PL206255B1

PL206255B1 - Inhibitor proteazy wirusa zapalenia wątroby C, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie inhibitora do wytwarzania leku do leczenia chorób związanych z HCV oraz zastosowanie do wytwarzania kompozycji do stosowania w kombinowanej terapii

Info

Publication number: PL206255B1
Application number: PL366063A
Authority: PL
Inventors: Anil K. Saksena; Viyyoor Moopil Girijavallabhan; Raymond G. Lovey; Edwin E. Jao; Frank Bennett; Cormick Jinping L. Mc; Haiyan Wang; Russell E. Pike; Stephane L. Bogen; Tin-Yau Chan; Yi-Tsung Liu; Zhaoning Zhu; F.George Njoroge; Ashok Arasappan; Tejal N. Parekh; Ashit K. Ganguly; Kevin X. Chen; Srikanth Venkatraman; Henry A. Vaccaro; Patrick A. Pinto
Original assignee: Dendreon Corporationdendreon Corporation; Schering Corporationschering Corporation
Priority date: 2000-07-21
Filing date: 2001-07-19
Publication date: 2010-07-30
Also published as: USRE43298E1; HUP0401730A2; CN1498224A; HK1058047A1; CN102206247A; ATE461207T1; ES2341534T3; JP4298289B2; WO2002008244A3; DK1385870T3; NO2013003I2; CY2011020I1; CZ2003151A3; EP1385870A2; PT1385870E; CN102206247B; IL153670A; IL153670A0; US20110117057A1; HU229997B1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe inhibitory proteazy wirusa zapalenia wątroby C (HCV), kompozycje farmaceutyczne zawierające jeden lub wiele takich inhibitorów, sposoby wytwarzania takich inhibitorów i sposoby stosowania takich inhibitorów do leczenia zapalenia wątroby C i zaburzeń pokrewnych. Konkretnie przedmiotem wynalazku są nowe związki peptydowe jako inhibitory proteazy serynowej NS3/NS4a HCV.

Wirus zapalenia wątroby C (HCV) to wirus o jednoniciowym RNA mającym polarność dodatnią (+), uznany za główny czynnik przyczynowy w zapaleniu wątroby nie-A, nie-B (NANBH), szczególnie w NANBH zwią zanym ze krwią (BB-NANBH) (patrz, publikacja WO-69/04669 i EP-381216). NANBH należy odróżnić od innych typów chorób wątroby wywoływanych przez wirusy, jak wirus zapalenia wątroby A (HAV), wirus zapalenia wątroby B (HBV), wirus zapalenia wątroby delta (HDV), cytomegalowirus (CMV) i wirus Epsteina-Barr (EBV), jak również od innych postaci chorób wątroby, jak alkoholizm i marskość wątroby żółciowa pierwotna.

Ostatnio zidentyfikowano, sklonowano i wyrażono proteazę HCV niezbędną do przetwarzania polipeptydu i replikacji wirusowej; (patrz, np. publikacja US-5712145). Ta licząca w przybliżeniu 3000 aminokwasów poliproteina zawiera, od końca aminowego do końca karboksylowego, białko nukleokapsydu (C), białka otoczki (E1 i E2) i kilka białek niestrukturalnych (NS1, 2, 3, 4a, 5a i 5b). NS3 jest białkiem mającym w przybliżeniu 68 kDa, kodowanym przez w przybliżeniu 1893 nukleotydy genomu HCV, i ma dwie odrębne domeny: (a) domenę proteazy serynowej składającą się z w przybliżeniu 200 aminokwasów N-końcowych; i (b) domenę ATPazy RNA-zależnej na C-końcu białka. Proteazę NS3 uważa się za członka rodziny chymotrypsyny ze względu na podobieństwa sekwencji białkowej, ogólnej struktury trójwymiarowej oraz mechanizmu katalizy. Innymi enzymami podobnymi do chymotrypsyny są elastaza, czynnik Xa, trombina, trypsyna, plazmina, urokinaza, tPA i PSA. Proteaza serynowa NS3 HCV jest odpowiedzialna za proteolizę polipeptydu (poliproteiny) na połączeniach NS3/NS4a, NS4a/NS4b, NS4b/NS5a i NS5a/NS5b i tak jest odpowiedzialna za wytwarzanie czterech białek wirusowych przy replikacji wirusowej. Uczyniło to proteazę serynową NS3 HCV atrakcyjnym celem dla chemioterapii przeciwwirusowej.

Stwierdzono, że białko NS4a, polipeptyd o wielkości w przybliżeniu 6 kDa, stanowi kofaktor dla aktywności proteazy serynowej NS3. Autorozszczepianie połączenia NS3/NS4a przez proteazę serynową NS3/NS4a następuje wewnątrzcząsteczkowo (tj. cis), zaś inne miejsca rozszczepiania są przetwarzane międzycząsteczkowo (tj. trans).

Analiza naturalnych miejsc rozszczepiania proteazy HCV ujawniła obecność cysteiny w pozycji P1 i seryny w pozycji P1', i że te reszty są ściśle zachowywane w połączeniach NS4a/NS4b,

NS4b/NS5a i NS5a/NS5b. Połączenie NS3/NS4a zawiera treoninę w pozycji P1 i serynę w pozycji

P1'. Postuluje się, że podstawienie Cys > Thr w pozycji NS3/NS4a odpowiada za wymaganie przetwarzania cis zamiast trans w miejscu tego połączenia. Patrz, np. Pizzi i in. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 91: 888-892, Failla i in. (1996) Folding&Design 1:35-42. Miejsce rozszczepiania NS3/NS4a jest także bardziej tolerancyjne dla mutagenezy niż inne miejsca. Patrz, np. publikacja Kollykhalov i in. (1994) J. Virol. 68: 7525-7533. Stwierdzono także, że dla wydajnego rozszczepiania potrzebne są reszty kwasowe w regionie przed miejscem rozszczepiania. Patrz, np. Komoda i in. (1994) J. Virol. 68: 7351-7357.

Opisane inhibitory proteazy HCV obejmują przeciwutleniacze (patrz publikacja WO 98/14181), pewne peptydy i analogi peptydów (patrz WO 98/17679, Landro i in. (1997) Biochem. 36: 9340-9348, Ingallinella i in. (1998) Biochem. 37: 8906-8914. Llinas-Brunet i in. (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8: 1713-1718), inhibitory oparte o liczący 70 aminokwasów polipeptyd eglinę c (Martin i in. (1998) Biochem. 37: 11459-11468, inhibitory powinowactwa wybrane spośród ludzkiego inhibitora wydzielania trzustkowego trypsyny (hPSTI-C3) i repertuarów miniciał (MBip) (Dimasi i in. (1997) J. Virol. 71: 74617469), cVHE2 (fragment wielbłądzi domeny zmiennej przeciwciała) (Martin i in. (1997) Protein Eng. 10: 607-614), i a1-antychymotrypsynę (ACT) (Elzouki i in.) (1997) J. Hepat. 27: 42-28). Ostatnio ujawniono rybozym skonstruowany w celu selektywnego niszczenia RNA wirusa zapalenia wątroby C (patrz BioWorld Today 9(217): 4 (10 listopada 1998)).

Czyni się także odniesienie do publikacji PCT nr WO 98/17679, opublikowanej 30 kwietnia 1998 (Vertex Pharmaceuticals Incorporated); WO 98/22496, opublikowanej 28 maja 1998 (F. Hoffmann-La Roche AG); i WO 99/07734, opublikowanej 18 lutego 1999 (Boehringer Ingelheim Canada Ltd.).

PL 206 255 B1

Domniemywa się udział HCV w marskości wątroby i w indukcji raka wątrobowokomórkowego. Prognoza dla pacjentów cierpiących na zakażenie HCV jest obecnie zła. Zakażenie HCV trudniej jest leczyć niż inne postacie zapalenia wątroby wskutek braku odporności lub remisji związanej z zakażeniem HCV. Bieżące dane wskazują mniejszy niż 50% współczynnik przeżycia po czterech latach od diagnozy marskości wątroby. Zdiagnozowani pacjenci z umiejscowionym operacyjnym rakiem wątrobowokomórkowym mają w okresie pięciu lat współczynnik przeżycia wynoszący 10-30%, podczas gdy pacjenci z umiejscowionym nieoperacyjnym rakiem wątrobowokomórkowym mają w okresie pięciu lat współczynnik przeżycia wynoszący mniej niż 1%.

Czyni się odniesienie do publikacji A. Marchetti i in., Synlett, S1 1000-1002 (1999) opisującej syntezę bicyklicznych analogów inhibitora proteazy NS3 HCV. Ujawniony tam związek ma wzór:

Czyni się także odniesienie do publikacji W. Han i in., Bioorganic&Medicinal Chem. Lett., (2000)

10, 711-713, która opisuje wytwarzanie pewnych α-ketoamidów, α-ketoestrów i α-diketonów zawierających grupy funkcyjne allilowe i etylowe.

Czyni się także odniesienie do publikacji WO 00/09558 (dla Boehringer Ingelheim Limited; opublikowanej 24 lutego 2000), która ujawnia pochodne peptydowe o wzorze:

gdzie rozmaite parametry są zdefiniowane tamże. Przykładowy związek z tamtej serii stanowi:

PL 206 255 B1

Czyni się także odniesienie do publikacji WO 00/09543 (dla Boehringer Ingelheim Limited; opublikowanej 24 lutego 2000), która ujawnia pochodne peptydowe o wzorze:

Bieżące terapie zapalenia wątroby C obejmują interferon α (INF_a) oraz terapię skojarzoną rybawiryną i interferonem. Patrz np. Beremguer i in. (1998) Proc. Assoc. Am. Physicians 110(2): 98-112. Wadą tych terapii jest niski współczynnik utrzymującej się odpowiedzi i częste działania uboczne. Patrz np. Hoofnagle i in. (1997) N. Engl. J. Med. 336: 347. Obecnie nie ma dostępnej szczepionki na zakażenie HCV.

Rozpatrywane i wspólnie rozpatrywane zgłoszenia patentowe USA, nr 60/194607, zgłoszone 5 kwietnia 2000, i nr 60/198204, zgłoszone 19 kwietnia 2000, nr 60/220110, zgłoszone 21 lipca 2000, nr 60/220109, zgłoszone 21 lipca 2000, nr 60/220107, zgłoszone 21 lipca 2000, nr 60/254869, zgłoszone 12 grudnia 2000, i nr 60/220101, zgłoszone 21 lipca 2000, ujawniają rozmaite typy peptydów i/lub inne związki jako inhibitory proteazy serynowej NS3 wirusa zapalenia wątroby C.

Istnieje zapotrzebowanie na nowe sposoby leczenia i terapie zakażenia HCV. Przedmiotem wynalazku są związki przydatne do leczenia lub zapobiegania lub łagodzenia jednego lub wielu objawów zapalenia wątroby C.

Takie związki mają zastosowanie w sposobach leczenia lub zapobiegania lub łagodzenia jednego lub wielu objawów zapalenia wątroby C.

Związki według wynalazku mają także zastosowanie w sposobie modulowania aktywności proteaz serynowych, szczególnie proteazy serynowej NS3/NS4a HCV.

Związki według wynalazku mają zastosowanie w sposobach modulacji przetwarzania polipeptydu HCV.

Przedmiotem wynalazku jest nowa klasa inhibitorów proteazy HCV przedstawiona wzorem ogólnym I, kompozycje farmaceutyczne zawierające takie związki, oraz zastosowanie takich związków do wytwarzania leku do leczenia chorób związanych z HCV, oraz zastosowanie takich związków do wytwarzania kompozycji do stosowania w kombinowanej terapii do leczenia chorób związanych z wirusem zapalenia wątroby typu C, a taka terapia obejmuje podawanie (i) związku oraz (ii) interferonu.

PL 206 255 B1

Związki mogą być stosowane w sposobie modulowania oddziaływania polipeptydu HCV z proteazą HCV. Wśród podanych związków korzystne są takie, które hamują aktywność proteazy serynowej NS3/NS4a HCV.

Przedmiotem wynalazku jest związek, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery, oraz racematy, oraz jego farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, związek mający wzór ogólny I:

w którym:

Y jest wybrany z grupy składającej się z następujących ugrupowań: alkilu, alkiloarylu, heteroalkilu, heteroarylu, aryloheteroarylu, alkiloheteroarylu, cykloalkilu, alkiloksy, alkiloaryloksy, aryloksy, heteroaryloksy, heterocykloalkiloksy, cykloalkiloksy, alkiloamino, aryloamino, alkiloaryloamino, aryloamino, heteroaryloamino, cykloalkiloamino oraz heterocykloalkiloamino, przy czym Y może być ewentualnie podstawiony przez X¹¹ albo X¹²;

X¹¹ oznacza alkil, alkenyl, alkinyl, cykloalkil, cykloalkiloalkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, aryl, alkiloaryl, aryloalkil, heteroaryl, alkiloheteroaryl, albo heteroaryloalkil, przy czym X¹¹ może być dodatkowo ewentualnie podstawiony przez X¹²;

X¹² oznacza hydroksy, alkoksy, aryloksy, tio, alkilotio, arylotio, amino, alkiloamino, aryloamino, alkilosulfonyl, arylosulfonyl, alkilosulfonamido, arylosulfonamido, karboksy, karbalkoksy, karboksamido, alkoksykarbonyloamino, alkoksykarbonyloksy, alkiloreido, aryloureido, halogen, cyjano, albo nitro, przy czym dany alkil, alkoksy, oraz aryl może być dodatkowo ewentualnie podstawiony przez ugrupowania niezależnie wybrane spośród X¹²;

R¹ oznacza COCONR⁹R¹⁰, w którym R⁹ oznacza H, R¹⁰ oznacza H, R¹⁴, [CH(R^1')]pCOOR¹¹, [CH(R^1')]pCONR¹²R¹³, [CH(R^1')]pSO2R¹¹, [CH(R^1')]pCOR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2')COOR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2'), CONR¹²R¹³, albo CH(R^1')CONHCH(R^2')(R'), w których R^1', R^2', R¹¹, R¹², oraz R¹³ są niezależnie wybrane z grupy składającej się z: H, alkilu, arylu, heteroalkilu, heteroarylu, cykloalkilu, alkiloarylu, alkiloheteroarylu, aryloalkilu oraz heteroaralkilu, i gdzie R¹⁴ oznacza H, alkil, aryl, heteroalkil, heteroaryl, cykloalkil, alkiloaryl, alkiloheteroaryl, aryloalkil, alkenyl, alkinyl albo heteroaralkil;

Z jest wybrany spośród O, N, CH albo CR;

W może występować albo nie, i jeśli występuje to W jest wybrany spośród C=O, C=S, C(=N-CN), albo SO2;

Q może występować albo nie, i jeśli wystę puje to Q oznacza CH, N, P, (CH2)p, (CHR)p, (CRR')p, O, NR, S, albo SO2; a gdy Q nie występuje to M może występować albo nie; gdy Q oraz M nie występują to A jest bezpośrednio przyłączony do L;

A oznacza O, CH2, (CHR)p, (CHR-CHR')p, (CRR')p, NR, S, albo SO2;

E oznacza CH, N, CR, albo podwójne wią zanie w kierunku A, L albo G;

G może występować albo nie, i jeśli występuje to G oznacza (CH2)p, (CHR)p, albo (CRR')p; a gdy G nie występuje to J występuje i E jest bezpośrednio przyłączony do atomu węgla we wzorze I tak jak jest przyłączony G;

J moż e występować albo nie, i jeśli występuje to J oznacza (CH2)p, (CHR)p, albo (CRR')p, SO2, NH, NR albo O; a gdy J nie występuje, G występuje i E jest bezpośrednio przyłączony do N we wzorze I tak jak jest przyłączony J;

L moż e wystę pować albo nie, i jeś li wystę puje to L oznacza CH, CR, O, S albo NR; a gdy L nie występuje, to M może występować albo nie; oraz jeśli M występuje i nie występuje L, to M jest bezpośrednio i niezależnie przyłączony do E, oraz J jest bezpośrednio i niezależnie przyłączony do E;

M moż e wystę pować albo nie, i je ś li wystę puje to M oznacza O, NR, S, SO2, (CH2)p, (CHR)p (CHR-CHR')p, albo (CRR')p;

p oznacza liczbę od 0 do 6; oraz

PL 206 255 B1

R, R', R², R³ oraz R⁴ są niezależnie wybrane z grupy składającej się z H; C1-C10 alkilu; C2-C10 alkenylu; C3-C8 cykloalkilu; C3-C8 heterocykloalkilu, alkoksy, aryloksy, alkilotio, arylotio, amino, amido, grupy estrowej, kwasu karboksylowego, karbaminianowej, ureidowej, ketonowej, aldehydowej, cyjano, nitro, halogenu; (cykloalkilo)alkilu oraz (heterocykloalkilo)alkilu, przy czym dany cykloalkil składa się z 3 do 8 atomów węgla, oraz 0 do 6 atomów tlenu, azotu, siarki, albo fosforu, oraz dany alkil ma 1 do 6 atomów węgla; arylu; heteroarylu; alkiloarylu; oraz alkiloheteroarylu;

przy czym dany alkil, heteroalkil, alkenyl, heteroalkenyl, aryl, heteroaryl, cykloalkil oraz heterocykloalkil może być ewentualnie i chemicznie odpowiednio podstawiony, przy czym określenie podstawiony odnosi się do ewentualnego i chemicznie odpowiedniego podstawienia przez jedno albo więcej ugrupowań wybranych z grupy składającej się z alkilu, alkenylu, alkinylu, arylu, aralkilu, cykloalkilu, heterocyklu, halogenu, hydroksy, tio, alkoksy, aryloksy, alkilotio, arylotio, grupy amino innej niż dla R² amido, grupy estrowej, kwasu karboksylowego, karbaminianowej, ureidowej, ketonowej, aldehydowej, cyjano, nitro, sulfonamidowej, sulfotlenku, sulfonu, sulfonyloureidowej, hydrazydu, oraz hydroksamianowej;

ponadto ugrupowanie N-C-G-E-L-J-N oznacza pięcio- albo sześcio-członowy cykliczny pierścień, przy czym gdy ugrupowanie N-C-G-E-L-J-N oznacza pięcio-członowy cykliczny pierścień, albo gdy bicykliczny pierścień we wzorze I obejmując podstawniki N, C, G, E, L, J, N, A, Q, i M oznacza pięcio-członowy cykliczny pierścień, to w danym pięcio-członowym cyklicznym pierścieniu brak grupy karbonylowej jako część cyklicznego pierścienia;

przy czym, jeżeli nie podano inaczej, to wyżej stosowane określenia mają poniższe znaczenia: alkil, w tym alkilowa część alkoksy odnosi się do monowartościowej grupy pochodzącej z prostego lub rozgałęzionego nasyconego łańcucha węglowodorowego po usunięciu jednego atomu wodoru, mającej od 1 do 8 atomów węgla;

alkenyl i alkinyl oznaczają grupy mające od 2 do 10 atomów węgla; aryl oznacza grupę karbocykliczną mającą od 6 do 14 atomów węgla, i mającą co najmniej jeden benzenoidowy pierścień, przy czym wszystkie możliwe do podstawienia aromatyczne atomy węgla grupy karbocyklicznej są możliwymi punktami przyłączenia;

aralkil oznacza ugrupowanie zawierające arylową grupę przyłączone poprzez niższy alki; alkiloaryl oznacza ugrupowanie zawierające niższą grupę alkilową przyłączoną poprzez grupę arylową;

cykloalkil oznacza nasycony karbocykliczny pierścień mając od 3 do 8 atomów węgla, ewentualnie podstawiony;

heterocykliczny oznacza obok grup heteroarylowych, nasycone albo nienasycone cykliczne organiczne grupy mające co najmniej jeden atom O, S i/albo N przerywający strukturę karbocyklicznego pierścienia, która składa się z jednego pierścienia, albo dwóch skondensowanych pierścieni, przy czym każdy pierścień jest 5-, 6- albo 7- członowy i może mieć, albo nie mieć, podwójne wiązania którym brak zdelokalizownych elektronów pi, przy czym struktura opierścienia ma od 2 do 8 atomów węgla;

halogen oznacza fluor, chlor, brom albo jod;

heteroaryl oznacza cykliczną organiczną grupę mającą co najmniej jeden atom O, S i/albo N przerywający strukturę karbocyklicznego pierścienia i mający wystarczającą ilość zdelokalizowanych elektronów pi dla nadania aromatycznego charakteru, aromatyczna grupa heterocykliczna ma od 2 do 14 atomów węgla;

oraz, jeżeli nie podano inaczej, określenia „podstawiony albo niepodstawiony albo „ewentualnie podstawiony odnoszą się do danych ugrupowań ewentualnie i chemicznie trwale podstawionych ugrupowaniami określonymi jako R¹² albo R¹³.

Korzystny jest związek, w którym R¹⁰ oznacza H, R¹⁴, CH(R^1')COOR¹¹, CH(R^1')CH(R^1')COOR¹¹,

CH(R^1')CONR¹²R¹³, CH(R^1')CH(R^1') CONR¹²R¹³, CH(R^1')CH(R^1') SO₂R¹¹, CH(R^1')CH(R^1')COR¹¹,

CH(R^1')CONHCH(R^2')COOR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2') CONR¹²R¹³, albo CH(R^1')CONHCH(R^2')(R^'), w których R^1' oznacza H albo alkil, oraz R^2' oznacza fenyl, podstawiony fenyl, hetero atom-podstawiony fenyl, tiofenyl, cykloalkil, piperydyl albo pirydyl.

Zwłaszcza związek w którym R^1' oznacza H.

Korzystny jest związek, w którym R¹¹ oznacza H, metyl, etyl, allil, tert-butyl, benzyl, α-metylobenzyl, α,α-dimetylobenzyl, 1-metylocyklopropyl albo 1-metylocyklopentyl;

R' oznacza hydroksymetyl albo CH₂CONR¹²R¹³;

PL 206 255 B1

2'

R^2' jest niezależnie wybrany spośród grupy składającej się z:

w których:

U¹ oraz U² mogą być takie same, albo różne, i są wybrane spośród H, F, CH2COOH, CH2COOMe, CH2CONH2, CH2CONHMe, CH2CONMe2, azydo, amino, hydroksyl, podstawiony amino, podstawiony hydroksyl;

U³ oraz U⁴ mogą być takie same, albo różne, i są wybrane spośród O oraz S;

U⁵ jest wybrany z ugrupowań składających się z alkilosulfonylu, arylosulfonylu, heteroalkilosulfonylu, heteroarylosulfonylu, alkilokarbonylu, arylokarbonylu, heteroalkilokarbonylu, heteroarylokarbonylu, alkoksykarbonylu, aryloksykarbonylu, heteroaryloksykarbonylu, alkiloaminokarbonylu, aryloaminokarbonylu, heteroaryloaminokarbonylu, albo ich kombinacji;

oraz NR¹²R¹³ jest wybrany z grupy składającej się z:

/-ΝΗ₂, NHMe, ś-NH-n-Pr, |~N(Me)OMe,

PL 206 255 B1 w których U⁶ oznacza H, OH, albo CH2OH, oraz 14

R¹⁴ jest wybrany z grupy składającej się z: H, Me, Et, n-propylu, metoksy, cyklopropylu, n-butylu, 1-but-3-ynylu, benzylu, α-metylobenzylu, fenetylu, allilu, 1-but-3-enylu, OMe, cyklopropylometylu.

Korzystny jest związek, w którym R² jest wybrany z grupy składającej się z następujących ugrupowań:

PL 206 255 B1

Zwłaszcza korzystny jest związek, w którym R³ jest wybrany z grupy składającej się z:

'ΧΑΛΑ.

'WW λλαλ.

•χλλλ.

aaaa.

ΧΛΑΛ

Λ/ννυ

ΧΑΛΑ χαλα xaaa

ΧΑΛΑ

ΧΑΧΑ

ΧΑΛΑ

SCH

COOEt

COR

ΧΑΛΑ

COOH

SBn

COOH

PL 206 255 B1

w których R³¹ = OH albo O-alkil;

Y¹⁹ jest wybrany spośród następujących ugrupowań:

oraz Y²⁰ jest wybrany spośród następujących ugrupowań:

ch₃

PL 206 255 B1 ₃

Korzystny jest związek, w którym R jest wybrany z grupy składającej się z następujących ugrupowań:

Korzystny jest związek, w którym Z oznacza N oraz R⁴ oznacza H. Korzystny jest związek, w którym W oznacza C=O.

PL 206 255 B1

Korzystny jest związek, w którym Y jest wybrany spośród następujących ugrupowań:

PL 206 255 B1

COOH

HOOC'

COOH

OTHP

CHa^^rg/ ηοοοΧχΟζ

CH₃ ch₃

HOO

HOOO^\

HaCOOC^^

Ηοοσ^ζ

ΗΟΟΟη/γ

X hooc y

HOO θ3^Η7ΑΧ\₍ y

CH₃ ^H3CX

H₃c^y ch₃.

ch₃

XV ch₃

HOOCtAy ch₃

C3H7

CsH/^y ch₃.

w ch₃

COOH HaC^A, 0-2 ^Z

CHaCH₃

HOOC²^^

PL 206 255 B1 ,ΟΟΟΗ

COOH

AcHN

COOH

HOOC.

z

EtO

COOH

PL 206 255 B1

COOH

COOCH3

CONHCH3

COOH

COOH .OC₂H₅

HOOC

O

O o

Me^ /O Me

CR ;-Y /

PL 206 255 B1

których:

¹ jest wybrany spośród H, COOH, COOEt, OMe, Ph, OPh, NHMe, NHAc, NHPh, CH(Me)2, lu, 1-imidazolilu, oraz NHCH2COOH;

Y¹² jest wybrany spośród H, COOH, COOMe, OMe, F, Cl, albo Br;

Y¹³ jest wybrany spośród następujących ugrupowań:

Y¹⁴ jest wybrany spośród MeSO2, Ac, Boc, iBoc, Cbz, albo Alloc;

Y¹⁵ oraz Y¹⁶ są niezależnie wybrane spośród alkilu, arylu heteroalkilu, oraz heteroarylu;

PL 206 255 B1

Y¹⁷ oznacza CF3, NO2, CONH2, OH, COOCH3, OCH3, OC6H5, C6H5, COC6H5, NH2, albo COOH;

oraz

Y¹⁸ oznacza COOCH3, NO2, N(CH3)2, F, OCH3, CH2COOH, COOH, SO2NH2, albo NHCOCH3. Korzystny jest związek, w którym Y jest wybrany z grupy składającej się z:

PL 206 255 B1

których:

Y¹⁷ = CF3, NO2, CONH2, OH, NH2, albo COOH; Y¹⁸ = F, albo COOH.

PL 206 255 B1

Korzystny jest związek, w którym Y jest wybrany z grupy składającej się z:

Korzystny jest związek, w którym L oraz M są nieobecne, a J jest bezpośrednio przyłączony do E.

Korzystny jest związek, w którym L, J oraz M są nieobecne, a E jest bezpośrednio przyłączony do N.

Korzystny jest związek, w którym G oraz M są nieobecne.

PL 206 255 B1

Korzystny jest związek, w którym ugrupowanie:

A zwłaszcza korzystny jest związek, w którym struktura a jest wybrana spośród następujących:

Także korzystny jest związek, w którym struktura a oznacza:

gdzie R²⁰ jest wybrany spośród następujących:

PL 206 255 B1

Także korzystny jest związek, w którym struktura a oznacza:

22 gdzie R²¹ oraz R²² mogą być takie same, albo różne, i są niezależnie wybrane spośród następujących:

PL 206 255 B1

Korzystny jest związek, w którym struktura a jest wybrana spośród następujących:

Korzystny jest związek, w którym:

gdzie Q może występować albo nie, i jeśli Q nie występuje, to M jest bezpośrednio przyłączony do A.

PL 206 255 B1

Zwłaszcza korzystny jest związek, w którym struktura b jest wybrana spośród następujących:

gdzie G oraz J są niezależnie wybrane z grupy składającej się z (CH2)p, (CHR)p, (CHR-CHR')p, oraz (CRR')p; A oraz M są niezależnie wybrane z grupy składającej się z O, S, SO2, NR, (CH2)p, (CHR)p, (CHR-CHR')p oraz (CRR')p; oraz Q oznacza CH2, CHR, CRR', NH, NR, O, S, SO2, NR, (CH2)p, (CHR)p, oraz (CRR')p.

Korzystny jest związek, w którym struktura cjest wybrana spośród następujących:

PL 206 255 B1

Także korzystny jest związek, w którym:

jest wybrany spośród następujących:

PL 206 255 B1

Także korzystny jest związek, w którym:

jest wybrany spośród następujących:

Korzystny jest związek wykazujący aktywność hamowania proteazy HCV, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery oraz racematy, i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, wybrany z przedstawionych poniżej struktur

PL 206 255 B1

R t-butyl

NH₂) (R

Isobutyl

NH₂) (R

OH) (R

T richloroethyl

OH

Me

A.

li nnr 11

HOOC

Ti

Me nX~N

A/ 'rf

Me (X = O‘Bu) (X = OH)

Me

Λχ li (X = OH) (X = O^lBu) (X = NH₂) (X = NHMe) (X = NMe₂)

PL 206 255 B1

Μβ-r Me Me (X = O*Bu) (X = OH) (X = NH₂) (X = NMe₂) (X = NMeOMe)

Me li

Me

A/O nJ<

n

NMe₂

Me

Me! Me

Me

Xo νΛ li

Me (X = NH₂) (X = NMe₂) (X = NHMe) (X = OH)

R t-butyl) iSbbutyl)

R (X = o’Bu) (X = OH) (X = NH₂) (X = NMe₂)

PL 206 255 B1

Korzystny jest związek, wykazujący aktywność hamowania proteazy HCV, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotametry, tautomery oraz racematy, i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, przedstawiony poniżej:

PL 206 255 B1

HjC^A ^Ηί· ch₃

Korzystny jest związek, wykazujący aktywność hamowania proteazy HCV, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery oraz racematy, i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, przedstawiony poniżej:

PL 206 255 B1

Korzystny jest związek, wybrany spośród następujących:

PL 206 255 B1

Przedmiotem wynalazku jest także farmaceutyczna kompozycja zawierająca składnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, która jako składnik aktywny zawiera związek jak określony powyżej.

Korzystnie kompozycja jest przeznaczona do stosowania w leczeniu chorób związanych z HCV.

Korzystnie kompozycja dodatkowo (a) zawiera środek przeciwwirusowy, albo (b) interferon, albo oba (a) oraz (b).

Korzystnie środkiem przeciwwirusowym jest rybawiryna, a interferonem jest α-interferon albo pegylowany interferon.

Korzystnie kompozycja jako składnik aktywny zawiera związek jak określony powyżej wzorami konkretnych związków.

Korzystnie kompozycja dodatkowo (a) zawiera środek przeciwwirusowy, albo (b) interferon albo koniugat PEG-interferon alfa, albo oba (a) oraz (b).

Wtedy korzystnie środkiem przeciwwirusowym jest rybawiryna, a interferonem jest α-interferon albo pegylowany interferon.

Korzystnie kompozycja według wynalazku jako składnik aktywny zawiera wykazujący aktywność hamowania proteazy HCV, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery oraz racematy, i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, związek wybrany spośród następujących:

PL 206 255 B1

W takim przypadku korzystnie kompozycja dodatkowo zawiera (a) środek przeciwwirusowy, albo (b) interferon albo koniugat PEG-interferon alfa, albo oba (a) oraz (b).

PL 206 255 B1

Korzystnie wtedy środkiem przeciwwirusowym jest rybawiryna a interferonem jest α-interferon. Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera związek wybrany spośród następujących:

PL 206 255 B1

W takim przypadku korzystnie kompozycja dodatkowo zawiera (a) środek przeciwwirusowy, albo (b) interferon albo koniugat pegylowany interferon alfa, albo oba (a) oraz (b).

PL 206 255 B1

Wtedy korzystnie środkiem przeciwwirusowym jest rybawiryna a interferonem jest alfainterferon.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie związku jak wyżej określony do wytwarzania leku do leczenia chorób związanych z HCV.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie związku jak wyżej określony do wytwarzania kompozycji do stosowania w kombinowanej terapii do leczenia chorób związanych z wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV), a ta kombinowana terapia obejmuje podawanie (i) związku oraz (ii) interferonu.

Korzystnie w takim zastosowaniu interferonem jest alfa-interferon albo pegylowany interferon.

O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie stosowane tutaj określenia techniczne i naukowe mają takie znaczenia, jakie są powszechnie rozumiane przez specjalistów z dziedziny, do której należy wynalazek. Na przykład, określenie grupa alkilowa (w tym części alkilowe grup alkoksylowych) odnosi się do jednowartościowej grupy pochodzącej od prostego lub rozgałęzionego łańcucha nasyconego węglowodoru przez usunięcie pojedynczego atomu, mającej od 1 do 8 atomów węgla, korzystnie od 1 do 6;

grupa arylowa - oznacza grupę karbocykliczną mającą od 6 do 14 atomów węgla i mającą co najmniej jeden pierścień benzenoidowy, przy wszystkich możliwych do postawienia aromatycznych atomach węgla grupy karbocyklicznej zamierzonych jako możliwe punkty przyłączenia. Korzystne grupy arylowe obejmują grupę fenylową, grupę 1-naftylową, grupę 2-naftylową i grupę indanylową, a zwłaszcza grupę fenylową i podstawioną grupę fenylową;

grupa aralkilowa - oznacza ugrupowanie zawierające grupę arylową połączoną przez niższą grupę alkilową;

grupa alkiloarylowa - oznacza ugrupowanie zawierające niższą grupę alkilową połączoną przez grupę arylową;

grupa cykloalkilowa - oznacza nasycony pierścień karbocykliczny mający od 3 do 8 atomów węgla, korzystnie 5 lub 6, ewentualnie podstawiony.

grupa heterocykliczna - oznacza, oprócz grup heteroarylowych zdefiniowanych poniżej, nasycone i nienasycone cykliczne grupy organiczne mające co najmniej jeden atom O, S i/lub N przerywający strukturę pierścienia karbocyklicznego, która składa się z jednego pierścienia lub dwóch pierścieni skondensowanych, gdzie każdy pierścień jest 5-, 6- lub 7-członowy i może (ale nie musi) mieć wiązania podwójne bez zdelokalizowanych elektronów pi, która to struktura pierścienia cyklicznego ma od 2 do 8, korzystnie od 3 do 6 atomów wę gla, np., grupa 2- lub 3-piperydynylowa, 2- lub 3-piperazynylowa, 2- lub 3-morfolinylowa, lub 2- lub 3-tiomorfolinylowa;

atom chlorowca - oznacza atom fluoru, chloru, bromu i jodu;

grupa heteroarylowa - oznacza cykliczną grupę organiczną mającą co najmniej jeden atom O, S i/lub N przerywający strukturę pierścienia karbocyklicznego i mającą dostateczną liczbę zdelokalizowanych elektronów pi dla uzyskania charakteru aromatycznego, przy czym aromatyczna grupa heterocyklilowa ma od 2 do 14, korzystnie 4 lub 5 atomów węgla, np., grupę 2-, 3- lub 4-pirydylową, grupę 2- lub 3-furylową, grupę 2- lub 3-tienylową, grupę 2-, 4- lub 5-tiazolilową, grupę 2- lub 4-imidazolilową, grupę 2-, 4- lub 5-pirymidynylową, grupę 2-pirazynylową, lub grupę 3- lub 4-pirydazynylową, itp. Korzystne grupy heteroarylowe stanowią grupy 2-, 3- i 4-pirydylowa; takie grupy heteroarylowe mogą także być ewentualnie podstawione. Dodatkowo, o ile nie zdefiniowano inaczej, określenie podstawione lub niepodstawione lub ewentualnie podstawione odnosi się do danego ugrupowania będącego ewentualnie i chemicznie podstawionym przez R¹² lub R¹³. Stosowane tutaj określenie prolek oznacza związki, które są prekursorami leków, które po podaniu pacjentowi uwalniają lek in vivo na drodze procesu chemicznego lub fizjologicznego (np., prolek doprowadzony do fizjologicznego pH lub przez działanie enzymu przekształca się w żądaną postać leku).

Wynalazkiem objęte są także tautomery, rotamery, enancjomery i inne izomery optyczne związków o wzorze I, jak również ich farmaceutycznie dopuszczalne sole i solwaty.

Przedmiotem wynalazku są także kompozycje farmaceutyczne zawierające jako składnik aktywny związek o wzorze I (lub jego sól, solwat lub izomery) razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub zaróbką.

Ujawniono sposoby wytwarzania związków o wzorze I, jak również sposoby leczenia chorób takich jak, na przykład, HCV, AIDS, oraz pokrewnych. Sposoby leczenia obejmują podawanie pacjentowi cierpiącemu na daną chorobę lub choroby, terapeutycznie skutecznej ilości związku o wzorze I, lub kompozycji farmaceutycznych zawierających związek o wzorze I.

PL 206 255 B1

Ujawniono zastosowanie związku o wzorze I do wytwarzania leku do leczenia HCV, AIDS, oraz pokrewnych.

Ujawniono sposób leczenia zaburzenia związanego z wirusem zapalenia wątroby C, który obejmuje podawanie skutecznej ilości jednego lub więcej, związku według wynalazku.

Ujawniono sposób modulowania aktywności proteazy wirusa zapalenia wątroby C (HCV), który obejmuje kontaktowanie proteazy HCV z jednym lub więcej, związkiem według wynalazku.

Ujawniono sposób leczenia, zapobiegania, lub łagodzenia jednego lub wielu objawów zapalenia wątroby C, który obejmuje podawanie skutecznej ilości jednego lub więcej związków według wynalazku. Proteaza HCV oznacza proteazę NS3 lub NS4a. Związki według wynalazku hamują takie proteazy. Także modulują przetwarzanie polipeptydu wirusa zapalenia wątroby C (HCV).

W jednym z wykonań , wynalazek ujawnia zwią zki o wzorze I jako inhibitory proteazy HCV, zwłaszcza proteazy serynowej NS3/NS4a HCV, lub ich farmaceutycznie dopuszczalną pochodną, gdzie podstawniki są podane wyżej.

Reprezentatywne związki według wynalazku, które wykazują wyśmienitą aktywność hamowania proteazy HCV, są podane poniżej w Tabelach 1 do 5 wraz ze swoją aktywnością (zakresy wartości Ki* w nanomolach/litr, nM). Kilka zwią zków, jak również dodatkowe zwią zki są dodatkowo ujawnione w zastrzeż eniach.

T a b e l a 1: Związki i wyniki oznaczeń ciągł ych dla proteazy HCV

Związek z przykładu nr	Związek Ki*
1	2
1	C
2	C
3	C
4	C
5	C
6	C
7	C
8	C
9	C
10	C
11	C
12	C
13	C
14	C
15	C
16	C
17	C
18	C
19	C
20	C
21	C
22	C
23	C
24	C

PL 206 255 B1 cd. tabeli 1

1	2
25	C
26	C
27	C
28	C
29	C
30	C
31	C
32	C
33	C
34	C
35	C
36	C
37	C
38	C
39	C
40	C
41	C
42	C
43	C
44	C
45	C
46	C
47	C
48	C
49	C
50	C
51	C
52	C
53	C
54	C
55	C
56	C
57	C
58	C
59	C
60	C
61	C
62	C

PL 206 255 B1 cd. tabeli 1

1	2
63	C
64	C
65	C
66	C
67	C
68	B
69	C
70	C
71	B
72	C
73	B
74	C
75	C
76	A
77	B
78	A
79	C
80	A
81	C
82	A
83	B
84	C
85	C
86	B
87	B
88	A
89	B
90	C
91	C
92	C
93	C
94	C
95	C
96	C
97	C
98	B
99	B
100	A

PL 206 255 B1 cd. tabeli 1

1	2
101	A
102	C
103	C
104	C
105	C
106	C
107	B
108	A
109	A
110	A
111	A
112	A
113	B
114	A
115	B
116	A
117	A
118	A
119	A
120	A
121	B
122	B
123	A
124	B
125	B
126	B
127	A
128	A
129	A
130	B
131	A
132	A
133	A
134	B
135	A
136	A
137	A
138	A

PL 206 255 B1 cd. tabeli 1

1	2
139	A
140	B
141	A
142	A
143	B
144	B
145	C
146	A
147	A
148	B
149	A
150	A
151	A
152	A
153	A
154	A
155	B
156	B
157	B
158	C
159	B
160	A
161	A
162	A
163	C
164	A
165	C
166	B
167	A
168	C
169	B
170	B
171	A
172	A
173	A
174	A
175	A
176	B

PL 206 255 B1 cd. tabeli 1

1	2
177	B
178	A
179	A
180	B
181	A
182	B
183	A
184	A
185	A
186	A
187	A
188	A
189	B
190	B
191	B
192	A
193	A
194	B
195	A
196	B
197	A
198	A
199	A
200	A
201	B
202	A
203	B
204	B
205	B
206	B
207	B
208	A
209	A
210	A
211	A
212	A
213	B
214	B

PL 206 255 B1 cd. tabeli 1

1	2
215	B
216	B
217	C
218	A
219	A
220	A
221	A
222	A
223	B
224	C
225	C
226	A
227	A
228	C
229	A
230	A
231	A
232	C
233	C
234	C
235	C
236	B
237	C
238	A
239	C
240	A
241	C
242	B
243	C
244	B
245	C
246	B
247	A
248	A
249	C
250	C
251	B
252	C

PL 206 255 B1 cd. tabeli 1

1	2
253	C
254	B
255	B
256	A
257	C
258	A
259	A
260	C
261	C
262	A
263	B
264	B
265	C
266	B
267	A
268	C
269	A
270	C
271	A
272	C
273	C
274	C
275	C
276	A
277	B
278	A
279	B
280	A
281	C
282	C
283	C
284	C
285	C
286	C
287	C
288	B
289	B
290	C

PL 206 255 B1 cd. tabeli 1

1	2
291	C
292	C
293	C
294	C
295	C
296	B
297	C
298	C
299	B
300	B
301	C
302	C
303	B
304	C
305	C
306	C
307	B
308	B
309	C
310	C
311	C
312	C
313	B
314	A
315	B
316	B
317	A
318	A
319	A
320	A
321	C
322	C
323	C
324	C
325	A
326	A
327	C

PL 206 255 B1 cd. tabeli 1

1	2
328	B
329	B
330	A
331	A
332	A
333	B
334	B
335	B
336	A
337	A
338	C
339	A
340	C
341	C
342	C
343	A
344	C
345	C
346	C
347	B
348	B
349	C
350	C
351	C
352	C
353	C
354	C
355	C
356	A
357	A
358	C
359	A
360	B
361	B
362	C

Zakres wyników oznaczeń ciągłych Ki* dla HCV:

Kategoria A = 1-100 nM; Kategoria B = 101-1000 nM; Kategoria C >1000 nM.

Niektóre z typów związków według wynalazku i sposobów syntezy rozmaitych typów związków według wynalazku o wzorze I są podane poniżej, po czym opisane schematycznie, a następnie zilustrowane przykładami.

PL 206 255 B1

HOOC

R butyl

NHa) (R

NH₂)

Isobutyl (R butyl

OH) (R

Tnchłoroet

OH)

X

Bu) (X

OH) (X = OH) (X = O^<Bu) ~(X = NH₂) (X = NHMe) (X = NMe₂)

PL 206 255 B1

(X=NH₂) (X = NMe₂) (X = NHMe) (X = OH)

(X = O*Bu) (X = OH) (X=NH₂) (X = NMe₂)

(X = O*Bu) (X = OH) (X = NH₂) (X = NMe₂) (X = NMeOMe) (R = t-butyl) (R = Isobutyl)

PL 206 255 B1

Me-Τ'Me Me

Me-TMe

Me —-N

NMe₂

NMęj

Me

CH₂Me) (X

Me) (X

OAc

NMe₂

Me \^Me

Me

NMęj

NMe,

Me

PL 206 255 B1

EtOOC

PL 206 255 B1

W h/ch,

PL 206 255 B1

3f 3f

PL 206 255 B1

100

PL 206 255 B1

101

102

PL 206 255 B1

103

104

PL 206 255 B1

105

106

PL 206 255 B1

107

108

PL 206 255 B1

109

110

PL 206 255 B1

111

112

PL 206 255 B1

ch₃

PL 206 255 B1

113

114

PL 206 255 B1

115

116

PL 206 255 B1

117

118

PL 206 255 B1

119

Zależnie od swojej struktury, związki według wynalazku mogą tworzyć farmaceutycznie dopuszczalne sole z organicznymi lub nieorganicznymi kwasami, albo organicznymi lub nieorganicznymi zasadami. Przykłady kwasów przydatnych do tworzenia takiej soli stanowią kwasy solny, siarkowy, fosforowy, octowy, cytrynowy, malonowy, salicylowy, jabłkowy, fumarowy, bursztynowy, askorbinowy, maleinowy, metanosulfonowy i inne kwasy mineralne i karboksylowe znane specjalistom. Zasady przydatne do tworzenia soli z zasadami stanowią, na przykład, NaOH, KOH, NH4OH, wodorotlenek tetraalkiloamoniowy, i tym podobne.

W innym wariancie wykonania, przedmiotem niniejszego wynalazku są kompozycje farmaceutyczne zawierające jako składnik aktywny peptydy według wynalazku. Kompozycje farmaceutyczne ogólnie dodatkowo zawierają farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik, zaróbkę lub nośnik (zbiorczo określane niniejszym jako materiały nośnikowe). Ze względu na swoją aktywność hamowania HCV, takie kompozycje farmaceutyczne są przydatne do leczenia zapalenia wątroby C i zaburzeń pokrewnych.

