクターを用いることがで
きる。ウイルスベクターの作成にあたっては、まず発現
しようとする外来遺伝子をトランスファーベクターに組
み込む。トランスファーベクターは、通常の大腸菌プラ
スミドが本体で、ポリヘドリン遺伝子の上流数ｋｂと下
流数ｋｂずつが外来遺伝子をクローニングする部位で連
結された配列を含む。野生型ウイルスＤＮＡとともに細
胞内に導入されると、上流と下流とで２度のホモロガス
リコンビネーションを起こし、クローニング部位に挿入
された外来遺伝子とウイルスＤＮＡのポリヘドリン遺伝
子が置換され、組換え遺伝子が組み込まれたウイルスが
作られるように設計されている。

【００１８】バキュロウイルスには宿主特異性の異なる
２種のウイルスが存在する。１つはキンウワバの１種オ
ートグラファ・カルフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ
ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）を宿主とするウイルス（Ａ
ｃＮＰＶ）であり、ｉｎｖｉｔｒｏではハスモンヨト
ウ近縁種のＳＦ：スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏ
ｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の樹立細胞株
との組み合わせで増殖可能である。もう１つは、カイコ
（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）を宿主とするウイルス（Ｂ
ｍＮＰＶ）であり、Ｔ３ウイルス株と卵巣由来のカイコ
培養細胞（Ｂｍ−Ｎ４）を用いることができる。これら
のウイルスの中でもオートグラファ・カリフォルニカは
従来から広く研究されてきており、最適である。トラン
スファーベクターと野生型ウイルスＤＮＡを宿主細胞に
導入する方法としては、リン酸カルシウム法を用いるこ
とができる。

【００１９】組み換えウイルスの作成に当たっては、ま
ずバキュロウイルスの増殖に非必須な遺伝子領域を組み
込んだ第一の組み換えベクターが作成される。

【００２０】この場合、前記領域にバキュロウイルス内
で機能するプロモーターを存在させることが必要であ
り、さらにプロモーター下流に適当な制限酵素切断配列
を有する合成リンカーを挿入することが好ましい。

【００２１】ここでいう増殖に非必須な遺伝子領域と
は、例えばバキュロウイルスのポリヘドリン遺伝子
（Ｌ．Ｋ．ミラーら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ，２１
９，ｐｐ７１５−７２１（１９８３））など、外来性遺
伝子の挿入による変異を受けても実質上ウイルスの増殖
に影響を及ぼさない領域を言う。

【００２２】また、バキュロウイルス内で機能するプロ
モーターとは、合成、天然を問わずバキュロウイルスが
保有する転写の系でプロモーターとして有効に機能しえ
るものであればいかなる塩基配列のものでも良く、例え
ばバキュロウイルスのポリヘドリンをコードする遺伝子
のプロモーターがあげられる。

【００２３】本発明においては、第一の組み換えベクタ
ーのプロモーター下流にＣ型肝炎ウイルスの非構成蛋白
質に存在するセリンプロテイナーゼ活性領域を含む遺伝
子配列を挿入して第二の組み換えベクターを作成する。
挿入方法は、例えば第一のベクターのプロモーター下流
に人為的に付与された制限酵素切断配列を利用して挿入
すれば良い。

【００２４】次にバキュロウイルスの全ゲノムとこの第
二の組み換えベクターを混合した後に、昆虫細胞にトラ
ンスフェクションにより導入し、ベクター遺伝子とウイ
ルスゲノム遺伝子の間に相同組み換えを起こさせ、組み
換えバキュロウイルスを構築する。ここで用いられる昆
虫細胞はバキュロウイルスが増殖可能であればよく、例
えばスポドプラテ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａｆｕｒｕｇｉｐｅｒｄａ）などがあげられる。

【００２５】こうして得られた組み換えバキュロウイル
スを感染しやすい昆虫細胞または昆虫の幼虫に感染さ
せ、発現した蛋白質を回収する。感染に使用する昆虫細
胞または昆虫の幼虫はバキュロウイルスが増殖可能であ
れば特に限定されないが、例えば細胞増殖の早い昆虫細
胞のスポドプラテ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａｆｕｒｕｇｉｐｅｒｄａ）などが好ましい。

【００２６】このようにして、バキュロウイルスの増殖
に非必須な遺伝子領域にＣ型肝炎ウイルスのセリンプロ
テイナーゼを含む非構成蛋白質領域をバキュロウイルス
内で機能するプロモーターと共に組み込まれた組み換え
バキュロウイルスを得て、この組み換えウイルスを昆虫
細胞または昆虫の幼虫に感染させ、蛋白質を発現させる
ことにより大量に簡便に目的蛋白質を製造することがで
きる。

【００２７】酵素の精製は、酵素を発現させるプラスミ
ドにジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子をＨＣＶプロテイ
ナーゼ遺伝子の下流にインフレームに挿入し、ＨＣＶプ
ロテイナーゼとジヒドロ葉酸リダクターゼを融合させて
ある場合にはメトトレキセートカラム、酵素を発現させ
るプラスミドにマルトースバインディングプロテイン
（ＭＢＰ）遺伝子をＨＣＶプロテイナーゼをコードする
ｃＤＮＡ断片の上流にインフレームで挿入し、ＨＣＶプ
ロテイナーゼとＭＢＰとを融合させてある場合にはアミ
ロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィ
ーによって行うことができる。

【００２８】上記のように生成させたウイルス蛋白質分
解酵素は、このようにして得た基質蛋白を上記の切断部
位で特異的に切断するが、この切断反応を適当な方法で
検出できる。例えば、精製したウイルス蛋白分解酵素と
基質蛋白質を用いて酵素反応し、生成物を電気泳動し染
色して検出する、あるいは粗精製したウイルス蛋白分解
酵素を用いて酵素反応し、生成物を電気泳動し、ウエス
タンブロット法により検出する。また、合成ペプチドの
切断に関しては、ＨＰＬＣによる検出、末端標識の遊離
の検出などを行うことができる。

【００２９】酵素反応は、ｐＨ５．０から１０．０で行
うことができるが、至適ｐＨはｐＨ７．０から８．０で
ある。イオン要求性については、亜鉛０．１ｍＭから１
０ｍＭを添加すると酵素反応が促進される。

【００３０】ウイルス蛋白分解酵素の力価は、上記切断
部位を含むＣ型肝炎ウイルス蛋白を１時間で切断するマ
イクロモル数で定義することができ、電気泳動で切断さ
れた生成物を検出し、モル数を計算することによって算
定できる。

【００３１】同酵素の力価の判定にはバクテリアあるい
は細胞中に生成された酵素と基質によっても行うことが
できる。すなわち酵素あるいは基質を挿入した発現ベク
ターをバクテリアあるいは細胞に形質転換し、細胞中で
生成した基質と酵素の細胞中での反応を測定することが
できる。

【００３２】酵素反応の最適温度は、上記反応条件で２
０℃から４０℃である。

【００３３】阻害剤のアッセイは、上記の酵素反応系、
あるいはバクテリアおよび細胞による蛋白質分解酵素発
現系に、適当な溶媒に溶解した試験化合物を添加し、基
質蛋白の切断反応あるいは自己分解反応の進行を、試験
化合物非添加のものと比較して行う。

【００３４】さらに具体的には、産生されたプロテイナ
ーゼの活性測定は、精製した酵素と今回明らかとなった
ＨＣＶプロテイナーゼによって切断されるアミノ酸配列
を含む基質ポリペプチドとを試験管内で反応させる系、
および大腸菌、動物培養細胞、昆虫細胞、ウサギ網状赤
血球溶血液を用いた無細胞翻訳系などで酵素と基質であ
る蛋白質とを同時に発現させ、細胞内または無細胞翻訳
系内で酵素と基質を反応させる系で蛋白質の切断を行
い、切断生成物をポリアクリルアミド電気泳動で分子量
に応じて分離し、ウエスタンブロット法を用いて検出し
た切断生成物の量を指標として行う。ウエスタンブロッ
ト法はまた、ＨＣＶプロテイナーゼによるペプチドの切
断によって発色するようデザインされた基質を用いて発
色の度合いを指標として測定することもできる。このＨ
ＣＶプロテイナーゼ活性測定系に試験化合物を添加した
ときと、添加しないときを比較することにより、ＨＣＶ
プロテイナーゼの阻害剤のスクリーニングを行うことが
できる。

【００３５】ＨＣＶプロテイナーゼの阻害剤としては、
上記の活性測定に使用される切断点を含むペプチドがそ
のまま拮抗阻害剤となる。さらにこのようなペプチドの
アミノ末端をブチルオキシカルボニル基、ベンジルオキ
シカルボニル基などの保護基で修飾するとペプチドが安
定化されて好ましい。また、切断点のペプチド結合を下
図のように改変することにより優れたプロテイナーゼ阻
害剤が得られることが知られており（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：９７５７−
９７６１，１９８９）、ＨＣＶプロテイナーゼについて
も同様である。

【００３６】

【化１】本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略
号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｍｉｓ
ｉｏｎｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃ
ｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用
略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミ
ノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しな
ければＬ−体を示すものとする。

【００３７】ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＲＮＡ：リボ核酸ＧｌｙまたはＧ：グリシンＡｌａまたはＡ：アラニンＶａｌまたはＶ：バリンＬｅｕまたはＬ：ロイシンＩｌｅまたはＩ：イソロイシンＳｅｒまたはＳ：セリンＴｈｒまたはＴ：スレオニンＣｙｓまたはＣ：システインＭｅｔまたはＭ：メチオニンＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸ＡｓｐまたはＤ：アスパラギン酸ＬｙｓまたはＫ：リジンＡｒｇまたはＲ：アルギニンＨｉｓまたはＨ：ヒスチジンＰｈｅまたはＦ：フェニールアラニンＴｙｒまたはＹ：チロシンＴｒｐまたはＷ：トリプトファンＰｒｏまたはＰ：プロリンＡｓｎまたはＮ：アスパラギンＧｌｎまたはＱ：グルタミンなお、本発明のＨＣＶプロテイナーゼ活性物質において
は、活性が維持されている限り、そのアミノ酸配列の一
部が修飾（付加、除去、その他のアミノ酸への置換な
ど）されていてもよい。

【００３８】

【実施例】以下の実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００３９】本発明の実施例で得られたプラスミドｐＮ
８９８−１２３３でエシェリチア・コリＪＭ１０９を形
質転換した形質転換体エシェリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９−ｐＮ（８９８−
１２３３）、およびプラスミドｐＮ９９２−１９０７で
上記ＪＭ１０９を形質転換したエシェリチア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９−ｐＮ
（９９２−１９０７）は平成４年１月３１日に通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）にそれぞ
れ受託番号ＦＥＲＭＰ−１２７３４およびＦＥＲＭ
Ｐ−１２７３３として寄託されている。

