JP2968048B2 - 表面プラズモン共鳴に基づく酵素アッセイ - Google Patents

表面プラズモン共鳴に基づく酵素アッセイ

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 プロテアーゼの潜在的インヒビターをスクリーニング
するための高スループットアッセイ（high−throughput
assay）は、公知である。このようなアッセイの例に
は、シンチレーション近接アッセイ（scintillation pr
oximity assay）（SPA）がある。SPA技術はシンチラン
ト（scintillant）でコートしたビーズの使用を包含す
る。ビーズには、可逆的様式でリガンドまたは酵素と相
互作用する受容体分子（例えば、抗体、レセプターまた
は酵素基質）が結合する。
典型的なプロテアーゼアッセイのために、基質ペプチ
ドは、一方の末端でビオチン化され、そして他方の末端
は、125Iまたは3Hのような低エネルギーエミッターで放
射性標識される。次いで標識した基質を、酵素とともに
インキュベートする。次いで、アビジンをコートしたSP
Aビーズを添加し、ビオチンに結合させる。基質のペプ
チドがプロテアーゼによって切断されると、放射性エミ
ッター（radioactive emitter）は、シンチラントビー
ズの近傍にはもはや存在せず、そして光の放射は生じな
い。プロテアーゼのインヒビターは、基質をインタクト
な（intact）ままにし、そしてインヒビターの存在下で
生じて得られる光の放出によって同定され得る。
SPAアッセイは良好に作用する。しかし、基質を標識
すると、基質の不活性化が生じる。さらに、放射性標識
エミッターは、健康および環境の両方への問題を引き起
こし得る。従って、放射性基質を用いる必要のない高ス
ループットアッセイを作製する必要がある。
発明の要旨 本発明は、基質が酵素によって切断されたかどうか
を、表面プラズモン共鳴を用いて決定するための方法を
提供することによって、この必要性を満たす。本発明の
プロセスに従って、基質及びプロテアーゼはともに、プ
ロテアーゼが基質を切断し得、その後反応が停止する条
件下で反応容器中の溶液内に配置される。次いで、プロ
テアーゼおよび基質を含む溶液を、センサーチップに結
合したリガンドに接触させる。ここでリガンドは基質に
結合し得、そしてここでインタクトな基質の質量対切断
された基質の質量を、表面プラズモン共鳴技術によって
検出する。
本発明は、さらに、試験基質がプロテアーゼインヒビ
ターであるかどうかを決定する方法をさらに包含する。
試験基質を、プロテアーゼおよび基質を有する反応容器
中の溶液内に配置する。次いで、プロテアーゼ、基質お
よび試験基質を含む溶液をセンサーチップに結合したリ
ガンドに接触させる。ここでリガンドは基質に結合し
得、そしてここでインタクトな基質の質量対切断された
基質の質量を、表面プラズモン共鳴技術によって検出す
る。基質が切断されて、これが表面プラズモン共鳴技術
によって検出されるように、これが質量における基質の
減少によって決定されるならば、試験基質はプロテアー
ゼインヒビターではない。一方、基質がプロテアーゼイ
ンヒビターであるならば、基質は、表面プラズモン共鳴
によって決定されるような質量の減少を有しない。
発明の詳細な説明 表面プラズモン共鳴技術（SPR）を利用する新規の高
スループット酵素アッセイは、首尾良く開発されてい
る。このアッセイおよび専用のBIAcoreTM装置を用い
て、少なくとも1000サンプル／週を、96ウエルプレート
フォーマットにおいて、酵素活性または酵素活性に対す
るサンプルの阻害効果のいずれかについてスクリーニン
グし得る。この方法論は、容易に酵素−基質反応に適用
し得る。本発明者らは、この方法論を首尾良く用いて、
CMVおよびHCVプロテアーゼに対する高スループットアッ
セイを開発した。現在利用可能なSPAアッセイに対する
本アッセイの利点は、本アッセイが放射性標識ペプチド
基質を必要としないことである。
BIAcoreTMは、生物特異的相互作用分析（Biospecific
Interaction Analysis）のための処理ユニットであ
る。処理ユニットは、オートサンプラーおよび微量流体
力学システム（microfluidic system）を有する光学検
出システムを組み込んでいる。BIAcoreTMは、光学的現
象、生体分子間の相互作用をモニターするために表面プ
ラズモン共鳴を用いる。SPRは、薄い金属フィルムの表
面上での入射光子と電子との間の共鳴現象である。共鳴
は、厳密に規定された角度の入射光で生じる。この角度
（共鳴角という）で、エネルギーが金属フィルムの電子
に遷移し、その結果、反射光の強度が減少する。SPR反
応は、センサーチップ表面の極近くの屈折率の変化に依
存し、そして表面に結合した分析物の質量に比例する。
BIAcoreは、共鳴ユニット（RU）の相対的スケールによ
って共鳴角を接続的に測定し、そしてそれをセンサグラ
ム内のSPRシグナルとして表示する。センサグラムで
は、RUを時間の関数としてプロットする。
さらに、BIAcoreTMは、連続流体技術を用いる。１つ
の相互作用体を、センサーチップ上に不可逆的に固定化
する。このセンサーチップは、二分子の相互作用に対し
て親水性の環境を提供する非架橋性のカルボキシメチル
化デシストランを含む。他の相互作用体を含む溶液は、
センサーチップ表面上を継続的に流れる。溶液からの分
子が固定化されたリガンドに結合すると、共鳴角が変化
し、その結果シグナルが装置に記録される。
多くの現行のスループットアッセイが、研究される反
応物の１つを放射性標識することを必要とする技術に基
づくのとは対照に、BIAcoreTMにおいては、放射性標識
化を必要としない。この重要な利点は、成分の１つの標
識化が、容易ではないか、またはスクリーニングのため
の標的生体分子の真の相互作用を妨害するかのいずれか
である場合の、反応を研究するためのアッセイの開発を
可能にすることである。
BIAcoreTMの市販以来、表面プラズモン共鳴技術は、
広範にかつ主として用いられ、生体分子（すなわち、タ
ンパク質−タンパク質、タンパク質−DNA、タンパク質
−抗体、ペプチド−抗体など）の交互作用がリアルタイ
ムで研究されている。本発明者らの知る限りでは、酵素
−基質反応の程度を追跡し、酵素の触媒活性を決定し、
酵素の速度論（kinetics）を決定し、そして最終的に酵
素活性のインヒビターをスクリーニングするためのSPR
技術（特に、高スループット様式で）の使用のための方
法論は、現在公開されていない。今回、本発明者らは、
SPR技術と合わせて用いる場合に酵素活性のインヒビタ
ーの迅速なスクリーニングを可能にする新規の方法論を
開示する。本方法論において、酵素反応は、BIAcore以
外（すなわち、反応チューブまたは96ウエル組織培養プ
レート中）において、現在利用可能な高スループットア