W jeszcze innym wariancie wykonania, niniejszy wynalazek ujawnia sposoby wytwarzania kompozycji farmaceutycznych zawierających jako składnik aktywny związki według wynalazku. W kompozycjach farmaceutycznych i sposobach według niniejszego wynalazku, składniki aktywne będą typowo podawane w mieszaninie z przydatnymi materiałami nośnikowymi dogodnie dobranymi w odniesieniu do zamierzonej postaci podawania, tj., jako doustne tabletki, kapsułki (napełnione substancją stałą, półstałą albo ciekłą), proszki do odtworzenia składu, żele doustne, eliksiry, dyspergowalne granulki, syropy, zawiesiny, i tym podobne, i zgodnie z konwencjonalną praktyką farmaceutyczną. Na przykład, do podawania doustnego w postaci tabletek lub kapsułek, składnik aktywny leku można połączyć z dowolnym doustnym nietoksycznym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem obojętnym, takim jak laktoza, skrobia, sacharoza, celuloza, stearynian magnezu, fosforan diwapnia, siarczan wapnia, talk, mannit, alkohol etylowy (postacie ciekłe) i tym podobne. Ponadto, jeśli jest to pożądane lub potrzebne, to w mieszaninie można także zawrzeć przydatne środki wiążące, środki poślizgowe, środki powodujące rozpad i środki barwiące. Proszki i tabletki mogą składać się z od około 5 do około 95 procent kompozycji według wynalazku. Przydatne środki wiążące obejmują skrobię, żelatynę, cukry naturalne, słodziki otrzymywane z kukurydzy, gumy naturalne i syntetyczne, takie jak guma arabska, alginian sodu, karboksymetyloceluloza, glikol polietylenowy i woski. Ze środków poślizgowych do stosowania w tych postaciach dawkowania można wspomnieć kwas borowy, benzoesan sodu, octan sodu, chlorek sodu, i tym podobne. Środki powodujące rozpad obejmują skrobię, metylocelulozę, gumę guar i tym podobne.

Kiedy to właściwe, to można także zawrzeć środki słodzące i zapachowe oraz środki konserwujące. Niektóre z określeń podanych wyżej, mianowicie środki powodujące rozpad, rozcieńczalniki, środki poślizgowe, środki wiążące i tym podobne, są omawiane niżej bardziej szczegółowo.

Dodatkowo, kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być przygotowane w postaci o podtrzymanym uwalnianiu dla uzyskania uwalniania z regulowaną szybkością dowolnego jednego lub wielu ze składników lub składników aktywnych w celu optymalizacji skutków terapeutycznych, tj. aktywności hamowania HCV i temu podobnych. Przydatne postacie dawkowania do podtrzymanego uwalniania obejmują warstwowe tabletki zawierające warstwy o zmiennych szybkościach rozpadu albo matryce polimerowe o regulowanym uwalnianiu impregnowane składnikami aktywnymi i uformowane w postaci tabletki albo kapsu ł ek zawierają ce takie impregnowane lub zamknię te porowate matryce polimerowe.

Preparaty w postaci ciekłej obejmują roztwory, zawiesiny i emulsje. Jako przykład można wymienić roztwory w wodzie lub wodzie-glikolu propylenowym do wstrzyknięć pozajelitowych lub dodatek środków słodzących i środków uspokajających do roztworów, zawiesin i emulsji doustnych. Preparaty w postaci ciekł ej mogą takż e obejmować roztwory do podawania do nosa.

Preparaty aerozolowe przydatne do inhalacji mogą obejmować roztwory i substancje stałe w postaci proszku, które mogą być połączone z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, takim jak sprężony gaz obojętny, np. azot.

Do wytwarzania czopków, najpierw topi się wosk o niskiej temperaturze topnienia, taki jak mieszanina glicerydów kwasów tłuszczowych taka jak masło kakaowe, i w nim dysperguje się jednorodnie składnik aktywny metodą mieszania mieszadłem albo podobną. Następnie stopioną jednorodną mieszaninę wylewa się do form o dogodnej wielkości, zostawia do ostygnięcia i przez to zestalenia.

120

PL 206 255 B1

Wynalazkiem objęte są także preparaty w postaci stałej, które mają być przekształcone, na krótko przed użyciem, w preparaty w postaci ciekłej do podawania doustnego lub pozajelitowego. Takie postacie ciekłe obejmują roztwory, zawiesiny i emulsje.

Związki według wynalazku mogą także być dostarczane przezskórnie. Kompozycje przezskórne mogą przybierać postać kremów, płynów, aerozoli i/lub emulsji, i mogą być zawarte w plastrze przezskórnym typu matrycy lub zbiorniczka, jak jest zwyczajne w stanie techniki dla tego celu.

Korzystnie związek jest podawany doustnie, dożylnie lub podskórnie.

Korzystnie, preparat farmaceutyczny znajduje się w jednostkowej postaci dawkowania. W takiej postaci, preparat jest podzielony na dawki jednostkowe o dogodnej wielkości, zawierające właściwe ilości składników aktywnych, np., ilość skuteczną dla osiągnięcia pożądanego celu.

Ilość kompozycji aktywnej według wynalazku w dawce jednostkowej preparatu może być ogólnie zmieniana lub dobrana od około 1,0 miligrama do około 1000 miligramów, korzystnie od około 1,0 do około 950 miligramów, korzystniej od około 1,0 do około 500 miligramów, i typowo od około 1 do około 250 miligramów, odpowiednio do poszczególnego zastosowania. Rzeczywiste wykorzystywane dawkowanie może być zmieniane zależnie od wieku, płci, wagi pacjenta i ciężkości leczonego stanu. Takie techniki są znane specjalistom.

Ogólnie, doustna postać dawkowania dla ludzi zawierająca składniki aktywne może być podawana 1 lub 2 razy dziennie. Ilość i częstość podawania będą regulowane zależnie od osądu lekarza prowadzącego. Ogólnie zalecany reżim dawkowania dziennego do podawania doustnie może leżeć w zakresie od okoł o 1,0 miligrama do okoł o 1000 miligramów dziennie, w dawce pojedynczej lub dawkach podzielonych.

Poniżej opisano niektóre z przydatnych określeń:

Kapsułka - odnosi się do specjalnego pojemnika lub zamknięcia wytworzonego z metylocelulozy, alkoholi poliwinylowych, lub zdenaturowanych żelatyn lub skrobi w celu utrzymywania lub zawarcia kompozycji zawierających składniki aktywne. Kapsułki o twardej otoczce typowo wytwarza się z mieszanek żelatyn z kości i skór wieprzowych o względnie wysokiej odporności na ścinanie. Sama kapsułka może zawierać małe ilości barwników, środków zmętniających, plastyfikatorów i środków konserwujących.

Tabletka - odnosi się do sprasowanej lub odlewanej stałej postaci dawkowania zawierającej składniki aktywne z przydatnymi rozcieńczalnikami. Tabletka może być wytworzona metodą prasowania mieszanin lub granulatów otrzymanych metodą granulowania na wilgotno, granulowania na sucho lub metodą prasowania.

Żel doustny - odnosi się do składników aktywnych zdyspergowanych lub rozpuszczonych w hydrofilowej matrycy półstałej.

Proszek do odtworzenia składu odnosi się do mieszanek proszków zawierających składniki aktywne i przydatne rozcieńczalniki, które mogą być zawieszone w wodzie lub sokach.

Rozcieńczalnik - odnosi się do substancji, które zazwyczaj stanowią główną część kompozycji lub postaci dawkowania. Przydatne rozcieńczalniki obejmują cukry takie jak laktoza, sacharoza, mannit i sorbit; skrobie pochodzące z pszenicy, kukurydzy, ryżu i ziemniaków; i celulozy takie jak celuloza mikrokrystaliczna. Ilość rozcieńczalnika w kompozycji może leżeć w zakresie od około 10 do około 90% w odniesieniu do wagi całkowitej kompozycji, korzystnie od około 25 do około 75%, korzystniej od około 30 do około 60% wagowo, jeszcze korzystniej od około 12 do około 60%.

Środek powodujący rozpad - odnosi się do materiałów dodawanych do kompozycji w celu ułatwienia rozpadnięcia się (rozdrobnienia) i uwolnienia leków. Przydatne środki powodujące rozpad obejmują skrobie; rozpuszczalne na zimno w wodzie skrobie zmodyfikowane, takie jak sól sodowa karboksymetyloskrobi; gumy naturalne i syntetyczne, takie jak mączka chleba świętojańskiego, karaya, guar, tragakant i agar; pochodne celulozy takie jak metyloceluloza i sól sodowa karboksymetylocelulozy; celulozy mikrokrystaliczne i usieciowane celulozy mikrokrystaliczne takie jak sól sodowa kroskarmelozy; alginiany takie jak kwas alginowy i alginian sodu; glinki takie jak bentonity; i mieszaniny musujące. Zawartość w kompozycji środka powodującego rozpad może leżeć w zakresie od około 2 do okoł o 15% w odniesieniu do wagi kompozycji, korzystniej od okoł o 4 do okoł o 10% wagowo.

Środek wiążący - odnosi się do substancji, które wiążą lub zlepiają proszki razem i nadają im spójność przez tworzenie granulek, służąc tak w preparacie jako klej. Środki wiążące dodają wytrzymałość na rozdzielanie do już dostępnej w rozcieńczalniku lub środku spęczniającym. Przydatne środki wiążące obejmują cukry takie jak sacharoza; skrobie pochodzące z pszenicy, kukurydzy, ryżu i ziemniaków; gumy naturalne takie jak guma arabska, żelatyna i tragakant; pochodne wodorostów

PL 206 255 B1

121 takie jak kwas alginowy, alginian sodu i alginian amonu wapnia; materiały celulozowe takie jak metyloceluloza i sól sodowa karboksymetylocelulozy oraz hydroksypropylometyloceluloza; poliwinylopirolidon; i substancje nieorganiczne takie jak glinokrzemian magnezu. Ilość środka wiążącego w kompozycji może leżeć w zakresie od około 2 do około 20% w odniesieniu do wagi kompozycji, korzystniej od około 3 do około 10% wagowo, jeszcze korzystniej od około 3 do około 6% wagowo.

Środek poślizgowy - odnosi się do substancji dodawanej do postaci dawkowania w celu umożliwienia wyjęcia tabletek, granulek, itp. po ich sprasowaniu, z formy do odlewania lub wytłaczania przez zmniejszenie tarcia lub ścierania. Przydatne środki poślizgowe obejmują stearyniany metali takie jak stearynian magnezu, stearynian wapnia lub stearynian potasu; kwas stearynowy; woski o wysokiej temperaturze topnienia; i rozpuszczalne w wodzie ś rodki poś lizgowe takie jak chlorek sodu, benzoesan sodu, octan sodu, oleinian sodu, glikole polietylenowe oraz d,l-leucyna. Środki poślizgowe zazwyczaj dodaje się na ostatnim etapie przed prasowaniem, ponieważ muszą one być obecne na powierzchniach granulek oraz między nimi i częściami tabletkarki. Zawartość w kompozycji środka poślizgowego może leżeć w zakresie od około 0,2 do około 5% w odniesieniu do wagi kompozycji, korzystnie od około 0,5 do około 2%, korzystniej od około 0,3 do około 1,5% wagowo.

Środek nadający sypkość - materiał, który zapobiega zbrylaniu i polepsza charakterystykę sypkości granulatów, tak, że przesypywanie się jest gładkie i jednorodne. Przydatne środki nadające sypkość obejmują ditlenek krzemu i talk. Zawartość w kompozycji środka nadającego sypkość może leżeć w zakresie od około 0,1% do około 5% w odniesieniu do wagi całkowitej kompozycji, korzystnie od około 0,5 do około 2% wagowo.

Środki barwiące - zaróbki, które nadają zabarwienie kompozycji lub postaci dawkowania. Takie zaróbki mogą obejmować barwniki spożywcze oraz barwniki spożywcze zaadsorbowane na przydatnym adsorbencie takim jak glinka lub tlenek glinu. Ilość środka barwiącego może zmieniać się od około 0,1 do około 5% w odniesieniu do wagi kompozycji, korzystnie od około 0,1 do około 1%.

Dostępność biologiczna - odnosi się do szybkości oraz stopnia, w którym aktywny składnik leku lub ugrupowanie terapeutyczne jest absorbowane w krążeniu dużym z podanej postaci dawkowania w porównaniu ze wzorcem lub próbą kontrolną .

Konwencjonalne sposoby wytwarzania tabletek są znane. Takie sposoby obejmują sposoby na sucho, takie jak prasowanie bezpośrednie i prasowanie granulatu wytworzonego metodą zgniatania, lub sposoby na mokro albo inne procedury specjalne. Konwencjonalne sposoby wytwarzania innych postaci do podawania takich jak, na przykład, kapsułki, czopki i tym podobne, są także znane.

Inny wariant wykonania wynalazku ujawnia zastosowanie kompozycji farmaceutycznych ujawnionych wyżej do leczenia chorób takich jak, na przykład, zapalenie wątroby C i tym podobne. Sposób obejmuje podawanie terapeutycznie skutecznej ilości kompozycji farmaceutycznej według wynalazku pacjentowi cierpiącemu na taką chorobę lub choroby, i któremu potrzeba takiego leczenia.

W jeszcze innym wariancie wykonania, związki wedł ug wynalazku mogą być stosowane do leczenia HCV u ludzi w trybie terapii pojedynczym środkiem lub w trybie terapii skojarzonej (np. kombinacja podwójna, kombinacja potrójna, itp.) takim jak, na przykład, w kombinacji ze środkami przeciwwirusowymi i/lub modulującymi układ odpornościowy. Przykłady takich środków przeciwwirusowych i/lub modulujących układ odpornościowy obejmują Ribavirin (z firmy Schering-Plough Corporation, Madison, New Jersey) i Levovirin™ (z firmy ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, California), VP 50406™ (z firmy Viropharma, Incorporated, Exton, Pennsylvania), ISIS 14803™ (z firmy ISIS Pharmaceuticals, Carlsbad, California), Heptazyme™ (z firmy Ribozyme Pharmaceuticals, Boulder, Colorado), VX 497™ (z firmy Vertex Pharmaceuticals, Cambridge, Massachusetts), Thymosin™ (z firmy SciClone Pharmaceuticals, San Mateo, California), Maxamine™ (Maxim Pharmaceuticals, San Diego, California), mikofenolan mofetylu (z firmy Hoffman-LaRoche, Nutley, New Jersey), interferon (taki jak, na przykład, interferon-alfa, połączenia PEG-interferon alfa) i tym podobne. Połączenia PEGinterferon alfa oznaczają cząsteczki interferonu alfa kowalencyjnie przyłączone do cząsteczki PEG. Przykładowe połączenia PEG-interferon alfa obejmują interferon alfa-2a (Roferon™, z firmy Hoffman La-Roche, Nutley, New Jersey) w postaci pochodnej PEG interferonu alfa-2a (np., jak sprzedawany pod znakiem towarowym Pegasys™), interferon alfa-2b (Intron™, z firmy Schering-Plough Corporation) w postaci pochodnej PEG interferonu alfa-2b (np., jak sprzedawany pod znakiem towarowym PEG-Intron™), interferon alfa-2c (Berofor Alpha™, z firmy Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Niemcy) lub interferon zgodny jak zdefiniowano metodą wyznaczenia sekwencji zgodnej występujących w przyrodzie interferonów alfa (Infergen™, z firmy Amgen, Thousand Oaks, California).

122

PL 206 255 B1

Jak stwierdzono wcześniej, wynalazek obejmuje także tautomery, rotamery, enancjomery i inne stereoizomery związków. Tak więc, jak doceni specjalista, niektóre ze związków według wynalazku mogą istnieć w odpowiednich postaciach izomerycznych. Takie odmiany mają być objęte zakresem wynalazku.

Inny wariant wykonania wynalazku ujawnia sposób wytwarzania związków ujawnionych niniejszym. Związki mogą być wytwarzane kilkoma technikami znanymi w stanie techniki. Reprezentatywne procedury ilustrujące są naszkicowane na następujących schematach reakcji. Należy rozumieć, że podczas gdy następujące ilustrujące schematy opisują wytwarzanie paru reprezentatywnych związków według wynalazku, to odpowiednie podstawienie dowolnych spośród zarówno naturalnych jak i nienaturalnych aminokwasów spowoduje utworzenie pożądanych związków opartych na takim podstawieniu. Takie odmiany mają być objęte zakresem wynalazku.

Skróty, które są stosowane w opisach następujących schematów, preparatów i przykładów, to:

THF: Tetrahydrofuran

DMF: N,N-Dimetyloformamid

EtOAc: Octan etylu

AcOH: Kwas octowy

HOOBt: 3-Hydroksy-1,2,3-benzotriazyn-4(3H)-on

EDCI: Chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu

DEC: Chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu

NMM: N-Metylomorfolina

ADDP: 1,1'-(Azodikarboksy)dipiperydyna

DEAD: Azodikarboksylan dietylu

MeOH: Metanol

EtOH: Etanol

Et2O: Eter dietylowy

DMSO: Dimetylosulfotlenek

HOBt: N-Hydroksybenzotriazol

PyBrOP: Heksafluorofosforan bromo-tris-pirolidynofosfoniowy

DCM: Dichlorometan

DCC: 1,3-Dicykloheksylokarbodiimid TEMPO: Rodnik 2,2,6,6-tetrametylo-1-piperydynyloksylowy

Phg: Fenyloglicyna

Chg: Cykloheksyloglicyna

Bn: Benzyl

Bzl: Benzyl

Et: Etyl

Ph: Fenyl iBoc: Izobutoksykarbonyl iPr: Izopropyl ^tBu lub Bu^t: tert-Butyl Boc: tert-Butyloksykarbonyl

Cbz: Benzyloksykarbonyl

Cp: Cyklopentylodienyl

Ts: p-Toluenosulfonyl

Me: Metyl

HATU: Heksafluorofosforan O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowy

DMAP: 4-N,N-Dimetyloaminopirydyna

Bop: Heksafluorofosforan benzotriazol-1-iloksy-tris(dimetyloamoniowy)

Ogólne schematy preparatywne:

Następujące schematy opisują sposoby syntezy pośrednich bloków budulcowych:

PL 206 255 B1

123

124

PL 206 255 B1

Schemat

NaOCl

NaBr

COOMe TEMPO

Cbz

COOMe

Cbz

Cb

TMSI (3 eq.), 30 min Boc₂0 (4 eq.) / (i-Pr)₂NEt (3,1 eq.) / THF, 20 min

LiOH

HC1 dioksan dioksan

COOH

Boc

COOMe

Boc

HC1

COOMe

Schemat 4

HOOBt

EDCI utlenianie

Morfatta

Iboc-Chg n= 1: 3.8 n= 2: 3.4

HC1

HC1 n= n=

HC1

Iboc-Chg-OH

4,9

HOOBt

EDCI

Iboc-Chg i-BuOCOCl + H-Chg-OH

DIPEA

-►

DMF n= n=

PL 206 255 B1

125

126

PL 206 255 B1

127

128

PL 206 255 B1

129

130

PL 206 255 B1

131

Schemat 16

CO₂Et (EtO)₂P(O)CH₂CO₂Et

10%Pd/C

NaHMDS

1) Me₃CCOCI, Et₃N

LiOH

2) (S)-4-benzylo-2-oksazolidynon n-BuLi

LiOH

THF

2. 4N HCI, dioksan

Schemat 17

OM©

O

N

Ph

HCI.H₂N^CONMe₂

1. HOOBt, EDCI NMM, DMF cnch₂co₂ch₃

CH₃CO₂H, ch₂ci₂

132

PL 206 255 B1

ο

KHMDS

CH₂N₂--->.

Η₂,10 %Pd/C hco₂h

ΒοεΗΝ_/ζ...(;θ₂Η

1) . (Boc)₂O, iPr₂NEł T

2) . LiOH f J

PL 206 255 B1

133

BocHN,

BocHN_/z

Schemat 18

Schemat 19

H₂ (50 psi)

Rh na węglu, 7 dni

Schemat 20 węglan

N N-disukcynoimidylu

Et₃N, CH₃CN

Boc

Boc reagent Jonesa

HATU iPr₂NEt

Me₂CHCH₂CHO	H ,/CO₂H	nBu₄NOH
Et₃N, NaBH₃CN	Π	(Boc)₂O

134

PL 206 255 B1

Wytwarzanie związków pośrednich:

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 1

Etap A: Związek (1.1)

Do mieszanego roztworu związku (1.08) (3,00 g, 12,0 mmol (S. L. Harbeson i in. J. Med. Chem. 37 nr 18 (1994) 2918-2929) w DMF (15 mL) i CH2CI2 (15 mL) w temperaturze -20°C dodano HOOBt (1,97 g, 12,0 mmol), N-metylomorfolinę (4,0 mL, 36,0 mmol) i EDCI (2,79 g, 14,5 mmol) i mieszano przez 10 minut, a następnie dodano HCHH-N-Gly-OBn (2,56 g, 13,0 mmol). Otrzymany roztwór mieszano w temperaturze -20°C przez 2 h, trzymano w lodówce przez noc, po czym zatężono do suchej masy, a następnie rozcieńczono przy użyciu EtOAc (150 mL). Następnie roztwór w EtOAc przemyto dwukrotnie nasyconym roztworem NaHCO3, H2O, 5% H3PO4, solanką, osuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono do suchej masy, otrzymując związek (1.09) (4,5 g, 94%). LRMS m/z MH⁺ = 395,1.

Etap B: Związek (1.1)

Roztwór związku (1.09) (7,00 g, 17,8 mmol) w bezwodnym etanolu (300 mL) mieszano w temperaturze pokojowej w atmosferze wodoru w obecności Pd-C (300 mg, 10%). Postęp reakcji kontrolowano metodą TLC. Po upływie 2 godzin mieszaninę przesączono przez warstwę celitu i otrzymany roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując związek (1.1) (5,40 g, ilościowo). LRMS m/z MH⁺ = 305,1.

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 2

Etap A Związek (1.3)

Mieszaninę związku (1.1) z Przykładu Preparatywnego 1, Etap B powyżej (1 ekwiw.), związku (1.2) (z firmy Novabiochem, nr katalogowy 04-12-5147) (1,03 ekwiw.), HOOBt (1,03 ekwiw.), N-metylomorfoliny (2,2 ekwiw.), i dimetyloformamidu (70 mL/g) mieszano w temperaturze -20°C. Dodano EDCI (1,04 ekwiw.) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 48 h. Mieszaninę reakcyjną wylano do 5% wodnego roztworu KH2PO4 i ekstrahowano octanem etylu (2 x). Połączone fazy organiczne przemyto zimnym 5% wodnym roztworem K2CO3, następnie 5% wodnym roztworem KH2PO4, następnie solanką, i warstwę organiczną osuszono nad bezwodnym MgSO4. Mieszaninę przesączono, następnie odparowano, i przesącz osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość roztarto z Et2O-heksanem, i odsączono, otrzymując związek tytułowy (1.3 ) (86% wydajności), C25H39N3O7 (493,60), widmo masowe (FAB) M+1 = 4 94,3.

PL 206 255 B1

135

Etap B Związek (1.4)

Związek (1.3) z Przykładu Preparatywnego 2, Etap A (3,0 g) potraktowano z 4 N HCl w dioksanie (36 mL) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 7 min. Mieszaninę wylano do 1,5 L zimnego (5°C) heksanu i mieszano, po czym zostawiono do sedymentacji na zimno przez 0,5 h. Mieszaninę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem w atmosferze suchej, i zebraną substancję stałą wysuszono dalej, otrzymując związek tytułowy (1.4) (2,3 g, 88% wydajności), C20H31N3O5 • HCl, H¹ NMR (DMSOd6/NaOD) δ 7, 38 (m, 5H), 5,25 (m, 1H), 4,3-4,1 (m, 1H), 3,8 (m, 2H), 3,4-3,3 (m, zasłonięte przez D2O), 1,7-1,1 (m, 4H), 1,35 (s, 9H), 0,83 (m, 3H).

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 3

Związek (1.5)

Związek (1.3) z Przykładu Preparatywnego 2, Etap A, potraktowano w sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykładzie Preparatywnym 7, Etap A poniżej, otrzymując związek (1.5).

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 4 Związek (1.6)

Związek (1.5) z Przykładu Preparatywnego 3 potraktowano w sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykł adzie Preparatywnym 2, Etap B, otrzymują c zwią zek (1.6).

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 5 Etap A Związek (2.09)

Do roztworu chlorowodorku dimetyloaminy (1,61 g, 19,7 mmol), N-Boc-fenyloglicyny, związku (2.08) (4,50 g, 17,9 mmol, Bachem Co. nr A-2225), HOOBt (3,07 g, 18,8 mmol) i EDCI (4,12 g, 21,5 mmol) w bezwodnym DMF (200 mL) i CH2Cl2 (150 mL) w temperaturze -20°C dodano NMM (5,90 mL, 53,7 mmol). Po 30 minutach mieszania w tej temperaturze, mieszaninę reakcyjną trzymano w lodówce przez noc (18 h). Następnie zostawiono ją do ogrzania do temperatury pokojowej, i dodano EtOAc

136

PL 206 255 B1 (450 mL), solankę (100 mL) i 5% roztwór H3PO4 (100 mL). Po rozdzieleniu warstw, warstwę organiczną przemyto 5% roztworem H3PO4 (100 mL), nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2 X 150 mL), wodą (150 mL), i solanką (150 mL), osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując związek (2.09) (4,86 g) jako białą substancję stałą, której użyto bez dalszego oczyszczania.

Etap B Związek (2.1)

Związek (2.09) z Przykładu Preparatywnego 5, Etap A (4,70 g, surowy) rozpuszczono w 4 N HCl (60 mL, 240 mmol) i otrzymany roztwór mieszano w temperaturze pokojowej. Postęp reakcji kontrolowano metodą TLC. Po upływie 4 godzin roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując związek (2.1) jako białą substancję stałą, której użyto w następnej reakcji bez dalszego oczyszczania. LRMS m/z MH⁺ = 179,0.

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 6

W sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykładzie Preparatywnym 2, Etap A, podstawiając chlorowodorek N,N-dimetyloamid fenyloglicyny zamiast chlorowodorku estru tert-butylowego fenyloglicyny, wytworzono związek (2.2), widmo masowe (FAB) M+1 = 465,3.

Etap B Związek (2.3)

Związek (2.2) z Etapu A (1,85 g) poddano reakcji z 4 N HCl w dioksanie (50 mL) w temperaturze pokojowej przez 1 h. Mieszaninę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem na łaźni wodnej w temperaturze 20°C, roztarto pod eterem izopropylowym, odsączono, i wysuszono, otrzymując związek (2.3) (1,57 g, 98% wydajności), C18H28N4O4 • HCl, widmo masowe (FAB) M+1 = 365,3.

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 7

Etap A

PL 206 255 B1

137

Roztwór związku (2.2) z Przykładu Preparatywnego 5, Etap A (2,0 g) w dichlorometanie (60 mL) potraktowano dimetylosulfotlenkiem (3,0 mL) i kwasem 2,2-dichlorooctowym (0,70 mL). Mieszaną mieszaninę ochłodzono do 5°C, a następnie dodano 1 M roztwór dicykloheksylokarbodiimidu/dichlorometanu (8,5 mL). Łaźnię chłodzącą usunięto i mieszaninę mieszano przez 22 h. Następnie dodano 2-propanol (0,5 mL), i mieszano przez dodatkową 1 godzinę. Mieszaninę przesączono, po czym przemyto lodowatym 0,1 N roztworem NaOH (50 mL), następnie lodowatym 0,1 N HCl (50 mL), następnie 5% wodnym roztworem KH2PO4, następnie nasyconą solanką. Roztwór organiczny osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu, następnie przesączono. Przesącz odparowano i poddano chromatografii na żelu krzemionkowym eluowanym octanem etylu, otrzymując związek (2.3) (1,87 g, 94% wydajności), C23H34N4O6, widmo masowe (FAB) M+1 = 463,3.

Etap B Związek (2.5)

W sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykł adzie Preparatywnym 2, Etap B, wytworzono zwią zek (2.5).

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 8 Etap A Związek (3.1)

W kolbie połączono ester metylowy N-Cbz-hydroksyproliny (dostępny z firmy Bachem Biosciences, Incorporated, King of Prussia, Pennsylvania), związek (3.01) (3,0 g), toluen (30 mL), i octan etylu (30 mL). Mieszaninę mieszano energicznie, a następnie dodano roztwór NaBr/woda (1,28 g/5 mL). Do tego dodano wolny rodnik 2,2,6,6-tetrametylo-1-piperydynyloksylowy (TEMPO, 17 mg, z firmy Aldrich Chemicals, Milwaukee, Wisconsin). Mieszaną mieszaninę ochłodzono do 5°C, a następnie w ciągu 0,5 h dodano kroplami wytworzony roztwór utleniacza [dostępny w handlu podchloryn, Clorox® (18 mL), NaHCO3 (2,75 g) i wody do 40 mL]. Do tego dodano 2-propanol (0,2 mL). Warstwę organiczną oddzielono, i warstwę wodną ekstrahowano octanem etylu. Ekstrakty organiczne połączono, przemyto 2% roztworem tiosiarczanu sodu, następnie nasyconą solanką. Roztwór organiczny osuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono, i odparowano przesącz pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując bladożółtą gumę nadającą się do kolejnych reakcji (2,9 g, 97% wydajności), C14H15NO5 (277,28), widmo masowe (FAB) M+1 = 278,1.

Etap B Związek (3.2)

138

PL 206 255 B1

Związek (3.1) z Etapu A powyżej (7,8 g) rozpuszczono w dichlorometanie (100 mL), i ochłodzono do 15°C. Do tej mieszaniny najpierw dodano 1,3-propanoditiol (3,1 mL), a następnie świeżo destylowany kompleks trifluorku boru z eterem (3,7 mL). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 18 h. Mieszając energicznie, ostrożnie dodano roztwór K2CO3/woda (2 g/30 mL), a następnie nasycony roztwór NaHCO₃ (10 mL). Warstwę organiczną oddzielono od warstwy wodnej (pH —7,4), przemyto wodą (10 mL), następnie solanką. Roztwór organiczny osuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono, i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym, przy eluowaniu toluenem, następnie gradientem heksanuEt2O (2:3 do 0:1), otrzymując brunatny olej (7,0 g, 68% wydajności), C17H21NO4S2 (367,48), widmo masowe (FAB) M+1 = 368,1.

Etap C Związek (3.3)

Roztwór związku (3.2) z Etapu B powyżej (45 g) w acetonitrylu (800 mL) w temperaturze 20°C potraktowano świeżo destylowanym jodotrimetylosilanem (53 mL) w jednej porcji od razu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 30 minut, po czym wylano do świeżo wytworzonego roztworu diwęglanu ditert-butylu (107 g), eteru etylowego (150 mL), i diizopropyloetyloaminy (66,5 mL). Mieszaninę mieszano przez 30 minut więcej, a następnie przemyto heksanem (2 x 500 mL). Do niższej warstwy acetonitrylowej dodano octan etylu (1000 mL), a następnie warstwę przemyto 10% wodnym roztworem KH2PO4 (2 x 700 mL), i solanką. Przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem na łaźni wodnej w temperaturze 25°C, rozpuszczono w świeżym octanie etylu (1000 mL), i przemyto kolejno 0,1 N HCl, 0,1 N NaOH, 10% wodnym roztworem KH2PO4, i solanką. Roztwór organiczny osuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono, i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość (66 g) poddano chromatografii na żelu krzemionkowym (2 kg), przy eluowaniu heksanem (2 L), następnie Et2O/heksanem (55:45, 2 L), następnie Et2O (2 L), otrzymując pomarańczową gumę, która powoli krystalizowała stojąc (28 g, 69% wydajności), C14H23NO4S2 (333,46), widmo masowe (FAB) M+1 = 334,1.

Etap D Związek (3.4)

Roztwór związku (3.3) z Etapu C powyżej (11 g) w dioksanie (150 mL) w temperaturze 20°C potraktowano 1 N wodnym roztworem LiOH (47 mL) i mieszano przez 30 h. Mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem na łaźni wodnej w temperaturze 30°C do połowy objętości. Pozostałość rozcieńczono wodą (300 mL), ekstrahowano Et2O (2 x 200 mL). Warstwę wodną zakwaszono do pH -4 przy użyciu 12 N HCl (3-4 mL), ekstrahowano octanem etylu, i przemyto solanką. Roztwór organiczny osuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono, i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując związek (3.4) (8,1 g, 78%), C13H21NO4S2 (319,44), widmo masowe (FAB) M+1 = 320,1.

PL 206 255 B1

139

Etap E Związek (3.5).

Do roztworu związku (3.3) z Etapu C powyżej (1 g) w dioksanie (5 mL), dodano 4 N roztwór HCl w dioksanie (50 mL). Mieszaninę mieszano energicznie przez 1 h. Mieszaninę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem na łaźni wodnej w temperaturze 25°C. Pozostałość roztarto z Et2O, i odsączono, otrzymując związek tytułowy (0,76 g, 93% wydajności), C9H15NO2S2 • HCl (269,81), widmo masowe (FAB) M+1 = 234,0.

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 9

Etap A Związek (3.6)

Postępując zgodnie z procedurą zasadniczo taką samą jak w Przykładzie Preparatywnym 8, Etap B, i podstawiając etanoditiol zamiast propanoditiolu, otrzymano związek (3.6).

Etap B Związek (3.7)

Postępując zgodnie z procedurą zasadniczo taką samą jak w Przykładzie Preparatywnym 8, Etap C, i podstawiając związek (3.6) zamiast związku (3.2), otrzymano jako produkt związek (3.7).

Etap C Związek (3.8)

Postępując zgodnie z procedurą zasadniczo taką samą jak w Przykładzie Preparatywnym 8, Etap D, i podstawiając związek (3.7) zamiast związku (3.3), otrzymano jako produkt związek (3.8).

140

PL 206 255 B1

Etap D Związek (3.9)

Postępując zgodnie z procedurą zasadniczo taką samą jak w Przykładzie Preparatywnym 8, Etap E, i podstawiając związek (3.7) zamiast związku (3.3), otrzymano jako produkt związek (3.9).

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 10 Etap A Związek (4.1) /—\

W sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykł adzie Preparatywnym 2, Etap A, wytworzono zwią zek (4.1); C33H48N4O9S2 (708,89).

Etap B Związek (4.2)

W sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykł adzie Preparatywnym 2, Etap B, wytworzono zwią zek (4.2); widmo masowe (FAB) M+1 = 609,3.

Etap C Związek (4.3)

PL 206 255 B1

141

W sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykładzie Preparatywnym 2, Etap A, wytworzono związek (4.3); C41H61N5O10S2 (708,89), widmo masowe (FAB) M+H = 709,3.

Etap D Związek (4.4)

W sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykładzie Preparatywnym 7, Etap A, wytworzono związek (4.4).

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 11 Etap A Związek (4.5)

W sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykładzie Preparatywnym 2, Etap A, wytworzono związek (4.5).

Etap B Związek (4.6)

W sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykładzie Preparatywnym 2, Etap B, wytworzono związek (4.6).

Etap C Związek (4.7)

142

PL 206 255 B1

Związek (4.9) z Przykładu Preparatywnego 12 poddano reakcji ze związkiem (4.6) z Etapu B powyżej, w sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykładzie Preparatywnym 2, Etap A, otrzymując związek (4.7).

Etap D Związek (4.8)

W sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykładzie Preparatywnym 7, Etap A, wytworzono związek (4.8).

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 12

Związek (4.9) i-BuOCOCl + H-Chg-OH Iboc-Chg-OH (4.01) (4.02) (4.9)

Roztwór L-cykloheksyloglicyny (4.02) (1,0 ekwiw.), dimetyloformamidu (20 mL/g), i diizopropyloetyloaminy (1,1 ekwiw.) w temperaturze 5°C traktuje się chloromrówczanem izobutylu (4.01) (1,1 ekwiw.). Usuwa się łaźnię chłodzącą i miesza się go przez 6 h. Mieszaninę reakcyjną wylewa się do 5% wodnego roztworu KH2PO4 i ekstrahuje octanem etylu (2x). Połączone fazy organiczne przemywa się zimnym 5% wodnym roztworem K2CO3, następnie 5% wodnym roztworem KH2PO4, następnie solanką, i substancje organiczne suszy się nad bezwodnym MgSO4. Mieszaninę sączy się, przesącz odparowuje pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość poddaje chromatografii jeśli to konieczne albo w przeciwnym razie pozostałość rozciera z Et2O-heksanem, i odsącza, otrzymując związek tytułowy (4.9); C13H23NO4 (257,33).

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 13

Związek (13.1) i-BuOCOCl +

H-Thr(Bzl)-OH Iboc-Thr(Bzl)-OH (4.01) (13.02) (13.1)

W sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykładzie Preparatywnym 12, podstawiając L-O-benzylotreoninę (13.02) (Wang i in., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, (1997) nr 5, 621-624) zamiast L-cykloheksyloglicyny (4.02) wytwarza się związek (13.1); C16H23NO5 (309,36), widmo masowe (FAB) M+1 = 310,2.

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 14

Etap A Związek (5.1)

Związek (4.8) z Przykładu Preparatywnego 11, Etap D (1,0 g) poddano reakcji z roztworem bezwodnego kwasu trifluorooctowego w dichlorometanie (1:1, 50 mL) przez 2 h. Roztwór rozcieńczono ksylenem (100 mL) i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość roztarto z Et2O, i odsączono, otrzymują c związek tytuł owy (5.1) (0,9 g); C37H53N5O9S2 (775,98), widmo masowe (FAB) M+1 = 776,5.

PL 206 255 B1

143

W sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykładzie Preparatywnym 2, Etap A, związek (5.1) poddano reakcji z amoniakiem (0,5 M roztwór w 1,4-dioksanie), otrzymując związek tytułowy (5.2); C37H54N6O8S2 (774,99), widmo masowe (FAB) M+1 = 775,4.

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 15

Mieszaninę związku (5.1) z Przykładu Preparatywnego 14, Etap A (0,15 g), N,N-dimetyloaminy (0,12 mL 2 M roztworu w THF), dimetyloformamidu (10 mL), i reagenta sprzęgającego Py-BrOP (0,11 g) ochłodzono do 5°C, po czym dodano diizopropyloetyloaminę (DIEA lub DIPEA, 0,12 mL). Mieszaninę mieszano na zimno przez 1 minutę, następnie mieszano w temperaturze pokojowej przez 6 h. Mieszaninę reakcyjną wylano do zimnego 5% wodnego roztworu H3PO4 (50 mL) i ekstrahowano octanem etylu (2 x). Połączone fazy organiczne przemyto zimnym 5% wodnym roztworem K2CO3, następnie 5% wodnym roztworem KH2PO4, następnie solanką. Roztwór organiczny osuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono, i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym, przy eluowaniu MeOH-CH2Cl2, otrzymując związek tytułowy (5.3), C39H58N6O8S2 (803,05), widmo masowe (FAB) M+1 = 803,5.

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 16

Etap A Związek (6.2)

W sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykładzie Preparatywnym 2, Etap A, związek (6.1), chlorowodorek estru benzylowego hydroksyproliny poddano reakcji ze związkiem (4.9) z Przykładu Preparatywnego 12, otrzymując związek tytułowy (6.2); C25H36N2O6 (460,56), widmo masowe (FAB) M+1 = 461,2.

Etap B Związek (6.3)

144

PL 206 255 B1

W sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykł adzie Preparatywnym 8, wytworzono zwią zek (6.3); C25H34N2O6 (458,55), widmo masowe (FAB) M+1 = 459,2.

Etap C Związek (6.4)

Mieszaninę związku (6.3) z Etapu B (1 g), 10% Pd/C (0,05 g), i EtOH (100 mL) mieszano pod ciśnieniem 1 atm H2 przez 6 h. Mieszaninę przesączono i odparowano do suchej masy pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując związek tytułowy (6.4) (0,77 g); C18H28N2O6 (368,42), widmo masowe (FAB) M+1 = 369,2.

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 17

Etap A Związek (7.1)

Związek (6.4) z Przykładu Preparatywnego 16, Etap C, poddano reakcji ze związkiem (2.3) z Przykładu Preparatywnego 6, Etap B, w sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykł adzie Preparatywnym 2, Etap A, otrzymując związek (7.1); C36H54N6O9 (714,85), widmo masowe (FAB) M+1 = 715,9.

Etap B Związek (7.2)

Związek (7.1) poddano reakcji w sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykładzie Preparatywnym 7, Etap A, otrzymując związek (7.2); C36H52N6O9 (712,83), widmo masowe (FAB) M+1 = 713,5.

Etap C Związek (7.3)

PL 206 255 B1

145

Związek (7.2) z Etapu B powyżej, poddano reakcji w sposób zasadniczo taki sam, jak w Przykładzie Preparatywnym 8, Etap B, z 1,4-butanoditiolem, otrzymując związek tytułowy (7.3); C40H60N6O8S2 (817,07), widmo masowe (FAB) M+1 = 817,5.

Stosując procedury opisane wyżej wytworzono związki podane w załączonej Tabeli 2. Jako uwaga ogólna do wszystkich Tabel, które są załączone do niniejszego opisu, jak również do Przykładów i Schematów w niniejszym opisie, jakikolwiek atom azotu o niewysyconej wartościowości w strukturach chemicznych w Przykładach i Tabelach odnosi się do NH, albo w przypadku końcowego atomu azotu, do -NH2. Podobnie, jakikolwiek atom tlenu o niewysyconej wartościowości w strukturach chemicznych w Przykładach i Tabelach odnosi się do -OH.

Synteza na fazie stałej

Ogólna procedura reakcji sprzęgania na fazie stałej.

Syntezę wykonywano w naczyniu reakcyjnym, które było zbudowane z cylindra strzykawki polipropylenowej mającego na spodzie polipropylenową frytę. Aminokwasy zabezpieczone grupą Fmoc były sprzęgane w normalnych warunkach technik na fazie stałej. Każde naczynie reakcyjne było napełnione 100 mg wyjściowej żywicy Fmoc Siebera (w przybliżeniu 0,03 mmol). Żywicę przemyto porcjami po 2 mL DMF (2 razy). Grupę zabezpieczającą Fmoc usunięto działaniem 2 mL 20% obj. roztworu piperydyny w DMF przez 20 min. Żywicę przemyto porcjami po 2 mL DMF (4 razy). Sprzęganie wykonywano w DMF (2 mL), stosując 0,1 mmol Fmoc-aminokwasu, 0,1 mmol HATU [heksafluorofosforanu O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowego] i 0,2 mmol DIPEA (N,N-diizopropyloetyloaminy). Po 2 h wytrząsania naczynie reakcyjne odsączono i żywicę przemyto porcjami po 2 mL DMF (4 razy). Cykl sprzęgania powtarzano z następnym Fmoc-aminokwasem lub grupą kończącą.

Ogólna procedura utleniania Dessa-Martina na fazie stałej.

Syntezę przeprowadzono w naczyniu reakcyjnym, które było zbudowane z cylindra strzykawki polipropylenowej mającego na spodzie polipropylenową frytę. Związany z żywicą hydroksy-związek (w przybliżeniu 0,03 mmol) potraktowano roztworem 0,12 mmol nadjodinanu Dessa-Martina i 0,12 mmol t-BuOH w 2 mL DCM przez 4 h. Ż ywicę przemyto porcjami po 2 mL 20% obj. roztworu iPrOH w DCM, THF, 50% obj. roztworu THF w wodzie (4 razy), THF (4 razy) i DCM (4 razy).

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 18

Wytwarzanie związku N-Fmoc-2',3'-dimetoksyfenyloglicyny (901)

146

PL 206 255 B1

Do roztworu cyjanku potasu (1,465 g, 22,5 mmol) i węglanu amonu (5,045 g, 52,5 mmol) w wodzie (15 mL) dodano roztwór 2,3-dimetoksybenzaldehydu 901A (2,5 g, 15 mmol) w etanolu (15 mL). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze 40°C przez 24 h. Objętość roztworu zmniejszono do 10 mL przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano stężony kwas solny (15 mL) i związek 901B otrzymano jako biały osad. Związek 901B wydzielono przez odsączenie (2,2 g, 9,3 mmol). Związek 901B rozpuszczono w 10% wagowo wodnym roztworze wodorotlenku sodu (15 mL) i otrzymany roztwór ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 24 h. Dodano stężony kwas solny i pH doprowadzono do obojętnego (pH 7). Otrzymany roztwór zawierający związek 901C odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 5% wagowo wodnym roztworze wodorowęglanu sodu (150 mL). Roztwór ochłodzono do 0°C w łaźni lodowej i w temperaturze 0°C dodano 1,4-dioksan (30 mL) i roztwór węglanu 9-fluorenylometylu sukcynoimidylu (2,7 g, 8 mmol) w 1,4-dioksanie (30 mL). Mieszaninę reakcyjną zostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej i mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 h. 1,4-Dioksan odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Roztwór wodny przemyto eterem dietylowym. Dodano stężony kwas solny i pH doprowadzono do kwaśnego (pH 1). Dodano octan etylu, warstwę organiczną przemyto wodą i solanką. Warstwę organiczną osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując pożądany związek 901 jako białą pienistą substancję stałą (3,44 g, 7,9 mmol). MS (LCMS-elektrorozpylanie) 434,1 MH⁺.

P r z y k ł a d P r e p a r a t y w n y 19

Związek (801)

OH

Do roztworu N-Fmoc-fenyloalaniny 801A (5 g, 12,9 mmol) w bezwodnym DCM (22 mL) ochłodzonego do -30°C w łaźni suchy lód-aceton dodano po kolei N-metylopirolidynę (1,96 mL, 16,1 mmol) i chloromrówczan metylu (1,2 mL, 15,5 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -30°C przez 1 h i dodano roztwór chlorowodorku N,O-dimetylohydroksyloaminy (1,51 g, 15,5 mol) i N-metylopirolidynę (1,96 mL, 16,1 mmol) w bezwodnym DCM (8 mL). Mieszaninę reakcyjną zostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej i mieszano w temperaturze pokojowej przez noc. Dodano toluen i warstwę organiczną przemyto rozcieńczonym kwasem solnym, wodnym roztworem wodorowęglanu sodu i solanką. Warstwę organiczną osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując związek 801B (4 g, 9,29 mmol).