【００４０】実施例１：ＨＣＶゲノムＲＮＡの一部に
相当するｃＤＮＡ断片の構成および構築方法（図１〜
３）アラニンアミノトランスフェラーゼ高値の非Ａ非Ｂ型肝
炎患者の血漿よりＲＮＡを調製し、Ｎ．Ｋａｔｏ，ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８７，９５２４，（１９９０）の方法に従いｃＤ
ＮＡ（Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，Ｃ４，Ｃ５およびＣ６）を得
た。Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，Ｃ４，Ｃ５およびＣ６はそれぞ
れｐＴＺ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩに挿入し、
プラスミドｐＣ１，ｐＣ２，ｐＣ３，ｐＣ４，ｐＣ５お
よびｐＣ６を作成した。図１のＨＣＶＲＮＡｇｅｎｏ
ｍｅにおけるＨ，Ｄ，Ｓはセリンプロテイナーゼ様配列
の中の活性部位を形成する３つのアミノ酸をコードする
位置を示す。

【００４１】（１）翻訳開始メチオニンコドンの導入ｐＣ１プラスミドをＥｃｏＲＩ（挿入配列の５’末端側
に相当する）で切断し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラ
ーゼＩクレノーフラグメントを用いて平滑末端にした
後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとＮｃｏＩリンカー［ｄ（ＣＡ
ＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧ）］（配列番号：５）を用いて両
末端を結合し、翻訳開始に必要なメチオニンコドンを導
入した。この結果、ＨＣＶ−ＯＲＦのアミノ酸配列のＮ
末端側にこのリンカー由来のメチオニン、アラニン、グ
ルタミン酸、フェニルアラニンの４種のアミノ酸が導入
された。

【００４２】（２）構築方法結合方法１隣接する各ＤＮＡ断片が重複する領域の中
で共通して存在する制限酵素部位でその断片を結合す
る。

【００４３】結合方法２結合方法１で用いることがで
きる制限酵素が存在しない場合、ＰＣＲ法を用いて、結
合に可能な重複ＤＮＡ断片を合成し、これを介して結合
した（図３）。すなわち、 i）ＤＮＡ断片１を含むプラスミドを鋳型として制限
酵素部位Ａの５’上流とＤＮＡ断片２との重複領域にオ
リゴヌクレオチドプライマーを設定して（各々プライマ
ーａとプライマーａＲとする）ＰＣＲ法によりこのプラ
イマー間のＤＮＡを増幅する（１次ＰＣＲ、ＰＣＲ産物
１）。

【００４４】ii）同様にＤＮＡ断片２を含むプラスミ
ドを鋳型としてプライマーａＲより５’上流の位置に設
定したプライマーｂと制限酵素部位の３’下流に設定し
たプライマーｂＲを用いてＰＣＲ法によりプライマー間
のＤＮＡを増幅する（１次ＰＣＲ、ＰＣＲ産物２）。

【００４５】iii）ＰＣＲ産物１とＰＣＲ産物２を鋳
型として、プライマーａとプライマーｂＲを用いてＰＣ
Ｒ法によりプライマー間のＤＮＡを増幅する（２次ＰＣ
Ｒ、ＰＣＲ産物３）。

【００４６】iv）制限酵素部位ＡとＢを利用してＤＮＡ
断片１、ＰＣＲ産物３、そしてＤＮＡ断片２を結合す
る。

【００４７】Ｃ１とＣ２の結合（図２）結合方法２、鋳型ＤＮＡ１：ｐＣ１，鋳型ＤＮＡ２：ｐ
Ｃ２制限酵素部位Ａ：ＳｐｈＩ，制限酵素部位Ｂ：Ｅｃｏ５
２Ｉプライマーａ：５’−ＴＴＴＧＴＡＣＧＧＧＣＴＣＡ
ＧＧＧＧＣＴ−３’（配列番号：６）プライマーａＲ：５’−ＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＧＡＡ
ＧＡＣＧＡＣ−３’（配列番号：７）プライマーｂ：５’−ＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＴＡＧＡＧ
ＣＣＣＧＴＣ−３’（配列番号：８）プライマーｂＲ：５’−ＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣＡ
ＡＡＡＣＴＡ−３’（配列番号：９）ｐＣ１のＳｐｈＩ−ＨｉｎｄIII部位にＰＣＲ産物Ｓｐ
ｈＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ断片とｐＣ２のＥｃｏ５２Ｉ−Ｈｉ
ｎｄIII断片を挿入してｐＣ１−２を作成した。

【００４８】Ｃ２とＣ３の結合結合方法１、プラスミドベクターｐＴＺ１８ＲのＥｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にｐＣ２のＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ
断片とｐＣ３のＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片を挿入してｐ
Ｃ２−３を作成した。

【００４９】Ｃ１−２とＣ２−３の結合結合方法１、ｐＣ１−２のＢｓｓＨII（部分切断）−Ｈ
ｉｎｄIII部位にｐＣ２−３のＢｓｓＨII−ＨｉｎｄIII
断片を挿入してｐＣ１−３を作成した。

【００５０】Ｃ２−３とＣ４の結合結合方法２、鋳型ＤＮＡ１：ｐＣ２−３、鋳型ＤＮＡ
２：ｐＣ４制限酵素部位Ａ：ＢｓｓＨII、制限酵素部位Ｂ：Ｂａｍ
ＨＩプライマーａ：５’−ＧＴＣＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＣ
ＡＴＧＧＡ−３’（配列番号：１０）プライマーａＲ：５’−ＴＧＧＴＡＧＴＣＧＡＧＴＣＡ
ＧＴＴＧＡＧＴ−３’（配列番号：１１）プライマーｂ：５’−ＡＣＴＣＡＡＣＴＧＡＣＴＣＧＡ
ＣＴＡＣＣＡ−３’（配列番号：１２）プライマーｂＲ：５’−ＴＣＡＧＣＧＧＧＣＧＴＧＡＧ
ＣＴＣＡＴＡ−３’（配列番号：１３）ｐＣ１−３のＢｓｓＨＩＩ（部分切断）−ＢａｍＨＩ部
位にＰＣＲ産物（Ｃ２−４）のＢｓｓＨＩＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片を挿入してｐＣ１−４を作成した。

【００５１】Ｃ４とＣ５の結合結合方法２、鋳型ＤＮＡ１：ｐＣ４，鋳型ＤＮＡ２：ｐ
Ｃ５制限酵素部位Ａ：ＢａｍＨＩ，制限酵素部位Ｂ：Ｓａｃ
Ｉプライマーａ：５’−ＡＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＣＡＧ
ＡＣＡＧＴ−３’（配列番号：１４）プライマーａＲ：５’−ＴＣＡＧＣＧＧＧＣＧＴＧＡＧ
ＣＴＣＡＴＡ−３’（配列番号：１３）プライマーｂ：５’−ＡＴＧＡＣＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧ
ＣＴＴＧＧ−３’（配列番号：１５）プライマーｂＲ：５’−ＣＴＧＣＡＴＴＣＣＴＴＧＣＴ
ＣＧＡＴＧＴ−３’（配列番号：１６）ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩｓＳａｃＩで切断しＣ４−５Ｂ
ａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を得た。

【００５２】Ｃ５とＣ６の結合結合方法２、鋳型ＤＮＡ１：ｐＣ５，鋳型ＤＮＡ２：ｐ
Ｃ６制限酵素部位Ａ：ＳａｃＩ、制限酵素部位Ｂ：ＳｍａＩプライマーａ：５’−ＡＴＧＡＣＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧ
ＣＴＴＧＧ−３’（配列番号：１５）プライマーａＲ：５’−ＣＴＧＣＡＴＴＣＣＴＴＧＣＴ
ＣＧＡＴＧＴ−３’（配列番号：１６）プライマーｂ：５’−ＧＴＴＣＧＡＴＧＡＧＡＴＧＧＡ
ＡＧＡＧＴ−３’（配列番号：１７）プライマーｂＲ：５’−ＣＡＴＣＣＡＣＴＧＣＡＣＡＧ
ＣＣＣＣＣＴＣ−３’（配列番号：１８）ＰＣＲ産物をＳａｃＩとＳｍａＩで切断しＣ５−６Ｓａ
ｃＩ−ＳｍａＩ断片を得た。

【００５３】Ｃ１−４とＣ４−５とＣ５−６の結合結合方法１、ｐＣ１−４プラスミドをＰｓｔＩ（挿入配
列の３’末端側に位置するベクター内の部位）で切断
し、Ｔ４ファージＤＮＡポリメラーゼＩを用いて平滑末
端化した後、ＢａｍＨＩで切断し、このｐＣ１−４のＢ
ａｍＨＩ−平滑末端化ＰｓｔＩ部位にＣ４−５ＢａｍＨ
Ｉ−ＳａｃＩ断片とＣ５−６ＳａｃＩ−ＳｍａＩ断片を
挿入してｐＣ１−６を作成した。ｐＣ１−６はＧＣＶ−
ＯＲＦ上７２２番目のアミノ酸から１９０７番目のアミ
ノ酸までの領域に相当するｃＤＮＡを含むためｐＮ７２
２−１９０７と命名した。７２２番目のアミノ酸のコド
ンより５’上流にはＮｃｏＩリンカーが存在し、この配
列に由来するメチオニン、アラニン、グルタミン酸、フ
ェニルアラニンの４種のアミノ酸がこの順にＮ末端側に
付加されている。

【００５４】（３）欠失変異体発現プラスミドの構築
（図４）ｐＮ８９８−１９０７：ｐＮ７２２−１９０７をＥｃｏ
ＲＩおよびＲｓｒIIで切断し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポ
リメラーゼＩクレノーフラグメントを用いて平滑末端に
した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとＮｃｏＩリンカー［ｄ
（ＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧ）］（配列番号：５）を用
いて両末端を結合し、構築した。

【００５５】ｐＣ９９２−１９０７：ｐＮ８９８−１９
０７と同様に、ただし切断はＥｃｏＲＩとＳａｃIIで行
い、ＮｃｏＩリンカーは［ｄ（ＧＣＣＡＴＧＧＣ）］を
用いた。