ッセイのいずれかに従来的に行われるように、実施され
る。SPRは、反応停止後、酵素存在および非存在の溶液
中に残存するインタクトな基質の量を決定するための検
出手段としてのみ用いられる。
酵素添加前のインタクトな基質の量を測定するために
は、センサーチップ上の基質を捕獲するための手段を確
立しなければならなかった。さらに、BIAcore上の高ス
ループットアッセイのための要件を満たすためには、分
析終了後に表面から基質を除去する必要がある。このこ
とは、同一の表面を次の反応のために用いるので必要で
ある。これらの２つの要件を達成するために、ホスホチ
ロシンを合成的に基質の一方の末端に結合する。ホスホ
チロシンを選択したのは、抗ホスホチロシンモノクロー
ナル抗体が市販されているためである。抗体は、標準的
なアミノカップリング化学によりセンサーチップに共有
結合している。抗ホスホチロシン抗体は、チップに永久
的に結合しており、可逆的な様式でホスホチロシンを含
む基質を捕獲するために用いられる。抗体−ホスホチロ
シン相互作用を最終的に用いて、種々の試薬（すなわ
ち、2M MgCl2）での表面の再生により、所望するときに
ペプチド基質を捕獲し、そして放出する。
抗体表面上にインタクトなペプチドを導入すると、よ
り大きな質量を生じ、これは装置によって検出される。
ペプチド切断の程度を追跡するために、ペプチド基質と
酵素との混合物を所望の時間インキュベートし、そして
停止させる。切断されたペプチドおよびインタクトなペ
プチドを含むこの混合物を再生された抗体表面に導入す
ると、インタクトなペプチドのみを含むサンプルに対し
て検出される値よりも低い質量値を生じる。次に、２つ
の値の差を用いて、酵素による切断後に残存するインタ
クトなペプチドの正確な量を算出する。
典型的な合成ペプチド基質の質量は小さい（10〜20ア
ミノ酸、１〜３ダルトン）ため、多くの大きな基質を用
いて、質量の減少を直接追跡し得るが、インタクトなペ
プチドと切断されたペプチドとの間の質量の差、従って
シグナルの差はきわめて小さく、装置のシグナル対ノイ
ズ比内にある。この低い感度を避けるために、本発明者
らは、ペプチドのＮ末端上にビオチン分子を結合した。
ストレプトアビジンを添加してストレプトアビジンでペ
プチドにタグを付けした後、チップの抗体表面上にタグ
付けしたペプチドを注入することによって、シグナル
は、ストレプトアビジンの存在のためにより高くなる。
このアプロータを用いて、Ｎ末端の半分を欠き、ストレ
プトアビジンでタグ付けした切断ペプチドは、より低い
シグナルを生じる。
図８および９は、表面プラズモン共鳴装置のサンプル
容器10の概略図である。サンプルコンテナ12内には、セ
ンサーチップ16が存在する。センサーチップ16には、基
質20に結合した抗体18が付着している。
以下の実施例は、Ｃ型肝炎プロテアーゼおよびその基
質ならびにサイトメガロウイルスおよびその基質を用い
て本発明を説明するために含まれる。
実施例１ 表面プラズモン共鳴アッセイ 本実施例は、化合物が表面プラズモン共鳴アッセイを
用いてHCVプロテアーゼインヒビターとして有用である
得るかどうかを決定するための方法を例示する。図8A、
8B、9A、および9Bはその技術を例示する。
抗ホスホチロシンMabのセンサーチップへの結合のため
の手順 抗ホスホチロシンMabを以下の様式に従ってセンサー
チップのカルボキシメチル化されたデキストラン表面へ
結合する。結合手順を通して使用する流速は、５μl/分
である。最初に、表面をNHS/EDC（Ｎ−ヒドロキシスク
ニンイミド/N−ジメチルアミノプロピル（dimethyllami
nopropyl）−Ｎ′−エチルカルボジイミド−HCl）35μ
ｌの注入で活性化する。続いて、10mM酢酸ナトリウム緩
衝液（pH＝4.0）の中のMab 4GlO（50μg/ml）の40mlを
注入する。次いで、すべての残存している活性化された
エステルを、35μｌの1Mエタノールアミンの注入により
ブロックする。これらの状態は、約7,500応答ユニット
（420μＭ）の抗体の固定をもたらす。
ペプチドの結合およびMab 4GlO表面の再生 BIAcore分析を通じて使用する流速は、５μl/分であ
る。ストレプトアビジンタグ化ペプチド（２μＭのペプ
チド濃度、９μＭのストレプトアビジン結合部位濃度）
を含有する４μｌの注入を行う。（応答ユニットで）抗
体表面に結合したストレプトアビジンタグ化ペプチドの
量を、注入が完了した30秒後に測定する。
センサーチップ表面の再生 Mab 4GlO表面の再生を、各ペプチド注入の後、2M MgC
l2の４μｌのパルスを用いて達成する。500回までの表
面再生はなお、タグ化ペプチドの100％の結合を示し
た。
ペプチドおよびストレプトアビジンの光学濃度の決定 光学的ペプチド濃度を決定するために、標準曲線を、
過剰なストレプトアビジンの存在下で種々の量のペプチ
ド（０〜10μＭ）を用いて作製した。直線範囲内の値
（２μＭ）を、標準アッセイ条件について選択した。
ペプチドを完全にタグ化するために必要なストレプト
アビジンの量を、2.5μＭのペプチド濃度を用いて、そ
してストレプトアビジンの量を滴定することにより決定
した（結合部位のμＭ）。すべてのペプチドは、３μＭ
よりも高い濃度（ペプチド濃度に対しておよそ等モル）
のストレプトアビジンを用いた場合に完全にタグ化され
たことが示された。９μＭのストレプトアビジン濃度
（4.5倍過剰）を標準アッセイ条件について選択した。
HCVプロテアーゼに対する記載された方法の適用 Ｃ末端にホスホチロシン、およびＮ末端にビオチンを
有するHCVプロテアーゼの5A/5Bペプチド基質である、DT
EDVVACSMSYTWTGK（配列番号18）を合成する。抗ホスホ
チロシンモノクローナル抗体である4GlOをセンサーチッ
プに結合した。
HCVプロテアーゼの非存在下で、インタクトな、スト
レプトアビジンでタグ化したビオチン化ホスホチロシン
ペプチドは、その抗ホスホチロシンモノクローナル抗体
との相互操作により大きなシグナル（大きい質量ユニッ
ト／大きな応答ユニット）を生じる。
ホスホチロシンビオチン化ペプチドのプロテアーゼで
触媒される加水分解を96ウェルプレート中で行った。反
応を安息香酸水銀を含む等量の停止緩衝液を用いて停止
した。ストレプトアビジンを、ビオチンに結合するペプ
チドをタグ化するために添加した。タグ化したストレプ
トアビジンを欠失している切断されたペプチド（より小
さい質量）は、応答ユニットの喪失をもたらす。
抗体表面は2M MgCl2で繰り返し再生され得るので、こ
のアッセイを用いて、多数の化合物をそれらの阻害活性
について試験し得る。
HCVプロテアーゼによるペプチド切断活性を、BIAcore
に基づく方法論を用いて時間存在的な様式でモニターし
得る。濃縮した酵素およびBIAcore基質であるビオチン
−DTEDVVAC SMSYTWTGK−pY（配列番号17）を用いること