Do roztworu Red-Al (6,28 mL, 21,4 mmol) w bezwodnym toluenie (8 mL) ochłodzonego do -20°C w łaźni suchy lód-aceton dodano roztwór związku 801B (4 g, 9,29 mmol) w bezwodnym toluenie (12 mL). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -20°C przez 1,5 h. Warstwę organiczną przemyto rozcieńczonym kwasem solnym, wodnym roztworem wodorowęglanu sodu i solanką. Warstwę organiczną osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i surowy produkt 801C zastosowano w następnej reakcji bez dalszego oczyszczania.

PL 206 255 B1

147

Do roztworu związku 801C (około 9,29 mmol) w heksanie (15 mL) dodano roztwór cyjanku potasu (24 mg, 0,37 mmol) i jodek tetrabutyloamoniowy (34 mg, 0,092 mmol) w wodzie (4 mL) i cyjanohydrynę acetonu (1,27 mL, 13,9 mmol) po kolei. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 h. Dodano octan etylu i warstwę organiczną przemyto wodą i solanką. Warstwę organiczną osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując związek 801D (2,4 g, 6,03 mmol).

Do roztworu związku 801D (2,4 g, 6,03 mmol) w 1,4-dioksanie (11 mL) dodano stężony kwas solny (11 mL). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze 80°C przez 3 h. Dodano octan etylu (25 mL) i wodę (25 mL). Warstwę organiczną przemyto solanką i osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując pożądany związek 801 jako białą pienistą substancję stałą (2 g, 4,8 mmol). MS (LCMS-elektrorozpylanie) 418,1 MH⁺.

FmocHN^Ai'

FmocHN-P

FmocHN

301A

301C

FmocHN.

Fmoc

FmocHN,

301F

301G

301H

Schemat 8

148

PL 206 255 B1

Przykład (301J):

Schemat 8 Związek (301J)

Związane z żywicą związki 301B, 301C, 301D, 301E, 301F i 301G wytworzono zgodnie z ogólną procedurą reakcji sprzęgania na fazie stałej wychodząc od 100 mg żywicy Fmoc Siebera (0,03 mmol). Związany z żywicą związek 301G utleniono do związanego z żywicą związku 301H zgodnie z ogólną procedurą utleniania Dessa-Martina na fazie stałej. Związany z żywicą związek 301H potraktowano przy użyciu 4 mL 2% obj. roztworu TFA w DCM przez 5 min. Przesącz dodano do 1 mL AcDH i roztwór zatężono metodą odwirowania pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując związek 301J (0,0069 g, 29% wydajności). MS (LCMS-elektrorozpylanie) 771,2 MH⁺.

Stosując techniki syntezy na fazie stałej wyszczególnione wyżej, i następujące ugrupowania dla rozmaitych funkcji w związku o wzorze 1, wytworzono związki podane w Tabeli 3:

-W-:

ο

Y-W-:

PL 206 255 B1

149

150

PL 206 255 B1

151

152

PL 206 255 B1

153

154

PL 206 255 B1

155

O R2’

156

PL 206 255 B1

T a b e l a 3. Związki wytworzone metodą syntezy na fazie stałej

PL 206 255 B1

157

c.d. Tabeli

Ύ°	c
X	Β
X	Β
X	C
	Β
X	C
χΧχ/ΧτΧ	Β
X	Β

158

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

5 Ϋ	c
°r Υλ\ολ~°	c
	c
r 1	c

Ά	c
r
Y-hsyw^ o ^M ° i ° >-» °	c
X	c
-a V	c

PL 206 255 B1

159

c.d. Tabeli

A	c
r	c
	c
HO Wo aAv/>a^a	c
MO \sO	c
¹ *w	c
^0 ν \ί ϊ I S ΗI ο ^Η Ο W Ο Ο	c
ΗΟ \κ?Ο fHf «'^S/Só'''L AZ^ u* ° C\| ° Fęi	c

160

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

HO \ssO	C
'y-sO	C
γ>	C
A _Λ Αχ^χ	C
ΗΟ \~α&	C
ΗΟ. ~ \ssO ΧχλΑΛχΑ'' ο ^Η ° 1 °^Ζ V °	C
ΗΟ \sssO	C
Ρ	C

PL 206 255 B1

161

c.d. Tabeli

p	c
	B
	C
o Yh i « rf	B
. p	C
	C
	C
r-i P Γθ 5 •^ΜΛφ^’³'	C

162

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

	c
	c
z P	c
	c
	c
	c
ZA q _h ZA o~Z— ^h^O I *y <fy.°	c
	c
ζ\ i.aasZa^ S° °/-° '	c

PL 206 255 B1

163

c.d. Tabeli

o	c
O Η O 8 ^γΤΙ o /— O	c
< . . o . .>- yMy y	c
^OH \ yTyyTy	c
yPyyyy	c
T ( ? h n_z⁰~-^~	c
p	B
P	B

164

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

PL 206 255 B1

165

c.d. Tabeli

	c
	c
	B
	C
	B
	C
i ^!	B
ΣΧ	B

166

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

	c
	A
	A
	A
(S Η ? Η iPV°	B
X b	A
P kkpogp'	B
V γΡΥτγΟΛ-^	B

PL 206 255 B1

167

c.d. Tabeli

ji+aA,' VTT I ^oxX°	B
rp ° A s fi	C
A °r	B
?	B
V	B
Λ Ar _{o H} Λ A ^•γ'η^ Ł A ° f~\~y°	B
ΓΥ^γ sry*	C
A ^esO	B

168

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

P	B
• . f	B
οΑΧχΧο	B
P 0 r-Z «ί cp^\VW	B
ζΡΧΒψτΧ/?	B
	C
, cZZr/r^O	C
θ^^Ρ	A

PL 206 255 B1

169

c.d. Tabeli

P	B
	B
P	B
PW	B
	B
P	B
P	B
	C

170

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

	B
p _	B
	B
	B
p γΥϊ\τΥ%	B
C?TV^r^fO	A
	B
. f crTptWAp	B

PL 206 255 B1

171

c.d. Tabeli

172

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

	B
P	C
	C
	c
F	A
cpT-y^yjro	B
P cTTĄsy^-o	A
	A

PL 206 255 B1

173

c.d. Tabeli

-- p	B
“ p “	A
—p	A
P	A
p	A
I	B
P	B
p	A

174

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

PL 206 255 B1

175

c.d. Tabeli

	c
	c
p	c
p	c
axavL«X Χ’ 7 ΛΛΓ	B
% c?WW>	B
A UJ £)	B
	B

176

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

	A
X XXvA\|Z	B
ΖΧ.Α	C
X o^ U* ° V o^y/ł	C
C??VćrjS	B
JAAyA<0	B
	B
	B

PL 206 255 B1

177

c.d. Tabeli

V Η Ο^ο V ο	A
	A
	A
	A
	B
ίΜ*φ	C
	B
	A

178

PL 206 255 B1

179

180

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

_F ϊρ Φφ Η- α^α	B
	B
	C
	B
	A
YyS4y?TT	B
”PÓĆ^kr^JSAr'^ci5y ρΜΤ^Υρ o o J o o	B
o o J 0 o	B

PL 206 255 B1

181

c.d. Tabeli

F O 0 F	? Y 0 ° k	Άτ^ί 3 o	c	_χα ^^NH2 1	B
	Ί	OMe. . Ύ o o		_xOMe .NH,	B
	o o J	o	o
F O Y It⁵! ffll	/ή Γ*/	Y %AA„	ζ	,OMe NH,	B
			II o
	Ί	OMB\.		,OMe
F O Y hrVSr		•YY-Ar	ς	NH,	B
_?>A,>	° o J	S ^H	o
« F 0	\
	Ί /** Υγ	I o o	o	,OMe	B
	> p-\|-	. .τχ
Ουψ	o o J	o	o		B
X	Y o ° J	8 '	Λ		B
Γ	X” o
rW	Au				B
CQ	il fi o o J	o . 8
ił o

182

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

	A
	B
_OV~ q>H ° V	C
A A Z~\ Χί ° ° MPYYr^Ażr %. / 4 O L o o \JH ° η fcp	C
>£ A oh. · jt A Ja	C
A A Z—\ Λ» f B z*a> O y~~o L □ o	C
	C
τ^λΧ^ζ/αΧα	B

PL 206 255 B1

183

c.d. Tabeli

	ο......\|........ \ 0 ο J	χχχ ł	C
fYVX ο	θ -OUl	ο X ϋ *	C
ΛΑζη ° ρΧ γ XX F 0	Ο \| ’	_γοχΧ	Β
ο J	0
'Γ'Ρ'»^!'		C
g 9	Ο—1™		Β
βίγΥτ ° zk	ο J	ο ο
	θ__\|—	ο Αα
ćcW	ΧΧΜ Ο J	ΧΧΧΧ^νη, 0 0	Β
	ρ—j—	XX
Γγ\τγ 0		ί^:-·'': '^,:	Β
ο J	Ο Ο
	ρ—\|—	„ χχ
F Ο XX ιΓ	Χ?Η_γ	ΜΆ η	Β
ΧΑ xk /ΟΗ ο ^F ίΓ	ο J	0 0
F Ο

184

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

O γΆ	*°~j— ¥>Ay 0 o \	< Λ	B
ΆΆ 0	A/NH, o
„ „c	y	ΑΆ-	v> xAo^z O	B
iy	G—j- Ί? “Λτ’Ψ ° O A	J-Jy 0	x> o	B
	) Y+	c	x>
\|Γι>< o	0 o J	0	s^NHj O	B
F ° \| Wr	A j^5-j—	K O 0 VA	Ύ> /.NH,	B
F O	° o J	o	o
o η Ύ^ο-Z^j	A O—\|p~ ° o J	(f LiiJL 0	A G	B
-KJĆ 8 A(	*A p· \| - ⁰ o J	(Γ juuę 0	S⁵^ 8	B
p o	Ί p-“j~—	/AA „u
[flfi		γΑί o		B
u?	° o J	o

PL 206 255 B1

185

c.d. Tabeli

(fAn Αν® o	> o-jL? a 0 o J	.<?' γ ^XAX o , 0	B
F 0	Ί Azt”	0 0	B
F'^VⁱS<^0H F 0	O 0 J
0	X 0—j— ° 0 J	,9'· X 0 O	B
1^{M 0}o ”	A O-—j~* O o J	i ,QC o o y o JL JL JL Χ/^j o o	B
ATT'	) H-	i Ϊ § yL’'	B
	o o J	o o
O Y Γί«	) uH“ .^n-Pb	.«o o	B
o	O fi J
f θ η Fu A X prY (Λ/γ* F 8	A p‘,„‘\|· ~» O o J	£ o o γ^'ιτ' o o	B
O	Ρ XH~ ΧχΝ—ZJ1 O o J	, ,x ϊ (T^ o o	B

186

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

<o 0 5	B
rO o <Ζ	B
<0 Q	B
⁴³ 1

<p-	B

F	B
fP i?
MO	C
	B
cf~O 0 “πΛν'Ρ^τΎ' ,;T ^v	B

PL 206 255 B1

187

c.d. Tabeli

W 0	O o	c
rD Cr⁷		c
z~0 W\ h « I i
° L FTTir^UT oko b c. J. o ] kF	c
<P-	c
<~O π
° Ł ł fl 1 1 °·Κ^ΝΗ ° 1 -φ-	o	B
°h°s s?
yO* MO	C
eO Ή. b s b	u ΊΓ
° L / T I W °y-w ° i	o	C
<rO ÓUuO O l Γ\|Γ J;iF y-Ą, o L o yr “ ¹		C

188

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

V	c
^5	c
<O ę	c
<O O Άο	c
	c
	c
o	c
	c

PL 206 255 B1

189

c.d. Tabeli

S-	c
	c
<0 O	B
V	B
	B
	B
	B
o o j 0 0	B .

190

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

Q II \| -π—	Β
n 4· ęr AjX-OH 0 δ jj δ ^0	Β
	Β
ΧχΑ ₈Χ γ-οXfj ^Ν''γ^^	Β
+χχχ	C
, γ X , Ο ΤΧνγ/γΧν	Β
	Β
, ο χ+·, , Ο ° ο J ο ο	C

PL 206 255 B1

191

c.d. Tabeli

	0-j—		Β
	b	C
		φ	Β
	X	0	Β
	Β
			Β
cć
Υ>Λ,	2dti, όΧ/τΛ	νΗ— Λγ-	C
γΛ	X) p~i— YpY	A+- ^«γ·	C

192

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli

	c
	c
O ° 1.......... «γ<4~	c
	c
	B Iw*¹
xxi^ŁA^sJlX-	c
	c
	c

PL 206 255 B1

193

c.d. Tabeli

	3 8 ° \P	,-A	B
a4	yY^		C
		o 1 £ π fl	B
Α-γ	ΧΎ O YlAji o θ /	o ηρ ^ΎΥΥ<^ΝΗι 0 0	C
AĄ-	3 o ° z		C
av	;Υγ	/γ53	C
	3	Λ = ^M O	C
Ύ~Ύ	o AJ	γΎγ	B

194

PL 206 255 B1

	Β
	C
	C
	C
	C

Dodatkowe związki, które wytworzono, oraz ich zakresy aktywności (Ki*) są podane w załączonych Tabelach 4 i 5. Procedura stosowana do wytwarzania związków w Tabelach 4 i 5 jest naszkicowana poniżej.

I) Synteza związków pośrednich dla związków w Tabelach 4 i 5:

P r z y k ł a d I. Synteza estru metylowego 4,4-dimetyloproliny (H-Pro(4,4-diMe)-OMe)

Etap 1. Synteza N-tert-butoksykarbonylo-4-metylo-L-piroglutaminianu tert-butylu (Boc-PyroGlu(4-metylo)-OtBu):

PL 206 255 B1

195

Do roztworu N-tert-butoksykarbonylo-piroglutaminianu tert-butylu (11,5 g, 40 mmol) w THF (200 mL) mieszanego w temperaturze -78°C, w ciągu 5 minut dodano kroplami 1 M roztwór heksametylodisilazydku litu w THF (42 mL, 42 mmol). Po 30 minutach dodano jodek metylu (3,11 mL, 50 mmol). Po dodatkowych 2 godzinach w temperaturze -78°C usunięto łaźnię chłodzącą i dodano 50%-nasycony wodny roztwór chlorku amonu (200 mL). Roztwór mieszano przez 20 minut, a następnie ekstrahowano eterem (3 x 200 mL). Połączone warstwy organiczne przemyto solanką (200 mL), osuszono (Na2SO4), przesączono i zatężono. Pozostałość poddano chromatografii przy użyciu 1:1 octanu etylu/heksanu, otrzymując Boc-PyroGlu(4-metylo)-OtBu (10,6 grama, 35,4 mmol, 88%) jako mieszaninę izomerów (2:1 cis do trans).

Etap 2. Synteza N-tert-butoksykarbonylo-4,4-dimetylo-L-piroglutaminianu tert-butylu (BocPyroGlu(4,4-dimetylo)-OtBu):

Do roztworu N-tert-butoksykarbonylo-4-metylo-L-piroglutaminianu tert-butylu (1,2 g, 4,0 mmol) w tetrahydrofuranie (20 mL) mieszanego w temperaturze -78°C, dodano kroplami w cią gu 5 minut 1 M roztwór heksametylodisilazydku litu w tetrahydrofuranie (4,4 mL, 4,4 mmol). Po 30 minutach dodano jodek metylu (0,33 mL, 5,2 mmol). Po dodatkowych 3 godzinach w temperaturze -78°C usunięto łaźnię chłodzącą i dodano 50%-nasycony wodny roztwór chlorku amonu (40 mL). Roztwór mieszano przez 20 minut, po czym ekstrahowano eterem (2 x 50 mL). Połączone warstwy organiczne przemyto wodą (2 x 25 mL), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (2 x 25 mL), solanką (50 mL), osuszono (Na2SO4), przesączono i zatężono, otrzymując Boc-PyroGlu(4,4-dimetylo)-OtBu (0,673 g, 54%).

Etap 3. Synteza estru tert-butylowego N-tert-butoksykarbonylo-4,4-dimetyloproliny (BocPro(4,4-dimetylo)-OtBu)

Modyfikacja znanej procedury: Pedregal, C.; Ezquerra, J.; Escribano, A.; Carreno, M. C.; Garcia Ruano, J. L. Tetrahedron Letters 1994, 35(13), 2053-2056).

Do roztworu N-tert-butoksykarbonylo-4,4-dimetylopiroglutaminianu tert-butylu (2,0 mmol) w tetrahydrofuranie (5 mL) mieszanego w temperaturze -78°C, dodano kroplami w ciągu 5 minut 1 M roztwór trietyloborowodorku litu w tetrahydrofuranie (2,4 mL, 2,4 mmol). Po 30 minutach usunięto łaźnię chłodzącą i dodano nasycony wodny roztwór wodorowęglanu sodu (5 mL). Mieszaninę reakcyjną zanurzono w łaźni zawierającej wodę z lodem i dodano 30% wodny roztwór nadtlenku wodoru (10 kropli). Roztwór mieszano przez 20 minut w temperaturze 0°C, a następnie mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem w celu usunięcia tetrahydrofuranu. Roztwór wodny rozcieńczono wodą (10 mL) i ekstrahowano dichlorometanem (3 x 40 mL). Warstwy organiczne osuszono (Na2SO4), przesączono i zatężono. Pozostałość rozpuszczono w dichlorometanie (20 mL) i trietylosilanie (310 gL, 2,0 mmol), po czym ochłodzono do -78°C i dodano kroplami kompleks trifluorek boru-eter dietylowy (270 gL, 2,13 mmol). Mieszanie kontynuowano przez 30 minut, po czym dodano dodatkowy trietylosilan (310 gL, 2,0 mmol) i kompleks trifluorek boru-eter dietylowy (270 gL, 2,13 mmol). Po wymieszaniu w temperaturze -78°C przez dodatkowe dwie godziny, usunięto łaźnię chłodzącą i dodano nasycony wodny roztwór wodorowęglanu sodu (4 mL). Po 5 minutach mieszaninę ekstrahowano dichlorometanem (3 x 40 mL). Warstwy organiczne osuszono (Na2SO4), przesączono i zatężono, otrzymując Boc-Pro(4,4-dimetylo)-OtBu.

196

PL 206 255 B1

Etap 4. Synteza 4,4-dimetyloproliny (H-Pro(4,4-dimetylo)-OH):

Roztwór estru tert-butylowego N-tert-butoksykarbonylo-4,4-dimetyloproliny w dichlorometanie (5 mL) i trifluorooctowym (5 mL) mieszano w temperaturze pokojowej przez pięć godzin. Roztwór zatężono, osuszono pod silnie zmniejszonym ciśnieniem i wzięto do następnego etapu bez dalszego oczyszczania.

Etap 5. Synteza N-tert-butoksykarbonylo-4,4-dimetyloproliny (Boc-Pro(4,4-dimetylo)-OH):

Do roztworu soli trifluorooctanowej 4,4-dimetyloproliny (1,5 mmol) w dioksanie (7 mL), acetonitrylu (12 mL) i diizopropyloetyloaminie (700 gL, 4 mmol) dodano roztwór diwęglanu di-tert-butylu (475 mg, 2,18 mmol) w acetonitrylu (5 mL). Po 12 godzinach mieszania w temperaturze pokojowej roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, rozpuszczono w nasyconym wodnym roztworze wodorowęglanu sodu (50 mL) i przemyto eterem dietylowym (3 x 40 mL). Warstwę wodną zakwaszono do pH 3 kwasem cytrynowym, po czym ekstrahowano dichlorometanem (3 x 40 mL). Połączone warstwy organiczne osuszono nad siarczanem sodu przesączono i zatężono.

Etap 6. Synteza chlorowodorku estru metylowego 4,4-dimetyloproliny (HCl'H-Pro(4,4-dimetylo)OMe):

Do roztworu Boc-Pro(4,4-diMe)-OH (0,5 g, 2,06 mmol) w bezwodnym metanolu (8 mL) dodano kroplami chlorek tionylu (448 gl, 6,18 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez sześć godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną zatężono, otrzymując bezpostaciową substancję stałą (377 mg, 95%).

P r z y k ł a d II. Procedura ogólna syntezy N-tert-butoksykarbonylo-4-alkilo-4-metyloproliny:

Związki, w których grupa R oznacza grupę allilową i grupę benzylową, zsyntetyzowano postępując zgodnie z Etapami 1-4 poniżej:

Etap 1. Synteza N-tert-butoksykarbonylo-4-alkilo-4-metylo-L-piroglutaminianu tert-butylu:

PL 206 255 B1

197

Do roztworu N-tert-butoksykarbonylo-4-metylo-L-piroglutaminianu tert-butylu (10,2 g, mmol) (patrz Przykład I, Etap 1) w tetrahydrofuranie (170 mL) mieszanego w temperaturze -78°C, dodano 1 M roztwór heksametylodisilazydku litu w tetrahydrofuranie (37,5 mL, 37,5 mmol) kroplami w ciągu 5 minut. Po 40 minutach dodano halogenek alkilu (61,4 mmol). Po dodatkowych 3 godzinach w temperaturze -78°C, usunięto łaźnię chłodzącą i dodano 50%-nasycony wodny roztwór chlorku amonu (200 mL). Roztwór mieszano przez 20 minut, po czym ekstrahowano eterem (2 x 200 mL). Połączone warstwy organiczne rozcieńczono heksanem (150 mL) i przemyto nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (100 mL), wodą (2 x 100 mL) i solanką (100 mL), osuszono (Na2SO4), przesączono i zatężono. Pozostałość poddano chromatografii błyskawicznej przy użyciu 20% octanu etylu w heksanie, otrzymując czysty N-tert-butoksykarbonylo-4-alkilo-4-metylo-L-piroglutaminian tert-butylu.

Etap 2. Synteza estru tert-butylowego N-tert-butoksykarbonylo-4-alkilo-4-metyloproliny:

Modyfikacja znanej procedury: Pedregal, C.; Ezquerra, J.; Escribano, A.; Carreno, M. C.; Garcia Ruano, J. L. Tetrahedron Letters (1994) 35(13), 2053-2056).

Do roztworu N-tert-butoksykarbonylo-4-alkilo-4-metylopiroglutaminianu tert-butylu (16,6 mmol) w tetrahydrofuranie (40 mL) mieszanego w temperaturze -78°C, dodano 1 M roztwór trietyloborowodorku litu w tetrahydrofuranie (20 mL, 20 mmol) kroplami w ciągu 10 minut. Po 120 minutach łaźnię chłodzącą zostawiono do ogrzania do -25°C, kiedy dodano nasycony wodny roztwór wodorowęglanu sodu (40 mL). Mieszaninę reakcyjną zanurzono w łaźni zawierającej wodę z lodem i dodano 30% wodny roztwór nadtlenku wodoru (4 mL). Roztwór mieszano przez 10 minut w temperaturze 0°C, po czym mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem w celu usunięcia tetrahydrofuranu. Roztwór wodny rozcieńczono wodą (300 mL) i ekstrahowano dichlorometanem (3 x 200 mL). Warstwy organiczne osuszono (siarczan sodu), przesączono i zatężono. Pozostałość rozpuszczono w dichlorometanie (100 mL) i trietylosilanie (2,6 mL, mmol), następnie ochłodzono do -78°C i dodano kroplami kompleks trifluorek boru-eter dietylowy (2,2 mL, mmol). Mieszanie kontynuowano przez 1 godzinę, po czym dodano dodatkowy trietylosilan (2,6 mL, mmol) i kompleks trifluorek boru-eter dietylowy (2,2 mL, mmol). Po dodatkowych 4 godzinach mieszania w temperaturze -78°C, usunięto łaźnię chłodzącą i dodano nasycony wodny roztwór wodorowęglanu sodu (30 mL) i wodę (150 mL). Po 5 minutach mieszaninę ekstrahowano dichlorometanem (3 x 200 mL). Warstwy organiczne osuszono (Na2SO4), przesączono i zatężono.

Etap 3. Synteza 4-alkilo-4-metyloproliny:

198

PL 206 255 B1

Roztwór estru tert-butylowego N-tert-butoksykarbonylo-4-alkilo-4-metyloproliny w dichlorometanie (5 mL) i trifluorooctowym (5 mL) mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 godzin. Dodano toluen i zatężono roztwór, a następnie osuszono pod silnie zmniejszonym ciśnieniem.

Etap 4. Synteza N-tert-butoksykarbonylo-4-alkilo-4-metyloproliny:

Do roztworu soli trifluorooctanowej 4-alkilo-4-metyloproliny (1,5 mmol) w dioksanie (7 mL), acetonitrylu (12 mL) i diizopropyloetyloaminie (700 gL, 4 mmol) dodano roztwór diwęglanu di-tert-butylu (475 mg, 2,18 mmol) w acetonitrylu (5 mL). Po 12 godzinach mieszania w temperaturze pokojowej roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, rozpuszczono w nasyconym wodnym roztworze wodorowęglanu sodu (50 mL) i przemyto eterem dietylowym (3 x 40 mL). Warstwę wodną zakwaszono do pH 3 1 N kwasem solnym, po czym ekstrahowano dichlorometanem (3 x 40 mL). Połączone warstwy organiczne osuszono (Na2SO4), przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii błyskawicznej przy użyciu 1:1 octanu etylu/heksanu z 1% kwasu octowego.

P r z y k ł a d III. Synteza N-tert-butoksykarbonylo-4-propylo-4-metyloproliny:

Roztwór N-tert-butoksykarbonylo-4-allilo-4-metyloproliny (400 mg, 1,48 mmol) (patrz Przykład II Etap 4) i 10% Pd na węglu (400 mg) w metanolu (20 mL) uwodorniano pod ciśnieniem 50 psi (345 kPa) przez 4 godziny. Mieszaninę przesączono i zatężono.

P r z y k ł a d IV. Synteza Boc-4-cykloheksyloproliny:

Roztwór dostępnej w handlu Boc-4-fenyloproline (750 mg) i 5% Rh na węglu (750 mg) w metanolu (15 mL) uwodorniano pod ciśnieniem 50 psi (345 kPa) przez 24 godziny. Mieszaninę przesączono i zatężono, otrzymując 730 mg produktu.

P r z y k ł a d V: Wytwarzanie kwasu fluorenylometoksykarbonylo-Pro-(4-spirocyklopentano)karboksylowego:

PL 206 255 B1

199

Etap 1. Synteza estru tert-butylowego kwasu (4-allilo)-Boc-piroglutaminowego:

Do ochłodzonego (-78°C) roztworu dostępnego w handlu N-Boc-piroglutaminianu tert-butylu (10 g, 35,1 mmol) w THF (175 mL) dodano heksametylodisilazydek litu (36,8 mL, 36,8 mmol) w ciągu pięciu minut. Mieszanie kontynuowano przez trzydzieści minut. Do pierwszego roztworu dodano kroplami roztwór bromku allilu (6,1 mL, 70,2 mmol) w THF (39 mL). Po upływie dwóch godzin w temperaturze -78°C, reakcję zatrzymano przez powolne dodanie nasyconego roztworu chlorku amonu (50 mL). Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylu i warstwy rozdzielono. Warstwę organiczną osuszono nad siarczanem sodu i zatężono. Błyskawiczna chromatografia kolumnowa wykonana przy użyciu 2:8 octanu etylu: heksanu dała produkt (6 g, 53%). NMR δ ppm (CDCl3): 5,7 (m, 1H), 5,1 (dd, 2H), 4,4 (m, 1H), 2,6 (m, 2H), 2,4 (m, 1H), 1,8-2,2 (m, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,4 (s, 9H).

Etap 2. Synteza estru tert-butylowego kwasu (4,4-diallilo)-N-Boc-piroglutaminowego:

Ester tert-butylowy kwasu (4-allilo)-N-Boc-piroglutaminowego otrzymany w Etapie 1 wyżej (2,68 g, 8,24 mmol) poddano drugiemu alkilowaniu bromkiem allilu w podobnych warunkach. Chromatografia błyskawiczna przy użyciu 15:85 octanu etylu: heksanu dała 2,13 g produktu (71%) jako klarowny olej.

Etap 3. Synteza estru tert-butylowego (4,4-diallilo)-Boc-Pro:

Część a: Do ochłodzonego (-78°C) roztworu estru tert-butylowego (4,4-diallilo)-Boc-PyroGlu (2,13 g, 5,83 mmol) w tetrahydrofuranie (14 mL) dodano trietyloborowodorek litu (1 M w tetrahydrofuranie, 7,29 mL, 7,29 mmol) w ciągu pięciu minut. Po upływie dwóch godzin w temperaturze -78°C, reakcję ogrzano do 0°C i zatrzymano przez powolne dodawanie nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu (20 mL) i 30% nadtlenku wodoru (20 kropli). Mieszanie kontynuowano przez 20 minut. Tetrahydrofuran usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałą gęstą białą pozostałość rozcieńczono wodą (80 mL) i ekstrahowano trzykrotnie dichlorometanem. Warstwę organiczną osuszono, przesączono i zatężono, i wzięto do następnego etapu bez dalszego oczyszczania.

Część b): Do produktu otrzymanego w części (a) w dichlorometanie (14 mL) dodano trietylosilan (931 gl, 5,83 mmol), a następnie kompleks trifluorek boru-eter dietylowy (776 gl, 6,12 mmol). Po trzydziestu minutach dodano więcej trietylosilanu (931 gl, 5,83 mmol) i kompleksu trifluorku boru-eteru dietylowego (776 gl, 6,12 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -78°C przez trzy godziny, po czym reakcję zatrzymano przez powolne dodawanie nasyconego roztworu wodorowęgla200

PL 206 255 B1 nu sodu i wody. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano dichlorometanem, i warstwę organiczną osuszono, przesączono i zatężono. Błyskawiczna chromatografia kolumnowa przy użyciu 15% octanu etylu w heksanie dał a 1,07 bezbarwnego oleju (57%). NMR δ ppm (CDCl3): 5,7-5,8 (m, 2H), 5,1 (m, 4H), 4,1-4,2 (2 dd, 1H, rotamery), 3,5-3,3 (dd, 1H) i 3,2 (dd, 1H) rotamery, 2,2-2,0 (m, 5H), 1,7 (m, 1H), 1,46 (s, 9H), 1,43 (s, 9H).

Etap 4. Synteza estru tert-butylowego (4-spirocyklopenteno)-Boc-Pro:

Do estru tert-butylowego (4,4-diallilo)-Boc-Pro (1,07 g, 3,31 mmol) w dichlorometanie (66 mL) dodano 5% dichlorek bis(tricykloheksylofosfino)benzylidenorutenu(IV) (katalizator Grubbsa) i mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 1,5 godziny. Mieszaninę reakcyjną zatężono i uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą błyskawicznej chromatografii kolumnowej przy użyciu 15% octanu etylu w heksanie. Otrzymano żółty olej (0,57 g, 53%). NMR δ ppm (CDCl3): 5,56 (bs, 2H), 4,2 i 4,1 (t, 1H, rotamery), 3,2-3,5 (m, 2H), 2,2-2,5 (m, 5H), 1,9 (dd, 1H) 1,47 i 1,46 (2 s, 9H, rotamery), 1,45 i 1,44 (2 s, 9H, rotamery).

Etap 5. Synteza estru tert-butylowego (4-spirocyklopentano)-Boc-Pro:

Roztwór estru tert-butylowego (4-spirocyklopenteno)-Boc-Pro (1,12 g) w metanolu (18 mL), wodzie (4 mL) i kwasie octowym (4 mL) umieszczono w aparacie Parra i uwodorniano przez trzy godziny pod ciśnieniem 35 psi (241 kPa) w obecności 10% palladu na węglu (300 mg). Katalizator odsączono i przesą cz zatężono, otrzymują c bezbarwny olej (1,26 g). NMR δ ppm (CDCl3): 4,1 i 4,2 (t, 1H, rotamery, 3,4 (d, 1H), 3,2 (d, 1H), 2,1 (m, 1H), 1,9 (m, 1H), 1,6-1,7 (m, 10H), 1,5 (3 s, 18H, rotamery).

Etap 6. Synteza kwasu Fmoc-Pro(4-spirocyklopentano)-karboksylowego:

Ester tert-butylowy (4-spirocyklopentano)-Boc-Pro (1,26 g, 3,9 mmol) potraktowano dichlorometanem (10 mL) i kwasem trifluorooctowym (15 mL) przez trzy godziny. Mieszaninę reakcyjną zatężono i otrzymany żó łty olej rozpuszczono w wodzie (6 mL). Dodano porcjami węglan fluorenylometylu sukcynylu (1,45 g, 4,3 mmol) rozpuszczony w dioksanie (6 mL), a następnie dodano węglan potasu (2,16 g, 15,6 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 18 godzin i zatężono. Uzyskaną pozostałość rozcieńczono nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (10 mL) i przemyto eterem dietylowym (3 x 10 mL). Następnie warstwę wodną zakwaszono do pH ~1 przy użyciu 1 N roztworu wodosiarczanu sodu i ekstrahowano octanem etylu. Warstwę organiczną osuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono, otrzymując beżową pianę (1,3 g, 100%).

PL 206 255 B1

201

P r z y k ł a d VI. Synteza Boc-Pro(4t-NH(Fmoc))-OH:

ο ο

Ν °Α

ο ο

Etap 1. Synteza estru benzylowego N^a-tert-butoksykarbonylo-cis-4-chloro-L-proliny: Cl

o o

Mieszaninę dostępnej w handlu N-tert-butoksykarbonylo-trans-4-hydroksyproliny (8,79 g, 38 mmol), węglanu potasu (13,0 g, 94 mmol), bromku benzylu (4,5 mL, 38 mmol) i dimetyloformamidu (150 mL) mieszano przez 18 h. Po dodaniu octanu etylu (100 mL) mieszaninę przesączono. Biały mętny przesącz sklarowano przez dodanie 1 M HCl (100 mL). Warstwy rozdzielono i warstwę wodną ekstrahowano dodatkowym octanem etylu (2 x 100 mL). Połączone warstwy organiczne przemyto wodą (2 x 50 mL), osuszono (siarczan sodu), przesączono i zatężono. Do surowego estru benzylowego dodano toluen, i roztwór przesączono i zatężono ponownie. Dodano dichlorometan (70 mL) i tetrachlorek węgla (70 mL), a następnie trifenylofosfinę (21,11 g, 80 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 10 h, reakcję zatrzymano etanolem (7 mL) i mieszano przez 5 godzin więcej. Roztwór zatężono do około 100 mL, następnie dodano dichlorometan (40 mL), a następnie mieszając dodano eter (200 mL). Roztwór chłodzono przez 4 h, przesączono i zatężono, otrzymując żółtobrunatny olej, który oczyszczono metodą chromatografii błyskawicznej przy użyciu 2:2:1 eteru/heksanu/dichlorometanu, otrzymując związek tytułowy (9,13 g, 26,9 mmol, 71%) jako białą substancję stałą.

Etap 2. Synteza estru benzylowego N^a-tert-butoksykarbonylo-trans-4-azydo-L-proliny:

Roztwór estru benzylowego N^a-tert-butoksykarbonylo-cis-4-chloro-L-proliny (9,0 g, 26,5 mmol) i azydku sodu (7,36 g, 113 mmol) w dimetyloformamidzie (270 mL) ogrzewano w temperaturze 75°C przez 2 dni. Dodano wodę (100 mL) i mieszaninę reakcyjną ekstrahowano octanem etylu (3 x 100 mL). Połączone warstwy organiczne przemyto wodą (3 x 50 mL), osuszono (siarczan sodu), przesączono i zatężono. Olej oczyszczono metodą chromatografii błyskawicznej przy użyciu 1:1 octanu etylu/heksanu, otrzymując związek tytułowy (8,59 g, 24,8 mmol, 94%).

202

PL 206 255 B1

Etap 3. Synteza Boc-Pro(4t-NH(Fmoc))-OH:

Mieszaninę estru benzylowego N^a-tert-butoksykarbonylo-trans-4-azydo-L-proliny (8,59 g, 24,8 mmol) i 10% palladu na węglu (900 mg) w etanolu (500 mL) uwodorniano pod ciśnieniem 50 psi (345 kPa) przez 14 h przy użyciu aparatu Parra do wodorowania. Mieszaninę przesączono, zatężono, rozpuszczono w metanolu (60 mL), ponownie przesączono i zatężono, otrzymując bezbarwny olej. Olej rozpuszczono w wodzie (53 mL) zawierającej węglan sodu (5,31 g, 50,1 mmol) i w ciągu 40 min dodano roztwór węglanu fluorenylometylu sukcynylu (8,37 g, 29,8 mmol) w dioksanie (60 mL). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 17 h, po czym zatężono w celu usunięcia dioksanu i rozcieńczono wodą (200 mL). Roztwór przemyto eterem (3 x 100 mL). pH roztworu wodnego doprowadzono do 2 przez dodanie kwasu cytrynowego (ostrożnie: pienienie!) i wody (100 mL). Mieszaninę ekstrahowano dichlorometanem (400 mL, 100 mL, 100 mL) i połączone warstwy organiczne osuszono (siarczan sodu), przesączono i zatężono, otrzymując związek tytułowy.

P r z y k ł a d VII. Synteza N-tert-butoksykarbonylo-4-trans-(N-fluorenylometyloksykarbonyloaminometylo)-L-proliny (Boc-Pro(4t-MeNHFmoc)-OH):

Etap 1. Synteza estru benzylowego tert-butoksykarbonylo-cis-4-hydroksy-L-proliny (Boc-Pro(4-cis-OH)-OBn):

Do mieszaniny cis-hydroksy-L-proliny (5 g, 38,1 mmol) w benzenie (45 mL) i alkoholu benzylowego (45 mL) dodano monohydrat kwasu p-toluenosulfonowego (7,6 g, 40,0 mmol). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze 125°C przez 20 h, usuwając wodę (2 mL) przy użyciu urządzenia Deana-Starka. Roztwór przesączono jeszcze gorący, a następnie dodano eter (150 mL). Roztwór zostawiono do ostygnięcia przez trzy godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przez trzy godziny w temperaturze 4°C. Otrzymaną substancję stałą zebrano, przemyto eterem (100 mL) i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem przez 1 godzinę, otrzymując 13,5 grama białej substancji stałej. Substancję stałą rozpuszczono w dioksanie (40 mL) i diizopropyloetyloaminie (7,6 mL), a następnie w ciągu 5 minut dodano diwęglan di-tert-butylu (10 g, 45,8 mmol), stosując łaźnię lodową do utrzymania stałej temperatury reakcji. Po 10 godzinach w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną wylano do zimnej wody (200 mL) i ekstrahowano octanem etylu (3 x 200 mL). Połączone warstwy organiczne przemyto wodą (3 x 100 mL)

PL 206 255 B1

203 i nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu (50 mL), osuszono (siarczan sodu), przesączono i zatężono. Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii błyskawicznej przy użyciu 40-60% octanu etylu w heksanie, otrzymując związek tytułowy (10,04 g, 31,24 mmol, 82%).

Etap 2. Synteza estru benzylowego N-tert-butoksykarbonylo-cis-4-mezyloksy-L-proliny (BocPro(4-cis-OMs)-OBn):

Do roztworu Boc-Pro(4-cis-OH)-OBn (8,45 g, 26,3 mmol) w pirydynie (65 mL) w temperaturze 0°C, w ciągu 7 min dodano kroplami chlorek metanosulfonylu (3,4 mL, 44 mmol). Mieszaninę reakcyjną zostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej przez 2 h, po czym mieszano przez noc. Roztwór 10% wody w pirydynie (20 mL) dodano w ciągu 15 min i zatężono mieszaninę reakcyjną. Pozostałość rozpuszczono w wodzie i ekstrahowano octanem etylu (2 x 200 mL). Połączone warstwy organiczne przemyto wodą (2 x 50 mL), nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (50 mL) i nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu (50 mL), osuszono (siarczan sodu), przesączono i zatężono. Otrzymaną pozostałość rozpuszczono w toluenie (100 mL) i zatężono w celu usunięcia śladów pirydyny. Pozostałość osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem przez 30 min, otrzymując związek tytułowy (10,7 g, 102%), który następnie zastosowano w następnym etapie bez oczyszczania.

Etap 3. Ester benzylowy N-tert-butoksykarbonylo-trans-4R-cyjano-L-proliny (Boc-Pro(4-transCN)-OBn):

Roztwór Boc-Pro(4-cis-OMs)-OBn (10,7 g, 26,3 mmol) i cyjanku tetrabutyloamoniowego (15,0 g, 56 mmol) w dimetyloformamidzie (100 mL) ogrzewano na łaźni olejowej w temperaturze 55°C przez 28 h. Po ochłodzeniu dodano wodę (150 mL) i mieszaninę ekstrahowano octanem etylu (3 x 200 mL). Połączone warstwy organiczne przemyto wodą (3 x 100 mL) i nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu (100 mL), osuszono (siarczan sodu), przesączono i zatężono. Otrzymaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii błyskawicznej (1:1 eter/heksan), a następnie rekrystalizowano z octanu etylu/heksanu, otrzymując związek tytułowy (2,40 g, 7,26 mmol, 28%).

Etap 4. N-tert-butoksykarbonylo-4-trans-(N-fluorenylometyloksykarbonyloaminometylo)-L-prolina (Boc-Pro(4t-MeNHFmoc)-OH):

204

PL 206 255 B1

Mieszaninę związku z Etapu 3 powyżej (2,31 g, 7 mmol), wody (10 mL), metanolu (85 mL) i 10% palladu na wę glu (700 mg) uwodorniano pod ciśnieniem 50 psi (345 kPa) przez 11 h przy uż yciu aparatu Parra do wodorowania. Mieszaninę przesączono i zatężono. Do pozostałości dodano wodę (15 mL) i węglan sodu (1,5 g, 14,2 mmol). W ciągu 5 min dodano roztwór węglanu fluorenylometylu sukcynylu (2,36 g, 7,0 mmol) w dioksanie (17 mL) i mieszanie kontynuowano przez 28 h w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości 15 mL, i dodano wod ę (100 mL). Roztwór przemyto eterem (3 x 75 mL). pH roztworu wodnego doprowadzono do 2 przez dodanie kwasu cytrynowego (około 20 g, ostrożnie: pienienie!) i wody (100 mL). Mieszaninę ekstrahowano dichlorometanem (4 x 100 mL), i połączone warstwy organiczne osuszono (siarczan sodu), przesączono i zatężono. Surowy produkt zawierał główne zanieczyszczenie, które wymagało oczyszczania trój etapowego. Surowy produkt rozpuszczono w dichlorometanie (50 mL) i kwasie trifluorooctowym (50 mL) i mieszano przez 5 h przed zatężeniem. Pozostałość oczyszczono metodą preparatywnej HPLC z odwróconymi fazami. Czystą sól trifluorooctanową 4-(N-fluorenylometyloksykarbonyloaminometylo)proliny (1,887 g, 3,93 mmol) rozpuszczono w dioksanie (10 mL), acetonitrylu (20 mL) i diizopropyloetyloaminie (1,4 mL, 8 mmol). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór diwęglanu di-tert-butylu (1,1 g, 5 mmol) w dioksanie (5 mL). Po 18 godzinach mieszania, pH roztworu doprowadzono do 2 przez dodanie kwasu cytrynowego (ostrożnie: pienienie!) i wody (100 mL). Mieszaninę ekstrahowano octanem etylu (3 x 150 mL) i połączone warstwy organiczne przemyto nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu (100 mL), osuszono (siarczan sodu), przesączono i zatężono. Surowy produkt rozpuszczono w nasyconym wodnym roztworze wodorowęglanu sodu (100 mL) i przemyto eterem (3 x 75 mL). Warstwę wodną doprowadzono do pH 3 przez dodanie kwasu cytrynowego, po czym ekstrahowano dichlorometanem (4 x 100 mL). Połączone warstwy organiczne osuszono (siarczan sodu), przesączono i zatężono, otrzymując związek tytułowy (1,373 g, 2,94 mmol, 42%).

P r z y k ł a d VIII. Synteza 3,4-izopropylidenoprolinolu:

Etap 1. Reakcja cyklopropanowania (Tetrahedron Lett. 1993, 34 (16), 2691 i 2695):

Do mieszanego roztworu jodku izopropylotrifenylofosfoniowego (4,14 g, 9,58 mmol) w tetrahydrofuranie (60 mL) w temperaturze 0°C, dodano n-butylolit (1,6 M w heksanie, 5,64 mL, 9,02 mmol) w cią gu 5 min. Po up ł ywie 30 minut, w cią gu 10 minut dodano roztwór enamidu ((5R,7S)-5-fenylo5,6,7,7a-tetrahydro-6-oksapirolizyn-3-onu) (1,206 grama, 6,0 mmol) (synteza wyjściowego enamidu patrz J. Org. Chem. 1999, 64(2), 547) w tetrahydrofuranie (40 mL). Po upływie dodatkowych 10 minut usunięto łaźnię chłodzącą i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Mieszaninę reakcyjną wylano do wody (400 mL) i ekstrahowano eterem dietylowym (400 mL) i octanem etylu (2 x 400 mL). Połączone ekstrakty organiczne osuszono siarczanem sodu, przesączono i zatężono, otrzymując pożądany produkt surowy. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii błyskawicznej przy eluowaniu mieszaniną 3:5:2 octanu etylu/heksanu/chlorku metylenu, otrzymując czysty produkt cyklopropanowany (750 mg, 3,08 mmol, 51%).