【００５６】ｐＮ１１１７−１９０７：ｐＮ８９８−１
９０７と同様、ただし切断はＥｃｏＲＩとＢｓｓＨIIで
行い、ＮｃｏＩリンカーは［ｄ（ＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣ
ＴＧ）］（配列番号：５）を用いた。

【００５７】ｐＮ７２２−１６４７：ｐＮ７２２−１９
０７の挿入配列３’末端側ＮｓｉＩ−ＳｐｈＩ断片を欠
失させて構築した。

【００５８】ｐＮ７２２−１４６６：ｐＮ７２２−１９
０７構築の中間体（ｐＣ１−４）を用いた。

【００５９】ｐＮ７２２−１３２５：ｐＮ７２２−１９
０７構築の中間体（ｐＣ１−３）を用いた。

【００６０】（４）ｐＮ７２２−１３２５産物のＮ末端
側およびＣ末端側からの欠失変異体を発現するプラスミ
ドの構築ｐＮ８９８−１３２５：Ｎ７２２−１３２５を用いてＮ
８９８−１９０７と同様に作成した。

【００６１】ｐＮ９９２−１３２５：Ｎ７２２−１３２
５を用いたＮ９９２−１９０７と同様に作成した。

【００６２】ｐＮ７２２−１２３３：ｐＮ７２２−１３
２５の挿入配列の３’末端下流に存在するプラスミドベ
クター内のＸｂａＩ，ＰｓｔＩ両制限酵素部位を用いて
ＳｔｅｖｅｎＨｅｎｉｋｏｆｆらの方法［ジーン（Ｇ
ｅｎｅ），２８，３５１（１９８４）］に従って欠失変
異体を作成した。

【００６３】ｐＮ７２２−１１７４：Ｎ７２２−１３２
５と同様に作成した。

【００６４】ｐＮ７２２−１０１９：Ｎ７２２−１２３
３と同様に作成した。

【００６５】（５）ｐＮ７２２−１９０７およびｐＮ７
２２−１３２５の点突然変異体（ｐＮ７２２−１９０７
Ｍ１、ｐＮ７２２−１３２５Ｍ１）の構築Ｔ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌらの方法［メソッズ・イン・エン
ザイモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ），１５４，３６７（１９８７）］に従ってｐＮ
７２２−１３２５を鋳型として２０−ｍｅｒのオリゴヌ
クレオチド５’−ＧＴＣＣＡＣＣＣＧＣＧＧＡＧＣＣＣ
ＴＴＣ−３’（配列番号：１９）を用いて部位特異的突
然変異誘発（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ）を行い、ＨＣＶ−ＯＲＦ上１１６５番目
のアミノ酸に相当するセリン残基（推定されるセリンプ
ロテイナーゼの活性残基に相当する）をアラニン残基に
変異させ、Ｎ７２２−１３２５Ｍ１を構築した。ｐＮ７
２２−１９０７Ｍ１はｐＮ７２２−１３２５Ｍ１を基に
ｐＮ７２２−１９０７同様に構築した（図４）。

【００６６】実施例２：ＨＣＶプロテイナーゼによる切
断性の解析（Ａ）無細胞転写翻訳実験Ｍ．Ｈｉｊｉｋａｔａら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｓ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，５５４７，（１９９１）］
の実験条件に準じる。

【００６７】（１）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた無
細胞転写実験（i）用いたすべての発現用組換えプラスミドは挿入配
列３’末端側のベクター配列に存在するＨｉｎｄIII部
位で切断した。（ii）直鎖状になったプラスミド２．５ｕｇを４０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５ｍＭＭｇＣ
ｌ₂，０．５ｍＭＡＴＰ，０．５ｍＭＣＴＰ，０．
５ｍＭＵＴＰ，０．０５ｍＭＧＴＰ，０．５ｍＭｍ
⁷Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ，５０ｕＲＮａｓｉｎ
を含む溶液に加え、４０ｕＴ７ＲＮＡポリメラーゼを
用いて３７℃，６０分間転写した。

【００６８】（iii）転写して得られたＲＮＡは公知の
方法（フェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール
沈澱）により回収した。

【００６９】（２）ウサギ網状赤血球溶血液を用いた無
細胞翻訳実験（i）無細胞転写実験によって合成したＲＮＡを７０％
ウサギ網状赤血球溶血液、４０μＭアミノ酸混合液（メ
チオニンを除く）、８０ｅｑ．／ｍｌの犬膵臓ミクロソ
ーム膜画分、１０μＣｉ³⁵Ｓ−メチオニンを含む溶液中
で３０℃、６０分間翻訳した。

【００７０】（ii）同時にミクロソーム膜画分を除いた
反応も行った。

【００７１】（iii）翻訳反応産物はＳＤＳポリアクリ
ルアミド電気泳動法とそれに続くフルオログラフィーに
よって検出した。

【００７２】（Ｂ）結果（１）Ｎ７２２−１９０７の無細胞翻訳産物の解析（図
５）ミクロソーム膜画分存在下、分子量１３０ｋＤａ，１０
５ｋＤａ，１００ｋＤａ，７０ｋＤａ，２６ｋＤａ，２
１ｋＤａの６種のポリペプチドが認められた。後述する
欠失変異体の翻訳産物の解析から１３０ｋＤａポリペプ
チドは未切断の翻訳産物、すなわち前駆体であり、１０
５ｋＤａと１００ｋＤａのポリペプチドは切断中間体、
７０ｋＤａ，２６ｋＤａ，２１ｋＤａのポリペプチドが
前駆体から切断されて産生された産物であることがわか
った。以後、３種の産物の各々をｐ７０，ｐ２６，ｐ２
１と呼ぶことにするが、ｐ２１を除くｐ７０，ｐ２６は
ミクロソーム膜画分非存在下でも産生されるため、この
翻訳産物自体にプロテイナーゼ活性が存在することがわ
かった。

【００７３】（２）Ｃ末端側およびＮ末端側からの欠失
変異体の無細胞翻訳産物の解析（図５）（i）Ｃ末端側からの欠失変異体Ｎ７２２−１６４７：分子量１００ｋＤａの前駆体ポリ
ペプチドとｐ７０とｐ２１が検出されたが、ｐ２６は認
められなかった。このことからｐ２６はＮ７２２−１９
０７のＣ末端領域に由来し、Ｎ７２２−１９０７の１０
０ｋＤａ中間体はｐ２１とｐ７０から、１０５ｋＤａ中
間体はｐ２６とｐ７０から構成されることがわかった。

【００７４】Ｎ７２２−１４６６：分子量７８ｋＤａの
前駆体ポリペプチドとｐ２１および５１ｋＤａの産物が
認められた。

【００７５】Ｎ７２２−１３２５：分子量５５ｋＤａの
前駆体ポリペプチとｐ２１および３３ｋＤａの産物が認
められた。

【００７６】Ｎ７２２−１２３３：分子量４２ｋＤａの
前駆体ポリペプチドとｐ２１および２４ｋＤａの産物が
認められた。以上の結果から３種の産物はＮ７２２−１
９０７中でＮ末端側からｐ２１−ｐ７０−ｐ２６の順に
並ぶことがわかった。

【００７７】Ｎ７２２−１１７４：分子量３５ｋＤａの
前駆体ポリペプチドのみが検出された。この欠失変異体
ではｐ２１が産生されず、ｐ２１とｐ７０（ｐ２１／ｐ
７０）を切断するプロテイナーゼ活性が失われた。

【００７８】Ｎ７２２−１０１９：分子量２１ｋＤａの
前駆体ポリペプチドのみが検出された。このことからｐ
２１とｐ７０の間の切断点はＨＣＶ−ＯＲＦ上ほぼ１０
００番目のアミノ酸の近辺であることがわかった。

【００７９】（ii）Ｎ末端側からの欠失変異体Ｎ８９８−１９０７：ミクロソーム存在非存在に関わら
ず分子量１１０ｋＤａの前駆体ポリペプチドと９６ｋＤ
ａの切断中間体およびｐ２６と１０ｋＤａ前後の産物が
検出されたがｐ２１は認められなかった。このことから
もｐ２１がＮ７２２−１９０７のＮ末端側に位置し、ｐ
２１のＮ末端側の切断がミクロソーム依存的であること
がわかった。

【００８０】Ｎ９９２−１９０７：分子量１１０ｋＤａ
の前駆体ポリペプチドとｐ２６および７２ｋＤａの産物
が検出された。ｐ７０は認められずｐ２１とｐ７０を切
断するプロテイナーゼ活性が失われたことが示された。
しかしながらｐ２６が検出されることからｐ７０とｐ２
６（ｐ７０／ｐ２６）を切断するプロテイナーゼ活性は
認められている。切断産物の分子量等から推定してｐ７
０／ｐ２６の切断点はＨＣＶ−ＯＲＦ上ほぼ１６５０番
目のアミノ酸の近辺であることがわかった。

【００８１】Ｎ１１１７−１９０７：前駆体ポリペプチ
ドのみが検出されプロテイナーゼ活性はすべて失われ
た。

【００８２】（iii）両末端からの欠失変異体Ｎ８９８−１３２５：分子量４７ｋＤａの前駆体ポリペ
プチドと３３ｋＤａと１０ｋＤａ前後の産物が検出さ
れ、ｐ２１／ｐ７０の切断活性は保存されていた。

【００８３】Ｎ９９２−１３２５：分子量３６ｋＤａの
前駆体ポリペプチドのみが検出され、ｐ２１／ｐ７０の
切断活性は失われた。

【００８４】Ｎ８９８−１２３３：分子量３４ｋＤａの
前駆体ポリペプチドと２４ｋＤａと１０ｋＤａ前後の産
物が検出され、ｐ２１／ｐ７０の切断活性は保存されて
いた。

【００８５】以上のことをまとめるとＮ７２２−１９０
７のポリペプチドにはプロテイナーゼ活性が存在し、そ
れ自体を切断してＮ末端からｐ２１，ｐ７０，ｐ２６の
各産物が産生される。欠失変異体を用いた解析からｐ２
１／ｐ７０の切断活性はＨＣＶ−ＯＲＦ上、アミノ酸配
列８９８番目から１２３３番目（配列番号：１）までの
領域に存在し、約１０００番目のアミノ酸近辺を切断す
ることがわかり、ｐ７０／ｐ２６の切断活性はアミノ酸
配列９９２番目から１９０７番目（配列番号：２）まで
の領域に存在し、約１６５０番目のアミノ酸近辺を切断
することがわかった。ＨＣＶ−ＯＲＦ上、アミノ酸配列
１０７５番目から１１８５番目の領域にはキモトリプシ
ン様のセリンプロテイナーゼと相同性の高いアミノ酸配
列が存在し、これがウイルスプロテイナーゼである可能
性が示唆されている［Ｎ．Ｋａｔｏ，ｅｔａｌ．ＦＥ
ＢＳＬｅｔｔ．，２８０，３２５，（１９９１）］。
この領域を欠く欠失変異体（Ｎ７２２−１１７４および
Ｎ１１１７−１９０７）は各々プロテイナーゼ活性を失
っており、今回認められたｐ２１／ｐ７０およびｐ７０
／ｐ２６の切断活性がこのセリンプロテイナーゼ様構造
に依存する可能性がある。そこでこのことを検討するた
め、この構造中、セリンプロテイナーゼの活性中心に相
当するＨＣＶ−ＯＲＦ１１６５番目のセリン残基をアラ
ニン残基に変異させた突然変異体Ｎ７２２−１９０７Ｍ
１およびＮ７２２−１３２５Ｍ１を作成し（図４）、同
様に解析を行った（図５）。