により、BIAcoreに基づくHCVアッセイを用いて、１時間
以内に50％の基質切断が達成される。酵素の量、２時間
以内での50％の切断に到達するために必要とされるHis
−NS3（183）Δ4AHT、高スループットアッセイの開発の
ために所望される時間のスケールに基づいて、本発明者
らは、His−NS3（183）Δ4AHT構築物の１リットルの発
酵が、BIAcoreにおける少なくとも100回の反応を行うた
めに十分なプロテアーゼを生じると判断する。
BIAcoreに基づくHCVアッセイのためび標準的な操作手順 反応緩衝液（50mM HEPES（pH7.4）、20％グリセロー
ル、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1％Tween−20、1mM DT
T）を希釈剤として用いて、反応物を96ウェル組織培養
プレート中で調製する。最終反応容量は100μｌであ
る。ペプチドの最終濃度が10μＭになるように、ペプチ
ドのみを含有するサンプル（ビオチン−DTEDVVAC SMSYT
WTGKpY）を、10μｌの100μＭペプチドストック（反応
緩衝液中で調製した）の90μｌの反応緩衝液への添加に
より調製する。ペプチドおよび酵素の最終濃度がそれぞ
れ10μＭおよび0.1μＭになるように、ペプチドおよび
酵素を含有するサンプルを、10μｌの100μＭペプチド
ストックおよび10μｌの1.7mg/mlの部分的に精製された
His−NS3（183）−Δ4A−HTストック（両方とも反応緩
衝液中で調製した）の、80μｌの反応緩衝液への添加に
より調製する。この反応を特定の時間30℃で保ち、次い
で停止させる。停止は、反応混合物の20μｌのアリコー
トを、等量のPMB停止緩衝液（50mM HEPES（pH7.8）、15
0mM NaCl、5mM P−ヒドロキシ水銀安息香酸、および13m
M EDTA）を含有する新しい組成培養プレートに移すこと
により達成する。
センサー表面上への注入のための停止した反応混合物
を調製するために、30μｌのPMB BIAcore緩衝液（50mM
HEPES（pH7.4）、1M NaCl）および30μｌのストレプト
アビジン（水中で0.5mg/ml）を、最終容量が100μｌに
なるように、40μｌの停止した反応混合物に添加する。
この工程で、サンプルの注入の前に、すべてのペプチド
をストレプトアビジンでタグ化する。最後に、４μｌの
このサンプルを、切断されたペプチドに対してインタク
トなペプチドを決定するために抗ホスホチロシンの表面
に注入す。BIAcoreサンプル中のペプチドおよびストレ
プトアビジンの最終濃度は、それぞれ、２μＭおよび９
μＭである。
実験条件： 基質： DTTを含まない反応緩衝液中のビオチン
−DTEDVVAC SMSYTWTGK−pY（配列番号19） 濃度： 170μＭ（重量に基づく粗ペプチド） 酵素： 10μｌの濃縮された1.7mg/mlのHis−NS3
（183）−Δ4A−HT 反応容量： 100μｌ 反応緩衝液： 50mM HEPES（pH7.8） 20％グリセロール 150mM NaCl 1mM EDTA 1mM DTT 0.1％Tween−20 温度： 30℃ 停止： ｐ−ヒドロキシ水銀安息香酸 実施例２ 表面プラズモン共鳴CMVアッセイのための標準的操作手
順 反応緩衝液（50mM HEPES,pH＝7.4、25％グリセロー
ル、1mM DTT）を希釈液として用いて、96ウエル組織培
養プレート中で反応物を調製する。最終反応容積は100
μＬである。ペプチド（ビオチン−RGVVNA SCRLAKY（配
列番号31））のみを有するサンプルを、96μｌの反応緩
衝液に10μｌのペプチドストック（100mM）（反応緩衝
液中で調製）を添加することによって調製し、ペプチド
の最終濃度を10μＭとする。ペプチドおよび酵素を含む
サンプルを、80μｌの反応緩衝液に10μｌのペプチドス
トック（100μＭ）および10μｌの酵素ストック（1mM）
（両者とも反応緩衝液中で調製）を添加することによっ
て調製し、ペプチドおよび酵素の最終濃度をそれぞれ10
および0.1μＭする。反応を特定の時間25℃で保ち、次
に停止した。停止は、反応混合物の20μｌアリコート
を、等容量のPMB停止緩衝液（50mM HEPES,pH7.8、150mM
NaCl、5mM p−ヒドロキシ水銀安息香酸（ｐ−Hydroxym
ercuribenzoic Acid）、および13mM EDTA）を含む新た
な組織培養プレートに移すことによって達成される。
センサー表面上に注入するための停止反応混合物を調
製するために、30μl PMB BIAcore緩衝液（50mM HEPES,
pH7.4、1M NaCl）および30μｌのストレプトアビジン
（水中で0.5mg/ml）を40μｌの停止反応混合物に添加し
て、100μｌの最終容積にする。この工程において、サ
ンプルの注入前に、全てのペプチドをストレプトアビジ
ンでタグ化する。最後に、インタクトなペプチド対切断
されたペプチドの決定のために、そのサンプルの４μｌ
を抗ホスホチロシン表面上に注入する。BIAcoreサンプ
ル中のペプチドおよびストレプトアビジンの最終濃度
は、それぞれ、２および９μＭである。
説明した方法論のCMVプロテアーゼへの適用 I.HPLC方法論とBIAcore方法論との比較 １組のCMVプロテアーゼ反応サンプルを、標準的なHPL
C方法論と上記で説明したBIAcoreに基づく方法の両方に
よって分析した。両方法を用いて、各時刻で残存するイ
ンタクトなペプチド基質の量に対する値を決定した。BI
Acore法によって測定される酵素触媒の程度は、酵素触
媒の分野で典型的に用いられる標準的なHPLC法によって
測定される程度と同一であった。
HPLC基質:A−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ｌ−Ａ
（配列番号32） BIAcore基質：（ビオチン）−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ａ
−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ｌ−Ａ−Ｋ−（pY）（配列番号31） 基質濃度:100μＭ 酵素： CMVプロテアーゼ（Baum,Ellenら、J.Virology January
1993、497−506頁を参照のこと）。
A. リフォールディングした野生型:0.5μＭ 時刻:10、20、30、45、70、および100分 温度:25℃ 反応条件： 50mM HEPES,pH 7.5 150mM NaCl 1mM DTT 25％グリセロール II.種々のヒトCMVプロテアーゼ形態によるCMV成熟部位
基質の加水分解に対する速度論的パラメータの決定 上記のBIAcoreに基づく方法論を用いてペプチドの切
断をモニターすることによって、HCMVプロテアーゼ活性