PL 206 255 B1

205

Etap 2. Synteza 3,4-izopropylidenoprolinolu P[3,4-(diMecyklopropylo)]-alkohol) (J. Org. Chem. (1999) 64(2), 330):

Mieszaninę produktu otrzymanego w Etapie 1 powyżej (1,23 grama, 5,06 mmol) i glinowodorku litu (1,0 M w THF, 15 mL, 15 mmol) ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 5 godzin. Po ochłodzeniu do 0°C, pozostały glinowodorek ostrożnie rozłożono, dodając kroplami nasycony wodny roztwór siarczanu sodu (1,5 mL) w ciągu 15 min. Mieszaninę rozcieńczono octanem etylu (40 mL), a następnie przesączono przez celit. Przesącz osuszono siarczanem sodu, przesączono i zatężono, otrzymując surowy N-benzyloaminoalkohol (1,25 grama), który przeniesiono do następnego etapu bez dalszego oczyszczania. Roztwór surowego N-benzyloaminoalkoholu (1,25 grama, 5,06 mmol) w mieszaninie 1:1 kwasu octowego/octanu etylu (30 mL) z 10% Pd/C (1 gram) uwodorniano pod ciśnieniem 50 psi (345 kPa) przez 16 godzin przy użyciu aparatu Parra do wodorowania. Mieszaninę reakcyjną przesączono w celu usunięcia katalizatora na węglu i przesącz zatężono. Pozostałość rozpuszczono w wodzie (30 mL) i pH doprowadzono do 13 przy użyciu 50% NaOH. Mieszaninę ekstrahowano eterem (3 x 60 mL). Połączone ekstrakty osuszono siarczanem sodu, przesączono i zatężono, otrzymując surowy aminoalkohol (485 mg, 3,43 mmol). Ten materiał wzięto do następnego etapu bez dalszego oczyszczania.

P r z y k ł a d IX. Synteza kwasu iBoc-G(Chx)-Pro(3,4-izopropylideno)-karboksylowego:

Etap 1. Synteza izobutyloksykarbonylo-cykloheksyloglicyny (iBoc-G(Chx)-OH):

Do roztworu dostępnego w handlu chlorowodorku cykloheksyloglicyny (15 g, 77,4 mmol) w acetonitrylu (320 mL) i wodzie (320 mL) dodano węglan potasu. Do klarownego roztworu w ciągu 15 minut dodano chloromrówczan izobutylu (11,1 mL, 85,1 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 17 godzin. Acetonitryl usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałą warstwę wodną ekstrahowano dwukrotnie eterem (100 mL). Następnie warstwę wodną zakwaszono do pH 1 stosując 6 N

206

PL 206 255 B1 kwas solny i ekstrahowano dichlorometanem (3 x 300 mL). Warstwę organiczną osuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono, otrzymując 18,64 g (94%) produktu jako białą substancję stałą.

Etap 2. Synteza izobutyloksykarbonylo-cykloheksyloglicylo-3,4-izopropylidenoproliny (iBocG(Chx)-P[3,4-(diMe-cyklopropylo)]-OH):

a) Etap sprzęgania

Do roztworu iBoc-G(Chx)-OH (890 mg, 3,45 mmol) w acetonitrylu (20 mL) dodano HATU (1,33 g, 3,5 mmol), HOAt (476 mg, 3,5 grama), a następnie diizopropyloetyloaminę (2,5 mL, 14 mmol). Po 2 minutach dodano 3,4-izopropylidenoprolinol (485 mg, 3,43 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc. Po dodaniu nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu sodu mieszaninę ekstrahowano eterem i octanem etylu. Połączone warstwy organiczne osuszono, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii błyskawicznej przy eluowaniu mieszaniną 1:1 octanu etylu/heksanu, otrzymując czysty alkohol dipeptydowy iBoc-G(Chx)-3,4-izopropylidenoprolinol (870 mg, 2,3 mmol, 67%)

b) Etap utleniania Jonesa

Do roztworu alkoholu dipeptydowego iBoc-G(Chx)-3,4-izopropylidenoprolinolu (100 mg, 0,26 mmol) w acetonie (2 mL) mieszanego w temperaturze 0°C w ciągu 5 min dodano kroplami reagent Jonesa (300 gL). [Reagent Jonesa: Wytworzono z tritlenku chromu (13,4 g) i stężonego kwasu siarkowego (11,5 mL) rozcieńczonego wodą do objętości całkowitej 50 mL]. Po 3 godzinach mieszania w temperaturze 0°C, dodano izopropanol (500 mL) i mieszanie kontynuowano przez dodatkowe 10 minut. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono wodą (20 mL) i ekstrahowano octanem etylu (3 x 70 mL). Połączone warstwy organiczne osuszono, przesączono i zatężono, otrzymując dipeptyd iBoc-G (Chx)-3,4-izopropylidenoprolinę (100 mg, 0,25 mmol, 96%).

P r z y k ł a d X. Synteza N-Cbz-3,4-metanoproliny:

Etap 1. Synteza N-benzylo-3,4-metanoprolinolu:

Mieszaninę benzylidenowego materiału wyjściowego (J. Org. Chem. 1999, 64(2), 547) (4,6 grama, 21,4 mmol) i glino-wodorku litu (1,0 M w THF, 64 mL, 64 mmol) ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 5 godzin. Po ochłodzeniu do 0°C, pozostały glinowodorek ostrożnie rozłożono, dodając kroplami nasycony wodny roztwór siarczanu sodu (5 mL) w ciągu 15 min. Mieszaninę rozcieńczono octaPL 206 255 B1

207 nem etylu (200 mL), a następnie przesączono przez celit. Przesącz osuszono siarczanem sodu, przesączono i zatężono, otrzymując surowy N-benzyloamino-alkohol (3,45 grama), który przeniesiono do następnego etapu bez dalszego oczyszczania.

Etap 2. Synteza N-benzyloksykarbonylo-3,4-metanoprolinolu (Cbz-P(3,4-CH2)-ol):

Roztwór surowego N-benzyloaminoalkoholu (3 gramy, 14,76 mmol) w metanolu (120 mL) i stężonym HCl (1,5 mL) z 10% Pd/C (300 mg) uwodorniano pod ciśnieniem 50 psi (345 kPa) przez 16 godzin. Mieszaninę reakcyjną przesączono w celu usunięcia katalizatora na węglu i przesącz zatężono. Pozostałość rozpuszczono w wodzie/dioksanie (100 mL) i dodano diizopropyloetyloaminę (3,2 mL). Dodano chloromrówczan benzylu (2,76 mL, 16,2 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc. Mieszaninę reakcyjną zatężono, rozpuszczono w 1 M HCl (100 mL) i ekstrahowano octanem etylu (3 x 200 mL). Połączone warstwy organiczne osuszono siarczanem magnezu, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii błyskawicznej przy użyciu mieszaniny 1:3 octan etylu/heksan, otrzymując N-Cbz-3,4-metanoprolinol (2,4 g).

Etap 3. Synteza N-benzyloksykarbonylo-3,4-metanoproliny (Cbz-P(3,4-CH2)-OH):

Do roztworu N-Cbz-3,4-metanoprolinolu (2,2 g, 8,90 mmol) w acetonie (68 mL) mieszanego w temperaturze 0°C, dodano kroplami reagent Jonesa (6,6 mL) w ciągu 5 min. [Reagent Jonesa: Wytworzono z tritlenku chromu (13,4 g) i stężonego kwasu siarkowego (11,5 mL) rozcieńczonego wodą do objętości całkowitej wynoszącej 50 mL]. Po 3 godzinach mieszania w temperaturze 0°C dodano izopropanol (11 mL) i kontynuowano mieszanie przez dodatkowe 10 minut. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono wodą (400 mL) i ekstrahowano octanem etylu (3 x 500 mL). Połączone warstwy organiczne osuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i zatężono, otrzymując N-Cbz-3,4-metanoprolinę (2,25 g, 96%).

P r z y k ł a d XI. Synteza Boc-(6S-karboetoksymetano)proliny:

Syntezę związku tytułowego przeprowadzono zgodnie z opublikowaną procedurą: Marinozzi, M.; Nataini, B.; Ni, M. H.; Costantino, G.; Pellicciari R. IL Farmaco (1995) 50 (5), 327-331.

208

PL 206 255 B1

P r z y k ł a d XII. Synteza kwasu Boc-3-morfolinokarboksylowego:

Syntezę związku tytułowego przeprowadzono zgodnie z opublikowaną procedurą: Kogami Y., Okawa, K. Bull. Chem. Soc. Jpn. (1987) 60, 2963-2965.

P r z y k ł a d XIII. Synteza N-tert-butoksykarbonylo-2-aza-3S-hydroksykarbonylo-[2,2,2]-bicyklooktanu:

Roztwór surowego 2-aza-2-(1-fenyloetylo)-3S-metoksykarbonylo-[2,2,2]-bicyklookt-5-enu (10 mmol) (Tetrahedron (1992) 48(44) 9707-9718) i 10% Pd na węglu (1 g) w metanolu (30 mL) zakwaszono przy użyciu 12 N HCl, po czym uwodorniano pod ciśnieniem 50 psi (345 kPa) przez 16 godzin przy użyciu aparatu Parra do wodorowania. Mieszaninę reakcyjną przesączono w celu usunięcia katalizatora na węglu i przesącz zatężono. Pozostałość rozpuszczono w stężonym HCl i mieszano przez noc. Roztwór zatężono i ponownie rozpuszczono w acetonitrylu (50 mL). Dodano diizopropyloetyloaminę (3,5 mL) i di-węglan di-tert-butylu (1 g). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 24 godziny, a następnie zatężono. Pozostałość rozpuszczono w CH2CI2 i 5% wodnym kwasie siarkowym. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano przy użyciu CH2CI2 i połączone warstwy organiczne zatężono. Pozostałość rozpuszczono w 10% nasyconym roztworze wodorowęglanu sodu, przemyto eterem dietylowym (2x) i zakwaszono przy użyciu 5% wodnego kwasu siarkowego. Warstwę wodną ekstrahowano octanem etylu (2x). Połączone warstwy octanu etylu osuszono, przesączono i zatężono, otrzymując N-tert-butoksykarbonylo-2-aza-3S-hydroksykarbonylo-[2,2,2]-bicyklooktan (650 mg).

P r z y k ł a d XIV. Synteza izobutyloksykarbonylo-cykloheksylo-glicylo-4,4-dimetyloproliny (iBoc-G(Chx)-P(4,4-dimetylo)-OH):

Etap 1. Synteza iBoc-G(Chx)-P(4,4-dimetylo)-OMe

Do roztworu iB oc-G(Chx)-OH (Przykład IX, Etap 1.) (377 mg, 1,95 mmol) w acetonitrylu (7 mL) dodano kolejno HCl'HNPro(4,4-dimetylo)-OMe (Przykład I, Etap 6) (377 mg, 1,95 mmol), N-hydroPL 206 255 B1

209 ksybenzotriazol (239 mg, 1,75 mmol), TBTU (845 mg, 2,63 mmol) i diizopropyloetyloaminę (1,35 mL, 7,8 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Mieszaninę reakcyjną zatężono i uzyskaną pozostałość rozpuszczono w octanie etylu. Warstwę organiczną przemyto dwukrotnie porcjami po 10 mL nasyconego roztworu wodoroweglanu sodu, 1 N kwasem solnym, i solanką . Warstwę organiczną osuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono, otrzymując białą substancję stałą (612 mg, 79%).

Etap 2. Synteza iBoc-G(Chx)-P(4,4-dimetylo)-OH:

Ester metylowy otrzymano w Etapie 1 powyżej (612 mg, 1,54 mmol) w metanolu (6 mL) zmydlono w obecności 2 M wodorotlenku litu (1,16 mL) przez trzy godziny. Metanol usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskaną pozostałość rozcieńczono octanem etylu i zakwaszono do pH 2 1 N kwasem solnym. Warstwy rozdzielono i warstwę organiczną przemyto wodą i solanką, osuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono.

P r z y k ł a d XV. Synteza dimetyloamidu L-fenyloglicyny

Etap 1. Synteza dimetyloamidu N-benzyloksykarbonylo-L-fenyloglicyny (Cbz-Phg-NMe2):

N-Benzyloksykarbonylo-L-fenyloglicynę (25 g, 88 mmol) rozpuszczono w THF (800 mL) i ochłodzono do -10°C. Dodano N-metylomorfolinę (9,7 mL, 88 mmol) i chloromrówczan izobutylu (11,4 mL, 88,0 mmol) i mieszaninę mieszano przez 1 minutę. Dodano dimetyloaminę (100 mL, 2 M w THF) i reakcję zostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej. Mieszaninę przesą czono i przesą cz zatę żono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując dimetyloamid N-benzyloksykarbonylo-L-fenyloglicyny (32,5 g) jako żółty olej.

Etap 2. Synteza dimetyloamidu L-fenyloglicyny (H-Pha-NMe2):

Otrzymany wyżej dimetyloamid N-benzyloksykarbonylo-L-fenyloglicyny (32,5 g) rozpuszczono w metanolu (750 mL) i dodano 10% palladu na węglu aktywnym (3,3 g). Tę mieszaninę uwodorniano

210

PL 206 255 B1 na aparacie Parra pod ciśnieniem 35 psi (241 kPa) atom wodoru przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną przesączono i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rekrystalizowano z metanolu-heksanu, otrzymując dimetyloamid fenyloglicyny (26 g) jako białawą substancję stałą. Nadmiar enancjomeryczny tego produktu wyznaczono na >99% metodą analizy HPLC pochodnej tioizocyjanianu 2,3,4,6-tetra-O-acetyloglukopiranozylu.

P r z y k ł a d XVI. Synteza (1-metylocykloheksylo)glicyny:

Etap 1. 1-Metylo-1-hydroksymetylocykloheksan

Do roztworu 1-metylo-1-hydroksykarbonylo-cykloheksanu (10 g, 70 mmol) w tetrahydrofuranie (300 mL) w temperaturze 0°C dodano 1 M diboran w tetrahydrofuranie (200 mL, 200 mmol) w ciągu 90 minut. Usunięto łaźnię chłodzącą i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez dwa dni. Pozostały boran rozłożono przez powolne dodawanie nasyconego roztworu wodosiarczanu sodu (10 mL) w ciągu 90 min przy chłodzeniu. Dodano dodatkowy nasycony roztwór wodosiarczanu sodu (200 mL) i po 20 min mieszania usunięto warstwę wodną. Warstwę organiczną przemyto wodą i nasyconym roztworem chlorku sodu, osuszono, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii błyskawicznej przy użyciu 20% eteru dietylowego w heksanie, otrzymując 1-metylo-1-hydroksymetylocykloheksan (6,17 g, 48 mmol, 69%).

Etap 2. 1-metylocykloheksylokarboksaldehyd:

Do roztworu 1-metylo-1-hydroksymetylocykloheksanu (6,17 g, 48 mmol) i trietyloaminy (20,1 mL, 144 mmol) w dichlorometanie (150 mL) w temperaturze 0°C, dodano roztwór kompleksu pirydyna-tritlenek siarki (22,9 g, 144 mmol) w dimetylosulfotlenku (150 mL) w ciągu 15 min. Łaźnię chłodzącą zostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej przez dwie godziny, po czym mieszaninę reakcyjną wylano do solanki z lodem (400 mL). Warstwy rozdzielono i warstwę wodną ekstrahowano dichlorometanem (200 mL). Połączone warstwy organiczne rozcieńczono heksanem (600 mL) i przemyto przy użyciu 1 M HCl (2 x 150 mL), nasyconego roztworu chlorku sodu (2 x 100 mL), osuszono, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii błyskawicznej, otrzymując 1-metylocykloheksylokarboksaldehyd (1,77 g, 13,8 mmol, 29%).

PL 206 255 B1

211

Etap 3. Synteza N-formylo-N-glikozylo-1-metylocykloheksylo-tert-butyloamidu:

Syntezę 2,3,4-tri-O-piwaloilo-a-D-arabinozyloaminy przeprowadzono zgodnie z opublikowaną procedurą (Kunz, H.; Pfrengle, W.; Ruck, K.; Wilfried, S. Synthesis (1991) 1039-1042).

Do roztworu 1-metylocykloheksylokarboksaldehydu (1,17 g, 8,34 mmol), 2,3,4-tri-O-piwaloilo-a-D-arabinozyloaminy (8,3 g, 20,7 mmol), kwasu mrówkowego (850 μ(, 22,2 mmol) i izocyjanku tert-butylu (2,4 mL, 21,2 mmol) w tetrahydrofuranie (170 mL) w temperaturze -30°C dodano 0,5 M roztwór chlorku cynku w tetrahydrofuranie (41 mL, 20,57 mmol). Roztwór mieszano w temperaturze -20°C przez 3 dni, po czym zatężono. Pozostałość rozcieńczono CH2CI2 (500 mL), przemyto nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (2 x 500 mL), wodą (500 mL). Warstwę organiczną osuszono, przesączono i zatężono, otrzymując klarowny olej. Chromatografia błyskawiczna (20% octanu etylu w heksanie) dała czysty produkt (4,3 g, 6,6 mmol, 33%).

Etap 4. Synteza (1-metylocykloheksylo)glicyny:

Roztwór produktu otrzymanego w Etapie 3 powyżej (4,3 g, 6,6 mmol) w dichlorometanie (30 mL) i nasyconym bezwodnym roztworze metanolowym HCl (30 mL) mieszano przez noc. Roztwór zatężono i pozostałość rozpuszczono w wodzie (100 mL) i przemyto pentanem (2 x 100 mL). Warstwę wodną zatężono i pozostałość rozpuszczono w 6 N HCl (50 mL) i ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 30 godzin. Roztwór zatężono, otrzymując surowy chlorowodorek (1-metylocykloheksylo)glicyny (790 mg, 3,82 mmol, 58%).

P r z y k ł a d XVII. Synteza (4,4-dimetylocykloheksylo)glicyny:

Etap 1. Synteza 4,4-dimetylocykloheksanonu:

212

PL 206 255 B1

Mieszaninę 4,4-dimetylocykloheks-2-en-1-onu (12 mL, 91,2 mmol) i katalizatora typu Degussa 10% Pd na węglu (2 g) uwodorniano pod ciśnieniem 40 psi (276 kPa) przez 18 godzin.

Mieszaninę przesączono i zatężono (¹H NMR wykazał mieszaninę ketonu i alkoholu w proporcji 5:3). Mieszaninę rozpuszczono w acetonie (400 mL) i ochłodzono do 0°C. Reagent Jonesa (40 mL) dodano w ciągu 30 min i usunięto łaźnię chłodzącą. Po 2 dniach odparowano nadmiar acetonu i otrzymaną pozostałość rozpuszczono w wodzie i eterze dietylowym. Warstwę eterową przemywano wodą, aż stała się bezbarwna, osuszono, przesączono i zatężono, otrzymując 4,4-dimetylocykloheksanon (7,4 g, 58,6 mmol, 64%).

Etap 2: Synteza eteru metylowego enolu 4,4-dimetylocykloheksylokarboksaldehydu:

Do roztworu chlorku metoksymetylotrifenylofosfoniowego (8,6 g) w tetrahydrofuranie (125 mL) w temperaturze 0°C dodano n-butylolit (1,6 M w heksanie, 14,3 mL) w cią gu 10 min. Po upł ywie 30 minut mieszaninę reakcyjną ochłodzono do -78°C i w ciągu 20 minut dodano roztwór 4,4-dimetylocykloheksanonu (2,45 g, 19,1 mmol) w tetrahydrofuranie (50 mL). Po upływie 1 godziny łaźnię chłodzącą usunięto i reakcję ogrzano powoli do 0°C. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono nasyconym roztworem chlorku amonu (50 mL), octanem etylu (100 mL) i heksanem (100 mL). Warstwę organiczną przemyto wodą i solanką, osuszono, przesączono i zatężono. Pozostałość mieszano z heksanem (70 mL) przez 10 min i przesączono. Przesącz zatężono i poddano chromatografii przy użyciu 25% octanu etylu w heksanie, otrzymując związek tytułowy (1,925 g, 12,5 mmol, 65%).

Etap 3: 4,4-Dimetylocykloheksylokarboksyaldehyd:

Roztwór eteru metylowego enolu 4,4-dimetylocykloheksylokarboksyldehydu (1,925 g, 12,5 mmol) (Etap II powyżej), tetrahydrofuranu (100 mL) i 6 M HCl (20 mL) mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono heksanem, eterem dietylowym, solanką i wodą. Warstwę organiczną osuszono, przesączono i zatężono, otrzymując 4,4-dimetylocykloheksylokarboksyaldehyd (1,0 g, 7,1 mmol, 57%).

Etap 4. Synteza N-formylo-N-glikozylo-4,4-dimetylocykloheksylo-tert-butylamidu:

PL 206 255 B1

213

Do roztworu 4,4-dimetylocykloheksylokarboksyaldehydu (1,17 g, 8,34 mmol), 2,3,4-tri-O-piwaloilo-a-D-arabinozylo-aminy (3,43 g, 8,55 mmol), kwasu mrówkowego (350 gL, 9,17 mmol) i izocyjanku tert-butylu (990 gL, 8,76 mmol) w THF (70 mL) w temperaturze -30°C dodano 0,5 M roztwór chlorku cynku w tetrahydrofuranie (17 mL, 8,5 mmol). Roztwór mieszano w temperaturze -20°C przez 2 dni, po czym zatężono. Pozostałość rozcieńczono dichlorometanem (200 mL), przemyto nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (2 x 200 mL), wodą (200 mL). Warstwę organiczną osuszono, przesączono i zatężono, otrzymując klarowny olej. Chromatografia błyskawiczna (20% octanu etylu w heksanie) dała czysty produkt (2,1 g, 3,3 mmol, 39%).

Etap 5. Synteza (4,4-dimetylocykloheksylo)glicyny:

Roztwór produktu Ugi otrzymanego w Etapie 4 powyżej (2,1 g, 3,3 mmol) w dichlorometanie (20 mL) i nasyconym bezwodnym metanolowym roztworze HCl (20 mL) mieszano przez noc. Roztwór zatężono i pozostałość rozpuszczono w wodzie (100 mL) i przemyto pentanem (2 x 100 mL). Warstwę wodną zatężono i pozostałość rozpuszczono w 6 N HCl (40 mL) i ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 30 godzin. Roztwór zatężono, otrzymując surowy chlorowodorek (1-metylocykloheksylo)glicyny (300 mg, 1,36 mmol, 41%).

P r z y k ł a d XVIII. Synteza Boc-nVal-(CHOH)-Gly-OH:

Etap 1. Wytwarzanie Boc-norwalinolu:

Do roztworu Boc-norwaliny (25,0 g, 0,115 mol) w tetrahydrofuranie (461 mL) ochłodzonego do 0°C dodano kroplami kompleks boran/tetrahydrofuran (461 mL 1,0 M roztworu w tetrahydrofuranie). Po 1 h w temperaturze 0°C, roztwór ogrzano do temperatury pokojowej w ciągu 1,5 h. TLC wykazała, że reakcja była zakończona. Dodano metanol w celu zatrzymania reakcji. Roztwór zatężono, otrzymując związek tytułowy (22,56 g, 96%) jako pienisty syrop. TLC produktów wykazała zadowalającą czystość. Rf = 0,34 (40% octanu etylu/heksanu).

Etap 2. Wytwarzanie Boc-norwalinalu:

Do Boc-norwalinolu (7,77 g, 38 mmol), w bezwodnym dimetylosulfotlenku (153 mL) i toluenie (153 mL) dodano EDC (73,32 g, 382 mmol). Po ochłodzeniu roztworu do 0°C dodano kroplami kwas

214

PL 206 255 B1 dichlorooctowy (15,8 mL, 191 mmol). Po zakończeniu dodawania, mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 min. Roztwór zostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej przez okres 2 h. Mieszaninę reakcyjną zatężono w celu usunięcia toluenu, po czym rozpuszczono w octanie etylu. Roztwór przemyto kolejno 1 N roztworem wodosiarczanu sodu, nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu i solanką, osuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono, otrzymując surowy Boc-norwalinal, którego zastosowano bezpośrednio w następnym etapie. TLC Rf = 0,84 (40% octanu etylu/heksanu).

Etap 3. Synteza Boc-nVal-(CHOH)-Gly-OEt

Do roztworu surowego Boc-norwalinalu (4,18 g, 20,77 mmol) w dichlorometanie (83 mL) dodano izocyjanooctan etylu (2,72 mL, 24,93 mmol) i pirydynę (6,72 mL, 83,09 mmol). Po ochłodzeniu roztworu do 0°C dodano kroplami kwas trifluorooctowy (4,15 mL, 41,54 mmol). Po 1 godzinie mieszania, roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 18 godzin pozwalając na parowanie rozpuszczalnika z mieszaniny reakcyjnej w naczyniu bez zamknięcia w warunkach otoczenia. Mieszaninę reakcyjną zatężono, po czym rozpuszczono w octanie etylu. Roztwór przemyto kolejno 1 N roztworem wodosiarczanu sodu, nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu i solanką, osuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a następnie zatężono. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii błyskawicznej przy eluowaniu 20% do 40% octanu etylu/heksanu, otrzymując 2,8 g związku tytułowego jako żółty syrop. Niskorozdzielcza spektroskopia masowa potwierdziła obecność pożądanego produktu (MH⁺ 333).

Etap 4. Synteza Boc-nVal-(CHOH)-Gly-OH:

Otrzymany produkt (Boc-nVal-(CHOH)-Gly-OEt) (1,52 g, 4,70 mmol) rozpuszczony w etanolu (23 mL) zmydlono przy użyciu 1 N wodorotlenku litu (18,81 mL) przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną zakwaszono do pH 2 przy użyciu żywicy jonowymiennej Dowex® 50 WX8, mieszano przez 20 minut, a następnie przesączono. Żywicę przemyto starannie etanolem i wodą , i połączone przesą cze zatężono, otrzymują c białą pianę (0,48 g, 33%).

P r z y k ł a d XIX. Synteza (2R,3S,4S,5S)-N-Cbz-3-amino-2-hydroksy-4,5-metyleno-heksanianu tert-butylu:

Etap 1:

Do roztworu dietylofosfonooctanu tert-butylu (4,7 mL, 20 mmol) rozpuszczonego w THF (50 mL) w temperaturze -78°C dodano 1,6 M n-butylolit w heksanie (12,4 mL). Po 30 minutach w ciągu 10 minut

PL 206 255 B1

215 dodano (1S,2S)-2-metylocyklopropylokarboksyaldehyd (1 g, 12 mmol) (Barrett, A. G. M.; Doubleday, W. W.; Kasdorf, K.; Tustin, G. J., J. Org. Chem. (1996) 61, 3280) w eterze dietylowym (100 mL). Reakcję ogrzewano do 0°C przez 2 godziny i do 6°C przez 12 godzin. Reakcję zatrzymano nasyconym roztworem chlorku amonu (20 mL) i warstwę organiczną oddzielono, przemyto 50 mL solanki i osuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono, otrzymując 3,5 g klarownego oleju. Chromatografia błyskawiczna (20% octanu etylu w heksanie) dała czysty nienasycony ester tert-butylowy (1,4 g).

Etap 2:

Do roztworu karbaminianu benzylu (3,55 g, 23,5 mmol) w n-propanolu (24 mL) dodano roztwór wodorotlenku sodu (900 mg, 22,7 mmol) w wodzie (48 mL), a następnie podchlorynu tert-butylu (2,57 mL, 22,7 mmol). Po 15 minutach reakcję ochłodzono do 0°C i (DHQ)2PHAL (350 mg, 0,45 mmol) dodano w n-propanolu (24 mL), a następnie nienasycony ester tert-butylowy (1,4 g) z powyższego etapu w n-propanolu (48 mL). Na koniec dodano osmian potasu (110 mg, 0,30 mmol) w wodzie (2 mL) i roztwór bardzo gwałtownie uzyskał barwę ciemnozieloną, która utrzymywała się przez 4 godziny. Po upływie 6 godzin dodano nasycony siarczan sodu (50 mL) i mieszaninę ekstrahowano octanem etylu (2 x 50 mL). Połączone warstwy organiczne przemyto solanką (30 mL), osuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Chromatografia błyskawiczna przy użyciu 20% octanu etylu w heksanie dała pożądany ester tert-butylowy z grupą aminową zabezpieczoną grupą Cbz jako białą substancję stałą (316 mg).

Etap 3:

Mieszaninę estru tert-butylowego z grupą aminową zabezpieczoną grupą Cbz (316 mg, 0,9 mmol) i 32 mg 10% palladu na węglu w 9 mL metanolu uwodorniano przez 8 godzin. Mieszaninę przesączono i zatężono, otrzymując wolną aminę jako klarowny olej (195 mg).

P r z y k ł a d XX. Synteza chloromrówczanu IR, 2-dimetylopropylu:

Do dostępnego w handlu 2R-hydroksy-3-metylobutanu (410 mg, 4,65 mmol) dodano roztwór 20% fosgenu w toluenie (1 mL, 2 mmol). Roztwór mieszano przez 6 godzin w celu wytworzenia chloromrówczanu (2 mmol), który poddano reakcji wprost i bezpośrednio z pożądaną aminą. Taką samą procedurą zsyntetyzowano izomer S.

II) Reprezentatywna synteza inhibitorów HCV w fazie roztworu Przykład XXI. Synteza w fazie roztworu iBoc-G(Chx)-Pro(4,4-dimetylo)-Leu-(CO)-Gly-Phg-dimetyloamidu:

216

PL 206 255 B1

Etap 1. Synteza tert-butyloksykarbonylo-leucynalu (Boc-Leu-CHO):

Do roztworu dostępnego w handlu (Advanced Chem Tech) Boc-L-leucynalu (0,78 g, 3,6 mmol) w bezwodnym dichlorometanie (17,5 mL) dodano trietyloaminę (2 mL, 14,36 mmol) i mieszaninę ochłodzono do 0°C. Dodano dimetylosulfotlenek (17,5 mL), a następnie kompleks tritlenek siarkipirydyna (2,3 g, 14,36 mmol), i mieszaninę reakcyjną mieszano przez dwie godziny. TLC w 1:1 octanie etylu: heksanie potwierdziła zakończenie reakcji. Mieszaninę reakcyjną zatężono i uzyskaną pozostałość rozcieńczono octanem etylu. Warstwę octanu etylu przemyto 1 M kwasem solnym (2 x 75 mL), a następnie nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (2 x 75 mL) i solanką (75 mL). Warstwę organiczną osuszono (siarczan sodu), przesączono i zatężono, otrzymując 775 mg produktu.

Etap 2. Synteza estru etylowego Boc-2-hydroksy-3-amino-5-metyloheksanoilo-glicyny (Boc-Leu(CHOH)-Gly-OEt):

Do roztworu Boc-leucynalu (0,77 g, 3,59 mmol) w bezwodnym dichlorometanie (24 mL) dodano bezwodną pirydynę (1,16 mL, 14,36 mmol) i izocyjanooctan etylu (0,4 mL, 4,66 mmol). Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 0°C i w ciągu dwóch minut dodano kwas trifluorooctowy (0,55 mL, 7/18 mmol). Mieszaninę reakcyjną zakorkowano i mieszano w temperaturze 4°C przez cztery dni, i w temperaturze pokojowej przez jeden dzień . Mieszaninę reakcyjną rozcień czono dichlorometanem (350 mL) i przemyto dwukrotnie porcjami po 75 mL 1 M kwasu solnego, nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu, i solanki. Warstwę organiczną osuszono, przesączono i zatężono. Otrzymaną pozostałość poddano chromatografii błyskawicznej na kolumnie 2 x 6 z żelem krzemionkowym, stosując 10% octanu etylu w heksanie (800 mL), a następnie 1:1 octan etylu w heksanie (800 mL). Frakcje odpowiadające produktowi połączono i zatężono, otrzymując 980 mg (79%) produktu.

Etap 3. Synteza Boc-Leu-(CHOH)-Gly-OH:

Do roztworu Boc-Leu-(CHOH)-Gly-OEt (0,98 g, 2,83 mmol) w etanolu (11,3 mL) dodano 2 M wodorotlenek litu (4,25 mL) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez pięć godzin w temperaturze pokojowej. Etanol usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i warstwę wodną rozcieńczono octanem etylu. Warstwę organiczną przemyto 1 M kwasem solnym, a następnie solanką, osuszono, przesączono i zatężono, otrzymują c 775 mg (86%) produktu jako białą substancję stałą.

PL 206 255 B1

217

Etap 4. Synteza Boc-Leu-(CHOH)-Gly-Phg-dimetyloamidu:

Do roztworu Boc-Leu-(CHOH)-Gly-OH (0,37 g, 1,18 mmol) w acetonitrylu (23 mL) dodano kolejno dimetyloamid fenyloglicyny (otrzymany w Przykładzie XV, Etap 2), EDC (0,34 g, 1,76 mmol), N-hydroksybenzotriazol (HOBt)(0,18 g, 1,18 mmol) i diizopropyloetyloaminę (DIEA) (0,82 mL, 4,7 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 18 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną zatężono i uzyskaną pozostałość rozcieńczono octanem etylu i przemyto kolejno dwiema porcjami po 75 mL 1 M kwasu solnego, nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu i solanką. Następnie warstwę organiczną osuszono, przesączono i zatężono. Surowy produkt poddano chromatografii błyskawicznej na kolumnie 2 x 6 z żelem krzemionkowym przy użyciu 4:1 octanu etylu: heksanu (700 mL), a następnie octanu etylu (1000 mL) i 10% metanolu w dichlorometanie (600 mL). Frakcje odpowiadające produktowi połączono i zatężono, otrzymując 445 mg (80%) białej substancji stałej.

Etap 5. Synteza soli trifluorooctanowej H-Leu-(CHOH)-Gly-Phg-dimetyloamidu:

Do roztworu Boc-Leu-(CHOH)-Gly-Phg-dimetyloamidu (70 mg, 0,146 mmol) w dichlorometanie (1 mL) dodano kwas trifluorooctowy (1 mL) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną zatężono i wzięto do następnego etapu bez dalszego oczyszczania.

Etap 6. Synteza iBoc-G(Chx)-Pro(4,4-dimetylo)-Leu-(CHOH)-Gly-Phg-dimetyloamidu:

218

PL 206 255 B1

Do roztworu iBoc-G(Chx)-P(4,4-diMe)-OH (Przykład XIV, Etap 2) (53 mg, 0,14 8 mmol) w acetonitrylu (3 mL) dodano kolejno TFA'2HN-Leu(CHOH)-Gly-Phg-NMe₂ (61 mg, 0,148 mmol), N-hydroksybenzotriazol (HOBt) (23 mg, 0,148 mmol), TBTU (71,5 mg, 0,222 mmol i diizopropyloetyloaminę (103 gl, 0,593 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 18 godzin i zatężono. Uzyskaną pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i przemyto 1 M kwasem solnym (2x5 mL), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (2x5 mL), i solanką (2 x 5 mL). Warstwę organiczną osuszono, przesączono i zatężono. Produkt (100 mg) wzięto do następnego etapu bez dalszego oczyszczania.

Etap 7. Synteza iBoc-G(Chx)-Pro(4,4-dimetylo)-Leu-(CO)-Gly-Phg-dimetyloamidu:

Do roztworu iBoc-G(Chx)-Pro(4,4-dimetylo)-Leu-(CHOH)-Gly-Phg-dimetyloamidu (30 mg, 0,04 mmol) w dichlorometanie (1 mL) dodano dostępny w handlu odczynnik Dessa-Martina (Omega Chemical Company Inc.) (67,8 mg, 0,16 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Mieszaninę reakcyjną zatężono i uzyskaną pozostałość mieszano w 5% roztworze tiosiarczanu sodu. Następnie rozcieńczono ją dichlorometanem i warstwy rozdzielono. Warstwę organiczną przemyto roztworem tiosiarczanu sodu (4x3 mL), a następnie wodą i solanką. Warstwę organiczną osuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Surowy produkt rozpuszczono w heksanie i alkoholu izopropylowym i poddano oczyszczaniu metodą HPLC, stosując kolumnę z krzemionką Kromasil 5 (Phenomenex, 250 x 21,20 mm, wielkość porów 100 A, cząstki żelu 5 gm) przy eluowaniu 30-minutowym gradient od 0 do 25% alkoholu izopropylowego w heksanie (25 mL/minutę). Frakcje odpowiadające produktowi połączono i zatężono. Liofilizacja z wody dała 6,7 mg białego proszku. Niskorozdzielcze widmo masowe potwierdziło pożądaną masę (MH⁺ = 741,4).

III) Synteza na fazie stałej:

Synteza na fazie stałej jest przydatna do wytwarzania małych ilości pewnych związków według niniejszego wynalazku. Tak, jak przy konwencjonalnej syntezie peptydów na fazie stałej, reaktory do syntezy peptydyloketoamidów na fazie stałej składają się z naczynia reakcyjnego mającego co najmniej jedną powierzchnię przepuszczalną dla rozpuszczalnika i rozpuszczonych reagentów, ale nieprzepuszczalną dla żywicy do syntezy o dobranej wielkości ziaren. Takie reaktory obejmują szklane naczynia reakcyjne do syntezy na fazie stałej z frytą ze spieku szklanego, polipropylenowe rury lub kolumny z frytami, lub reaktor Kans^TM z firmy Irori Inc., San Diego CA. Typ wybranego reaktora zależy od potrzebnej objętości żywicy w fazie stałej, i na różnych etapach syntezy można stosować różne typy reaktorów. Następujące procedury będą odnośnikami w następujących po nich przykładach:

Procedura A: Reakcja sprzęgania: Do żywicy zawieszonej w N-metylopirolidynie (NMP) (10-15 mL/gram żywicy) dodano Fmoc-aminokwas (2 eq), HOAt (2 eq), HATU (2 eq) i diizopropyloetyloaminę (4 eq). Reagującą mieszaninę zostawiono na 4-48 godzin. Reagenty odsączono i żywicę przemyto kolejno dimetyloformamidem, dichlorometanem, metanolem, dichlorometanem i eterem dietylowym

PL 206 255 B1

219 (stosując 10-15 mL rozpuszczalnika/gram żywicy). Następnie żywicę wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem.

Procedura B: Odbezpieczenie Fmoc: Żywicę zabezpieczoną Fmoc potraktowano 20% roztworem piperydyny w dimetyloformamidzie (10 mL reagenta/g żywicy) przez 30 minut. Reagenty odsączono i żywicę przemyto kolejno dimetyloformamidem, dichlorometanem, metanolem, dichlorometanem i eterem dietylowym (10 mL rozpuszczalnika/gram żywicy).

Procedura C: Odbezpieczenie Boc: Żywicę zabezpieczoną Boc potraktowano mieszaniną 1:1 dichlorometanu i kwasu trifluorooctowego przez 20-60 minut (10 mL rozpuszczalnika/gram żywicy). Reagenty odsączono i żywicę przemyto kolejno dichlorometanem, dimetyloformamidem, 5% roztworem diizopropyloetyloaminy w dimetyloformamidzie, dimetyloformamidem, dichlorometanem i dimetyloformamidem (10 mL rozpuszczalnika/gram żywicy).

Procedura D: Hydroliza semikarbazonu: Żywicę zawieszono w koktajlu rozszczepiającym (10 mL/g żywicy) stanowiącym mieszaninę kwas trifluorooctowy: kwas pirogronowy: dichlorometan: woda 9:2:2:1 przez 2 godziny. Reagenty odsączono i procedurę powtórzono jeszcze trzy razy. Żywicę przemyto kolejno dichlorometanem, wodą i dichlorometanem i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem.

Procedura E: Rozszczepianie HF: Osuszoną żywicę peptyd-nVal(CO)-G-O-PAM (50 mg) umieszczono w naczyniu HF zawierającym mały element mieszający. Jako zmiatacz dodano anizol (10% objętości całkowitej). W obecności aminokwasów kwasu glutaminowego i cysteiny dodawano także tioanizol (10%) i 1,2-etanoditiol (0,2%). Następnie naczynie HF podwieszono do aparatury HF (Immuno Dynamics) i układ przedmuchiwano azotem przez pięć minut. Następnie ochłodzono go do -70°C przy użyciu łaźni zawierającej suchy lód/izopropanol. Po 20 minutach metodą destylacji wprowadzono pożądaną objętość HF (10 mL HF/g żywicy). Zachodzącą reakcję zostawiono przez półtorej godziny w temperaturze 0°C. Przerób polegał na usunięciu całego HF przy użyciu azotu. Następnie do żywicy dodano dichlorometan i mieszaninę mieszano przez pięć minut. Po tym dodano 20% kwas octowy w wodzie (4 mL). Po 20 minutach mieszania, żywicę odsączono przy użyciu tygla ze spiekiem i dichlorometan usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość i mieszaninę przemyto heksanem (2x) w celu usunięcia zmiatacza. Tymczasem żywicę namoczono w 1 mL metanolu. Warstwę wodną (20% HOAc) dodano ponownie do żywicy i mieszaninę mieszano przez pięć minut, a nastę pnie przesą czono. Metanol usunię to pod zmniejszonym ciś nieniem i warstwę wodną liofilizowano. Następnie peptyd rozpuszczono w 10-25% metanolu (zawierającym 0,1% kwasu trifluorooctowego) i oczyszczono metodą HPLC z odwróconymi fazami.

P r z y k ł a d XXII: Reprezentatywna synteza na fazie stałej inhibitorów zapalenia wątroby C: (iBoc-G(Chx)-P(4t-NHSO2Ph)-nV(CO)-G-G(Ph)-NH2)

Etap 1. Synteza Fmoc-nV-(dpsc)-Gly-OH:

A) Synteza izocyjanooctanu allilu (Etapy a-b poniżej): a) Synteza soli potasowej kwasu izocyjanooctowego:

220

PL 206 255 B1

Izocyjanooctan etylu (96,6 mL, 0,88 mol) dodano kroplami do oziębionego roztworu etanolu (1,5 L) i wodorotlenku potasu (59,52 g, 1,0 mol). Mieszaninę reakcyjną powoli ogrzano do temperatury pokojowej. Po upływie dwóch godzin wytrącony produkt odsączono na lejku szklanym i przemyto kilkoma porcjami oziębionego etanolu. Tak otrzymaną sól potasową kwasu izocyjanooctowego osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując złotobrunatną substancję stałą (99,92 g, 91,8%).

b) Synteza izocyjanooctanu allilu:

Do produktu z części a (99,92 g, 0,81 mol) rozpuszczonego w acetonitrylu (810 mL) dodano bromek allilu (92 mL, 1,05 mol). Po czterech godzinach ogrzewania w temperaturze wrzenia otrzymano ciemnobrunatny roztwór. Mieszaninę reakcyjną zatężono i uzyskaną pozostałość rozpuszczono w eterze (1,5 L) i przemyto trzykrotnie wodą (500 mL). Warstwę organiczną osuszono, przesączono i zatężono, otrzymują c ciemnobrunatny syrop. Surowy produkt oczyszczono metodą destylacji próż niowej pod ciśnieniem 7 mm Hg (98°C), otrzymując klarowny olej (78,92 g, 78%). NMR δ ppm (CDCl3): 5,9 (m, 1H), 5,3 (m, 2H), 4,7 (d, 2H), 4,25 (s, 2H).

B) Synteza 9-fluorenylometoksykarbonylo-norwalinalu (Etapy a-c poniżej):

a) Synteza estru metylowego 9-fluorenylometoksykarbonylo-L-norwaliny (Fmoc-nVal-OMe):

Do oziębionego roztworu dostępnej w handlu Fmoc-norwaliny (25 g, 73,75 mmol) w bezwodnym metanolu (469 mL) dodano chlorek tionylu (53,76 mL, 737,5 mmol) w ciągu jednej godziny. Wykonana godzinę później TLC w octanie etylu potwierdziła zakończenie reakcji (Rf = 0,85). Mieszaninę reakcyjną zatężono i uzyskaną pozostałość rozpuszczono w octanie etylu. Warstwę organiczną przemyto kilkoma porcjami po 200 mL nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu, a następnie solanką. Warstwę organiczną osuszono, przesączono i zatężono, otrzymując Fmoc-norVal-OMe) jako białą substancję stałą (26,03 g) z wydajnością ilościową. NMR δ ppm (CD3OD): 7,7 (m, 2H), 7,6 (m, 2H), 7,4 (m, 2H), 7,3 (m, 2H), 4,3 (m, 2H), 4,1 (m, 2H), 3,7 (s, 3H), 1,7 (m, 1H), 1,6 (m, 1H), 1,4 (m, 2H), 0,95 (t, 3H).

b) Synteza 9-fluorenylometoksykarbonylo-norwalinolu (Fmoc-nValinol):

Do Fmoc-nVal-OMe (26,03 g, 73,75 mmol) w tetrahydrofuranie (123 mL) i metanolu (246 mL) dodano chlorek wapnia (16,37 g, 147,49 mmol). Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 0°C i w kilku partiach dodano borowodorek sodu (11,16 g, 294,98 mmol). Do otrzymanej gęstej pasty dodano metanol (500 mL) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 90 minut. TLC w 2:3 octanie etylu: heksanie potwierdziła zakończenie reakcji (Rf = 0,25). Reakcję zatrzymano przez powolne dodanie wody (100 mL) w temperaturze 0°C. Metanol usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałą fazę wodną rozcieńczono octanem etylu. Warstwę organiczną przemyto wodą (3 x 500 mL), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (3 x 500 mL) i solanką (500 mL). Warstwę organiczną osuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono, otrzymując białą substancję stałą (21,70 g, 90,5%). NMR δ ppm (CD3OD): 7,8 (m, 2H), 7,7 (m, 2H), 7,4 (m, 2H), 7,3 (m, 2H), 4,3-4,5 (m, 2H), 4,2 (m, 1H), 3,6 (s, 1H), 3,5 (s, 2H), 1,5 (m, 1H), 1,3-1,4 (m, 3H), 0,99 (m, 3H).

PL 206 255 B1

221

c) Synteza 9-fluorenylometoksykarbonylo-norwalinalu (Fmoc-nVal-CHO):

Do roztworu Fmoc-norwalinolu (21,70 g, 66,77 mmol) w dichlorometanie (668 mL) dodano trietyloaminę (37,23 mL, 267 mmol) i roztwór ochłodzono do 0°C. Do oziębionego roztworu dodano zawiesinę kompleksu pirydyna-tritlenek siarki (42,51 g, 267 mmol) w dimetylosulfotlenku (96 mL). Po upływie jednej godziny, TLC w 2:3 octanie etylu: heksanie potwierdziła zakończenie reakcji. Dichlorometan usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskaną pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i przemyto wodą (2 x 50 mL), 1 N nasyconym roztworem wodosiarczanu sodu (2 x 50 mL), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (2 x 50 mL) i solanką (50 mL). Warstwę organiczną zatężono, otrzymując białą substancję stałą. Założono wydajność teoretyczną (21,57 g) i bez dalszego oczyszczania wykonano następny etap reakcji.