【００８６】Ｎ７２２−１９０７Ｍ１：Ｎ７２２−１９
０７に比較して、分子量１３０ｋＤａの前駆体ポリペプ
チドと１０５ｋＤａの中間体およびｐ２１は検出された
が１００ｋＤａの中間体およびｐ２６は認められず、ｐ
７０／ｐ２６の切断に関与するプロテイナーゼ活性のみ
が失われ、ｐ２１／ｐ７０の切断活性は保存されてい
た。

【００８７】Ｎ７２２−１３２５Ｍ１：Ｎ７２２−１３
２５と全く同じプロテイナーゼ活性を示し、ｐ２１／ｐ
７０の切断活性は保存されていた。

【００８８】以上のことからｐ７０／ｐ２６の切断活性
はＨＣＶ−ＯＲＦ上１０７５番目から１１８５番目まで
のアミノ酸配列に相当する領域に存在するキモトリプシ
ン様セリンプロテイナーゼ相同構造に依存するが、ｐ２
１／ｐ７０の切断は、ＯＲＦ上の領域はｐ７０／ｐ２６
の切断活性と重複するが、これとは全く異なるプロテイ
ナーゼ活性によることがわかった。

【００８９】したがって、ｐ２１／ｐ７０の切断活性を
示す最小領域をコードするプラスミドとしてｐＮ８９８
−１２３３，ｐ７０／ｐ２６の切断活性を示す最小領域
をコードするプラスミドとしてｐＮ９９２−１９０７が
これらＨＣＶプロテイナーゼの発現のために有用である
と考えられる。

【００９０】ｐＮ８９８−１２３３でエシェリチア・コ
リＪＭ１０９を形質転換した形質転換体エシェリチア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９
−ｐＮ（８９８−１２３３）、およびｐＮ９９２−１９
０７で上記ＪＭ１０９を形質転換したエシェリチア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９−
ｐＮ（９９２−１９０７）は平成４年１月３１日に通商
産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）にそ
れぞれ受託番号ＦＥＲＭＰ−１２７３４およびＦＥＲ
ＭＰ−１２７３３として寄託されている。ｐＮ８９８
−１２３３は配列番号２０で示したＤＮＡ配列を、ｐＮ
９９２−１９０７は配列番号２１で示したＤＮＡ配列を
含む。

【００９１】実施例３：バキュロウイルスを用いた発現
系（Ａ）バキュロウイルスによるＣ型肝炎ウイルスの非構
成蛋白質領域に存在するプロテイナーゼ配列の領域の発
現（１）Ｃ型肝炎ウイルスの非構成蛋白質領域に存在すプ
ロテイナーゼ配列の領域を含む遺伝子を組み込んだ第二
の組み換えベクターの作製非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清から単離したＣ型肝炎ウイル
スの遺伝子の塩基３０１８番の制限酵素ＲｓｒIIサイト
から塩基６０５２番の制限酵素ＳｍａＩサイトを切り出
し、ＲｓｒIIサイト側に開始コドンのメチオニンを含む
リンカー１を、ＳｍａＩサイト側にリンカー２をライゲ
ーションし、結合した後リン酸化する。東洋紡績（株）
製のベクターｐＴＺ１８ＵをＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII
で切断し、切断したベクターを精製し脱リン酸化し、前
述したリンカー１，２を結合したＣ型肝炎ウイルスの遺
伝子とライゲーションをし、一度、大腸菌にトランスフ
ォーメーションにより導入し増やす。

【００９２】その得られたプラスミドを再度ＥｃｏＲ
Ｉ、ＨｉｎｄIIIで切断し、リンカー１，２を結合した
Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子を得る。ＥｃｏＲＩサイト側
にはリンカー３を、ＨｉｎｄIIIサイト側には終始コド
ンを含むリンカー４をライゲーションし、結合した後リ
ン酸化する。ＰＨＡＲＭＩＧＥＮ社製のバキュロウイル
ストランスファーベクターｐＶＬ９４１（第二の組み換
えベクター）をＢａｍＨＩで切断し、脱リン酸化し、前
述したリンカー３，４を結合したＣ型肝炎ウイルスの遺
伝子とライゲーションをし、一度、大腸菌にトランスフ
ォーメーションにより導入し増やし第二の組み換えベク
ターを作製する。この第二の組換えベクターの作製手順
を図６に示す。

【００９３】（２）組み換えバキュロウイルスの作製ＰＨＡＲＭＩＧＥＮ社製のトランスフェクションキット
ＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤを使用し、前述したバキュロウイ
ルストランスファーベクターｐＶＬ９４１（第二の組み
換えベクター）とバキュロウイルス遺伝子を混合し、ス
ポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆ
ｕｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の細胞Ｓｆ９に挿入する。この
トランスフェクションキットのバキュロウイルス遺伝子
はバキュロウイルストランスファーベクターと相同組み
換えを起こさないとウイルスとして増殖できないように
なっているため、相同組み換えを起こしたウイルスだけ
が得られる。

【００９４】細胞に挿入して一週間程度の後、この組み
換えウイルスを回収する。

【００９５】（３）組み換えバキュロウイルスによるＣ
型肝炎ウイルスの非構成蛋白質に存在するプロテイナー
ゼ配列領域の製造得られた組み換えバキュロウイルスを細胞Ｓｆ９に感染
させ、培養３日後に回収する。ウエスタンブロット法に
より発現蛋白質の確認を行った。

【００９６】その結果、分子量約７００００ダルトンの
蛋白質を産生していることが判明した。（図７を参照）
Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子のＲｓｒIIサイトからＳｍａＩ
サイトの領域には、その分子内に含まれるプロテイナー
ゼにより切断される場所が２か所含まれており、プロテ
イナーゼ配列の領域は分子量７００００ダルトンの蛋白
質として産生されることが推定され、実際に発現した蛋
白質と同一の分子量である。

【００９７】ウエスタンブロット法を用いた抗血清は、
下遠野らにより報告（Ｊｐｎ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅ
ｓ．Ｖｏｌ．８３，ｐｐ２６４−２６８（１９９２））
されている蛋白質０７（塩基４２２４番から塩基４９６
３番）により得られた抗血清を用いた。

【００９８】ウエスタンブロット法はＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８
９）１８項を参照して行った。

【００９９】（Ｂ）組み換えバキュロウイルスにより発
現した分子量７００００ダルトンの蛋白質のＮ末端解析分子量７００００ダルトンの蛋白質のＮ末端はＣ型肝炎
遺伝子内に存在するプロテイナーゼにより切断される。
Ｎ末端解析を解析することによりこの切断点が解明され
る。

【０１００】スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａｆｕｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の細胞Ｓｆ２１
に組み換えバキュロウイルスを感染させ３日後に遠心分
離し回収する。１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
７．４で再懸濁し超音波破砕する。遠心分離により不溶
性分画を回収し、１２．５％均一ゲルＳＤＳ電気泳動を
行う。ＰＶＤＦ膜（ミリポア製）にプロッティングを行
い、コマシブリリアントブルーにより染色し分子量７０
０００ダルトンの蛋白質を切り取る。

【０１０１】次いでアプライドバイオシステム４７７Ａ
プロテインシーケンサーを使用してこの蛋白質のＮ末端
分析を行った。

【０１０２】結果はアラニン−プロリン−イソロイシン
−スレオニン−アラニン−トリプトファン−？−グルタ
ミン−グルタミン−スレオニンとなり、切断点はアミノ
酸１０２６番ロイシンとアミノ酸１０２７番アラニンの
間であることが確認された。

【０１０３】実施例４：大腸菌を用いた発現系（ＨＣＶ
プロテイナーゼによるＨＣＶ−ＯＲＦ上アミノ酸番号１
６５７番目のスレオニンと１６５８番目のセリンの間の
切断）（Ａ）プラスミドの構築Ｃ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡ断片としてＧｅｎｅ
ｂａｎｋｄａｔａｂａｓｅ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎ
ｏ．Ｄ９０２０８）の配列を用いた。実験はＴ．Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，
ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＳｅｃｏ
ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８
９）の条件に準じる。なお、本発明で使用したプラスミ
ドを図８にまとめて示した。

【０１０４】ｐＭＡＮＳ２ｄ３ＨＣＶ−ＯＲＦ上アミノ酸番号７２２番目から１３２５
番目をコードするｃＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐ
ＭＡＬ−ｃ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ
Ｉｎｃ．品番＃８００）のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩサイ
トに挿入したプラスミドｐＭＡＮＳ２３をＥｃｏＲＩ及
びＫｐｎＩで切断し、エキソヌクレアーゼIIIで消化し
たマングビーンヌクレアーゼで平滑末端にし、さらにＤ
ＮＡポリメラーゼＩクレノーフラグメントを用い末端を
完全に平滑末端にした後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
両末端を結合して構築した。挿入されたｃＤＮＡ断片の
塩基配列を決定しＨＣＶゲノム上３２９４番目から４３
１８番目までの塩基配列が挿入されている事を確認し
た。

【０１０５】ｐＭＡＮＳ２ｄ３ＸプラスミドｐＭＡＮＳ２ｄ３をＳａｃＩで切断しＴ４ポ
リメラーゼで平滑末端にした後、ＨｉｎｄIIIで切断し
得られた平滑末端化ＳａｃＩ−ＨｉｎｄIII断片をｐＭ
ＡＬ−ｃのＳｔｕＩ−ＨｉｎｄIIIサイトにＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結した。このプラスミドで形質転換
したＥ．ｃｏｌｉはＭＢＰ（ＭａｌｔｏｓｅＢｉｎｄ
ｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ）とＨＣＶ−ＯＲＦ上９８５番
目から１３２５番目のアミノ酸が融合したポリペプチド
を発現する。