を決定した。速度論的パラメータの算出に用いられるペ
プチドの濃度を、アミノ酸組成分析によって決定した。
12の異なる濃度の基質（10μＭ〜3.2mM）を、kmの算出
に用いた（下記を参照のこと）。各ペプチド濃度におけ
る加水分解を、６つの異なる時刻（下記を参照のこと）
でモニターした。12時間以内に96ウエルプレートフォー
マットにおいて、各酵素に対する速度論的パラメータの
決定のために、合計で96サンプルを処理した。BIA評価
プログラム（Pharmecia Biosensor）およびK.catプログ
ラム（BioMetallics,Inc.）の両方を用い、速度（総基
質加水分解の15％未満での初速度）対基質濃度データを
ミカエリス−メンテンの式に直接当てはめることによっ
て、速度論的パラメータ（km、Vmax、Kcat）を決定し
た。
基質:A−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ｌ−Ａ（配
列番号32） 酵素番号： CMVプロテアーゼ A. リフォールディングした野生型（SPAバッチ＃35187
−81）： 0.2μＭ B. 可溶性A143V: 0.1μＭ C. 可溶性A143V/V209A: 0.1μＭ 基質濃度： 10、13、16、22、35、60、110、210、410、810、1610、
3210μＭ 時刻:1、５、10、15、20、25分 温度:22℃ 反応条件： 50mM HEPES,pH 7.5 150mM NaCl 1mM DTT 25％グリセロール III.BIAcoreに基づくCMVアッセイを用いて決定した酵素
の速度論および阻害のバリデーション A. 天然のペプチド基質の切断に対する酵素濃度および
反応時間の影響 実験条件： 天然のペプチド：（ビオチン）−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−
Ａ−Ｓ−Ｃ−Ｒ−Ｌ−Ａ−（pY）（配列番号32） ペプチドの最終濃度: 10μＭ 最終酵素（A143V/V209A）： 可変 時間経過: 可変 最終DTT: 1mM 概要： 天然の基質を用いると、基質の切断は、プロテアーゼ
の濃度（0.02〜0.08μＭの範囲内）および時間（１〜４
時間の範囲内）について直線的である。天然の基質を用
いる基準的なBIAcoreに基づくCMVアッセイを、２時間、
0.06μＭで実施すると50％の基質の切断を生じる。
B. p2′セリンアナログ基質の切断に対する酵素濃度お
よび反応時間の影響 実験条件： セリンアナログ：（ビオチン）−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−
Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ｌ−Ａ−（pY） ペプチドの最終濃度: 10μＭ 最終酵素（A143V/V209A）： 可変 時間経過: 可変 最終DTT: 1mM 概要： セリン基質を用いると、基質の切断は、プロテアーゼ
の濃度（0.1〜0.5μＭの範囲内）および時間（１〜４時
間の範囲内）について直線的である。セリンアナログを
用いる標準的なBIAcoreに基づくCMVアッセイを、２時
間、0.5μＭで実施すると、50％の基質の切断を生じ
る。
C. 加水分解速度に対する基質濃度の影響 実験条件： セリンアナログ：（ビオチン）−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−
Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ｌ−Ａ（pY） ペプチドの最終濃度: 可変 最終酵素（A143V/V209A）： 0.1μＭ 時間経過: ２時間 最終DTT: 1mM 概要： CMVペプチド基質の加水分解速度は、60μＭまでの基
質濃度について直線的である。標準的なBIAcoreに基づ
くアッセイで使用した基質の濃度は、10μＭである。
D. CMVプロテアーゼ活性に対するジチオスレイトール
の影響 実験条件： セリンアナログ：（ビオチン）−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−
Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ｌ−Ａ−（pY） ペプチドの最終濃度: 10μＭ 最終酵素（A143V/V209A）： 0.5μＭ 時間経過: 可変（２〜20時間） 最終DTT: 可変（０〜1mM） プロテアーゼ： 1.DTTの存在下で細胞を破壊する。
2.DTTの存在下で陰イオン交換カラム上で上清を精製す
る 3.DTTの存在下または非存在下で、フェニルセファロー
ス上でプロテアーゼを精製する。
概要 DTTの非存在下で精製したCWVプロテアーゼは、DTT存
在下で精製した活性な調製物と比較して20時間アッセイ
で判定されるように、触媒活性を欠く。不活性なプロテ
アーゼにDTTを添加すると、プロテアーゼの完全な再活
性化が生じる。従って、CMVアッセイにDTTが存在するこ
とは、CMVプロテアーゼの触媒活性に必須である。
E. CMVプロテアーゼ活性に対するDTTの最小の必要性 実験条件： DTT存在下で完全に精製し、続いてDTTとともに保存し
たCMVプロテアーゼのストック調製物（最終濃度＝2mM）
を使用した。アッセイのために、800μＭから４μＭへ
のDTTの滴定を行い、全反応の酵素の最終濃度を0.04μ
Ｍとした。等容積の5mM水銀安息香酸を添加することに
よって、全ての反応を種々の時間（１、２、３、および
４時間）で停止した。
天然のペプチド：（ビオチン）−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−
Ａ−Ｓ−Ｃ−Ｒ−Ｌ−Ａ−（pY） ペプチドの最終濃度： 10μＭ 最終酵素（A143V/V209A）: 0.04μＭ 時間経過： 可変（１〜４時間） 最終DTT 可変（４〜800mM） 最終遊離SH（酵素および基質） 10.2μＭ 概要： DTT濃度を800μＭから４μＭへ200倍減少されると、
天然の基質の切断％が２時間でわずか12％減少する。標
準的なBIAcoreアッセイに対する時間では、基質の50％
の切断を生じる。この切断％の減少は、反応時間を２時
間から３時間に増加させることによって容易に回復され
得る。従って、現在、BIAcoreに基づくCMVアッセイは、
わずか４μＭのDTT濃度で実施され得る。所望であれ
ば、反応時間を増加することによって、DTTの濃度をさ
らに減少し得る。
F. BIAcoreに基づくCMVアッセイを用いる、４および80
0μM DTT存在下でアッセイした化合物33277−129−２を
用いるCMVプロテアーゼ阻害研究 実験条件： 天然のペプチド：（ビオチン）−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−