C) Synteza soli trifluorooctanowej difenylometylosemikarbazydu (dpsc) (Etapy a-b poniżej): a) Synteza Boc-semikarbazyd-4-ylodifenylometanu

Do roztworu karbonylodiimidazolu (16,2 g, 0,10 mole) w dimetyloformamidzie (225 mL) dodano roztwór karbazanu tert-butylu (13,2 g, 0,100 mol) w dimetyloformamidzie (225 mL) kroplami w ciągu 30 minut. Difenylometyloaminę (18,3 g, 0,10 mol) następnie w ciągu 30 minut dodano. Reakcję mieszano w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Wodę (10 mL) dodano i mieszaninę zatężono do około 150 mL pod zmniejszonym ciśnieniem. Ten roztwór wylano do wody (500 mL) i ekstrahowano octanem etylu (400 mL). Fazę octanu etylu przemyto po dwa razy 75 mL 1 N HCl, wodą, nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu i roztworu chlorku sodu, i osuszono siarczanem magnezu. Mieszaninę przesączono i roztwór zatężono, otrzymując 29,5 g (85% wydajności) białej piany. Ten materiał można było oczyścić metodą rekrystalizacji z octanu etylu/heksanu, ale był dostatecznie czysty dla zastosowania bezpośrednio w następnym etapie: t.t. 142-143°C. ¹H NMR (CDCl3) δ 1,45 (s, 9H), 6,10 (dd, 2H), 6,42 (s, 1H), 6,67 (bs, 1H), 7,21-7,31 (m, 10H).

Anal. obliczona dla C19H23N3O3: C, 66,84; H, 6,79; N, 12,31.

Stwierdzono: C, 66,46; H, 6,75; N; 12,90.

b) Synteza soli trifluorooctanowej difenylometylosemikarbazydu (dpsc)

Roztwór Boc-semikarbazyd-4-ylodifenylometanu (3,43 g, 10 mmol) w dichlorometanie (12,5 mL) potraktowano przy użyciu 12,5 mL kwasu trifluorooctowego w temperaturze pokojowej i mieszano przez 30 min. Roztwór dodano kroplami do 75 mL eteru i otrzymaną substancję stałą (2,7 g, 80%)

222

PL 206 255 B1 zebrano przez odsączenie, t.t. 182-184°C. ¹H NMR (CD3OD) δ 6,05 (s, 1H), 7,21-7,35 (m, 10H). ¹³C NMR (CD3OD) δ 57,6, 118,3 (q, CF3), 126,7, 127,9, 141,6, 156,9, 160,9 (q, CF3CO2H).

D) Synteza Fmoc-nVal-(CHOH)-Gly-Oallilu:

Do roztworu Fmoc-nVal-CHO (Etap IB) (5,47 g, 16,90 mmol) w dichlorometanie (170 mL) dodano izocyjanooctan allilu (Etap IA) (2,46 mL, 20,28 mmol) i pirydynę (5,47 mL, 67,61 mmol). Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 0°C i dodano kroplami kwas trifluorooctowy (3,38 mL, 33,80 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 0°C przez 1 h, a następnie w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. TLC wykonana w octanie etylu potwierdziła zakończenie reakcji. Mieszaninę reakcyjną zatężono i poddano chromatografii błyskawicznej przy użyciu 20% do 70% octanu etylu w heksanie. Frakcje zawierające pożądany produkt połączono i zatężono, otrzymując białą pianę (6,88 g, 87,3%). TLC w mieszaninie 50:50 octan etylu wykazała jedną plamkę (Rf = 0,37). NMR δ ppm (CD3OD): 7,8 (m, 2H), 7,65 (m, 2H), 7,4 (m, 2H), 7,3 (m, 2H), 5,9 (m, 1H), 5,1-5,4 (m, 2H), 4,55-4,65 (m, 2H), 4,3-4,4 (m, 2H), 4,15-4,25 (m, 1H), 4,01 (s, 1H), 3,9-4,0 (m, 3H), 1,5-1,6 (m, 2H), 1,35-1,45 (m, 3H), 0,9 (m, 3H).

E) Synteza Fmoc-nVal-(CO)-Gly-Oallilu:

Do roztworu Fmoc-nVal-(CHOH)-Gly-Oallilu (Etap D) (5,01 g, 10,77 mmol) w dimetylosulfotlenku (100 mL) i toluenie (100 mL) dodano EDC (20,6 g, 107,7 mmol). Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 0°C i dodano kroplami kwas dichlorooctowy (4,44 mL, 53,83 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 minut w temperaturze 0°C i przez 1 h w temperaturze pokojowej. Po ponownym ochłodzeniu do 0°C, dodano wodę (70 mL) i toluen usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość rozcieńczono octanem etylu i przemyto kilka razy nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu, a następnie 1 N roztworem wodosiarczanu sodu i solanką. Warstwę organiczną osuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Założono wydajność teoretyczną równą 4,99 g i bez dalszego oczyszczania wykonano następny etap reakcji. TLC w mieszaninie 50:50 octan etylu wykazała jedną plamkę (Rf = 0,73).

F) Synteza Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-Oallilu:

Do roztworu Fmoc-nVal-(CO)-Gly-Oallilu (Etap E) (4,99 g, 10,75 mmol) w etanolu (130 mL) i wodzie (42 mL) dodano kolejno sól trifluorooctanową difenylometylosemikarbazydu (dpsc) (Etap IC) (7,6 g, 21,5 mmol) i octan sodu ^'3H2O (1,76 g, 12,9 mmol). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 90 minut. Zakończenie reakcji zostało potwierdzone metodą TLC wykonanej w mieszaninie 1:1 octan etylu: heksan. Etanol usunię to pod zmniejszonym ciś nieniem i uzyskaną pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i przemyto 1 N roztworem wodosiarczanu sodu (2 x 10 mL),

PL 206 255 B1

223 nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (2 x 10 mL), a następnie solanką (10 mL). Warstwę organiczną osuszono, przesączono i zatężono. Otrzymaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii błyskawicznej w 20% do 50% octanu etylu w heksanie, otrzymując białą substancję stałą (5,76 g, 78%). TLC w mieszaninie 50:50 octan etylu: heksan wykazała dwie plamki (izomery cis i trans) mające Rf = 0,42 i 0,5.

G) Synteza Fmoc-nVal)-(dpsc)-Gly-OH:

Do roztworu Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-Oallilu (Etap IG) (4,53 g, 6,59 mmol) w tetrahydrofuranie (300 mL) dodano dimedon (4,62 g, 32,97 mmol), a następnie katalizator tetrakis-(trifenylofosfina)pallad(0) (0,76 g, 0,66 mmol). Po upływie 90 minut metodą TLC potwierdzono zakończenie reakcji, stosując 9:1 dichlorometan: metanol. Mieszaninę reakcyjną zatężono i uzyskaną pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i przemyto trzykrotnie porcjami po 50 mL 0,1 M wodorofosforanu potasu. Następnie warstwę organiczną potraktowano 50 mL wodorosiarczynu sodu i układ dwufazowy mieszano przez 15 minut. Fazy rozdzielono i procedurę powtórzono jeszcze dwukrotnie. Warstwę organiczną osuszono i zatężono i poddano chromatografii błyskawicznej przy użyciu 20% do 100% octanu etylu w heksanie. Po tym nastąpił roztwór 9:1 dichlorometanu: metanolu. Frakcje odpowiadające czystemu produktowi połączono i zatężono, otrzymując białą substancję stałą (3,99 g, 94%). TLC w 9:1 dichlorometanie: metanolu wykazała dwie plamki (izomery cis i trans). NMR δ ppm (CD3OD): 7,75 (m, 2H), 7,6 (m, 3H), 7,2-7,4 (m, 14H), 6,1-6,2 (m, 1H), 4,25-4,4 (m, 2H), 4,1-4,2 (m, 2H), 3,85 (s, 2H), 1,6-1,8 (m, 2H), 1,3-1,5 (m, 2H), 0,95 (t, 3H).

Etap 2. Synteza H-Phg-żywicy MBHA:

Dostępną w handlu żywicę MBHA (2,6 g, 1,12 mmol/g, 2,91 mmol) przeniesiono do naczynia reakcyjnego 250 mL z frytami do reakcji na fazie stałej zaopatrzonego w doprowadzenie azotu. Następnie przemyto ją starannie porcjami po 30 mL dichlorometanu, metanolu, dimetyloformamidu i dichlorometanu i sprzężono w ciągu 18 godzin z dostępnym w handlu Fmoc-Phg-OH (2,17 g, 5,82 mmol) zgodnie z Procedurą A z wydajnością 99,82%. Następnie żywicę poddano odbezpieczeniu Fmoc zgodnie z Procedurą B. Jakościowa analiza ninhydrynowa na małej porcji dała ciemnoniebieską żywicę i roztwór, dowodzące udanej reakcji.

Etap 3. Synteza H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-żywicy MBHA:

224

PL 206 255 B1

Żywicę otrzymaną w Etapie II (2,6 g, 0,8 mmol/g, 2,91 mmol) poddano reakcji z Fmoc-nVal(dpsc)-Gly-Oallilem (Etap IG) (5,82 mmol, 3,77 g) zgodnie z Procedurą A. Po upływie 18 godzin ilościowa analiza ninhydrynowa wykazała skuteczność sprzęgania 99,91%. Żywicę poddano odbezpieczeniu Fmoc zgodnie z Procedurą B. Jakościowa analiza ninhydrynowa na małej porcji dała ciemnoniebieską żywicę i roztwór, dowodzące udanej reakcji.

Etap 4. Synteza Boc-Pro(4t-NHFmoc)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-żywicy MBHA:

Związek H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-żywica MBHA (Etap 3 powyżej) (600 mg, 0,8 mmol/g, 0,67 mmol) przeniesiono do rury polipropylenowej z frytą i sprzężono z Boc-Pro(4t-NHFmoc)-OH (Przykład VI, Etap 3) (610 mg, 1,34 mmol) zgodnie z Procedurą A. Po upływie 18 godzin ilościowa analiza ninhydrynowa wykazała skuteczność sprzęgania 99,96%.

Etap 5. Synteza Boc-Pro(4t-NH2)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-żywicy MBHA:

Żywicę z poprzedniego etapu (Boc-Pro(4t-NHFmoc)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-żywica MBHA) poddano odbezpieczeniu Fmoc zgodnie z Procedurą B. Jakościowa analiza ninhydrynowa na małej porcji dała ciemnoniebieską żywicę i roztwór, dowodzące udanej reakcji.

Etap 6. Synteza Boc-Pro (4t-NHSO2Bn)-nVal (dpsc)-Gly-Phg-żywicy MBHA:

PL 206 255 B1

225

Do żywicy otrzymanej z poprzedniego etapu (Boc-Pro(4t-NH2)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-żywica MBHA) (0,2 g, 0,22 mmol) zawieszonej w NMP (2 mL) dodano 2,4,6-kolidynę (0,24 mL, 1,79 mmol) i chlorek benzenosulfonylu i mieszaninę reakcyjną wytrząsano przez 18 godzin. Rozpuszczalnik odsączono i żywicę przemyto starannie porcjami po 2 mL dichlorometanu, metanolu, dimetyloformamidu i dichlorometanu. Jakoś ciowa analiza ninhydrynowa dał a bezbarwne pereł ki i roztwór, dowodzą ce udanej reakcji.

Etap 7. Synteza Fmoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phg- żywicy MBHA:

Żywicę otrzymaną w poprzednim etapie (Boc-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-żywica MBHA) poddano procedurze odbezpieczenia Boc zgodnie z Procedurą C. Następnie sprzężono Fmoc-G(Chx) (0,17 g, 0,45 mmol) zgodnie z Procedurą A. Po upływie 18 godzin jakościowa analiza ninhydrynowa dała bezbarwne perełki, a ilościowa analiza ninhydrynowa wykazała skuteczność sprzęgania 99,79%.

Etap 8. Synteza iBoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phg- żywicy MBHA:

Żywicę otrzymaną w poprzednim etapie (Fmoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phgżywica MBHA) poddano odbezpieczeniu Fmoc zgodnie z Procedurą B. Analiza ninhydrynowa na małej porcji dała ciemnoniebieską żywicę i roztwór, dowodzące udanej reakcji. Do żywicy (0,2 g, 0,22 mmol) zawieszonej w 2 mL NMP dodano chloromrówczan izobutylu (0,12 mL, 0,90 mmol), a następnie diizopropyloetyloaminę (0,31 mL, 1,79 mmol), i mieszaninę reakcyjną wytrząsano przez 18 godzin w temperaturze pokojowej. Jakościowa analiza ninhydrynowa dała bezbarwne perełki i roztwór, dowodzące udanej reakcji.

226

PL 206 255 B1

Etap 9. Synteza iBoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(CO)-Gly-Phg-żywicy MBHA:

Związek z poprzedniego etapu (iBoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-żywica MBHA) (200 mg) poddano hydrolizie semikarbazonu zgodnie z Procedurą D.

Etap 10. Synteza iBoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(CO)-Gly-Phg -NH2:

Żywicę z poprzedniego etapu (iBoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(CO)-Gly-Phg-żywica MBHA) (100 mg) poddano warunkom rozszczepiania HF (Procedura E), otrzymując pożądany produkt surowy. Materiał oczyszczono metodą HPLC przy użyciu kolumny 2,2 x 25 cm z odwróconymi fazami, zawierającej żywicę C-18 złożoną z cząstek żelu o wielkości 10 mikronów z porami o wielkości 300 angstremów, przy eluowaniu gradientem przy użyciu 20-50% acetonitrylu w wodzie. Analityczna HPLC przy użyciu kolumny 4,6 x 250 mm z odwróconymi fazami, zawierającej żywicę C-18 złożoną z cząstek żelu o wielkości 5 mikronów z porami o wielkości 300 angstremów, przy eluowaniu 25-75% acetonitrylu (zawierającego 0,1% kwasu trifluorooctowego) wykazała jeden pik o czasie retencji 13,5 minut. Widmo masowe o niskiej rozdzielczości potwierdziło pożądaną masę (MH⁺ 826,4).

IV. Dodatkowe związki wytworzone metodą syntezy w fazie roztworu:

Reprezentatywne procedury wytwarzania dodatkowych związków według wynalazku są pokazane poniżej, a związki wytworzone takimi procedurami są podane w Tabeli 5.

PL 206 255 B1

227

P r z y k ł a d XXIII: Wytwarzanie związku o wzorze XXIII:

Mieszany roztwór ketiminy XXIIIa (50 g, 187,1 mmol) pod osłoną atmosfery N2 w suchym THF (400 mL) ochłodzono do -78°C i potraktowano 1 M roztworem K-^tBuO (220 mL, 1,15 ekwiw.) w THF. Mieszaninę reakcyjną ogrzano do 0°C i mieszano przez 1 h i potraktowano bromometylocyklobutanem (28 mL, 249 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 48 h i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w Et2O (300 mL) i potraktowano wodnym HCl (2 M, 300 mL) Otrzymany roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 h i ekstrahowano Et2O (1 L). Warstwę wodną zalkalizowano do pH ~12-14 przy użyciu NaOH (50% roztwór wodny) i ekstrahowano CH2CI2 (3 x 300 mL). Połączone warstwy organiczne osuszono (MgSO4), przesączono, i zatężono, otrzymując czystą aminę (XXIIIb, 18 g) jako bezbarwny olej.

Roztwór aminy XXIIIb (18 g, 105,2 mmol) w temperaturze 0°C w CH2CI2 (350 mL) potraktowano diwęglanem di-tert-butylu (23 g, 105,4 mmol) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 h. Po zakończeniu reakcji (TLC) mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w THF/H₂O (200 mL, 1:1) i potraktowano przy użyciu LiOH'H₂O (6,5 g, 158,5 mmol) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 h. Mieszaninę reakcyjną zatężono i zasadową warstwę wodną ekstrahowano przy użyciu Et2O.

Warstwę wodną zakwaszono przy użyciu stężonego HCl do pH ~1-2 i ekstrahowano przy użyciu CH2CI2. Połączone warstwy organiczne osuszono (MgSO4), przesączono, i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując XXIIIc jako bezbarwny lepki olej, który zastosowano do następnego etapu bez jakiegokolwiek dalszego oczyszczania.

228

PL 206 255 B1

Etap 3.

Roztwór kwasu XXIIIc (15,0 g, 62 mmol) w CH2Cl2 (250 mL) potraktowano reagentem BOP (41,1 g, 93 mmol), N-metylomorfoliną (27 mL), chlorowodorkiem N,O-dimetylohydroksylo-aminy (9,07 g, 93 mmol) i mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 1 N wodnym HCl (250 mL), i warstwy rozdzielono i warstwę wodną ekstrahowano przy użyciu CH2CI2 (3 x 300 mL). Połączone warstwy organiczne osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i oczyszczono metodą chromatografii (SiO2, EtOAc/heksan 2:3), otrzymując amid XXIIId (15,0 g) jako bezbarwną substancję stałą.

Etap 4.

Roztwór amidu XXIIId (15 g, 52,1 mmol) w suchym THF (200 mL) potraktowano kroplami roztworem LiAlH4 (1 M, 93 mL, 93 mmol) w temperaturze 0°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 h, i reakcję ostrożnie zatrzymano w temperaturze 0°C działaniem roztworu KHSO4 (10% aq.) i mieszano przez 0,5 h. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono wodnym HCl (1 M, 150 mL) i ekstrahowano przy użyciu CH2CI2 (3 x 200 mL). Połączone warstwy organiczne przemyto wodnym HCl (1 M), nasyconym roztworem NaHCO3, solanką, i osuszono (MgSO4). Mieszaninę przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując XXIIIe jako lepki bezbarwny olej (14 g).

Etap 5.

Roztwór aldehydu XXIIIe (14 g, 61,6 mmol) w CH2CI2 (50 mL) potraktowano Et3N (10,73 mL, 74,4 mmol) i cyjanohydryną acetonu (10,86 g, 127,57 mmol) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 h. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i rozcieńczono wodnym HCl (1 M, 200 mL) i ekstrahowano do CH2CI2 (3 x 200 mL). Połączone warstwy organiczne przemyto H2O, solanką, osuszono (MgSO4), przesączono, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i oczyszczono metodą chromatografii (SiO2, EtOAc/heksan 1:4), otrzymując XXIIIf (10,3 g) jako bezbarwną ciecz.

PL 206 255 B1

229

Etap 6.

Metanol nasycony chlorowodorem*, wytworzony metodą barbotowania gazowego HCl przez CH3OH (700 mL) w temperaturze 0°C, potraktowano cyjanohydryną XXIIIf i ogrzewano do temperatury wrzenia przez 24 h. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując XXIIIg, który użyto w następnym etapie bez oczyszczania.

*Alternatywnie można także zastosować 6 M HCl wytworzony przez dodanie AcCl do suchego metanolu.

Etap 7.

Roztwór chlorowodorku aminy XXIIIg w CH2CI2 (200 mL) potraktowano przy użyciu Et3N (45,0 mL, 315 mmol) i Boc2O (45,7 g, 209 mmol) w temperaturze -78°C. Następnie mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez noc i rozcieńczono przy użyciu HCl (2 M, 200 mL) i ekstrahowano do CH2CI2. Połączone warstwy organiczne osuszono (MgSO4)/przesączono, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i oczyszczono metodą chromatografii (EtOAc/heksan 1:4), otrzymując hydroksyester XXIIIh.

Etap 8.

Roztwór estru metylowego XXIIIh (3 g, 10,5 mmol) w THF/H2O (1:1) potraktowano LiOH^'H2O (645 mg, 15,75 mmol) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 h. Mieszaninę reakcyjną zakwaszono wodnym HCl (1 M, 15 mL) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem.

Roztwór kwasu w CH2Cl2 (50 mL) i DMF (25 mL) potraktowano NH4Cl (2,94 g, 55,5 mmol), EDCI (3,15 g, 16,5 mmol), HOOBt (2,69 g, 16,5 mmol), i NMM (4,4 g, 44 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 dni. Rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozcieńczono wodnym HCl (250 mL) i ekstrahowano przy użyciu CH2Cl2. Połączone warstwy organiczne przemyto wodnym nasyconym roztworem NaHCO3, osuszono (MgSO4), przesączono, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując XXIIIi, który zastosowano jako taki w następnych etapach. (Alternatywnie XXIIIi można także otrzymać bezpośrednio przez reakcję XXIIIf (4,5 g, 17,7 mmol) z wodnym roztworem H2O2 (10 mL), LiOH^'H2O (820 mg, 20,8 mmol) w temperaturze 0°C w 50 mL CH3OH przez 0,5 h.)

230

PL 206 255 B1

Etap 9.

Roztwór XXIIIi otrzymany w poprzednim etapie rozpuszczono w 4 N HCl w dioksanie i mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 h. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując XXIIIj jako substancję stałą, której użyto bez dalszego oczyszczania.

Aminoester XXIIII wytworzono sposobem, który opisali R. Zhang i J. S. Madalengoitia (J. Org. Chem. 1999, 64, 330), z tym wyjątkiem, że grupę Boc odszczepiono metodą reakcji aminokwasu zabezpieczonego grupą Boc z metanolowym roztworem HCl.

Roztwór handlowego aminokwasu Boc-Chg-OH, XXIIIk (Senn Chemicals, 6,64 g, 24,1 mmol) i chlorowodorku aminy XXIIII (4,5 g, 22 mmol) w CH2CI2 (100 mL) w temperaturze 0°C potraktowano reagentem BOP i mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 h. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, następnie rozcieńczono ją wodnym 1 M HCl i ekstrahowano do EtOAc (3 x 200 mL). Połączone warstwy organiczne przemyto nasyconym roztworem NaHCO3 (200 mL), osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, i poddano chromatografii (SiO2, EtOAc/heksan 3:7), otrzymując XXIIIm (6,0 g) jako bezbarwną substancję stałą.

Etap 11.

PL 206 255 B1

231

Roztwór estru metylowego XXIIIm (4,0 g, 9,79 mmol) w THF/H2O (1:1) potraktowano przy użyciu LiOH^'H2O (401 mg, 9,7 9 mmol) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 h. Mieszaninę reakcyjną zakwaszono wodnym HCl i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując wolny kwas.

Roztwór kwasu (1,5 g, 3,74 mmol) w DMF/CH2Cl2 (1:150 mL) potraktowano aminą XXIIIj (772 mg, 3,74 mmol), EDCI (1,07 g, 5,61 mmol), HOOBt (959 mg, 5,61 mmol) i NMM (2,15 mL, 14,96 mmol) w temperaturze -10°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 0°C przez 48 h i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozcieńczono wodnym 1 M HCl i ekstrahowano przy użyciu CH2Cl2, Połączone warstwy organiczne ekstrahowano wodnym roztworem NaHCO3, wodnym HCl, solanką, osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując XXIIIn (2,08 g) jako beżową substancję stałą.

Etap 12.

Roztwór amidu XXIIIn (2,08 g, 3,79 mmol) w toluenie i DMSO (1:1 20 mL) w temperaturze 0°C potraktowano EDCI (7,24 g, 37,9 mmol) i kwasem dichlorooctowym (2,42 g, 19,9 mmol) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 h. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH2CI2, przemyto nasyconym roztworem NaHCO3, i solanką. Warstwę organiczną osuszono (MgSO4), przesączono, zatężono, pod zmniejszonym ciśnieniem i oczyszczono metodą chromatografii (SiO2, aceton/heksan 3:7), otrzymując XXIII jako bezbarwną substancję stałą.

P r z y k ł a d XXIV: Wytwarzanie zwi ą zku o wzorze XXIV:

232

PL 206 255 B1

Roztwór Boc-tert-Leu XXIVa (Fluka, 5,0 g 21,6 mmol) w suchym CH2CI2/DMF (50 mL, 1:1) ochłodzono do 0°C i potraktowano aminą XXIIII (5,3 g, 25,7 mmol), NMM (6,5 g, 64,8 mmol) i reagentem BOP (11,6 g, 25,7 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 h, rozcieńczono wodnym HCl (1 M) i ekstrahowano przy użyciu CH2CI2. Połączone warstwy organiczne przemyto wodnym HCl (1 M), nasyconym roztworem NaHCO3, solanką, osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, i oczyszczono metodą chromatografii (SiO2, aceton/heksan 1:5), otrzymując XXIVb jako bezbarwną substancję stałą.

Etap 2.

Roztwór estru metylowego XXIVb (4,0 g, 10,46 mmol) rozpuszczono w HCl (4 M roztwór w dioksanie) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 h. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując chlorowodorek aminy zastosowany w następnym etapie.

Roztwór chlorowodorku aminy (397 mg, 1,24 mmol) w CH2CI2 (10 mL) ochłodzono do -78°C i potraktowano izocyjanianem tert-butylu (250 mg, 2,5 mmol) i mieszano w temperaturze pokojowej przez noc. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozcieńczono wodnym HCl (1 M) i ekstrahowano przy użyciu CH2CI2. Połączone warstwy organiczne przemyto wodnym HCl (1 M), nasyconym roztworem NaHCO3 i solanką. Warstwy organiczne osuszono, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość oczyszczono metodą chromatografii (SiO2, aceton/heksan 1:4), otrzymując XXIVc jako bezbarwną substancję stałą.

Etap 3:

Roztwór estru metylowego XXIVc (381 mg, 1,0 mmol) w THF/H2O (1:1,5 mL) potraktowano przy użyciu LiOH'H₂O (62 mg, 1,5 mmol) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 h. Mieszaninę reakcyjną zakwaszono wodnym HCl i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując wolny kwas.

Roztwór kwasu (254,9 mg, 0,69 mmol) w DMF/CH2Cl2 (1:1, 5,0 mL) potraktowano aminą XXIIIj (159 mg, 0,763 mmol), EDCI (199 mg, 1,04 mmol), HOOBt (169,5 mg, 1,04 mmol) i NMM (280 mg, 2,77 mmol) w temperaturze -20°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -20°C przez 48 h i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozcieńczono wodnym 1 M HCl i ekstrahowano przy użyciu EtOAc. Połączone warstwy organiczne ekstrahowano wodnym roztworem NaHCO3, wodPL 206 255 B1

233 nym HCl, solanką, osuszono (MgSO4), przesączono, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując XXIVd (470 mg) jako beżową substancję stałą.

Etap 4.

Roztwór amidu XXIVd (470 mg, 0,9 mmol) w toluenie i DMSO (1:1 20 mL) w temperaturze 0°C potraktowano EDCI (1,72 g, 9,0 mmol) i kwasem dichlorooctowym (0,37 mL, 4,5 mmol) i mieszano w temperaturze 0°C przez 4 h. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH2CI2, i przemyto nasyconym roztworem NaHCO3 oraz solanką. Warstwę organiczną osuszono (MgSO4), przesączono, zatężono, pod zmniejszonym ciśnieniem i oczyszczono metodą chromatografii (SiO2, aceton/heksan 3:7), otrzymując XXIV jako bezbarwną substancję stałą.

P r z y k ł a d XXV: Wytwarzanie związku o wzorze XXV:

Etap 1.

►

FmocHN

XXVa XXVb XXVc

Roztwór Fmoc-glicyny (Bachem, 2,0 g, 6,87 mmol) w CH2CI2 (20 mL) potraktowano 2-fenylo-2-propanolem (Aldrich, 3,36 g, 24,7 mmol), DCC (1 M roztwór w CH2Cl2, 8,24 mL), DMAP (167 mg, 1,37 mmol) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 h. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i rozcieńczono Et2O (100 mL). Wytrąconą substancję stałą odsączono i przesącz przemyto nasyconym roztworem NaHCO3. Warstwę organiczną osuszono (MgSO4), przesączono, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, i oczyszczono metodą chromatografii (SiO2, EtOAc/-heksan 1:5), otrzymując ester XXVc (1,1 g) jako bezbarwną lepką ciecz.

234

PL 206 255 B1

Etap 2

Roztwór XXVc w CH2CI2 (16,0 mL) potraktowano piperydyna (4,0 mL) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 0,5 h. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i oczyszczono metodą chromatografii (SiO2, aceton/heksan 1:10 do 1:1), otrzymując aminę XXVd (420 mg) jako bezbarwną ciecz.

przy użyciu LiOH^'H2O (62 mg, 1,5 mmol) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 h. Mieszaninę reakcyjną zakwaszono wodnym HCl i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując wolny kwas.

Roztwór kwasu (2,0 g, 5,5 mmol) w DMF/CH2CI2 (1:1, 40,0 mL) w temperaturze -10°C potraktowano aminą XXIIIg (1,51 g, 6,8 mmol), EDCI (1,57 g, 8,25 mmol), HOOBt (1,41 g, 8,25 mmol) i NMM (2,5 g, 24,7 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 0°C przez 48 h i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozcieńczono wodnym 1 M HCl (100 mL) i ekstrahowano przy użyciu CH2CI2 (3 x 100 mL). Połączone warstwy organiczne ekstrahowano wodnym roztworem NaHCO3, wodnym HCl, solanką, osuszono (MgSO4), przesączono, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując XXVe (3,17 g) jako beżową substancję stałą, którą zastosowano dalej bez żadnego oczyszczania.

Etap 4.

Roztwór estru metylowego XXVe (2,5 g, 4,66 mmol) w THF/H2O/CH3OH (1:1:1, 60 mL) potraktowano przy użyciu LiOH^'H2O (200 mg, 4,87 mmol) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 h. Mieszaninę reakcyjną zakwaszono wodnym HCl i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując wolny kwas.

Roztwór kwasu (200,0 mg, 0,38 mmol) w DMF/CH2Cl2 (1:1, 6,0 mL) w temperaturze -10°C potraktowano aminą XXVd (78 mg, 0,4 mmol), EDCI (105 mg, 0,55 mmol), HOOBt (95 mg, 0,55 mmol)

PL 206 255 B1

235 i NMM (150 mg, 1,48 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 0°C przez 48 h i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozcieńczono wodnym 1 M HCl (30 mL) i ekstrahowano przy użyciu CH2CI2 (3 x 30 mL). Połączone warstwy organiczne ekstrahowano wodnym roztworem NaHCO3 (2 x 30 mL), wodnym HCl, solanką (30 mL), osuszono (MgSO4), przesączono, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując XXVf (240 mg) jako beżową substancję stałą.

Etap 5.

Roztwór XXVf (240 mg, 0,28 mmol) w CH2Cl2 (10 mL) potraktowano odczynnikiem DessaMartina (Omega, 242 mg, 0,56 mmol) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 h. Po zakończeniu utleniania (TLC, aceton/heksan 1:4) mieszaninę reakcyjną rozcieńczono nasyconym roztworem NaHCO3 (20 mL) i Na2S2O3 (10% roztwór wodny, 20 mL). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 30 min i ekstrahowano przy użyciu CH2CI2 (3 x 30 mL). Połączone warstwy organiczne ekstrahowano nasyconym roztworem NaHCO3, solanką, osuszono (MgSO4), przesączono, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i oczyszczono metodą chromatografii (SiO2, aceton/heksan 1:5), otrzymując XXV (122 mg) jako bezbarwną substancję stałą.

P r z y k ł a d XXVI: Wytwarzanie związku o wzorze XXVI

Etap 1:

Do mieszanego roztworu N-Boc-3,4-dehydroproliny XXVIa (5,0 g, 23,5 mmol), diwęglanu di-tert-butylu (7,5 g, 34,4 mmol), i 4-N,N-dimetyloaminopirydyny (0,40 g, 3,33 mmol) w acetonitrylu (100 mL) w temperaturze pokojowej dodano trietyloaminę (5,0 mL, 35,6 mmol). Otrzymany roztwór mieszano w tej temperaturze przez 18 h, zanim zatężono go pod zmniejszonym ciśnieniem. Ciemnobrunatną

236

PL 206 255 B1 pozostałość oczyszczono metodą błyskawicznej chromatografii kolumnowej przy eluowaniu 10-25% EtOAc/heksanem, otrzymując produkt XXVIb jako blado-żółty olej (5,29 g, 84%).

Etap 2:

Do mieszanego roztworu dehydroproliny XXVIb (10,1 g, 37,4 mmol), chlorku benzylotrietyloamoniowego (1,60 g, 7,02 mmol) w chloroformie (120 mL) w temperaturze pokojowej dodano 50% wodny roztwór wodorotlenku sodu (120 g). Po 24 h energicznego mieszania w tej temperaturze czarną mieszaninę rozcieńczono CH2CI2 (200 mL) i eterem dietylowym (600 mL). Po rozdzieleniu warstw, roztwór wodny ekstrahowano przy użyciu CH2Cl2/Et2O (1:2, 3 x 600 mL). Roztwór organiczny osuszono (MgSO4) i zatężono. Pozostałość oczyszczono metodą błyskawicznej chromatografii kolumnowej przy użyciu 5-20% EtOAc/heksanu, otrzymując 9,34 g (71%) XXVIc jako białawą substancję stałą.

Etap 3:

Roztwór XXVIc (9,34 g, 26,5 mmol) w CH2Cl2 (25 mL) i CF3CO2H (50 mL) mieszano w temperaturze pokojowej przez 4,5 h, zanim zatężono go pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując brunatną pozostałość, którą zastosowano w Etapie 4 bez dalszego oczyszczania.

Etap 4

Handlowy stężony kwas solny (4,5 mL) dodano do roztworu pozostałości z Etapu 3 w metanolu (70 mL) i otrzymaną mieszaninę ogrzano do 65°C na łaźni olejowej. Po 18 h, mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując brunatny olej XXVIe, który zastosowano w Etapie 5 bez dalszego oczyszczania.

Etap 5:

PL 206 255 B1

237

Do mieszanego roztworu estru metylowego proliny XXVIe z Etapu 4, handlowej N-Boc-cykloheksyloglicyny XXVIf (10,2 g, 40,0 mmol) i [heksafluorofosforanu O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowego] (HATU) (16,0 g, 42,1 mmol) w DMF (200 mL) w temperaturze 0°C dodano diizopropyloetyloaminę (18,0 mL, 104 mmol). Po zostawieniu razem z łaźnią lodową na noc (18 h) do ogrzania do temperatury pokojowej, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono przy użyciu EtOAc (600 mL), 5% H3PO4 (150 mL) i solanką (150 mL). Roztwór organiczny przemyto 5% roztworem H3PO4 (150 mL), nasyconym roztworem NaHCO3 (2 x 200 mL), zanim osuszono go (MgSO4), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono metodą błyskawicznej chromatografii kolumnowej przy użyciu

5-20% EtOAc/heksanu, otrzymując 3,84 g (32% na trzy etapy) XXVIg jako białawą substancję stałą.

Etap 6:

XXVI g XXVI h

Roztwór estru metylowego XXVIg (5,87 g, 13,1 mmol) i LiOH (1,65 g, 39,3 mmol) w THF/MeOH/H2O (1:1:1, 90 mL) mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 h. Metanol i THF usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Roztwór wodny zakwaszono do pH ~2 przy użyciu 1 N wodnego roztworu HCl (50 mL) i nasycono stałym chlorkiem sodu, zanim ekstrahowano go przy użyciu EtOAc (3 x 150 mL). Roztwory organiczne połączono, osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując białą substancję stałą XXVIh (5,8 g, ilościowo).

Pożądany produkt XXIIii wytworzono zgodnie z procedurą w Przykładzie XXIII, Etap 11. Etap 8:

238

PL 206 255 B1

Pożądany produkt XXVI wytworzono zgodnie z procedurą w Przykładzie XXIII, Etap 12.

Pożądany produkt XXVIla wytworzono zgodnie z procedurą w Przykładzie XXIII, Etap 9. Etap 2

XXVIla XXVIIb

Pożądany produkt XXVIIb wytworzono zgodnie z procedurą w Przykładzie XXIV, Etap 2. Etap 3

PL 206 255 B1

239

Pożądany produkt XXVII wytworzono zgodnie z procedurą w Przykładzie XXIII, Etap 12. P r z y k ł a d XXVIII: Wytwarzanie związku o wzorze XXVIII:

Etap 1:

XXVIIla XXVIIIb

Związek pośredni XXVIIIb wytworzono zgodnie z procedurą w Przykładzie XXIII, Etapy 3-6. Etap 2:

Kwas z Przykładu XXIV, Etap 2 (XXVIIIc) (0,7 g) poddano reakcji z produktem z Etapu 1 powyżej (0,436 g), HATU (6,934 g) i DIPEA (1,64 mL) w sposób opisany poprzednio w Przykładzie IX, Etap 2a, otrzymując 0,66 g pożądanego produktu XXVIIId.

Etap 3:

240

PL 206 255 B1

Produkt z Etapu 2 (0,5 g) poddano reakcji z odczynnikiem Dessa-Martina (1 g) w sposób opisany poprzednio w Przykładzie XX, Etap 7. Oczyszczanie metodą błyskawicznej chromatografii kolumnowej (40% EtOAc, heksan, krzemionka) dało 0,35 g produktu XXVIIle. Widmo masowe (LCMS) 522 (M+H⁺).

Etap 4:

Produkt z Etapu 4 (0,3 g) dodano do roztworu 1/1H2O/MeOH (20 mL) i stałego NaHCO3 (242 mg, 5 ekwiw.). Po 18 godzinach mieszania w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną rozcieńczono przy użyciu EtOAc i warstwy rozdzielono. Warstwę wodną zakwaszono do pH 2 przy użyciu HCl 1,0 N i ekstrahowano przy użyciu EtOAc. Warstwę EtOAc przemyto solanką, po czym osuszono nad MgSO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując produkt XXVIIIf jako biały proszek (0,26 g). Widmo masowe (LCMS) 508 (M+H⁺).

Etap 5:

Produkt z Etapu 5 (0,15 g) rozpuszczono w CH2CI2 i poddano reakcji z HATU (0,137 g), NH4CI (0,08 g, 5 ekwiw.) i DIPEA (0,53 mL). Po upływie 2 godzin w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną rozcieńczono przy użyciu EtOAc, przemyto 10% roztworem kwasu cytrynowego, następnie nasyconym roztworem NaHCO3. Warstwę EtOAc przemyto solanką, po czym osuszono nad MgSO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując surową mieszaninę. Oczyszczanie metodą błyskawicznej chromatografii kolumnowej (30% acetonu, heksan, krzemionka) dało pożądany produkt XXVIII (0,096 g). Widmo masowe (LCMS) 507 (M+H⁺).

PL 206 255 B1

241

W temperaturze 0°C, do roztworu wyjś ciowego aldehydu (4,0 g) w CH2Cl2 (75 mL) dodano kwas octowy (2,0 ekwiw., 2,15 mL), a następnie izocyjanooctan metylu (1,1 ekwiw., 1,9 mL). Następnie mieszaninę reakcyjną stopniowo ogrzewano do temperatury pokojowej. Po upływie 18 godzin (po nocy), mieszaninę reakcyjną rozcieńczono przy użyciu EtOAc i przemyto nasyconym roztworem NaHCO3. Warstwę EtOAc przemyto solanką, następnie osuszono nad MgSO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując surową mieszaninę. Oczyszczanie metodą błyskawicznej chromatografii kolumnowej (30 do 40% EtOAc, heksan, krzemionka) dało produkt XXIXa (4,5 g).

Etap 2:

W temperaturze 0°C, do roztworu XXIXa (4,4 g) w THF (100 mL) dodano 26 mL (2,2 ekwiw.) 1,0 N roztworu LiOH. Mieszaninę reakcyjną mieszano w tej temperaturze przez 2 godziny, po czym ogrzano do temperatury pokojowej. Po upływie 2 godzin, mieszaninę reakcyjną zakwaszono do pH 2 roztworem 1,0 N HCl. Dodano EtOAc i rozdzielono warstwy. Warstwę EtOAc przemyto solanką, następnie osuszono nad MgSO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując produkt XXIXb (3,7 g).

242

PL 206 255 B1

Etap 3:

XXIXc

Kwas XXIXb poddano reakcji z aminą z Przykładu XV w sposób opisany poprzednio w Przykładzie XXI, Etap 4. Następnie otrzymany związek pośredni potraktowano HCl w sposób opisany poprzednio w Przykładzie XXIII, Etap 9, otrzymując produkt XXIXc.

Etap 4:

Kwas XXVIIIc (2,43 g) rozpuszczono w CH2CI2 i poddano reakcji z aminą XXIXc (2,47 g), HATU (2,5 g) i DIPEA (5,8 mL) w sposób opisany poprzednio w Przykładzie IX, Etap 2a, otrzymując, po oczyszczeniu metodą błyskawicznej chromatografii kolumnowej (4% MeOH, CH2CI2, krzemionka), pożądany produkt XXIXd (4,35 g). Widmo masowe (LCMS) 727 (M+H⁺).

PL 206 255 B1

243

Produkt z Etapu 4 (4,2 g) poddano reakcji z odczynnikiem Dessa-Martina (6,4 g) w sposób opisany poprzednio w Przykładzie Preparatywnym XX, Etap 7. Oczyszczanie metodą błyskawicznej chromatografii kolumnowej (100% EtOAc, krzemionka) dało 3 g produktu końcowego XXIX. Widmo masowe (LCMS) 725 (M+H⁺).

P r z y k ł a d XXX: Wytwarzanie związku o wzorze XXX:

Etap 1:

244

PL 206 255 B1

Alkohol 2-(trifluorometylo)propan-2-ol (1,28 g) poddano reakcji z węglanem N,N-disukcynoimidylu (3,84 g) i Et3N (4,2 mL) w suchym CH3CN (50 mL) przez 18 godzin. Mieszaninę rozcieńczono przy użyciu EtOAc (200 mL) i przesączono. Przesącz przemyto NaHCO3, solanką, następnie osuszono nad MgSO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując surową mieszaninę. Oczyszczanie metodą błyskawicznej chromatografii kolumnowej (50% EtOAc, heksan, krzemionka) dało pożądany produkt XXXa (0,3 g).

Etap 2:

Produkt z Przykładu XXIX (0,3 g) potraktowano przy użyciu 100 mL 4,0 N HCl w dioksanie. Po upływie 1 h dodano 200 mL Et2O i otrzymany osad odsączono i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując produkt XXXb (0,27 g) jako biały proszek. Widmo masowe (LCMS) 625 (M -HCl +H⁺).

Etap 3:

PL 206 255 B1

245

W temperaturze pokojowej, do roztworu XXXb (0,05 g) w CH2Cl2 (5 mL) dodano DIPEA (0,040 mL) XXXa (1,5 ekwiw., 0,030 g), a następnie 1 kryształek DMAP. Po 30 minutach mieszaninę reakcyjną rozcieńczono przy użyciu EtOAc (20 mL) i przemyto HCl 1,5 N, następnie NaHCO3, a następnie solanką. Warstwę EtOAc osuszono nad MgSO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując surową mieszaninę. Oczyszczanie metodą chromatografii preparatywnej (40% acetonu, heksan, krzemionka) dało pożądany produkt XXX (0,044 g). Widmo masowe (LCMS) 779 (M+H⁺).

P r z y k ł a d XXXI: Wytwarzanie związku o wzorze XXXI:

Etap 1:

A”

XXXI

Do roztworu XXXb (0,05 g) w CH2CI2 (5 mL) w temperaturze pokojowej dodano DIPEA (0,040 mL) i izocyjanian tert-butylu (1,2 ekwiw., 0,01 mL). Po upływie 18 godzin mieszaninę reakcyjną rozcieńczono przy użyciu EtOAc (20 mL) i przemyto HCl 1,5 N, NaHCO3 i solanką. Warstwę EtOAc osuszono nad MgSO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując surową mieszaninę. Oczyszczanie metodą chromatografii preparatywnej (100% EtOAc, krzemionka) dało produkt końcowy XXXI (0,021 g). Widmo masowe (LCMS) 724 (M+H⁺).

246

PL 206 255 B1

P r z y k ł a d XXXII: Wytwarzanie związku o wzorze XXXII:

Produkt z Przykładu XXVIII potraktowano w sposób opisany poprzednio w Przykładzie Preparatywnym XXX, Etap 2, otrzymując produkt XXXIIa. Widmo masowe (LCMS) 407 (M -HCl +H⁺).

PL 206 255 B1

247

Aminę XXXIIa poddano reakcji z XXXa w sposób opisany poprzednio w Przykładzie Preparatywnym XXX, Etap 3, otrzymując pożądany produkt XXXII. Widmo masowe (LCMS) 508 (M+H⁺).

P r z y k ł a d XXXIII: Wytwarzanie związku o wzorze XXXIII:

w Przykładzie XXXI, Etap 1, otrzymując produkt XXXIII. Widmo masowe (LCMS) 561 (M+H⁺). P r z y k ł a d XXXIV: Wytwarzanie związku o wzorze XXXIV:

XXXIV

Etap 1:

248

PL 206 255 B1

Do mieszaniny estru (6,0 g) i sit molekularnych (5,2 g) w bezwodnym chlorku metylenu (35 mL) dodano pirolidynę (5,7 mL, 66,36 mmol). Otrzymaną brunatną zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej pod osłoną atmosfery N2 przez 24 h, przesączono i przemyto bezwodnym CH3CN. Połączony przesącz zatężono, otrzymując pożądany produkt.

Etap 2:

Do roztworu produktu z poprzedniego etapu w CH3CN (35 mL) dodano bezwodny K2CO3, chlorek metallilu (2,77 g, 30,5 mmol), Nal (1,07 g, 6,7 mmol). Otrzymaną zawiesinę mieszano w temperaturze otoczenia pod osłoną atmosfery N2 przez 24 h. Dodano 50 mL lodowatej wody, a następnie 2 N roztwór KHSO4 aż pH wynosiło 1. Dodano EtOAc (100 mL) i mieszaninę mieszano przez 0,75 h. Połączone warstwy organiczne zebrano i przemyto solanką, osuszono nad MgSO4, i odparowano, otrzymując pożądany produkt.