【０１０６】ｐｄｈｆｒＦＸ１ＳＨＴａｋａｓｈｉＯｓｕｍｉ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ１８１：９４７−９
５４１９９１）で報告されたプラスミドｐＴＺＣＭＶ
ｄｈｆｒのサイトメガロウイルスのプロモーターエンハ
ンサー配列をＳＶ４０プロモーターと置き換えたｐＴＺ
ＳＶ２ｄｈｆｒｓＨのＨｉｎｄIII−平滑末端化Ｂｃ１
Ｉサイトに合成ＤＮＡ：５’−ＡＧＣＴＴＴＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＡＧＧＴＡＴ−３’ ３’−ＡＡＧＴＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＡ−５’ を連結し、さらに以下のＤＮＡ：５’−ＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＧ−３’ ３’−ＧＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣ−５’ をＢａｍＨＩサイトに連結した。

【０１０７】ｐｄｈｆｒＦＸ２ＳＨＴａｋａｓｈｉＯｓｕｍｉ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅｒｃｈ
Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｉｏｎｓ１８１：９４７−９５４
１９９１）で報告されたプラスミドｐＴＺＣＭＶｄｈ
ｆｒのサイトメガロウイルスのプロモーターエンハンサ
ー配列をＳＶ４０プロモーターと置き換えたｐＴＺＳＶ
２ｄｈｆｒＨのＨｉｎｄIII−平滑末端化Ｂｃ１Ｉサイ
トに合成ＤＮＡ：５’−ＡＧＣＴＴＧＣＡＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＡＧＧＴＡＴ−３’ ３’−ＡＣＧＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＡ−５’ を連結し、さらに以下のＤＮＡ：５’−ＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＧ−３’ ３’−ＧＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣ−５’ をＢａｍＨＩサイトに連結した。

【０１０８】ｐＮＳ２３４ＮｄｈｆｒＨＣＶ−ＯＲＦ上アミノ酸番号７２２番目から１６４７
番目をコードするｃＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐ
ＴＺ１８ＲのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩサイトに挿入したｐ
ＮＳ２３４ＮをＨｉｎｄIIIで切断し、ｐｄｈｆｒＦＸ
１ＳＨのｄｈｆｒ遺伝子を含むＨｉｎｄIII断片を連結
した。塩基配列を決定しＨＣＶ−ＯＲＦとｄｈｆｒ遺伝
子が同じ読み枠である事を確認した。

【０１０９】ｐＮＳ２３４ＳｐｄｆｒＨＣＶ−ＯＲＦ上アミノ酸番号７２９番目から１９０８
番目をコードするｃＤＮＡ断片をクローニングしたｐＮ
Ｓ２３４ＳのＮｓｉＩ−ＨｉｎｄIII断片を 5'-TGCATGTCGGGCGACCTGGAGGTCGTCACTAGTA- 3' 3'-ACGTGCAGCCCGCTGGACCTCCAGCAGTGATCAT -5' と置き換えた。ＨｉｎｄIIIサイトにｐｄｈｆｒＦＸ２
ＳＨのｄｈｆｒ遺伝子を含むＨｉｎｄIII断片を連結し
た。塩基配列を決定しＨＣＶ−ＯＲＦとｄｈｆｒ遺伝子
が同じ読み枠である事を確認した。

【０１１０】ｐＭＡＮＳ３４Ｎｓ＋ｄｈｆｒｐＮＳ２３４ＳＰｄｈｆｒをＳａｃIIとＳａ１Ｉで切断
し得られたＳａｃII−Ｓａ１Ｉ断片をｐＭＡＮＳ２ｄ３
ＸのＳａｃII−Ｓａ１Ｉサイトに連結した。このプラス
ミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉはＭＢＰとＨＣＶ−Ｏ
ＲＦ上９８５番目から１６５８番目のアミノ酸とジヒド
ロ葉酸リダクターゼが融合したポリペプチドを発現す
る。

【０１１１】ｐＭＡＮＳ３４Ｎｓ＋ｄｈｆｒＭ１ｐＭＡＮＳ３４Ｎｓ＋ｄｈｆｒのＢｌｎII−ＥｃｏＴ２
２Ｉ断片をｐＮＳ２３４ＳＭ１のＢｌｎII−ＥｃｏＴ２
２Ｉ断片と置き換えた。このプラスミドで形質転換した
Ｅ．ｃｏｌｉはＭＢＰとＨＣＶ−ＯＲＦ上１１６５番目
のセリンがアラニンに置換された９８５番目から１６５
８番目のアミノ酸とジヒドロ葉酸リダクターゼが融合し
たポリペプチドを発現する。

【０１１２】ｐＭＡＮＳ３４Ｎｓ＋ｄｈｆｒｄＳｍｐＭＡＮＳ３４Ｎｓ＋ｄｈｆｒをＳｍａＩで切断しＳｍ
ａＩ−ＳｍａＩ断片を欠失させ再び連結した。このプラ
スミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉはＭＢＰとＨＣＶ−
ＯＲＦ上９８５番目から１１１６番目のアミノ酸が融合
したポリペプチドを発現する。

【０１１３】（Ｂ）大腸菌での蛋白質の発現実験はＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒ
ｅｓｓ，１９８９）の条件に準じる。

【０１１４】ｐＭＡＮＳ３４Ｎｓ＋ｄｈｆｒでＥ．ｃｏ
ｌｉＪＭ１０９を形質転換した形質転換体ｐＭＡＮＳ
３４Ｎｓ＋ｄｈｆｒ／ＪＭ１０９を０．１ｍｌのＬＢ
Ｂｒｏｔｈに植え３７℃で一晩振盪培養した培養液に１
０ｍｌのＬＢを加え培養液の６００ｎｍの吸光度が０．
６になるまで振盪培養を続けた。吸光度が０．６に達し
た時点で最終濃度０．５ｍＭになるようイソプロピルベ
ータ−チオガラクトシドを加えさらに２時間振盪培養し
た。培養液を遠心し菌体を集めた。集めた菌体を１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），３０ｍＭＮａ
Ｃｌ，１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）のバッファー１
ｍｌに懸濁した後、超音波破砕機で菌体を破壊し菌体抽
出液を得た。菌体抽出液に２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプ
ルバッファー１ｍｌを加え１００℃で５分加熱し発現産
物溶液を得た。

【０１１５】ｐＭＡＮＳ３４Ｎｓ＋ｄｈｆｒＭ１で同様
に蛋白質の発現を行い発現産物溶液を得た。

【０１１６】ｐＭＡＮＳ３４Ｎｓ＋ｄｈｆｒｄＳｍで同
様に蛋白質の発現を行い発現産物溶液を得た。

【０１１７】（Ｃ）発現産物の解析ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動後抗ジヒドロ葉酸リ
ダクターゼ抗体を用いたウエスタンブロット法で解析を
行った。

【０１１８】結果ｐＭＡＮＳ３４Ｎｓ＋ｄｈｆｒ産物の解析１４０ｋＤａ，２４ｋＤａ，２３ｋＤａの３種のポリペ
プチドが認められた。ｐＭＡＮＳ３４Ｎｓ＋ｄｈｆｒＭ１産物の解析１４０ｋＤａ，２３ｋＤａの２種のポリペプチドが認め
られた。

【０１１９】ｐＭＡＮＳ３４Ｎｓ＋ｄｈｆｒｄＳｍ産物の解析２３ｋＤａのポリペプチドが認められた。

【０１２０】以上の結果から１４０ｋＤａのポリペプチ
ドはＭＢＰとＨＣＶ−ＯＲＦ上９８５番目から１６５８
番目のアミノ酸とジヒドロ葉酸リダクターゼが融合した
ポリペプチド、２３ｋＤａのポリペプチドはｄｈｆｒ遺
伝子上に存在する開始コドンから翻訳されたポリペプチ
ドである事が推定される。そしてＨＣＶ−ＯＲＦ上９８
５番目から１６５８番目のポリペプチドはフラビウイル
スのトリプシン様セリンプロテイナーゼと相同な領域が
含まれる事から、ＨＣＶ−ＯＲＦ上９８５番目から１６
５８番目のポリペプチドに存在するセリンプロテイナー
ゼによって１４０ｋＤａのポリペプチドが切断され２４
ｋＤａのジヒドロ葉酸リダクターゼが融合したポリペプ
チドが産生されたと推定される。

【０１２１】（Ｄ）メトトレキセートカラム作成方法
（ＭＴＸ−ゲル）トレシルトヨパールゲル（東ソー株式会社製）６．２５
ｇを１００ｍＭ炭酸ナトリウム０．５Ｍ塩化ナトリウム
水溶液２５０ｍｌに入れ、良く混合する。エチレンジア
ミン（和光純薬製）を３１０μｌ入れ１６時間２５℃で
おだやかに混合する。溶液を捨て、ゲルを回収し、１０
０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．５、２５０ｍｌを加
え、１５分混合する。この工程を５回繰り返す。

【０１２２】塩酸および水酸化ナトリウム溶液でｐＨ
６．５に合せた蒸留水でゲルをよく洗浄する。その後、
容量を２５０ｍｌにする。メトトレキセート（和光純薬
製）２２５ｍｇをｐＨ６．５に合せた蒸留水２５ｍｌに
溶解し加える。

【０１２３】このゲル溶液を２５℃で混合しながら、あ
らかじめ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミドハイドロクロライド９７ｍｇを２
５ｍｌのｐＨ６．５に合せた蒸留水で溶解しておき、こ
れを３０分ごとに２．５ｍｌづつ１０回に分け加える。
その後、２０時間２５℃でおだやかに混合する。