Ａ−Ｓ−Ｃ−Ｒ−Ｌ−Ａ−（pY） ペプチドの最終濃度: 10μＭ 最終酵素（A143V/V209A）： 0.04μＭ 時間経過: 可変（１〜４時間） 最終DTT ３μＭまたは800μＭ 化合物: 33277−129−２（ストッ
ク:100％DMSO中で5.8mM） 化合物の最終濃度: 12または116μＭ 最終DMSO: ２％ インキュベーション: 化合物をプロテアーゼとと
もに30分間プレインキュベートする；基質を添加する;1
〜４時間インキュベートする；反応を停止する。
概要： 化合物33277−129−２は、４μM DTT存在下で、CMVプ
ロテアーゼ活性を、約12μＭで40％阻害し、約100μＭ
で60％阻害することが示される。本化合物による阻害％
は、800mM DTTの存在下で、12μＭで33％まで低下し、
そして100μＭで40％まで低下する。
IV.BIAcore上でモニターした成熟部位ペプチドアナログ
によるCMVプロテアーゼ活性の競合阻害 成熟部位ペプチド（AGVVNASＳRLA（p2′セリンアナロ
グ）に対するCMVプロテアーゼ（A143V/V209A）の精製さ
れた二重変異体の見かけの親和性（km）を、BIAcoreに
基づくCMVアッセイを用いて22℃で900μＭと決定した
（表１）。
次いで、加水分解に重要なアミノ酸対酵素の結合に関
与するアミノ酸をさらに明確にするために、この基質の
種々のアナログを特徴付けした。この問題に取り組むた
めに、HPLC上での酵素による各ペプチドの加水分解を直
接モニターすること、およびBIAcore上で開発されたCMV
アッセイを用いるビオチン化された天然の基質と各ペプ
チドとの競合との両方によって、天然の成熟部位ペプチ
ド（GVVNASCRLA）および４つのその変異アナログと酵素
との相互作用について研究した。
HPLCの結果は、試験した４つのアナログのうち３つ
（アナログＡ、Ｃ、Ｄ）が、HPLC上でモニターされるよ
うに、酵素によって加水分解されなかったことを示す。
３つの非加水分解性ペプチドのうちの２つ（アナログ
Ａ、Ｄ）を、１つのアミノ酸変異のみを有して合成し
た。ここで、アナログＣは、２つのそのアミノ酸が２つ
の非天然のアミノ酸に変異するように合成した。
アナログＡおよびＣ対アナログＤに対する加水分解の
消失についてのメカニズムを、BIAcoreに基づくCMVアッ
セイを用いて実施した競合研究により解明した。このア
ッセイの結果は、ペプチド基質アナログＡおよびＣが酵
素に対するそれらの結合能を保持するが、これらは加水
分解されないことを示す。これらのペプチドは、ビオチ
ン化した天然の基質と、天然のペプチドのIC−50と同様
のIC−50で競合することによって、酵素活性を阻害した
（IC−50天然約1mM;IC−50変異約1.5mM）。一方、競合
アッセイの結果は、ペプチド基質アナログＤの観察され
たいずれかの加水分解を欠くこと（HPLC上でモニターさ
れるような）は、その酵素に対する結合能の消失によ
る。なぜなら、このペプチドは、BIAcore上で検出され
るようなビオチン化した天然のペプチドとは競合し得な
いからである。
実施例３ HCV NS3プロテアーゼの生産 A. プラスミド構築。
いくつかのプラスミドを、HCVプロテアーゼをE.coli
で発現するために、標準的な組換えDNA技術（Sambrook,
FritschおよびManiatis）を用いて設計および構築した
（図２〜７）。全てのHCVの特定の配列は、親プラスミ
ドpBRTM/HCV 1−3011に由来した（Grakouiら、1993）。
プロテアーゼのＮ末端183アミノ酸バージョンを発現す
るために、停止コドンを、合成オリゴヌクレオチドを用
いてHCVゲノムに挿入した（図３）。Ｎ末端246アミノ酸
残基を発現するために設計されたプラスミドを、Ｃ末端
の天然のNcol制限部位による作製した。
ｉ）プラスミドpBJ1015の構築（図２） 完全なHCVゲノムを含むプラスミドpBRTH/HCV 1−3011
（Grakoui Aら、J.Virol.67:1385−1395）を、制限酵素
Sca IおよびHpa Iで消化し、そして7138bp（塩基対）DN
Aフラグメントを単離し、そしてpSP72（Promega）のSma
I部位にクローン化してプラスミドpRJ201を作製した。
プラスミドpRJ201をMsc Iで消化して2106bpのMsc Iフラ
ゲメントを単離し、そしてプラスミドpBD7のSma I部位
にクローン化した。得られたプラスミドpMBM48をKas I
およびNco Iで消化し、そしてクレノウポリメラーゼで
の平滑末端化後、734dpのDNAフラグメントを単離したNc
o I消化したクレノイポリメラーゼ処理したpTrcHIS B配
列発現プラスミド（Invitrogen）にクローン化した。こ
の連結により、HCV配列の５′末端部位にNoc I部位およ
び３′末端部位にNsi I部位が再生された。次いで、プ
ラスミドpTHB HCV NS3をNco IおよびNsi Iで消化し、そ
してクレノウポリメラーゼおよびT4 DNAポリメラーゼ処
理し、平滑末端化した738bpのDNAフラグメントを生成し
た。このフラグメントを単離し、そしてAsp I切断、ク
レノウポリメラーゼ処理した発現プラスミドpQE30（HI
V）にクローン化した。得られらプラスミドpBJ 1015
は、HCV NS3（246アミノ酸）プロテアーゼを発現する。
（ii）アミノ酸183の後ろに停止コドンを有するプラス
ミドpTS 56−９の構築（図３） プラスミドpTHB HCV NS3をNco Iで消化し、クレノウ
ポリメラーゼで処理し、次いでBstY Iで消化した；そし
てHCV配列を含むDNAフラグメントを単離し、そしてSma
IおよびBgl II消化したpSP72にクローン化した。次い
で、得られたプラスミドpTS 49−27をBgl IIおよびHpa
Iで消化し、そして２本鎖オリゴヌクレオチド： GA TCA CCG GTC TAG ATCT T GGC CAG ATC TAGA（配列番号11）を連絡し、pTS56
−９を作製した。
従って、停止コドンは、NS3タンパク質のプロテアー
ゼ触媒ドメインをコードするDNAの末端に直接配置され
た。これは、HCVプロテアーゼがNS3にタンパク質のヘリ
カーゼドメインから独立して発現されることを可能にし
た。
（iii）NS3 183のカルボキシ末端で正に荷電したアミノ
酸のペプチドと融合されたプラスミドpJB 1006の構築
（図４）。
プラスミドpTS 56−９をSph IおよびBgl IIで消化
し、そしてHCV配列を含むDNAフラグメントを単離し、そ
してSph I、Bgl II切断pSP72にクローン化した。得られ
たプラスミドpJB 1002を、Age IおよびHpa Iで消化し、
２本鎖オリゴヌクレオチド、 CCG GTC CGG AAG AAA AAG AGA CGC TAG C AG GCC TTC TTT TTC TCT GCG ATC G（配列番号12）を