Etap 3:

Produkt z poprzedniego etapu (2,7 g, 8,16 mmol) rozpuszczono w dioksanie (20 mL) i potraktowano świeżo wytworzonym 1 N roztworem LiOH (9 mL). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze otoczenia pod osłoną atmosfery N2 przez 20 h. Mieszaninę reakcyjną rozpuszczono w EtOAc i przemyto H2O. Połączoną fazę wodną ochłodzono do 0°C i zakwaszono do pH 1,65 przy użyciu 1 N HCl. Mętną mieszaninę ekstrahowano przy użyciu EtOAc (2 x 100 mL). Połączone warstwy organiczne przemyto solanką, osuszono nad MgSO4, zatężono, otrzymując pożądany kwas (3,40 g).

Etap 4:

Do zawiesiny NaBH(OAc)3 (3,93 g, 18,5 mmol) w CH2Cl2 (55 mL) dodano roztwór produktu z poprzedniego etapu w bezwodnym CH2CI2 (20 mL) i kwasie octowym (2 mL). Zawiesinę mieszano w temperaturze otoczenia przez 20 h. Do zawiesiny dodano lodowatą wodę (100 mL) i mieszano

PL 206 255 B1

249 przez 1/2 h. Warstwę organiczną oddzielono, przesączono, osuszono i odparowano, otrzymując pożądany produkt.

Etap 5:

Do roztworu produktu z poprzedniego etapu (1,9 g) w MeOH (40 mL) potraktowano nadmiarem roztworu CH2N2/Et2O i mieszano przez noc. Mieszaninę reakcyjną zatężono do suchej masy, otrzymując surowy pozostałość. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym, przy eluowaniu gradientem EtOAc/heksan, otrzymując 1,07 g czystego pożądanego produktu.

Do roztworu produktu z poprzedniego etapu (1,36 g) w bezwodnym CH2Cl2 (40 mL) potraktowano BF3^'Me2O (0,7 mL). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze otoczenia przez 20 h i reakcję zatrzymano nasyconym roztworem NaHCO3 (30 mL) i mieszano przez 1/2 h. Warstwę organiczną oddzielono i połączone warstwy organiczne przemyto solanką, osuszono nad MgSO4, zatężono, otrzymując surową pozostałość. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym przy eluowaniu gradientem EtOAc/heksan, otrzymując 0,88 g pożądanego związku.

Do roztworu produktu (0,92 g) z poprzedniego etapu w MeOH (30 mL) dodano 10% Pd/C (0,16 g) w temperaturze pokojowej i uwodorniano w temperaturze otoczenia pod ciśnieniem 1 atm. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 4 h i zatężono do suchej masy, otrzymując pożądany związek.

250

PL 206 255 B1

Pożądany produkt wytworzono zgodnie z procedurą w Przykładzie XXIII, Etap 10.

Pożądany kwas produkt wytworzono zgodnie z procedurą w Przykładzie XXIV, Etap 3. Etap 10:

XXXIV

Pożądany produkt XXXIV wytworzono zgodnie z procedurą w Przykładzie XXIX, Etapy 4-5. P r z y k ł a d XXXV: Wytwarzanie związku o wzorze XXXV:

PL 206 255 B1

251

Etap 1:

Roztwór fosfonianu trietylu (44,8 g) w THF (30 mL) w temperaturze 0°C potraktowano 1 M roztworem (200 mL) bis(trimetylosililoamidku) sodu w THF. Otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 0,5 godziny, a następnie ochłodzono do 0°C. Dodano kroplami roztwór ketalu etylenowego 1,4-cykloheksanodionu (15,6 g) w THF (50 mL), i otrzymany roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 0°C, potraktowano zimnym wodnym roztworem kwasu cytrynowego, i mieszaninę ekstrahowano przy użyciu EtOAc. Ekstrakt przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3, następnie solanką; następnie osuszono nad bezwodnym Na2SO4, przesączono, i przesącz odparowano. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym, przy eluowaniu gradientem CH2Cl2/EtOAc, otrzymując związek tytułowy (21 g), 92% wydajności. Widmo masowe (FAB) 227,3 (M+H⁺).

Etap 2:

Produkt z poprzedniego etapu (20 g) rozpuszczono w EtOH (150 mL) i potraktowano 10% Pd/C pod ciśnieniem 1 atm wodoru przez 3 dni. Mieszaninę przesączono i przesącz odparowano, otrzymując związek tytułowy (20,3 g), 100% wydajności. Widmo masowe (FAB) 229,2 (M+H⁺).

Etap 3:

Produkt z poprzedniego etapu (20 g) rozpuszczono w MeOH (150 mL) i potraktowano roztworem LiOH (3,6 g) w wodzie (50 mL). Mieszaninę mieszano przez 18 godzin, i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w zimnej wodzie (100 mL), roztwór zakwaszono do pH 2-3 przy użyciu 5 N HCl, i otrzymaną mieszaninę ekstrahowano przy użyciu EtOAc. Ekstrakt osuszono nad bezwodnym Na2SO4, przesączono, i przesącz odparowano, otrzymując związek tytułowy (17,1 g), 97% wydajności. Widmo masowe (FAB) 201,2 (M+H⁺).

252

PL 206 255 B1

1. Produkt z poprzedniego etapu (3,0 g) rozpuszczono w Et2O (150 mL), potraktowano Et3N (2,1 mL), i roztwór ochłodzono do -78°C. Dodano kroplami chlorek piwaloilu (1,85 mL), i po 0,25 godziny dodatkowego mieszania reakcję zostawiono do ogrzania do 0°C przez 0,75 godziny, a następnie ochłodzono ponownie do -78°C, otrzymując roztwór mieszanego bezwodnika do reakcji w części 2.

2. Roztwór (S)-4-benzylo-2-oksazolidynonu (2,66 g) w THF (22 mL) ochłodzono do -78°C, i dodano kroplami 1,6 M roztwór (9,38 mL) n-butylolitu w heksanie. Po upływie dodatkowo 0,33 godziny mieszania w tej temperaturze, roztwór przeniesiono igłą do zimnego roztworu z części 1. Mieszaninę mieszano w temperaturze -78°C, następnie ogrzano do 0°C i mieszano w tej temperaturze przez 0,5 godziny. Warstwę organiczną oddzielono, warstwę wodną ekstrahowano przy użyciu Et2O, połączone fazy organiczne przemyto solanką, osuszono nad bezwodnym Na2SO4, przesączono, i przesącz odparowano. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym, przy eluowaniu gradientem heksanu/EtOAc (9:1), otrzymując związek tytułowy (5,0 g), 93% wydajności. Widmo masowe (FAB) 360,4 (M+H⁺).

Etap 5:

Produkt z poprzedniego etapu (2,7 g) rozpuszczono w THF (25 mL), ochłodzono do -78°C, przeniesiono igłą do roztworu 0,5 M bis(trimetylosililo)amidku potasu/toluenu (16,5 mL) w THF (25 mL) w temperaturze -78°C, i otrzymany roztwór mieszano w temperaturze -78°C przez 0,75 godziny. Do tego roztworu dodano igłą roztwór azydku trisylu (3,01 g) w THF (25 mL) wcześniej ochłodzony do -78°C. Po upływie 1,5 minuty reakcję zatrzymano kwasem octowym (1,99 mL), mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej, a następnie mieszano przez 16 godzin. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono przy użyciu EtOAc (300 mL), i przemyto 5% wodnym roztworem NaCl. Fazę wodną ekstrahowano przy użyciu EtOAc, połączone fazy organiczne przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3, następnie solanką; następnie osuszono nad bezwodnym Na2SO4, przesączono, i przesącz odparowano. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym, przy eluowaniu EtOAc/heksanem (1:3), otrzymując związek tytułowy (2,65 g), 88% wydajności.

Etap 6:

PL 206 255 B1

253

Produkt z poprzedniego etapu (11,4 g) rozpuszczono w 95% kwasie mrówkowym (70 mL) i mieszają c ogrzewano w temperaturze 70°C przez 0,5 godziny. Roztwór odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, i pozostałość rozpuszczono w EtOAc. Roztwór przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3, następnie solanką; następnie osuszono nad bezwodnym Na2SO4, przesączono, i przesącz odparowano. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym, otrzymując związek tytułowy (8,2 g).

Produkt z poprzedniego etapu (8,2 g) rozpuszczono w CH2CI2 (16 mL) i traktowano trifluorkiem dietyloaminosiarki (DAST, 7,00 mL) w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Mieszaninę reakcyjną wylano do wody z lodem (200 cm³), i ekstrahowano przy użyciu CH2CI2. Ekstrakt przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3, następnie solanką; następnie osuszono nad bezwodnym Na2SO4, przesączono, i przesącz odparowano. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym, przy eluowaniu EtOAc/heksanem (15:85), otrzymując związek tytułowy (4,5 g), 52% wydajności.

Etap 8:

F F F F

Produkt z poprzedniego etapu (3,7 g) rozpuszczono w mieszaninie THF (150 mL) i wody (48 mL), ochłodzono do 0°C, potraktowano 30% H₂O₂ (3,95 mL), a następnie LiOH-H₂O (0,86 g). Mieszaninę mieszano przez 1 godzinę w temperaturze 0°C, po czym reakcję zatrzymano roztworem Na2SO3 (5,6 g) w wodzie (30 mL), a następnie dodano roztwór 0,5 N NaHCO3 (100 mL). Mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do 1/2 objętości, rozcieńczono wodą (do 500 mL), i ekstrahowano przy użyciu CH2Cl2 (4 x 200 mL). Fazę wodną zakwaszono do pH 1-2 przy użyciu 5 N HCl, i ekstrahowano przy użyciu EtOAc (4 x 200 mL). Ekstrakt przemyto solanką; następnie osuszono nad bezwodnym Na2SO4, przesączono, i przesącz odparowano, otrzymując związek tytułowy (1,95 g), 91% wydajności, który zastosowano bezpośrednio w następnym etapie.

Etap 9:

Produkt z poprzedniego przykładu (2,6 g) rozpuszczono w Et2O (50 mL) i potraktowano kroplami roztworu CH2N2 w Et2O, aż roztwór pozostawał żółty. Roztwór mieszano przez 18 godzin, następnie odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując związek tytułowy (2,8), który zastosowano bezpośrednio w następnym etapie.

254

PL 206 255 B1

Etap 10:

F F F F

Produkt z poprzedniego etapu (1,95 g) rozpuszczono w MeOH (150 mL), potraktowano kwasem mrówkowym (1,7 mL), następnie potraktowano 10% Pd/C (3,3 g, typ Degussa E101) pod ciśnieniem 1 atm wodoru przez 1,5 godziny. Mieszaninę przesączono i przesą cz odparowano, otrzymują c zwią zek tytułowy (2,1 g) jako sól kwasu mrówkowego, którą zastosowano bezpośrednio w następnym etapie.

Etap 11:

Produkt z poprzedniego etapu (2,1 g) rozpuszczono w 1,4-dioksanie (100 mL) i dodano diwęglan di-tert-butylu (1,9 g), a następnie diizopropyloetyloaminę (2,9 mL). Roztwór mieszano przez 18 godzin, i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość potraktowano wodnym 5% roztworem KH2PO4 i mieszaninę ekstrahowano przy użyciu EtOAc. Ekstrakt przemyto solanką; następnie osuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono, i przesącz odparowano. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym, przy eluowaniu gradientem CH2Cl2/Et2O, otrzymując związek tytułowy (2,5 g), 99% wydajności. Widmo masowe (FAB) 307,9 (M+H⁺).

Etap 12:

Produkt z poprzedniego etapu (2,5 g) rozpuszczono w 1,4-dioksanie (35 mL), potraktowano wodnym roztworem 1 M LiOH (17 mL), i mieszano przez 2 godziny. Reakcję zatrzymano przy użyciu wody z lodem (125 cm³), mieszaninę zakwaszono do pH 3-4 przy użyciu 3 N HCl, i ekstrahowano przy użyciu EtOAc. Ekstrakt osuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono, i przesącz odparowano, otrzymując związek tytułowy (2,3 g), 96% wydajności. Widmo masowe (FAB) 294,0 (M+H⁺).

PL 206 255 B1

255

Pożądany produkt wytworzono zgodnie z procedurą w Przykładzie XXIII, Etap 10. Etap 14:

Pożądany produkt kwasowy wytworzono zgodnie z procedurą w Przykładzie XXIV, Etap 3. Etap 15:

256

PL 206 255 B1

Pożądany produkt kwasowy wytworzono zgodnie z procedurą w Przykładzie XXIX, Etap 4.

P r z y k ł a d XXXVI. Wytwarzanie związków o wzorach XXXVI i XXXVIII:

Związki o wzorach XXXVI i XXXVIII wytworzono zgodnie z poniższym schematem, wykorzystując omówione wyżej Przykłady Preparatywne 11 do 15.

Związek o wzorze XXXVIb wytworzono znanymi procedurami ze związku o wzorze XXXVIa, jak następuje:

XXXVIa XXXVIb

Do roztworu związku XXXVIa (6,58 g, 22 mmol) w 100 mL MeOH dodano 10% Pd/C (0,8 g) i kwas p-toluenosulfonowy (4,2 g). Mieszaninę reakcyjną poddano uwodornieniu w temperaturze pokojowej przez noc. Mieszaninę reakcyjną przesączono przez celit i przemyto nadmiarem MeOH. Połączony przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując związek tytułowy XXXVIb jako substancję gumowatą. Przekształcenie XXXVIb w XXXVI i XXXVII nastąpiło zgodnie ze szlakiem syntetycznym pokazanym wyżej na schemacie i zgodnie z przykładami preparatywnymi 11-15.

P r z y k ł a d XXXVIII. Wytwarzanie związku o wzorze XXXVIII:

Związek o wzorze XXXVIII wytworzono przy zastosowaniu następującego schematu, postępując zgodnie z Przykładami Preparatywnymi 11 do 15 omówionymi wcześniej.

PL 206 255 B1

257

258

PL 206 255 B1

Roztwór chlorku sulfonylu XXXIXa wytworzony procedurą z publikacji H. Mcklwain (J. Chem. Soc. 1941, 75) dodano kroplami do mieszaniny 1,1 równoważnika tert-butylometyloaminy i trietyloaminy w temperaturze -78°C i mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 h. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i oczyszczono metodą chromatografii (SiO2, heksan/aceton 4:1), otrzymując sulfonamid XXXIXb jako bezbarwny olej.

Etap 2:

Roztwór zabezpieczonej grupą Cbz aminy XXXIXb rozpuszczono w metanolu i potraktowano 5% mol. Pd/C (5% wagowo) i uwodorniano pod ciśnieniem 60 psi (414 kPa). Mieszaninę reakcyjną przesączono przez warstwę celitu i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując wolną aminę XXXIXc, która stojąc zestaliła się.

Etap 3:

Hydroksysulfonamid XXXIXd zsyntetyzowano podobnie do procedury syntezy XXVf, z tym wyjątkiem, że aminę XXVd zastąpiono przez XXXIXc. Surową mieszaninę reakcyjną zastosowano bezpośrednio do następnej reakcji.

Etap 4:

XXXIXd XXXIX

Hydroksyamid XXXIXd utleniono do związku XXXIX przy użyciu odczynnika Dessa-Martina, postępując zgodnie z procedurą syntezy XXV (Etap 5). Surową mieszaninę oczyszczono metodą chromatografii (SiO2, aceton/heksan 3:7), otrzymując XXXIX jako bezbarwną substancję stałą.

Oznaczenie aktywności hamowania proteazy HCV:

Oznaczenie spektrofotometryczne: Oznaczenie spektrofotometryczne proteazy serynowej HCV przeprowadzono na związkach według wynalazku postępując zgodnie z procedurą opisaną w publikacji R. Zhang i in., Analytical Biochemistry, 270 (1999) 268-275, której ujawnienie stanowi odnośnik dla niniejszego. Oznaczenie oparte na proteolizie substratów estrów chromogennych jest przydatne do ciągłego kontrolowania aktywności proteazy NS3 HCV. Substraty pochodziły ze strony P sekwencji połączenia NS5A-NS5B (Ac-DTEDWX (Nva), gdzie X = A lub P), której C-końcowe grupy karboksylowe zostały zestryfikowane jednym z czterech różnych chromoforycznych alkoholi (3- lub 4-nitrofenol, 7-hydroksy-4-metylo-kumaryna, lub 4-fenyloazofenol). Poniżej przedstawiona jest synteza,

PL 206 255 B1

259 charakterystyka i zastosowanie tych nowych substratów estrów spektrofotometrycznych do badania przesiewowego o wysokiej przepustowości oraz szczegółowej oceny kinetycznej inhibitorów proteazy NS3 HCV.

Materiały i sposoby:

Materiały: Reagenty chemiczne do buforów związanych z oznaczeniem otrzymano z firmy Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri). Reagenty do syntezy peptydów pochodziły z firmy Aldrich Chemicals, Novabiochem (San Diego, California), Applied Biosystems (Foster City, California) i Perseptive Biosystems (Framingham, Massachusetts). Peptydy zsyntetyzowano ręcznie lub na zautomatyzowanym syntetyzatorze ABI model 431A (z firmy Applied Biosystems). Spektrometr UV/VIS model LAMBDA 12 pochodził z firmy Perkin Elmer (Norwalk, Connecticut), a płytki UV o 96 studzienkach otrzymano z firmy Corning (Corning, New York). Blok do ogrzewania pochodził z firmy USA Scientific (Ocala, Florida), a wytrząsarka do płytek o 96 studzienkach pochodziła z firmy Labline Instruments (Melrose Park, Illinois). Czytnik płytek mikrotitracyjnych Spectramax Plus z monochromatorem otrzymano z firmy Molecular Devices (Sunnyvale, California).

Wytwarzanie enzymów: Rekombinacyjną heterodimeryczną proteazę NS3/NS4A HCV (szczep 1a) wytworzono przez zastosowanie procedur opublikowanych poprzednio (D. L. Sali i in., Biochemistry, 37 (1998) 3392-3401). Stężenia białek określano metodą barwnikową Biorad przy użyciu wzorców rekombinacyjnej proteazy HCV poprzednio zmierzonej ilościowo metodą analizy aminokwasów. Przed rozpoczęciem oznaczenia bufor do przechowywania enzymu (50 mM fosforanu sodu pH 8,0, 300 mM

NaCl, 10% gliceryny, 0,05% maltozydu laurylu i 10 mM DTT) zastąpiono buforem testowym (25 mM

MOPS pH 6,5, 300 mM NaCl, 10% gliceryny, 0,05% maltozydu laurylu, 5 μΜ EDTA i 5 μΜ DTT) wykorzystując wstępnie napełnioną kolumnę Biorad Bio-Spin P-6.

Synteza i oczyszczanie substratów: Syntezę substratów przeprowadzono jak opisano w publikacji R. Zhang i in., (ibid.) i zainicjowano przez zakotwiczenie Fmoc-Nva-OH do żywicy z chlorkiem 2-chlorotritylu, stosując normalną procedurę (K. Barlos i in., Int. J. Pept. Protein Res., 37 (1991), 513-520). Peptydy składano kolejno, stosując chemię Fmoc, albo ręcznie albo na automatycznym syntetyzatorze peptydów ABI model 431. N-Acetylowane i w pełni zabezpieczone fragmenty peptydów odszczepiano od żywicy albo działaniem 10% kwasu octowego (HOAc) i 10% trifluoroetanolu (TFE) w dichlorometanie (DCM) przez 30 min, albo działaniem 2% kwasu trifluorooctowego (TFA) w DCM przez 10 min. Połączony przesącz i popłuczyny w DCM odparowano azeotropowo (lub wielokrotnie ekstrahowano wodnym roztworem Na2CO3) w celu usunięcia kwasu użytego przy rozszczepianiu. Fazę DCM osuszono nad Na2SO4 i odparowano.

Substraty estrowe składano stosując standardowe procedury sprzęgania kwas-alkohol (K. Holmber i in., Acta Chem. Scand., B33 (1979) 410-412). Fragmenty peptydów rozpuszczono w bezwodnej pirydynie (30-60 mg/mL), do której dodano 10 równoważników molowych chromoforu i katalityczną ilość (0,1 ekwiw.) kwasu para-toluenosultonowego (pTSA). Dodano dicykloheksylokarbodiimid (DCC, 3 ekwiw.) w celu zainicjowania reakcji sprzęgania. Tworzenie produktu kontrolowano metodą HPLC i stwierdzono, że jest zakończone po 12-72 godzinach reakcji w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik pirydynę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i dalej usunięto metodą odparowania azeotropowego z toluenem. Ester peptydu odbezpieczono przy użyciu 95% TFA w DCM przez dwie godziny i ekstrahowano trzykrotnie bezwodnym eterem etylowym w celu usunięcia nadmiaru chromoforu. Odbezpieczony substrat oczyszczono metodą HPLC z odwróconymi fazami na kolumnie C3 lub C8 z gradientem 30% do 60% acetonitrylu (przy użyciu sześciu objętości kolumny). Wydajność całkowita po oczyszczeniu HPLC wynosiła w przybliżeniu 20-30%. Masa cząsteczkowa została potwierdzona metodą spektroskopii masowej z jonizacją w trybie elektrorozpylania. Substraty przechowywano w postaci suchego proszku w eksykatorze.

Widma substratów i produktów: Widma substratów i odpowiadających im produktów chromoforycznych otrzymywano w buforze testowym o pH 6,5. Współczynniki absorbancji wyznaczano przy optymalnej długości fali poza pikiem w kuwetach 1 cm (340 nm dla 3-Np i HMC, 370 nm dla PAP i 400 nm dla 4-Np) przy użyciu metody wielokrotnych rozcieńczeń. Optymalną długość fali poza pikiem zdefiniowano jako tę długość fali, dla której uzyskuje się maksymalną ułamkową różnicę absorbancji między substratem i produktem (produkt OD - substrat OD)/substrat OD).

Oznaczenie proteazy: Oznaczenia proteazy HCV przeprowadzono w temperaturze 30°C przy użyciu 200 μl mieszanki reakcyjnej na płytce mikrotitracyjnej o 96 studzienkach. Warunki buforu testowego (25 mM MOPS pH 6,5, 300 mM NaCl, 10% gliceryny, 0,05% maltozydu laurylu, 5 μM EDTA i 5 μM DTT) były zoptymalizowane dla heterodimeru NS3/NS4A (D. L. Sali i in., ibid.)). Typowo,

260

PL 206 255 B1

150 μl mieszaniny buforu, substratu i inhibitora umieszczano w studzienkach (stężenie końcowe

DMSO 4% obj.) i zostawiano do wstępnej inkubacji w temperaturze 30°C przez w przybliżeniu minuty. Następnie do zainicjowania reakcji stosowano pięćdziesiąt μl uprzednio ogrzanej proteazy (12 nM, 30°C) w buforze testowym (objętość końcowa 200 μθ. Płytki kontrolowano przez cały czas trwania oznaczenia (60 minut), mierząc zmianę absorbancji przy odpowiedniej długości fali (340 nm dla 3-Np i HMC, 370 nm dla PAP, i 400 nm dla 4-Np) przy użyciu czytnika płytek mikrotitracyjnych Spectromax Plus wyposażonego w monochromator (dopuszczalne wyniki można otrzymać przy czytnikach płytek, które wykorzystują filtry progowe). Rozszczepianie proteolityczne wiązania estrowego między Nva i chromoforem kontrolowano przy odpowiedniej długości fali wobec ślepej próby bez enzymu jako próby porównawczej dla uwzględnienia hydrolizy nieenzymatycznej. Ocenę parametrów kinetycznych substratów prowadzono na trzydziestokrotnym zakresie stężenia substratu (~ 6-200 μM). Szybkości początkowe wyznaczano stosując regresję liniową i stałe kinetyczne otrzymano korelując dane równaniem Michaelisa-Mentena przy użyciu analizy regresji nieliniowej (Mac Curve Fit 1.1, K. Raner). Wydajności obrotu katalitycznego (kcat) obliczano przy założeniu pełnej aktywności enzymu.

Ocena inhibitorów i inaktywatorów: Stałe hamowania (Ki) dla inhibitorów konkurencyjnych Ac-D-(D-Gla)-L-I-(Cha)-C-OH (27), Ac-DTEDVVA(Nva)-OH i Ac-DTEDVVP (Nva)-OH wyznaczano doświadczalnie przy ustalonych stężeniach enzymu i substratu wykreślając vo/vi w odniesieniu do stężenia inhibitora ([I]o) zgodnie z przegrupowanym równaniem Michaelisa-Mentena dla kinetyki hamowania konkurencyjnego: vo/vi = 1 + [I]o/(Ki(1 + [S]o/Km)), gdzie vo oznacza szybkość początkową bez hamowania, vi oznacza szybkość początkową w obecności inhibitora przy danym stężeniu inhibitora ([I]o) i [S]o oznacza zastosowane stężenie substratu. Otrzymane dane skorelowano przy użyciu regresji liniowej i otrzymane nachylenie, 1/(Ki(1 + [S]o/Km), zastosowano do obliczenia wartości Ki*.

Otrzymane wartości Ki* dla różnych związków według niniejszego wynalazku są podane w wyżej wymienionej Tabeli, w której związki ułożono w porządku zakresów wartości Ki*. Na podstawie tych wyników testów specjalista pojmie, że związki według wynalazku mają wyśmienitą przydatność jako inhibitory proteazy serynowej NS3.

Podczas gdy niniejszy wynalazek został opisany w połączeniu z konkretnymi wariantami wykonania przedstawionymi powyżej, specjaliści dostrzegą wiele jego alternatyw, modyfikacji i innych odmian. Wszystkie takie alternatywy, modyfikacje i odmiany mają być objęte duchem i zakresem niniejszego wynalazku.

PL 206 255 B1

261

Tabela 2

N_r Ciężar

Przykładu Struktura cząsteczkowy

1	A,· S -	691.7853
2	ć c	627.7441
3	Yf ν^	754.8883
4	A? Ł i °s	527.6259
5	Ap rA z om os	698.7799
	r-zCĆp o Ά~ <	631.7352
6	>· o
7	Z-Af° *>^c' A ° s CH,	381.476

262

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

8	-	540.6626
9	ν ο^ύ OH	498.5813
10	O « 5/¼ o? *	633.7482
11	oΎ £> ^A-\y o_K °S	641.7249
12	A&T . l, °«n-f °\ cm,	641.7249
13	*$-. °> H,C	683.8061
14	αΎ¹ γα X? °Χγ w z~° H.C	637.7802

PL 206 255 B1

263

c.d. Tabeli 2

15	X ° <y • r~° >C	637.7802
16	o	637.7802
17	AA/P·. o 'c*S	625.769
18	HO	613.6707
19	'YYa. . •ł^c \_^ .—<( Ύο~ «5	613.6707
20	- z-M o y~ >< r\^ KO	627.6978
21	>O	609.726

264

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

22	HO	609.726
23	~Λ° 'i ₀T-l,o “ o >v </\_^	609.726
24	/S ~C o C >^Ζ c> \_\-CH» MO	611.742
25	Γ O H ^r i HX	600.7183
26	cr~TĆP N J	554.7361
27	^rp-o Ύ», JT N J	478.5937
28	xtY? °S O^N N $ V	546.7132

PL 206 255 B1

265

c.d. Tabeli 2

29	g w? CH, cX\j N . $	562.7562
30	o ^cM> oA. H J	699.8519
31	crXvA_P k-CH.r ° / M $	643.7435
32	W, 8 °v^kxp^N'ż'O °^H J °i^N H,C^/ jS®° o=< N J	509.6077
33	V J-( V* A Λ\_/ «Λ”· “A.OS	637.7802
. 34	‘A V o~ «Λ»,	637.7802
35	V· z-H, „ “S H-C a \_ζ “Άο.,	579.6995

266

PL 206 255 B1

c.d..Tabeli 2

36	°Ύ«η,	537.6619
37	λλΜ. I A—ν ^θ H.C CH	539.6342
38	λρϋι. %> )-γ φ HP\n,	597.7149
39	π>% Ο 0 7 U Μ X MM ο ο^Μ^{ν 0}	493.6055
40	'ΤΧ-Χ— ^θ<~χΝ Ο	632.8044
41	σ-φν-ϊ 5/ 1 \=*0 / ρο ο	747.8965
42	ο ηζ-Μ^'^ΤΓ' PU <Λν ^K>^c-~Pp° Μ \|	523.6348

PL 206 255 B1

267

c.d. Tabeli 2

43	oąFr o os M,C	598.7024
44	cYWA— γ ° £ Aj, »,=-γ ot,	578.712
45	Aa- b AoA	495.6214
46	Aj CK, o g V ^aWó o X '—J	627.7878
47	° ° Y	541.6501
48	«η YYyo o ° ' i	543.666
49	o Λ YMMi” ° ° ó	501.5847

268

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

50	A	656.7394
⁵¹	O^WiA ch, z MjC CH,	578.712
⁵²	<> / % ° Z ⁰ Λς A	725.8901
53	AiVrV^JL^°' 5’	584.6782
54	ν^Α ° X° H,C' CH,	538.6467
55	PA/A „ZZ □A Ά CZ °	685.8248
I \| 56	z °_VŃ f»A AZ _o %-ⁿ AA5 O — HjC CH,	527.6695

PL 206 255 B1

269

c.d. Tabeli 2

57		810.9557
58	OH _o. A o A-n o	552.6737
59	w o A ____N ΆΤ o iTrpó ó	592.7391
60	•sYysAtj cA ^^/α>*⁰ N 3	534.702
61	Aa c o 1	653.8232
62	o, z /—o „•K y·^ Ά O 8	696.892
63	X 0 8 A a Ύ'	606.7662

270

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

64	CA ^’^γτΓ^ν>^Αι<'^^Αο— y- °i ° H,C	643.7435
65	αΥΥΛ . °<y-^N «η CH, /·'< Xc/ «i	742.8771
66	γ· ,?^m-V“· n s s ΥΥγΥ'Α» u y^ ° < ° CM,	747.8965
67		747.8965
68	o P • ó	761.9236
69	Ω P ^οΛΑΑ> p_o o ⁰³ ° «aĄVysA. • ”ó	747.8965
70	o P sAPyę Λ _n“ *> oX ^rW ~Y O 0-0 K,C	733.913

PL 206 255 B1

271

c.d. Tabeli 2

⁷¹	’Ó	746.9118
72	Q P ° °Ó	646.7935
73	o θ Λ o «η oAAjA^YsAn ’ °ó	746.9118
⁷⁴	o—' P yΛ Λ ΌΛ HC y o X— w Y^Sę>	668.8782
⁷⁵	OH v_So_v rk r o Pt H,*-] o %-N ^vo%	628.8129
⁷⁶	r	760.9792
I 77	O «Λ . Cr° YyM ó Y	818.0723

272

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

78	,Λ r o A w-	761.964
79	o ® .ΛίΑ Λ ' “^AV-xVxo	844.0702
80	O P Τ’ 1 I O T f O g “ ° ₀ΑΑΧ«'^'γ^Α'=« ° °Ó	753.9443
81		844.0702
82	AĄw.	753.9443
83	O p ° °ó	747.8965
84	o p^ w. ⁰ οΑρΑΑ'^'Α • ‘0	804.0049

PL 206 255 B1

273

c.d. Tabeli 2

85	• ‘0	879.2858
86	η P o C CM, i ° ° ° ^a ° αΧ.'ΧΧχ'^ιΑ'^^⁰ • ’ό	823.1774
87	A? _r. Cr JL o * ° M,C'^X O ^oxtS3 Ό O	832.0994
88	X -> o X- r o *s^cZX g V	775.9911
89	γ·ΧΑ.γΰ. • Ó	725.8901
90	PC X yA r- CC M,cX\| O %-N x%	698.9483
91	OH ”·% y»A Γ o rC Η,ο'^η o Ύ—N Ύχγ	642.84

274

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

	γ», H.C	O ZĄ	Y	853.0995
92
	o O, o	o 2) .o-/ r A r*	Y	789.9778
93
	,9	o_P		809.9682
94	cyr OH
	e ηρ	y> y λ		878.8583
	_oXy= = OH		‘i
95
	<ΧΛΧ o	Z /—\ a '^lq^z< f o		772.006
96
	⁰ ΊΓ	A ΓΛ A	r	761.9672
	CK, o
		ć
97
	Κ,γχ^,Α^Αγ.	</h y^o ηρ i m	o »,JL_	728.85
		o o	5
98

PL 206 255 B1

275

c.d. Tabeli 2

99	Ćk O	828.0239
100	pYi. X o n ° K.C'^1 θ ν-’* γΛφ₅	789.0334
101	φ y -^Χ Γ ₀ r% ° tyr'') Β ν' w	775.0063
102	X Ou y ó V*“	886.1102
103	n ° i* r~\ Γ’ ΧΧ« ’ „ΧΑΡ'ΜΖ’χΑα ~ ⁰ 0	880.8306
104	Pi <3^ XnJ&cJXp.	855.0718
105		790.7047

276

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

106	” c, ° rY 3 '· · ό	821.0543
107	° ΊΓ 1Γ~*C vA7n „S °s ° a/a^yA • ó	685.7812
108	o y''} FS JGC ® Υ,Χγ^γγΑ ~ ⁰ °0	891.8973
109	O r-\' en, ° T*‘ “· ° AA/zy/. • 0	775.0063
110	r—, ⁰ Y ΑΑΑΥΥγ^Α A o w, • -Ó	785.0452
111	X H.C A ^'“'CH o / O O A i o Of . ^c i *^jX ^”	789.0334
112	Ύ o r% s '«. r = vv V] i<^jl ^-ⁿ	803.0605

PL 206 255 B1

277

c.d. Tabeli 2

113	ΓΑ p I l ⁰ Α'Ρ 0 Ά I ' °	1 862.4689
114	PA o Η,Υ ’ Λ V^= I - J .\p i °	884.1323
115	Ά p LM, ° Ά	889.5384
¹¹⁶	rXYp? - ’ ó	887.1794
¹¹⁷	o f- \ °s I pA App / o a, I ° y», ° AĄAry Ά° ^v ’O	831.071
¹¹⁸	o Ρ~\'’^ °S I YAArY Λ _r ° y-os »ΛΛΑγΧ. I ^v ° °ó	830.0863
119 I	γΑγγ Ρ P- o A ‘οΑγΡγΧ ’ Ό	858.1405

278

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

120	ί ^{3 łsc}'N^x°-_c	874.1399
121	Op o V · Oy ⁰¹ χχο 1 °	904.1227
122	I °kx “*>(· AO^xyc	929.195
¹²³		873.0867
¹²⁴	• ‘0	872.1019
¹²⁵	’ 'O	900.1561
I 126 I	-s ΟΏ WT/. 7< ' Ό	860.11

PL 206 255 B1

279

c.d. Tabeli 2

127	] i ° ^0,1 ° °0	804.0016 I
128	Cw/Y - ⁰ Λ/γΑγΑ. ° °ó	803.0169
129	d 5 τ rP ?* —νψγγ A o •'S^ “ »A AiZdCA⁰” “0	831.071
130	• Ό	806.0612
131	HyO , “•'y^oAi-Tj-jCz Tg „ · οΑ.Αρ/.-γ-γΑο ’ ’G	749.9528
132	T, “· ° οΑΑΆ«Ά'γΑ₀ ° Ό	748.9681
133	fl I /- \ ³ νγ-.ΑΤγ*γ > „ γ' “s ⁰ οΑΑγΑ,^γ-%Α_ο ° “Ó	777.0223

280

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

134	» ,ΑΛγΥ''γγΆ • ό	842.1382
135	/~-ι o ^γ^ f-Ar*^s ę^s X 0 OH ° «Τ υ„ύΥ^ο ⁰ °0	786.0299
136	/X ° ?*» λΧΑΧ/Ζ X 3 ^Η·'γ~· - „ΑΧΥγΧ· • Ó	813.0994
137	ClCCy x’„ o ,,ΑΖγΧ,--- ‘ Ό	829.0988
138	^α-Ύγ ” ό	788.0022
139	/·*-, O 0 Ot, ΥΜΧγΥ X o ’ό	815.0717
140	JX ***» ο _ο<^_Ν>χγΑ_Μ>>-γ«γ<_Ϊ0 • ·ό	846.1265

PL 206 255 B1

281

c.d. Tabeli 2

141	U ° ο^ΛΛ'-Χγ⁰ ' ’ό	790.0181
142	“S ° oA.yPs.-~ypo ° °ό	817.0876
143	« ° ο Ayy.-~yys> ° °ό	833.087
144	•^Όφ Ο ρχγ - TPy ° γ	911.2017
145	Oy.O yp “2 Pyp	931.1921
146	ΥΑ ί Ο 1 Ο Ο Ot, <° ν y.,	844.1106
147	cgyw%- . °s	788.0022

282

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

148	O 0 ° k ⁰ 0 A”	815.0717
149		817.0876
150	n, ę ίΤΤ	831.1147
151		819.0599
152		833.087
153	α&> .i,/'·-:· ’Ó	829.0988
154	o n	845.0981

PL 206 255 B1

283

c.d. Tabeli 2

	A			816.0784
	( / \ -A	A
			γ tc
	P °^u h,A°	S
155
	•ν/· A	f	2)	773.0125
		o o X«JU	p
			Y '“
	yA Ά’	CK,
156
	Λ “*	r		787.0396
	< / \Ά	P 0 X	p
			Y “
	P’ ° ,c-T °s	°S
157
	9 s C) <1.	JL-Jy?	3	850.0959
	My 5 Ί
	y/S °	Ί ° CH,
158
	o			807.03
	> s %	(f
	o A	X«JL·	A
	A	CH,	Υ Ή 0
159
	o			821.0571
	> 5	r
		o o	ćr
	pA °	L o os	Y “*> o
160
	o			793.9876
	) oP	PP
	A ° Λ° A	s° CH,	□
161

284

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

162	I Z^-CK ___ nh i -9	I 759.9701
163	ęY° ° s ° ° - -r	767.9714
164	Q_v5^V^y'^'’^^oh O⁴- ° S ° ° / ^CH> -Γ	711.863
¹⁶⁵	Y yA ° r - >A	712.8506
¹⁶⁶	₂ :Ά M,C p o N I W	712.8506
¹⁶⁷	^v>y—I r o >a h,c η o y-* \| v%	817.0876
168 I	x% I	817.0876

PL 206 255 B1

285

c.d. Tabeli 2

169	O Γ - CA _σ =¾^ ^Tc%	817.0876
170	Q / OŁ γ _νΛ r X - S-A O V« 'Yż	817.0876
171	«ί z**\ -J n \ _$ CM, °S ⁰ -γ^ο o o X.	777.0223
172	O CM, »Μγ^^>γ-γ T a • ’Ó	777.0223
173	w-C γ y Ω ° Ύ /--Y ^0<C' °	801.0882
174	“yY-SyP'// - · '0	919.9515
175	Φ ss^ %++αΎύ t o /UL,, “ ΥΛ/ν^γΚ z « °(5	919.9515

286

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

176	/ © O m \|g r	892.8821
177	'^ζγν'Υγ A o « .,ΑΧγίΟ ° AΑγΑ,^^-γ*·γΑ₀	892.8821
178	XaO _t Α^ζΖΧ' zgI oCmJ ·. - _ΒΑ,,ΛγΛ'*·γ γΑ ° Ό	818.0723
179	e»C~S«H, / )	761.964
180	Η«φ^Ο U ° ₀<^Αγ^^γ«^Α₀ “ °ó	789.0334
181	Α^ΤγΤγΒ P5 S.Ł.jr», W, o _βΑ_#ΑγΑγγ>γΛ>_φ O ·	789.0334
182	-pyD _r ^Λγχτχ /¾	820.0883

PL 206 255 B1

287

c.d. Tabeli 2

		763.9799
β	AfY i '	^kX“^°
Ο^ί^Ν 'γ 0
183
		γ O _f °	4,	791.0494
		Ϋ ⁰
	°*»		'1Γ 1 ⁰
		0	° Λ
			u
184
		£». O..		791.0494
	MyV*V	”ιί^χΝχΓ τ ^c	K X
	.^C CK,	o X Αχ 0' N	xrp
		0	° A
			U
185
	K,Ł			791.0494
	0	l r\ P
	‘Ύ'-οΧ	li 1 \ ^c	n-SA** Cl i
	*%^C CM,	⁰	ΆΧ
		o	° A
			U
186
	h»c>E	CH,^SP>		809.0674
	O ł	f—\ 'S CM,
	VvA·	ά*^υ ł ⁰	SC^CH, £
	ó	° Ο^Η'γ^' O	Ύτ⁰
187			O
	CK h,<L	-CH, \Ą		809.0674
	o I	rV“^{s CH}>
		\ ⁰	h,c.^ch,
	6	° οΡχΡ 0	αχ
			O
188
		x »ę~i		823.0945
	° Γ	A-A—s ^CH>
	.γΧΑ	x^Hx^z t ?,	sp-CH,
		⁰	'^νΧΎχ °

			Ml

189

288

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

190	H,C^ A	ΪΪεΗ, \X i f \⁵ l¹γγ / o ° οΤ_κχΑγΊ_ο • ό	823.0945
		X“s ο _.	865.1758


	Φ	° Αγ»γ Ά

	CM,
191
	H.C	Χ^ Ο...	865.1758
	A	Ι/Χ / ο
	Φ	⁰ ° Λ
		UJ
	CH,
192
		ο ίΥ	817.0876
	X Ά Y 0	„U Υ- ο JL J
193		YCH, H,C
		π ΤΛ	817.0876
	X	ο
194	Y	?%. H,C
	άΧ Aa	1606.121
	‘ÓAAp
195	A
	-,-/¾ ΆψΙ ' za	1606.121
	2°ΑΧ
196	A

PL 206 255 B1

289

c.d. Tabeli 2

197	r .Υ- p y	1638.12
198	r . SA y	1638.12
199	o I γΧ~^Λ p ΥΛύ χχ γ· ° .AY-pA ‘ °Ó	775.0063
200	_o-,p o γΛγ Ά γ ° YY· ⁰ °ό	775.0063
201	o T?’ ' Ό	763.887
202	_Γ γφ ,,^γΑο 0 p O o °ó “·	707.7786
203	-ΧγΑ ° p o o °Ó ‘	734.848

290

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

204	ΖνΛ-Ά y*“ =>·, r⁰ WLC—\ CH,	774.9659
205	A · ·? Q oto o c«, V· ° u A CH,	800.0139
206	cjWAp V» ° \ ji»»O κ,εΆ os	687.7971
207	H.C—P* ©S	714,8666
208	«AL-CW, \ / o 1 ,A~^S CH, •Ó ••‘'ν-ΎΖ	853.0774
209	•ν-ϊι», \ ) Η,γ.<.Α«Χ/θ* z® s.'’ o · y	853.0774
210	aa o «ΑΛΑΤΑ jżj ° °A sA	811.0398

PL 206 255 B1

291

c.d. Tabeli 2

211	⁰ I f \⁵ ό '· -Y-Ap-	811.0398
212	O \| xV”^S ?“· “YtpY Y 0 -Sr-· ό “·^Λ·ν·Α·ρ	811.0398
213	° οη	817.0876
214		817.0876
215		835.1057
216	0-0^ ο Η-ο - Pt w r \ ο/ο _ο Υ^__Ν ^ΎΧ%	630.8288
217	ΟΗ . Ύ· ΧΧ^95>	616.8018

292

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

		742.9208
218	ρρϊφϊ T Ογ“ °S ?
		744.9367
219	y*y γΥ JyA,⁰ <,^{0 0} ? .c cm,
220	Φ’νΛο _o oJA	735.9694
221		853.0774
222	^A_rMM_oΛ^χk_ϊz*yz X _e •Sr⁰'· • °0	809.0862
223	/S γ/Η) m,5L«s _o °φ/ ° ΎΑ i ' Y~)	749.9965
224	O-OS 'Λ yC° •Λ , Cr- Yo ηΥ£°% γ_£ο% O%	612.7703

PL 206 255 B1

293

c.d. Tabeli 2

225	OH A ·/” r ryT νχΛΛ CM,	598.7432
226	X .9. - ΧγΧ ° X ° ° °<γ·^Ν A-CHj X	758.9638
227	KywSa *vsL S L o © Η,ίΓ^γ © j x° Η,ίΤ^ΧΜ,	684.8401
228	p-c » V A Ó o ĆP VHtS f** CM,	758.9638
229	>r X) V A O Λ fY Μ,ίΤχ O V-Y<>S CM,	758.9638
230	CH. S \ •SUC-CK, ^s. / o ( /Ύ⁵ ?*> r» 1 f ? X. ° Ο^ΧΑ/γΧο o o Jx^	795,0404
231	>VUp.CH, ^SQ « T η* Γ A/yA > - o ·· 'Wrg·	795.0404

294

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

232	o °·γ^Ν r	624.7815
233	AA <γ.Ν χ Η,ε-^ΟΗ,	610.7544
234	ΟγΚ X	770.9749
235	O-CH, ,S yX° χ ο Ά· ‘kcAA ρ bp \_pcM, CH,	612.7703
236	Αν X °Y* Ά HC*» ”>^C CH,	722.8369
237	OH y yX r „”yA υύϋΛ °νχρ CH,	598.7432
238	H.C.?’ / S ° □Α»Α/^,''κ-^γ-γΑο 0 O J.	795.0592

PL 206 255 B1

295

c.d. Tabeli 2

239	O CH, yc .s y· θ r .Ύζ o y~* CH, ·	758.9638
240	$ O OS • ° Ό	839.0414
241	9 ^-ο ίίΎ ,ίΥ-Φ-^Ύ Cr ° “·	729.8375
242	x. Y •sĄ-' . νΡ· υύΜ	756.0443
243	y-=. N-\ / S—OH y o r% H,cV> 0 «3X X£%	701.9518
244	OH r %Υ« ,. y «.p-· o V“ ° ΥγΜ •y	734.0159
245	y-cH, M-\ / V—OH y c, Γ% « Vr y o y/ ⁰ Y PyY> %0wYr)	715.9789 '