【０１２４】蒸留水でよくゲルを洗浄する。次に０．２
Ｍ炭酸水素ナトリウムで続いて１Ｍ塩化カリウムでよく
洗浄する。

【０１２５】（Ｅ）ジヒドロ葉酸リダクターゼが融合し
たポリペプチドの精製ｐＭＡＮＳ３４Ｎｓ＋ｄｈｆｒでＥ．ｃｏｌｉＪＭ１
０９を形質転換した形質転換体ｐＭＡＮＳ３４Ｎｓ＋ｄ
ｈｆｒ／ＪＭ１０９を２０ｍｌのＬＢＢｒｏｔｈに植
え３７℃で一晩振盪培養した培養液に２０００ｍｌのＬ
Ｂを加え培養液の６００ｎｍの吸光度が０．６になるま
で振盪培養を続けた。吸光度が０．６に達した時点で最
終濃度０．５ｍＭになるようイソプロピルベータ−チオ
ガラクトシドを加えさらに２時間振盪培養した。培養液
を遠心し菌体を集めた。集めた菌体を１０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），３０ｍＭＮａＣｌ．１０
ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）のバッファー２００ｍｌ
に懸濁した後、超音波破砕機で菌体を破壊し菌体抽出液
を得た。菌体抽出液を９０００ｇで２０分間遠心し上清
を得た。この上清に最終濃度１０％になるようグリセロ
ールを加えた。この溶液を上記のカラムバッファ（５０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．６１００ｍＭＫ
Ｃｌ２ｍＭＤＴＴ１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で
平衡化した１ｍｌのＭＴＸゲルをつめたカラムにかけ、
ゲルに吸着しない蛋白質をカラムバッファで洗浄し、溶
出バッファ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．８
５００ｕＭ葉酸２ｍＭＤＴＴ１０％Ｇｌｙｃｅ
ｒｏｌ）でゲルに吸着したジヒドロ葉酸リダクターゼが
融合したポリペプチドを溶出した。

【０１２６】（Ｆ）ジヒドロ葉酸リダクターゼが融合し
たポリペプチドのアミノ末端のアミノ酸配列の決定精製したジヒドロ葉酸リダクターゼが融合したポリペプ
チドをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量
に応じて分離した後ＰＶＤＦ膜にブロットしクマシーブ
リリアントブルーで染色し２４ｋＤａのポリペプチドを
ＰＶＤＦ膜ごと切り取った。この切り取ったＰＶＤＦ膜
をアブライドバイオシステムズ製プロテインシークエン
サー４７７Ａにかけポリペプチドのアミノ末端のアミノ
酸配列を決定した。

【０１２７】結果２４ｋＤａのポリペプチドのアミノ酸末端の配列はＳＫ
ＬＡＩＥＧ？ＧＭＩ？ＬＩＡＡＬＡＶであった。

【０１２８】この結果からＨＣＶ−ＯＲＦ上９８５番目
から１６５８番目のポリペプチドに存在するセリンプロ
テイナーゼによってＨＣＶ−ＯＲＦ上１６５７番目のス
レオニンと１６５８番目のセリンの間が切断される事が
明かとなった。

【０１２９】実施例５：切断部位のアミノ酸変異体の作
成とＨＣＶプロテイナーゼによるその変異体産物の切断
性の解析（Ａ）プラスミドｐＮＳ２３４Ｓの作成Ｃ型肝炎遺伝子の塩基２５２７番の制限酵素ＢｓｓＨII
サイトから塩基６４９９番の制限酵素ＰｓｔＩサイトを
切り出し、ＢｓｓＨIIサイトはあらかじめＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼにより平滑末端にし、５’ＣＡＧＣＣＡＴＧ
ＧＣＴＧ３’（ＮｃｏＩリンカー）をつないだ。市販の
ベクターｐＴＺ１８Ｒ（東洋紡績製）のマルチクローニ
ングサイトのＥｃｏＲＩサイトとＰｓｔＩサイトに、Ｅ
ｃｏＲＩサイトはあらかじめＴ４ＤＮＡポリメラーゼに
より平滑末端にしておき、ＮｃｏＩリンカーをつないだ
上記Ｃ型肝炎遺伝子塩基２５２７番から塩基６４９９番
までを挿入した。

【０１３０】塩基６０６５番ＳｍａＩからマルチクロー
ニングサイトのＳｐｈＩの遺伝子を除き、Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼにより平滑末端にし再度結合した。

【０１３１】遺伝子の結合はＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
た。得られたプラスミドをｐＮＳ２３４Ｓと命名した。

【０１３２】（Ｂ）プラスミドｐＮＳ２３４Ｓｐ−６ｄ
ｈｆｒの作成ＴａｋａｓｈｉＯｓｕｍｉ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ１８１：９４７−９
５４，１９９１）で報告されたプラスミドｐＴＺＣＷＶ
ｄｈｆｒのサイトメガロウイルスのプロモーターエンハ
ンサー配列をＳＶ４０プロモーターと置きかえたプラス
ミドｐＴＺＳＶ２ｄｈｆｒｓＨのプロモーター領域の直
後のＨｉｎｄIIIサイトとあらかじめＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼにより平滑末端したＢｌｎＩサイトに、５’ＡＧＣＴＴＧＣＡＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＡＧＧＴＡＴ３’ ３’ＡＣＧＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＡ５’ （Ｌｆｘ２リンカー）を挿入した。

【０１３３】さらにポリＡシグナル後のＢａｍＨＩサイ
トを切断しＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端に
し、５’ＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＧ３’ ３’ＧＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣ５’ （ＳＨＳリンカー）を挿入した。

【０１３４】ＨｉｎｄIIIによりＬｆｘ２リンカーにつ
ながるｄｈｆｒ遺伝子を取り出し、プラスミドｐＮＳ２
３４ＳのマルチクローニングサイトのＨｉｎｄIIIサイ
トに挿入した。

【０１３５】塩基５２８７番ＮｓｉＩからＬｆｘ２リン
カー前に存在するＨｉｎｄIIIの遺伝子を次の遺伝子と
交換した。

【０１３６】さらに、このリンカーの中に存在するＳｐｅＩサイトに
次のリンカーを挿入した。

【０１３７】５’ＣＴＡＧＴＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＧＧＣＡ３’ ３’ＡＴＧＧＡＣＣＣＡＣＧＡＣＣＡＴＣＣＧＴＴＣＧＡ５’ 以上のようにして、プラスミドｐＮＳ２３４Ｓｐ−６ｄ
ｈｆｒを作成した。

【０１３８】（Ｃ）プラスミドｐＮＳ２３４−６ｄｈｆ
ｒ／Ｔ１６５７Ｎの作成ｐＮＳ２３４Ｓｐ−６ｄｈｆｒをＳｐｅＩで切断し、Ｍ
ｕｎｇＢｅａｎヌクレアーゼにより平滑末端にし、続
いてＨｉｎｄIIIで切断しｄｈｆｒ遺伝子を除く。

【０１３９】そして、次のリンカーを挿入した。

【０１４０】５’ＡＴＡＧＴＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＧＧＣＡ３’ ３’ＴＡＴＣＡＴＧＧＡＣＣＣＡＣＧＡＣＣＡＴＣＣＧＴＴＣＧＡ５’ 再度、ＨｉｎｄIIIによりプラスミドｐＮＳ２３４Ｓか
ら取り出したＬｆｘ２リンカーにつながるｄｈｆｒ遺伝
子を、このプラスミドのＨｉｎｄIIIサイトに挿入し
た。得られたプラスミドをｐＮＳ２３４−６ｄｈｆｒ／
Ｔ１６５７Ｎと命名した。

【０１４１】（Ｄ）その他のプラスミドの構築ｐＮＳ２３４Ｓ／Ｌ１０２６ＩＴ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌらの方法（メソッズ．イン．エン
ザイモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ），１５４，３６７（１９８７））に従って上記
のｐＮＳ２３４Ｓを鋳型として２０−ｍｅｒのオリゴヌ
クレオチド５’＞ＧＴＧＡＴＡＧＧＣＧＣＡＡＴＧＡＧ
ＣＣＧ＜３’を用いて部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔ
ｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を行
い、ＨＣＶ−ＯＲＦ上１０２６番目のアミノ酸に相当す
るロイシン残基（推定されるｐ２１とｐ７０の切断部
位）をイソロイシン残基に変異させ構築した。

【０１４２】ｐＮＳ２３４Ｓ／Ｌ１０２６ＶＴ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌらの方法（メソッズ．イン．エン
ザイモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ），１５４，３６７（１９８７））に従ってｐＮ
Ｓ２３４Ｓを鋳型として２０−ｍｅｒのオリゴヌクレオ
チド５’＞ＧＴＧＡＴＡＧＧＣＧＣＣＡＣＧＡＧＣＣＧ
＜３’を用いて部位特異的突然変異誘発を行い、ＨＣＶ
−ＯＲＦ上１０２６番目のアミノ酸に相当するロイシン
残基（推定されるｐ２１とｐ７０の切断部位）をバリン
残基に変異させ構築した。

【０１４３】ｐＣＭＶプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ‖ ＫＳ
＋のクローニングサイトＸｂａＩ−ＢａｍＨＩサイトに
ＣＭＶのプロモター遺伝子［ＰＣＭＶ（Ｂ）由来のＸｂ
ａＩ−ＢａｍＨＩ０．６ＫｂＦｒａｇｍｅｎｔ］
を、ＨｉｃＩＩ−Ｓａ１ＩサイトにＳＶ４０のｐｏｌｙ
Ａｓｉｇｎａｌ［ｐＳＶＬ由来のＢａｍＨＩ−Ｓａ１
Ｉ０．６ＫｂＦｒａｇｍｅｎｔ］をそれぞれ挿入し
構築した。

【０１４４】ｐＣＭＶ／ＮＳ２３４ＳＣ型肝炎ウイルスゲノム（Ｇｅｎｅｂａｎｋｄａｔａ
ｂａｓｅａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．Ｄ９０２０
８）上７２９番目から１９０８番目のアミノ酸をコード
するｃＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＣＭＶのＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し構築した。

【０１４５】ｐＣＭＶ／ＮＳ２３４５ＣＣ型肝炎ウイルスゲノム（Ｇｅｎｅｂａｎｋｄａｔａ
ｂａｓｅａｃｃｅｓｉｏｎｎｏ．Ｄ９０２０８）
上７２９番目から３０１０番目のアミノ酸をコードする
ｃＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＣＭＶのＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し構築した。

【０１４６】ｐＣＭＶ／ＮＳ２３４５Ｃ−Ｍ１Ｔ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌらの方法（メソッズ．イン．エン
ザイモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ），１５４，３６７（１９８７））に従ってｐＣ
ＭＶ／２３４５Ｃを鋳型として２０−ｍｅｒのオリゴヌ
クレオチド５’＞ＧＴＣＣＡＣＣＣＧＣＧＧＡＧＣＣＣ
ＴＴＣ＜３’を用いて部位特異的突然変異誘発を行い、
ＨＣＶ−ＯＲＦ上１１６５番目のアミノ酸に相当するセ
リン残基（推定されるセリンプロテイナーゼの活性残基
に相当する）をアラニン残基に変異させ、３３１５ｂｐ
に存在するＳａｃＩＩサイトと３８０６ｂｐに存在する
ＡｖｒＩＩサイトで切断し、同じくｐＣＭＶ／ＮＳ２３
４５ＣのＳａｃＩＩ−ＡｖｒＩＩサイトと交換すること
により構築した。