連結してpJB 1006を構築した。これにより親水性可溶化
モチーフがNS3プロテアーゼ内に融合された。
（iv）E.coliにおいてHis−NS3（183）−HTを発現する
プラスミドpBJ 1022の構築（図５） プラスミドpJB 1006をNgoM IおよびNhe Iで消化し、2
16bpのDNAフラグメントを単離し、そいてNgoM I、Nhe I
切断pBJ 1015にクローン化してプラスミドpBJ 1019を構
築した。プラスミドpBJ 1019をNar IおよびPvu IIで消
化し、そしてンNar Iフラグメントの５′末端をフィル
インするためにクレノウポリメラーゼで処理した。発現
プラスミドpQE31（Invitrogen）をBamH Iで消化し、ク
レノイポリメラーゼで平滑末端化した。717dpのNar I−
Pvu II DNAフラグメントを単離し、そして発現プラスミ
ドpQE31（Invitrogen）の2787dpのBamH I/クレノウ化−
Msc I（Bal I）フラグメントに連結した。E.coliへの形
質転換後に得られた組換えプラスミドpBJ 1022は、いず
れのHIVプロテアーゼ切断部位配列も含まないHis NS3
（２−183）−HTを発現する。このプラスミドはまた、C
AT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ）遺伝子において大きな失欠を含む。
（ｖ）プラスミドpNB（−Ｖ）182−Δ4A HTの構築（図
６） プラスミドpMBM 48をEag IおよびXho Iで消化し、ク
レノウポリメラーゼで処理し、320bpのDNAフラグメント
を単離し、そしてBamH I切断、平滑末端化pSP 72にクロ
ーン化してプラスミドpJB 1004を構築した。320bpのフ
ラグメントは、NS3（631）のカルボキシ末端から７つの
アミノ酸、全てのNS4A、およびNS4Bのアミノ末端から46
のアミノ酸をコードす。組換えプラスミドpJB 1004をEa
g IおよびCel2で消化し、クレノウポリメラーゼで平滑
末端化した。220bpのDNAフラグメントを単離し、そして
連結の前にBamH Iで消化し、クレノウポリメラーゼで平
滑末端化した発現プラスミドpQE30にクローン化した。
得られたプラスミドpJB 1011をNgoM IおよびHind IIIで
消化し、そして２本鎖オリゴヌクレオチド、 に連結し、プラスミドpNB 4A HTを構築した。プラスミ
ドpNB 4AHTをMsl IをおよびXba Iで消化した。1218bpの
DNAフラグメントを単離し、そしてpBJ 1019のAge I切断
クレノウポリメラーゼ処理したXba I切断ベクターDNAに
クローン化した。この連結により、NS3における183番目
のアミノ酸残基バリンがグリシン残基に置換され、そし
て接合部でNS4Aのアミノ末端の３つのアミノ酸残基の欠
失が起こる。NS3（182アミノ酸）−Ｇ−NS4A（４−54ア
ミノ酸）を含む組換えプラスミドpNB182Δ4A HTは、NS3
/NS4A切断部位配列を接合部で含まず、そしてNS3の自己
触媒活性により切断されない。最後に、プラスミドpNB1
82Δ4A HT（配列番号８）をStu IおよびNhe Iで消化
し、803dpのDNAフラグメントを単離し、そしてStu Iお
よびNhe I切断プラスミドpBJ 1022にクローン化した。
得られたプラスミドpNB（−Ｖ）182−Δ4A HTは、NS3配
列のアミノ末端からのHIV配列の欠失およびCAT遺伝子に
おける欠失を含む（配列番号27）。
（iv）プラスミドpT5 His HIV−NS3の構築（図７） プラスミドpTS56−９をBgl IIで消化し、そして５′
末端をフィルインするためにクレノウポリメラーゼで処
理した。次いで、プラスミドをNgoM Iで消化し、そして
NS3配列を含む平滑末端化Bgl II/NgoM Iフラグメントを
単離し、そしてSgl I、クレノウ処理NgmM I切断、およ
びSal Iクレノウ処理したpBJ 1015に連結した。得られ
たプラスミドをpT5His HIV 183と名付ける。
実施例４ 可溶性モチーフを有するHCV NS3のプロテアーゼの精製 His182HT（配列番号４）およびHis（−Ｖ）182Δ4AHT
（配列番号８）の精製 組換えプラスミドpBJ 1022およびpNB（−Ｖ）182Δ4A
を使用して、製造者により推奨される方法に従って、la
cリプレッサーを過剰発現するE.coli MI5株［pREP4］
（Qiagen）の異なる培養物を形質転換した。組換えプラ
スミドを有するM15［pREP4］細菌を、20g/Lのバクトト
リプトン、5g/Lのバクト酵母抽出物、10g/LのNaClを含
み、100μg/mlアンピシリンおよび25μg/mlカナマイシ
ンを補充したブロス内で一晩増殖させた。培養物をO.D.
600が0.1より低くなるように希釈し、次いで30℃でO.D.
600が0.6〜0.8になるまで増殖させた。この後、IPTGを1
mMの最終濃度で添加した。誘導から２〜３時間後、細胞
をペレット化により採取し、そして細胞ペレットを100m
M Tris（pH7.5）で洗浄した。細胞溶解物を以下のよう
に調製した：ペレット化発酵ブロスのml等量物のそれぞ
れに、1mg/mlのリゾチームを有する50μｌの超音波処理
緩衝液（50mMリン酸ナトリウム（pH7.8）、0.3M NaCl）
を添加した；細胞懸濁物を30分間氷上に置いた。次い
で、懸濁物に最終濃度0.2％Tween−20、10mMジチオトレ
イトール（DTT）を添加し、細胞破壊が完了するまで超
音波処理した。不溶性物質をマイクロ遠心分離器で15分
間、12,000×ｇでペレット化し、可溶性部分を別のチュ
ーブに取り出し、次いで、可溶性溶解物に最終濃度10％
のグリセロールを添加した。プラスミドを発現する細胞
由来の可溶性溶解物は、予想される分子量の強力な免疫
反応性バンドを生じる。DTTの代わりに10mMβ−メルカ
プトエタノール（BME）を用いて、Ni2+カラム精製のた
めに調製された可溶性溶解物を調製した。溶解物を−80
℃で保存した。
Ni2+−ニトロシル酢酸（NTA）アガロース（QIAGEN）を
用いた精製 次いで、タンパク質をNTAアガロースカラムに抽出し
た溶解物を入れることにより精製した。NTAアガロース
カラムクロマトグラフィーを使用した。なぜなら、プロ
テアーゼのＮ末端に融合されたヒスチジンタグは、容易
にニッケルカラムに結合するからである。このことは、
可溶性プロテアーゼを迅速に精製するための効果的なア
フィニティクロマトグラフィー技術をもたらす。カラム
クロマトグラフィーをバッチモードで行った。Ni2+NTA
樹脂（3ml）を、50mlの緩衝液Ａ（10％グリセロール、
0.2％Tween 20、10mM BMEを含む50mMリン酸ナトリウム
（pH7.8））で２回洗浄した。250mlの発酵物から得られ