296

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

246	J >—-OH Ά \ O A A^cs „ ° °yVy$	715.9789
247	.—OH . A κ,οΐγ*, ₀	741.9951
248	ΟΑΑΖΓ’Ζ’ο y»s AV^yYr*ⁱ ° '0	821.0786
249	CH, _yO~°S r Ά A O V-N K aZZl-/ ch. AZ \_L-o*, OS	626.7974
250	CH_ O^H r PA kcJ 0 YA^fS CH,	612.7703
251	KaA ^AA= ’ S ° ° γ os · z	698.8672
252	Z i ĄY^S d	674.842

PL 206 255 B1

297

c.d. Tabeli 2

253	<3γ« tn r	584.7162
254	Η,ίρ», θ %jO vvM	735.9694
255	t-„ H~\ CH, O O %—N ⁰ «,	772.9909
256	_/_x~O Μ,Ζ* .	776.9383
257	X />-<*> X °Yó W,	626.7974
258	/“θ O ySr χΑΡΎ V- * l, X	835.0189
259	_β _ H i i T f Ο^/νγΑΧ'Α^ A-A oko o «,= Y “5 KcA	835.0189

298

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

260	X 1 U \c-Yh	OH .V <W^N Ύ·-. CH,	612.7703
			686.856
	. u 1 2	) τ
	U ° <Y	ΆΛ-^τΆ” • Ó
261
	04.	Ζ ο,	686.856
		> > _ο
	°S ⁰ cY	° Ό
262
	γγ		686.856
	••‘y-Ay	YYgc
263
	»ScJ2oS	os	686.856
		/ J _ο κ»%,^
	L, 0^ °S er	\-γ.·γΎ • ·ό
264
	^VA ”γ	. . 0 ,Λγ^ΑΧ-*· A.	742.9236
	Η,Υ^Ο.,
265
		χ\	738.9325
	° Γ c «ΑγΖ-~₀Α_ΗΑγΗΚ “S ° o	ΑΥ / Α ο ^t'«'A^A>df^J'Y^ee • ’ό	-
266

PL 206 255 B1

299

c.d. Tabeli 2

267	Ol, —* γΖνγγ f « Ά «. ° ΑΑ_ΙΑ_ίγ'γ% ° ’Ó	738.9325
	γχ, o, '	817.0444
268	Ατγγχγ Ύ y X,
269	ZMr. <Y>A\yy i *^C'»A «, ° AAAyA • -Ó	738.9325.
270	V'°s Λ o A /γ γγ-. o Η,Γ] O O I—-/ CH, OS	772.9909
271	νΖγ/χ AC ot, O Ο’ΎιΎ^η'Ύ'Y ° °Ó	795.0592
272	• . .0 ^ΥτΥΥ'^-γ·' AA°° S^{0 0} y^K Y X	758.9638
273	^H,c^ 0 ^ΜΑΑ^β γ ⁰ y* y X°	810.9966

300

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

274	r Ά s V ΎΧΜ CH,	610.7544
275	r„ A r o u h/Y) u Y'·* χΎφ cy	596.7273
276	O CM, W CH. *-“% Y ę./.o X .. rS °τ τ'ó O%	756.9479
277	%-X ~ M-M A T° p 8 V ytM O%	756.9479
278	Χ?-. O ’ί^.Ν Y%	744.9799
279	£γ⁰ V ⁰ °γ“ “ «,Μ^εκ, '	698.8672
280	XA - S ° ° °γ“ “*· r ne-Sn	698.8672

PL 206 255 B1

301

c.d. Tabeli 2

281	\ Q ΧΧΤί'Ar- MO ⁰ L· CK3	709.8471
282	X	598.7432
283	XXX ΑΑ^β s ° Ύ X, Χ° Μ,β*^βΜ,	810.9966
284	Τ _ο ,0 AA ° Α ° °Y X χ K,C CM,	758.9638
285	«α/· - Α Ο °γ^Η X «,ε-^εκ,	742.9236
286	χ», ΑΑ ° ι/ν Υ· Ύ χ X	817.0444
287	Ά ΑΑΑΑ ./ ’	817.0444

302

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

288	YyM C”.	759.9526
289	O^N CH, H.C	494.6367
290	PA :x 0 Ύ-^Η W	719.9263
291	Y o °<^^N ^CH, • r H,C^CH,	731.938
292	9 XR • U O Ά-'Ν Χ.9·	677.8887
293	AA γ¹ X X	612.7703
294	. °ν^Ν Y r łSC^cw,	612.7703

PL 206 255 B1

303

c.d. Tabeli 2

295	Y χ-cH, ΫΥϊ χ°	716.9261
296	Ά Q °yⁿ A Η,Χ-CH,	717.9109
297	X . .9 .O •Αχ Y “· m.c^ck,	950.0884
298	e> Ϋ-ος ę_vxo A uY ytY os	729.9221
299	HA^CH, °<^^N Au, yz H.C CH,	578.712
300	Π,γ,ΕΗ, °<y^N > n^Y⁰ K⁰ CH,	564.6849
301	Y o O^N CH, χ	703.8838

304

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

302	ckćWr □γ» ĆH, χ Η,Χχ	553.7021
303	x o =γ.« Z «Χ	703.8838
304	χϊΥΫ Ογ,Ν {ą m,c7^ch	552.7173
305	en, ^N 'Y^Sf'⁰'⁰⁴» °γ^Ν Y •VyO 'Ά,	523.6756
306	oy <η X	731.9783
307	XX y$yY °γ^Ν X £Χ° * CH,	509.6485
308	ΧΧ χχ °y^N ^ch,	508.6638

PL 206 255 B1

305

c.d. Tabeli 2

309	ζΑ γλ γ» =* η,<Χ~ο^	731.9783
310	Η,ε^ος	667.8503
311	JA·¹- 0γ^Ν OS Η,^Χο^	667.8503
312	H.C τ Ο C*⁵ oJr-cY Ά L, Λ° ⁵ CH,	567.7292
313	^νΚ“· Ο OC AΑ ° γ ° °<γ·^{Μ A}CH, «.C CH,	724.9054
314	*ν“· β Α ο ο V f«. AA · °·5γ-^Ν ιΧ, Λ,	724.9054
315	^νΑ π ΤγγΥΡ ΑΑ ° s ° ° °γ“ χ°	762.9736

306

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

316	Ά O KyWA ° v ° γ Y x°	764.9896
317	Ά o $Ά⁰ S⁰ ° °γ^Ν ^ch, 1° H,C CH,	764.9896
318	v,£ ° o -,Ργγν^ΑΑ %A ° S ° ° <γ^κ Sw, r HjCT^ck,	764.9896
319	Ap A ' A °^s	908.0734
320	Ά 0 ;ΑατΡ^Υ·' γ pf° CH,	724.9054
321	Ογί. os wr A os	508.6638
322	H,C_VOS Χγχ a-m y ΐ CH,	522.6909

PL 206 255 B1

307

c.d. Tabeli 2

323	YJ TJ °γΝ Z Y° . CH.	522.6909
324	Ύ . „ę> AAjrA' γ Y χ H.C Y	731.938
325	O CH, /—h^z ^N—\ Z h,c yA^³ \~J zyⁿ· o γ ⁵ °^Y 1 ó “.cTyAyiH,	744.9367
326	'ν' O K,C J O y-CH, °·%γ^^{Ν H}J^C Η»<ΥΥ> H,C*T CH,	727.9102
327	o ΑΥΥ¹ γ γ	567.7292

308

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

328	• «γ-^Ν χ η/Χ	584.8029
329	Ο °<5^^Ν ^οη, χ° Η,ίΧ^ΟΗ,	726.9214
330	π-ν^ Ο ζλγγΥΑν- H.C-J -L. Ο b ° ο ΜΑγ ·ο Ί χ° Μ,ε^ος	726.9214
331	ΧΧ 0 γΑχ-χ Χ<, X	726.9214
332	π·ν^ Ο °γ^κ Α Η.Υ“·	740.9484
333	Ο CH, Ν—ζ Α h,c ’γΥ’ ΚΑ,εΗ» ο. /Ά ^νΎ Η χχχ CH, οη	688.8284
	°γ «Sy⁰ H,Cch.	564.6849

PL 206 255 B1

309

c.d. Tabeli 2

335	m.^cvch, XX ΟγΝ CH, . H.C Yk,	550.6578
336	o ,««, CH, Hf Ύ* ° \=/ ζΥ X	820.9918
337	χ O YYpYr Ογ« X ^HfCH,	710.8784
338	</ \=/ ΑΧη, ^CM3	746.9089
339	Πι ΆΑ oto ο X ιΐ γ “ ο%	710.8784
340	<3 \=/ Υγν Η,Ο'^ςΜ, ^CMJ	590.6823
341	Υ ο ϊζΑγ-Κ⁰ γ °Υ'^Ν ''CH, H.C^CH,	716.9261

310

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

342	r · hMch,	539.675
343	O CM, o ΛΧ Cr Η.Ύ¹ O °V-4° Ϊ&, Y CH.	772.9473
344	HC y.cM, SyAb ęn. ^ημ\Λ ·** 1 R ^eV ° °^v I ó ‘ν'Υ \_ρ, CH,	731.938
345	HO V—^CK» S yA b i·*, H,cA O °y-N ⁰ °τφ3ό νΦξΠ’ \_£%, CH,	731.938
346	HO^ y/X) C o wy> 'γ-.¹-; fi, CM,	731.938
347	«.ycH, °γ^Ν YcH, Y^O H.C CH,	546.7132
348	h,c^ch, ΥΥΥ''' H,yy H,C CH,	606.7662

PL 206 255 B1

311

c.d. Tabeli 2

349	«.ycH, ^cy^N k H,C 'cH,	578.712
350	yy <x y < CH, CH,	564.7722
351	°y^N Y CH,	548.7291
352	HyCH, k. y ch,	562.7562
353	H,^cy °γ“ Y £γ° «X,	642.8432
354	H,^cy yy- en, £Y° > CH,	536.718
355	• °y^N X ^r° * CH,	574.7673

312

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 2

356	άα- 0 ογ¹ ”* ν-Μ V CH,	726.9214
357	O «»©·>£ O L 0 CH, 0 k,c ° ] <γΑ ^νχ° «,= CH,	726.9214
358	«Y-CH, •Aa ΟγΝ «, ΆΑ «Α CH,	580.7279
359	HA^ch, ι«.Ρυ^νύΑγ^νΥ^^ηύρ ΑΧ ° A 99 «,<<7 i °γ “* H,C^O «,= CH,	639.799
360	Η,γΟΚ °γ^Ν X £p° * CH,	538.6902
361	κ,γ°8, °γ^Ν X £Ρ° CH,	562.7562
362	Η,γ^ ΑΑ °γ^Ν X CH,	566.7444

PL 206 255 B1

313

Struktura

Tabela 4

Zakres Ki*

Nazwa

CH, Ύ . ΛυΥ Λ .	iBoc-G(Chx)-P(4t- NHiBoc)-nV-(CO)· G-G(Ph)-Am	A
ογ .„29Υ;2.Α·^·οο LU · ·&	(2-CO2)PhCO- G(Chx)-P(4t- MeNHC0Ph(3- OPh)-nV-(CO)-G- G(Ph)-Am	A
(Al ch, i? Z—( ^Η,°'^^χ'°ν^Ν'i”’⁴ j [ jj g U .	iBoc-G(Chx)-P(4t- NHSO2Ph)-nV- {CO)-G-G(Ph)-Am	A
Q ύΑλ o	iBoc-G(Chx)-P(4t- UreaPh)-nV-(CO)- G-G{Ph)-Am	A
~y Y -	iBoc-G(Chx)-P(4t- MeNHCOPh)-nV- (CO)-G-G(Ph)-Am	A
2 ••AAZZy-TT ^U · -Ó	Boc-G(Chx)-P(4t- MeNHS02Ph)-nV- (CO)-G-G(Ph)-Am	A
ero ; O ' CMj g- j-f CH, ₍ H,=>A'^OY^MY^L,iY Z o 8 ⁰ r% ‘WaM¹· tu . y	Boc-G(Chx)-P(4t- VIeNHCOPh(3-. OPh))-nV-(CO)-G- 3(Ph)-Am	B

314

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 4

9. z $AC“?A .a ^u o	(2-CO2)PhCOG(chx)-P(4tUreaPh)-nV-(CO)G-G(ph)-Am .	C
Ά “^AYŻ5pAA., U - y	iBoc-G(Chx)-P(4t- NHSO2-(4Me)Ph)- nV(CO)-G-G(Ph)- Am	B
A --AAŚJA.y., ° · Ó	iBoc-G(Chx)-P(4t- NHSO2-(3Cl)Ph)- nV-(CO)-G-G(Ph)- Am	B
'ΎΧΧ, oA r* δ A r* ΑΥΤΎ/ϊ „ A ^u . «φ	iBoc-G(Chx)-P(4t- NHSO2-(4- NHAc)Ph)-nV- (CO)-G-G(Ph)-Am	A
^αγΑ _o AA ^aAA .jl ^u · ’ό	iBoc-G(Chx)-P(4t- NHSO2-(3,4- diCI)Ph)-nV-(CO)- G-G(Ph)-Am	B
ęo -c-νΑ/Λ „u. ^u · Ó	iBoc-G(Chx)-P(4t- Urea-1-Np)-nV- (CO)-G-G(Ph)-Am	B
A,.· .M ?^M> j? /—( ? .A-Y-p? A . ’ “O	iBoc-G(Chx)-P(4t- NHSO2-2-Np)-nV- (CO)-G-G(Ph)-Am	B

PL 206 255 B1

315

c.d. Tabeli 4

^οτχ ΛγΧ Λ , = o	iBoc-G(Chx)-P(4t- NHSO2-(4CI)Ph)- nV-(CO)-G-G(Ph)- Am	B
Ά ° A	iBoc-G(Chx)-P(4t- NHSO2-5(2,3- dihydrobenzofuran ))-nV-(CO)-G- G(Ph)-Am	B
γγ CH, A- ΛγΑΫΛ _s ⁰ yS ΧΧ/,'γ’γΧίΗ, L-J » Y	iBoc-G(Chx)-P(4t- NHSO2-6(4- OMe)Courmarin)- nV-(CO)-G-G(Ph)- Am	B
₀,CK. Φ. L_J · &	iBoc-G(Chx)-P(4t- Urea-Ph(4-OMe))- nV-(CO)-G-G(Ph)- Am	A
Cł Φ Γ’ %Χ~~ζ j‘ ‘ ^<X oXYa^yA· AJ . _O(O	iBoc-G(Chx)-P(4t- Urea-Ph(4-CI))-nV· (CO)-G-G(Ph)-Am	B
Φ. O O »_O	iBoc-G(Chx)-P(4t- Urea-Ph(4-CI))-nV- (CO)-G-G(Ph)-Am	C
Y° Φ H^.0 Z CH, ° >«( CH, ^^Ύ0 ΑύΑ· AJ 8 «_ο	Boc-G(Chx)-P(4t- LJrea-Ph(4-Ac))- iV-(CO)-G-G(Ph)-	B

316

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 4

·=γ° φ Γ’ 8 /—ί Γ· ρ. ^ⁿu Ρ—η. y j ^m>^c—if r τ r u β ^Ο ΡγΧ_Ν Ύ< ''ν'-'Ά_ΜΗ *	liBoc-G(Chx)-P(4t Urea-Ph(4-Ac))- nV-(CO)-G-G(Ph) Am	B
ΐ^Η' “<Ą 'ΥΥΫχνΧ Ó	iBoc-G(Chx)-P(4t- NHSO2-Ph(4- OMe))-nV-(CO)-G G(Ph)-Am	B
cv οχ <?Η, Ο y-f* CHj κΑγγ^Φ X ο ο °Η,0^χΛ^ΟΗί><^Χγ^χ1^Ν'Υ\|^^ΝΎ^ΝΗ1 °ό	iBoc-V-P(4t- NHSO2-Ph)-nV- (CO)-G-G(Ph)-Am	B
γ.· ί^Ν ί^Ηι Ε /—\ ?^Η> sc^Yy ^Νγ \|Α ο ο ^β Ρ 9J. . .£	iBoc-G(Chx)-P(4t- NHSO2-1Np)-nV- (CO)-G-G(Ph)-Am	B
6^· Η,οΡΡγ Υ·Υ$ j Ο ° ^ΤΑ οΡΑγ,,γχΧΑ U ο	iBoc-G(Chx)-P(4t- NHSO2-8- Quinoline)-nV- (CO)-G-G(Ph)-Am	B
Ρ Η,C-A «γ» ΧΧψΥΪΛ ₀ _οΡοη° 2s ₀P_NP_łfX_N^y^^N'_VX_N„_i ° °ό	(2,5-diF-6- CO2)PhCO- G(Chx)-P(4t-NH- Boc)-nV-(CO)-G- G(Ph)-Am	A
Φχ ΡΦχφΛ λ <Ροη° r-Χ. _οΧΡ_1ΓΧνΎ^^ΝΎ'νη, ^u ° °ό	2,5-diF-6- 3O2)PhCO- 3(Chx)-P(4t- MHSO2-Ph)-nV- CO)-G-G(Ph)-Am	A

PL 206 255 B1

317

c.d. Tabeli 4

X c ^cy° ΥυΎ'Τχα -u. · ’Ó	(3,4-diCI-6- CO2)PhCO- G(Chx)-P(4t-NH- iBoc)-nV-(CO)-G- G(Ph)-Am	A
9 N^.0 Γ N jj y—\* ^CH* θ’^^Χ·ΟΗ YY O^N^>”'’pp^N '^^^^N“y^X^'NHj ° · ’Ó	(3,4-diCI-6- CO2)PhCO- G(Chx)-P(4t- UreaPh)-nV(CO)- G-G(Ph)-Am	A
ęr” N^O %N ί^Η> U i—( 9^H» ^MaC^^ Y I r u fi ⁰ '^X0J^x'^N><^ N H J ° ’Ó	iBoc-G(Chx)-P(4t- Urea-(3-CI)Ph)-nV- (CO)-G-G(Ph)-Am	B
i PY ΦυΧ/Λ · Ά . °9	(3.4-diCI-S- CO2)PhCO- G(Chx)-P(4t- NHSO2-Ph)-nV- (CO)-G-G(Ph)-Am	A
ΧγνΠ'Χ'Ρ'Χ⁰’ 0	iBoc-G(Chx)-P(3,4 iPr)-nV-(CO)-G- G(Ph)-OH	A
CH, 0 0 L 0 0 CH,	iBoc-G(Chx)-P(4t- Chx)-nV-(CO)-G- G(Ph)-Am	B
Υ'^^ΑγΎΤ'^Χ CH, 0 0 k 0 0 Qi	Boc-G(Chx)-P(4- diMe)-nV-(CO)-G- 3(Ph)-Am	A

318

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 4

OS	Ρχ □ oko 0 CH,	iBoc-G(Chx)-P(4- Bn,4-Me)-nV-(C0) G-G(Ph)-Am	• B «
	<n	iBoc-G(Chx)-P(4- spirocyclopentane )-nV-(CO)-G- G(Ph)-OH	A
CH, O	$ Λ « ° °ó	iBoc-G(Chx)-2- Azabicyclo[2.2.2]o ctane-3-C0-nV- (CO)-G-G(Ph)-Am	B
xtx 0 0 L 0 0 <*,	iPrOCO-G{Chx)- P(4-OtBu)-nV- {CO)-G-G(Ph)-OH	A
OS ⁰	aA »S	Neopentoxy(CO)G(Chx)-P(4-OtBu)nV- (CO)-G-G(Ph)· OH	B
ΧΛ/τ w, o	oto 0 OS	Neopentoxy(CO)- G{Chx)-P(OH)-nV(CO)-G- G(Ph)OH	B
X	o 0 0	Ethoxy(CO)- G(Chx)-P(OH)-nV(CO)-G- G(Ph)OH	B

PL 206 255 B1

319

e.d. Tabeli 4

0' Pt P ΐ-N o ° ,°t χίγφ	iBoc-G(Cfox)-P(4,< diMe)-nV-{CO)- G G(Ph)-N(Me)2	4 A
«fi CH. Λ. tĄ_ U-Z ⁰ ° T “ó° ί ° ”	iBoc-G(Chx)-P(3,4 iPr)-nV-(CO)- GG(Ph)-N(Me)2	A
W, ° V-« o o CK, 0%Mr	iBoc-G(Chx)-P(4spirocyclopeniane )- nV-(CO)-GG(Pft)-N(Me)2	A
P W H/S O yj CH,	iBoc-G(Chx)-P(4cMe,4t-Pr)- nV(CO)-G-G(Ph)N(Me)2	A
	iBoc-G(Chx)-P(4,4 diMe)-nV-(CO)- GG(Ph)-OMe	* 1 »
Q Λν«χ J- •óTM	Boc-G(Chx)-P(4spirocyclopentane - nV-(CO)-G3(Ph)-OMe	A
Π ‘ ”0. 2	Boc-G(Chx)-P(3t4e)-nV-(CO)- G3(Ph)-N(Me)2	A

320

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 4

γΊηχ	9 0	liBoc-G(Chx)-P(4,- diMe)-nV-(CO)- S(Me)-G(Ph)-OH	4 A
	o	Y\VA
o / CH	' V 1 CH)
(	Υ		ίΊ		iBoc-G(Chx)-P(4/	l B
o y				diMe)-nV-(CO)-S-
	ϊ I	CH.	y\Z Y ⁰		G(Ph)-OH
		f		iBoc-G(Chx)-P(4,4	C
o k			diMe)-nV-(CO)-
γΛ		Ύ		Y^w	G(Ac)-G(Ph)-OH
CH.	o C	Ύ CH,	⁰ Ach.	o
Y					N-Me-G(Chx)-	C
^CH,		0		P(4,4-diMe)-nV-
	τΎ	O	Yj	X^OH	(CO)-G- G(Ph)CO2H
	Ύ
	ch₃
	Y		γ		iBoc-G(tBu)-P(4,4-	A
	o	ΥΛ	fH,	diMe)-nV-(CO)-G-
γΛ/	ΊΓΎ	Ύ	Ύ I	G(Ph)-N(Me)2
O>.	o o	? θ'.	0 O
A	Y	Y	1	Boc-G(Chx)-P(3.4	A
γΛχ		5» Y	(diMe- cyclopropyl))-
CH,	O o	A OS	O 0	< <	G((S,S)-Me- cyclopropyl)-(CO)- 3-G(Ph)-N(Me)
				li	Boc-G(Chx)-P(6S-	A
γ	Z		A	(	3EM)-nV-(CO)-G-
	A-	O		=H. <	3(Ph)-N(Me)2
γΛΛ		Ύ	Y
CM,	0 o	i	0

PL 206 255 B1

321

c.d. Tabeli 4

CKj -	iPoc-G(tBu)-P(4,4 diMe)-nV-(CO)-G- G(Ph)-N(Me)2	- A
ch, o O } o 0 CH,	iBoc-G(Chx)-P(6R CEM)-nV-(CO)-G- G(Ph)-N(Me)2	A
ΥΧΆ 0 γΑγνν^νν·¹ CH, OOOO CH, 0	iBoc-G(tBu)-P(4,4- diMe)-L-(CO)-G- G(Ph)-N(Me)2	A
Αχ CH,	((R)-l-Me-iBoc)- G(Chx)-P(4,4- diMe)-nV-(CO)-G- G(Ph)-N(Me)2	A
«. . . ° γ	iBoc-G(Chx)-P(5- c/t-Me)-nV-(CO)- G-G(Ph)-C02H	A
αΧμ· ¹ 0 0 0 0	Boc-G(Chx)-P(5- cis-Ph)-nV-(CO)- G-G(Ph)-C02H	B
1 0 0 > 0 0	Boc-G(4,4- JiMeChx)-P(4,4- JiMe)-nV-(CO)-G- 3(Ph)-N(Me)2	A

322

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 4

¹ 0 0^0 o	iBoc-G(1-MeChx)- P(4,4-diMe)-nV- (CO)-G-G(Ph)- N(Me)2	A
υτΑ/αλΑ 1 o o ko 0	iBoc-G(Chx)-P(3,4 CH2)-nV-(CO)-G- G(Ph)-N(Me)2	A
yo/yP o CH, O γ/ Am P H_SC H—< _ZCW, JZ~^N O CH,	iBoc-Chg-Pip-nV- (CO)-G-G(Ph)- N(Me)2	C
° A ^{0 0}	iBoc-G(Chx)-P(4,4 diMe)-L-(CO)-G- G(Ph)-N(Me)2	A
⁰ ° ° °ó	iPoc-G(tBu)-P(4,4- diMe)-L-(CO)-G- G(Ph)-N(Me)2	n
0 0 O 0 γ. ¹ 0	iPoc-G(tBu)-P(5- c/t-Me)-nV-(CO)- G-G(Ph)-N(Me)2	A
myl	;(R)-1-Me-iBoc)- 3(tBu)-P(4,4- diMe)-nV-(CO)-G- 3(Ph)-N(Me)2	A

PL 206 255 B1

323

c.d. Tabeli 4

1 0 0 t 0 0	(S)-l-MeiBoc- G(Chx)-P(4,4- diMe)-nV-(CO)-G- G(Ph)-N(Me)2	A
	iBoc-G(tBu)-P(4- cis-Me)-nV-(CO)- G-G(Ph)-N(Me)2	A
ΑχνΑ	iBoc-G(Chx)-P(4- cis-Me)-nV-(CO)- G-G(Ph)-N(Me)2	A
	iBoc-G(tBu)-P(5- cis-Me)-nV-(CO)- G-G(Ph)-N(Me)2	A
^\xx5z O ° r ° °	iBoc-G(Chx)-P(5- cis-Me)-nV-(CO)- G-G(Ph)-N(Me)2	A
1 0 0 t 0 0	iBoc-G(Chx)-P(t- 3Ph)-nV-(C0)-G- G(Ph)-N(Me)2	B
• 0 0^0 0	iBoc-allo(lle)-P(4,4 diMe)-nV-(CO)-G- G(Ph)-N(Me)2	A

324

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 4

0 0 χ 0 O	iBoc-G(Chx)-Pip(4 morpholino)-nV- (CO)-G-G(Ph)- N(Me)2	B
	iBoc-G(1-MeChx)- P[3,4-(diMe- cyclopropyl)]-nV- (CO)-G-G(Ph)- N(Me)2	A
o yC /V o O 1 1 o Ιγ & Ϊ	iBoc-G(1-MeChx)- P[3,4-(diMe- cyciopropyl)]-L- (CO)-G-G(Ph)- N(Me)2	A
¹ ° °J δ 0 ~\	iBoc-G(tBu)-P[3,4- (diMe- cyclopropyl)]-L- (CO)-G-G(Ph)- N(Me)2	A
ν°^Λ5ρΥχχ5Α	iBoc-erythro-D.L- F(beta-Me)-P(4,4- diMe)- nV-(CO)-G-G(Ph)- N(Me)2	A
	((R)-1-Me)iBoc- G(1-MeChx)-P[3,4· (diMe- cyclorpropy!)]-nV- (CO)-G-G(Ph)- N(Me)2	A
ΡΧ^αΑχ 0 0 0 ο <Λ	Poc-G(tBu)-P[3,4- 'diMe- oyclopropyl)]-nV- (CO)-G-G(Ph)- N{Me)2	A

PL 206 255 B1

325

c.d. Tabeli 4

„ £ a «, o Yyj ,? i? i ^ΑγγΛ^Λ'Υ o 0 / o o «τί OS	iPoc-G(tBu)-P[3,4- (diMe- cyclopropyl)]-L- (CO)-G-G(Ph)- N(Me)2	A
νΜ/Λ ας oo^o o CH,	iBoc-G(tBu)-P(3,4- CH2)-nV-(C0)-G- G(Ph)-N(Me)2	A
A 0 0^0 O <*3	iBoc-G(Chx)-P(3,4 CH2)-nV-(C0)-G- G(Ph)-N(Me)2	A
γ· Ατ3 ί i? O o O O <=«,	iPoc-G(tBu)-P(3,4- CH2)-nV-(C0)-G- G(Ph)-N(Me)2	A
o o γ ps YZąPYYĄy A 0 0^0 0	((R)-1-Me)iBoc- G(tBu)-P(3,4- CH2)-nV-(C0)-G- G(Ph)-N(Me)2	A
OH, 0 0^-0 O . CFS	((R)-1-Me)iBoc- G(1-MeChx)-P(3,4 CH2)-nV-(C0)-G- G(Ph)-N(Me)2	A

326

PL 206 255 B1

Tabela 5
Struktura	'Ciężar cząste- czkowy	Zakres Ki*
CM, Jł {[ £ jf Y=” γ y™ Y Y •V= ck,	507	B
Zyz OyN ¹ ΑΤ°	481	B
^ΗΎ^0Η>
A ,Yx^NZP/ u, ^H‘^cZl 8 X, ° % CH, O=s CH,	473	C
^hv^cm’ ♦ \ o
_{H c} ^CHa γ ^ιΓ^^ιιΓ* ^a H,c/yY> ° ° •„„Y	586	B
y~\ h i n
AT y · Ż	497	C
Pd ^{1 0} Φ ¹	483	c
ΧτγΡ YA ° S⁰ ^{1 0}	481	c

PL 206 255 B1

327

c.d. Tabeli 5

Hy^CK’ ^K„iyPo ° ⁰ °y M,CjT ’ CM,	479	B
^HV _o cH,Oyy^Jł>r^NH’ y^N A ^Η>°χ° ^mXch,	507	A
^Hy^CM· CH, Ίπ,	521	A
H,C^CH, αχΑ CM, . Hjp^^CM,	612	A
^H*^cv^CMa ęYY ^Μ>%^° HC< ^CMJ	533	A
H,C CH, <AWr °^^N 's/ HjC^O HjcAF CM,	569	A
J X .	557	B

328

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

X>	521	C
Y	555	A
yo_YJ^ ΧΎ Λ o Λ ¹	497	C
Ly· ά X	569	B
y· opóL =Y~ A X	533	B
τ ° YO	519	C
Pr óyy	621	B

PL 206 255 B1

329

c.d. Tabeli 5

ΑΧ A iygr HjC-T-CH, i,	392	C
H C ^CH3 ³ V όνγίγ-. ó‘9	418	C
ł^c CH, T: y« hc V H,^c «,	509	B
°γ^Ν x°	493	C
cgSrgr °γ^Ν X	507	B
Οτγτ'Α' A	567	A
^hX^ch’ cóAćr ΟγΝ · H,C ³ CHj	519	A

330

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

y AA ° χΑγΑ-ο ⁰ \ ° >f	519	B
cLpL ΟγΚ «Ρ »V° HjC* ch₃	535	B
^ΗΑ>(/±. o T o . ^Hsc A—sh γ ^H’^e CH, ’ Kfu^-0 H,Ct ^! CH,	523	C
^M,C'^^CM’ cn,ir y y j κ^ΑγΑο⁰ X ⁰ °γ« H,C^O «αΛη,	493	B
Ηγ^ι n S^yV^mhi kAyM o k 0 Ογ,Ν P HA CH,	547	B
η ΡΥ”' ΧγΧ o k ° «Αγ° CH,	519	A
_VyC«. cOcrP¹*' γ YL	505	C

PL 206 255 B1

331

c.d. Tabeli 5

332

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

Hyos Yż OyN CH,	478	C
z	555	B
«y- ' T	554	B
H,_Cy=H, ϊ^Η»ΧΡτ^Νχ^£ν^ΝΗ’ H,C PA, ° ° °γ^Ν H,C^l ’ CH,	465	C
cAjr oy ^CH>	520	A
optr <y ^v σ	558	A
wyCH, op'Ż y^N wyN H.C CH,	532	A

PL 206 255 B1

333

c.d. Tabeli 5

Hyc». cpA OyN <x	547	B
cpA y^N V°	547	B
'-CbCiTi y > y° CH,	553	A
AA y« ch, σ'	520	B
/A X*	521	A
A	543	C
ΟχγγσΑ A	569	B

334

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

A AAPa ΜγΑ⁰y^N a’ CH, .	507	B
£ / u¹ U Ρ-Αγ łA .yA $ 1	522	B
HyCH. Aż J OyN CH, Y—''Ύ'	606	C
H,y^cH. ck^rpr· ΟγΝ CH, Y CH,	493	B
Y ZtW“' Hjc-yy^o γ Cy« ^CM, HjCyO CH,	467	C
H,C_y<=H, kPyY, ° '^mf^Z °γ ^Kh,cY° ³ CH,	507	B
Y Y/ Υ» ^CH3 .	572	A

PL 206 255 B1

335

c.d. Tabeli 5

ckxm-	718	C
V χ·	547	A
a yT '' ''	666	B
(7	540	C
yp Χ X	554	B
Qy£Wy Ογ-Ν ' Ύ“	540	B
- X ° - °γ^Ν ' Q“	632	. B

336

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

ΟλγτΑ Y σ	580	B
ΟγχΥΑ V r	552	A
Άυ cr	592	A
oM Ύ* γ CH,	518	A
«Λ/*» AA ΟγΝ ^V CK,	506	A
Ąg’ O Y* cr	532	A
ΟχγΤ'Χτ °·γ- L-J A	581	B

PL 206 255 B1

337

c.d. Tabeli 5

338

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

f<x	543	C
X	574	A
opy	534	C
cpX Ύ T	549	B
Ογ»Χ Y^Y A	562	A
oyA A	662	A
CupY'X A	563	' B

PL 206 255 B1

339

c.d. Tabeli 5

Ύ CH, Y	518	B
tyyCH, yy yM ch, Y	492	B
OyY Ύ	533	A
HyCH, CH, ας	510	C
Y yy yM ^v Y	504	A
h,c_vch, cAWr <yM H,C^--N A	530	B
V yy V V	516	B

340

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

ojxg “γ- >c	574	B
clJSpA·	561	B
Aa χ	533	B
Τ^χΑτΑ Y Y	493	C
oJcAtA· “βγ·- X	546	A
Άχ _Y ^uyx	561	A
AA A	505	B

PL 206 255 B1

341

c.d. Tabeli 5

X y^N	490	B
^K^5<^eHl Ο=γ-^Η CH, -‘'Y,	539	C
Y	532	A
y=n yy X H.C X,	561	A
ΥΥχτ'Χ X X	573	A
<X^nV YY	567	A
	581	A

342

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

z\ ₀ X°	608	A
X	587	B
a\|Sa γ X	561	B
	581	A
Az X	573	A
C\X/P A	624	A
Yż X	547	A

PL 206 255 B1

343

c.d. Tabeli 5

ΑγχτΑ y	583	A
oj/ γ- — r	545	Β
v O V	609	C
jAj	549	C
	575	C
_v γ/ σ' .	613	A
°Ασ X	573	A

344

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

V X	561	A
X	625	A
C	666	C
^a\y X X	588	A
^cyd oSPtY °γΝ θ'	599	A
oJPy °Y' X	573	A
X'	587	A

PL 206 255 B1

345

c.d. Tabeli 5

X	615	A
<V^H‘ _{H c} ^c«a 9 jj yy H₉C’^V''''^^f3 ° V>° ζγ° X CH, .	535	B
oY/r £Y° °Λ .	561	A
αΧΑ <Y« ” Zy° CR,	531	A
ΟχοΥγ V Ά	651	A
X ••as^y V	506	A
Ty >rq? a	520	A

346

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

Cj	546	A
Αϋ -WyĄo° a °Ó	602	A
Pal X Ϊ	549	B
«γ. AA h,c x %	587	A
Η,γ. ΟγχΝ V H.C I %	561	A
ggż· ' Ρ X -	517	B
K₅c ^CH, Ρ^ΊΓ ° bjCS^O ° γ^° °^^{N V} X	491	B

PL 206 255 B1

347

c.d. Tabeli 5

Y °X H,C CH,	533	B
^H’^cy^CH’
^h3^c^9T^° ° v?° °X H₃c cH,	507	A
	598	A
X X	535	A
°Y X	561	A
^cyci °y cr	633	A
^H>^CyCH, .ΧγτΥ· OyN *» ^HY H₃c ch₃	497	' C

348

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

^CIY-CI	607	A
YT	574	B
Ά⁵” ’	518	B
ΑΑν	580	C
Oy. · X 0	544	B
cy o X	562	A
XyAn y X	561	A

PL 206 255 B1

349

c.d. Tabeli 5

Υύ V er	587	A
^H,V^H' ć ^NH, CH, N yj— ηρ ;_:>ςχ_οτ O^N <r CH,	533	A
H C CH, ³ V αΧΧ °«γ-« X ce ch₃	559	A
^H)Cv^ch, cęAA _pxk_F ^H3C ° H₃c-y CH,	557	C
y A	535	A
h,c_v ^ch, y Osy F F *£-K° H,C CH,	535	B
Ay X	547	A

350

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

Tr γ X	546	A
γ™’ ,χΧΑ y _σ-«.	546	B
γ*. ν Ρ- «α,	523	B
^H,cx“' „ οΡχΎ'' Η ,C^\| C> .^c-k “^CY/^N· H,C ^CMJ	663	C
^ΗΥ · :::XX Y Η <C ł -;P° M.C^l m ,e cm ,	637	C
Η,γΗ, ' :χΛ V Ογ' CH, y H_aC ,	521	B
^ΜΎ^Η’ χχ y .,Y	573	. B

PL 206 255 B1

351

c.d. Tabeli 5

Ύ y£rp· 1 HjC .	559	A
X · z X	533	A
1 ^h’^cv^<!k’ 9 I ^{c h}j	573	B
^H,cy^CHl 1 ^H>^c-7< HjC CH₃	595	B
^HjCy^CH’ cYfr' °γ“ _FX ^F H ,cZ = H,	575	A
^H,cy^CH‘ cAWf yM p f ^H’C-T< K₃c CHj	560	B
h,c_Y=h, o \ ° <yM ^F f ..n H,C^< K₃c CHj	534	C

352

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

°γ^Ν ' x°	727	A
°Y^N x°	727	A
γΧγΎ f o ^XY	753	C
?TXX χ^Χί/γγ < o AA °ΑΛ\|\|Αζγ\Χο ° °o	753	B
OL fHj ^hAL~ch, j^sŁ^ch, en, o 1 r—-i / os ·' WyA ° Ό	745	A
CH, fh> “ACch, YLch, CH, 0 I y—t 1 m, ^AcAl/y J £ O hA^oti ⁰ °ρί°	745	A
CH, °S HApCH, Λψ-CH, k,c o 1 i—i i r-oi, ΧΛΧυ r o °ΧΛ/^ί'ΥγγΧ₀ . ° Ό	759	C

PL 206 255 B1

353

c.d. Tabeli 5

« o [	4, A/ ΓΛ AZ ΑΑ/χγΧο ⁰ Ό	759	Β
Y	γ-'^<τ5-<	669	Β
		669	Α
T-a-A	554	C
A	Ιο ο	610	Β
y <*,	ο ? γ «»
A’ ¹ <*γ^Μ H#yz® ch₄	.ο °	711	Α
>po° y^N X	ΛΑΜ Ιο 0	713	Α

354

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

.V	713	A
y k X	732	A
AaA <y k Y	733	A
τγχ 7 ^λ	733	A
y Τ’ Ύ	737	A
JyY QyK ^V CH-,	667	A
Af³ 0 pYiAAA, Λ ° k ° ° KcPcH,	612	C

PL 206 255 B1

355

c.d. Tabeli 5

Ω4 ΧΛχΟ'^,0/° ^ολΑχΧγχΛ_ο ° Ό	745	C
fPo, A CH, 0 Γ !—\ I CH, ΧΛ/γΑΧ 0 AA ⁰ °ó	745	C
A&, Λ ΑΛΛγ / o ^οΛΑ/άχΧο ° Ό	745	C
ΓΜ. CH ΗΡχα-i XY<H χΛχχ ° °ó	759	C
CK CH, tócH, ^ALcH, *Υ°<· ^c °λγγλ ° Ό	759	c
“Apcn XX I i? Γ aL·^ ę o Y⁰¹· ° A	759	c
IX Qy° ^V	668	c

356

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

“X ° A	636	B
OyN k X	733	A
JkAy y k X	767	B
W «Ą_o 0 k O 0 «.Ach, HP ³	626	B
Aa-aSa *γ° °	715	C
>fyvV γ θ	715	A
A <v ·	699	B

PL 206 255 B1

357

c.d. Tabeli 5

x°ir°° ι °	725	A
^h^h, 1 AA o ° ch, jAd o^- k„, <2	781	^B
I ^m»^c ?~^CHł 1 CH, \ 1 CH, O Γ ,—-4 CH, ^YAJyO J ° h_V, y	743	^B
I *Λ_ / ° ’θ ί	743	C
^Ησ / C’ HcJl > P□ Sr⁰*· ⁰ ZAj/yLA ° °ό	743	A
„ A _h ch, oA”/ ΑΛN-pę Po '«Sr⁰’· ζγγχ ⁰ °g	757	6
n\_ X AA ) ~ ot, o f 7—1 aaW/o ⁰ Λ AA yi ’ A I	757	C

358

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

Hf V A W?/? ° Ό	757	B
yyw L° ° ⁰ Ϋ '	715	A
yM⁰ v° ° ⁰ ϋ '	715	A
sZ-. 0 o Y , ζΧγΧ^χΛρΧ ΥχΆ⁴ γ ^J	701	C
yy Y° )° ^!	701	A
yX	713	A
yX Xb	739	A

PL 206 255 B1

359

c.d. Tabeli 5

φγΫγΥγ Α'ΥY'“ - y °	741	C
. ΑτφΑζτ yY y	715	C
	837	B
Yż>	751	A
	725	C
.γ	711	C
Y ⁰	737	A

360

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

Ti <ΛγΛ0 oko O °Y^N 1 ^x°	775	A
Xw A °	729	A
Λ°γΧ^θ L° ° X '	729	A
X ¹	715	A
Α	775	A
ΡΑυΤυ Χο '	739	A
Xy χτ	713	A

PL 206 255 B1

361

c.d. Tabeli 5

v . „0 O^N CH, ⁰ >-°S h,c ·	719	Α
PC Q V^{N C}^ Hi	719	Α
γ*. Q >sc^^xV^rY^o £χΑ> ° g ° hPch, <V^N CH, 4» V ⁰ )-«, H£	719	Α
>?	773	Α
A . „Q _Hc 0Η,9Χ^^ΝγΧ'^ΝΡ^!-_ΝΛ_γ0 X H,C CH, °<5γ-^Ν CH, H»C O ^H>^C CH,	727	Α
’T 0 0 O -’Ρ^η,χΡ'^ΝτΛγ“^’Ά° Hf^A ° ° „,X'ch, 0<^N CH, γ i CH,	727	Α
«,y_H, Q ,-Η,ΑΖγγ^γΧΧγ⁰ H.cAf 111¹ 1 P X. o Po ✓n. η h,c' ch, Ος^χΗ ch, Η,Ο ο ^HiC*ch,	727	Α

362

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

ν’ .	787	A i
°v\ X° τ	809	c
\	709	A
b o A 1 k'k\|f'^NA»'^NYkN'k^Ns Αν V ° oy v x°	769	B
Ab¹ 0 oy HP^O HplT CH.	723	C
Hę X	713	A
oW y k X .	723	' ^A

PL 206 255 B1

363

c.d. Tabeli 5

«γ» A Y	723	Β
X 0 οΑφΥγ %γ-* X	771	C
_bc ο,^γν Α^^Γ-. 'υ' ν Υ	741	Α
ρ Aa ο ο «, αργΧϊ’^Λ¹- ΟγΝ ΥΥ Μ,σγ CH,	725	Α
	745	Α
ΧυμΑ υ	716	Α
γ	733	Α

364

PL 206 255 B1

C.d. Tabeli 5

X · Ύ YY · '•as X'	713	A
ργγ ^τ γ ^s=i σ	753	A
Hf ZV γ Υ „y V	726	A
Υ Q» ΧγΥ, χΥγ ^Γ γ· X». Ύ	712	A
X. . ·9γ. χχγ ·	771	B
- V *· 3£f ‘	804	A
Μ*. ;:ĄT · \ · · οχ,	726	A

PL 206 255 B1

365

c.d. Tabeli 5

PP- · \ · V “· . σ	746	A
..ΟγΡΆΧΑ V - cr	752	A
PP' X' Hf CH,	741	A
° S ° ^H ° OyNH C*, X HjC CH,	727	A
Η’ΡΡο ° <, ° ° ΟγΝΗ ^CH, y CH,	699	A
X JLX A' ch/n-St y*y ΎΥχ s ° ⁰ <^^NH CHj o°	739	A
x	712	A

366

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

«F <, γψχ V ^T v ”· ·γ- Ol, .	698	A
γ ⁰⁴ A	757	B
AY γγγΤΙΤ - ° w, H	790	A
ΥΛ “r *F	712	A
Y “· a	732	A
γ- “· σ'	738	A
ογ ¹ A	869	A

PL 206 255 B1

367

c.d. Tabeli 5

	785	A
	785	A
Z	785	A
yN J x°	785	A
CpAzA' X	781	A
4#¹/ 2y '	780	A
V 0 OpW' y^N x<° H,C CH,	697	C

368

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

W 0 yw y HjC Oł,	671	C
y	780	A
A . .o_r. -	884	A
<8 o,, <y* ^CM* h/ST* ’ ^K’^c\	855	A
Y · 0 „. ^ΥΫΥ^^N 5 ϊαΛ° γ o«y Yh, ^m>^cx° ^MX	757	B
X « «A C^N CH, ^KW H,c-y CH,	741	B
vy, Q 0YAw <y y κρχ³ H,C-T CH, ·	779	B

PL 206 255 B1

369

c.d. Tabeli 5

o ΧαΦ v\A_o oko o ΟγΝ 1 x°	725	A
ΑψυυΥ αφτγχν V ^v x°	787	A
X”	785	A
n Χ-φΛο ° S ^{0 0} yy x°	737	A
Y ° X’	737	A
φΑζΑΑ r	739	A
Χ'ΑΑ '· X^-	855	A