【０１４７】ｐＣＭＶ／ＮＳ５ＰＳＮＣ型肝炎ウイルスゲノム（Ｇｅｎｅｂａｎｋｄａｔａ
ｂａｓｅａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．Ｄ９０２０
８）上２０５４番目から２９５１番目のアミノ酸をコー
ドするｃＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＣＭＶのＥ
ｃｏＲ１−ＢａｍＨＩサイトに挿入し構築した。

【０１４８】（Ｅ）無細胞転写翻訳実験（１）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた無細胞転写翻訳
実験、および（２）ウサギ網状赤血球溶血液を用いた無
細胞翻訳実験、は実施例２（Ａ）に記載の方法によって
実施した。

【０１４９】（Ｆ）細胞系での蛋白発現実験Ｃｈｅｎ，Ｃ．らの方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，７：２７４５−２７５２，１９８７）に準じる。

【０１５０】（１）Ｃｈｅｎ−Ｏｋａｙａｍａ法による
ＣＯＳ−Ｃｅｌｌへのトランスフェクション（ｉ）ＣＯＳ細胞（５ｍｌ培地２×１０⁵）をシャーレ
等にまき、３７℃（５％炭酸ガス）で一夜培養する。

【０１５１】（ｉｉ）約１０ｕｇのＤＮＡを０．２５ｍ
ｌの０．２５ＭＣａＣｌ₂と０．２５ｍｌの２×ＢＢ
Ｓ（５０ｍＭＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒ
ｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕ
ｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ，２８０ｍＭＮａＣｌ，１．
５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄，ｐＨ６．９５）の混液に加え、
室温に１０−２０分間置く。

【０１５２】（ｉｉｉ）これを一滴ずつ培地中の細胞に
加え、良く拡散させ、３７℃で１５−２４時間培養す
る。

【０１５３】（ｉｖ）培地を除き、細胞を５ｍｌのＰＢ
Ｓ（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉ
ｎｅ）で２度洗い、５ｍｌの新しい培地を加え、３７℃
（５％炭酸ガス）で２昼夜培養する。

【０１５４】（ｖ）培養細胞をトリプシン処理し、細胞
を回収する。

【０１５５】（２）抗体アッセイ（ｉ）回収した培養細胞はＳＤＳポリアクリルアミド電
気泳動とそれに続くウェスタンブロッテイング法（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＳｅｃｏｎｄＥｄ
ｉｔｉｏｎ，Ｓｅｃｔｉｏｎ１８）によりＰＶＤＦ膜
（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）にトランスファーした。

【０１５６】（ｉｉ）ＰＶＤＦ膜にトランスファーされ
た蛋白は、ｐ７０抗体［Ｊｐｎ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓ．Ｖｏｌ．８３，２６４−２６８，１９９２に記載
されている蛋白質０７（塩基番号４２２４から塩基番号
４９６３）により得られた抗体］）、ｐ５８抗体［Ｊｐ
ｎ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．Ｖｏｌ．８３，２６４
−２６８，１９９２に記載されている蛋白質１５（塩基
番号７０７１から塩基番号７６６０）により得られた抗
体］を用い、抗体アッセイ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ｓｅｃｔ
ｉｏｎ１８）した。

【０１５７】（Ｇ）実験結果（１）無細胞転写翻訳実験（図９）（ｉ）ｐＳＮ２３４Ｓの無細胞翻訳産物の解析（図９
レーンｌ）：分子量２１ｋＤａ，７０ｋＤａ，２８ｋＤ
ａの３種のポリペプチドが認められた。これはｐ７０蛋
白内に存在するプロティナーゼ活性により、１本のポリ
プロティンが３本のポリペプチドに切断され生じたもの
である。

【０１５８】（ｉｉ）ｐＳＮ２３４Ｓ／Ｌ１０２６Ｉの
無細胞翻訳産物の解析（図９レーン２）：分子量９１
ｋＤａ，２８ｋＤａの２種のポリペプチドが認められ
た。これは、ｐ２１とｐ７１の切断点に存在するロイシ
ンがイソロイシンに置き換わったため、ｐ７０から産生
されたプロテイナーゼによって、ｐ２１とｐ７０の切断
点が認識されなかったためである。

【０１５９】（ｉｉｉ）ｐＳＮ２３４Ｓ／Ｌ１０２６Ｖ
の無細胞翻訳産物の解析（図９レーン３）：分子量９
１ｋＤａ，２８ｋＤａの２種のポリペプチドが認められ
た。これは、ｐ２１とｐ７１の切断点に存在するロイシ
ンがバリンに置き換わったため、ｐ７０から産生された
プロテイナーゼによって、ｐ２１とｐ７０の切断点が認
識されなかったためである。

【０１６０】以上，（ｉ）−（ｉｉｉ）の結果より、ｐ
２１とｐ７０の切断には１０２６番目のロイシンが関与
しており、ロイシンをイソロイシンまたはバリンに変異
させたｐＳＮ２３４Ｓ／Ｌ１０２６Ｉ、ｐＳＮ２３４Ｓ
／Ｌ１０２６Ｖにおいては、ｐ７０から産生されるプロ
テイナーゼによって、認識されないことが判った。

【０１６１】（ｉｖ）ｐＳＮ２３４Ｓｐ−６ｄｈｆｒの
無細胞翻訳産物の解析（図９レーン４）：分子量２１
ｋＤａ，７０ｋＤａ，２４ｋＤａの３種によってポリペ
プチドが認められた。これはｐ７０から産生されたプロ
テイナーゼによって、ｐ２１とｐ７０、ｐ７０とｐ３１
が切断されるためである。

【０１６２】（ｖ）ｐＳＮ２３４Ｓｐ−６ｄｈｆｒ／Ｔ
１６５７Ｎの無細胞翻訳産物の解析（図９レーン
５）：分子量２１ｋＤａ，９４ｋＤａの２種のポリペプ
チドが認められた。これは、ｐ７０とｐ３１の切断点に
存在するスレオニンがアスパラギンに置き換わったた
め、ｐ７０から産生されたプロテイナーゼによって、ｐ
７０とｐ３１の切断点が認識されなかったためである。

【０１６３】（２）細胞系での蛋白質発現実験（図１
０）（ｉ）ｐＣＭＶＮＳ２３４Ｓの細胞系での蛋白発現実験
（図１０レーン１）：ｐ７０抗体で検出したところ、
分子量約１２０ｋＤａ，７０ｋＤａの２種のポリプロテ
インが検出された。１２０ｋＤａの蛋白は、プロテイナ
ーゼによって切断される前の前駆体蛋白に相当し、７０
ｋＤａの蛋白は切断後に産生される蛋白に相当する。

【０１６４】（ｉｉ）ｐＣＭＶＮＳ／Ｍ１の細胞系での
蛋白発現実験（図１０レーン２）：ｐ７０抗体で検出
したところ、前駆体蛋白のみが検出された。これは、セ
リンプロテイナーゼの活性中心である１１６５番目のセ
リンがアラニンに置換されたため、プロテイナーゼ活性
を失い、前駆体蛋白のプロセッシングがなされなかった
ためである。ｐ５８抗体で検出したところ、同様に前駆
体蛋白のみが検出された。

【０１６５】（ｉｉｉ）細胞内でｐＣＭＶＮＳ２３４Ｓ
とｐＣＭＶＮＳ／Ｍ１とをコトランスフェクトすること
による蛋白発現実験（図１０レーン３）：ｐ５８抗体
で検出したところ、前駆体蛋白と５８ｋＤａの蛋白が検
出された。これは、ｐＣＭＶＮＳ２３４Ｓから産生され
る、セリンプロテイナーゼを含むｐ７０蛋白がｐＣＭＶ
ＮＳ／Ｍ１から産生される前駆体蛋白のｐ３１とｐ５８
蛋白間、ｐ５８とｐ６６蛋白間を切断してｐ５８蛋白を
産生するためである。

【０１６６】以上，（ｉ）−（ｉｉｉ）の結果より、ｐ
３１とｐ５８の切断には１９４０−１９８０番目の領域
に切断点が存在することが推定される。

【０１６７】（ｉｖ）ｐＣＭＶ／ＮＳ５ＰＮＳの細胞系
での蛋白発現実験（図１０レーン５）：ｐ５８抗体で
検出したところ、分子量約１２０ｋＤａの蛋白のみが検
出された。

【０１６８】（ｖ）ｐＣＭＶＮＳ２３４ＳとｐＣＭＶ／
ＮＳ５ＰＮＳの細胞系での蛋白発現実験（図１０レー
ン６）：ｐ５８抗体で検出したところ、前駆体蛋白と４
６ｋＤａの蛋白が検出された。これは、ｐＣＭＶから産
生される、セリンプロテイナーゼを含むｐ７０蛋白がｐ
ＣＭＶ／ＮＳ５ＰＮＳから産生される蛋白の、ｐ５８と
ｐ６６蛋白間を切断してｐ４６蛋白を産生するためであ
る。

【０１６９】以上の結果より、ＨＣＶゲノムにコードさ
れるセリンプロテイナーゼによって切断されるＨＣＶ蛋
白の切断部位は、ＨＣＶ−ＯＲＦ上アミノ酸番号で１９
４０−１９８０と２４１０−２４４０の領域に存在する
ことが推定される。実施例６：ウイルス蛋白分解酵素反
応のアッセイ法（１）アッセイ法−１酵素反応酵素反応は１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．２、１０
ｍＭβ−メルカプトエタノール存在下３７℃で行う。ｐ
ＭＡＮＳ３４ＮＳ＋ｄｈｆｒの発現産物（ＭＢＰ−ＮＳ
３４−ＤＨＦＲ）の自己分解反応は上記反応溶液５０μ
ｌ中、蛋白約１０μｇを３７℃で反応させ、蛋白分解酵
素活性による２４ＫＤのＮＳ４−ＤＨＦＲ蛋白の生成を
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分析する。泳動
された蛋白をニトロセルロースあるいはポリフッ化ビニ
リデン膜に転写する。これにＤＨＦＲ蛋白に対する抗血
清を反応させ、さらに標識された血清アルブミンに対す
る抗血清で染色して、ウエスタンブロット法で検出し、
ＨＣＶ−ＯＲＦ上アミノ酸番号１６５７番目と１６５８
番目の間の自己切断活性を確認した。