た溶解物（12.5ml）を、４℃で１時間、樹脂と共にイン
キュベートした。フロースルーを遠心分離により回収し
た。樹脂を1.0×4cmカラムにパックし、そしてベースラ
インに達するまで緩衝液Ａで洗浄した。次いで、結合タ
ンパク質を、緩衝液Ａ中の20mlのイミダゾールグラジエ
ント（０〜0.5M）で溶出した。溶出画分を、SDS−PAGお
よびHis−HIV 813に対するウサギポリクローナル抗体を
用いたウェスタンブロット分析により評価した。
POROS金属キレートアフィニティカラムを用いた精製 タンパク質を精製するための別の方法において、タン
パク質を含む溶解物を、POROS金属キレートアフィニテ
ィカラムに適用した。潅流クロマトグラフィーを、Ni2+
で予め荷電したPOROS MC金属キレートカラム（4.6×50m
m、1.7ml）で行った。サンプルを10ml/分で適用し、そ
してカラムを緩衝液Ａで洗浄した。カラムを、25mMをイ
ミダゾールを含む緩衝液Ａの10カラム容量で段階的に
（step）溶出した。カラムを、緩衝液Ａ中の25カラム容
量の25〜250mMイミダゾールグラジエントでさらに溶出
した。全ての溶出画分を、SDS−PAGEおよびウサギポリ
クローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析により
評価した。
実施例５ 5A/5Bおよび4B/5A基質のペプチド合成 ペプチド5A/5Bおよび4B/5A基質（配列番号16、18、1
9、20、および21）を、Fmoc化学を用いてABI431A型ペプ
チド合成器で合成した。製造者が推奨するFastMocTM活
性化トスラテジー（HBTU/HOBt）を、4Aアクチベーター
ペプチドの合成のために使用した。より強力なアクチベ
ーターであるHATUを、添加剤HOAtの存在下、または非存
在下で使用して、予め負荷したWang樹脂で5A/5B基質ペ
プチドを組み立てた。ペプチドを樹脂から切断し、そし
て標準的なTFA切断プロトコルによる脱保護した。ペプ
チドを逆相HPLCで精製し、そして質量分析により確認し
た。
実施例６ 合成5A/5Bペプチド基質を用いたHPLCアッセイ HCV NS3プロテアーゼのタンパク質分解活性を試験す
るために、DTEDVVCC SMSYTWTGK（配列番号16）および可
溶性HCV NS3（配列番号27）を、アッセイ緩衝液に共に
入れた。アッセイ緩衝液は、15％グリセロール、10mM D
TT、0.2％Tween20、および200mM NaClを含む50mMリン酸
ナトリウム（pH7.8）であった。配列番号27のプロテア
ーゼ活性は、２つの副産物ペプチド、すなわち5Aおよび
5Bに基質を切断した。基質および２つの副産物ペプチド
を、300Åの孔サイズおよび５μｍの粒子サイズを有す
る逆相IPLCカラム（Dynamax、4.6×250mm）で分離し
た。カラムを、１分あたり1mlの流量速度で0.1％TFA
（溶媒Ａ）を用いて平衡化した。基質および産物のペプ
チドのスタンダードをＡで平衡化したカラムに適用し
た。溶出を、アセトニトリルグラジエント（溶媒Ｂ＝Ａ
中の100％アセトニトリル）を用いて行った。２つのグ
ラジエント（50分間、５％〜70％Ｂ、続いて10分間、70
％〜100％Ｂ）を溶出のために使用した。
別の実験において、部分的に精製した配列番号27また
はベクターコントロールを、30℃で３、７および24時
間、100μＭの基質と共にインキュベートした。反応混
合物を、0.01％までのTFAの添加により停止し、そして
逆相HPLCカラムに適用した。各流出（run）からの画分
を、質量分析および配列決定により評価した。
実施例７ 不溶性HCV NS3プロテアーゼのリフォールディング 本実施例は、HCV NS3プロテアーゼのリフォールディ
ングの新規のプロセスを記載する。HCV NS3はプロテア
ーゼE.coli封入体ペレット由来の可溶化のモチーフを有
さない。この手順を用いて、活性アッセイおよび構造研
究のために精製された酵素を生成し得る。
E.coli封入体ペレット由来のHis−HIV 183の抽出および
精製 HisHIVl183のプラスミドを有するE.coli細胞を用い
て、市販供給源により推奨される方法に従って、E.coli
M15［pREP］株（Qiagen）（これは、lacリプレッサー
を過剰発現する）の培養物を形質転換した。組換えプラ
スミドを有するM15［pREP］細菌を、100μg/mlのアンピ
シリンおよび25μg/mlのカナマイシンを補充した20−10
−５ブロス中で一晩増殖させた。培養物をO.D.600が0.1
になるように希釈し、次いでO.D.600が0.6〜0.8になる
まで37℃で増殖させた後、1mMの最終濃度になるようにI
PTGを添加した。誘導の２〜３時間後、細胞ペレット化
することにより回収し、細胞ペレットを100mM Tris（pH
7.5）で洗浄し、そして遠心分離によりペレット化し
た。細胞ペレットを、ペレットの各gm湿重量あたり10ml
の0.1M Tris−HCl、5mM EDTA（pH 8.0）（緩衝液Ａ）中
に再懸濁した。Dounceホモジナイザーを用いてペレット
をホモジナイズし、そして再懸濁した。懸濁液を20,000
×ｇで30分間、４℃で遠心分離することにより明澄化し
た。このペレットを以下の５つの緩衝液で連続的に洗浄
した。
1. 緩衝Ａ 2. 1.0M塩化ナトリウム（NaCl）含有緩衝液Ａ 3. 1.0％Triton X−100含有緩衝液Ａ 4. 緩衝液Ａ 5. 1.0MグアニジンHCl（GuHCl）含有緩衝液Ａ 洗浄したペレットを5M GuHCl、１％βメルカプトエタ
ノールを含有する緩衝液Ａ（ペレットgm湿重量あたり3m
l）で、Dounceホモジナイザーを用いて可溶化し、100,0
00×ｇで30分間、４℃で遠心分離した。高分子量凝集物
からの変成HisHIV183の精製を、SEPHACRYL S−300ゲル
濾過カラム上でのサイズ排除により達成した。
特に、5.0M GuHClのE.coli抽出物の8mlサンプルを、
流速1.0ml/分で、160ml Pharmacia S−300カラム（1.6
×100cm）にアプライした。カラム緩衝液は、5.0M GuHC
l、0.1M Tris−HCl（pH8.0）、および5.0mM EDTAを含ん
でいた。画分サイズは5.0mlであった。適切な画分を、S
DS−PAGEの結果ならびにProBlotへ転写されたタンパク
質のＮ末端配列分析に基づいてプールした。
HCV−プロテアーゼの界面活性剤に補助されるリフォー
ルデング タンパク質を43mm Amicon YM10膜を用いて限外濾過す
ることにより、5M GuHCl、0.1M Tris−HCl（pH8.0）、
1.0mM EDTA、1.0％βメルカプトエタノール中で1.0mg/m
lまで濃縮した。次いで、これを50倍希釈してリフォー
ルディング緩衝液（100mM リン酸ナトリウム（pH8.