370

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

X	826	Α
A	857	Α
Y * X	826	Α
p· P ' X	765	Α
σίρχ^ X χ·	792	Α
Α^Ά''	799	Α
X	784	Α

PL 206 255 B1

371

c.d. Tabeli 5

λ'. ·. ·9γ ^Ην «Ρ «Μ,	750	A
H.C ΓΗ X ο j-ζ ο 0 Tg CM, h,c γ jf T li JJ JAŻ°⁰ Z Ο«γ·^κ v>/ Ύ,	771	A
«Λ e«, _Λ Λ O )—f ⁰ ° ΊΓ Z’ R,C •rr·· / o<y — M.e*x CH,	771	A

372

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

XX Ύ^- P, '‘Χ° K.C CH.	536	C
Χ' «γ- ' V »f «,	508	Β
^H,cv^CH’
< JLu .-Ν. J1 CH, Χη. ^τχτχτ ’ „ _ογ Ρ	601	C
2.. H,C^*CH,
^H>cy^CH>
Η,εΑγΑϊ_ο ο Ο 0^-Ν CM, %'? τ H,C'^>^'CHj	587	Β
Η,εγκ, <γ^Ν ^H,^cy° H.C*ł ^CMJ	494	C
	512	C '
_χγ^Ύτ	538	C

PL 206 255 B1

373

c.d. Tabeli 5

Υ-Αγ χ-A¹·^- Υ ' ⁰	538	C
W H°	522	C
ΥΤ^Ρ	496	C
<γΝ * Vy° h,cT ’ CH,	522	C
. 'jPyPT ΧΎΥ“° 1	540	C
Żo xS	598	C
„XX X\-K° ° ΟγΝ Η,<Υ>3 .	480	• C

374

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

yy °y^N A H,C.-0	508	B
αχΧ- <γΝ V Ύ° hAT	548	C
Η,ογΜ, oXtV ^H’%y° H,C1 .	534	B
Ηγ/Η, °Y^N >7 ^ΗΎ° X	584	C
^H’^cy^CH3 · 'χΧυΑ“ °<γ^Ν ^\/ ^h3c o H,C< ³ CH,	570	B
Χχγτν Y Y	558	C
	433	C

PL 206 255 B1

375

c.d. Tabeli 5

y/³ Η/Ηχη, CH,	407	c
u r C H ^H’^cy ³ a^xⁿ'x^Xx°^h <^0 ° η,οΤοη, CH,	393	C
H C θ H₃ ć PA ϊ^ιΓ T« ^CHj	433	c
^H:jCV^CH3 ⁰ 4^°	419	c
y> . opp h.%A	534	c
^Hy,^CHł Ąy Η,οΡΤ X	520	B
y XX y^{N 11} x°	534	C

376

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

CęAy ¹¹ x°	520	B
h^ch, Q^N H,C Η,Ρ^Ο HjC^T cm₃	550	C
^ΗΎ^Η’
H_jC>-0 H^Y CH,	536	C
H,C_V ^CH, A ⁰
m, Yy ^Ηϊ°>Υ Jm oko ^H3C\|^° hxVch₃ O^N CH, H_iC i H,C*H CH_S	538	C
yTy Y	568	B
Q~1 ęr· v . Y	582	0
y\|tY yz / Y	570	C

PL 206 255 B1

377

c.d. Tabeli 5

ΟιΡγύΥ' V ^r T	584	C
°s	418	c
CM, .Jcrgr·' Oli k,c^o H.C ck, ·	554	c
H_jC C_Hj y* 4. r-gA ° Y>° ογ P* rx° ⁿ3^u CH,	508	c
^H3^CV^CHj 4 zP/A J4 ^OH _HiCxgv y oyi P^- H,C ° ^H.^C CH,	494	B
^H’V^Hl α^ϊ\Ρ“· αγΝ A Ύ° i CH,	562	C
Η,γΗ, a^rpr °Y^N A H,C_.° V CH,	548 _	A

378

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

H₅cyn, αΖΧ' y^N ^H>^cy° HjC''! ³ CHj	520	C
H C CH, ³ V cpjX° γ^Ν H,ch ³ CH,	506	C
\ Ji JL ch, γ y j h.cJ L 0 L 0 η ”i^cy^o M,^c «,	540	C
^H’^Cy^CH3 αΖχσ X τ H,C*( ³ ch₃	562	C
X .· .A “ o X	548	B
_H,cy^H. pXr^NxV°'^CH· H,^⁰ y^N ^h>Ąh, '	480	C
H,cyH, ργνΎν γΝ H,C^0 ηΛ ^H3^C ch,	466	C

PL 206 255 B1

379

c.d. Tabeli 5

Kpy, Ga °<y^N H₅c~y CH,	0 '''^ζΥ'ΧΗ,	568	C
H,y^H> Οί A. °y^N H,c~y° CH,	O 3 k °	554	B
^H3^cyH, XX Pr L o '--- Oy^N Η,Ο^,Ο H,C-T CH,	fi X <Axli I ΙΓ ° X=M,°	508	B
γρδχΧ ey κρ^ο η,Ύ CH,	482	C
H,C.^,CH,	o
?^h> ? τΑ χγΑο ° sy Η,Ο^-Ο H,cY CH,	YYch, 0 o CH,	496	C
H₃C^C^H3
T^lT L xk Gy o ^X ^*0 O^N w° ³ CH,	Μχ- χ^χ^χ ®x jF jj ^CH’ K. o CH,	522	C
yXX y ^K^	Y	535	C

380

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

Ty X ' '	539	B
X < NyS/CHj Η/?ηΥ»_Ο ° ° y <0, X ⁵ °s	563	B
ys y P, X CHj	567	C
rpYy 0	561	C
0-L ’ PS tóm, AL-chj ΛΛγΧ o	567	c
CH, yycH, Ap Pyp . 0	581	c
y-y	495	c

PL 206 255 B1

381

c.d. Tabeli 5

>Xo^o s ° OyN ¹¹ x°	654	B
H,C_yCH, χχχ ν χ Sy⁰ ^CHJ	549	C
CH °S XX, ΧΧχΛ o	567	C
CK. XX Pf 1 Χ-ο/·^ Χαγ π ^oA/yV^ o	581	C
χ/ψΑ-ο ΟγΝ I x°	654	c
H/yCH, «Χτψ^»·⁰ γΝΗ CH, Η<γ° HC cn	626	B
	654	. A

382

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

°γ ¹ Y .	535	C
°γ^Ν Υ	535	Β
ΫυυΧ^ y-qA° γ	523	C
^ϊΐ°^Ο 1°	523	C
γ*. · agigr γΝ CH, Η,σ,ο κ,σΓ CH.	561	Β
χχχ ° Υ	511	C
υτΫυ¹^ \°	537	C

PL 206 255 B1

383

c.d. Tabeli 5

X .	654	B
ΟγΝ x°	654	A
Ύ¹ , %°Ύ h,XSA. κ,ηΥοη,	626	B
yy cóYA' □ □γ “· Α> Η,ΥΟΗ,	652	B
yy . ΧΥΑ y^N m, Ύ	525	C
yy ΧΧτΧ' y^N > A	539	C
yy yy y-N CH, X° \| Ηγΐ CH,	549	C

384

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

ΟγΝ x°	641	B
	630	C
cyN Y x°	653	B
χ^ϊ'Χ'ΖΓΟ yN J Z	653	B
Yy^, QXP i °	553	C
« θ °9 Tma,' χΥΥ°° Y ^ló	655	C
JyyP? x°Yp° 5 °	629	' C

PL 206 255 B1

385

c.d. Tabeli 5

χΥό” Y ° x	539	C
y . ⁰	521	C
yyy Ϋ	521	C
yY° y °ό	547	C
αυ 0	547	C
y ρΡρχ* Ογ^Ν CH, π>%/° kcAF ³ CH,	590	B
Y <Y “S ^H\z° ^HAh,	590	B

386

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

cyw ¹¹ x°	641	B
yT, ) OL O Γ /—Ά CH-, ypę > «, ° cAmP\|jP\|M^^CH! 0	565	C
H,C CH, u _c <?^Hi \ y_CH, / _Ch, ^HlSL X X N y J Η^οΑ/γ y ę o o	579	C
	644	C
^{1 0} X ¹	587	C
Υίψ'ΧΌ ΟγΝ k x°	654	B
ΤΛ X	716	B

PL 206 255 B1

387

c.d. Tabeli 5

	668	Β
χϊΥΧγχ ΟγΝ ¹¹ χ°	670	Α
X _{ο 0} AaYYeo ο7 Χ°	666	C
ypypo χ^τ	666	C
yrżr-^-o Υ” χ°	630	Β
°γ^{Ν 1} Υ	531	C
ύυΥ°° s°	563	C

388

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

Αρ γ	537	C
^Qi> Η,ΕΥχΟ	575	Β
«V¹ Aw CM, Ν ⁵ ^Χ3Λ?₀ ° Κ. ° Ογ« CH, Α	591	Β
A/*· „(W3 Υν εγ« CM, bSz⁰ ϊμπΓ «%	586	C
ν_ν<Η . Υγο ο χ, ° 0γ« °S Η>Υχ° «,£/< CH,	586	C
H,C_yCH, 3σΧ° 0γ« «,<Αχ° H,cfT '	585	Β
Χ>#γ ΟγΝ CHj Η>Υχ° kc! CHj	563	Β

PL 206 255 B1

389

c.d. Tabeli 5

Y L ° Υ Δ MP^-O Y	547	B
y w γΡγΧιΑ''’^'*’ AZ X O^O k,c cyn κ,&^ο kcA °s	519	C
n<vc^ f\ Η P Η H ^HYVX⁰ V ⁰ ΟγΝΗ ^CH ΗΟ^,Ο ^H,^c ch	640	B
A	546	B
yŻpAo γ ¹ X	646	B
Y^J Z—i O O 4 ^\ ^-^ch3 c«,X*yy i Y n ³ ^HjC>L X © < O Η,ο'γ^ο y O^N ch₃ n_jC ° H_aC<T CH,	594	C
y^H’ oy c«j Hi^.0 Κ^Ύ CH,	592	B

390

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

Yr' ΟγΗ CH, HjSkzO ł-ucs ^CKj „	S33	C
A*a y« X X	545	c
i/pW	65S	B
X	509	A
Aa^y Os^-N XX	635	B
yw ¹¹ o X	685	B
J ^o=^p <x X Xy	519	C

PL 206 255 B1

391

c.d. Tabeli 5

^A^ y k X”	621	B
^HA^CH· ΑτΑ-χ !TrA k°	521	B
y YAA «.kr H,Cil	547	B
«χχ C0Ay- oy V H£^,O h,c< ‘ ,	573	B
y . AyAw °y v Η,χ,ο H.C-T CH,	609	B
Aa- °y k X	547	B
AAA oy ¹¹ x°	719	B

392

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

y ’ x°	719	C
y γΧχΧ y % x°	653	B
T	597	B
<y k X¹	697	A
X	619	B
X ₀ Typ y % X°	651	C
JW—* <γ» Φ- x°	592	B

PL 206 255 B1

393

c.d. Tabeli 5

«Λ/*¹ y^N v Ah,	587	C
οΑφτ' Αχ κτί ⁵ <*,	563	Β
yy YWy- yN Τ7 ^H’Sz°	589	C
5γ κ°	621	C
γγ X	519	C
trY γ	597	Β
yy «5 ękipAr^^⁰¹¹yy ° $» y* <> yy κ,ο-η <,	549	C

394

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

Η,ΖγΚ⁰ γ , γγ ^CH> HC-T	535	C
γ °S κ,ε-Τ ch₃	521	B
γγ y-N m, °S	519	C
gxx x°	689	C
γ^Ν ' ,x°	611	C
Ą$T'XAJ y ¹ X	600	C
ΟχπΥ^ y ¹ Y	595	B

PL 206 255 B1

395

c.d. Tabeli 5

/-y o CH''~''^^%SCH; ^>0^ δ k ° «.c-y o η CU -N ch, θ-^$>_0Η, H,C	541	C
^H,cx^H> ° η O^N ch, H^O h₃c^ch,	549	B
Aa^ X	593	C
y opP^aY9 yN ¹¹ x°	680	B
X	559	C
x+y X	559	C
oX~ ^Z* ^o., x « Ot	573	B

396

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

+ΧΥ·	644	C
ΦγΤγ'—+ γν y ° \ °	537	C
YnS—ο V X’	627	C
ΦτγΧ X	609	Β
Υχ-Α—γ	664	Β
ΟγΝ φ χ°	650	C
οΥ'Τ'ΑγΧ OyN Τ X	661	Β

PL 206 255 B1

397

c.d. Tabeli 5

2χγ Y X	571	C
A	661	B
X _ο Qx γ oy Y x°	607	B
ΥΎ χ^Ύ	625	C
^K,cx·· ₀ ΥΧΎ—- 0<^χΝ CM, «_SC^O HjC^c u,	575	B
H C C M _ X οΥΆ'— °ssy ^ŁM, ::r ^Ks^c CH, .	575	. B
K C C H , X r H -C *W-CH, ’ CM,	575	B

398

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

_αγ_τγ._,„ Ο^^,Ν CH, „.cPcM.	575	Β
οΖυ'Ατ'^'·· °*y ch, r	559	Β
V _o cóAX'^- o<^« CH, CZ	573	Β
Kpy αΧΑ'' qy ch, -^ΛΛο	637	Β
	473	C
αγττγ X	559	Β
ΗΑ», y^o yj <γπ κρ . V »Ρ CH,	549	C

PL 206 255 B1

399

c.d. Tabeli 5

οΧΎ X	587	C
Αγ X	547	C
°γ^Ν X	547	Β
X ^χ	573	C
ογπΧ X	573	C
αΧοΧ Υ X	607	C
CH τυ χ-γΑ,» g » V X	595	Β

400

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

Y Y	581	Β
	609	Β
6	629	C
1 ΦτΥυ^ AyyA.· γ	694	C
οΧηΜ X	605	C
γΑτΥ	579	C
γ'	627	C

PL 206 255 B1

401

c.d. Tabeli 5

<γ« CH, CH,	553	C
AA riAin a ^Λ	571	C
opAA^ X	572	Β
1 ΧύΑ'* Αγ· y cY^O	551	C
οχτΑ^ Ύ* A	609	C
ί	593	Β
Ολγί3^ί'^ Α	593	C

402

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

oAp* A	613	C
Ολγτχγ >r	593	B
oYór >r	581	C
OssS¹ ΛΓ· CH,	571	B
A/*³ Pr	577	C
_v ΤγΑγΧ γ v	615	C
CtM''* y y _v V CH,	571	C

PL 206 255 B1

403

c.d. Tabeli 5

y,cn, C\Ao ° s ° y P V H£ CH,	571	C
cAA <y^N yh, yy H.C CH,	545	C
oAA^ y P, h.<Xh,	633	c
yc, app y Y X ^HZ CM,	585	B
tym, cpA* y X, V H.C CH,	587	B
cXy* y P R/°	647	B
<yyy, y’ V	512	c

404

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

yi V Χη,	575	C
i Οχ γ-γρΛ. η 'Ćę^A	658	C
, ΟγΧγ*^ Α-Υ<Αο^ο g° ° \r°f ο ¹	621	C
ΧγήΑ>° g° 0	565	c
η-Ύη, /*·. cgWr~~ y^N Ρ, Η/γΝ ^CH,	572	A
yos αχΑΧ y^M Ρ ^ΗΑΥ° «Ρ CH,	587	A
H/yCH, Χ»₂ «/v° ηΧΓ °S	587	B

PL 206 255 B1

405

c.d. Tabeli 5

«yCH, Ύγϋ~- NH, 9 ² CH,	509	C
ycH, Η,<Αχ° ° \ ° V Y «Κχ° hjY °s	533	C
θ οφτΥτ^- ν Δ ηΧ ^H3^C ος	587	B
χΥ	644	C
Ολ^τΫΥ'^ y Υ	594	B
γΥτΥΥ y U X	695	B
αΥγ· V ν	650	B

406

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

«Py-CH, αίΖσ y Z yy°s ch₃ ch,	600	B
^yCH, ΟλΠΧ °y Z χ% h/ch,°S	628	A
Λ**, tyP⁰ N	556	B
Ay-y· < '	674	B
ΡυΧ <^KH CM, X f ot,	579	C
»y; ®S y* HC X ^MP ch,	637	C
•vy yrŻ^Y A	671	C

PL 206 255 B1

407

c.d. Tabeli 5

Αχ X	583	C
γ θ v S γ ch,	587	B
W™ x°	601	B
Kpy Χχ/Αθ ° X ° O CH, CH, Ύ	623	B
ycH, yV S ° y A V «Ρ CH,	621	A
$υΑ— I O < O XΎΥχ l	645	C
ηΑ^,οη, αίΥ' y k F	664	- B

408

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

χγΑ'- V χ	573	C
Ορϊ'Α'^ X	559	C
V_VCH, ° i ° o y V .Χ·· 3_ύχ0 o	847	B
^Cy.CH, cXtA^“' Os. -^N X CH,	651	B
Ιύ /	547	C
oAr/r'’- X	561 '	B
cAyt- V Y'	561	B

PL 206 255 B1

409

c.d. Tabeli 5

cyTcY Y Y	546	C
Ty Y	545	C
Ty+y Y Y	633	B
Y	681	C
Yy Y	561	C
YY y y y	598	B
	583	C

410

PL 206 255 B1

e.d. Tabeli 5

Υ .	567	C
y	539	c
V	519	c
^Ki^CyCK, yz\yxyTyM-suZ«is_>Cłłł ^<ϊΥ^ο’ΥΧ^^!%Γβ i ° » ^CM*° jX-j V Poyq	708	B
ΧΥΥγΎ <^ζ*» Π Υ	649	c
^M.^CV^CH> ^χχ^γΝχ?^γΝ'^^5ί°^Μί’y γ ^ΗΑχ*° H_}C bH,	561	B
HfyCH, y	461	• C

PL 206 255 B1

411

c.d. Tabeli 5

Y		531	C
QyY Y Y	y	606	A
OayYT	Ar^	606	A
V X	Y
YuA Y Y ·	Λρ-^	592	A
OiT	o Υγ—	666	C
Y
	Y'^	626	B
Ty a^-	Y
4_Yi YY
Y r		640	B
ó

412

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

	654	B
KAy-CH, <ys-ó' y X	698	B
^<Qy^Y“2V^^> O	654	B
ΧΑχ ΟΧΜ-	758	C
^HJ^CX^.CH_s X As. ^N. JL ^.N. <?^CHj ^H>V^Hs lY Ύ o η ° %p Th, X	638	A
X	683	B
Qi\|XiX X	593	A

PL 206 255 B1

413

c.d. Tabeli 5

X ·	621	A
Z	607	B
ΟιχτΫί^ α	627	B
Py^CH, °y Yh, X) .	586	A
Y¹ oy ch, X CH,	534	B
Y> αΖΨ^ oy °s AA CH,	560	C
' ° X ⁰ y k T	621	A

414

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

y X, H,C ^MZ CH, ¹	616	B
ycH, „AA™ y P cr	572	A
<ί Py k/kzYj° ^CH,° y Μ/° CH,	547	C
HZ^CH, ΥΖγΧ ° 'ch,⁰ y ΗΛ-Ο «χί CH,	561	C
•yy, . Aa y ^H’Sz° «Zl CH,	521	C
Αρλ x^Y	620	B
χ^Ύ	578	B

PL 206 255 B1

415

c.d. Tabeli 5

ypg Al Ά		560	A

«γ X H»^c CHj	o p	620	A
pY °y“ cr”		618	B
Qx^r X	Ύ	632	B
Cyr χτΓ	Yn
5? X		662	B
Oy ySr 7	γ	592	B
Cpi W !		590	B

416

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

i '	690	B
OiJYy''' Z	609	B
Xi °γ^Ν X Yr	749	B
Ά y A”•ySr‘^^cHy Ah,	648	A
H>ycH, ' ΥΛ	783	B
W YżY	783	B
Y Y	634	C

PL 206 255 B1

417

c.d. Tabeli 5

αχζχ V” • x°	648	C
οφΖΧ Y *X’	634	C
Y X*	649	C
c^rpy-o Y Y	629	C
V X’	657	C
^αχ^α αΖτΥ^ Qy^N A x°	614	A
^Brx^Br y^N A X°	702	B

418

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

By Br yN k- x°	702	A
CM, X « «-< S»>, . Ύ H,C CH,	675	B
X · _o yy L /Px4,. oko X χ/y x η c«j py «/CM,	647	B
K/yCH, P k-s h/\h,	568	C
«/yCH, ' /A o o HyA H£ as	619	c
άτχΧ' .	482	c
y^\ . /aa Qy-A ⁵ k ’	576	c

PL 206 255 B1

419

c.d. Tabeli 5

Y	617	B
	651	C
* ΐΓρΤ^!	637	C
' L” '	684	B
' L”	685	B
	698	B
Οχρίγ^ 1	605	' B

420

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

Υ	Yp·^	620	B
<Qy^Y		672	C
XX YY' Y*’ a	0 Ύ^ιΓ*^—	620	B
XX ['Υ' \χΆχ*Χ ⁰ Y r	k. °	594	B
ΧΧι Llf \ 'T <x	A'^· 0	606	B ’
Ύ		580	C
o^A y- ' Ύ	Χ*	532	B

PL 206 255 B1

421

c.d. Tabeli 5

Y α	572	Β
αγφΎ	738	Α
Υχτ y X	718	Β
y Υ X	664	Β
cya cYtY- cyw X χ°	614	Β
<φγγ ..y Υ	624	Β
α\|γΥ^ Υ <r	558	Β

422

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

YY °y k a	633	B
°y k,	770	C
^MfX° HjC CH,	535	C
ęx° tk' Aj°	533	C
W oYY :Y CM,	677	C
^H’^cx^CH· CH, H,C^O H.C-T CH,	563	B
^H£yCH, - Yw y k «py h,c^Ach,	651	' A

PL 206 255 B1

423

c.d. Tabeli 5

y y Y o·, ·	634	A
,0 oYy y ' Ύ	706	C
X · -9 . yy y y Yy	757	A
	662	A
^HycH, οΥΛμτΧ γ y H,Ł-O H.C CH,	660	A
OyCI x^T	648	A
^clyCi Gh yyAo⁰ \ ° <y y x°	648	C

424

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

X*	668	B
oAA χ^Ύ	618	A
oJPp V X'	660	B
X	601	B
V X	673	B
y ąprp— X	662	A
X/ X	602	A

PL 206 255 B1

425

c.d. Tabeli 5

yCH, πΥγΑί ° \| ° H_iC^xT'^CH3 y Z ^CH5 ;y H,⁰ CHj	681	A
O <y «, V CH.	681	C
ys, 0 y «. Y° H,C CH	655	C
«y. Ύ V °s ,	689	B
h.c^ch, Π ψν YrYńCi Α/ΥΑθ ° Z ° 0 CH» ’ y Z ·%/ HP CH,	660	A
Zy	538	C
Y Xr	764	A

426

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

HA^cn, · Ya y >	816	C
y, Ύ-. Xf	780	B
Hyc», (YyJOs^-^cH, __ (Ao ° > ° yY Y	560	C
pY X	602	C
^HycH, JsWyta ^pA₀ ° <0 ° ° “, CyH CH, y° HACH,	625	B
Hycn, \m\Yq ° X_Q ° O CK, Q^N CH, V HA CH,	685	B
o\|y Y	587	A

PL 206 255 B1

427

c.d. Tabeli 5

οΧΥ' Y	587	A
oAa _Ύ- y	601	A
y Z	625	B
y X X“	601	A
Jry- σ'	627	B
-A^A Y *% X	679	A
Ά X	628	A

428

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

oy Y V	587	A
y A>	641	A
y, Yr y k«, V HP CH,	659	A
n^CH, (ΑγΛτ y^N ku, Η,Ρ,Ι Kp CH,	674	A
Α'Ύ oy k x°	615	B
X ₀ oWto Oy^N k x°	641	B
Yro y k . x°	641	B

PL 206 255 B1

429

c.d. Tabeli 5

	627	A
	665	A
Y	614	A
k/k-Χο ° > ° o np ch, tZ y^N P Ύ° h/ch,	737	B
Y/.CH, L X X o X ° ⁿ y^N P, V K.C CH,	666	A
«AyCH, y^N P, V ►*£ CH,	660	A
opA X	591	C

430

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

χΐΆ'γ y T x° .	615	C
cĄAa y^N A, Or	754	B
H,t.CH, y X ^4tSy° Ά,	577	C
np®, nęVrVYA y \ ó V H,C CH,	694	A
<yy? °γ ¹ x°	702	A
O^YTjr^T X	701	A
A/¹ α&Χγ y^N Y Y H.C CH,	546	B

PL 206 255 B1

431

c.d. Tabeli 5

YYY y X ,n H.C CH,	520	B
H,y, jA-pr··» y ’ V σ”	546	B
yyO y y UL·,⁰ H.C CH,	723	B
oYyyrn y y y ►V ch,	675	A
. ρ LL'^myL^NxxL^o,>γτ \° V) y y y Xy	771	B
y θ αΥγΥ y y Yr	847	C
ojy i	641	' A

432

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

ο\|γ 1 z	613	^A
	651	^C
	700	^A
Y 1 ^x°	569	A
n 9yvV^v^o ΤΛΛο Oko ty CH, y hAch V <n Ύτ	756	B
CęJrÓAY I CK .N U. Y	786	A
1 Z '	669	B

PL 206 255 B1

433

c.d. Tabeli 5

c/y	601	A
AA y ' > X	601	B
CL Cl yN X	683	A
Aa^ X	673	A
d Qy Ar a! ° XM°° v ^hA y^N Sh, Η,^,Ν ►V CH,	680	A
oTy x^Y	602	A
oAa^ X	735	A

434

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

X '	743	A
χ·	655	B
αΜγ y^N V ^1-7 W K.C CH,	692	A
^Αο» k ° - y “> Η,ς^ H.C CH,	639	A
χ .γ ^^c^⁵kyk₀ ⁰ χ ° y °*. y V CH,	639	A
Aa-^tz _Y k X' ·	675	A
Ογ\|ϊΑ— «y ' <r	621	A

PL 206 255 B1

435

c.d. Tabeli 5

X ° »9 γΥ' °y^N κ°	668	A
X ° ° 9 ΥήΥ ¹ x°	642	A
Y X	654	A
y, ch ΥΧ-ΜζμΖ· un r* » π Τ 1Γ 4¾ χΧ o Ł o o o SjM* <*>	601	C
y« «ί hY ³ CM,	663	B
°y^N X	641	A
oyrYfT y X Y	702	A

436

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

%y 9 X	701	A
^C1V^CI χΧτΧ' °y^N P X	588	B
ogYgr-A· X	638	A
C\vŻ~X y* P, X	630	A
X	697	A
<X	621	A
OglYAr— V X^K	608	B

PL 206 255 B1

437

c.d. Tabeli 5

I Y	682	A
A TAjAo ° % ° HjAcH, yN CHj 1 H\|C CH,	667	B
\| y, yN CH, CH,	520	B
H.C c^ yrX ° S ° ^oK,c “ y X HAyzO I HP CH,	645	B
Ύ nHy yyk_o o p o y-cH, yN CH, ⁰¹¹ Ύ I «X	669	C
^HY 1 V CH,	575	A
HA/’ ośy y^N <V Ύ HjC CHj	709	B

438

PL 206 255 B1

c.d. Tabeli 5

H/yCH, π <Λγ_ο ⁰ S ° °Τ° y y y V ch,	652	B
V· X Hp CH,	714	A
y “>^^MTf'^NyY'^K^^CMi Js o V. o Hp , ° ] Ογ «, X h,c	561	B
Ύ QyN ^c«, ««, .	561	B
H,<y yr y ^F f Ύ H,C CH,	685	B

PL 206 255 B1

Claims

1. Związek, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery, oraz racematy, oraz jego farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, związek mający wzór ogólny I:

w którym:

R¹ oznacza COCONR⁹R¹⁰, w którym R⁹ oznacza H, R¹⁰ oznacza H, R¹⁴, [CH(R^1')]pCOOR¹¹, [CH(R^1')]pCONR¹²R¹³, [CH(R^1')]pSO₂R¹¹, [CH(R^1')]_pCOR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2')COOR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2')CONR¹²R¹³, albo CH(R^1')CONHCH(R^2')(R'), w których R^1', R^2', R¹¹, R¹², oraz R¹³ są niezależnie wybrane z grupy składającej się z: H, alkilu, arylu, heteroalkilu, heteroarylu, cykloalkilu, alkilo14 arylu, alkiloheteroarylu, aryloalkilu oraz heteroaralkilu, i gdzie R¹⁴ oznacza H, alkil, aryl, heteroalkil, heteroaryl, cykloalkil, alkiloaryl, alkiloheteroaryl, aryloalkil, alkenyl, alkinyl albo heteroaralkil;

Z jest wybrany spoś ród O, N, CH albo CR;

W może występować albo nie, i jeśli występuje to W jest wybrany spoś ród C=O, C=S, C(=N-CN), albo SO2;

Q może wystę pować albo nie, i jeś li wystę puje to Q oznacza CH, N, P, (CH2)p, (CHR)p, (CRR')p, O, NR, S, albo SO2; a gdy Q nie występuje to M może występować albo nie; gdy Q oraz M nie występują to A jest bezpośrednio przyłączony do L;

A oznacza O, CH2, (CHR)p, (CHR-CHR')p, (CRR')p, NR, S, albo SO2;

E oznacza CH, N, CR, albo podwójne wiązanie w kierunku A, L albo G;

G może występować albo nie, i jeśli występuje to G oznacza (CH2)p, (CHR)p, albo (CRR')p; a gdy G nie wystę puje to J występuje i E jest bezpośrednio przyłączony do atomu węgla we wzorze I tak jak jest przyłączony G;

J moż e wystę pować albo nie, i jeś li wystę puje to J oznacza (CH2)p, (CHR)p, albo (CRR')p, SO2, NH, NR albo O; a gdy J nie występuje, G występuje i E jest bezpośrednio przyłączony do N we wzorze I tak jak jest przyłączony J;

p oznacza liczbę od 0 do 6; oraz

R, R', R2, R3 oraz R4 są niezależnie wybrane z grupy składającej się z H; C1-C10 alkilu; C2-C10 alkenylu; C3-C8 cykloalkilu; C3-C8 heterocykloalkilu, alkoksy, aryloksy, alkilotio, arylotio, amino, amido, grupy estrowej, kwasu karboksylowego, karbaminianowej, ureidowej, ketonowej, aldehydowej, cyjano,

PL 206 255 B1

441 nitro, halogenu; (cykloalkilo)alkilu oraz (heterocykloalkilo)alkilu, przy czym dany cykloalkil składa się z 3 do 8 atomów węgla, oraz 0 do 6 atomów tlenu, azotu, siarki, albo fosforu, oraz dany alkil ma 1 do 6 atomów wę gla; arylu; heteroarylu; alkiloarylu; oraz alkiloheteroarylu;

przy czym dany alkil, heteroalkil, alkenyl, heteroalkenyl, aryl, heteroaryl, cykloalkil oraz heterocykloalkil może być ewentualnie i chemicznie odpowiednio podstawiony, przy czym określenie „podstawiony” odnosi się do ewentualnego i chemicznie odpowiedniego podstawienia przez jedno albo więcej ugrupowań wybranych z grupy składającej się z alkilu, alkenylu, alkinylu, arylu, aralkilu, cykloalkilu, heterocyklu, halogenu, hydroksy, tio, alkoksy, aryloksy, alkilotio, arylotio, grupy amino innej niż dla R² amido, grupy estrowej, kwasu karboksylowego, karbaminianowej, ureidowej, ketonowej, aldehydowej, cyjano, nitro, sulfonamidowej, sulfotlenku, sulfonu, sulfonyloureidowej, hydrazydu, oraz hydroksamianowej;

alkenyl i alkinyl oznaczają grupy mające od 2 do 10 atomów węgla; aryl oznacza grupę karbocykliczną mającą od 6 do 14 atomów węgla i mającą co najmniej jeden benzenoidowy pierścień, przy czym wszystkie możliwe do podstawienia aromatyczne atomy węgla grupy karbocyklicznej są możliwymi punktami przyłączenia;

aralkil oznacza ugrupowanie zawierające arylową grupę przyłączone poprzez niższy alkil; alkiloaryl oznacza ugrupowanie zawierające niższą grupę alkilową przyłączoną poprzez grupę arylową;

cykloalkil oznacza nasycony karbocykliczny pierścień mający od 3 do 8 atomów węgla, ewentualnie podstawiony;

heterocykliczny oznacza obok grup heteroarylowych, nasycone albo nienasycone cykliczne organiczne grupy mające co najmniej jeden atom O, S i/albo N przerywający strukturę karbocyklicznego pierścienia, która składa się z jednego pierścienia, albo dwóch skondensowanych pierścieni, przy czym każdy pierścień jest 5-, 6- albo 7- członowy i może mieć, albo nie mieć, podwójne wiązania którym brak zdelokalizowanych elektronów pi, przy czym struktura opierścienia ma od 2 do 8 atomów węgla;

halogen oznacza fluor, chlor, brom albo jod;

oraz, jeżeli nie podano inaczej, określenia „podstawiony albo niepodstawiony” albo „ewentualnie podstawiony” odnoszą się do danych ugrupowań ewentualnie i chemicznie trwale podstawionych ugrupowaniami określonymi jako R¹² albo R¹³.

2. Związek według zastrz. 1, w którym R¹⁰ oznacza H, R¹⁴, CH(R^1')COOR¹¹, CH(R^1')CH(R^1')COOR¹¹, CH(R^1')CONR¹²R¹³, CH(R^1')CH(R^1')CONR¹²R¹³, CH(R^1')CH(R^1')SO₂R¹¹, CH(R^1')CH(R^1')COR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2')COOR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2')CONR¹²R¹³, albo CH(R^1')CONHCH(R^2')(R'), w których R^1' oznacza H albo alkil, oraz R^2' oznacza fenyl, podstawiony fenyl, hetero atom-podstawiony fenyl, tiofenyl, cykloalkil, piperydyl albo pirydyl.

3. Związek według zastrz. 2, w którym R^1' oznacza H.

4. Związek według zastrz. 3, w którym R¹¹ oznacza H, metyl, etyl, allil, fe/f-butyl, benzyl, α-metylobenzyl, α,α-dimetylobenzyl, 1-metylocyklopropyl albo 1-metylocyklopentyl;

R' oznacza hydroksymetyl albo CH₂CONR¹²R¹³;

R^2' jest niezależnie wybrany spośród grupy składającej się z:

442

PL 206 255 B1 w których:

₅

U⁵ jest wybrany z ugrupowań składających się z alkilosulfonylu, arylosulfonylu, heteroalkilosulfonylu, heteroarylosulfonylu, alkilokarbonylu, arylokarbonylu, heteroalkilokarbonylu, heteroarylokarbonylu, alkoksykarbonylu, aryloksykarbonylu, heteroaryloksykarbonylu, alkiloaminokarbonyl, aryloaminokarbonyl, heteroaryloaminokarbonylu, albo ich kombinacji;

oraz NR¹²R¹³ jest wybrany z grupy składającej się z:

/-NH_2i Ś-NHMe, f-NH-n-Pr, Ś^-N(Me)OMe, w których U⁶ oznacza H, OH, albo CH2OH, oraz

R¹⁴ jest wybrany z grupy składającej się z: H, Me, Et, n-propylu, metoksy, cyklopropylu, n-butylu, 1-but-3-ynylu, benzylu, α-metylobenzylu, fenetylu, allilu,1-but-3-enylu, OMe, cyklopropylometylu.

5. Związek według zastrz. 1, w którym R² jest wybrany z grupy składającej się z następujących ugrupowań:

PL 206 255 B1

443

444

PL 206 255 B1

445 w których R¹¹ = OH albo O-alkil;

Y¹⁹ jest wybrany spośród następujących ugrupowań:

oraz Y²⁰ jest wybrany spośród następujących ugrupowań:

446

PL 206 255 B1

7. Związek według zastrz. 6, w którym R³ jest wybrany z grupy składającej się z następujących ugrupowań:

8. Zwią zek według zastrz. 7, w którym Z oznacza N oraz R⁴ oznacza H.

9. Zwią zek według zastrz. 8, w którym W oznacza C=O.

10. Związek według zastrz. 9, w którym Y jest wybrany spośród następujących ugrupowań:

PL 206 255 B1

447

448

PL 206 255 B1

COOH

HOOC'

COOH

OTHP

CH₃

Y Ύ CHs-M-/

HOOCYy

CHa ch₃

1-2

COOH ^HXA

HoocCyCy hooc y ch₃ ch₃

0-2 p3^H7

HOO ch₃ ch₃

Λ '3>^π3

Λ/y

HOOC

0-4 h₃COOC^x\

COOH

HOOC

Λ

HOO wy hooc y ch₃

H₃cy

HOOCy

C3^H7kX\ h₃c y

HOO

PL 206 255 B1

449

COOH

AcHN

COOH

HOOC.

W z

EtO

COOH

450

PL 206 255 B1

COOH

COOCH3

CONHCH3

COOH

COOH .OC₂H₅

HOOC

O

O o

/

Me^ /O Me

CFc

PL 206 255 B1

451 w których:

Y¹¹ jest wybrany spośród H, COOH, COOEt, OMe, Ph, OPh, NHMe, NHAc, NHPh, CH(Me)2, 1-triazolilu, 1-imidazolilu, oraz NHCH2COOH;

Y¹² jest wybrany spośród H, COOH, COOMe, OMe, F, Cl, albo Br;

Y¹³ jest wybrany spośród następujących ugrupowań:

Y¹⁴ jest wybrany spośród MeSO2, Ac, Boc, iBoc, Cbz, albo Al-loc;

Y¹⁵ oraz Y¹⁶ są niezależnie wybrane spośród alkilu, arylu, heteroalkilu, oraz heteroarylu;

oraz

Y¹⁸ oznacza COOCH3, NO2, N(CH3)2, F, OCH3, CH2COOH, COOH, SO2NH2, albo NHCOCH3.

11. Związek według zastrz. 10, w którym Y jest wybrany z grupy składającej się z:

452

PL 206 255 B1

453 w których:

Y¹⁷ = CF3, NO2, CONH2, OH, NH2, albo COOH;

Y¹⁸ = F, albo COOH.

12. Związek według zastrz. 11, w którym Y jest wybrany z grupy składającej się z:

454

PL 206 255 B1

13. Związek według zastrz. 12, w którym L oraz M są nieobecne, a J jest bezpośrednio przyłączony do E.

14. Związek według zastrz. 12, w którym L, J oraz M są nieobecne, a E jest bezpośrednio przyłączony do N.

15. Związek według zastrz. 12, w którym G oraz M są nieobecne.

16. Związek według zastrz. 12, w którym ugrupowanie:

PL 206 255 B1

455

17. Związek według zastrz. 16, w którym struktura a jest wybrana spośród następujących:

18. Związek według zastrz. 16, w którym struktura a oznacza:

gdzie R²⁰ jest wybrany spośród następujących:

456

PL 206 255 B1

19. Związek według zastrz. 16, w którym struktura ą oznacza gdzie R²¹ oraz R²² mogą być takie same, albo różne, i są niezależnie wybrane spośród następujących:

PL 206 255 B1

457

458

PL 206 255 B1

21. Związek według zastrz. 12, w którym:

22. Związek według zastrz. 21, w którym struktura b jest wybrana spośród następujących:

gdzie G oraz J są niezależnie wybrane z grupy składającej się z (CH2)p, (CHR)p, (CHR-CHR')p, oraz (CRR')p; A oraz M są niezależnie wybrane z grupy składającej się z O, S, SO2, NR, (CH2)p, (CHR)p,

PL 206 255 B1

459 (CHR-CHR')p, oraz (CRR')p; oraz Q oznacza CH2, CHR, CRR', NH, NR, O, S, SO2, NR, (CH2)p, (CHR)p, oraz (CRR')p.

24. Związek według zastrz. 23, w którym struktura c jest wybrana spośród następujących:

460

PL 206 255 B1

25. Związek według zastrz. 12, w którym:

jest wybrany spośród następujących:

PL 206 255 B1

461

462

PL 206 255 B1

26. Związek według zastrz. 25, w którym:

jest wybrany spośród następujących:

27. Związek według zastrz. 1, wykazujący aktywność hamowania proteazy HCV, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery oraz racematy, i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, wybrany z przedstawionych poniżej struktur

PL 206 255 B1

463

R t-butyl

NH₂) (R

Isobutyl

NH₂) (R

OH) (R

T richloroethyl

OH

Me

A li

Me

ΪΑ.

NAĆ nnr 11

HOOC

A

RP

Π

Me

RAP

RAk π

RA-n

A/

Ίί

Me (X = O‘Bu) (X = OH)

Me

A

NA*ϊί (X = OH) (X = O^lBu) (X = NH₂) (X = NHMe) (X = NMe₂)

464

PL 206 255 B1

ΜθΎ Me Me (X = O*Bu) (X = OH) (X = NH₂) (X = NMe₂) (X = NMeOMe)

Me λχ li

Me

Me nJL π

NMe₂

Me

MeM Me

Me

Χ-0

ΝχΛ li

Me (X = NH₂) (X = NMe₂) (X = NHMe) (X = OH)

R t-butyl) iSbbutyl)

R (X = O*Bu) (X = OH) (X = NH₂) (X = NMe₂)

PL 206 255 B1

465

466

PL 206 255 B1

467

468

PL 206 255 B1

469

470

PL 206 255 B1

471

472

PL 206 255 B1

473

474

PL 206 255 B1

475

476

PL 206 255 B1

477

478

PL 206 255 B1

479

480

PL 206 255 B1

481

482

PL 206 255 B1

483

484

PL 206 255 B1

485

486

PL 206 255 B1

487

488

PL 206 255 B1

489

490

PL 206 255 B1

491

492

PL 206 255 B1

493

494

PL 206 255 B1

495

496

PL 206 255 B1

497

498

PL 206 255 B1

28. Związek według zastrz. 1, wykazujący aktywność hamowania proteazy HCV, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery oraz racematy, i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, przedstawiony poniżej:

PL 206 255 B1

499

Η,γ ^Ηί· ch₃

29. Związek według zastrz. 1, wykazujący aktywność hamowania proteazy HCV, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery oraz racematy, i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, przedstawiony poniżej:

30. Związek według zastrz. 1, wykazujący aktywność hamowania proteazy HCV, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery oraz racematy, i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, przedstawiony poniżej:

31. Związek według zastrz. 1, wykazujący aktywność hamowania proteazy HCV, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery oraz racematy, i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, przedstawiony poniżej:

32. Związek według zastrz. 1, wykazujący aktywność hamowania proteazy HCV, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery oraz racematy, i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, przedstawiony poniżej:

500

PL 206 255 B1

33. Związek według zastrz. 1, wykazujący aktywność hamowania proteazy HCV, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery oraz racematy, i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, przedstawiony poniżej:

34. Związek według zastrz. 1, wykazujący aktywność hamowania proteazy HCV, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery oraz racematy, i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, przedstawiony poniżej:

35. Związek według zastrz. 1, wykazujący aktywność hamowania proteazy HCV, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery oraz racematy, i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, przedstawiony poniżej:

36. Związek według zastrz. 1, wykazujący aktywność hamowania proteazy HCV, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery oraz racematy, i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, przedstawiony poniżej:

PL 206 255 B1

501

37. Związek według zastrz. 1, wykazujący aktywność hamowania proteazy HCV, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery oraz racematy, i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, przedstawiony poniżej:

38. Związek według zastrz. 1, wybrany spośród następujących:

502

PL 206 255 B1

39. Farmaceutyczna kompozycja zawierająca składnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako składnik aktywny zawiera związek jak określony w zastrz. 1-38.

40. Kompozycja według zastrz. 39, do stosowania w leczeniu chorób związanych z HCV.

41. Kompozycja według zastrz. 39 albo 40, znamienna tym, że dodatkowo (a) zawiera środek przeciwwirusowy, albo (b) interferon, albo oba (a) oraz (b).

42. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że środkiem przeciwwirusowym jest rybawiryna, a interferonem jest α-interferon albo pegylowany interferon.

43. Kompozycja według zastrz. 39, znamienna tym, że jako składnik aktywny zawiera związek jak określony w zastrz. 27.

44. Kompozycja według zastrz. 43, znamienna tym, że dodatkowo (a) zawiera środek przeciwwirusowy, albo (b) interferon albo koniugat PEG-interferon alfa, albo oba (a) oraz (b).

45. Kompozycja według zastrz. 44, znamienna tym, że środkiem przeciwwirusowym jest rybawiryna, a interferonem jest α-interferon albo pegylowany interferon.

46. Kompozycja według zastrz. 39 albo 40, znamienna tym, że ja ko składnik aktywny zawiera wykazujący aktywność hamowania proteazy HCV, w tym jego enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery oraz racematy, i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub solwaty, związek wybrany spośród następujących:

PL 206 255 B1

503

504

PL 206 255 B1

47. Kompozycja według zastrz. 46, znamienna tym, że dodatkowo zawiera (a) środek przeciwwirusowy, albo (b) interferon albo koniugat PEG-interferon alfa, albo oba (a) oraz (b).

PL 206 255 B1

505

48. Kompozycja według zastrz. 47, znamienna tym, że środkiem przeciwwirusowym jest rybawiryna a interferonem jest α-interferon.

49. Kompozycja według zastrz. 46, znamienna tym, że związek jest wybrany spośród następujących:

506

PL 206 255 B1 ciwwirusowy, albo (b) interferon albo koniugat pegylowany interferon alfa, albo oba (a) oraz (b).

51. Kompozycja według zastrz. 50, znamienna tym, że środkiem przeciwwirusowym jest rybawiryna a interferonem jest alfainterferon.

52. Zastosowanie związku jak określony w zastrz. 1-38, do wytwarzania leku do leczenia chorób związanych z HCV.

53. Zastosowanie związku jak określony w zastrz. 1-38, do wytwarzania kompozycji do stosowania w kombinowanej terapii do leczenia chorób związanych z wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV), a ta kombinowana terapia obejmuje podawanie (i) związku oraz (ii) interferonu.

54. Zastosowanie według zastrz. 53, w którym interferonem jest alfa-interferon albo pegylowany interferon.