【０１７０】ＭＢＰ−ＮＳ３４−ＤＨＦＲなど発現酵素
蛋白の、ウイルス由来蛋白を切断する活性の測定を行う
が、本アッセイでは、本明細書に記載する切断部位を含
むウイルス由来蛋白を大腸菌などで発現させて生成し、
これを基質として用いる。

【０１７１】ウイルス蛋白分解酵素の力価は、２７ＫＤ
の基質と分子間切断反応によって生じた生成物との割合
から、１時間で切断するマイクロモル数で定義すること
ができる。

【０１７２】（２）アッセイ法−２バクテリア内で
のウイルス蛋白切断反応バクテリアでｄｅｎｏｖｏ生成したウイルス蛋白分解
酵素の自己切断活性の検出には、プラスミドを大腸菌に
形質転換し、大腸菌内でＭＢＰ−ＮＳ３４−ＤＨＦＲの
生成をＩＰＴＧ添加で誘導する。誘導された蛋白の切断
生成物をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に付し、
生成物である２４ＫＤのＮＳ４−ＤＨＦＲをウエスタン
ブロット法で検出し、ＨＣＶ−ＯＲＦ上アミノ酸番号１
６５７番目と１６５８番目の間の自己切断活性を確認し
た。

【０１７３】（３）アッセイ法−３無細胞系転写翻訳系実施例５の（Ｅ）無細胞系転写翻訳系を用いて、ｐＳＮ
２３４Ｓの無細胞系転写翻訳産物の解析を行い、ＮＳ３
抗体に反応するｐ７０蛋白を検出し、ＨＣＶ−ＯＲＦ上
アミノ酸番号１０２６番目と１０２７番目の間、および
１６５７番目と１６５８番目の間の自己切断活性を確認
した。

【０１７４】（４）アッセイ法−４細胞系での蛋白発現実験実施例５の（Ｆ）細胞系での蛋白発現実験を用いて、ｐ
ＣＭＶＳＮ２３４ＳをＣＯＳ細胞にトランスフェクトし
て発現産物の解析を行い、ＮＳ３抗体に反応するｐ７０
蛋白を検出し、自己切断活性を検討した。

【０１７５】また、ｐＳＮ２３４Ｓ（酵素用ベクター）
とｐＣＭＶＮＳ／Ｍ１（蛋白用ベクター）とをコトラン
スフェクトして発現産物の解析を行い、ｐ５８抗体に反
応するｐ５８蛋白を検出し、分子間反応によるＮＳ４と
ＮＳ５Ａの間、およびＮＳ５ＡとＮＳ５Ｂの間の分子間
切断活性を検出した。

【０１７６】なお、ＨＣＶ蛋白質のプロセシングを表す
模式図を図１１に示す。

【０１７７】

【発明の効果】本発明によって、Ｃ型肝炎ウイルス蛋白
を特異的な部位で切断するＣ型肝炎ウイルス蛋白分解酵
素を精製した蛋白として得ることができ、その活性を検
出することができた。この酵素を用いて該酵素の阻害剤
をスクリーニングすることによって、Ｃ型ウイルス性肝
炎の治療薬の開発を行うことができ、本発明の効果は極
めて有用である。

【０１７８】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３３６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列配列番号：２配列の長さ：９１６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列配列番号：３配列の長さ：１００８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｇｅｎｏｍｉｃＲＮＡ配列配列番号：４配列の長さ：２７４８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｇｅｎｏｍｉｃＲＮＡ配列配列番号：５配列の長さ：１２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ配列ＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧ配列番号：６配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ配列ＴＴＴＧＴＡＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＴ配列番号：７配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ配列ＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣ配列番号：８配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ配列ＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＴＡＧＡＧＣＣＣＧＴＣ配列番号：９配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ配列ＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＴＡ配列番号：１０配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ配列ＧＴＣＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡ配列番号：１１配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ配列ＴＧＧＴＡＧＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＴＧＡＧＴ配列番号：１２配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ配列ＡＣＴＣＡＡＣＴＧＡＣＴＣＧＡＣＴＡＣＣＡ配列番号：１３配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ配列ＴＣＡＧＣＧＧＧＣＧＴＧＡＧＣＴＣＡＴＡ配列番号：１４配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ配列ＡＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＣＡＧＡＣＡＧＴ配列番号：１５配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ配列ＡＴＧＡＣＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＧ配列番号：１６配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ配列ＣＴＧＣＡＴＴＣＣＴＴＧＣＴＣＧＡＴＧＴ配列番号：１７配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ配列ＧＴＴＣＧＡＴＧＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＧＴ配列番号：１８配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ配列ＣＡＴＣＣＡＣＴＧＣＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣ配列番号：１９配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ配列ＧＴＣＣＡＣＣＣＧＣＧＧＡＧＣＣＣＴＴＣ配列番号：２０配列の長さ：１０４２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｇｅｎｏｍｉｃＲＮＡ配列の特徴：特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１１．．１０４２特徴を決定した方法：Ｅ配列配列番号：２１配列の長さ：２７７７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｇｅｎｏｍｉｃＲＮＡ配列の特徴：特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：９．．２７７７特徴を決定した方法：Ｅ配列配列番号：２２配列の長さ：３０１０，９４３１配列の型：アミノ酸，核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＲＮＡ配列

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＮ７２２−１９０７（ＨＣＶゲノムＲＮＡの
一部に相当するｃＤＮＡ断片を含むプラスミド）構築の
方法の概略を示す。

【図２】図１における結合方法の概略を示す。

【図３】図１における結合方法２の概略を示す。

【図４】ｐＮ７２２−１９０７の欠失変異体および点突
然変異体を示す。

【図５】ｐＮ７２２−１９０７、その欠失変異体および
点突然変異体の無細胞転写翻訳産物のＳＤＳ電気泳動法
による解析結果を示す。

【図６】Ｃ型肝炎ウイルスの非構成蛋白質に存在するセ
リンプロテイナーゼ活性領域を含む遺伝子を組み込んだ
バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ９４１
の作製手順を示す。

【図７】組換えバキュロウイルスにより産生した蛋白質
のウエスタンブロット法による結果を示す。

【図８】本発明に使用したプラスミドを示す。

【図９】無細胞転写翻訳実験の結果を示す。

【図１０】細胞系での蛋白発現実験の結果を示す。

【図１１】Ｃ型肝炎ウイルス蛋白質のプロセシングを示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｚ // Ｃ０７Ｋ 14/18 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）特許法第30条第１項適用申請有り平成３年８月10日、日本癌学会発行の「第50回日本癌学会総会記事」に発表 (72)発明者土方誠東京都中央区佃２−21−11 (72)発明者加藤宣之東京都目黒区東が丘２−５−20 国立がんセンター宿舎ＲＥ−41 (72)発明者大津山祐子東京都中央区築地５−１−１国立がんセンター宿舎Ａ−14 (72)発明者丹生谷博東京都江東区豊洲４−10−５−1306 (72)発明者垣内信子大阪府大阪市中央区北浜４丁目５番33号住友金属工業株式会社内 (72)発明者菰田泰正大阪府大阪市中央区北浜４丁目５番33号住友金属工業株式会社内 (72)発明者許斐康嗣大阪府大阪市中央区北浜４丁目５番33号住友金属工業株式会社内 (72)発明者丹治保典神奈川県横浜市鶴見区岸谷４−34 ＮＫＫ社宅Ｃ−407 (72)発明者広渡祐史神奈川県海老名市河原口 2398 東ソー厚木寮

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】のアミノ酸配列もしくはその一部を含有するプロテイナ
ーゼ。
【請求項２】Ｃ型肝炎ウイルス蛋白を、Ｃ型肝炎ウイ
ルス蛋白のアミノ酸番号１０２６−１０２７間で切断す
る請求項１記載のプロテイナーゼ。
【請求項３】のアミノ酸配列もしくはその一部を含有するプロテイナ
ーゼ。
【請求項４】Ｃ型肝炎ウイルス蛋白を、Ｃ型肝炎ウイ
ルス蛋白のアミノ酸番号１６５７−１６５８間で切断す
る請求項３記載のプロテイナーゼ。
【請求項５】をコードするＤＮＡもしくはその一部を含有するＤＮＡ
配列。
【請求項６】をコードするＤＮＡもしくはその一部を含有するＤＮＡ
配列。
【請求項７】もしくはその一部を含有する請求項５記載のＤＮＡ配
列。
【請求項８】もしくはその一部を含有する請求項６記載のＤＮＡ配
列。
【請求項９】請求項５、６、７または８記載のＤＮＡ
配列を含むベクター。
【請求項１０】請求項９記載のベクターで形質転換し
た細胞。
【請求項１１】請求項８記載の形質転換体を培養する
ことからなる、請求項１もしくは２記載のプロテイナー
ゼの製造法。
【請求項１２】請求項１または２記載のプロテイナー
ゼを用いて、Ｃ型肝炎ウイルス蛋白の切断反応の進行を
検出することからなる、Ｃ型肝炎ウイルスプロテイナー
ゼ活性のアッセイ法において、（i）該精製したＣ型
肝炎ウイルスプロテイナーゼと、Ｃ型肝炎ウイルスプロ
テイナーゼによって切断されるアミノ酸配列を含む基質
ポリペプチドとを試験管内で反応させる系、あるいは
（ii）大腸菌、動物培養細胞、昆虫細胞、またはウサ
ギ網状赤血球溶血液を用いる無細胞翻訳系で、Ｃ型肝炎
ウイルスプロテイナーゼと基質蛋白質とを同時に発現さ
せ、細胞内または無細胞翻訳系内でプロテイナーゼと基
質を反応させる系、を用いる上記アッセイ法。
【請求項１３】請求項１または２記載のプロテイナー
ゼを用いて、反応系に試験化合物を添加し、Ｃ型肝炎ウ
イルス蛋白の切断反応の進行を、試験化合物添加のもの
と添加しないものとで比較することからなる、Ｃ型肝炎
ウイルスプロテイナーゼ阻害剤のアッセイ法において、
（i）該精製したＣ型肝炎ウイルスプロテイナーゼ
と、Ｃ型肝炎ウイルスプロテイナーゼによって切断され
るアミノ酸配列を含む基質ポリペプチドとを試験管内で
反応させる系、あるいは（ii）大腸菌、動物培養細
胞、昆虫細胞、またはウサギ網状赤血球溶血液を用いる
無細胞翻訳系で、Ｃ型肝炎ウイルスプロテイナーゼと基
質蛋白質とを同時に発現させ、細胞内または無細胞翻訳
系内でプロテイナーゼと基質を反応させる系、を用いる
上記アッセイ法。