0）、10mM DTT、0.1％ラウリルマルトシド）中で0.1M G
uHClとし、そして混合物を氷上で少なくとも１時間イン
キュベートした。リフォールディング緩衝液中の500μ
ｇのタンパク質を含有する25mlのサンプルを、Pro−RPC
HR 3/5逆相クロマトグラフィーカラムにアプライし
た。アプライしたサンプルは、25mlのリフォールディン
グ緩衝液中に500μｇのタンパク質を含んでいた。次い
でカラムに、99.9％H2O＋0.1％トリフルロ酢酸（TFA）
を含む溶液Ｂをアプライした。10ml容量の溶液Ｃ（10％
H2O、90％アセトニトリル（AcN）＋0.1％TFA）を、流速
0.5ml/分および0.5mlの画分サイズで溶液Ｂ中に０〜60
％グラジエントでカラムにアプライした。この画分を、
A214;2.0吸収ユニットフルスケール（AUFS）でモニター
した。
タンパク質（ピーク１に対応する）を含有する画分を
段階的な透析による再生のためにプールした。この画分
をまず0.1％TFAを含有する25％グリセロール中で、一晩
４℃で透析した；次いで、0.01％TFAを含有するグリセ
ロール中で４℃で一晩透析した；次いで0.001％TFAを含
有する25％のグリセロール中で3.0時間透析した；次い
で、50mM NaPO4（pH6.0）、10mMジチオトレイトール（D
TT）を含有する25％グリセロール中で４℃で３時間透析
した。次いでこのタンパク質を、50mM NaPO4（pH7.
0）、0.15M NaCl、10mM DTTを含有する25％グリセロー
ル中で４℃で3.0時間透析した；次いで最後に、50mM Na
PO4（pH7.8）、0.3M NaCl、10mM DTT、0.2％Tween 20を
含有する25％グリセロール中で透析した。これにより、
精製された、リフォールディングされた、可溶性の、活
性なHCV NS3プロテアーゼが得られた。
タンパク質の遠UV円偏光二色性（CD）分析を用いて、
酸変性状態から中性pHにおける折りたたみ状態までのリ
フォールディングをモニターした。タンパク質の回収を
UVスキャンおよびSDS−PAGE分析によりモニターした。
結果： His−HIV183の界面活性剤に補助されるリフォールディ
ング HisHIV183をE.coli封入体ペレットから定量的に抽出
した。抽出の様々な段階におけるSDS−PAGE分析は、連
続的な洗浄が、混入しているタンパク質の有意の量を除
去するために必須であるということを示す。HisHIV183
を、5M GuHClの存在下で洗浄した封入体ペレットから抽
出した。5M GuHCl抽出物をSEPHACRYL S−300カラムにア
プライし、そして適切な画分をSDS−PAGE分析に基づい
てプールした。最初の10個の残基のアミノ酸配列を確認
した。
リフォールディングは、DTT、ラウリルマルトシド、
およびグリセロールの存在下で、４℃、非常に低いタン
パク質の濃度において行った。希釈したタンパク質をPr
o−RPC逆相カラムで濃縮した。２つのピークをUVおよび
タンパク質プロフィールに基づいて得た。ピーク１のみ
が段階的透析後に可溶性タンパク質を生じた。遠UV CD
スペクトル分析を用いて、酸性pHでの変性状態から中性
pHでの折りたたみ状態へのリフォールディングをモニタ
ーした。pH7.4において、タンパク質は有意な量の２次
構造（βシートタンパク質の構造と一致する）を示すこ
とが見出された。低pHでは、CDスペクトルは、タンパク
質が200nmで最小モル楕円率を有する完全なランダムコ
イルであることを示した。220nmの肩の値に対する200nm
のこの最小値の比は約4:1である。この比は２次構造形
成が中性pHで起こる場合に減少した。
透析の各段階でのUVスキャンは、タンパク質回収率が
pH7.4まででは90％より大きく、そしてタンパク質凝集
物に起因する光散乱効果が存在しなかったことを示し
た。SDS−PAGE分析はまた、リフォールディングの間、p
H7.0までではタンパク質の損失がないということを示し
た。タンパク質の沈殿が、透析の最後の段階で生じ、そ
して可溶性タンパク質を遠心分離による明澄化した。全
体のタンパク質回収率は約0.10％であった。リフォール
ディングされたタンパク質は、4Aペプチドの存在下でイ
ンビトロ翻訳された5A/5B基質を用いるトランス−切断
アッセイにおいて活性であることが見出された。
フロントページの続き (56)参考文献 国際公開90／15983（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/37 G01N 33/566 G01N 33/53 ＢＩＯＳＩＳ ＷＰＩ

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】表面プラズモン共鳴を用いて、酵素により
    基質が切断されるか否かを決定する方法であって、以下
    の工程： （ａ）該基質およびプロテアーゼを、反応容器中の溶液
    内に該プロテアーゼが該基質を切断し得る条件下でとも
    に配置する工程； （ｂ）該反応を停止する工程；および （ｃ）該プロテアーゼおよび該基質を含有する該溶液
    を、センサーチップに結合したリガンドと接触させる工
    程であって、ここで該リガンドは該基質に結合し得、そ
    してここで該切断された基質の質量に対する該基質の質
    量が表面プラズモン共鳴技術により検出される工程、 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】前記基質および前記酵素がサイトメガロウ
    イルス由来であり、そして該酵素がプロテアーゼであ
    る、請求項１に記載のプロセス。
  3. 【請求項３】前記基質および前記酵素がＣ型肝炎ウイル
    ス由来であり、そして該酵素がNS3プロテアーゼであ
    る、請求項１に記載のプロセス。
  4. 【請求項４】前記基質が該基質に結合した大きな部分を
    有して、該基質の質量を増大させる、請求項１に記載の
    方法。
  5. 【請求項５】前記部分がポリペプチドまたはタンパク質
    である、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記タンパク質が前記基質に共有結合した
    ビオチンである、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】ストレプトアビジンが前記ビオチンに結合
    している、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】試験物質が、プロテアーゼが切断し得る基
    質に対するプロテアーゼインヒビターであるか否かを決
    定する方法であって、以下の工程： （ａ）該試験物質を、反応容器中の溶液内に該プロテア
    ーゼおよび該基質とともに配置する工程； （ｂ）該プロテアーゼ、該基質、および該試験物質を含
    有する該溶液を、センサーチップに結合したリガンドと
    接触させる工程であって、ここで該リガンドは該基質に
    結合し得、そしてここで該切断された基質の質量に対す
    る該基質の質量が表面プラズモン共鳴技術により検出さ
    れる工程、 が包含し、 ここで、表面プラズモン共鳴技術により検出したとき、
    その質量の減少により決定される場合に該基質が切断さ
    れるならば、該試験物質がプロテアーゼインヒビターで
    はなく、そして該基質がプロテアーゼインヒビターであ
    るならば、該基質は表面プラズモン共鳴により決定され
    るような質量の減少を有さない、方法。
  9. 【請求項９】前記基質が、該基質に結合した大きな部分
    を有して、該基質の質量が増加する、請求項８に記載の
    方法。
  10. 【請求項１０】前記部分がポリペプチドまたはタンパク
    質である、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記タンパク質が、前記基質に共有結合
    したビオチンである、請求項10に記載の方法。
  12. 【請求項１２】ストレプトアビジンが前記ビオチンに結
    合している、請求項11に記載の方法。
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